KR101133324B1

KR101133324B1 - 인간 태반 유래 지지 세포를 이용한 인간 배아줄기세포의 배양 방법 및 그 배양 배지

Info

Publication number: KR101133324B1
Application number: KR1020090132908A
Authority: KR
Inventors: 김병수; 박용; 최인영
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2009-12-29
Filing date: 2009-12-29
Publication date: 2012-04-03
Also published as: KR20110076251A

Abstract

본 인간 태반 유래 지지 세포를 이용한 인간 배아줄기세포의 배양 방법 및 그 배양 배지에 관한 것이다. 본 발명에서는 외래 bFGF의 공급없이 인간 태반 유래 지지세포(HPC) 상에서 광범위하게 사용되는 인간배아줄기세포인 H1 및 HSF6를 50 50^th 계대까지 증식시켰다. 배양 배지에 bFGF의 부존재는 HPC 지지세포 상에서 배양된 형성된 배아체(embryoid bodies;EBs) 및 형성된 배아체 분화능력 뿐 아니라 미분화 증식 및 줄기세포성 마커(ALP, SSEA-4, TRA-60, Oct-4, Nanog, 또는 Rex-1)의 발현을 방해하지 않았다.

지지세포, 인간 배아 줄기세포, 배양, 섬유세포성장인자, 태반

Description

인간 태반 유래 지지 세포를 이용한 인간 배아줄기세포의 배양 방법 및 그 배양 배지{A CULTURE METHOD OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELL USING A HUMAN PLACENTA-DERIVED FEEDER CELL AND A CULTURE MEDIA THEREOF}

본 발명은 인간 태반 유래 지지 세포를 이용한 인간 배아줄기세포의 배양 방법 및 그 배양 배지에 관한 것이다.

인간 배아 줄기 세포는 전분화능(totipotency)을 가지며 인간의 몸을 구성하는 삼배엽성(내배엽, 외배엽, 중배엽)으로 분화될 수 있는 능력을 지니고 있어, 이에 대한 연구는 인간의 초기분화에 대한 근본적인 부분에서 중요한 단서를 제공할 수 있으며, 난치병 등과 같은 질병에 있어 세포치료연구의 핵심기술을 마련할 수 있다. 그러므로 인간 배아 줄기 세포를 이용한 세포치료연구는 높은 주목을 받아 왔으나, 마우스 배아 줄기 세포 배양 성공에도 불구하고 인간 배아 줄기 세포 배양은 그 특이성에 의해 오랫동안 성공을 거두지 못하였다.

최근, 인간배아 줄기세포의 배양방법이 1998년 Thomson (Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA,Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM, Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science (1998)282:1145-7)에 의해 성공을 거둔 이후로 인간줄기세포 치료연구는 전환점을 마련하며 세계적으로 그 무한한 가능성에 다시 높은 관심을 받고 있다.

이러한 인간 배아 줄기 세포의 배양방법 성공에도 불구하고 실제적 임상으로 적용하기 위해서는 해결되어야만 하는 몇몇 문제점이 있다. 이러한 문제점 중 하나는 세포배양시 수반되는 인간 배아 줄기 세포의 오염에 관한 것이다. Thomson의 방법을 기반으로 한 가장 일반적인 인간 배아 줄기 세포 배양법은 백혈병 억제 인자 (LIF)를 포함하는 조직배양 배지에서 마우스 배아섬유아세포(MEF)를 지지세포( 이하,'feeder cell'이라고도 함)로 이용하여 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법이다. 마우스 배아 줄기 세포 배양법과는 달리 인간 배아 줄기 세포는 LIF의 첨가만으로 분화를 억제할 수 없어 줄기세포가 빠르게 성장하는 것을 막을 수 있는 지지세포의 존재가 아직까지는 절대적으로 요구되고 있다 (Reubinoff BE, PEra MF, Fong C,Trounson A, Bongso A, Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. NatBiotechnol. (2000) 18(4):399-404).

새로운 배양액 조건 및 동물 기질세포와의 복합배양법을 통하여 다양한 인간 배아 줄기 세포 배양방법이 연구되고 있으나,동물세포 영양분 및 동물세포의 사용 특히 인간 배아 줄기 세포 내에 동물 세포의 잔재 가능성 등의 문제점들은 여전히 임상 적용 시 한계가 있을 것으로 보고되고 있다.

또 배아줄기세포 배양을 위해 수많은 지지세포가 필요하므로 매우 많은 생쥐 배아가 희생되어야 하여 비용적으로도 많은 부담이 있었다. 이를 극복하기 위해 지 지세포가 없는 배양기법(feeder-free system)이 개발되었다. 하지만 인간배아 줄기세포를 세포치료제로 개발하기 위해서는 매우 다량의 세포배양이 필요한데 feeder-free system은 기존의 feeder를 사용하는 방법에 비해 배양 효율이 낮아 실 험실에서 연구목적으로는 가능하겠으나 세포치료제 개발에는 적합하지 않다.

따라서 feeder cell을 생쥐가 아닌 인간에서 유래한 세포로 대치하고자 하는 노력들이 있어왔다. 마지막으로 다른 문제점으로는 인간 배아 줄기세포를 MEF feeder 위에서 배양할 때는 줄기세포를 미분화상태로 유지하기위해 반드시 basic fibroblast growth factor(bFGF)를 첨가해 주어야 하는데 bFGF의 비용이 상당하다.

또 동물세포에 의한 오염 및 감염을 줄이기 위해서 지지세포로 마우스의 섬유아세포를 대신하여 인간 섬유아세포, 인간 골수기질세포, 양수세포 등의 인간세포를 이용한 배양방법이 개발되고 있으나 이러한 방법을 통해서는 계대배양을 오랫동안 지속할 수 없어 치료목적으로 사용될 줄기세포를 다량 확보하기가 어려운 단점과, 인간세포 사용 시에도 여전히 배양된 줄기세포만을 지지세포로부터 효과적으로 분리해 내기는 어려운 실정이다. 이에 임상으로 사용되기 위한 적절한 배양 및 분리방법이 절대적으로 요구되고 있다.

최근 연구는 혈청-없는 배양 조건에서 배양 배지에 염기성 섬유세포 성장인자(이하,'bFGF'라 함)의 첨가는 인간배아줄기세포(이하, 'hESCs'라 함)의 자가-재생 활성을 유지하기 위한 유리한 점이 있다는 것을 나타낸다(Xu C, Inokuma MS, Denham J, et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2001;19:971-974;Carpenter MK, Rosler ES, Fisk GJ, et al. Properties of four human embryonic stem cell lines maintained in a feeder-free culture system. Dev Dyn. 2004;229:243-258;Rosler ES, Fisk GJ, Ares X, et al. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Dev Dyn. 2004;229:259-274).

FGF-2라고도 하는 bFGF는 다섯 종의 아이소폼(isoform)을 가지고, 이 중에서 네 고분자량 아이소폼(22 kDa, 22.5 kDa, 24 kDa, 34 kDa)은 인트라크라인 형태로 작용하고, 하나의 저 분자량 아이소폼(18kDa)은 분비되고 파라크라인이나 오토크라인 형태로 작용한다(Delrieu I. The high molecular weight isoforms of basic fibroblast growth factor (FGF-2): an insight into an intracrine mechanism. FEBS Lett. 2000;468:6-10).

hESCs를 feeder-free, serum-free 시스펨을 사용하여 배양할 때, bFGF 단독으로 다른 사이토카인의 혼합없이 hESCs의 줄기세포성(stemness)을 유지할 수 있다(Rao BM, Zandstra PW. Culture development for human embryonic stem cell propagation: molecular aspects and challenges. Curr Opin Biotechnol. 2005;16:568-576).

비록 bFGF가 hESCs에서 오토크라인 및 인트라크라인 형태 모두를 통하여 그것의 작용을 수행할 수 있다고 알려졌지만(Dvorak P, Dvorakova D, Koskova S, et al. Expression and potential role of fibroblast growth factor 2 and its receptors in human embryonic stem cells. Stem Cells. 2005;23:1200-1211;Dvorak P, Hampl A. Basic fibroblast growth factor and its receptors in human embryonic stem cells. Folia Histochem Cytobiol. 2005;43:203-208), 어떻게 bFGF가 hESCs를 미분화상태를 보존하는 것을 돕는지에 대한 정확한 메카니즘에 대해서는 알려지지 않았다.

아무튼 bFGF가 제노프리 배양 시스템(xeno-free culture system)에서 hESCs를 미분화 상태로 유지하는 필수적인 사이토카인이라는 것은 명백하다. 그러나 이 제노프리 배양 시스템은 몇 가지 제한성을 가진다. 이들 조건에서 배양된 hESC는 MEF feeder 또는 MEF-조건 배지에서 유지된 세포들에 비하여 더 낮은 클로닝 효율성 및 성장 률 및 더 높은 분화율을 가지고(Rao BM, Zandstra PW. Culture development for human embryonic stem cell propagation: molecular aspects and challenges. Curr Opin Biotechnol. 2005;16:568-576), 여전히 동물 혈청 사용 없이 bFGF의 첨가를 요구한다(Amit M, Carpenter MK, Inokuma MS, et al. Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Dev Biol. 2000;227:271-278).

인간 유래 feeder 세포들이 상기 언급한 문제점의 해결책으로 개발되었다. 최근에 몇몇 연구들은 인간 유래 feeder의 우수한 효과를 나타내었다(Amit M, Margulets V, Segev H, et al. Human feeder layers for human embryonic stem cells. Biol Reprod. 2003;68:2150-2156;Cheng L, Hammond H, Ye Z, et al. Human adult marrow cells support prolonged expansion of human embryonic stem cells in culture. Stem Cells. 2003;21:131-142;Hovatta O, Mikkola M, Gertow K, et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 2003;18:1404-1409;Lee JB, Lee JE, Park JH, et al. Establishment and maintenance of human embryonic stem cell lines on human feeder cells derived from uterine endometrium under serum-free condition. Biol Reprod. 2005;72:42-49;Lee JB, Song JM, Lee JE, et al. Available human feeder cells for the maintenance of human embryonic stem cells. Reproduction. 2004;128:727-735;Richards M, Fong CY, Chan WK, et al. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2002;20:933-936).

bFGF는 MEF feeder 상에서 hESCs의 미분화 상태를 유지하는데 필수적인 사이토카인이므로, bFGF는 우발적인 분화의 잠재적인 위험성을 회피하기 위하여 이들 연구들에서는 배지에 통상적으로 첨가하였다.

그러나 본 발명자들은 인간-유래 feeder의 세포-세포 상호작용 및 분비된 단백질은 동물 feeder의 것과는 다르다고 가정하였다. 이 가설에 기초하여, 본 발명자들은 외부 bFGF 공급없는 HPC feeder에 대하여 널리 사용되는 hESC인 H1 및 HSF6를 배양하는 것을 수행하고 그 결과를 HPC 또는 MEF feeders에 대한 외부 bFGF 공급의 결과와 비교하였다 .

본 발명자들은 인간 태반의 chorionic plate에서 추출한 세포(human placenta derived cell, HPC)를 지지세포로 사용하여 bFGF를 첨가하지 않으면서도 성공적으로 줄기 세포를 미분화상태로 유지시키면서 다량의 배양을 하는데 성공하 였다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 bFGF를 첨가하지 않으면서도 성공적으로 줄기 세포를 미분화상태로 유지시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 bFGF를 첨가하지 않으면서도 성공적으로 줄기 세포를 미분화상태로 유지시키는 배지를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법에 있어서, 지지세포(feeder cell)로 인간 태반-유래 세포(HPC)를 사용하는 것을 특징으로 하는 인간 배아 줄기 세포 배양방법을 제공한다.

또한 본 발명은 a) 인간 태반으로부터 인간 태반-유래 지지세포(HPC)를 제조하는 단계;b) 인간 배아 줄기세포를 상기 제조된 지지세포 상으로 트랜스퍼하는 단계; 및 c) 이들을 섬유세포 성장인자(FGF)를 공급하지 아니하고 배양하는 단계를 포함하는 인간 배아 줄기 세포 배양방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 인간 태반-유래 세포(HPC)는 인간 태반-유래 섬유세포-유사세포인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 인간 태반-유래 세포(HPC)는 융모막판(chorionic plates)으로부터 유래한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 배양방법은 배양 배지에 섬유세포 성장인자(FGF)를 공급하지 아니하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 섬유세포 성장인자(FGF)는 염기성 섬유세포 성장인자(bFGF)인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 배양 배지는 혈청대체물 (SR), 머캅토에탄올, 비-필수 아미노산, 및 항생물질을 포함하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 배양방법에 있어서, 상기 인간 태반-유래 세포(HPC)는 12계대까지 배양하고 저장(stock)된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 섬유세포 성장인자(FGF)가 보충되지 않은 배양 배지로 이루어진 인간 배아 줄기 세포 배양 배지를 제공한다(단 여기서 지지세포(feeder cell)로 인간 태반-유래 세포(HPC)를 사용).

본 발명의 배양 배지에서 상기 섬유세포 성장인자(FGF)는 염기성 섬유세포 성장인자(bFGF)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명의 배양 배지는 혈청대체물 (SR), 머캅토에탄올, 및 항생물질을 더욱 포함하며,

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 배양 배지는 염기성 섬유세포 성장인자(bFGF)가 보충되지 않은 KO-DMEM(KNOCKOUT Dulbecco's modified Eagle's medium, KO-DMEM), 혈청대체물 (SR), 머캅토에탄올, 및 항생물질로 구성된 배양배지인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명의 실험은 고려대학교 줄기세포연구소에서 진행되었다.

bFGF가 hESCs의 미분화 상태를 유지하는 역할을 하는 것은 분명하여서 bFGF를 필수 성장 인자(특히, MEF 지지세포를 사용하는 hESC 배양에서)로 간주한다. 최근에 동물 지지세포의 문제를 극복하기 위하여 여러 인간 유래된 지지세포를 hESC 배양에 소개하였다. 인간- 기원 지지세포에서 분비된 단백질 및 세포-세포 상호작용은 비록 정확하게 알려지지 않았지만 MEF 지지세포에서의 것들과 상당히 다를 것으로 예측된다. 따라서 본 발명자들은 인간 기원 지지세포를 사용하는 배양 시스템에서 bFGF의 역할을 재평가하기 위하여 본 발명을 수행하였다.

본 발명의 가장 중요한 특징은 HPC 지지세포를 사용하는 인간 배아줄기세포 배양에서 외부적인 bFGF의 부존재가 장기적인 배양의 결과에 영향을 미치지 아니하고 부가적인 장점을 제공한다는 것이다.

따라서 HPC 지지세포를 사용하는 인간 배아줄기세포 배양 조건 하에서는 배지에 외부적인 bFGF의 공급이 불필요한 것으로 간주된다.

본 발명자들은 HPC가 bFGF를 발현하지만 MEF는 그러하지 아니한다는 것을 밝혔다. 따라서 HPC가 hESCs의 미분화 상태를 유지시키는데 충분한 bFGF를 분비한다는 가정에 기초하여서, 상청액에서 ELISA를 수행하였다. ELISA의 결과는 외래 bFGF가 없이 배양된 H1(H1/HPC/-bFGF)으로부터 유래한 상청액의 평균 bFGF 농도가 외래 bFGF가 공급된 MEF에서 배양(인간 배아줄기세포 배양의 표준 방법)된 H1으로부터 유래한 상청액의 것과 큰 차이가 없다는 것을 알 수 있었다.

본 발명자들은 조건화된 hESC 및 지지세포 상청액을 사용하여서 그 동정된 bFGF는 hESC가 사용한 후의 나머지이다. 따라서 비록 HPC 지지세포에 의하여 분비된 bFGF의 정확한 양은 정량화하지 못하였지만, 이러한 발견은 적어도 HPC가 hESCs의 미분화상태를 유지하는데 충분한 bFGF를 분비할 수 있다는 것을 암시한다.

본 발명자들은 또한 배양된 hESCs에서 내생적인 bFGF 발현을 측정하였다. 인 간배아줄기세포에서 이러한 내생적인 bFGF 분석은 어떠한 암시를 가진다. 첫째, 내생적인 bFGF는 외래 bFGF를 가지는 MEF에서 배양된 인간배아줄기세포(H1, HSF6/MEF/+bFGF)에서 동정되었다.

두 번째, HPC 지지세포 군에서, 외래 bFGF와 무관하게, 모든 hESCs은 bFGF 발현을 나타내었다. 다른 말로, 내생적인 bFGF는 외래 bFGF가 없는 HPC 지지세포 상에서 배양된 인간배아줄기세포에서도 잘 발현된다는 것이다. 따라서 bFGF의 내생적인 발현이 hESCs가 외래 bFGF가 없는 HPC 지지세포에 대한 미분화 상태를 만드는데 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다.

bFGF의 신호전달에서, ERK1/2-c-fos/c-jun 경로의 활성화가 동정되었다. 이것은 외래 bFGF를 가지는 MEF 상에서 인간배아줄기세포에서 조사된 이전 연구(Kang HB, Kim JS, Kwon HJ, et al. Basic fibroblast growth factor activates ERK and induces c-fos in human embryonic stem cell line MizhES1. Stem Cells Dev. 2005;14:395-401)와 일치한다.

그러나 본 발명은 이 경로가 외래 bFGF가 없는 HPC 상에서 배양된 인간배아줄기세포에서도 활성화된다는 것을 발견하였다.

hESCs가 세포 대체 치료제의 공급원이 되기 위해서는 미분화된 hESCs의 대 량생산이 수반되어야 한다. 현재까지 지지세포를 사용하는 배양이 이러한 의도에 가장 잘 부합한다. 지지세포로 HPC를 사용하면 여러 잇점을 가진다.

첫째 그것이 인간 유래이므로 동물 지지세포를 사용하여 발생하는 문제점을 최소화할 수 있다.

두 번째 태반은 공여자의 부가적인 피해가 없이 얻을 수 있다.

세 번째, HPC 지지세포를 사용하는 배양 시스템은 연속적인 bFGF 공급이 필요하지 않아서 비용 및 노동력을 상당하게 절감할 수 있다.

본 발명의 실시에 있어서, 분자 생물학이나 재조합 DNA 기술 등의 유전자 공학 방법, 일반적인 세포생물학 방법 및 종래 기술에 대해, 실시자는 특별히 기재하지 않으며, 당해 분야의 표준적인 참고서적을 참조할 수 있다. 그 예로, Molecular Cloning : A Laboratory Manual 제3판(Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001); Current Protocols in Molecular biology(Ausubel et al.편, John Wiley & Sons, 1987); Methods in Enzymology 시리즈(Academic Press); PCR Protocols: Methods in Molecular Biology(Bartlett & Striling편, Humana Press, 2003);Animal Cell Culture: A Practical Approach 제3판(Masters편, 0xford University Press, 2000); Antiboides : A Laboratory Manual(Hatlow et al. & Lane편, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1987) 등을 참조할 수 있다.

또한, 본 명세서에서 참조되는 세포 배양, 세포 생물학 실험을 위한 시약 및 키트류는 Sigma사나 Aldrich사, Invitrogen/GIBCO사, Clontech사, Stratagene사 등 의 시판사로부터 입수가능하다.

또한, 다능성 줄기세포를 이용한 세포 배양, 및 발생?세포 생물학 실험의 일반적 방법에 대해, 실시자는 상기 분야의 표준적인 참고서적을 참조할 수 있다. 그 예로, Guide to Techniques in Mouse Development(Wasserman et al.편,Academic Press, 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro(M.V. Wiles, Meth. Enzymol. 225: 900, 1993); Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory manual(Hogan et al.편, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1994); Embryonic Stem Cells(Turksen편, Humana Press, 2O02)이 포함된다. 본 명세서에서 참조되는 세포 배양, 발생?세포 생물학 실험을 위한 시약 및 키트류는 Invitrogen/GIBCO사나 Sigma사 등의 시판사로부터 입수가능하다.

마우스 및 인간의 다능성 줄기세포의 제작, 계대, 보존법에 대한 표준적인 프로토콜이 이미 확립되고 있어, 실시자는 전술한 참고서적에 추가로, 복수의 참고 문헌(Matsui et al., Cell 70: 841, 1992; Thomson et al., 미국 특허 제 5,843,780호;Thomson et al., Science 282: 114, 1998; Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998; Shamblott et al., 미국 특허 제 6,090,622호; Reubinoff et al., Nat. Biotech. 18: 399, 2000; 국제 공개번호 제 00/27995호) 등을 참조함으로써, 이들 다능성 줄기세포를 사용할 수 있다. 또한, 그 밖의 동물종에 관해서도, 예로 원숭이(Thomson et al.,미국 특허 제 5,843,780호; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 7844, 1996)이나 랫(Iannaccone et al., Dev. Biol. 163:288, 1994; Loring et al., 국제 공개번호 제 99/27076호), 닭(Pain et al., Development 122: 2339, 1996; 미국 특허 제5,340,740호; 미국 특허 제5,656,479호), 돼지(Wheeler et al., Reprod. Fertil. Dev. 6: 563, 1994; Shim et al., Biol.Reprod. 57: 1089, 1997) 등에서의 ES 세포 또는 ES형 세포의 수립 방법이 알려져 있어, 각 기재의 방법을 따라, 본 발명에 이용할 수 있는 ES 세포를 제작할 수 있다.

ES 세포는 배반포기 배아의 내부에 있는 내부 세포 덩어리(inner cell mass)라고 하는 세포 집괴(cell clump)를 시험관내 배양으로 옮겨, 세포 덩어리의 해리와 계대를 반복함으로써, 미분화 줄기세포 집단으로서 분리시킨 다능성 줄기세포이다. 마우스 유래 ES 세포로는 E14, D3, CCE, R1, J1, EB3 등의 여러가지가 알려져 있으며, 일부는 American Type Culture Collection사나 Cell & Molecular Technologies, Thromb-X사 등으로부터 구입할 수 있다. 인간 유래 ES

세포는 현재, 전세계적으로 50종 이상이 수립되어 있으며, 미국 국립위생연구소(NIH)의 리스트( http: //stemcells.nih.gov/registry/index.asp)에는 20종 이상의 세포주가 등록되어 있다. 그 일부는 ES Cell International사나 Wisconsin Alulmi Research Foundation으로부터 구입할 수 있다.

ES 세포는 일반적으로 초기 배아를 배양하여 수립하지만, 체세포의 핵을 핵이식한 초기 배아에서 ES 세포를 제작할 수도 있다(Munsie et al., Curr. Biol. 10: 989, 2000; Wakayama et al., Science 292: 740, 2001; Hwang et al., Science 303: 1669, 2004). 또한, 이종 동물의 난세포 또는 탈핵한 난세포를 수개로 분할한 세포 소포(세포질체(cytoplast) 또는 오플라스토이드(ooplastoid)라 함)에, 원하는 동물의 세포핵을 이식하여 배반포기 배아의 세포 구조체를 제작하고, 그것을 기초로 ES 세포를 제작하는 방법도 고안되어 있다(국제 공개번호 제 99/45100호; 제 01/46401호; 제 01/96532호; 미국 특허 공개 제 02/90722호; 제 02/194637호). 또한, 단성생식(parthenogenesis) 배아를 배반포기와 동등한 수준의 단계까지 발생시킨 후 ES 세포를 제조하는 시도(미국 특허 공개 제 02/168763호; Vrana K et al., Proc, Natl. Acad. Sci,USA 100: 11911-6)나, ES 세포와 체세포를 융합시킴으로써 체세포 핵의 유전 정보를 가진 ES 세포를 만드는 방법도 보고되어 있다(국제 공개 번호 제 00/49137호; Tada et al., Curr. Biol. 11: 1553, 2001). 본 발명에서 사용되는 ES 세포는 이러한 방법에 의해 제조된 ES 세포 또는 ES 세포의 염색체상의 유전자를 유전자 공학 방법으로 변형시킨 세포도 포함한다.

상기의 과제해결수단 및 하기 실시예를 통하여 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 인간배아줄기세포의 미분화된 상태는 인간 태반-유래 지지세포 상에서 bFGF 없이도 장기간 배양 동안에 잘 보존되어 질 수 있었고, HPC 지지세포 상에서 인간배아줄기세포의 배양에서 외래 bFGF의 연속적인 공급이 부가적인 효과를 제공하지 못하였다.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: 태반 및 MEF 세포들로부터 지지세포의 제조

임신 6-8 주에 낙태한 건강한 여성의 융모막판(chorionic plates)을 수술적으로 분리하여,다지고 37℃에서 30분간 0.25% trypsin-EDTA (GIBCO-Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 배양하였다. 그 후에 그 세포들을 20% fetal bovine serum (FBS; HyClone Laboratories Inc, Logan, UT), 100 U/ml penicillin, 및 100 μg/ml streptomycin를 가지는 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) 에서 37℃, 5% CO₂, 및 95% 습도 조건에서 배양하였다. 그 배지를 세 계대(passage)까지 매 3-4 일마다 교환하였다. 배양 동안에, 본 발명자들은 배양 배지에서 떠 오르는 세포 찌꺼기를 제거하고, 그 판에 부착된 태반-유래 섬유세포-유사 세포를 발견하였다. 접종 약 2 주에, 그 판에 부착된 섬유세포-유사 세포의 콜로니를 형성하였다. HPC에서 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells;MSC)의 존재는 CD 29 및 CD 44의 포지티브 발현 및 CD 34의 네가티브 발현을 나타내는 유세포분석(flowcytometric analysis)에 의하여 동정되었다.

초기 10 태반으로부터 유래한 HPC의 일차 배양에서, HPCs는 종종 얇아지고 20^th~25^th 계대 후에 안정성을 잃었고, 13^th~17^th 계대 후의 HPCs는 H1 및 HSF6 hESCs의 미분화 성장을 유지할 수 없었다. 따라서 HPCs는 12^th 계대까지 배양하고, 이들 세포 모두를 hESC 배양을 위하여 저장(stock)하였다. 냉동 스톡을 트립신처리 및 조사(1500 cGy)로 하비스트한 후에 크라이오바이얼(cryovial) 당 1 x 10⁶ 세포의 양으로 수행하였다). hESC 배양을 위해서, 스톡된 HPCs를 해동하고 hESCs와 공동배양(coculture)하기 위하여 1 x 10⁶ cells/well으로 0.1% 젤라틴-코팅된 35-mm 웰 플레이트 상에 시딩하였다. 태반에 통상적으로 감염되는 병원체들은 스톡으로 냉동하기 전에 RT-PCR에 의하여 테스트하였다. 이들은 cytomegalovirus, herpes simplex virus types 1 및 2, Chlamydia trachomatis , Chlamydia spp , Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis , 및 Ureaplasma ureaticum을 포함한다. 공개된 프라이머 서열(Genbacev O, Krtolica A, Zdravkovic T, et al. Serum-free derivation of human embryonic stem cell lines on human placental fibroblast feeders. Fertil Steril. 2005;83:1517-1529;McDonagh S, Maidji E, Ma W, et al. Viral and bacterial pathogens at the maternal-fetal interface. J Infect Dis. 2004;190:826-834)을 사용하였다. 병원성에 대하여 포지티브인 HPC는 폐기하였다. 그 MEF 세포주들은 Millipore (MA, USA)로부터 구입하였다. MEF는 10% FBS가 보충된 DMEM에서 대략 90% 컨푸루언스로 배양하였다; 전형적으로, MEF는 5^th-7^th 계대 후에 증식될 수 없고, 4^th-5^th 계대 후에 hESCs의 미분화 성장을 유지할 수 없다. 따라서, MEF는 3^rd 계대까지 배양하고 ESC 배양을 위해 저장하였다. MEF는 플레이트로 트랜스퍼되기 전에 10 μg/ml mitomycin으로 90 분간 배양하여 제조되었다. 이들 두 지지세포(HPC, MEF)를 hESCs의 시딩 전에 24시간 동안 부착하게 하였다.

실시예 2: 인간 ESC 배양

H1 hESC 세포주(p29)는 National Stem Cell Bank로부터 구입하여 초기에 공급자의 지시에 따라서 MEF 상에서 배양하였다. HSF6 hESC 세포주(p63)도 National Stem Cell Bank로부터 구입하여, MEF 상에서 배양하였다. H1 및 HSF6 hESC 세포주에서 10 계대 동안 MEFs 상에서 유지한 후, 각 hESCs의 콜로니들을 새롭게 제조된 HPC 및 MEF feeder 상으로 트랜스퍼하여 bFGF 존재 또는 부존재 조건하에서 이들을 각 feeder 상에서 증식하였다(도 1). bFGF를 4 ng/ml의 농도로 그 배양 배지에 첨가하였다. 각 군의 다른 배양 조건은 동일하였다; 20% Knockout Serum Replacer (GIBCO), 0.1 mM β-mercaptoethanol, 및 1% penicillin-streptomycin (Sigma)가 보충된 DMEM/F-12가 hESC 및 feeder의 동시배양에 사용되었다. 그 배양 배지는 매 48시간마다 교환하였다. hESCs를 기계적인 분리를 통하여 매주 계대한 후 37℃, 5% CO₂, 및 95% 습도에서 배양하고 각각 플레이트 당 4 x 10⁴ 의 밀도로 각 계대에서 시드하였다. 배양 동안, 본 발명자들은 첫 다섯 계대 동안에는 각 계대에서, 그 후에는 매 다섯 계대마다 ESC 콜로니들을 카운트하였다. 본 발명자들은 그리드 및 헤모사이토미터를 사용하여 100-280 ESCs를 포함하는 각 코로니를 카운트하였다.

실시예 3: ESCs 의 특성화

hESCs의 미분화상태를 동정하기 위하여, 형태, 줄기세포성 마커의 발현 및 분화능력을 조사하였다. 세포 형태는 매일 도립 현미경(inverted microscope) 하에 서 관찰하였고, 줄기세포성 마커의 발현은 alkaline phosphatase (ALP), Oct-4, stage specific embryonic antigen (SSEA)-4, tumor rejection antigen (TRA)-60에 대한 면역염색, 및 Oct-4, Nanog, 및 Rex-1에 대한 RT-PCR에 의하여 테스트하였다. 배양된 hESCs의 특성화는 매 10^th 계대에서 수행되었다(도 1). RT-PCR에 사용된 프라이머들은 다음과 같다; Oct-4, 577bp: CGACCATCTGCCGCTTTGAG (forward)(서열번호 1), CCCCCTGTCCCCCATTCCTA (reverse)(서열번호 2), Nanog, 149bp: AAAGAATCTTCACCTATGCC (forward)(서열번호 3), GAAGGAAGAGGAGAGACAGT (reverse)(서열번호 4), Rex-1, 306bp: CAGATCCTAAACAGCTCGCAGAAT (forward)(서열번호 5), GCGTACGCAAATTAAAGTCCAGA (reverse)(서열번호 6)

면역조직화학(immunocytochemistry)에 사용된 동시배양은 6-웰 플레이트에서 확립되었다. 분석 전에, 부착 세포 층(adherent cell layers)을 상온에서 10% 포르말린의 첨가에 의하여 고정하고(15 분), 10분 동안 0.1% Triton X-100/PBS를 투과시키고 4°C에서 일차 항체로 오버나잇 배양하였다. SSEA-4에 대한 일차 항체는 Hybridoma Bank (Hybricoma Bank, IA)에서 구입하였고, 다른 항체들은 Chemicon (Chemicon, CA)으로부터 구입하였다. ALP 활성은 상업적 키트(Sigma)를 사용하여 검출하였다.

줄기세포성 마커에 대한 RT-PCR도 수행하였다. 전체 RNA는 QIAGEN RNeasy 키트(Qiagen-Hilden, Germany)를 사용하여 제조하였고, 역전사는 AMVreverse transcriptase (Roche Molecular Biochemicals, Germany)를 사용하는 랜덤 헥사머 로 500 ng의 토탈 RNA를 프라이밍하여서 수행하였다 . PCR을 수행한 후, 그 산물들을 1.5% 아가로스 젤 상에서 분석하고 ethium bromide로 시각화하였다.

표 1은 본 발명의 RT-PCR에 사용된 프라이머 서열 및 PCR 산물의 크기이다. 표 1에서 상단이 인간에 대한 프라이머 서열이다.

실시예 4: 핵형( Karyotype ) 분석

염색체 안정성을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 매 10^th 계대마다 배양된 hESCs의 핵형 분석을 수행하였다(도 1). ESCs는 0.1 μg/ml colcemid로 3-4 시간동안 배양되고, 트립신처리된 후 37℃에서 20분 동안 0.075 M KCl로 배양되었다. 3:1 메탄올/아세트 산으로 고정 후, ESCs의 핵형을 550-밴드 레벨의 해상(resolution)으로 분석하였다.

실시예 5: 계열(lineage)-특이적 마커에 대한 RT-PCR 분석 및 배아체(embryoid bodies)의 형성

장 시간 인 비트로 유지 동안에 분화 능력을 결정하기 위하여 매 10^th 계대에서 배양된 hESCs로부터 배아체(EB) 형성을 유도하였다(도 1). hESC EB 형성을 유도하기 위하여 정해진 시기에서 콜로니들을 하비스트한 후 bFGF가 없는 20% SR가 보충된 EB 배양 배지 DMEM/F-12로 트랜스퍼하였다. 본 발명자들은 형성된 EB의 수를 카운트하고 인간 ES 세포 콜로니 당 형성된 EB의 퍼센트를 계산하였다. 형성된 EB 내에서 삼 배엽층(germ layer)의 존재를 검출하기 위하여 본 발명자들은 21일에 배아체의 RT-PCR 분석을 수행하였다. 그 분석을 위한 프라이머들은 다음과 같다; Sox-1, 132bp: CACAACTCGGAGATCAGCAA (forward)(서열번호 7), GGTACTTGTAATCCGGGTGC (reverse)(서열번호 8), Brachyury, 111bp: AATTGGTCCAGCCTTGGAAT (forward)(서열번호 9), CGTTGCTCACAGACCACA (reverse)(서열번호 10), AFP, 675bp: AGAACCTGTCACAAGCTGTG (forward)(서열번호 11), GACAG AAGCTGAGGATGTC (reverse)(서열번호 12).

실시예 6: bFGF 에 대한 효소 결합면역측정법( Enzyme - Linked Immunosorbent Assay;ELISA) 및 RT - PCR 분석

지지세포들(MEF 및 HPC) 및 배양된 hESCs가 bFGF를 발현하고 분비하는지를 동정하기 위하여, 본 발명자들은 상청액에서 ELISA 및 지지세포 및 hESCs에서 RT/RQ-PCR를 수행하였다. bFGF의 프라이머는 GGCTTCTTCCTGCGCATCCAGCATCCA (forward)(서열번호 13) 및 GCTCTTAGCAGACATTGGAAGA (reverse)(서열번호 14)이다. 배양 배지를 변경하기 전에, 즉 배양 배지를 48시간 조건화한 후, 1μL의 상청액 및 hESCs를 첫번 10계대 동안에 모든 군에서 모았다. 각 상청액의 농도를 시중에서 구할 수 있는 bFGF ELISA 키트(R&D systems, Germany)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라서 측정하였다. 각 측정은 2회 수행하였고,bFGF의 농도는 두 측정의 평균으로 결정하였다.

실시예 7: bFGF 신호전달 경로에 대한 RT - PCR 및 웨스턴 블럿 , 밀도측정법( Densitometry )

hESCs에서 bFGF 신호전달 경로를 밝히기 위하여, 본 발명자들은 인산화된 세포외 신호-조절된 카이네이즈(pERK)에 대한 면역불럿 및 c-fos, 및 c-jun에 대한 RT-PCR를 수행하였다. c-fos 및 c-jun에 대한 프라이머는 다음과 같다; c-fos, 236bp: GAATAAGATGGCTGCAGCCAAATGCCGCAA (forward)(서열번호 15), CAGTCAGATCAAGGGAAGCCACAGACATCT (reverse)(서열번호 16), c-jun, 325bp: GGAAACGACCTTCTATGACGATGCCCTCAA (forward)(서열번호 17), GAACCCCTCCTGCTCATCTGTCACGTTCTT (reverse)(서열번호 18).

웨스턴 블럿 분석을 위해서, H1 및 HSF6 hESCs 모두를 유리 피펫을 이용하여 콜로니들을 부드럽게 스크래핑하여서 수집하고 인산 버퍼 식염수(PBS)로 세척하고, 100 μl의 소디움 도데실 설페이트(SDS) 샘플 버퍼(12 mM Tris-HCl, pH 6.8, 0.4% SDS, 5% glycerol, 0.02% bromophenol blue, 0.288 mM 2-mercaptoethanol)에서 라이시스하였다. 샘플들을 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(PAGE)로 분리하고 polyvinylidene fluoride (PVDF) 막(Millipore Corp, MA)상에 전기이동(electrotransfer)하였다. 그 막들을 블럭킹 버퍼: PBS, 0.5% Tween-20(5% 탈지분유 함유)에서 상온에서 2시간 담가둔 후에 적당한 일차 항체로 4℃에서 오버나잇 배양하였다. 단백질들을 horseradish peroxidase (HRP)-부착된 이차 항체 및 ECL 시약(Amersham Pharmacia Biotech, NJ)으로 검출하였다. ERK1/2, phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)에 대한 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA)로부터 구입하였다. 항-c-Fos 및 항-c-jun은 Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA)로부터 구입하였다. ImageJ 소프트웨어는 밀도분석을 수행하는데 사용하였다.

실시예 8: 통계분석

각 hESC 군(H1/MEF/bFGF+, H1/MEF/bFGF-, H1/HPC/bFGF+, H1/HPC/bFGF-)는 다섯 배양 디쉬를 가졌다; 각 군에 대한 값들은 다섯 디쉬의 평균 값이었다.

본 실험은 10회 반복하였고 결과들을 두 다른 전문가에 의하여 검증하였다. 모든 정량적인 데이터는 평균 ± SEM로 나타내었다. 결과들은 p 값이 0.05 이하이면 유의적이라고 간주하였다.

본 발명의 전체 발명의 개략도는 도 1에 기재한다.

상기 실시예의 결과는 다음과 같다.

콜로니 카운트의 비교

외래 bFGF를 가지는 MEF 지지세포 군에서, 콜로니의 평균 숫자는 계대에서 H1 (H1/MEF/+bFGF 군)에서는 147±17이고, HSF6 (HSF6/MEF/+bFGF 군)에서는 150±13이었으며, 본 발명자들은 50^th 계대 후 H1/MEF/+bFGF 및 HSF6/MEF/+bFGF 군 모두에서 hESCs를 증식할 수 있었다 (도 2 A,B).

그러나 외래 bFGF가 없는 MEF 지지세포 군에서 콜로니의 평균값은 H1 (H1/MEF/-bFGF)에서 71±13이었고, HSF6 (HSF6/MEF/-bFGF)에서는 56±11이었으며, 그 콜로니는 10 계대 이상 유지될 수 없었다(도 2 A,B). 외래 bFGF의 존재 또는 부존재에 따르는 평균 콜로니 카운트에서 큰 차이가 있었다(각각 H1 및 HSF6에서 p<0.001) (도 2A)

외래 bFGF를 가지는 HPC 지지세포 군에서, 콜로니의 평균 숫자는 계대에서 H1 (H1/HPC/+bFGF 군)에서는 151±11이었고, HSF6 (HSF6/HPC/+bFGF 군)에서는 143±13이었다.

외래 bFGF가 없는 HPC 지지세포 군에서 콜로니의 평균값은 H1 (H1/HPC/+bFGF 군)에서는 153±10이었고, HSF6 (HSF6/HPC/+bFGF 군)에서는 145±9이었다(도 2C).

HPC 지지세포 군에서, hESC의 콜로니들은 외래 bFGF와 무관하게 50^th 계대 이상까지 증식할 수 있었다(도 2D).

외래 bFGF의 존재 또는 부존재에 따르는 H1 및 HSF6의 평균 콜로니 카운트에서 큰 차이가 없었다(각각 H1에서 p=0.227이고, HSF6에서 p=0.306).

본 발명자들은 외래 bFGF를 가지는 HPC 지지세포에서와 같은 효과로 외래 bFGF를 가지지 않는 HPC 지지세포에 대한 H1 및 HSF6 hESCs의 콜로니을 증식할 수 있었다.

인 비트로 배양 동안에 hESCs 의 염색체 안정성 및 미분화 상태

MEF 지지세포에 대한 hESCs (H1 및 HSF6)의 콜로니을 유지하기 위해서는 외래 bFGF가 필요하였다. 외래 bFGF가 없으면, hESCs의 콜로니가 얇아지고 8^th 또는 11^th 계대에서 지지세포로부터 분리되었다(도 3 A,B,I,J).

그러나 HPC 지지세포 상에서, hESC 콜로니는 외래 bFGF와 무관하게 잘 유지되었고 형태학적으로도 외래 bFGF 공급된 군(+bFGF) 및 외래 bFGF 미공급 군(-bFGF) 사이에 커다란 차이가 없었다(도 3 C,D,K,L).

MEF 지지세포 상에서, hESC 콜로니는 외래 bFGF의 존재에서만 ALP를 강하게 발현하였다(도 3 E,F,M,N). 반대로 hESC 콜로니들은 외래 bFGF와 무관하게 HPC 지지세포 상에서는 강하게 ALP를 발현하였다(도 3 G,H,O,P). Oct-4, SSEA-4, 및 TRA-60와 같은 줄기세포성 마커들에 대한 면역조직화학 염색은 외래 bFGF를 가지는 MEF 지지세포 상에서 hESCs의 잘 보존된 줄기세포성 마커들을 나타내었다(도시 안 함).

HPC 지지세포 상에서, hESCs의 잘 보존된 줄기세포성 마커들은 장 기간 유지에서 외래 bFGF와 무관하게 동정되었다 (도 4). 줄기세포성(Stemness)은 또한 Oct-4, Nanog, 및 Rex-1에 대한 RT-PCR을 통하여 매 10번째 계대마다 측정하였다.

이들 마커들의 발현은 bFGF를 가지는 MEF상에서 인간배아줄기세포에서는 동정되었다.

HPC 지지세포 상에서, 이들 줄기세포성 마커들의 발현은 외래 bFGF를 가지고 배양된 hESCs에서와 유사하게 외래 bFGF 없이 배양된 hESCs에서도 동정되었다(도시 안 함).

따라서 외래 bFGF의 부존재는 HPC 지지세포 상에서 배양된 hESCs에서의 줄기세포성 유전자의 발현에 영향을 주지 못하였다. 매 10번째 계대에서 hESC 핵형(karyotype)의 결정은 외래 bFGF를 가지는 MEF(H1/MEF/+bFGF, HSF6/MEF/+bFGF) 및 모든 HPC 군들(H1/HPC/±bFGF, HSF6/HPC/±bFGF)의 H1 및 HSF-6 hESCs에서 핵형 비정상성을 나타내지 않았다(도시 안 함).

계열- 특이전 마커들의 동정 및 EB 형성

EB 형성의 효율은 시드된 ESC 콜로니 당 형성된 EBs의 퍼센트에 의하여 계산되었다. MEF 지지세포 상에서 배양된 hESCs로부터 유래된 형성된 EB의 평균 퍼세텐지는 각각 H1/MEF/+bFGF 군에서 79.1±3.2%이고 HSF6/MEF/+bFGF 군에서는 82.7±2.5%이었다. HPC 지지세포 상에서 배양된 hESCs로부터 유래된 형성된 EB의 평균 퍼세텐지는 각각 H1/HPC/+bFGF 군에서는75.3±5.6%이었고, H1/HPC/-bFGF 군에서는 77.1±2.6%이었으며, HSF6/HPC/+bFGF 군에서는 81.6±1.6% 이었고, HSF6/HPC/-bFGF 군에서는 80.6±3.6%이었다. HPC 지지세포 군에서, +bFGF 및 -bFGF 군 사이에서 EB 형성 효율의 큰 차이는 없었다.

다른 말로, 외래 bFGF의 부존재는 HPC 상에서 배양된 EB 형성 효율에 영향을 미치지 못하였다. 형성된 EB 내에 삼배엽층의 존재는 RT-PCR에 의하여 동정하였다. Sox-1, Brachyury, 및 AFP의 발현은 모든 HPC 군으로부터 유래된 형성된 EB내에서 나타났고, 이것은 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 존재를 나타낸다(도 5). 유사하게 외래 bFGF의 부존재는 HPC 상에서 배양된 hESCs로부터 형성된 EB의 분화 능력에 영향을 미치지 못하였다.

hESC 및 HPC 모두에서 bFGF의 발현 및 분비

상기 언급한 바와 같이, 외래 bFGF는 MEF 지지세포 상 hESCs의 미분화 상태를 유지하는데는 필요하지만 HPC 지지세포 상에서 hESCs는 외래 bFGF없이 미분화상태로 증식될 수 있다. hESCs의 성장 및 분화에 영향을 줄 수 있는 MEF 및 HPC 지지세포 사이의 생물학적 차이를 조사하기 위하여 본 발명자들은 지지세포에서 bFGF에 대한 RT-PCR를 수행하였다. 이것은 HPC는 bFGF를 발현하였지만 MEF는 발현하지 못하는 것을 나타내었다(도 6A). 외래 bFGF를 가지는 MEF 지지세포 상의 hESCs(H1/MEF/+bFGF, HSF6/MEF/+bFGF)에서, bFGF는 RT-PCR 분석에 의해서도 동정되었다.

또한 HPC 상에서 배양된 모든 hESCs는 외래 bFGF와 무관하게 bFGF 발현을 나타내었다(도 6B). H1 hESCs에서, H1/HPC/+bFGF 군의 평균 bFGF 발현은 H1/MEF/+bFGF 군의 발현과 비교하여서 2.01±0.24 배 더 높았고(p=0.008) H1/HPC/-bFGF의 평균 bFGF 발현은 H1/MEF/+bFGF의 것과 큰 차이가 없었다(p=0.690) (도 6C). 이러한 경향은 HSF6 hESCs에서도 관찰되었다(도 6D). 분비된 bFGF의 정량화를 위하여, 본 발명자들은 H1 hESCs의 상청액들에서 ELISA를 수행하였다. 상청액에서 수행된 ELISA는 트랜스퍼 전 즉, 48시간 동안 H1 hESCs 및 지지세포로 조건화된 상청액에서 수행되었다. 평균 농도는 H1/MEF/+bFGF 군에서 0.07±0.15 ng/mL, H1/HPC/-bFGF 군에서 0.14±0.06 ng/mL 그리고 H1/HPC/+bFGF 군에서 0.28±0.09 ng/mL이었다. 이들 군들 사이에서 큰 차이가 없었다(p=0.157) (도 6E).

bFGF 에 의한 hESCs 에서 ERK 1/2의 활성화

hESCs에서 bFGF가 MEK/ERK1/2 경로를 활성화한다는 보고가 있다(Dvorak P, Dvorakova D, Koskova S, et al. Expression and potential role of fibroblast growth factor 2 and its receptors in human embryonic stem cells. Stem Cells. 2005;23:1200-1211;Kang HB, Kim JS, Kwon HJ, et al. Basic fibroblast growth factor activates ERK and induces c-fos in human embryonic stem cell line MizhES1. Stem Cells Dev. 2005;14:395-401).

인산화된 ERK1/2 (pERK1/2)에 대한 웨스턴 블럿 분석에 의하여, 본 발명자들은 외래 bFGF로 배양된 hESCs (H1/MEF/+bFGF, HSF6/MEF/+bFGF, H1/HPC/+bFGF, HSF6/HPC/+bFGF)에서 이것을 동정하였다(도 7, 왼쪽 패널, A,B). 흥미롭게도 본 발명자들은 외래 bFGF가 없는 HPC 지지세포 상에서 배양된 hESCs(H1/HPC/-bFGF, HSF6/HPC/-bFGF)에서도 활성화되었다(도 7 왼쪽 패널, A,B). 그러나 ERK 경로의 활성화 정도는 군들 사이에서 큰 차이가 있었다(도 7, 오른쪽 패널)

초기 전사 인자: c- fos , c- jun 의 유도

c-fos 유전자가 hESCs에서 bFGF의 ERK 활성화에 의하여 유도되는 것으로 알려졌다(Kang HB, Kim JS, Kwon HJ, et al. Basic fibroblast growth factor activates ERK and induces c-fos in human embryonic stem cell line MizhES1. Stem Cells Dev. 2005;14:395-401). C-jun은 또한 c-fos와 결합하여서 초기 전사 인자를 형성하는 것으로 알려졌다(Marx JL. jun Is bustin' out all over. Science. 1988;242:1377-1378).

본 발명자들은 RT-PCR에 의한 이들 유전자들의 유도를 측정하였다. 외래 bFGF로 배양된 hESCs (H1/MEF/+bFGF, HSF6/MEF/+bFGF, H1/HPC/+bFGF, HSF6/HPC/+bFGF)에서, 이들 초기 전사 인자의 유도는 동정되었다(도 7 D,E). 또한 외래 bFGF가 없는 HPC 지지세포 상에서 배양된 hESCs에서도 이들 유전자들의 유도가 동정되었다(도 7 D,E)

도 1은 본 발명의 개요를 나타낸다. 샘플을 hESC 세포주 및 지지세포 타입 및 외부 bFGF의 존재 또는 부존재에 따라서 그룹화하였다; H1/MEF/±bFGF, HSF6/HPC/±bFGF, H1/HPC/±bFGF, HSF6/HPC/±bFGF. 약어: ESC, 배아 줄기세포. MEF, 마우스 배아 줄기 섬유세포; HPC, 인간 태반-유래 섬유세포-유사세포; bFGF, 염기성 섬유세포 성장인자; +bFGF, 외부에서 bFGF가 제공된; -bFGF, 외부에서 bFGF가 제공되지 않은.

도 2는 계대에서 각 지지세포 상 hESC의 콜로니 카운트의 결과이다. (A) : MEF 지지세포 상에서, 평균 콜로니 카운트가 배양 배지에 bFGF의 존재 또는 부존재에 따라서 H1 및 HSF6 hESC 모두에서 현저하게 차이가 있었다. (B) : H1 및 HSF6 hESC 모두의 콜로니들은 bFGF가 없는 MEF feeder에서는 유지될 수 없었다. (C) : HPC feeder 상에서, bFGF가 없는 군들의 평균 콜로니 카운트가 H1 및 HSF6 hESC 모두에서 배양 배지에 bFGF의 존재를 가지는 군들의 콜로니 카운트와 큰 차이가 없었다. (D) : H1 및 HSF6 hESC 모두의 콜로니들은 bFGF가 존재하거나 존재하지 않거나에 불구하고 HPC feeder에서는 유지될 수 있었다.

도 3은 (A-D, I-L): 모든 feeder 상에서 H1 및 HSF6 hESC의 콜로니들의 형태. (E-H, M-P): 모든 feeder 상에서 콜로니들의 ALP 염색의 결과이다. MEF feeder 상에서, H1 및 HSF6 모두의 대부분의 hESC의 콜로니들은 bFGF가 부존재한 경우에는 8~9 계대에서 떨어졌다(B,F, J,N). 그러나, HPC feeder 상에서, H1 및 HSF6 양쪽 모두의 콜로니는 bFGF가 부존재한 경우에 50 계대에서 유지될 수 있었다(D, H, L, P). 배율(A-P): X40. B, F, J, N를 제외한 모든 사진은 50 계대에서; (B, F)는 8 계대에서, (J, N)는 11 계대에서 촬영하였다.

도 4는 HPC 군에서 줄기세포성 마커에 대한 면역염색 결과를 나타낸다. (A-D): Oct-4, (E-H): SSEA-4, (I-L) : TRA-60. HPC feeder 상에서, 줄기세포성 마커들은 외부 bFGF와 무관하게 H1(B,F,J) 및 HSF6(D,H,L) hESCs 모두에서 잘 보존되었다. 모든 사진은 50계대에서 촬영하였다.

도 5는 HPC 상에서 배양된 hESCs에서 유래된 배아체(EBs)에서 계열-특이적인 마커들에 대한 RT-PCR 분석을 나타내는 그림이다. 모든 삼배엽층(three germ-layer) 특이적인 마커들은 외부 bFGF가 없는 HPC상에서 hESCs에서 유래된 배아체(EBs)에서 잘 동정되었다(lane ②, ④).

도 6(A) : bFGF가 HPC 내에서는 발현되고, MEF에서는 발현되지 않음 (B) : 외부 bFGF를 가지는 MEF feeder 상 hESCs는 bFGF를 발현한다. HPC feeder 상에서, 외부 bFGF와 무관하게 hESCs는 bFGF를 발현한다(C-D) : H1 및 HSF6에서 bFGF의 RQ-PCR 결과, H1 hESCs (C)에서, H1/HPC/+bFGF 군의 bFGF의 평균 발현은 H1/MEF/+bFGF 군의 것보다 현저하게 더 높다(p=0.008). H1/HPC/-bFGF의 평균 발현은 크게 다르지 않았다(p=0.690). 이러한 경향은 HSF6 hESCs에서도 관찰되었다(D). (E) : hESC 및 지지 세포들에 대해 조건화된 상청액에서 bFGF의 평균 농도가 왼쪽에서 오른쪽 컬럼으로 증가하는 경향을 가지었지만(H1/MEF/+bFGF < H1/HPC/-bFGf < H1/HPC/+bFGF), 이들 군 사이에서는 큰 차이가 없었다 (p=0.157)

도 7 왼쪽 패널: feeder 타입 또는 외부 bFGF의 존재 또는 부존재에 따른 hESC에서 면역블럿(A-C) 및 RT-PCR (D-F)의 결과이다. 외부 bFGF를 가지는 MEF를 사용하는 표준 배양 조건에서, hESC에 대하여 외부 bFGF의 작용은 MEK/ERK1/2 신호전달 경로에 의하여 매개된다(A, lane①,②). 이것은 초기 반응 전사인자(c-fos, c-jun)의 유도를 매개한다(D, E, lane①,②). 이들 ERK1/2-c-fos-c-jun 경로는 외부 bFGF와 무관하게 HPC feeder 상 H1 및 HSF6 hESCs 양쪽 모두에서도 관찰되었다(A,D,E lane③,④,⑤,⑥). 오른쪽 패널: 각 그룹에서 ERK 활성화의 정도는 현저한 차이를 나타내었다(p=0.003). 약어: pERK1/2, 인산화된 ERK1/2.

<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> A CULTURE METHOD OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELL USING A HUMAN PLACENTA-DERIVED FEEDER CELL AND A CULTURE MEDIA THEREOF <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cgaccatctg ccgctttgag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ccccctgtcc cccattccta 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aaagaatctt cacctatgcc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gaaggaagag gagagacagt 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cagatcctaa acagctcgca gaat 24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcgtacgcaa attaaagtcc aga 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cacaactcgg agatcagcaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggtacttgta atccgggtgc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aattggtcca gccttggaat 20 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cgttgctcac agaccaca 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 agaacctgtc acaagctgtg 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gacagaagct gaggatgtc 19 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ggcttcttcc tgcgcatcca gcatcca 27 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gctcttagca gacattggaa ga 22 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gaataagatg gctgcagcca aatgccgcaa 30 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cagtcagatc aagggaagcc acagacatct 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ggaaacgacc ttctatgacg atgccctcaa 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gaacccctcc tgctcatctg tcacgttctt 30

Claims

인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법에 있어서,

지지세포(feeder cell)로 인간 태반-유래 세포(HPC)를 사용하고,

인간 배아 줄기세포를 상기 지지세포 상으로 트랜스퍼하여 섬유세포 성장인자(FGF)를 공급하지 아니하고 50계대 이상까지 인간배아줄기세포를 증식시키는 인간 배아 줄기 세포 배양방법.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 인간 태반-유래 세포(HPC)는 인간 태반-유래 섬유세포-유사세포인 것을 특징으로 하는 인간 배아 줄기 세포 배양방법.
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 섬유세포 성장인자(FGF)는 염기성 섬유세포 성장인자(bFGF)인 인간 배아 줄기 세포 배양방법.
제 1항에 있어서, 상기 배양 배지는 혈청대체물 (SR), 머캅토에탄올, 비-필수 아미노산, 및 항생물질로 구성된 인간 배아 줄기 세포 배양방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제