WO2016027842A1 - 幹細胞の分化状態の判定方法及びこれに用いられる新規な分化マーカー - Google Patents

幹細胞の分化状態の判定方法及びこれに用いられる新規な分化マーカー Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a novel differentiation marker that can determine the differentiation state of stem cells at an early stage of differentiation.
  • Pluripotent stem cells such as ES cells (Embryonic ES Stem cells) and iPS cells (Induced Pluripoent Stem Cells, induced pluripotent stem cells) are co-cultured with feeder cells, for example, to maintain their pluripotency Culturing in a feeder-derived conditioned medium (CM), adding basic FGF (bFGF / FGF2, basic Fibroblast Growth Factor, basic fibroblast growth factor) or LIF (leukemia inhibitor factor) to the medium is required. Otherwise, it may lose its pluripotency due to the environment and cell condition and easily differentiate. Therefore, it is important to accurately know the undifferentiated state (state having pluripotency) and the differentiated state of stem cells.
  • CM feeder-derived conditioned medium
  • basic FGF basic Fibroblast Growth Factor
  • LIF leukemia inhibitor factor
  • transplantation is performed after differentiating pluripotent stem cells into target cells. If the cells to be transplanted contain undifferentiated cells, this may cause tumor formation. There is a risk of becoming. Therefore, a technique for determining whether or not undifferentiated stem cells are mixed in differentiation-induced pluripotent stem cells is important.
  • pluripotent stem cells As a method of determining the differentiation state of pluripotent stem cells, a method of detecting a marker that is an indicator of the differentiation state has been performed.
  • Alkaline Phosphatase, Nanog, Oct4, TRA-1-60, Sox, LIF-R and the like are known as pluripotent markers of pluripotent stem cells. Since pluripotent stem cells express these markers in an undifferentiated state, it is possible to determine whether or not the stem cells maintain an undifferentiated state by detecting these markers. However, the differentiation state of these markers cannot be determined unless the stem cells are differentiated to some extent (for example, up to one of the three germ layers). Therefore, it is difficult to determine whether the undifferentiated cells maintain their undifferentiated state (pluripotency) or have acquired the ability to differentiate in the future at the initial stage of differentiation after differentiation induction. there were.
  • Non-patent Document 1 a group of transcription factors having a forkhead or winged helix DNA binding domain called Fox (Forkhead box) is known (Non-patent Document 1), and it is known that there are about 50 types in humans. (FOXB1, FOXB2, etc.). Fox proteins are known to function mainly as developmental regulators, tissue-specific regulators, and cell cycle regulators, but some of the actions have not been elucidated.
  • An object of the present invention is to provide a method capable of determining the differentiation state of undifferentiated stem cells at an early stage of differentiation.
  • the present invention has been made for the purpose of solving the above-described problems, and has the following configuration.
  • (1) A method for determining the differentiation state of a cell, wherein the expression of a FOXB2 gene in a stem cell is detected and a determination is made based on the result.
  • (2) A differentiation marker selected from mRNA or protein derived from FOXB2 gene.
  • undifferentiated cells such as ES cells and iPS cells are cultured in a medium supplemented with basic FGF (bFGF, FGF2, basic Fibroblast Growth Factor, basic fibroblast growth factor)
  • bFGF basic Fibroblast Growth Factor
  • basic fibroblast growth factor basic FGF
  • iPS cells are cultured in a bFGF-free medium (differentiation induction treatment), and FOXB2 mRNA expression of iPS cells is detected 3 to 5 days after the start of the culture. Moreover, the phenomenon that the expression level is remarkably increased was confirmed. It was also confirmed that FOXB2 mRNA expression was not confirmed in iPS cells cultured in a medium supplemented with bFGF and maintained in an undifferentiated state. From the above, it has been found that FOXB2 mRNA is useful as a differentiation marker for ES cells and iPS cells, and by measuring its expression, cells at an early stage of differentiation can be selected. It came to complete.
  • the differentiation state of stem cells can be determined at the initial stage of differentiation.
  • the present invention can also be applied to stem cell quality control and differentiated cell preparation / isolation methods. Furthermore, since the present invention can determine differentiated cells at the early stage of culture, it is useful for early screening of cells and quality control of stem cells, and can be expected to shorten the culture period and reduce the cost of the medium.
  • FIG. 2 is an electrophoretogram showing the results of detection of FOXB2 mRNA expression in hiPS cells obtained by Example 1 by RT-PCR.
  • FIG. 1 (1) shows the result of detecting the expression of FOXB2 mRNA
  • (2) shows the result of detecting the expression of GAPDH mRNA
  • (3) shows the result of detecting the expression of OCT3 / 4 mRNA
  • (4 ) Shows the result of detecting the expression of NANOG mRNA
  • (5) shows the result of detecting the expression of SOX2 mRNA.
  • It is an electrophoretic diagram which shows the result of having examined the expression of FOXB2 mRNA obtained in Example 2 by RT-PCR method.
  • FIG. 5 is a photograph of hiPS cells cultured in a bFGF-free medium obtained in Reference Example 1 (FIG. 5 (1)) and a photograph of hiPS cells cultured in a bFGF-added medium (FIG. 5 (2)).
  • the stem cells according to the present invention include cells having so-called self-renewal ability and differentiation ability capable of differentiating into various cells.
  • ES cells and iPS cells which are undifferentiated cells with pluripotency (pluripotency), ntES cells (nuclear transfer Membryonic cell Stem Cell), EG cells (Embryonic cell, embryonic germ cells), EC cells (Embryonic Cell, embryonic cancer stem cell) and the like.
  • stem cell-derived animals include mammals such as humans, cows, horses, dogs, guinea pigs, mice, and rats.
  • Stem cells which are test cells used in the method for determining the differentiation state of cells of the present invention, include stem cells that have been subjected to a known differentiation-inducing treatment, stem cells that have been treated to maintain an undifferentiated state, and known pluripotency Examples include somatic cells that have been subjected to sex induction treatment and have been dedifferentiated.
  • the method for inducing differentiation of undifferentiated stem cells may be any method known per se and is not particularly limited.
  • a method of culturing cells after treating them with a known differentiation inducer a method of culturing undifferentiated stem cells in an environment in which differentiation is induced, such as culturing in a medium not containing bFGF or LIF, and the like can be mentioned.
  • Examples of chemical substances that induce differentiation of undifferentiated stem cells include, for example, retinoic acid that induces differentiation into neurons, spermine that induces differentiation into cardiomyocytes, and sodium butyrate ( Sodium-Butyrate), Trichostatin A (Trichostatin A), DNA methyltransferase inhibitors that induce differentiation of mouse ES cells into insulin-producing cells (DNA-Methyltransferase Inhibitor), and the like are known.
  • Undifferentiated state means, for example, that a cell is in a state having the above-described self-renewal ability and differentiation ability capable of differentiating into various cells.
  • the “treatment for maintaining the undifferentiated state” may be any known process for maintaining the undifferentiated state of stem cells, for example, co-culture with feeder cells, addition of bFGF or LIF into the medium, etc. Can be mentioned.
  • the FOXB2 gene means a gene DNA, RNA or the like encoding a FOXB2 protein present in an animal species from which a cell subjected to determination is derived. Also included are genes encoding homologues, mutants, and derivatives of the FOXB2 protein. Furthermore, the base sequence that hybridizes with these genes under stringent conditions and the gene containing the same, and the FOXB2 gene have a sequence homology of 70%, preferably 80%, more preferably 95%, and even more preferably 97% or more. A gene having a nucleotide sequence having sex is also included.
  • the human FOXB2 gene has a gene corresponding to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (base sequence of human FOXB2 mRNA) and the base sequence encoding the protein represented by SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 1 base sequence of human FOXB2 mRNA
  • SEQ ID NO: 2 base sequence of human FOXB2 mRNA
  • examples thereof include genes or genes having a sequence homology of 70%, preferably 80%, more preferably 95%, and still more preferably 97% or more with these base sequences.
  • mouse Foxb2 gene a gene corresponding to the base sequence represented by SEQ ID NO: 34 (base sequence of mouse Foxb2 mRNA), a gene having a base sequence encoding the protein represented by SEQ ID NO: 35, or these Examples thereof include genes having a base sequence having 70%, preferably 80%, more preferably 95%, and still more preferably 97% or more sequence homology with the base sequence.
  • FOXB2 mRNA examples include mRNA transcribed from the FOXB2 gene present in the animal species from which the cells subjected to determination are derived, for example, the mRNA derived from the FOXB2 gene described above.
  • mRNA derived from the FOXB2 gene examples include the following as human FOXB2 mRNA.
  • -MRNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 GenBank Accession No. NM_001013735
  • -MRNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • MRNA encoding an amino acid sequence in which 1 to several, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 have been deleted, inserted, added or substituted
  • An mRNA encoding an amino acid sequence having 70%, preferably 80%, more preferably 95%, and still more preferably 97% or more sequence homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • mouse Foxb2 mRNA includes the following. -MRNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 34 (GenBank Accession No. NM_008023) -MRNA having a base sequence having a sequence homology of 70%, preferably 80%, more preferably 95%, and even more preferably 97% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 34 -MRNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35 -MRNA encoding an amino acid sequence in which 1 to several, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35 have been deleted, inserted, added or substituted -MRNA encoding an amino acid sequence having a sequence homology of 70%, preferably 80%, more preferably 95%, even more preferably 97% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the FOXB2 protein according to the present invention includes a protein translated from the FOXB2 gene present in the animal species from which the cells to be subjected to determination are derived. Such homologues, mutants, and derivatives of FOXB2 protein may be used.
  • human FOXB2 protein examples include the following.
  • mouse FOXB2 protein examples include the following.
  • the method for determining the differentiation state of a cell of the present invention is “a method for determining the differentiation state of a cell, wherein the expression of a FOXB2 gene in a stem cell is detected and a determination is made based on the result”.
  • Method for detecting FOXB2 gene expression examples include a method for detecting FOXB2 mRNA expression, and a method for detecting FOXB2 protein expression.
  • detecting expression refers to “detecting whether FOXB2 gene is expressed (for example, the presence or absence of FOXB2 mRNA or FOXB2 protein)” and “amount of FOXB2 gene expressed (for example, FOXB2). the amount of mRNA or the amount of FOXB2 protein is measured.
  • Detection of the expression of the FOXB2 gene is performed after the test cells after differentiation induction treatment express FOXB2 mRNA or FOXB2 protein to a level that can be detected. Specifically, after subjecting a test cell to differentiation induction, the upper limit is within 7 days, preferably within 6 days, more preferably within 5 days, and the lower limit is over 1 day, preferably over 2 days, more preferably over 3 days. After culturing as described above, cells may be collected and the following expression of FOXB2 gene may be detected. During this time, cells may be collected daily to detect the expression of the FOXB2 gene.
  • the method for detecting the expression of FOXB2 mRNA is not particularly limited as long as it is a method for detecting mRNA per se, and may be appropriately selected from known methods.
  • RT-PCR reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
  • real-time RT-PCR competitive PCR
  • competitive PCR in situ PCR
  • DNA array method DNA array method
  • Northern hybridization Northern hybridization
  • FISH method dot blot method
  • RNase protection assay method RT-LAMP method
  • SmartFlare that uses a complementary strand (capture strand) for target RNA bound to gold nanoparticles and a reporter strand that is the complementary strand of the capture strand TM method
  • detection method using two types of fluorescent probes Reduction-triggered Fluorescence activation probe, RETF probe
  • detection method using aromatic nucleophilic substitution reaction (complementary to target RNA) CNs-AMCA modified with aminocoumarin protected with 2-cyano-4-nitrobenzenesulfonyl group bound to various DNAs Lobe and, a method of a method) or the like using the MBA probe modified with thiophenol group attached the DNA complementary to the target RNA.
  • RT-PCR method is a method in which a target FOXB2 gene (for example, FOXB2 mRNA) is used as a template, cDNA is synthesized by reverse transcription, and then amplified by PCR [Kawasaki, ES, et al In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc., San Diego, 21-27 (1991)].
  • the conditions for the reverse transcription reaction and the DNA amplification reaction are not particularly limited, and optimum conditions can be adopted as appropriate.
  • the amplification region of the target gene (for example, FOXB2 mRNA) does not necessarily have the full length, and may be a partial region of the gene as long as there is no problem in confirming the amplification product.
  • the amplified cDNA amount (corresponding to the amount of mRNA) may be detected, for example, by subjecting the DNA amplification reaction solution to electrophoresis and using a probe that specifically hybridizes to the target amplified fragment.
  • mRNA is first extracted and separated from a test cell by a known method.
  • RT-PCR was performed using the mRNA obtained above as a template, and complementary to FOXB2 mRNA or a partial region thereof.
  • cDNA single-stranded DNA
  • the presence or amount of FOXB2 mRNA in the cell can be detected by detecting the presence or absence (amount) of the amplified product (cDNA).
  • amplification primer used above examples include, for example, a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 when detecting human FOXB2 mRNA.
  • a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 37 can be mentioned.
  • the nucleic acid amplification reaction When the nucleic acid amplification reaction is performed using the cDNA amplified by the above method as a template, it may be performed by a real-time amplification detection method.
  • An example of the detection method by the real-time amplification detection method is a real-time PCR detection method.
  • Examples of the real-time PCR detection method include a normal intercalator method for performing real-time PCR using an intercalator (eg, SYBR TM Green I), a TaqMan TM real-time PCR method, an MGB Eclipse Probe System method, a Molecular Beacons Probe Technology method, Examples include, but are not limited to, the LUX Fluorogenic Primer method, the Quenching probe-PCR (QP) method, and the cycling probe method.
  • an intercalator eg, SYBR TM Green I
  • TaqMan TM real-time PCR method e.g., MGB Eclipse Probe System method
  • MGB Eclipse Probe System method e.g., MGB Eclipse Probe System method
  • Molecular Beacons Probe Technology method examples include, but are not limited to, the LUX Fluorogenic Primer method, the Quenching probe-PCR (QP) method, and the cycling probe method.
  • the “primer pair prepared so that the FOXB2 mRNA target region can be amplified” used in the above PCR is a primer pair that amplifies the base sequence of FOXB2 mRNA or a specific region (partial sequence) thereof. Is mentioned.
  • Examples of such a primer pair include a primer pair that amplifies human FOXB2 mRNA (base sequence represented by SEQ ID NO: 1) or a specific region (partial sequence) thereof. Specifically, for example, when targeting the 179 bp region (SEQ ID NO: 3) at positions 45 to 223 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, a primer and a sequence having the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 The primer pair of the primer which has a base sequence represented by number 10 is mentioned.
  • a primer pair that amplifies mouse Foxb2 mRNA (base sequence represented by SEQ ID NO: 34) or a specific region (partial sequence) thereof is also included.
  • the primer and sequence having the base sequence represented by SEQ ID NO: 45 The primer pair of the primer which has a base sequence represented by number 46 is mentioned.
  • a specific example of a method for detecting human FOXB2 mRNA by RT-PCR is as follows.
  • FOXB2 mRNA amplification primer for example, primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4
  • 1 ⁇ L of FOXB2 mRNA amplification primer 1 ⁇ L to total RNA 500 ng to 10 ⁇ g extracted from test cells and treated with DNase, 65-80 ° C, 2-5 minutes
  • the reverse transcription reaction is carried out by incubating at 37-50 ° C. for 20-60 minutes. Thereafter, the obtained cDNA is recovered by a conventional method.
  • forward primer for example, a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 9
  • reverse primer for example, primer having the base sequence of SEQ ID NO: 10.
  • a reaction of 94 ° C. for 2 minutes, 98 ° C. for 10 seconds ⁇ 56 ° C. for 20 seconds ⁇ 68 ° C. for 30 seconds is performed for about 28 to 30 cycles.
  • the amplified product is detected and analyzed by electrophoresis, for example, to detect FOXB2 mRNA.
  • an intercalator eg, SYBR TM Green I
  • a polymerase such as Taq DNA polymerase is used.
  • the amplification product is detected and analyzed by measuring the fluorescence intensity of the intercalator that intercalates in correlation with the amplification amount of the amplification product, and FOXB2 mRNA is detected.
  • capillary electrophoresis J. Chromatogr. 593 253-258 (1992), Anal. Chem. 64 1926-1932 (1992), WO2007 / 027495, etc.
  • capillary chip electrophoresis After collecting the cDNA, a signal derived from the labeled PCR amplification product separated by capillary chip electrophoresis may be detected by a detector using a primer or intercalator labeled with a labeling substance such as a fluorescent substance.
  • the detector may be made by a device such as a differential refraction detector, a fluorescence detector, a UV detector, etc. Among them, a UV detector and a fluorescence detector are preferable, and a fluorescence detector is more preferable.
  • a device such as a differential refraction detector, a fluorescence detector, a UV detector, etc.
  • a UV detector and a fluorescence detector are preferable, and a fluorescence detector is more preferable.
  • an automatic immunoanalyzer such as LiBASys (manufactured by Shimadzu Corporation) is used, operations from PCR to electrophoresis can be performed in real time.
  • a method for detecting FOXB2 mRNA by Northern hybridization method for example, mRNA extracted / separated from a test cell is immobilized on an appropriate carrier, and a base sequence complementary to FOXB2 mRNA is prepared. Examples include a method of detecting FOXB2 mRNA in a test cell by performing hybridization with a labeled probe (may be cDNA) and detecting the degree thereof.
  • the probe used here may be composed of the entire complementary sequence of the base sequence of FOXB2 mRNA or may be composed of a part of the base sequence. Further, a microarray or DNA chip on which the probe is immobilized can also be used for this detection method.
  • the reagents used in the method for detecting FOXB2 mRNA according to the present invention include reagents usually used in this field, such as buffers, stabilizers, preservatives, etc. Those that do not inhibit the property and do not inhibit the nucleic acid amplification reaction such as PCR or the hybridization reaction can be used. In addition, the concentration may be appropriately selected from a concentration range usually used in this field.
  • buffer solutions include, for example, when performing nucleic acid amplification reactions and hybridization reactions such as normal PCR, such as Tris buffer solution, phosphate buffer solution, veronal buffer solution, borate buffer solution, Good buffer solution, etc. All the buffers used are mentioned.
  • the pH is not particularly limited, and examples thereof include a range of 5 to 9.
  • a nucleic acid synthase DNA polymerase, RNA polymerase, reverse transcriptase, etc.
  • a substrate dNTP, rNTP, etc.
  • a double-stranded intercalator ethidium bromide, SYBR TM Green, etc.
  • Labeled detection substances such as FAM and TAMRA are used.
  • FOXB2 mRNA can be detected without destroying the test cells.
  • the technique can be used to detect FOXB2 protein in the nucleus without destroying cells.
  • the nuclear membrane of the test cell is partially solubilized using a buffer containing a surfactant such as Triton TM , NP-40, Tween 20 TM , Saponin, Digitonin TM , Leucoperm TM .
  • a surfactant such as Triton TM , NP-40, Tween 20 TM , Saponin, Digitonin TM , Leucoperm TM .
  • the nuclear protein is stained with an anti-FOXB2 antibody labeled with a fluorescent substance or the like, the FOXB2 protein in the nucleus can be detected.
  • FOXB2 protein may be detected by staining the nuclear FOXB2 protein using these commercially available reagents.
  • FOXB2 protein can also be detected by the following method for destroying cells.
  • test cell culture is subjected to conventional methods such as filtration or centrifugation, and the cells or cells are collected and suspended in an appropriate buffer.
  • conventional methods such as filtration or centrifugation, and the cells or cells are collected and suspended in an appropriate buffer.
  • surfactant treatment for example, surfactant treatment, ultrasonic treatment, lysozyme treatment, freeze-thawing, etc.
  • an extract containing FOXB2 protein is obtained by methods such as centrifugation and filtration.
  • the FOXB2 protein in the obtained extract may be detected by a method known per se for detecting a protein.
  • Methods for detecting FOXB2 protein in the extract include, for example, so-called enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA) using a substance having affinity for FOXB2 protein (eg, antibody),
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • known immunological measurement methods such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescence immunoassay (FIA), Western blotting, immunohistochemistry, antibody array method, measurement method by simple immunochromatography, etc.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • FFA fluorescence immunoassay
  • Western blotting immunohistochemistry
  • antibody array method measurement method by simple immunochromatography, etc.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • electrophoresis capillary electrophoresis
  • capillary chip electrophoresis and the like
  • Examples of the measurement principle include, but are not limited to, a sandwich method, a competitive method, a two
  • FOXB2 protein may be detected by a measurement method according to an immunoagglutination method such as an immunoratio method or an immunoturbidimetric method. These detection methods may be performed according to a method known per se.
  • the antibody against FOXB2 protein (anti-FOXB2 antibody) used to detect FOXB2 protein may be any antibody that can recognize FOXB2 protein, its partial peptide, or salts thereof. There is no particular limitation.
  • any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody may be used, and these may be used alone or in appropriate combination.
  • these antibodies may be used as F (ab ′) 2 , Fab ′, or Fab after digestion with an enzyme such as pepsin or papain, if necessary.
  • a commercially available antibody against FOXB2 protein can also be used.
  • the antibody may be labeled with a labeling substance.
  • labeling substances used for labeling include alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, peroxidase, microperoxidase, glucose oxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, acetylcholinesterase used in EIA (ELISA), Enzymes such as malate dehydrogenase and luciferase, for example, radioactive isotopes such as 99m Tc, 131 I, 125 I, 14 C and 3 H used in RIA, such as fluorescein, dansyl and fluorescamine used in FIA, Fluorescent substances such as coumarin, naphthylamine or derivatives thereof, for example, luminescent substances such as luciferin, isoluminol, luminol, bis (2,4,6-trifluorophenyl) oxalate, such as phenol, naphthol, anthracene or
  • antibody against the FOXB2 protein examples include “an antibody against the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2” and “an antibody against the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35”.
  • the reagent used to detect the FOXB2 protein, the concentration at the time of detection, the measurement conditions for carrying out the detection, etc. (reaction temperature, reaction time, pH at the time of reaction, measurement wavelength, measuring device, etc.) May be set according to the measurement method of the above-mentioned immunological measurement method known per se, and any automatic analyzers, spectrophotometers, etc. that are usually used in this field are exceptions. Can be used without.
  • differentiated / differentiated or “differentiated state” means a state in which a cell is in an “early differentiation stage” state, “a state that has acquired differentiation ability to be differentiated in the future (differentiation induction)”, and “ This includes cases in any state of "differentiated”.
  • “differentiated / differentiated” or “differentiated state” means a state in which a cell is in an “early differentiation stage” state or “acquired differentiation ability to differentiate in the future (differentiation-induced)”. This is the case in either state.
  • the initial stage of differentiation means early after differentiation induction treatment, specifically, up to 7 days, preferably up to 6 days, more preferably 3 to 5 days after differentiation induction treatment. The time until.
  • the initial stage of differentiation refers to a stage before undifferentiated stem cells differentiate into one of the three germ layers, and an undifferentiated marker after differentiation induction treatment (eg, OCT3 / 4 , NANOG , SOX2, etc.). Including a stage before disappearance.
  • an undifferentiated marker after differentiation induction treatment eg, OCT3 / 4 , NANOG , SOX2, etc.
  • Examples of the differentiation state determination method of the present invention include the following methods.
  • Examples of the method of judging based on the result of detecting FOXB2 mRNA include the following methods. 1) When FOXB2 mRNA in a test cell is detected by the above method and FOXB2 mRNA is detected, it is determined that the test cell is differentiated.
  • FOXB2 mRNA of the test cell performs detection of FOXB2 mRNA of the test cell, to detect similarly FOXB2 mRNA with undifferentiated stem cells that are undifferentiated state as compared was confirmed.
  • the detected amount of FOXB2 mRNA of a test cell if greater than the detection of FOXB2 mRNA of undifferentiated stem cells to be compared is determined that the test cell is a state of differentiation, and.
  • whether many as compared with the detected amount of FOXB2 mRNA of undifferentiated stem cells detected amount of FOXB2 mRNA is compared in a test cell may be relatively determined by comparing the two.
  • Detection of FOXB2 mRNA of the test cell whether large compared to the detected amount of FOXB2 mRNA of undifferentiated stem cells to be compared, the detected amount of FOXB2 mRNA of a test cell, undifferentiated pre measured You may implement by comparing with the detection amount of FOXB2 mRNA of a stem cell.
  • the detected amount of FOXB2 mRNA of a test cell, if greater than the detection of FOXB2 mRNA of undifferentiated stem cells previously measured and determined its test cell is a state of differentiation, and.
  • a boundary value (cutoff value) that can be used to determine whether or not the test cell is differentiated is set in advance, and whether or not the test cell has a higher FOXB2 mRNA detection amount than the boundary value. You may judge the differentiation state. In this case, when the detected amount of FOXB2 mRNA in the test cell is higher than the cut-off value, it is determined that the test cell is in a differentiated state.
  • FOXB2 protein is similarly detected using undifferentiated stem cells that have been confirmed to be in an undifferentiated state as a comparison. Then, when the detected amount of FOXB2 protein in the test cell is larger than the detected amount of FOXB2 protein in the undifferentiated stem cell to be compared, it is determined that the test cell is in a differentiated state. At this time, whether the detected amount of FOXB2 protein in the test cell is larger than the detected amount of FOXB2 protein in the undifferentiated stem cell to be compared may be determined by comparing both.
  • the amount of FOXB2 protein detected in the undifferentiated stem cells measured in advance and whether the amount of FOXB2 protein detected in the test cells is higher than the amount detected in the undifferentiated stem cells to be compared You may implement by comparing with the detection amount of FOXB2 protein of a cell. When the detected amount of FOXB2 protein in the test cell is larger than the detected amount of FOXB2 protein in the undifferentiated stem cells measured in advance, the test cell is determined to be in a differentiated state.
  • a boundary value (cutoff value) that can be used to determine whether or not the test cell is differentiated is set in advance, and the test is performed depending on whether or not the detected amount of FOXB2 protein in the test cell is higher than the boundary value. You may judge the differentiation state of a test cell. In this case, when the detected amount of FOXB2 protein in the test cell is higher than the cutoff value, it is determined that the test cell is in a differentiated state.
  • the following method may be used.
  • Undifferentiated stem cells such as iPS cells or ES cells are subjected to differentiation induction treatment by a known method.
  • the upper limit after differentiation induction treatment is within 7 days, preferably within 6 days, more preferably within 5 days, and the lower limit is 1 day or more, preferably 2 days or more, more preferably 3 days or more, and then the cells are collected.
  • FOXB2 gene expression FOXB2 mRNA expression or FOXB2 protein expression
  • FOXB2 gene expression FOXB2 mRNA expression or FOXB2 protein expression
  • detection of FOXB2 gene expression in test cells detection of FOXB2 mRNA or FOXB2 protein
  • detection of FOXB2 gene expression using undifferentiated stem cells that have been confirmed to be undifferentiated as a comparison. I do.
  • the test cell Is determined to be in a differentiated state.
  • the detected amount of FOXB2 gene expression in undifferentiated stem cells was compared with the detected amount of FOXB2 gene expression in the test cell, and the FOXB2 gene in the test cell was compared.
  • the detected amount of expression is larger than the detected amount of FOXB2 gene expression in the undifferentiated stem cells to be compared, it is determined that the test cell is in a differentiated state.
  • a boundary value (cutoff value) that can be used to determine whether or not the test cell is differentiated is set in advance, and the detected amount of FOXB2 mRNA or the detected amount of FOXB2 protein in the test cell When higher than the value, it is determined that the test cell is in a differentiated state.
  • the differentiation state determination method of the present invention is applied to undifferentiated stem cells that have not been subjected to differentiation induction treatment, it can also be confirmed whether or not the undifferentiated stem cells maintain an undifferentiated state.
  • FOXB2 mRNA of the cells constituting the cell group is detected by the method of the present invention. If FOXB2 mRNA is detected, it is determined that there is a differentiated cell in the sample (the meaning of “differentiated state” is the same as described above; the same applies hereinafter), and if FOXB2 mRNA is not detected What is necessary is just to determine with the cell of the state differentiated to the sample not existing. Alternatively, the expression of FOXB2 protein is detected, and if FOXB2 protein is detected, it is determined that there is a differentiated cell in the sample, and if FOXB2 protein is not detected, the differentiated cell is detected in the sample. What is necessary is just to determine that it does not exist.
  • the method of the present invention can be applied to quality control of undifferentiated stem cells.
  • the medium does not contain, for example, a differentiation-inducing factor and maintains the undifferentiated state of undifferentiated cells.
  • the medium must be able to be cultured as it is. If the method for determining a differentiation state of the present invention is used, a quality inspection of such a medium can be performed.
  • the medium can be cultured while maintaining the undifferentiated state of the stem cells.
  • the medium is a medium that can be cultured while maintaining the undifferentiated state of the stem cells.
  • Differentiated cells can be prepared / isolated by applying the method of the present invention.
  • differentiated cells of anti-FOXB2 protein antibody labeled with a labeling substance according to “1) Method of detecting without destroying cells” described in “(2) Method of detecting FOXB2 protein expression” above.
  • Cells can be prepared and isolated by reacting with or expected to contain cells, and then separating and purifying only fluorescently labeled cells by a method such as flow cytometry.
  • undifferentiated stem cells can be prepared and isolated by separating and producing only cells that are not fluorescently labeled by a method such as flow cytometry in the same manner as described above.
  • the present invention can be applied to a method for confirming whether a substance has the ability to induce differentiation of undifferentiated stem cells.
  • the differentiation marker of the present invention examples include “a differentiation marker selected from mRNA or protein derived from FOXB2 gene”. Specifically, the differentiation marker of the present invention is a differentiation marker for stem cells. Specific examples of the stem cells are as described above.
  • FOXB2 gene-derived mRNA or protein examples include the FOXB2 mRNA and FOXB2 protein according to the present invention described above. Specific examples thereof are as described above.
  • differentiation markers selected from the following (i) to (vii) can be mentioned.
  • (Iii) mRNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 35 (Iv) Amino acids in which 1 to several, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 35 are deleted, inserted, substituted or added MRNA encoding sequence (V) mRNA encoding an amino acid sequence having a sequence homology of 70%, preferably 80%, more preferably 95%, and still more preferably 97% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 35 (V
  • kits for Differentiating State Determination examples include a kit equipped with a reagent for detecting the expression of the FOXB2 gene, or a kit equipped with a reagent for measuring the expression level of the FOXB2 gene.
  • Kits provided with primers used for detecting the expression of FOXB2 mRNA or measuring the expression level thereof, or labels thereof (b) The expression of FOXB2 protein is detected or the expression level is determined.
  • Kit comprising an antibody against FOXB2 protein used for measurement (an antibody that recognizes FOXB2 protein, preferably an antibody that specifically binds to FOXB2 protein) or a label of the antibody
  • Examples of the “primer used for detecting the expression of FOXB2 mRNA or measuring the expression level” according to the above (a) include, for example, “the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 34” A primer used for detecting the partial sequence ”.
  • a-1) a primer pair used when PCR is performed using the cDNA obtained by the reverse transcription reaction as a template
  • a-2 A combination of an amplification primer used for the reverse transcription reaction and a primer pair used for performing PCR using the cDNA obtained by the reverse transcription reaction as a template.
  • At least one of the primers constituting the primer pair (a-1) may be labeled with a labeling substance as necessary.
  • Specific examples of the primer pair (a-1) include “a primer pair of a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 and a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 10” or “SEQ ID NO: 45 And a primer pair of a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 46 and a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 46.
  • a primer comprising a primer represented by SEQ ID NO: 4, a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 9 and a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 10
  • a primer pair of a primer represented by SEQ ID NO: 37, a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 45 and a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 46, Combination a primer comprising a primer represented by SEQ ID NO: 4, a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 9 and a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 10
  • an antibody against a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 35 can be mentioned.
  • the kit containing (a-1) or (a-2) as a constituent element further includes a reverse transcriptase used for the RT-PCR method and, if necessary, a nucleic acid synthase (DNA polymerase, RNA polymerase, etc.) Further, it may contain a substrate (dNTP, rNTP, etc.) according to the enzyme, a double-stranded intercalator (SYBR TM Green, ethidium bromide, etc.) or a labeled detection substance such as FAM or TAMRA.
  • the kit containing the above (a-1) or (a-2) as a constituent element is, for example, a buffer, a stabilizer, a preservative, etc., and does not inhibit the stability of coexisting reagents, Those that do not inhibit PCR or hybridization reaction may be included.
  • the concentration may be appropriately selected from a concentration range usually used in this field.
  • the buffer include, for example, Tris buffer, phosphate buffer, veronal buffer, borate buffer, Good buffer, and the like buffers used for carrying out normal PCR and hybridization reactions. All liquids are listed.
  • the pH is not particularly limited, and examples thereof include a range of 5 to 9.
  • reagents included in the kit containing the above (b) as a constituent reagents usually used in this field, such as buffers, sensitizers, surfactants, preservatives (for example, sodium azide, salicylic acid, benzoic acid) Acid, etc.), stabilizers (eg albumin, globulin, water-soluble gelatin, surfactants, saccharides, etc.), activators, coexisting substance avoidance agents, and other reagents used in this field. That do not inhibit the stability and antigen-antibody reaction.
  • concentration range of these reagents and the like may be appropriately selected from the concentration ranges usually used in the measurement method known per se. Specific examples of the buffer and the like, the pH and concentration thereof are as described above.
  • kits for determining the differentiation state of cells according to the present invention include suspensions or the like suspended in appropriate buffers. It may be in a solution state, or a frozen product obtained by freezing it or a freeze-dried product obtained by freeze-drying. Specific examples of the buffering agent used for this purpose, the pH and the concentration thereof are as described above.
  • the kit of the present invention includes instructions for use in a method for detecting FOXB2 gene expression (eg, FOXB2 mRNA expression or FOXB2 protein expression) of the stem cells according to the present invention, or differentiation of the cells of the present invention. Instructions for carrying out the method for determining the state may be included.
  • the “instructions” are the instruction manuals, package inserts, pamphlets (leaflets), etc. of the kits in which the features, principles, operation procedures, judgment procedures, etc. of the method are substantially described in text or diagrams. Means.
  • Example 1 Expression of FOXB2 mRNA and a known undifferentiated marker of the hiPS cells subjected to differentiation induction was detected by RT-PCR.
  • hiPS cells 201B7 strain, iPS Cell Research Institute, Kyoto University (iPS Academia Japan Ltd.)
  • differentiated cells HDF cells (human normal cell-derived fibroblasts) , Lonza Japan Co., Ltd.) was subcultured 3 times in a medium (StemSure hPSC Medium, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with or without bFGF (cells on day 5).
  • a medium StemSure hPSC Medium, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • binding buffer 5.5 M guanidine hydrochloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 20 mM Tris-HCl pH6.6
  • Econospin sica membrane spin column for nucleic acid purification
  • the product was transferred to Gene Design Co., Ltd. and centrifuged at 12000 ⁇ g at room temperature for 1 minute to remove the tube solution.
  • wash Buffer 2 mM Tris-HCl pH 7.5 (Nippon Gene), 80% ethanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • FOXB2 mRNA amplification primer CAGAAGCTACCCTTGCCAG (SEQ ID NO: 4, GenBank Accession No. NM_001013735: 242-260 (corresponds to the base sequence of the complementary strand of the 242-260th base sequence of the base sequence of GenBank Accession No. NM_001013735) the same.)
  • -OCT3 / 4 mRNA amplification primer GTTCTTGAAGCTAAGCTGCAG (SEQ ID NO: 5, GenBank Accession No. NM_002701: 641-661)
  • ⁇ SOX2 amplification primers mRNA GACCACACCATGAAGGCATTC (SEQ ID NO: 7, GenBank Accession No. NM_003106: 572-592 ), GAPDH mRNA amplification primer, GTCTACATGGCAACTGTGAGG (SEQ ID NO: 8, GenBank Accession No. NM_002046: 1303-1323) (GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)
  • Binding Buffer 5.5 M guanidine hydrochloride (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 20 mM Tris-HCl pH 6.6 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • Econospin nucleic acid purification
  • RTase ReverTra Ace (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), reverse transcriptase) is not added. Reaction was performed.
  • the base sequence of each primer used is as follows. The following primers are all manufactured by Sigma-Aldrich.
  • the FOXB2 gene (base sequence represented by SEQ ID NO: 1), the 45th to 223rd, 179 bp region (SEQ ID NO: 3) (GenBank Accession No. NM_001013735.1) position 45-223) is amplified.
  • NANOG cDNA GenBank Accession No. NM_024865: 284-305, 528-550
  • Forward primer CACCTATGCCTGTGATTTGTGG (SEQ ID NO: 13)
  • Reverse primer CATTGAGTACACACAGCTGGGTG (SEQ ID NO: 14)
  • Amplification chain length 267bp
  • GAPDH cDNA GenBank Accession No.NM_002046: 240-260, 618-638
  • Forward primer GTCACCAGGGCTGCTTTTAAC (SEQ ID NO: 17)
  • Reverse primer GGCATTGCTGATGATCTTGAG (SEQ ID NO: 18)
  • Amplification chain length 399bp
  • OCT3 / 4 mRNA (FIG. 1 (3)), NANOG mRNA (FIG. 1 (4)) and SOX2 mRNA (FIG. 5)) was expressed in hiPS cells (in the case of hiPS / bFGF (+) / RTase (+)) in an undifferentiated / pluripotent state.
  • expression was still occurring (a band was confirmed) in the hiPS cells (in the case of hiPS / bFGF ( ⁇ ) / RTase (+)) 5 days after differentiation induction treatment.
  • OCT3 / 4 mRNA, NANOG mRNA and SOX2 mRNA were not expressed in HDF cells, which are differentiated cells.
  • FOXB2 mRNA (Fig. 1 (1)) is expressed in hiPS cells (in the case of hiPS / bFGF (-) / RTase (+)) 5 days after differentiation induction treatment (a band was confirmed). It was confirmed. However, FOXB2 mRNA is expressed in hiPS cells (in the case of hiPS / bFGF (+) / RTase (+)) that are still undifferentiated / pluripotent and in differentiated cells (particularly cells that have been differentiated). It was not expressed in some HDF cells.
  • Fig. 1 (2) show that “hiPS ⁇ bFGF (+) ⁇ RTase (+)”, “hiPS ⁇ bFGF ( ⁇ ) ⁇ RTase (+)”, “HDF ⁇ RTase In the case of (+), the band is confirmed.
  • hiPS • bFGF (+) • RTase ( ⁇ ) “hiPS • bFGF ( ⁇ ) • RTase ( ⁇ )”
  • DF • RTase ( ⁇ ) No band was confirmed. This confirmed that mRNA was not degraded in this experimental system.
  • FOXB2 mRNA differentiation marker by detecting the FOXB2 mRNA, it was revealed that it is possible to determine the differentiation state of a cell. Further, since the commonly measured in undifferentiated markers are (OCT3 / 4, NANOG, SOX2 ) significantly FOXB2 mRNA expression even at a stage where the change has not been detected in the expression is detected, FOXB2 mRNA is conventionally It was found that the differentiation state of the cells can be determined at an earlier stage of differentiation than the undifferentiated marker.
  • Example 2 Stem cell culture and differentiation induction treatment HiPS cells (201B7 strain, iPS Cell Laboratory, Kyoto University (iPS Academia Japan)) with or without bFGF (StemSure hPSC Medium, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) And cells were collected on the 3rd, 5th, and 7th days of culture.
  • HiPS cells 201B7 strain, iPS Cell Laboratory, Kyoto University (iPS Academia Japan)
  • bFGF StemSure hPSC Medium, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • HDF cells human normal cell-derived fibroblasts, manufactured by Lonza Japan Co., Ltd.
  • MEM medium (+ 10% FBS) manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • HMSC-bm cells human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • TOTAL RNA manufactured by ScienCell Research Laboratories
  • -FOXB2 mRNA amplification primer CAGAAGCTACCCTTGCCAG (SEQ ID NO: 4, GenBank Accession No. NM_001013735: 242-260), -OCT3 / 4 mRNA amplification primer, GTTCTTGAAGCTAAGCTGCAG (SEQ ID NO: 5, GenBank Accession No. NM_002701: 641-661), ⁇ NANOG amplification primers mRNA, GTTCTGGAACCAGGTCTTCAC (SEQ ID NO: 6, GenBank Accession No. NM_024865: 631-651 ), ⁇ SOX2 amplification primers mRNA, GACCACACCATGAAGGCATTC (SEQ ID NO: 7, GenBank Accession No. NM_003106: 572-592 ), GAPDH mRNA amplification primer, GTCTACATGGCAACTGTGAGG (SEQ ID NO: 8, GenBank Accession No. NM_002046: 1303-1323)
  • PCR reaction 1 ⁇ L of cDNA obtained in (4) above, 5 ⁇ L of distilled water, 2 ⁇ PCR Buffer for KOD FX Neo (Toyobo Co., Ltd.) 12.5 ⁇ L, 2 mM dNTPs (Toyobo Co., Ltd.) 4 ⁇ L, KOD FX Neo (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) 0.5 ⁇ L (0.5 U), 1 ⁇ L of each forward primer (10 ⁇ M) and 1 ⁇ L of each reverse primer (10 ⁇ M) were mixed.
  • KOD FX Neo manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • the base sequence of each Primer used is as follows. The following primers are all manufactured by Sigma-Aldrich.
  • NANOG cDNA GenBank Accession No. NM_024865: 284-305, 528-550
  • Forward primer CACCTATGCCTGTGATTTGTGG (SEQ ID NO: 13)
  • Reverse primer CATTGAGTACACACAGCTGGGTG (SEQ ID NO: 14)
  • Amplification chain length 267bp
  • GAPDH cDNA GenBank Accession No.NM_002046: 240-260, 618-638
  • Forward primer GTCACCAGGGCTGCTTTTAAC (SEQ ID NO: 17)
  • Reverse primer GGCATTGCTGATGATCTTGAG (SEQ ID NO: 18)
  • Amplification chain length 399bp
  • Electrophoresis 5 ⁇ L of PCR amplification product and 1 ⁇ L of 6 ⁇ Loading Buffer Double Dye (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) were mixed and electrophoresed on a 1.5% agarose gel. Staining was performed with GelRed Nucleic Acid Gel Stain (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • known undifferentiation markers OCT3 / 4 mRNA, NANOG mRNA, SOX2 mRNA, GAPDH mRNA
  • FOXB2 mRNA FOXB2 mRNA
  • HMSC-bm human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • FOXB2 mRNA is also expressed in known undifferentiated markers ( OCT3 / 4 mRNA, NANOG mRNA, SOX2 mRNA, GAPDH mRNA). The expression of) was not confirmed.
  • HMSC-bm is a somatic stem cell formed from a stem cell (RS cell) through a mesoderm. From this, it can be inferred that if differentiation of undifferentiated stem cells proceeds to this level, FOXB2 mRNA is not expressed, in other words, FOXB2 mRNA is specifically expressed in the early stage of cell differentiation.
  • FOXB2 mRNA and the expression of known undifferentiated markers were not confirmed in the HDF cells on day 5 of culture.
  • FOXB2 mRNA was detected earlier than the change in the expression of undifferentiated markers ( OCT3 / 4 , NANOG , SOX2 ) which were generally measured. This indicates that FOXB2 mRNA is particularly useful as a differentiation marker in the early stages of cell differentiation.In other words, FOXB2 mRNA is detected at the initial stage of differentiation by detecting the expression of FOXB2 mRNA. It has become clear that you can.
  • FIG. 1 Stem cell culture and differentiation induction treatment hiPS cells (201B7 strain, iPS Cell Research Institute, Kyoto University (iPS Academia Japan Ltd.)) and, as a comparison, differentiated cells, HDF cells (human normal cell-derived fibroblasts) , Lonza Japan Co., Ltd.) was subcultured 3 times in a medium (StemSure hPSC Medium, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with or without bFGF (cells on day 6). was recovered.
  • a medium Stem cell culture and differentiation induction treatment hiPS cells (201B7 strain, iPS Cell Research Institute, Kyoto University (iPS Academia Japan Ltd.)
  • differentiated cells human normal cell-derived fibroblasts
  • RNA was extracted from the cells recovered in (1) above using a commercially available nucleic acid extraction reagent kit ISOGEN (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) according to the instruction manual.
  • NM_002701: 641-661 ⁇ NANOG mRNA amplification primer, GTTCTGGAACCAGGTCTTCAC (SEQ ID NO: 6, GenBank Accession No. NM_024865: 631-651) ⁇ SOX2 mRNA amplification primers, GACCACACCATGAAGGCATTC (SEQ ID NO: 7, GenBank Accession No. NM_003106: 572-592 ) FGF5 mRNA amplification primer, CTCCCTGAACTTGCAGTCATC (SEQ ID NO: 19, GenBank Accession No. NM_004464: 709-729) CDX2 mRNA amplification primer, CCTGAGGAGTCTAGCAGAGTC (SEQ ID NO: 20, GenBank Accession No.
  • GATA4 mRNA amplification primers GATTACGCAGTGATTATGTCCC (SEQ ID NO: 21, GenBank Accession No. NM_001308094: 1110-1131 )
  • Amplification primer for GATA6 mRNA CATCTTGACCCGAATACTTGAG (SEQ ID NO: 22, GenBank Accession No. NM_005257: 1961-1982)
  • SOX17 mRNA amplification primers CCCAGGAGTCTGAGGATTTCC (SEQ ID NO: 23, GenBank Accession No. NM_022454: 1515-1535 )
  • GAPDH mRNA GTCTACATGGCAACTGTGAGG (SEQ ID NO: 8, GenBank Accession No. NM_002046: 1303-1323 )
  • Binding Buffer 5.5 M guanidine hydrochloride (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 20 mM Tris-HCl pH 6.6 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • Econospin ((Co)
  • 500 ⁇ L of Wash Buffer (2 mM Tris-HCl pH 7.5 (Nippon Gene Co., Ltd.), 80% ethanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and centrifuged at 12000 ⁇ g for 1 minute at room temperature.
  • PCR reaction 1 ⁇ L of cDNA obtained in (4) above, 5 ⁇ L of distilled water, 2 ⁇ PCR Buffer for KOD FX Neo (Toyobo Co., Ltd.) 12.5 ⁇ L, 2 mM dNTPs (Toyobo Co., Ltd.) 4 ⁇ L, KOD FX Neo (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) 0.5 ⁇ L (0.5 U), 1 ⁇ L of each forward primer (10 ⁇ M) and 1 ⁇ L of each reverse primer (10 ⁇ M) were mixed.
  • KOD FX Neo manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • the base sequence of each Primer used is as follows. The following primers are all manufactured by Sigma-Aldrich.
  • NANOG cDNA GenBank Accession No. NM_024865: 284-305, 528-550
  • Forward primer CACCTATGCCTGTGATTTGTGG (SEQ ID NO: 13)
  • Reverse primer CATTGAGTACACACAGCTGGGTG (SEQ ID NO: 14)
  • Amplification chain length 267bp
  • FGF5 cDNA GenBank Accession No.NM_004464: 462-482, 615-637
  • Forward primer GCAGAGCAGTTTCCAGTGGAG (SEQ ID NO: 24)
  • Reverse primer GTATTCCTACAATCCCCTGAGAC (SEQ ID NO: 25)
  • Amplified chain length 176 bp
  • CDX2 cDNA GenBank Accession No. NM_001265: 923-944, 1176-1196
  • Forward primer CAAATATCGAGTGGTGTACACG (SEQ ID NO: 26)
  • Reverse primer GACACTTCTCAGAGGACCTGG (SEQ ID NO: 27) Amplified chain length: 274bp
  • GATA4 cDNA GenBank Accession No. NM_001308094: 795-816, 1020-1040
  • Forward primer CAGCTCCTTCAGGCAGTGAGAG (SEQ ID NO: 28)
  • Reverse primer CGGGAGACGCATAGCCTTGTG (SEQ ID NO: 29)
  • Amplified chain length 246 bp
  • GATA6 cDNA GenBank Accession No. NM_005257: 1682-1703, 1842-1864
  • Forward primer GCTTGTGGACTCTACATGAAAC (SEQ ID NO: 30)
  • Reverse primer GCTGCAATCATCTGAGTTAGAAG (SEQ ID NO: 31)
  • Amplification chain length 183 bp
  • GAPDH cDNA GenBank Accession No.NM_002046: 240-260, 618-638
  • Forward primer GTCACCAGGGCTGCTTTTAAC (SEQ ID NO: 17)
  • Reverse primer GGCATTGCTGATGATCTTGAG (SEQ ID NO: 18)
  • Amplification chain length 399bp
  • FGF5 mRNA ectodermal differentiation marker
  • CDX2 mRNA ectodermal differentiation marker
  • GATA4 mRNA endodermal differentiation marker
  • GATA6 mRNA endodermal differentiation marker
  • SOX7 mRNA endodermal differentiation
  • FOXB2 mRNA was confirmed to be expressed (a band was confirmed) in hiPS cells (in the case of hiPS • bFGF ( ⁇ ) • RTase (+)) on the 6th day after differentiation induction treatment.
  • the GAPDH mRNA detection results show that “hiPS • bFGF (+) • RTase (+)”, “hiPS • bFGF ( ⁇ ) • RTase (+)”, “HDF • RTase (+)” A band was confirmed, and no band was confirmed for “hiPS • bFGF (+) • RTase ( ⁇ )”, “hiPS • bFGF ( ⁇ ) • RTase ( ⁇ )”, “DF • RTase ( ⁇ )”. . This confirmed that mRNA was not degraded in this experimental system.
  • FOXB2 mRNA differentiation marker by detecting the FOXB2 mRNA, it was revealed that it is possible to determine the differentiation state of a cell.
  • FOXB2 mRNA expression was remarkably detected even when changes in the expression of general undifferentiated markers ( OCT3 / 4 , NANOG , SOX2 ) were not detected.
  • FOXB2 mRNA expression was detected at the stage where FGF5 mRNA, which is known as the most promising differentiation marker, has not yet been expressed. That is, it was found that FOXB2 mRNA can determine the differentiation state of cells at an earlier stage of differentiation (initial stage) than conventional differentiation markers and undifferentiation markers.
  • FOXB2 mRNA is a very useful differentiation marker compared to conventional differentiation / undifferentiation markers.
  • differentiated cells can be determined at the early stage of culture, it is useful for early screening of cells, quality control of stem cells, and the like, and shortening of the culture period and cost reduction of the medium cost can be expected.
  • Example 4 Mouse ES cells were cultured in a LIF-free medium and subjected to differentiation induction, and expression of FOXB2 mRNA and a known undifferentiated marker was detected by RT-PCR.
  • Stem cell culture and differentiation induction treatment mES cells (D3 strain, ATCC, b723512), LIF added (1000Unit) or non-added medium (StemSure DMEM, StemSure Serum replacement, MEM non-essential amino acid solution, L-glutamine solution , StemSure 2-mercaptoethanol solution, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and subcultured three times, and cells were collected on the 3rd, 5th, and 7th days of culture.
  • mES cells D3 strain, ATCC, b723512
  • LIF added 1000Unit
  • non-added medium StemSure DMEM, StemSure Serum replacement, MEM non-essential amino acid solution, L-glutamine solution , StemSure 2-mercaptoethanol solution, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • RNA was extracted from the cells recovered in (1) above using a commercially available nucleic acid extraction reagent kit ISOGEN (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) according to the instruction manual.
  • binding buffer 5.5 M guanidine hydrochloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 20 mM Tris-HCl pH6.6
  • Econospin sica membrane spin column for nucleic acid purification
  • RNA was recovered by centrifugation at 12000 ⁇ g, room temperature for 1 minute, followed by ethanol precipitation, and the resulting precipitate was dissolved in 9.5 ⁇ L of distilled water. .
  • NM_008452: 1205-1227 -Esrrb mRNA amplification primer, GATTCGAGACGATCTTAGTCAATG (SEQ ID NO: 42, GenBank Accession No. NM_011934: 957-980) -Fgf5 mRNA amplification primer, GACGCATAGGTATTATAGCTG (SEQ ID NO: 43, GenBank Accession No. NM_010203: 729-749) -Gapdh mRNA amplification primer, CTTGATGTCATCATACTTGGC (SEQ ID NO: 44, GenBank Accession No. NM_001289726: 843-863)
  • Binding Buffer 5.5 M guanidine hydrochloride (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 20 mM Tris-HCl pH 6.6 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and mixed, and Econospin (Corporation)
  • the tube solution was removed by centrifugation at 12000 ⁇ g and room temperature for 1 minute, and then washed Buffer (2 mM Tris-HCl pH 7.5 (Nippon Gene Co., Ltd.), 80% ethanol ( 500 ⁇ L of Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, centrifuged at 12000 ⁇ g, room temperature for 1 minute to remove the tube solution, and then further centrifuged at 12000 ⁇ g, room temperature for 1 minute.
  • PCR reaction 1 ⁇ L of cDNA obtained in (4) above, 5 ⁇ L of distilled water, 2 ⁇ PCR Buffer for KOD FX Neo (Toyobo Co., Ltd.) 12.5 ⁇ L, 2 mM dNTPs (Toyobo Co., Ltd.) 4 ⁇ L, KOD FX Neo (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) 0.5 ⁇ L (0.5 U), 1 ⁇ L of each forward primer (10 ⁇ M) and 1 ⁇ L of each reverse primer (10 ⁇ M) were mixed.
  • the base sequence of each Primer used is as follows. The following primers are all manufactured by Sigma-Aldrich.
  • Sox2 cDNA GenBank Accession No. NM_011443: 1652-1674, 1836-1859
  • Forward primer GAATCGGACCATGTATAGATCTG (SEQ ID NO: 51)
  • Reverse primer CATTTGATTGCCATGTTTATCTCG (SEQ ID NO: 52)
  • Amplification chain length 208bp
  • Fgf5 cDNA GenBank Accession No. NM_010203: 445-465, 617-639
  • Forward primer GAACATAGCAGTTTCCAGTGG (SEQ ID NO: 57)
  • Reverse primer GTTGCTGAAAACTCCTCGTATTC (SEQ ID NO: 58)
  • Amplification chain length 195bp
  • Gapdh cDNA GenBank Accession No.NM_001289726: 224-246, 512-534 Forward primer: GTTCCAGTATGACTCCACTCACG (SEQ ID NO: 59) Reverse primer: CATTGCTGACAATCTTGAGTGAG (SEQ ID NO: 60) Amplification chain length: 311bp
  • FOXB2 mRNA is expressed (a band was confirmed) in ES cells (in the case of LIF (-) / RTase (+)) 7 days after differentiation induction treatment. confirmed. However, FOXB2 mRNA was not expressed in ES cells (in the case of LIF (+) / RTase (+)) maintaining undifferentiated / pluripotency.
  • Fgf5 mRNA which is a differentiation marker, was expressed in ES cells (in the case of LIF ( ⁇ ) / RTase (+)) 7 days after differentiation induction treatment (a band was confirmed).
  • undifferentiated markers OCT3 / 4 mRNA, NANOG mRNA, and SOX2 mRNA are expressed in ES cells (in the case of LIF (+) / RTase (+)) that maintain undifferentiated / pluripotent. It was. In addition, it was confirmed that the cells were still expressed (a band was confirmed) in the ES cells (in the case of LIF ( ⁇ ) / RTase (+)) 7 days after the differentiation induction treatment.
  • FOXB2 mRNA expression was detected as early as Fgf5 mRNA, which is currently considered the most promising as a differentiation marker.
  • FOXB2 mRNA expression was remarkably detected even when changes in the expression of general undifferentiated markers ( OCT3 / 4 , NANOG , SOX2 ) were not detected.
  • the expression of FOXB2 mRNA was confirmed at the stage of 7 days after induction of differentiation where Klf2 mRNA and Esrrb mRNA, which are known as naive markers, have not yet disappeared.
  • FOXB2 mRNA can determine the differentiation state of ES cells at an earlier stage of differentiation than conventional undifferentiated markers.
  • it is possible to determine the differentiated cells at the early stage of culture it is useful for early screening of cells, quality control of stem cells, and the like, and shortening of the culture period and cost reduction of the medium cost can be expected.
  • HiPS cells were seeded in 4 wells so that the concentration of hPSC ⁇ medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with or without the addition of + bFGF and + ROCKtorinhibitor was 20000 cells / well and cultured for 1 day.
  • FIG. 5 (1) is a photograph of hiPS cells cultured in a bFGF-free medium (differentiation induction treatment). (2) is a photograph of hiPS cells cultured in a bFGF-added medium.
  • the fraction after electrophoresis is transferred to a PVDF membrane by a semi-driving method.
  • Block Ace (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) is dissolved in PBS-T (Phosphate Buffered Saline with Tween TM 20, pH 7.4) to obtain a blocking solution.
  • PBS-T Phosphate Buffered Saline with Tween TM 20, pH 7.4
  • the PVDF membrane after the transfer is immersed in this blocking solution and subjected to blocking treatment at room temperature for 1 hour, and then the PVDF membrane is washed and immersed in the blocking solution.
  • the peroxidase-labeled anti-human FOXB2 protein antibody obtained in 2) above is added to the blocking solution and immersed at room temperature for about 1 hour.
  • the PVDF membrane is washed, luminescence is generated with ECL TM Prime Western Blotting Detection Reagent (peroxidase chemiluminescence substrate, manufactured by GE Healthcare), and detection is performed with an exposure time of 10 seconds using LAS4000 (manufactured by FUJIFILM Corporation).
  • ECL TM Prime Western Blotting Detection Reagent peroxidase chemiluminescence substrate, manufactured by GE Healthcare
  • detection is performed with an exposure time of 10 seconds using LAS4000 (manufactured by FUJIFILM Corporation).
  • the differentiation state of stem cells can be determined at the initial stage of differentiation.
  • the present invention can also be applied to stem cell quality control and differentiated cell preparation / isolation methods. Furthermore, since the present invention can determine differentiated cells at the early stage of culture, it is useful for early screening of cells and quality control of stem cells, and can be expected to shorten the culture period and reduce the cost of the medium.

Abstract

　未分化幹細胞の分化状態を、分化の初期段階で判定することができる方法を提供する。　本発明は、「幹細胞のFOXB2遺伝子の発現を検出し、その結果に基づいて判定行う、細胞の分化状態の判定方法。」及び「FOXB2遺伝子由来のmRNA又は蛋白質から選択される、分化マーカー。」に関する。　本発明は、幹細胞の品質管理や分化細胞の調製・単離方法へ応用することができる。更に本発明は培養初期で分化した細胞を判定きることから、細胞の早期スクリーニングや幹細胞の品質管理に有用であり、培養期間の短縮、培地代の経費削減などが期待できる。

Description

幹細胞の分化状態の判定方法及びこれに用いられる新規な分化マーカー
　本発明は、幹細胞の分化状態を分化の初期段階で判定することができる、新規な分化マーカに関する。
　ES細胞（Embryonic Stem cell、胚性幹細胞）やiPS細胞（Induced Pluripoent Stem Cell、人工多能性幹細胞）等の多能性幹細胞は、その多能性を維持するために、例えばフィーダー細胞と共培養する、フィーダー由来の条件培地（ＣＭ）で培養する、培地へbasic FGF (bFGF/FGF2、basic Fibroblast Growth Factor、塩基性繊維芽細胞増殖因子)やLIF（leukemia inhibitory factor）を添加する、等の技術が必要である。さもないと、環境や細胞のコンディションが原因で多分化能を失い、容易に分化してしまうことがある。そのため、幹細胞の未分化状態（多能性を持つ状態）や分化状態を正確に知ることは重要である。
　また、再生医療の分野では、多能性幹細胞を目的の細胞に分化させてから移植を行うが、その移植させる細胞に未分化細胞が混入している場合には、それが腫瘍形成の原因になる危険性がある。そこで、分化誘導処理した多能性幹細胞中に未分化幹細胞が混入しているかどうかを判定する技術は、重要である。
　しかしながら、細胞の分化状態を、細胞の外見から判断することは難しい。
　そこで、多能性幹細胞の分化状態を判定する方法として、分化状態の指標となるマーカーを検出する方法が行われている。例えば、多能性幹細胞の多能性マーカーとして、Alkaline Phosphatase、Nanog、Oct4、TRA-1-60、Sox、LIF-R等が知られている。多能性幹細胞は、未分化状態でこれらのマーカーを発現しているので、これらのマーカーを検出することにより、幹細胞が未分化状態を維持しているか否かを判断することができる。しかしこれらのマーカーは、幹細胞がある程度分化した状態（例えば三胚葉のいずれかにまで）でないと分化状態を判定できない。そのため、未分化細胞がその未分化状態（多能性）を維持しているのか、将来分化する分化能を獲得した状態なのかを分化誘導後の、分化の初期段階で判断することは困難であった。
　一方、Fox (Forkhead box)と呼ばれる、フォークヘッド又はウイングド・ヘリックス DNA 結合ドメインを持った転写因子の一群が知られており（非特許文献１）、ヒトでは 約50 種類存在していることが知られている（FOXB1、FOXB2等）。Foxの発現蛋白質は、主に発生調節因子、組織特異的調節因子、細胞周期調節因子として機能していることがわかっているが、ほとんど作用が解明されていないものもある。
Eddy H van Roon, et al. Clinical Epigenetics 2013, Jan 16; 5(1):2. doi: 10.1186/1868-7083-5-2
　本発明の課題は、未分化幹細胞の分化状態を、分化の初期段階で判定することができる方法を提供することにある。
　本発明は、上記課題を解決する目的でなされたものであり、以下の構成よりなる。
（１）幹細胞のFOXB2遺伝子の発現を検出し、その結果に基づいて判定を行う、細胞の分化状態の判定方法。
（２）FOXB2遺伝子由来のmRNA又は蛋白質から選択される、分化マーカー。
　basic FGF (bFGF, FGF2、basic Fibroblast Growth Factor、塩基性繊維芽細胞増殖因子)を添加した培地でES細胞やiPS細胞等の未分化細胞を培養すると、当該未分化細胞は長期にわたって、その未分化状態を維持したまま増殖することが知られている。
　本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、bFGF無添加培地でiPS細胞を培養すると（分化誘導処理）、培養開始後３～５日で、iPS細胞のFOXB2 mRNA発現が検出され、しかもその発現量が顕著に増加する現象を確認した。また、bFGFを添加した培地で培養し未分化状態を維持したiPS細胞では、FOXB2 mRNAの発現は確認されないことも確認した。以上のことから、FOXB2 mRNAが、ES細胞やiPS細胞の分化マーカーとして有用であること、そしてその発現を測定することにより、分化の初期段階の細胞を選別することができることを見出し、本発明を完成させるに到った。
　本発明の方法を実施することにより、幹細胞の分化状態を、分化の初期段階で判定することができる。また、本発明は、幹細胞の品質管理や分化細胞の調製・単離方法へ応用することができる。更に本発明は培養初期で分化した細胞を判定きることから、細胞の早期スクリーニングや幹細胞の品質管理に有用であり、培養期間の短縮、培地代の経費削減などが期待できる。
実施例１において得られた、hiPS細胞のFOXB2 mRNAの発現をRT-PCR法により検出した結果を示す電気泳動図である。図１において、(1)はFOXB2 mRNAの発現を検出した結果を、(2)はGAPDH mRNAの発現を検出した結果を、(3)はOCT3/4 mRNAの発現を検出した結果を、(4)はNANOG mRNAの発現を検出した結果を、(5)はSOX2 mRNAの発現を検出した結果をそれぞれ示す。 実施例２において得られた、FOXB2 mRNAの発現をRT-PCR法により検討した結果を示す電気泳動図である。 実施例３において得られた、FOXB2 mRNAの発現をRT-PCR法により検討した結果を示す電気泳動図である。 実施例４において得られた、Foxb2 mRNAの発現をRT-PCR法により検討した結果を示す電気泳動図である。 参考例１において得られたbFGF無添加培地で培養したhiPS細胞の写真(図５(1))、及びbFGF添加培地で培養したhiPS細胞の写真(図５(2))である。
　本発明に係る幹細胞としては、いわゆる自己複製能力と様々な細胞に分化し得る分化能を有する細胞が挙げられる。例えば多分化能（多能性）を有する未分化細胞であるES細胞、iPS細胞の他、ntES細胞（nuclear transfer Embryonic Stem Cell）、EG細胞（Embryonic Cell、胚性生殖細胞）、EC細胞（Embryonic Cell、胚性癌幹細胞）等が挙げられる。
　また、幹細胞の由来動物としては、例えばヒト、ウシ、ウマ、イヌ、モルモット、マウス、ラット等の哺乳動物が挙げられる。
　本発明の細胞の分化状態の判定方法に供される被検細胞である幹細胞としては、公知の分化誘導処理を施した幹細胞や、未分化状態を維持する処理を施した幹細胞、公知の多能性誘導処理を施して脱分化させた体細胞、等が挙げられる。
　未分化幹細胞を分化誘導処理する方法としては、自体公知の方法であればよく、特に限定されない。例えば、公知の分化誘導物質で細胞を処理した後培養する方法、bFGFやLIFを含有しない培地で培養する等の、未分化幹細胞を分化誘導される環境で培養する方法等が挙げられる。
　未分化幹細胞の分化を誘導する化学物質（分化誘導物質）としては、例えば神経細胞への分化を誘導するレチノイン酸（Retinoic Acid）、心筋細胞への分化を誘導するスペルミン（Spermine）、酪酸ナトリウム（Sodium Butyrate）、トリコスタチンA（Trichostatin A）、マウスES細胞のインスリン産生細胞への分化を誘導するDNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（DNA Methyltransferase Inhibitor）等が知られている。
　「未分化状態」とは、例えば、細胞が、上記した自己複製能力と様々な細胞に分化し得る分化能を有する状態にあることを意味する。
　「未分化状態を維持する処理」とは、例えば公知の幹細胞の未分化状態を維持する処理であればよいが、例えばフィーダー細胞との共培養、培地中へのbFGFやLIFの添加処理等が挙げられる。
　本発明に係るFOXB2遺伝子とは、判定に供される細胞が由来する動物種に存在するFOXB2蛋白質をコードする遺伝子DNA、RNA等を意味する。また、FOXB2蛋白質の同族体、変異体、及び誘導体などをコードする遺伝子も包含される。更に、これら遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列及びこれを含む遺伝子や、FOXB2遺伝子と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有する塩基配列を有する遺伝子なども包含される。
　具体的には、例えばヒトFOXB2遺伝子としては、配列番号１で表される塩基配列（ヒトFOXB2 mRNAの塩基配列）に対応する遺伝子や、配列番号２で表される蛋白質をコードする塩基配列を有する遺伝子、又はこれらの塩基配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有する塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
　例えばマウスFoxb2遺伝子としては、配列番号３４で表される塩基配列（マウスFoxb2 mRNAの塩基配列）に対応する遺伝子や、配列番号３５で表される蛋白質をコードする塩基配列を有する遺伝子、又はこれらの塩基配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有する塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
　本発明に係るFOXB2 mRNAとしては、判定に供される細胞が由来する動物種に存在するFOXB2遺伝子から転写されたmRNA、例えば上記したFOXB2遺伝子由来のmRNAが挙げられる。
　FOXB2遺伝子由来のmRNAとしては、例えばヒトFOXB2 mRNAとしては、以下のもの等が挙げられる。
・配列番号１で表される塩基配列（GenBank Accession No. NM_001013735）を有するmRNA
・配列番号１で表される塩基配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有する塩基配列を有するmRNA
・配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするmRNA
・配列番号２で表されるアミノ酸配列の１～数個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、あるいは置換されたアミノ酸配列をコードするmRNA
・配列番号２で表されるアミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードするmRNA。
　例えばマウスFoxb2 mRNAとしては、以下のもの等が挙げられる。
・配列番号３４で表される塩基配列（GenBank Accession No. NM_008023）を有するmRNA
・配列番号３４で表される塩基配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有する塩基配列を有するmRNA
・配列番号３５で表されるアミノ酸配列をコードするmRNA
・配列番号３５で表されるアミノ酸配列の１～数個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、あるいは置換されたアミノ酸配列をコードするmRNA
・配列番号２で表されるアミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードするmRNA
　本発明に係るFOXB2蛋白質としては、判定に供される細胞が由来する動物種に存在するFOXB2遺伝子から翻訳された蛋白質が挙げられる。このようなFOXB2蛋白質の同族体、変異体、及び誘導体であってもよい。
　例えばヒトFOXB2蛋白質としては、以下のもの等が挙げられる。
・配列番号２で表されるアミノ酸配列又はその１個若しくは数個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するもの
・配列番号２で表されるアミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するもの
　マウスFOXB2蛋白質としては、以下のもの等が挙げられる。
・配列番号３５で表されるアミノ酸配列又はその１個若しくは数個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するもの
・配列番号３５で表されるアミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するもの
＜Ｉ．本発明の細胞の分化状態の判定方法＞
　本発明の細胞の分化状態の判定方法は、「幹細胞のFOXB2遺伝子の発現を検出し、その結果に基づいて判定を行う、細胞の分化状態の判定方法。」である。
＜Ｉ－１．FOXB2遺伝子の発現を検出する方法＞
　FOXB2遺伝子の発現を検出する方法としては、FOXB2 mRNAの発現を検出する方法、又はFOXB2蛋白質の発現を検出する方法が挙げられる。
　本発明において「発現を検出する」という場合、「FOXB2遺伝子が発現したか否か（例えばFOXB2 mRNA又はFOXB2蛋白質の存在の有無）を検出する」場合と、「FOXB2遺伝子が発現した量（例えばFOXB2 mRNAの量、又はFOXB2蛋白質の量）を測定する」場合を含む。
　FOXB2遺伝子の発現の検出は、分化誘導処理後の被検細胞が、FOXB2 mRNA又はFOXB2蛋白質を、検出できる程度にまで発現した後に行う。具体的には被検細胞を分化誘導処理した後、上限は７日以内、好ましくは６日以内、より好ましくは５日以内、下限は１日以上、好ましくは２日以上、更に好ましくは３日以上培養後に細胞を採取して、以下のFOXB2遺伝子の発現の検出を行えばよい。この間、毎日細胞を採取して、FOXB2遺伝子の発現の検出を行ってもよい。
（１）FOXB2 mRNAの発現を検出する方法
　FOXB2 mRNAの発現を検出する方法は、自体公知のmRNAを検出する方法であれば特に制限されず、公知の方法から適宜選択すればよい。
　例えば、RT-PCR法（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）、リアルタイムRT-PCR法、コンペティティブPCR法、in situ PCR法、in situ ハイブリダイゼーション法、DNAアレイ法、ノーザンハイブリダイゼーション（Northern hybridization）、ＦＩＳＨ法、ドットブロット法、RNaseプロテクションアッセイ法、RT-LAMP法の他、金ナノ粒子に結合した標的RNAに対する相補鎖（捕捉鎖）と捕捉鎖の相補鎖であるレポーター鎖を用いるSmartFlareTM法、標的RNAに対応する配列を有する２種類の蛍光プローブ(Reduction-triggered Fluorescence activation probe、RETF probe)を用いた検出法、芳香族求核置換反応を利用した検出法（標的RNAに相補的なDNAを結合した２－シアノ－４－ニトロベンゼンスルホニル基で保護したアミノクマリンを修飾したＣＮｓ－ＡＭＣＡプローブと、標的RNAに相補的なDNAを結合したチオフェノール基で修飾されたＭＢＡプローブを用いた方法）等の方法が挙げられる。
１）ＲＴ－ＰＣＲ法
　RT-PCR法とは、標的のFOXB2遺伝子（例えばFOXB2 mRNA）を鋳型とし、逆転写反応によりcDNAを合成後、PCRによるDNAの増幅を行う方法〔Kawasaki, E. S., et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc., SanDiego, 21-27 (1991)］である。逆転写反応及びDNAの増幅反応の条件は特に限定されるものではなく、適宜最適な条件を採用することができる。また、当該標的の遺伝子（例えばFOXB2 mRNA）の増幅領域は、必ずしも全長である必要はなく、増幅産物の確認に支障が無ければ、当該遺伝子の一部領域であってもよい。増幅されたcDNA量（mRNA量に相当する）は、例えば、上記DNA増幅反応液を電気泳動に供した後、目的増幅断片に特異的にハイブリダイズするプローブを用いることで検出すればよい。
　具体的には、例えばまず公知の方法で、被検細胞からmRNAを抽出・分離する。次いでFOXB2 mRNAの塩基配列に対応する塩基配列を有するヌクレオチド鎖を増幅用プライマーとして用い、上記で得られたmRNAを鋳型としてRT-PCR法を実施し、FOXB2 mRNA又はその一部領域に対して相補的な、一本鎖DNA（cDNA）を合成・増幅する。そしてその増幅産物（cDNA）の有無や多少（量）を検出することにより、細胞のFOXB2 mRNAの存在や量を検出することができる。
　上記で使用する増幅用プライマーとしては、例えばヒトのFOXB2 mRNAを検出する場合の増幅プライマーとしては、例えば配列番号４で表される塩基配列を有するプライマーが挙げられる。マウスのFoxb2 mRNAを検出する場合の増幅プライマーとしては、例えば配列番号３７で表される塩基配列を有するプライマーが挙げられる。
　更に上記の方法で増幅されたcDNAを鋳型として、FOXB2 mRNAの塩基配列をもとに、FOXB2 mRNAの標的の領域が増幅できるように調製したプライマー対を用いて、常法に従って更にPCR法等の核酸増幅反応を実施して、増幅産物の有無や多小（量）を検出すれば、FOXB2 mRNAの存在や量をより正確に検出できる。この増幅産物の検出は、増幅産物を検出する電気泳動法等の常法で行えばよい。
　上記の方法で増幅されたcDNAを鋳型として核酸増幅反応を実施する場合、リアルタイム増幅検出法により行ってもよい。リアルタイム増幅検出法による検出法としては、例えばリアルタイムＰＣＲ検出法が挙げられる。
　リアルタイムＰＣＲ検出法の例としては、インターカレーター（例えばSYBRTM Green I）を利用してリアルタイムPCRを行う通常のインターカレーター法、TaqManTMリアルタイムＰＣＲ法、MGB Eclipse Probe System法、Molecular Beacons Probe Technology法、LUX Fluorogenic Primer法、Quenching probe-ＰＣＲ（QP）法、サイクリニングプローブ法等が挙げられるが、これに限定されない。
　上記PCR（リアルタイムPCRを含む。）に用いられる「FOXB2 mRNAの標的の領域が増幅できるように調製したプライマー対」としては、FOXB2 mRNAの塩基配列又はその特定領域（部分配列）を増幅するプライマー対が挙げられる。
　そのようなプライマー対としては、例えばヒトのFOXB2 mRNA（配列番号１で表される塩基配列）又はその特定領域（部分配列）を増幅するプライマー対が挙げられる。具体的には、例えば配列番号１で表される塩基配列の45～223番目の、179bpの領域（配列番号３）を標的とした場合、配列番号９で表される塩基配列を有するプライマーと配列番号１０で表される塩基配列を有するプライマーのプライマー対が挙げられる。
　また、例えばマウスのFoxb2 mRNA（配列番号３４で表される塩基配列）又はその特定領域（部分配列）を増幅するプライマー対も挙げられる。具体的には、例えば配列番号３４で表される塩基配列の132～300番目の、169bpの領域（配列番号３６）を標的とした場合、配列番号４５で表される塩基配列を有するプライマーと配列番号４６で表される塩基配列を有するプライマーのプライマー対が挙げられる。
　FOXB2 mRNA増幅用のプライマーは各種市販されているので、それを用いてもよい。
　RT-PCR法によるヒトFOXB2 mRNAの検出法を例にとって具体的に示すと、以下の通りである。
　被検細胞から抽出し、DNase処理したTotal RNA 500ng～10μgに、FOXB2 mRNAの増幅プライマー（例えば配列番号４の塩基配列を有するプライマー）1～10μMを1μL加え、65～80℃、2～5分間 保温した後、氷冷下で、5×Buffer 4μL、2.5mM dNTPs 4μL、RNase Inhibitor 0.5μL (20U)、逆転写酵素(ReverTra Ace) 1μL(100U)を加え、蒸留水にて全量20μLにして混合し、37～50℃、20～60分間保温することにより逆転写反応を行う。その後常法により、得られたcDNAを回収する。
　次いで得られたcDNA 1μL、蒸留水5μL、2×PCR Buffer 12.5μL、2 mM dNTPs 4μL、DNAポリメラーゼ(KOD FX Neo) 0.5μL（0.5Ｕ）、フォワードプライマー（例えば配列番号９の塩基配列を有するプライマー） 5～10μMを1μL、リバースプライマー（例えば配列番号１０の塩基配列を有するプライマー） 5～10μMを1μL混合する。次いで、例えば94℃ 2分間、98℃ 10秒間→56℃ 20秒間→68℃ 30秒間の反応を28～30サイクル程度行う。
　PCR終了後、例えば電気泳動で増幅産物の検出・解析を行い、FOXB2 mRNAを検出する。
　又は、cDNAを回収した後、インターカレーター（例えばSYBRTM Green I）及び例えば上記と同様のフォワードプライマーとリバースプライマーを用い、上記で得られたcDNAを鋳型として用いて、Taq DNA ポリメラーゼ等のポリメラーゼを用いたリアルタイムＰＣＲを行う。そして、増幅産物の増幅量と相関してインターカレーションするインターカレーターの蛍光強度を測定することにより増幅産物の検出・解析を行い、FOXB2 mRNAを検出する
　更に、上記の方法で増幅されたcDNAを鋳型として核酸増幅反応を実施した後の増幅産物の検出・解析を、キャピラリー電気泳動法（Ｊ.Chromatogr. 593 253－258 （1992）、Anal.Chem. 64 1926－1932 （1992）、WO2007/027495等）、キャピラリーチップ電気泳動法で行ってもよい。すなわち、cDNAを回収した後、例えば蛍光物質等の標識物質で標識したプライマーやインターカレーターを用いて、キャピラリーチップ電気泳動で分離された標識PCR増幅産物由来のシグナルを検出器で検出すればよい。検出器としては、示差屈折検出器、蛍光検出器、UV検出器等の機器によりなされればよく、中でも、UV検出器、蛍光検出器が好ましく、蛍光検出器がより好ましい。例えばLiBASys（島津製作所（株）製）等の自動免疫分析装置を用いれば、PCRから電気泳動までの操作をリアルタイムに行うことができる。
２）ノーザンハイブリダイゼーション法
　ノーザンハイブリダイゼーション法よりFOXB2 mRNAを検出する方法としては、例えば、被検細胞から抽出・分離したmRNAを適当な担体に固定し、これとFOXB2 mRNAに相補的な塩基配列を有する標識プローブ（cDNAでもよい）とハイブリダイゼーションを行い、その程度を検出することにより、被検細胞のFOXB2 mRNAを検出する方法が挙げられる。ここで使用するプローブは、FOXB2 mRNAの塩基配列の相補配列の全部からなるものであっても、その一部の塩基配列からなるものであってもよい。また、この検出法に、該プローブを固定化したマイクロアレイ、DNAチップを用いることもできる。
　なお、本発明に係るFOXB2 mRNAを検出する方法に用いられる試薬中には、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤、安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害せず、ＰＣＲ等の核酸増幅反応やハイブリダイゼーション反応を阻害しないものを用いることができる。また、その濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
　緩衝液の具体例を挙げると、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常のＰＣＲ等の核酸増幅反応やハイブリダイゼーション反応を実施する場合に用いられている緩衝液は全て挙げられる。そのpHも特に限定されないが、例えば5～9の範囲が挙げられる。
　また、必要に応じて核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素など）、酵素に応じた基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰなど）、また二本鎖インターカレーター（エチジウムブロマイド、SYBRTM Greenなど）あるいはFAMやTAMRA等の標識検出物質などが用いられる。
　なお、in situ PCR法やin situ ハイブリダイゼーション法を実施した場合には、被検細胞を破壊せずにFOXB2 mRNAの検出を行うことができる。
（２）FOXB2 蛋白質の発現を検出する方法
１）細胞を破壊しないで検出する方法
　FOXB2 蛋白質は転写因子であるので、細胞の核内に存在する。
　細胞を破壊せずに核内物質を染色する技術が開発されているので、その技術を用いて、細胞を破壊せずに核内のFOXB2蛋白質を検出することが出来る。例えば、Triton TM、NP-40、Tween 20 TM、Saponin、Digitonin TM、Leucoperm TMなどの界面活性剤を含む緩衝液を用い、被検細胞の核膜を部分的に可溶化する。すると細胞膜の構造を壊さずに抗体が通れるぐらいの間隙が出来るので、続いて蛍光物質等で標識した抗FOXB2抗体で核タンパク質の染色を行えば、核内のFOXB2蛋白質を検出することができる。
　また、核内物質を染色する各種試薬も市販されている。そこで、これらの市販の試薬を用いて核内のFOXB2蛋白質を染色して、FOXB2蛋白質の発現を検出してもよい。
２）細胞を破壊して検出する方法
　また、細胞を破壊する以下の方法を行って、FOXB2蛋白質を検出することもできる。
　まず被検細胞培養物を濾過又は遠心分離などの常法に付して菌体或いは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、例えば界面活性剤処理、超音波処理、リゾチーム処理、凍結融解などの方法で細胞等の細胞壁及び／又は細胞膜を破壊した後、遠心分離や濾過などの方法でFOXB2蛋白質を含有する抽出液を得る。
　次いで、得られた抽出液中のFOXB2蛋白質を、蛋白質を検出する自体公知の方法で検出すればよい。
　抽出液中のFOXB2蛋白質を検出する方法としては、例えばFOXB2蛋白質に対して親和性を有する物質（例えば抗体等）を用いた、いわゆる酵素免疫測定法（EIA）、放射免疫測定法（RIA）、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、蛍光免疫測定法（FIA）、ウエスタンブロット法、免疫組織化学法、抗体アレイ法、簡易イムノクロマトグラフィーによる測定法、等の自体公知の免疫学的測定法に準じた方法の他、これらと高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、キャピラリーチップ電気泳動法等の組み合わせによる方法等が挙げられる。その測定原理としては、例えばサンドイッチ法、競合法、二抗体法等が挙げられるが、これに限定されない。これらの測定法の具体的な条件は、当業者が適宜設定し得る。
　また、例えば、免疫比ろう法、免疫比濁法等の免疫凝集法に準じた測定法で、FOXB2蛋白質を検出してもよい。これらの検出法も、自体公知の方法に準じて行えばよい。
　上記１）及び２）の方法において、FOXB2蛋白質を検出するために用いられるFOXB2蛋白質に対する抗体（抗FOXB2抗体）は、FOXB2蛋白質やその部分ペプチド、又はそれらの塩を認識し得る抗体であればよく、特に限定されない。
　例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよく、これらを単独であるいはこれらを適宜組み合わせて用いる等は任意である。また、これら抗体は、要すればペプシン，パパイン等の酵素を用いて消化してF（ab'）2、Fab'、或はFabとして使用してもよい。更に、FOXB2蛋白質に対する市販の抗体を用いることもできる。
　当該抗体は、標識物質で標識されていてもよい。標識するために用いられる標識物質としては、例えばＥＩＡ(ELISA)に於いて用いられるアルカリホスファターゼ，β-ガラクトシダーゼ，パーオキシダーゼ，マイクロペルオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース-6-リン酸脱水素酵素，アセチルコリンエステラーゼ，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、例えばＲＩＡで用いられる99mＴc，131Ｉ，125Ｉ，14Ｃ，3Ｈ等の放射性同位元素、例えばＦＩＡで用いられるフルオレセイン，ダンシル，フルオレスカミン，クマリン，ナフチルアミン或はこれらの誘導体等の蛍光性物質、例えばルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス(2,4,6-トリフロロフェニル)オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール，ナフトール，アントラセン或はこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル，3-アミノ-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキシル，2,6-ジ-t-ブチル-α-(3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソ-2,5-シクロヘキサジエン-1-イリデン)-p-トリルオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられる。
　FOXB2蛋白質に対する抗体の具体例としては、例えば「配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対する抗体」や「配列番号３５で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対する抗体」等が挙げられる。
　また、上記したFOXB2蛋白質を検出するために用いられる、試薬及びその検出時の濃度、検出を実施するに際しての測定条件等（反応温度、反応時間、反応時のｐＨ，測定波長、測定装置等）は、すべて自体公知の上記した如き免疫学的測定法の測定操作法に準じて設定すれば良く、使用する自動分析装置、分光光度系等も通常この分野で使用されているものは何れも例外なく使用し得る。
＜Ｉ－２．細胞の分化状態の判定方法＞
　上記の方法により幹細胞のFOXB2遺伝子の発現を検出して得られた結果に基づいて、被検細胞の分化状態を判定する。
　本発明において「分化した／された」又は「分化した状態」とは、細胞が「分化の初期段階」の状態、「将来分化する分化能を獲得した（分化誘導された）」状態、及び「分化した」状態のいずれかの状態にある場合を含む。
　好ましくは、本発明において「分化した／された」又は「分化した状態」とは、細胞が「分化の初期段階」の状態又は「将来分化する分化能を獲得した（分化誘導された）」状態のいずれかの状態にある場合である。
　本発明において「分化の初期段階」とは、分化誘導処理後の早期、具体的には分化誘導処理を行ってから７日目まで、好ましくは６日目まで、より好ましくは３～５日目まで、の時期をいう。
　又は、本発明において「分化の初期段階」とは、未分化幹細胞が三胚葉のいずれかに分化する前の段階、及び分化誘導処理後未分化マーカー（例えばOCT3/4、NANOG、SOX2等）が消失する前の段階、を包含する。
　本発明の分化状態の判定方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
（１）FOXB2 mRNAの発現を検出した結果に基づいて判定する方法
　FOXB2 mRNAを検出した結果に基づいて判定する方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
　１）上記方法により被検細胞のFOXB2 mRNAの検出を行って、FOXB2 mRNAが検出された場合に、その被検細胞は分化した状態である、と判定される。
　２）被検細胞のFOXB2 mRNAの検出を行うと共に、比較として未分化状態であることが確認された未分化幹細胞を用いて同様にFOXB2 mRNAの検出を行う。そして、被検細胞のFOXB2 mRNAの検出量が、比較対象の未分化幹細胞のFOXB2 mRNAの検出量より多い場合に、その被検細胞は分化した状態である、と判定される。この時、被検細胞のFOXB2 mRNAの検出量が比較対象の未分化幹細胞のFOXB2 mRNAの検出量と比較して多いかどうかについては、両者を比較して相対的に判断すればよい。
　３）被検細胞のFOXB2 mRNAの検出量が比較対象の未分化幹細胞のFOXB2 mRNAの検出量と比較して多いかどうかについて、被検細胞のFOXB2 mRNAの検出量と、あらかじめ測定された未分化幹細胞のFOXB2 mRNAの検出量とを比較することによって実施してもよい。そして、被検細胞のFOXB2 mRNAの検出量が、あらかじめ測定された未分化幹細胞のFOXB2 mRNAの検出量より多い場合に、その被検細胞は分化した状態である、と判定される。
　４）被検細胞が分化した状態か否かを判断し得る境界値（カットオフ値）をあらかじめ設定しておき、被検細胞のFOXB2 mRNA検出量が当該境界値より高いかどうかで被検細胞の分化状態を判断してもよい。この場合、被検細胞のFOXB2 mRNAの検出量がカットオフ値よりも高い場合に、その被検細胞は分化した状態である、と判定される。
（２）FOXB2蛋白質を検出した結果に基づいて判定する方法
　FOXB2蛋白質を検出した結果に基づいて判定する方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
　１）上記方法により被検細胞のFOXB2蛋白質の検出を行って、FOXB2蛋白質が検出された場合に、その細胞が分化した状態である、と判定される。
　２）、被検細胞のFOXB2蛋白質の検出を行うと共に、比較として未分化状態であることが確認された未分化幹細胞を用いて同様にFOXB2蛋白質の検出を行う。そして、被検細胞のFOXB2蛋白質の検出量が、比較対象の未分化幹細胞のFOXB2蛋白質の検出量より多い場合に、その被検細胞は分化した状態である、と判定される。この時、被検細胞のFOXB2蛋白質の検出量が比較対象の未分化幹細胞のFOXB2蛋白質の検出量と比較して多いかどうかについては、両者を比較して相対的に判断すればよい。
　３）被検細胞のFOXB2蛋白質の検出量が比較対象の未分化幹細胞のFOXB2蛋白質の検出量と比較して多いかどうかについて、あらかじめ測定された未分化幹細胞のFOXB2蛋白質の検出量と、被検細胞のFOXB2蛋白質の検出量とを比較することによって実施してもよい。そして、被検細胞のFOXB2蛋白質の検出量が、あらかじめ測定された未分化幹細胞のFOXB2蛋白質の検出量より多い場合に、その被検細胞は分化した状態である、と判定される。
　４）更に、被検細胞が分化した状態か否かを判断し得る境界値（カットオフ値）をあらかじめ設定しておき、被検細胞のFOXB2蛋白質検出量が当該境界値より高いかどうかで被検細胞の分化状態を判断してもよい。この場合、被検細胞のFOXB2蛋白質の検出量がカットオフ値よりも高い場合に、その被検細胞は分化した状態である、と判定される。
　本発明の細胞の分化状態の判定方法を実施するには、具体的には例えば以下の方法で行えばよい。
　iPS細胞又はES細胞等の未分化幹細胞（被検細胞）を、公知の方法で分化誘導処理する。次いで分化誘導処理後上限は７日以内、好ましくは６日以内、より好ましくは５日以内、下限は１日以上、好ましくは２日以上、更に好ましくは３日以上培養した後に細胞を採取して、上記の方法でFOXB2遺伝子の発現（FOXB2 mRNAの発現、又はFOXB2蛋白質の発現）を検出する。そして、FOXB2遺伝子の発現が確認された場合に、その細胞は分化した状態である（「その細胞群の中に分化した状態の細胞が存在する」場合を含む。以下同じ。）と判定される。
　又は、被検細胞のFOXB2遺伝子の発現の検出（FOXB2 mRNA又はFOXB2蛋白質の検出）を行うと共に、比較として未分化状態であることが確認された未分化幹細胞を用いて同様にFOXB2遺伝子発現の検出を行う。そして、被検細胞のFOXB2遺伝子発現の検出量（FOXB2 mRNAの発現量、又はFOXB2蛋白質の発現量）が、比較対象の未分化幹細胞のFOXB2遺伝子発現の検出量より多い場合に、その被検細胞は分化した状態である、と判定される。
　また、あらかじめ測定された未分化幹細胞のFOXB2遺伝子発現の検出量（FOXB2 mRNA又はFOXB2蛋白質の検出量）と、被検細胞のFOXB2遺伝子発現の検出量とを比較して、被検細胞のFOXB2遺伝子発現の検出量が比較対象の未分化幹細胞のFOXB2遺伝子発現の検出量と比較して多い場合に、その被検細胞は分化した状態である、と判定される。
　さらに、被検細胞が分化した状態であるか否かを判断し得る境界値（カットオフ値）をあらかじめ設定しておき、被検細胞のFOXB2 mRNAの検出量又はFOXB2蛋白質の検出量が当該境界値より高い場合に、その被検細胞は分化した状態である、と判定される。
　更にまた、分化誘導処理を行っていない未分化幹細胞について、本発明の分化状態の判定方法を実施すれば、その未分化幹細胞が未分化状態を維持しているか否かを確認することもできる。
（３）本発明の応用
　本発明の細胞の分化状態の判定方法は、更に以下の方法に応用することができる。
１）細胞のスクリーニング方法への応用
　ある細胞群を含有する試料に対して、本発明の方法により細胞群を構成する細胞のFOXB2 mRNAを検出する。そして、FOXB2 mRNAが検出された場合にはその試料に分化した状態の細胞（「分化した状態」の意味は前記した通り。以下同じ。）が存在すると判定し、FOXB2 mRNAが検出されない場合にはその試料に分化した状態の細胞が存在しないと判定すればよい。又は、FOXB2蛋白質の発現を検出し、FOXB2蛋白質が検出された場合にはその試料に分化した状態の細胞が存在すると判定し、FOXB2蛋白質が検出されない場合にはその試料に分化した状態の細胞が存在しないと判定すればよい。
２）幹細胞の品質管理への応用
　公知の分化誘導処理を施した幹細胞に対して本発明の方法によりFOXB2遺伝子の発現を検出する（FOXB2 mRNA又はFOXB2蛋白質を検出する）ことにより、当該細胞が分化した状態にあるか、又は未分化幹細胞が混入している状態かを判定できる。そのため、本発明の方法は分化細胞の品質管理に応用することができる。
　また、未分化状態を維持する処理を施した幹細胞に対して、本発明の方法でFOXB2遺伝子の発現を検出する（FOXB2 mRNA又はFOXB2蛋白質を検出する）ことにより、当該細胞が未分化状態を維持しているかを確認できる。そのため、本発明の方法は未分化幹細胞の品質管理に応用することができる。
３）培地の品質検査方法への応用
　未分化幹細胞を、その未分化状態を維持したまま培養するためには、その培地が、例えば分化誘導因子を含まず、未分化細胞の未分化状態を維持したまま培養できる培地である必要がある。本発明の分化状態の判定方法を用いれば、そのような培地の品質検査を行うことができる。
　例えば、未分化幹細胞を判定対象の培地中で数日間、例えば３～７日程度、通常は５～６日程度培養した後、細胞のFOXB2 mRNAの発現を検出し、FOXB2 mRNAが検出されなかった場合に、当該培地が幹細胞の未分化状態を維持しながら培養できる培地であると判定することができる。又は培養後の当該細胞中のFOXB2蛋白質の発現を検出し、FOXB2蛋白質が検出されなかった場合に、当該培地が幹細胞の未分化状態を維持しながら培養できる培地であると判定することができる。
４）分化細胞の調製・単離方法への応用
　本発明の方法を応用して、分化細胞を調製・単離することができる。
　例えば、上記の「(２)FOXB2蛋白質の発現を検出する方法」に記載した「１）細胞を破壊しないで検出する方法」で、標識物質で標識した抗FOXB2蛋白質抗体を、分化した状態の細胞を含むか若しくは含むと予想される細胞と反応させた後、蛍光標識された細胞のみをフローサイトメトリーなどの方法により分離、精製すれば、分化した状態の細胞を調製・単離することができる。
　更に、上記と同様の方法で、蛍光標識されていない細胞のみをフローサイトメトリーなどの方法により分離、製製すれば、未分化幹細胞を調製・単離することができる。
５）分化誘導因子のスクリーニング方法への応用
　本発明を、ある物質が未分化幹細胞の分化誘導能を有するか確認する方法に応用することができる。
　例えば、未分化幹細胞を、被検物質を含有する培地中で数日間、例えば３～７日、通常は５～６日程度培養した後、培養細胞のFOXB2 mRNAの発現を検出し、FOXB2 mRNAが検出された場合に、被検物質は未分化幹細胞の分化を誘導することが確認される。又は当該培養細胞中のFOXB2蛋白質の発現を検出し、FOXB2蛋白質が検出された場合に、被検物質は未分化幹細胞の分化を誘導することが確認される。
＜ＩI．本発明の分化マーカー＞
　本発明の分化マーカーとしては、「FOXB2遺伝子由来のmRNAまたは蛋白質から選択される、分化マーカー。」が挙げられる。具体的には、本発明の分化マーカーは、幹細胞の分化マーカーである。幹細胞の具体例は上記した通りである。
　「FOXB2遺伝子由来のmRNA又は蛋白質」としては、上記した本発明にかかるFOXB2 mRNA及びFOXB2 蛋白質が挙げられる。その具体例は、上記した通りである。
　より具体的には、例えば下記(i)～(vii)から選択される分化マーカーが挙げられる。
（ｉ）配列番号１若しくは配列番号３４で表される塩基配列を有するmRNA
（ｉｉ）配列番号１若しくは配列番号３４で表される塩基配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有する塩基配列を有するmRNA
（ｉｉｉ）配列番号２若しくは配列番号３５で表されるアミノ酸配列をコードするmRNA
（ｉｖ）配列番号２若しくは配列番号３５で表されるアミノ酸配列の１～数個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするmRNA
（ｖ）配列番号２若しくは配列番号３５で表されるアミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードするmRNA
（ｖｉ）配列番号２若しくは配列番号３５で表されるアミノ酸配列又はその１個若しくは数個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質
（ｖｉｉ）配列番号２若しくは配列番号３５で表されるアミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質
が挙げられる。
＜ＩＩＩ．本発明に係る分化状態判定用キット＞
　本発明に係る細胞の分化状態判定用キットとしては、FOXB2遺伝子の発現を検出する試薬を備えたキット、又はFOXB2遺伝子の発現量を測定する試薬を備えたキットが挙げられる。
　例えば、以下のものが挙げられる。
（ａ）FOXB2 mRNAの発現を検出するか又はその発現量を測定するために使用されるプライマー、又はそれらの標識物を備えたキット
（ｂ）FOXB2蛋白質の発現を検出するか又はその発現量を測定するために使用されるFOXB2蛋白質に対する抗体（FOXB2蛋白質を認識する抗体、好ましくはFOXB2蛋白質に特異的に結合する抗体）又は該抗体の標識物等を備えたキット
　上記キットを構成する構成試薬の好ましい態様及び具体例は上記した通りである。
　上記（ａ）に係る「FOXB2 mRNAの発現を検出するか又はその発現量を測定するために使用されるプライマー」の例としては、例えば「配列番号１若しくは配列番号３４で表される塩基配列又はその部分配列を検出するために用いられるプライマー」が挙げられる。
　より具体的には、例えば
(ａ－１)逆転写反応で得られたcDNAを鋳型としてPCRを行う際に用いられるプライマー対、又は
(ａ－２)逆転写反応に用いられる増幅プライマーと、逆転写反応で得られたcDNAを鋳型としてPCRを行う際に用いられるプライマー対の組合せ、が挙げられる。
　（ａ－１）のプライマー対を構成するプライマーは、必要に応じて少なくとも一方が標識物質で標識されていてもよい。
　（ａ－１）のプライマー対の具体例としては、「配列番号９で表される塩基配列を有するプライマーと配列番号１０で表される塩基配列を有するプライマーとのプライマー対」又は「配列番号４５で表される塩基配列を有するプライマーと配列番号４６で表される塩基配列を有するプライマーとのプライマー対」が挙げられる。
　(ａ－２)の具体例としては、「配列番号４で表されるプライマーと、配列番号９で表される塩基配列を有するプライマーと配列番号１０で表される塩基配列を有するプライマーとのプライマー対、との組合せ」又は「配列番号３７で表されるプライマーと、配列番号４５で表される塩基配列を有するプライマーと配列番号４６で表される塩基配列を有するプライマーとのプライマー対、との組合せ」が挙げられる。
　上記（ｂ）に係る「FOXB2蛋白質の発現を検出するか又はその発現量を測定するために使用されるFOXB2蛋白質に対する抗体」の具体例は上記した通りである。
　例えば「配列番号２若しくは配列番号３５で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対する抗体」が挙げられる。
　上記(ａ－１)又は（ａ－２）を構成要件として含むキットには、更にRT-PCR法に使用する逆転写酵素や、必要に応じて更に核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ等）、酵素に応じた基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰなど）、また二本鎖インターカレーター（SYBRTM Green、エチジウムブロマイドなど）あるいはFAMやTAMRA等の標識検出物質等を含んでいてもよい。
　また、上記(ａ－１)又は（ａ－２）を構成要件として含むキットには、例えば緩衝剤、安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害せず、ＰＣＲやハイブリダイゼーション反応を阻害しないものが含まれていてもよい。また、その濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
　緩衝液の具体例を挙げると、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常のＰＣＲやハイブリダイゼーション反応を実施する場合に用いられている緩衝液は全て挙げられる。そのpHも特に限定されないが、例えば5～9の範囲が挙げられる。
　上記(ｂ)を構成要件として含むキットに含まれる試薬中には、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤、増感剤、界面活性剤、防腐剤（例えばアジ化ナトリウム、サリチル酸、安息香酸等）、安定化剤（例えばアルブミン、グロブリン、水溶性ゼラチン、界面活性剤、糖類等）、賦活剤、共存物質の影響回避剤その他この分野で用いられているものであって、共存する試薬との安定性を阻害したり、抗原抗体反応を阻害しないものを有していてもよい。またこれら試薬類等の濃度範囲等も、自体公知の該測定方法において通常用いられる濃度範囲等を適宜選択して用いればよい。緩衝剤等の具体例、そのpH及び濃度は上記した通りである。
　また、本発明に係る細胞の分化状態判定用キットに含まれる（ａ－１）、（ａ－２）（ｂ－１）等は、適当な緩衝液中に懸濁させた懸濁液等の溶液状態のもの、若しくはこれを凍結した凍結品や凍結乾燥した凍結乾燥品であってもよい。この目的に用いられる緩衝剤等の具体例、そのpH及び濃度は上記した通りである。
　更にまた本発明のキットには、本発明に係る幹細胞のFOXB2遺伝子の発現（例えばFOXB2 mRNAの発現又はFOXB2蛋白質の発現）を検出する方法に使用するための説明書、又は本発明の細胞の分化状態を判定する方法を実施するための説明書等を含ませておいてもよい。当該「説明書」とは、当該方法における特徴・原理・操作手順、判定手順等が文章又は図表等により実質的に記載されている当該キットの取扱説明書、添付文書、あるいはパンフレット（リーフレット）等を意味する。
　以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１．
　分化誘導処理したhiPS細胞の、FOXB2 mRNA及び公知の未分化マーカーの発現を、RT-PCR法により検出した。
（１）幹細胞の培養と分化誘導処理
　hiPS細胞(201B7株、京都大学iPS 細胞研究所（iPSアカデミアジャパン株式会社）)、及び比較として、分化した細胞であるHDF細胞（ヒト正常細胞由来繊維芽細胞、ロンザジャパン(株)製）を、bFGF添加（100ng/mL）又は無添加の培地（StemSure hPSC Medium、和光純薬工業（株）製）で3回継代培養し、培養5日目に細胞を回収した。
（２）Total RNA の抽出
　市販の核酸抽出試薬であるキットISOGEN（ニッポンジーン製）を用い、現品説明書に従って、上記(１)で回収した細胞から、Total RNAを抽出した。
（３）DNase処理
　上記(２)で抽出したTotal RNAの1μgに、全量17μLになるように蒸留水を加え、10X Reaction Buffer（プロメガ(株)製）を2μL、RQ1 RNase-Free DNase（プロメガ(株)製）を1μL(1U)を加え混合し、37℃、20分間インキュベートした。その後、Stop Buffer(20mM EGTA)（プロメガ(株)製）を1μL加え混合し、65℃、10分間インキュベートした。その後、反応物に結合Buffer（5.5Mグアニジン塩酸塩（和光純薬工業(株)製）、20mM Tris-HCl pH6.6）を100μL加え混合した後、エコノスピン（核酸精製用シリカメンブレンスピンカラム、(株)ジーンデザイン製）に移し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。次いで、チューブに洗浄Buffer（2mM Tris-HCl pH7.5（(株)ニッポンジーン）、80% エタノール（和光純薬工業(株)製））を500μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。更に12000×g、室温、1分間遠心分離した後、エコノスピン（mRNAが結合している）を新しいチューブに交換し、溶出Buffer（10mMTris-HCl pH8.0）（ニッポンジーン(株)製）を50μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離してTotal RNAを回収した。その後、エタノール沈殿を行い、得られた沈殿物を蒸留水9.5μLに溶解した。
（４）逆転転写反応
　上記(３)でDNase処理したTotal RNA 9.5μLに、下記の各mRNAを標的とする増幅プライマーを含む混合Primer（各5μM）1μLを加えた。下記プライマーは、すべてシグマアルドリッチ社製である。
　・FOXB2 mRNAの増幅プライマー、CAGAAGCTACCCTTGCCAG （配列番号４、GenBank Accession No. NM_001013735 : 242-260（GenBank Accession No. NM_001013735の塩基配列の242-260番目の塩基配列の相補鎖の塩基配列に相当する。以下同じ。））、
　・OCT3/4 mRNAの増幅プライマー、GTTCTTGAAGCTAAGCTGCAG （配列番号５、GenBank Accession No. NM_002701 :  641-661）、
　・NANOG mRNAの増幅プライマー、GTTCTGGAACCAGGTCTTCAC （配列番号６、GenBank Accession No. NM_024865 : 631-651）、
　・SOX2 mRNAの増幅プライマー、GACCACACCATGAAGGCATTC （配列番号７、GenBank Accession No. NM_003106 : 572-592）、
　・GAPDH mRNAの増幅プライマー、GTCTACATGGCAACTGTGAGG （配列番号８、GenBank Accession No. NM_002046 : 1303-1323）
（GAPDH：グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）
　それぞれの混合物を、72℃、3分間インキュベートした後、直ちに氷冷した。次いで、5×Buffer（東洋紡(株)製）4μL、2.5mM dNTPs（ニッポンジーン(株)製）4μL、RNase Inhibitor, super（和光純薬工業(株)製）0.5μL(20U)、ReverTra Ace（東洋紡(株)製）1μL(100U)加え混合し、42℃、50分間インキュベートした。その後、結合Buffer（5.5Mグアニジン塩酸塩（和光純薬工業(株)製）、20mM Tris-HCl pH6.6（和光純薬工業(株)製））を100μL加え混合し、エコノスピン（核酸精製用シリカメンブレンスピンカラム、(株)ジーンデザイン製）に移し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。その後、洗浄Buffer（2mM Tris-HCl pH7.5（ニッポンジーン(株)製）、80%エタノール（和光純薬工業(株)製））を500μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。その後、更に12000×g、室温、1分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、溶出Buffer（10mMTris-HCl pH8.5）（ニッポンジーン(株)製）を25μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離して、得られた沈殿物を蒸留水 １μLに溶解させてcDNAを回収した。
　なお、本実験系にゲノムDNAが混在していないことを確認するために、同じ試料を用い、RTase（ReverTra Ace（東洋紡(株)製）、逆転写酵素）を加えない以外は上記と同様の反応を行った。
（５）PCR反応
　上記(４)で得られたcDNA 1μLと、蒸留水5μL、2×PCR Buffer for KOD FX Neo （東洋紡）12.5μL、2 mM dNTPs（東洋紡）4μL、KOD FX Neo（東洋紡）0.5μL（0.5Ｕ）、各フォワードプライマー（10μM）1μL、各リバースプライマー（10μM）1μLを混合した。
　使用した各プライマーの塩基配列は、以下の通りである。下記プライマーは、すべてシグマアルドリッチ社製である。
FOXB2 cDNA、GenBank Accession No. NM_001013735 : 45-67、201-223
フォワードプライマー: CTACTCTTACATCTCGCTGACCG（配列番号９）
リバースプライマー: GAATCTTGATGAAGCAGTCGTTG（配列番号１０）
増幅鎖長 : 179bp
※配列番号９のフォワードプライマーと配列番号１０のリバースプライマーは、それぞれFOXB2 cDNA、GenBank Accession No. NM_001013735の45-67番目の塩基配列及び、201-223番目の塩基配列をもとに設計された。以下同じ。
　よって、このプライマーペアを用いた核酸増幅反応により、FOXB2遺伝子（配列番号１で表される塩基配列）の45～223番目の、179bpの領域（配列番号３）（GenBank Accession No. NM_001013735.1のposition 45-223）が増幅される。
OCT3/4 cDNA、GenBank Accession No. NM_002701 : 340-361、515-535
フォワードプライマー: CTTGGAGACCTCTCAGCCTGAG（配列番号１１）
リバースプライマー: CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG（配列番号１２）
増幅鎖長 : 196bp
NANOG cDNA、GenBank Accession No. NM_024865 : 284-305、528-550
フォワードプライマー: CACCTATGCCTGTGATTTGTGG（配列番号１３）
リバースプライマー: CATTGAGTACACACAGCTGGGTG（配列番号１４）
増幅鎖長 : 267bp
SOX2 cDNA、GenBank Accession No. NM_003106 : 31-54、443-464
フォワードプライマー: GTATCAGGAGTTGTCAAGGCAGAG（配列番号１５）
リバースプライマー: CAGCTCCGTCTCCATCATGTTG（配列番号１６）
増幅鎖長 : 434bp
GAPDH cDNA、GenBank Accession No. NM_002046 : 240-260、618-638
フォワードプライマー: GTCACCAGGGCTGCTTTTAAC（配列番号１７）
リバースプライマー: GGCATTGCTGATGATCTTGAG（配列番号１８）
増幅鎖長 : 399bp
　それぞれの混合物をサーマルサイクラーにセットし94℃ 2分間、98℃ 10秒間→56℃ 20秒間→68℃ 30秒間をOCT3/4 cDNA、NANOG cDNA、SOX2 cDNA及びFOXB2 cDNAを増幅させる場合は28サイクル、GAPDH cDNAを増幅させる場合は20サイクル行った後、68℃ 2分間反応させた。
（６）電気泳動
　上記(５)で得られたPCR増幅産物5μLと、6×Loading Buffer Double Dye（ニッポンジーン(株)製）1μLとを混合し、これを1.5%アガロースゲルにて電気泳動した。染色はGelRed核酸ゲル染色液（和光純薬工業(株)製）にて行った。
　なお、上記(４)でRTaseを加えないで反応を行って得られた反応物についても、上記の(５)～(６)の処理を行った。
（７）結果
　結果を図１に併せて示す。
　図１の結果から明らかな通り、一般的によく確認されている未分化マーカーであるOCT3/4 mRNA（図１(3)）、NANOG mRNA（図１(4)）及びSOX2 mRNA（図１(5)）は、未分化・多能性を維持している状態のhiPS細胞（hiPS・bFGF(+)・RTase(+)の場合）では発現していた。また、分化誘導処理後５日目のhiPS細胞（hiPS・bFGF(-)・RTase(+)の場合）でも、まだ発現している（バンドが確認された）ことが確認された。しかし、OCT3/4 mRNA、NANOG mRNA及びSOX2 mRNAは、分化した細胞であるHDF細胞では発現していなかった。
　一方、FOXB2 mRNA（図１(1)）は、分化誘導処理後５日目のhiPS細胞（hiPS・bFGF(-)・RTase(+)の場合）では発現している（バンドが確認された）ことが確認された。しかし、FOXB2 mRNAは、未分化・多能性を維持している状態のhiPS細胞（hiPS・bFGF(+)・RTase(+)の場合）と、分化した細胞（特に分化が完了した細胞）であるHDF細胞では発現していなかった。
　なお、すべてのmRNAの検出結果でRTase(-)の場合にバンドが確認されなかったことから、本実験系には、ゲノムDNAの混入が無いことが確認された。
　また、GAPDH mRNAの検出結果（図１(2)）を見ると、“hiPS・bFGF(+)・RTase(+)”、“hiPS・bFGF(-)・RTase(+)”、“HDF・RTase(+)”の場合にバンドが確認され、“hiPS・bFGF(+)・RTase(-)”、“hiPS・bFGF(-)・RTase(-)”、“DF・RTase(-)”の場合にバンドが確認されなかった。このことから本実験系ではmRNAは分解されていないことが確認された。
　従って、FOXB2 mRNAが分化マーカーとして有用であり、FOXB2 mRNAを検出することで、細胞の分化状態を判定することができることが明らかになった。また、一般的に測定されている未分化マーカー(OCT3/4, NANOG, SOX2）の発現の変化が検出されていない段階でも顕著にFOXB2 mRNAの発現が検出されたことから、FOXB2 mRNAは、従来の未分化マーカーよりも分化の初期段階で細胞の分化状態を判定できることがわかった。
実施例２．
（１）幹細胞の培養と分化誘導処理
　hiPS細胞(201B7株、京都大学iPS 細胞研究所（iPSアカデミアジャパン株式会社）)をbFGF添加又は無添加の培地（StemSure hPSC Medium、和光純薬工業（株）製）で培養し、培養３日目、５日目、７日目に、細胞を回収した。
　また、比較として及び分化した細胞であるHDF細胞（ヒト正常細胞由来繊維芽細胞、ロンザジャパン(株)製）をMEM培地（+10%FBS）(和光純薬工業（株）製）で培養し、培養7日目に細胞を回収した。
（２）Total RNA の抽出
　実施例１(２)と同様の方法で、上記(1)で回収した培養３日目、５日目、７日目の細胞から、それぞれTotal RNAを抽出した。
　また、比較としてHMSC-bm細胞（ヒト骨髄由来間葉系幹細胞）のTOTAL RNA（ScienCell Research Laboratories社製）を用いた。
（３）DNase処理
　実施例１(３)と同様の方法で上記(2)で抽出したTotal RNA、及びHMSC-bm細胞のTOTAL RNAの1μgを、それぞれDNAase処理した。
（４）逆転転写反応
　上記(３)でDNase処理したTotal RNA 9.5μLに、下記のプライマーを含む混合Primer（各5μM）1μLを加えた。下記プライマーは、すべてシグマアルドリッチ社製である。
　・FOXB2 mRNAの増幅プライマー、CAGAAGCTACCCTTGCCAG （配列番号４、GenBank Accession No. NM_001013735 : 242-260）、
　・OCT3/4 mRNAの増幅プライマー、GTTCTTGAAGCTAAGCTGCAG （配列番号５、GenBank Accession No. NM_002701 :  641-661）、
　・NANOG mRNAの増幅プライマー、GTTCTGGAACCAGGTCTTCAC （配列番号６、GenBank Accession No. NM_024865 : 631-651）、
　・SOX2 mRNAの増幅プライマー、GACCACACCATGAAGGCATTC （配列番号７、GenBank Accession No. NM_003106 : 572-592）、
　・GAPDH mRNAの増幅プライマー、GTCTACATGGCAACTGTGAGG （配列番号８、GenBank Accession No. NM_002046 : 1303-1323）
　それぞれの混合物について、実施例１(４)と同様の方法で、逆転写反応を行い、それぞれcDNAを回収した。
（５）PCR反応
　上記(４)で得られたcDNA 1μL、蒸留水5μL、2×PCR Buffer for KOD FX Neo（東洋紡(株)製）12.5μL、2 mM dNTPs（東洋紡(株)製）4μL、KOD FX Neo（東洋紡(株)製）0.5μL（0.5Ｕ）、各Forward primer（10μM）1μL、各Reverse primer（10μM）1μLを混合した。
　使用した各Primerの塩基配列は、以下の通りである。下記プライマーは、すべてシグマアルドリッチ社製である。
FOXB2 cDNA、GenBank Accession No. NM_001013735 : 45-67、201-223
フォワードプライマー: CTACTCTTACATCTCGCTGACCG（配列番号９）
リバースプライマー: GAATCTTGATGAAGCAGTCGTTG（配列番号１０）
増幅鎖長 : 179bp
OCT3/4 cDNA、GenBank Accession No. NM_002701 : 340-361、515-535
フォワードプライマー: CTTGGAGACCTCTCAGCCTGAG（配列番号１１）
リバースプライマー: CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG（配列番号１２）
増幅鎖長 : 196bp
NANOG cDNA、GenBank Accession No. NM_024865 : 284-305、528-550
フォワードプライマー: CACCTATGCCTGTGATTTGTGG（配列番号１３）
リバースプライマー: CATTGAGTACACACAGCTGGGTG（配列番号１４）
増幅鎖長 : 267bp
SOX2 cDNA、GenBank Accession No. NM_003106 : 31-54、443-464
フォワードプライマー: GTATCAGGAGTTGTCAAGGCAGAG（配列番号１５）
リバースプライマー: CAGCTCCGTCTCCATCATGTTG（配列番号１６）
増幅鎖長 : 434bp
GAPDH cDNA、GenBank Accession No. NM_002046 : 240-260、618-638
フォワードプライマー: GTCACCAGGGCTGCTTTTAAC（配列番号１７）
リバースプライマー: GGCATTGCTGATGATCTTGAG（配列番号１８）
増幅鎖長 : 399bp
　それぞれの混合物をサーマルサイクラーにセットし94℃ 2分間、98℃ 10秒間→56℃ 20秒間→68℃ 30秒間をOCT3/4 cDNA、NANOG cDNA、SOX2 cDNA及びFOXB2 cDNAを増幅させる場合は28サイクル、GAPDH cDNAを増幅させる場合は20サイクル行った後、68℃ 2分間反応させた。
（６）電気泳動
　PCR増幅産物5μLと、6×Loading Buffer Double Dye（ニッポンジーン(株)製）1μLとを混合し、これを1.5%アガロースゲルにて電気泳動した。染色はGelRed核酸ゲル染色液（和光純薬工業(株)製）にて行った。
　なお、上記(４)でRTaseを加えないで反応を行って得られた反応物についても、上記の(５)～(６)の処理を行った。
（７）結果
　結果を図２に併せて示す。
　図２の結果から明らかな通り、hiPS細胞をbFGF無添加培地で培養して分化誘導処理した場合、FOXB2 mRNAは、培養期間が長くなるのに比例して、発現量が増加した。
　これに対し、FOXB2 mRNA以外の公知の未分化マーカー（OCT3/4 mRNA, NANOG mRNA, SOX2 mRNA, GAPDH mRNA）は、bFGF無添加培地で培養して分化誘導処理しても、分化誘導処理後７日までは、まだ消失せずに発現していることが確認された。
　一方、HMSC-bm（ヒト骨髄由来間葉系幹細胞）をbFGF無添加培地で培養しても、FOXB2 mRNAの発現も、公知の未分化マーカー（OCT3/4 mRNA, NANOG mRNA, SOX2 mRNA, GAPDH mRNA）の発現も確認されなかった。HMSC-bmは、幹細胞（RS細胞）から中胚葉を経て形成される体性幹細胞である。このことから、未分化幹細胞の分化がこの程度まで進んでしまうと、FOXB2 mRNAは発現しなくなること、言い換えればFOXB2 mRNAは細胞の分化の初期に特異的に発現することが推察される。
　また、培養５日目のHDF細胞は、FOXB2 mRNAの発現も、公知の未分化マーカー（OCT3/4 mRNA, NANOG mRNA, SOX2 mRNA, GAPDH mRNA）の発現も確認されなかった。
　なお、すべてのmRNAの検出結果でRTase(-)の場合にバンドが確認されなかったことから、本実験系には、ゲノムDNAの混入が無いことが確認された。また、GAPDH mRNAは、RTase(+)の全ての場合で検出されているので、この本実験系ではmRNAは分解されず、mRNAの発現を正しく検出できていることが確認された。
　以上の結果から明らかな通り、FOXB2 mRNAの発現が、一般的に測定されている未分化マーカー(OCT3/4, NANOG, SOX2）の発現の変化が検出されるよりも早く検出された。このことから、FOXB2 mRNAは細胞の分化の初期段階の分化マーカーとして、特に有用であること、言い換えれば、FOXB2 mRNAの発現を検出することで、細胞の分化の状態を、分化の初期段階で判定することができることが明らかになった。
実施例３．
（１）幹細胞の培養と分化誘導処理
　hiPS細胞(201B7株、京都大学iPS 細胞研究所（iPSアカデミアジャパン株式会社）)、及び比較として、分化した細胞であるHDF細胞（ヒト正常細胞由来繊維芽細胞、ロンザジャパン(株)製）を、bFGF添加（100ng/mL）又は無添加の培地（StemSure hPSC Medium、和光純薬工業(株)製）で3回継代培養し、培養６日目に細胞を回収した。
（２）Total RNA の抽出
　市販の核酸抽出試薬であるキットISOGEN（(株)ニッポンジーン製）を用い、現品説明書に従って、上記(１)で回収した細胞から、Total RNAを抽出した。
（３）DNase処理
　実施例１(３)と同様の方法で、上記(２)で抽出したTotal RNAの1μgを、それぞれDNase処理した。
（４）逆転転写反応
　上記(３)でDNase処理したTotal RNA 9.5μLに、下記の各mRNAを標的とする増幅プライマーを含む混合Primer（各5μM）1μLを加えた。下記プライマーは、すべてシグマアルドリッチ社製である。
　・FOXB2 mRNAの増幅プライマー、CAGAAGCTACCCTTGCCAG（配列番号４、GenBank Accession No. NM_001013735 : 242-260）
　・OCT3/4 mRNAの増幅プライマー、GTTCTTGAAGCTAAGCTGCAG（配列番号５、GenBank Accession No. NM_002701 :  641-661）
　・NANOG mRNAの増幅プライマー、GTTCTGGAACCAGGTCTTCAC（配列番号６、GenBank Accession No. NM_024865 : 631-651）
　・SOX2 mRNAの増幅プライマー、GACCACACCATGAAGGCATTC（配列番号７、GenBank Accession No. NM_003106 : 572-592）
　・FGF5 mRNAの増幅プライマー、 CTCCCTGAACTTGCAGTCATC（配列番号１９、GenBank Accession No. NM_004464 : 709-729）
・CDX2 mRNAの増幅プライマー、CCTGAGGAGTCTAGCAGAGTC（配列番号２０、GenBank Accession No. NM_001265 : 1359-1379）
・GATA4 mRNAの増幅プライマー、GATTACGCAGTGATTATGTCCC（配列番号２１、GenBank Accession No. NM_001308094 : 1110-1131）
・GATA6 mRNAの増幅プライマー、CATCTTGACCCGAATACTTGAG（配列番号２２、GenBank Accession No. NM_005257 : 1961-1982）
・SOX17 mRNAの増幅プライマー、CCCAGGAGTCTGAGGATTTCC（配列番号２３、GenBank Accession No. NM_022454 : 1515-1535）
　・GAPDH mRNAの増幅プライマー、GTCTACATGGCAACTGTGAGG（配列番号８、GenBank Accession No. NM_002046 : 1303-1323）
　それぞれの混合物を、72℃、3分間インキュベートした後、直ちに氷冷した。次いで、5×Buffer（東洋紡(株)製）4μL、2.5mM dNTPs（(株)ニッポンジーン製）4μL、RNase Inhibitor, super（和光純薬工業(株)製）0.5μL(20U)、ReverTra Ace（東洋紡(株)製）1μL(100U)加え混合し、42℃、50分間インキュベートした。その後、結合Buffer（5.5Mグアニジン塩酸塩（和光純薬工業(株)製）、20mM Tris-HCl pH6.6（和光純薬工業(株)製））を100μL加え混合し、エコノスピン（(株)ジーンデザイン製）に移し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。その後、洗浄Buffer（2mM Tris-HCl pH7.5（(株)ニッポンジーン製）、80%エタノール（和光純薬工業(株)製）を500μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。その後、更に12000×g、室温、1分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、溶出Buffer（10mMTris-HCl pH8.5）（(株)ニッポンジーン製）を25μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離して、得られた沈殿物を蒸留水 １μLに溶解させてcDNAを回収した。
（５）PCR反応
　上記(４)で得られたcDNA 1μL、蒸留水5μL、2× PCR Buffer for KOD FX Neo（東洋紡(株)製）12.5μL、2 mM dNTPs（東洋紡(株)製）4μL、KOD FX Neo（東洋紡(株)製）0.5μL（0.5Ｕ）、各Forward primer（10μM）1μL、各Reverse primer（10μM）1μLを混合した。
　使用した各Primerの塩基配列は、以下の通りである。下記プライマーは、すべてシグマアルドリッチ社製である。
FOXB2 cDNA、GenBank Accession No. NM_001013735 : 45-67、201-223
Forward primer : CTACTCTTACATCTCGCTGACCG（配列番号９）
Reverse primer : GAATCTTGATGAAGCAGTCGTTG（配列番号１０）
増幅鎖長 : 179bp
OCT3/4 cDNA、GenBank Accession No. NM_002701 : 340-361、515-535
Forward primer : CTTGGAGACCTCTCAGCCTGAG（配列番号１１）
Reverse primer : CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG（配列番号１２）
増幅鎖長 : 196bp
NANOG cDNA、GenBank Accession No. NM_024865 : 284-305、528-550
Forward primer : CACCTATGCCTGTGATTTGTGG（配列番号１３）
Reverse primer : CATTGAGTACACACAGCTGGGTG（配列番号１４）
増幅鎖長 : 267bp
SOX2 cDNA、GenBank Accession No. NM_003106 : 31-54、443-464
Forward primer : GTATCAGGAGTTGTCAAGGCAGAG（配列番号１５）
Reverse primer : CAGCTCCGTCTCCATCATGTTG（配列番号１６）
増幅鎖長 : 434bp
FGF5 cDNA、GenBank Accession No. NM_004464 : 462-482、615-637
Forward primer : GCAGAGCAGTTTCCAGTGGAG（配列番号２４）
Reverse primer : GTATTCCTACAATCCCCTGAGAC（配列番号２５）
増幅鎖長 :176bp
CDX2 cDNA、GenBank Accession No. NM_001265 : 923-944、1176-1196
Forward primer : CAAATATCGAGTGGTGTACACG（配列番号２６）
Reverse primer : GACACTTCTCAGAGGACCTGG（配列番号２７）
増幅鎖長 :274bp
GATA4 cDNA、GenBank Accession No. NM_001308094 : 795-816、1020-1040
Forward primer : CAGCTCCTTCAGGCAGTGAGAG（配列番号２８）
Reverse primer : CGGGAGACGCATAGCCTTGTG（配列番号２９）
増幅鎖長 :246bp
GATA6 cDNA、GenBank Accession No. NM_005257 : 1682-1703、1842-1864
Forward primer : GCTTGTGGACTCTACATGAAAC（配列番号３０）
Reverse primer : GCTGCAATCATCTGAGTTAGAAG（配列番号３１）
増幅鎖長 :183bp
SOX17 cDNA GenBank Accession No. NM_022454 : 1286-1306、1490-1511
Forward primer : CGGAATTTGAACAGTATCTGC（配列番号３２）
Reverse primer : GCTCCTCCAGGAAGTGTGTAAC（配列番号３３）
増幅鎖長 :226bp
GAPDH cDNA、GenBank Accession No. NM_002046 : 240-260、618-638
Forward primer : GTCACCAGGGCTGCTTTTAAC（配列番号１７）
Reverse primer : GGCATTGCTGATGATCTTGAG（配列番号１８）
増幅鎖長 : 399bp
　それぞれの混合物をサーマルサイクラーにセットし94℃ 2分間、98℃ 10秒間→56℃ 20秒間→68℃ 30秒間をOCT3/4 cDNA、NANOG cDNA及びSOX2 cDNAを増幅させる場合は24サイクル、FOXB2 cDNA、FGF5 cDNA、GATA4 cDNA、GATA6 cDNA及びSOX17 cDNAを増幅させる場合は28サイクル、GAPDH cDNAを増幅させる場合は20サイクル、68℃ 2分間反応させた。
（６）電気泳動
　上記(５)で得られたPCR増幅産物5μLと、6×Loading Buffer Double Dye（(株)ニッポンジーン製）1μLとを混合し、これを1.5%アガロースゲルにて電気泳動した。染色はGelRed核酸ゲル染色液（和光純薬工業(株)製）にて行った。
　なお、上記(４)でRTaseを加えないで反応を行って得られた反応物についても、上記の(５)～(６)の処理を行った。
（７）結果
　結果を図３に併せて示す。
　図３の結果から明らかな通り、hiPS細胞をbFGF無添加培地で培養して分化誘導した場合、分化誘導後（hiPS・bFGF(-)・RTase(+)の場合）６日目でも、未分化マーカーであるOCT3/4 mRNA、NANOG mRNA及びSOX2 mRNAは、まだ発現している（バンドが確認された）ことが確認された。
　また、公知の分化マーカーであるFGF5 mRNA（外胚葉分化マーカー）、CDX2 mRNA（外胚葉分化マーカー）、GATA4 mRNA（内胚葉分化マーカー）、GATA6 mRNA（内胚葉分化マーカー）、SOX7 mRNA（内胚葉分化マーカー）、SSEA-1 mRNA（分化マーカー）は、分化誘導処理後６日目のhiPS細胞では、まだ発現していない（バンドが確認されなかった）ことが確認された。
　一方、FOXB2 mRNAは、分化誘導処理後６日目のhiPS細胞（hiPS・bFGF(-)・RTase(+)の場合）では発現している（バンドが確認された）ことが確認された。
　なお、すべてのmRNAの検出結果でRTase(-)の場合にバンドが確認されなかったことから、本実験系には、ゲノムDNAの混入が無いことが確認された。
　また、GAPDH mRNAの検出結果を見ると、“hiPS・bFGF(+)・RTase(+)”、“hiPS・bFGF(-)・RTase(+)”、“HDF・RTase(+)”の場合にバンドが確認され、“hiPS・bFGF(+)・RTase(-)”、“hiPS・bFGF(-)・RTase(-)”、“DF・RTase(-)”の場合にバンドが確認されなかった。このことから本実験系ではmRNAは分解されていないことが確認された。
　従って、FOXB2 mRNAが分化マーカーとして有用であり、FOXB2 mRNAを検出することで、細胞の分化状態を判定することができることが明らかになった。また、一般的な未分化マーカー(OCT3/4, NANOG, SOX2）の発現の変化が検出されていない段階でも顕著にFOXB2 mRNAの発現が検出された。
　更に、現在最も有望な分化マーカーとして知られているFGF5 mRNAがまだ発現していない段階で、FOXB2 mRNAの発現が検出された。すなわち、FOXB2 mRNAは、従来の分化マーカや未分化マーカーよりも分化の早い段階（初期段階）で、細胞の分化状態を判定できることがわかった。
　以上のことから、FOXB2 mRNAは従来の分化・未分化マーカーよりも極めて有用な分化マーカーであることが明らかになった。また、培養初期で分化した細胞を判定できることから、細胞の早期スクリーニングや幹細胞の品質管理等に有用であり、培養期間の短縮、培地代の経費削減などが期待できる。
実施例４．
　マウスES細胞をLIF無添加培地で培養して分化誘導処理し、FOXB2 mRNA及び公知の未分化マーカーの発現を、RT-PCR法により検出した。
（１）幹細胞の培養と分化誘導処理
　　mES細胞(D3株、ATCC、b723512)を、LIF添加（1000Unit）又は無添加の培地（StemSure DMEM、StemSure Serum replacement、MEM非必須アミノ酸溶液、L-グルタミン溶液、StemSure 2-メルカプトエタノール溶液、和光純薬工業(株)製）で3回継代培養し、培養３日目、5日目、７日目、に細胞を回収した。
（２）Total RNA の抽出
　市販の核酸抽出試薬であるキットISOGEN（(株)ニッポンジーン製）を用い、現品説明書に従って、上記(１)で回収した細胞から、Total RNAを抽出した。
（３）DNase処理
　上記(２)で抽出したTotal RNAの1μgに、全量17μLになるように蒸留水を加え、10X Reaction Buffer（プロメガ(株)製）を2μL、RQ1 RNase-Free DNase（プロメガ(株)製）を1μL(1U)を加え混合し、37℃、20分間インキュベートした。その後、Stop Buffer(20mM EGTA)（プロメガ(株)製）を1μL加え混合し、65℃、10分間インキュベートした。その後、反応物に結合Buffer（5.5Mグアニジン塩酸塩（和光純薬工業(株)製）、20mM Tris-HCl pH6.6）を100μL加え混合した後、エコノスピン（核酸精製用シリカメンブレンスピンカラム、(株)ジーンデザイン製）に移し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。次いで、チューブに洗浄Buffer（2mM Tris-HCl pH7.5（(株)ニッポンジーン製）、80% エタノール（和光純薬工業(株)製）を500μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。更に12000×g、室温、1分間遠心分離した後、エコノスピン（mRNAが結合している）を新しいチューブに交換し、溶出Buffer（10mMTris-HCl pH8.0）（(株)ニッポンジーン製）を50μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離してTotal RNAを回収した。その後、エタノール沈殿を行い、得られた沈殿物を蒸留水9.5μLに溶解した。
（４）逆転転写反応
　上記(３)でDNase処理したTotal RNA 9.5μLに、下記の各mRNAを標的とする増幅プライマーを含む混合Primer（各5μM）1μLを加えた。下記プライマーは、すべてシグマアルドリッチ社製である。
・Foxb2 mRNAの増幅プライマー、CATGATGAACTTGTAGATGTC（配列番号３７、GenBank Accession No. NM_008023 : 302-322）
・Oct3/4 mRNAの増幅プライマー、CATGTTCTTAAGGCTGAGCTGC（配列番号３８、GenBank Accession No. NM_013633 : 617-638）
・Nanog mRNAの増幅プライマー、CTGAATCAGACCATTGCTAGTC（配列番号３９、GenBank Accession No. NM_028016 : 388-408）
・Sox2 mRNAの増幅プライマー、CAACGATATCAACCTGCATGG（配列番号４０、GenBank Accession No. NM_011443 : 2120-2140）
・Klf2 mRNAの増幅プライマー、GAACTGGTGGCAGAGTCATTTTC（配列番号４１、GenBank Accession No. NM_008452 : 1205-1227）
・Esrrb mRNAの増幅プライマー、GATTCGAGACGATCTTAGTCAATG（配列番号４２、GenBank Accession No. NM_011934 : 957-980）
・Fgf5 mRNAの増幅プライマー、GACGCATAGGTATTATAGCTG（配列番号４３、GenBank Accession No. NM_010203 : 729-749）
・Gapdh mRNAの増幅プライマー、CTTGATGTCATCATACTTGGC（配列番号４４、GenBank Accession No. NM_001289726 :843-863）
　それぞれの混合物を、72℃、3分間インキュベートした後、直ちに氷冷した。次いで、5×Buffer（東洋紡(株)製）4μL、2.5mM dNTPs（(株)ニッポンジーン製）4μL、RNase Inhibitor, super（和光純薬工業(株)製）0.5μL(20U)、ReverTra Ace（東洋紡(株)製）1μL(100U)加え混合し、42℃、50分間インキュベートした。その後、結合Buffer（5.5Mグアニジン塩酸塩（和光純薬工業(株)製）、20mM Tris-HCl pH6.6（和光純薬工業(株)製）を100μL加え混合し、エコノスピン（(株)ジーンデザイン製）に移し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。その後、洗浄Buffer（2mM Tris-HCl pH7.5（(株)ニッポンジーン製）、80%エタノール（和光純薬工業(株)製）を500μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。その後、更に12000×g、室温、1分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、溶出Buffer（10mMTris-HCl pH8.5）（(株)ニッポンジーン製）を25μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離して、得られた沈殿物を蒸留水１μLに溶解させてcDNAを回収した。
（５）PCR反応
　上記(４)で得られたcDNA 1μL、蒸留水5μL、2× PCR Buffer for KOD FX Neo（東洋紡(株)製）12.5μL、2 mM dNTPs（東洋紡(株)製）4μL、KOD FX Neo（東洋紡(株)製）0.5μL（0.5Ｕ）、各Forward primer（10μM）1μL、各Reverse primer（10μM）1μLを混合した。
　使用した各Primerの塩基配列は、以下の通りである。下記プライマーは、すべてシグマアルドリッチ社製である。
Foxb2 cDNA、GenBank Accession No. NM_008023: 132-152、279-300
Forward primer : CTTTCCAAGAGGCGTTAAGGC（配列番号４５）
Reverse primer : CTCAGAGGCAGCATCTTCTCAG（配列番号４６）
増幅鎖長 : 169bp
Oct3/4 cDNA、GenBank Accession No. NM_013633: 163-186、480-501
Forward primer : GAACCTGGCTAAGCTTCCAAG（配列番号４７）
Reverse primer : GCTTGGCAAACTGTTCTAGCTC（配列番号４８）
増幅鎖長 : 339bp
Nanog cDNA、GenBank Accession No. NM_028016: 110-134、388-408
Forward primer : GCATTAGACATTTAACTCTTCTTTC（配列番号４９）
Reverse primer : CTTGAAGAGGCAGGTCTTCAG（配列番号５０）
増幅鎖長 : 299bp
Sox2 cDNA、GenBank Accession No. NM_011443: 1652-1674、1836-1859
Forward primer : GAATCGGACCATGTATAGATCTG（配列番号５１）
Reverse primer : CATTTGATTGCCATGTTTATCTCG（配列番号５２）
増幅鎖長 : 208bp
Klf2 cDNA、GenBank Accession No. NM_008452: 910-931、1159-1182
Forward primer : GAAGCCTTATCATTGCAACTGG（配列番号５３）
Reverse primer : CTGTCCTAAGGTCCAATAAATAGC（配列番号５４）
増幅鎖長 : 273bp
 Esrrb cDNA、GenBank Accession No. NM_011934: 552-573、760-782
Forward primer : GCAAGAGCTACGAGGACTGTAC（配列番号５５）
Reverse primer : GTTTGGTGATCTCACATTCATTG（配列番号５６）
増幅鎖長 : 231bp
Fgf5 cDNA、GenBank Accession No. NM_010203: 445-465、617-639
Forward primer : GAACATAGCAGTTTCCAGTGG（配列番号５７）
Reverse primer : GTTGCTGAAAACTCCTCGTATTC（配列番号５８）
増幅鎖長 : 195bp
Gapdh cDNA、GenBank Accession No. NM_001289726 : 224-246、512-534
Forward primer : GTTCCAGTATGACTCCACTCACG（配列番号５９）
Reverse primer : CATTGCTGACAATCTTGAGTGAG（配列番号６０）
増幅鎖長 : 311bp
　それぞれの混合物をサーマルサイクラーにセットし94℃ 2分間、98℃ 10秒間→57℃ 20秒間→68℃ 30秒間をOct3/4 cDNA、Nanog cDNA、Sox2 cDNA、Klf2 cDNA、及びEsrrb cDNAを増幅させる場合は25サイクル、Fgf5 cDNA及びFOXB2 cDNAを増幅させる場合は30サイクル、Gapdh cDNAを増幅させる場合は20サイクル、68℃ 2分間反応させた。
（６）電気泳動
　上記(５)で得られたPCR増幅産物5μLと、6×Loading Buffer Double Dye（(株)ニッポンジーン製）1μLとを混合し、これを1.5%アガロースゲルにて電気泳動した。染色はGelRed核酸ゲル染色液（和光純薬工業(株)製）にて行った。
　なお、上記(４)でRTaseを加えないで反応を行って得られた反応物についても、上記の(５)～(６)の処理を行った。
（７）結果
　結果を図４に併せて示す。
　図４の結果から明らかな通り、FOXB2 mRNAは、分化誘導処理後７日目のES細胞（LIF(-)・RTase(+)の場合）では発現している（バンドが確認された）ことが確認された。しかし、FOXB2 mRNAは、未分化・多能性を維持している状態のES細胞（LIF(+)・RTase(+)の場合）では発現していなかった。
　分化マーカーであるFgf5 mRNAは、分化誘導処理後７日目のES細胞（LIF(-)・RTase(+)の場合）で発現している（バンドが確認された）ことが確認された。
　また、未分化マーカーであるOCT3/4 mRNA、NANOG mRNA及びSOX2 mRNAは、未分化・多能性を維持している状態のES細胞（LIF(+)・RTase(+)の場合）では発現していた。また、分化誘導処理後７日目のES細胞（LIF(-)・RTase(+)の場合）でも、まだ発現している（バンドが確認された）ことが確認された。
　なお、すべてのmRNAの検出結果でRTase(-)の場合にバンドが確認されなかったことから、本実験系には、ゲノムDNAの混入が無いことが確認された。
　また、GAPDH mRNAの検出結果を見ると、“LIF(+)・RTase(+)”と“LIF(-)・RTase(+)”の場合にバンドが確認され、“LIF(+)・RTase(-)”と“LIF(-)・RTase(-)”の場合にバンドが確認されなかった。このことから本実験系ではmRNAは分解されていないことが確認された。
　以上の結果から明らかな通り、FOXB2 mRNAの発現は、現在分化マーカーとして最も有望であるとされるFgf5 mRNAと同程度の早期に検出された。また、FOXB2 mRNAの発現は、一般的な未分化マーカー(OCT3/4, NANOG, SOX2）の発現の変化が検出されていない段階でも顕著に検出された。更に、ナイーブマーカーとして知られているKlf2 mRNAやEsrrb mRNAがまだ消失しない分化誘導後７日目の段階で、FOXB2 mRNAの発現が確認された。
　以上のことから、FOXB2 mRNAは、従来の未分化マーカーよりも分化の初期段階でES細胞の分化状態を判定できることがわかった。また、培養初期で分化した細胞を判定きることから、細胞の早期スクリーニングや幹細胞の品質管理等に有用であり、培養期間の短縮、培地代の経費削減などが期待できる。
参考例１．細胞の分化状態の確認
（１）幹細胞の培養と分化誘導処理
　hiPS細胞(201B7株、京都大学iPS 細胞研究所（iPSアカデミアジャパン株式会社）)を以下の培地で培養した。
　hiPS細胞を+bFGF及び+ROCK inhibitorの添加又は無添加のhPSCΔ培地（和光純薬工業（株）製）20000 cells/wellになるように４枚のウェルに播種し、１日培養した。
　２日目からは４枚のウェルを２枚ずつ、培地を(1) hPSCΔ培地、+bFGF、(2) hPSCΔ培地、+bFGF（100mg/mL）とし、それぞれ毎日培地交換した。６日間培養後、細胞を観察した。
（２）結果
　結果を図５に示す。
　図５において、（１）はbFGF無添加培地で培養した（分化誘導処理）hiPS細胞の写真である。（２）は、bFGF添加培地で培養したhiPS細胞の写真である。
　bFGF無添加培地で培養することによりhiPSを培養した場合、iPS細胞は神経細胞系の細胞へ分化誘導されることがわかっている。
　図５(１)から明らかな通り、bFGF無添加（-bFGF）培地で培養した場合、培養６日目で細胞の形態が突起状又は繊維状に変化している様子が確認された（コロニーの淵がとげとげしている。）。
　しかし、図５(２)から明らかなように、bFGF添加（+bFGF）培地で培養した場合、bFGF無添加培地で培養した場合のような、細胞の形態の変化は観察されなかった。
　以上のことから、bFGF無添加培地で培養した場合、hiPS細胞の分化が誘導されることが確認された。
実験例１．FOXB2蛋白質の検出１
１）抗ヒトFOXB2蛋白質抗体固定化ELISA用マイクロプレートの調製
　抗ヒトFOXB2蛋白質抗体の溶液（50ｍM MOPS緩衝液(pH7.0)）をELISA用マイクロプレート（Nunk社製）の各ウェルに分注後２４時間静置して、抗ヒトFOXB2蛋白質抗体を固定化したマクロプロレートを得る。
２）ペルオキシダーゼ標識抗FOXB2蛋白質抗体の調製
　抗ヒトFOXB2蛋白質抗体を常法によりペルオキシダーゼ標識する。
３）試料の調製
　分化誘導後３日目のhiPS細胞を回収し、ソニケーションによりhiPS細胞を破壊して、細胞のライセートを得る。得られたライセートを緩衝液に溶解させて試料とする。
４）測定
　上記３）で調製した試料を、上記１)で調製した抗FOXB2蛋白質抗体固定化ELISA用マイクロプレートの各ウェルに添加し、３７℃で１時間程度反応させる。次いで各ウェルを緩衝液で回洗浄する。
　上記２）で調製したペルオキシダーゼ標識抗FOXB2蛋白質抗体をそれぞれ各ウェルに分注し、３７℃で１時間程度反応させる。各ウェルを緩衝液で、次いで蒸留水で洗浄し、ＴＭＢ（3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン）溶液(和光純薬工業(株)製)を各ウェルに50μLずつ添加し、25℃、30分間反応させる。その後、反応停止液（１Mりん酸溶液）を各ウェルに50μL ずつ添加して反応を停止させる。４５０nmにおける吸光度を、Vmax (モレキュラーデバイス社製) を用いて測定する。
　その結果、FOXB2蛋白質が検出された場合には、試料として用いたhiPS細胞は分化した状態であると判定される。又は、試料として用いたhiPS細胞の細胞群には、分化した状態の細胞が含まれると判定される。
実験例２．FOXB2蛋白質の検出２
１）試料の調製
　分化誘導後３日目のhiPS細胞を回収し、ソニケーションによりhiPS細胞を破壊して、細胞のライセートを得る。得られたライセートを緩衝液に溶解させて試料とする。
２）ペルオキシダーゼ標識抗FOXB2蛋白質抗体の調製
　抗ヒトFOXB2蛋白質抗体を常法によりペルオキシダーゼ標識する。
３）ウエスタンブロッティング
　上記１）で得られた試料をSuperSepTM(電気泳動用ゲル、和光純薬工業（株）,5-20%のグラジェントゲル)にアプライして、SDS-PAGE電気泳動（定電流25mA）を行う。次いで、泳動後の画分を、セミドライブロッティング法にてPVDFメンブレンに転写する。
　PBS-T(Phosphate Buffered Saline with TweenTM 20、pH 7.4)にブロックエース(DSファーマバイオメディカル（株）製)を溶解させてブロッキング液とする。このブロッキング液に上記転写後のPVDFメンブレンを浸漬させ、1時間室温にてブロッキング処理した後、PVDFメンブレンを洗浄し、ブロッキング液に浸漬させる。
　次いで、上記２）で得られたペルオキシダーゼ標識抗ヒトFOXB2蛋白質抗体をブロッキング液に加えて室温で1時間程度浸漬させる。PVDFメンブレンを洗浄し、ECLTM Prime Western Blotting Detection Reagent(ペルオキシダーゼの化学発光基質、GE Healthcare製)で発光させ、LAS4000(富士フイルム（株）製)を用い、露光時間10秒で検出する。
　その結果、FOXB2蛋白質が検出された場合には、試料として用いたhiPS細胞は分化した状態であると判定される。又は、試料として用いたhiPS細胞の細胞群には、分化した状態の細胞を含むと判定される。
した状態の細胞が含まれる判定される。
　本発明によれば、幹細胞の分化状態を、分化の初期段階で判定することができる。また、本発明は、幹細胞の品質管理や分化細胞の調製・単離方法へ応用することができる。更に本発明は培養初期で分化した細胞を判定きることから、細胞の早期スクリーニングや幹細胞の品質管理に有用であり、培養期間の短縮、培地代の経費削減などが期待できる。

Claims (15)

  1. 幹細胞のFOXB2遺伝子の発現を検出し、その結果に基づいて判定を行う、細胞の分化状態の判定方法。
  2. FOXB2遺伝子の発現の検出を、FOXB2 mRNA又はFOXB2蛋白質を検出することにより行う、請求項１に記載の方法。
  3. FOXB2 mRNAが検出された場合に、その細胞が分化した状態であると判定する、請求項２に記載の方法。
  4. FOXB2蛋白質が検出された場合に、その細胞が分化した状態であると判定する、請求項２に記載の方法。
  5. FOXB2 mRNAが、配列番号１又は配列番号３４で表される塩基配列を有する、又は配列番号１又は配列番号３４で表される塩基配列と７０％以上の相同性を有する、請求項２に記載の方法。
  6. FOXB2 mRNAが、配列番号２若しくは配列番号３５で表されるアミノ酸配列又はその１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする、請求項２に記載の方法。
  7. FOXB2蛋白質が配列番号２若しくは配列番号３５で表されるアミノ酸配列又はその１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の方法。
  8. FOXB2 mRNAの検出をRT-PCT法により行う、請求項２に記載の方法
  9. 幹細胞がiPS細胞又はES細胞である、請求項１に記載の方法。
  10. FOXB2遺伝子由来のmRNA又は蛋白質から選択される、分化マーカー。
  11. FOXB2遺伝子由来のmRNAが、配列番号１又は配列番号３４で表される塩基配列を有する、又は配列番号１又は配列番号３４で表される塩基配列と７０％以上の相同性を有する、請求項１０に記載の分化マーカー。
  12. FOXB2遺伝子由来のmRNAが、配列番号２若しくは配列番号３５で表されるアミノ酸配列、又はその１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするものである、請求項１０に記載の分化マーカー。
  13. FOXB2遺伝子由来の蛋白質が、配列番号２若しくは配列番号３５で表されるアミノ酸配列、又はその１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の分化マーカー。
  14. 幹細胞の分化マーカーである、請求項１０に記載の分化マーカー。
  15. 幹細胞がiPS細胞又はES細胞である、請求項１４に記載の分化マーカー。
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