WO2017141672A1 - 細胞の分化状態の判定方法、及びこれに用いられる新規な分化マーカー - Google Patents

細胞の分化状態の判定方法、及びこれに用いられる新規な分化マーカー Download PDF

Info

Publication number
WO2017141672A1
WO2017141672A1 PCT/JP2017/003130 JP2017003130W WO2017141672A1 WO 2017141672 A1 WO2017141672 A1 WO 2017141672A1 JP 2017003130 W JP2017003130 W JP 2017003130W WO 2017141672 A1 WO2017141672 A1 WO 2017141672A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
foxb1
seq
mrna
protein
cells
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/003130
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
幸信 林田
Original Assignee
和光純薬工業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 和光純薬工業株式会社 filed Critical 和光純薬工業株式会社
Publication of WO2017141672A1 publication Critical patent/WO2017141672A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to a novel differentiation marker for cells.
  • Pluripotent stem cells such as ES cells (Embryonic ES Stem cells) and iPS cells (Induced Pluripoent Stem Cells, induced pluripotent stem cells) are co-cultured with feeder cells, for example, to maintain their pluripotency It is necessary to cultivate in a conditioned medium derived from the feeder layer, add basic FGF (bFGF / FGF2, basic Fibroblast Growth Factor) or LIF (leukemia inhibitory factor) to the medium. It is. Otherwise, pluripotent stem cells may lose their pluripotency due to the environment and cell conditions and may easily differentiate. Therefore, it is important to accurately know the undifferentiated state (the state having pluripotency) and the differentiated state of pluripotent stem cells.
  • bFGF / FGF2, basic Fibroblast Growth Factor basic Fibroblast Growth Factor
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • transplantation is performed after differentiating pluripotent stem cells into target cells.
  • the cells to be transplanted are contaminated with undifferentiated cells, there is a risk of causing tumor formation. Therefore, a technique for determining whether undifferentiated cells are mixed in cells obtained by differentiation-inducing treatment of pluripotent stem cells is important.
  • a method of determining the differentiation state of a cell a method of detecting a marker serving as an index of the differentiation state and determining based on the result is performed.
  • a marker serving as an index of the differentiation state and determining based on the result.
  • Oct3 / 4 Nanog, Sox2, Rex1, Alkaline Phosphatase, TRA-1-60, LIF-R, and the like are known as markers for pluripotent stem cells. Since pluripotent stem cells express these markers in an undifferentiated state, it is possible to determine whether or not the cells maintain an undifferentiated state by detecting these markers.
  • the differentiated state can be determined only if the cells are in a state that has been differentiated to some extent (for example, a state that has differentiated into any of the three germ layers).
  • the determination result by the determination method using these undifferentiated markers may be greatly influenced by the cell culture conditions. For this reason, it is difficult to determine whether a cell maintains an undifferentiated state (pluripotency) or a state where it has acquired a differentiation ability to differentiate in the future at the initial stage of cell differentiation.
  • Non-patent Document 1 a group of transcription factors having a forkhead or winged helix DNA binding domain called Fox (Forkhead box) is known (Non-patent Document 1), and there are about 50 types in humans. Are known. Fox proteins are known to function mainly as developmental regulators, tissue-specific regulators, and cell cycle regulators. For example, FOXA1, FOXA2, FOXA3, etc. are known as early differentiation markers (Non-patent Document 2).
  • FOXB1 has been reported to be involved in the formation of neural tissue (Non-patent Document 3). However, the specific action of FOXB1 has not yet been elucidated.
  • the present invention has been made in view of the above-described situation, and an object of the present invention is to provide a method capable of determining the differentiation state of a cell at an early stage of differentiation.
  • the present invention has been made for the purpose of solving the above-described problems, and has the following configuration.
  • (1) A method for determining the differentiation state of a cell, wherein the expression of the FOXB1 gene in a test cell is detected and a determination is made based on the result.
  • (2) A differentiation marker selected from mRNA or protein derived from FOXB1 gene.
  • pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells are cultured in a medium supplemented with basic FGF (bFGF, FGF2, basic Fibroblast Growth Factor, basic fibroblast growth factor), It is known to proliferate while maintaining a differentiated state.
  • basic FGF basic FGF
  • FGF2 basic Fibroblast Growth Factor, basic fibroblast growth factor
  • FOXB1 mRNA is useful as a differentiation marker for ES cells and iPS cells, and by measuring its expression, cells at the early stage of differentiation can be selected. It came to complete.
  • the differentiation state of a cell can be determined at the initial stage of differentiation.
  • the determination method of the present invention can be applied to quality control of stem cells and preparation / isolation methods of differentiated cells.
  • the determination method of the present invention is useful for early screening of cells because the differentiation state of the cells can be determined in the early stage of culture after differentiation induction treatment, and can be expected to shorten the culture period and reduce the cost of the medium.
  • (1) shows the result of detecting the expression of Foxb1 mRNA
  • (2) shows the result of detecting the expression of Fgf5 mRNA
  • (3) shows the result of detecting the expression of Oct3 / 4 mRNA
  • (4 ) Shows the result of detecting the expression of Nanog mRNA
  • (5) shows the result of detecting expression of Sox2 mRNA
  • (6) shows the result of detecting expression of Rex1 mRNA.
  • Test cells used in the method for determining a differentiation state of a cell of the present invention include a stem cell subjected to a known differentiation induction treatment, a stem cell subjected to a treatment for maintaining an undifferentiated state, and a known pluripotency induction treatment. Examples include cells that have been subjected to dedifferentiation of somatic cells.
  • the stem cell according to the present invention is an undifferentiated cell having so-called self-renewal ability and differentiation ability capable of differentiating into various cells.
  • multipotent ES cells iPS cells, ntES cells (nuclear transfer Embryonic Stem Cell), EG cells (Embryonic Cell, embryonic germ cells), EC cells (Embryonic Cell, embryonic cancer stem cells) And pluripotent stem cells.
  • a method for inducing differentiation of stem cells may be any method known per se and is not particularly limited. For example, a method of culturing after treating cells with a known differentiation inducer, a method of culturing in an environment in which stem cells are induced to differentiate, such as culturing in a medium not containing bFGF or LIF, and the like can be mentioned.
  • substances that induce stem cell differentiation include, for example, retinoic acid that induces differentiation into nerve cells, spermine that induces differentiation into cardiomyocytes, and sodium butyrate (Sodium Butyrate) , Trichostatin A (Trichostatin A), DNA methyltransferase inhibitors that induce the differentiation of mouse ES cells into insulin-producing cells, etc. are known.
  • Undifferentiated state means, for example, that the cell is in a state having the above-mentioned self-replicating ability and in a state having a differentiation ability capable of differentiating into various cells.
  • the “treatment for maintaining the undifferentiated state” may be any known treatment for maintaining the undifferentiated state of the stem cells, and examples thereof include co-culture with feeder cells, treatment for adding bFGF or LIF to the medium, and the like. It is done.
  • test cells examples include mammals such as humans, cows, horses, dogs, guinea pigs, mice and rats.
  • the FOXB1 gene means a gene DNA, RNA or the like encoding a FOXB1 protein present in an animal species from which a cell subjected to determination is derived. Also included are genes that encode homologues, mutants, and derivatives of the FOXB1 protein. Furthermore, nucleotide sequences that hybridize with these genes under stringent conditions and genes containing the same, and FOXB1 gene are 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 95% or more, and even more preferably 97% or more. Also included are genes having a base sequence having the sequence homology.
  • a human FOXB1 gene a gene corresponding to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (base sequence of human FOXB1 mRNA), a gene having a base sequence encoding the protein represented by SEQ ID NO: 2 1 to several, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2 nucleotides of these nucleotide sequences are deleted, inserted, substituted or added. Or a gene having a base sequence having 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 97% or more of these base sequences.
  • the mouse Foxb1 gene includes a gene corresponding to the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 (base sequence of mouse Foxb1 mRNA), a gene having a base sequence encoding the protein represented by SEQ ID NO: 8, and these base sequences.
  • FOXB1 mRNA examples include mRNA transcribed from the FOXB1 gene present in the animal species from which the cells subjected to determination are derived, for example, the above-mentioned mRNA derived from the FOXB1 gene.
  • mRNA derived from the FOXB1 gene examples include the following as human FOXB1 mRNA.
  • -MRNA having the base sequence (GenBank Accession No. NM_012182) represented by SEQ ID NO: 1, -1 to several, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2 nucleotides of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 are deleted, inserted, substituted or added.
  • MRNA having a base sequence determined An mRNA having a base sequence having a sequence homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 95% or more, and even more preferably 97% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1; -MRNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 1 to several, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2 amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 are deleted, inserted, substituted or added.
  • MRNA encoding the amino acid sequence An mRNA encoding an amino acid sequence having a sequence homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 95% or more, and even more preferably 97% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • mouse Foxb1 mRNA examples include the following. -MRNA having the base sequence (GenBank Accession No. NM_022378) represented by SEQ ID NO: 7, -One to several, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2 nucleotides of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 are deleted, inserted, substituted or added.
  • MRNA having a base sequence determined An mRNA having a base sequence having a sequence homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 95% or more, and even more preferably 97% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 7, -MRNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, -1 to several, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2 amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 are deleted, inserted, substituted or added MRNA encoding the amino acid sequence, An mRNA encoding an amino acid sequence having a sequence homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 95% or more, and even more preferably 97% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8.
  • FOXB1 gene human gene
  • Foxb1 gene genes of animals other than humans
  • FOXB1 gene both the “ FOXB1 gene” and the “ Foxb1 gene” may be simply described as “ FOXB1 gene”.
  • FOXB1 mRNA human mRNA
  • FOXB1 mRNA mRNA derived from an animal other than a human
  • FOXB1 mRNA mRNA derived from an animal other than a human
  • FOXB1 protein examples include a protein translated from the FOXB1 gene present in the animal species from which the test cell subjected to determination is derived. Such homologues, mutants, and derivatives of the FOXB1 protein may be used.
  • examples of human FOXB1 protein include the following.
  • a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 1 to several, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2 amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 are deleted, inserted, substituted or added.
  • a protein having an amino acid sequence A protein having an amino acid sequence having a sequence homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 95% or more, and even more preferably 97% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • mouse FOXB1 protein examples include the following.
  • a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, -1 to several, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2 amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 are deleted, inserted, substituted or added
  • a protein having an amino acid sequence A protein having an amino acid sequence having a sequence homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 95% or more, and even more preferably 97% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8.
  • the method for determining the differentiation state of a cell of the present invention (hereinafter sometimes simply referred to as “the determination method of the present invention”) is “determined based on the result of detecting the expression of the FOXB1 gene in a test cell. "A method for determining the differentiation state of a cell.” Specific examples of the FOXB1 gene, FOXB1 mRNA, and FOXB1 protein according to the determination method of the present invention are as described above.
  • Method for detecting FOXB1 gene expression examples include a method for detecting FOXB1 mRNA expression, and a method for detecting FOXB1 protein expression.
  • detecting expression refers to “detecting whether FOXB1 gene is expressed (for example, the presence or absence of FOXB1 mRNA or FOXB1 protein)” and “amount of FOXB1 gene expressed (for example, FOXB1 measurement of the amount of mRNA or the amount of FOXB1 protein ”.
  • a method for detecting the expression of FOXB1 mRNA or FOXB1 protein in the test cells will be described below.
  • the expression is performed after the test cells after the differentiation induction treatment are expressed to such an extent that FOXB1 mRNA or FOXB1 protein can be detected.
  • the upper limit is within 7 days, preferably within 6 days, more preferably within 5 days
  • the lower limit is 1 day or more, preferably 2 days or more, preferably cells were harvested after three or more days of culture, it is sufficient to detect the expression of the following FOXB1 gene.
  • the cells may be collected periodically (for example, every day) to detect the expression of the FOXB1 gene.
  • the method for detecting FOXB1 mRNA expression is not particularly limited as long as it is a method for detecting mRNA per se known, and may be appropriately selected from known methods.
  • RT-PCR Reverse Transcription-Quantitative Polymerase Chain Reaction
  • competitive PCR in situ PCR
  • DNA array method Northern hybridization
  • Fluorescence in situ hybridization (FISH) method dot blot
  • RNase protection assay RT-LAMP method
  • SmartFlare TM method target bound to gold nanoparticles
  • in situ PCR in situ hybridization
  • SmartFlare TM method detection method, such as detection method using an aromatic nucleophilic substitution reaction, can be detected FOXB1 mRNA without destroying the test cell.
  • target FOXB1 gene eg FOXB1 mRNA
  • cDNA is synthesized by reverse transcription and then amplified by PCR [Kawasaki, ES, et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc., SanDiego, 21-27 (1991)].
  • Conditions for the reverse transcription reaction and the DNA amplification reaction are not particularly limited, and optimal conditions may be adopted as appropriate.
  • the amplification region of the gene of the target e.g. FOXB1 mRNA
  • the amplification region of the gene of the target is not necessarily a full length of the gene, if there is no hindrance to confirm the amplification product, may be a part region of the gene.
  • the presence or amount of FOXB1 mRNA can be detected and measured by detecting the presence or absence (amount) of the amplified product (cDNA).
  • the amplification product may be detected by a conventional method for detecting the amplification product such as electrophoresis.
  • mRNA is first extracted and separated from a test cell by a known method.
  • RT-PCR was performed using the mRNA obtained above as a template, and FOXB1 mRNA or a partial region thereof was sequenced.
  • Single-stranded DNA (cDNA) having a complementary base sequence is synthesized and amplified.
  • the amplified DNA (amplified product) is detected by ordinary Northern hybridization or the like. Based on the results, the presence and amount of FOXB1 mRNA are detected.
  • Examples of the amplification primer used above include a primer designed from the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 as an amplification primer for detecting human FOXB1 mRNA.
  • An example of such a primer is a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • a primer designed from the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 can be mentioned.
  • An example of such a primer is a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • Examples of the method for designing the primer for amplification and the method for synthesizing the same include methods according to conventional methods in this field. Moreover, since various primers for amplifying FOXB1 mRNA are commercially available, they may be used.
  • FOXB1 the mRNA nucleotide sequence with the prepared primer pair capable of amplifying a target region of the original to FOXB1 mRNA, nucleic acid amplification of further such as PCR according to a conventional method
  • the presence and amount of FOXB1 mRNA can be detected more accurately by conducting the reaction and detecting the presence or absence and amount (amount) of the amplified product.
  • the amplification product may be detected by a conventional method such as electrophoresis.
  • the nucleic acid amplification reaction using the cDNA amplified by the above method as a template and the detection of the amplification product may be performed by a real-time amplification detection method.
  • An example of the detection method by the real-time amplification detection method is a real-time PCR detection method.
  • Examples of the real-time PCR detection method include a normal intercalator method for performing real-time PCR using an intercalator (for example, SYBR TM Green I), TaqMan TM real-time PCR method, MGB Eclipse Probe System method, Molecular Beacons Probe Technology method, Examples include, but are not limited to, the LUX Fluorogenic Primer method, the Quenching probe-PCR (QP) method, and the cycling probe method.
  • an intercalator for example, SYBR TM Green I
  • TaqMan TM real-time PCR method for example, TaqMan TM real-time PCR method, MGB Eclipse Probe System method, Molecular Beacons Probe Technology method
  • Examples include, but are not limited to, the LUX Fluorogenic Primer method, the Quenching probe-PCR (QP) method, and the cycling probe method.
  • the “primer pair prepared so that the target region of FOXB1 mRNA can be amplified” used in the nucleic acid amplification reaction is a primer that amplifies the base sequence of FOXB1 mRNA or a specific region (partial sequence) thereof Pairs are mentioned.
  • Examples of such a primer pair include a primer pair that amplifies human FOXB1 mRNA (base sequence represented by SEQ ID NO: 1) or a specific region (partial sequence) thereof. What is necessary is just to design by a conventional method from the base sequence represented by sequence number 1. Specifically, for example, when targeting the 986 to 1102th, 117 bp region (SEQ ID NO: 3) of the 986 to 1102 base sequence represented by SEQ ID NO: 1, a primer and a sequence having the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 The primer pair of the primer which has a base sequence represented by number 6 is mentioned.
  • a primer pair that amplifies mouse Foxb1 mRNA (base sequence represented by SEQ ID NO: 7) or a specific region (partial sequence) thereof is also included. What is necessary is just to design by a conventional method from the base sequence represented by sequence number 7. Specifically, for example, when targeting the 954 to 1078th 125 bp region (SEQ ID NO: 9) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7, the primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 and the sequence The primer pair of the primer which has a base sequence represented by number 12 is mentioned.
  • the primers constituting these primer pairs may be chemically synthesized by conventional methods in this field. Commercially available primers or primer pairs may also be used.
  • a specific example of a method for detecting human FOXB1 mRNA by RT-PCR is as follows.
  • 1 ⁇ L of FOXB1 mRNA amplification primer (for example, primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4) 1 ⁇ L is added to total RNA 500 ng to 10 ⁇ g extracted from the test cells by a conventional method and DNase-treated. Incubate for 5 minutes. Add 5 ⁇ Buffer 4 ⁇ L, 2.5 mM dNTPs 4 ⁇ L, RNase Inhibitor 0.5 ⁇ L (20 U), reverse transcriptase (ReverTra Ace) 1 ⁇ L (100 U), and add 20 ⁇ L in distilled water. And reverse transcription reaction is carried out by incubating at 37 to 50 ° C. for 20 to 60 minutes. Thereafter, the obtained cDNA is recovered by a conventional method.
  • cDNA 1 ⁇ L, distilled water 5 ⁇ L, 2 ⁇ PCR Buffer 12.5 ⁇ L, 2 mM dNTPs 4 ⁇ L, DNA polymerase (KOD FX Neo) 0.5 ⁇ L (0.5 U), forward primer (for example, having the base sequence of SEQ ID NO: 5) Primer) 1 ⁇ L of 5 to 10 ⁇ M and 1 ⁇ L of reverse primer (for example, primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6) 1 ⁇ L.
  • a reaction of 94 ° C. for 2 minutes, 98 ° C. for 10 seconds ⁇ 58 ° C. for 10 seconds ⁇ 68 ° C. for 30 seconds is performed for about 28 to 40 cycles. Detect and analyze amplification products by conventional methods to detect FOXB1 mRNA.
  • the detection method using an intercalator may be performed by the following method, for example. That is, after recovering cDNA by the above method, using an intercalator (for example, SYBR TM Green I) and, for example, the same forward primer and reverse primer as described above, and using the cDNA obtained above as a template, Taq DNA Real-time PCR is performed using a polymerase such as polymerase. The amplification product is detected and analyzed by measuring the fluorescence intensity of the intercalator that intercalates in correlation with the amplification amount of the amplification product, and FOXB1 mRNA is detected.
  • an intercalator for example, SYBR TM Green I
  • a polymerase such as polymerase
  • Detecting and analyzing amplified products by RT-PCR may be performed by qPCR by the dual probe method using two TaqMan probes.
  • Detection and analysis of the amplification product after the nucleic acid amplification reaction using the cDNA amplified by the above method as a template is performed by capillary electrophoresis (J. Chromatogr. 593 253-258 (1992), Anal. Chem. 64 1926- 1932 (1992), WO2007 / 027495, etc.) or capillary chip electrophoresis. That is, after collecting cDNA, a nucleic acid amplification reaction is performed using a primer or intercalator labeled with a labeling substance such as a fluorescent substance. Subsequently, capillary chip electrophoresis is performed, and a signal derived from the separated labeled PCR amplification product may be detected by a detector.
  • the detector devices such as a differential refraction detector, a fluorescence detector, and a UV detector may be used. Among these, a UV detector and a fluorescence detector are preferable, and a fluorescence detector is more preferable.
  • an automatic immunoanalyzer such as LiBASys (manufactured by Shimadzu Corporation) is used, operations from PCR to electrophoresis can be performed in real time.
  • RT-PCR may be performed using a commercially available kit for qPCR (KOD SYBR qPCR Mix (manufactured by Toyobo Co., Ltd.)) containing SYBR TM Green I and the like.
  • KOD SYBR qPCR Mix manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • Northern hybridization Northern hybridization as a method of detecting the FOXB1 mRNA is, for example, the following methods. For example, mRNA extracted / separated from a test cell is immobilized on an appropriate carrier. Then, hybridization is performed between the immobilized mRNA and a labeled probe (which may be cDNA) labeled with a labeling substance capable of detecting a nucleotide chain having a base sequence complementary to FOXB1 mRNA. The FOXB1 mRNA can be detected by detecting a signal derived from the labeling substance of the labeled probe hybridized with the immobilized mRNA.
  • a labeled probe which may be cDNA
  • the probe used here may be composed of the entire complementary sequence of the base sequence of FOXB1 mRNA or may be composed of a part of the base sequence. Further, a microarray or DNA chip on which the probe is immobilized can also be used for this detection method.
  • any known labeling substance such as a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or biotin can be used.
  • radioactive isotopes for example, 32 P, 33 P, 35 S, etc. as radioactive isotopes, alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, etc. as enzymes, Cyanine Dye-based Cy3, Cy5 (Amersham Biosciences), Alexa555, Examples of luminescent substances such as Alexa647 (Invitrogen) fluorescein include chemiluminescent reagents containing Acridinium Ester.
  • a method for labeling a probe a method for labeling an oligonucleotide usually performed in this field may be mentioned, and a method may be appropriately selected for each labeling substance.
  • the method for measuring the label (signal) derived from the labeling substance of the labeling probe differs depending on the type of labeling substance. What is necessary is just to measure by the conventional method according to the property which the labeling substance has.
  • the reagents used in the method for detecting FOXB1 mRNA according to the present invention include reagents usually used in this field, such as buffers, stabilizers, preservatives, etc. Those that do not inhibit the property and do not inhibit the nucleic acid amplification reaction such as PCR or the hybridization reaction can be used. Further, the concentration may be appropriately selected from a concentration range usually used in this field.
  • the buffer solution include, for example, performing a normal nucleic acid amplification reaction such as PCR or a hybridization reaction such as Tris buffer solution, phosphate buffer solution, veronal buffer solution, borate buffer solution, Good buffer solution, etc. All the buffer solutions mentioned are mentioned.
  • the pH is not particularly limited, and examples thereof include a range of 5 to 9.
  • a nucleic acid synthase DNA polymerase, RNA polymerase, reverse transcriptase, etc.
  • a substrate dNTP, rNTP, etc.
  • a double-stranded intercalator ethidium bromide, SYBR TM Green, etc.
  • Labeled detection substances such as FAM and TAMRA are used.
  • the nuclear membrane of the test cell is partially solubilized using a buffer containing a surfactant such as Triton TM , NP-40, Tween 20 TM , Saponin, Digitonin TM , Leucoperm TM .
  • a surfactant such as Triton TM , NP-40, Tween 20 TM , Saponin, Digitonin TM , Leucoperm TM .
  • the nuclear FOXB1 protein can be detected by staining the nuclear protein with an anti-FOXB1 antibody labeled with a fluorescent substance or the like.
  • FOXB1 protein may be detected by staining the nuclear FOXB1 protein using these commercially available reagents.
  • the FOXB1 protein can be detected by the following method for destroying cells.
  • test cell culture is treated by a conventional method such as filtration or centrifugation, and the cells are collected and suspended in an appropriate buffer.
  • a method such as surfactant treatment, ultrasonic treatment, lysozyme treatment, or freeze-thawing, an extract containing FOXB1 protein is obtained by a method such as centrifugation or filtration.
  • the FOXB1 protein in the obtained extract may be detected by a method known per se for detecting a protein.
  • Methods for detecting FOXB1 protein in the extract include, for example, so-called enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA) using a substance having affinity for FOXB1 protein (eg, antibody),
  • immunoassay methods such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescent immunoassay (FIA), Western blot, immunohistochemistry, antibody array method, assay by simple immunochromatography, etc.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • FIA fluorescent immunoassay
  • Western blot immunohistochemistry
  • antibody array method assay by simple immunochromatography, etc.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • electrophoresis capillary electrophoresis
  • capillary chip electrophoresis and the like.
  • the measurement principle include, but are not limited to, a sandwich method, a competitive method, a two-antibody method, and the like. Specific conditions for these measurement methods can be appropriately set by those skilled in the art.
  • FOXB1 protein may be detected by a measurement method according to an immunoagglutination method such as an immunoratio method or an immunoturbidimetric method. These detection methods may be performed according to a method known per se.
  • the anti-FOXB1 protein antibody used to detect FOXB1 protein is the FOXB1 protein, its partial peptide, or a salt thereof. Antibodies that can be recognized are mentioned.
  • the type of antibody is not particularly limited.
  • any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody may be used, and these may be used alone or in appropriate combination.
  • these antibodies may be used as F (ab ′) 2 , Fab ′, or Fab after digestion with an enzyme such as pepsin or papain, if necessary.
  • a commercially available antibody against FOXB1 protein can also be used.
  • anti-FOXB1 antibody examples include “an antibody against a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2” and “an antibody against a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8”.
  • the anti-FOXB1 antibody may be labeled with a labeling substance.
  • the labeling substance used for labeling the anti-FOXB1 antibody may be an ordinary labeling substance used for labeling the antibody.
  • enzymes such as alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, peroxidase, microperoxidase, glucose oxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, acetylcholinesterase, malate dehydrogenase, luciferase used in EIA (ELISA) 99m Tc, 131 I, for example, used in the RIA, 125 I, 14 C, 3 radioisotope such as H, for example, fluorescein used in FIA, dansyl, fluorescamine, coumarin, naphthylamine or fluorescence of derivatives of these Luminescent materials such as luciferin, isoluminol, luminol, luminescent materials such as bis (2,4,6
  • a conventional antibody labeling method can be mentioned, and a method may be appropriately selected for each labeling substance to be used.
  • the method for measuring the label (signal) derived from the labeling substance varies depending on the type of labeling substance. What is necessary is just to measure by the conventional method according to the property which the labeling substance has.
  • the reagent used to detect the FOXB1 protein, the concentration at the time of detection, the measurement conditions for carrying out the detection are as follows: All can be set in accordance with the measurement method of the above-described immunological measurement method known per se, and any automatic analyzer, spectrophotometer, etc. that are usually used in this field are used without exception. Can do.
  • Method for determining cell differentiation state The expression of the FOXB1 gene in the test cell is detected by the above method, and the differentiation state of the test cell is determined by the following method based on the obtained result.
  • differentiated / differentiated or “differentiated state” means a state in which a cell is in an “early differentiation stage” state, “a state that has acquired differentiation ability to be differentiated in the future (differentiation induction)”, and “ This includes cases in any state of "differentiated”.
  • “differentiated / differentiated” or “differentiated state” means a state in which a cell is in an “early differentiation stage” state or “acquired differentiation ability to differentiate in the future (differentiation-induced)”. This is the case in either state.
  • the initial stage of differentiation means early after differentiation induction treatment, specifically, up to 7 days, preferably up to 6 days, more preferably 3 to 5 days after differentiation induction treatment. The time until.
  • the initial stage of differentiation refers to a stage before the stem cells differentiate into one of the three germ layers and after differentiation induction treatment, and an undifferentiation marker (for example, OCT3 / 4 , NANOG , SOX2, etc. ) Before expression disappears.
  • an undifferentiation marker for example, OCT3 / 4 , NANOG , SOX2, etc.
  • Examples of the differentiation state determination method of the present invention include the following methods.
  • Examples of the method of judging based on the result of detecting FOXB1 mRNA include the following methods.
  • the relative value of the expression level (detection amount) of FOXB1 mRNA in the test cell relative to the expression level (detection amount) of FOXB1 mRNA in the stem cell to be compared is obtained, and the relative value is obtained.
  • the above determination may be made based on the above.
  • the amount of FOXB1 mRNA in stem cells that have been confirmed to be in an undifferentiated state is measured in advance.
  • the detected amount of FOXB1 mRNA of a test cell, if greater than the detection of FOXB1 mRNA stem cells previously measured and determined its test cell is a state of differentiation, and.
  • a boundary value (cutoff value) of the FOXB1 mRNA amount capable of determining whether or not the test cell is differentiated is set in advance. Then, the differentiation state of the test cell is determined based on whether or not the detected amount of FOXB1 mRNA in the test cell is higher than the boundary value. In this case, when the detected amount of FOXB1 mRNA in the test cell is higher than the cutoff value, it is determined that the test cell is in a differentiated state.
  • the FOXB1 protein in the test cell is detected by the above method, and the FOXB1 protein is similarly detected using a stem cell confirmed to be in an undifferentiated state as a comparison.
  • the detected amount of FOXB1 protein in the test cell is larger than the detected amount of FOXB1 protein in the comparison target stem cell, it is determined that the test cell is in a differentiated state.
  • whether or not the detected amount of the FOXB1 protein in the test cell is larger than the detected amount of the FOXB1 protein in the comparison target stem cell may be determined by comparing the two.
  • the amount of FOXB1 protein in stem cells that have been confirmed to be in an undifferentiated state is measured in advance.
  • the detected amount of FOXB1 protein in the test cell is larger than the detected amount of FOXB1 protein in the stem cell measured in advance, it is determined that the test cell is in a differentiated state.
  • a boundary value (cutoff value) of the FOXB1 protein mass that can be used to determine whether or not the test cell is differentiated is set in advance. Then, the differentiation state of the test cell is determined based on whether or not the detected amount of FOXB1 protein in the test cell is higher than the boundary value. In this case, when the detected amount of FOXB1 protein in the test cell is higher than the cutoff value, it is determined that the test cell is in a differentiated state.
  • Stem cells such as iPS cells or ES cells are subjected to differentiation induction treatment by a known method.
  • the upper limit after differentiation induction treatment is within 7 days, preferably within 6 days, more preferably within 5 days, and the lower limit is 1 day or more, preferably 2 days or more, more preferably 3 days or more, and then the cells are collected.
  • the expression of FOXB1 gene (expression of FOXB1 mRNA or FOXB1 protein) is detected by the above method.
  • the differentiation state of the cells can be determined by any one of methods 1) to 4) below. 1) When the expression of FOXB1 gene is confirmed (if FOXB1 mRNA or FOXB1 protein is detected), the cell is in a differentiated state (“the cell group has a differentiated state”). Including the case, the same shall apply hereinafter).
  • the FOXB1 gene expression level is similarly detected using stem cells that have been confirmed to be in an undifferentiated state.
  • the expression level of the FOXB1 gene in the test cell (the detection level of FOXB1 mRNA or FOXB1 protein) is greater than the expression level of the FOXB1 gene in the comparison target stem cell, the test cell is in a differentiated state. Determined.
  • the state test cells differentiated it may determine whether or not the state test cells differentiated, is set FOXB1 gene expression level of the boundary value (cutoff value) in advance.
  • the expression level of the FOXB1 gene in the test cell (the detection level of FOXB1 mRNA or FOXB1 protein) is higher than the boundary value, it is determined that the test cell is in a differentiated state.
  • the differentiation state determination method of the present invention is performed on a stem cell that has not been subjected to differentiation induction treatment, it can also be confirmed whether or not the stem cell maintains an undifferentiated state. That is, FOXB1 gene expression (expression of FOXB1 mRNA or FOXB1 protein) is detected from stem cells that have not undergone differentiation induction treatment, for example, by any of the methods 1) to 4) above. When the expression of the FOXB1 gene is not confirmed, or when the expression level of the FOXB1 gene is lower than the amount to be compared in the methods 2) to 4) above, the cell or cells of the cell group are It is determined that the undifferentiated state is maintained.
  • FOXB1 gene expression expression of FOXB1 mRNA or FOXB1 protein
  • FOXB1 mRNA of the cells constituting the cell group is detected by the method of the present invention.
  • FOXB1 mRNA When FOXB1 mRNA is detected, it is determined that there is a differentiated cell in the sample (the meaning of “differentiated state” is as described above; the same applies hereinafter). If the FOXB1 mRNA is not detected it is judged that there is no cell in the state that have differentiated into the sample.
  • the FOXB1 protein of the cells constituting the cell group is detected from the sample containing the cell group by the method of the present invention. When FOXB1 protein is detected, it is determined that there are differentiated cells in the sample. When FOXB1 protein is not detected, it is determined that there is no differentiated cell in the sample.
  • the method of the present invention can be applied to quality control of stem cells.
  • the medium does not contain, for example, a differentiation-inducing factor, and maintains the undifferentiated state of undifferentiated cells. It must be a medium that can be cultured. If the method for determining a differentiation state of the present invention is used, a quality inspection of such a medium can be performed.
  • stem cells are cultured in the medium to be determined for several days, for example, about 3 to 7 days, usually about 5 to 6 days, and then the expression of FOXB1 mRNA in the cells is detected.
  • FOXB1 mRNA When FOXB1 mRNA is not detected, it is determined that the medium can be cultured while maintaining the undifferentiated state of the cells.
  • the expression of the FOXB1 protein in the cells after culture is detected and the FOXB1 protein is not detected, it is determined that the medium is a medium that can be cultured while maintaining the undifferentiated state of the cells.
  • Differentiated cells can be prepared / isolated by applying the method of the present invention.
  • Cells can be prepared / isolated by reacting with or expected to contain cells, and then separating and purifying only fluorescently labeled cells using a method such as flow cytometry. .
  • flow cytometry a method such as flow cytometry
  • undifferentiated stem cells can be prepared and isolated.
  • the present invention can be applied to a method for confirming whether a substance has the ability to induce differentiation of stem cells.
  • the differentiation state determination method of the present invention may be performed after the stem cells are treated by a method corresponding to each test substance.
  • stem cells are cultured in a medium containing a test substance for several days, for example, 3 to 7 days, usually about 5 to 6 days, and then the expression of FOXB1 mRNA in the cultured cells is detected.
  • FOXB1 mRNA it is confirmed that the test substance is a substance that induces stem cell differentiation.
  • FOXB1 protein in the cultured cells is detected.
  • FOXB1 protein it is confirmed that the test substance is a substance that induces stem cell differentiation.
  • the differentiation marker of the present invention includes “a differentiation marker selected from mRNA or protein derived from FOXB1 gene”. Specifically, the differentiation marker of the present invention is a cell differentiation marker. Specific examples of the cells (test cells) are as described above.
  • FOXB1 gene-derived mRNA or protein examples include the FOXB1 mRNA and FOXB1 protein according to the present invention described above. Specific examples thereof are as described above.
  • differentiation markers selected from the following (i) to (vii) can be mentioned.
  • (Ii) 1 to several, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and further preferably 1 to 2 nucleotides of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 7 are deleted.
  • MRNA having a base sequence inserted, substituted or added (Iii) a base sequence having a sequence homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 95% or more, and even more preferably 97% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 7
  • kits for Differentiating State Determination examples include a kit equipped with a reagent for detecting the expression of the FOXB1 gene, or a kit equipped with a reagent for measuring the expression level of the FOXB1 gene.
  • Kits provided with primers used for detecting the expression of FOXB1 mRNA or measuring the expression level thereof, or labels thereof (b) The expression of FOXB1 protein is detected or the expression level thereof
  • a kit comprising an antibody against FOXB1 protein used for measurement (an antibody that recognizes FOXB1 protein, preferably an antibody that specifically binds to FOXB1 protein) or a label of the antibody
  • Examples of “a primer used for detecting the expression of FOXB1 mRNA or measuring its expression level” included in the kit of (a) above are represented by “SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 7,” for example. And a primer used to detect a base sequence or a partial sequence thereof.
  • Examples of the “primer used for detecting the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 7 or a partial sequence thereof” included in the kit of (a) above include: (a-1) a primer pair used when PCR is performed using the cDNA obtained by the reverse transcription reaction as a template, or (a-2) A combination of an amplification primer used for the reverse transcription reaction and a primer pair used when performing PCR using the cDNA obtained by the reverse transcription reaction as a template, Is mentioned.
  • At least one of the primers constituting the “primer pair used when performing PCR using the cDNA obtained by the reverse transcription reaction as a template” in (a-1) may be labeled with a labeling substance as necessary.
  • primer pair examples include “a primer pair of a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 and a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 6” or “the base represented by SEQ ID NO: 11”.
  • a specific example of “a combination of an amplification primer used for reverse transcription reaction and a primer pair used for PCR using cDNA obtained by reverse transcription reaction as a template” in (a-2) is “SEQ ID NO: 4 And a primer pair of a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 and a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 or "SEQ ID NO: 10"
  • a combination of a primer and a primer pair of a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 and a primer having the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 Any of these primers may be labeled with a labeling substance.
  • the kit of (a) further includes a reverse transcriptase used for RT-PCR, a nucleic acid synthesizing enzyme (DNA polymerase, RNA polymerase, etc.) as necessary, and a substrate (dNTP, rNTP, etc.) according to the enzyme, Further, it may contain a double-stranded intercalator (SYBR TM Green, ethidium bromide, etc.) or a label detection substance such as FAM or TAMRA.
  • a reverse transcriptase used for RT-PCR
  • a nucleic acid synthesizing enzyme DNA polymerase, RNA polymerase, etc.
  • a substrate dNTP, rNTP, etc.
  • dNTP double-stranded intercalator
  • FAM label detection substance
  • the kit containing the above (a-1) or (a-2) as a constituent element is, for example, a buffer, a stabilizer, a preservative, etc., and does not inhibit the stability of coexisting reagents, Those which do not inhibit PCR or hybridization reaction may be contained. Further, the concentration may be appropriately selected from a concentration range usually used in this field.
  • the buffer include, for example, Tris buffer, phosphate buffer, veronal buffer, borate buffer, Good buffer, and the like buffers used for normal PCR and hybridization reactions. All liquids are listed.
  • the pH is not particularly limited, and examples thereof include a range of 5 to 9.
  • the antibody against FOXB1 protein used for detecting the expression of FOXB1 protein or measuring the expression level included in the kit of (b) above are as described above.
  • an antibody against a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 8 can be mentioned.
  • reagents usually used in this field such as buffers, sensitizers, surfactants, preservatives (for example, sodium azide, salicylic acid, benzoic acid, etc.), Stabilizers (eg, albumin, globulin, water-soluble gelatin, surfactants, saccharides, etc.), activators, coexisting substance avoidance agents, and other substances used in this field, and stability with coexisting reagents Or may not inhibit the antigen-antibody reaction.
  • concentration range of these reagents and the like may be appropriately selected from the concentration ranges usually used in the measurement method known per se. Specific examples of the buffer and the like, and the pH and concentration thereof are the same as those described in the description regarding the kit (a).
  • a reagent or the like constituting the kit for determining the differentiation state of a cell according to the present invention may be in the form of a solution such as a suspension suspended in an appropriate buffer, or a frozen product or a lyophilized product obtained by freezing this.
  • a solution such as a suspension suspended in an appropriate buffer, or a frozen product or a lyophilized product obtained by freezing this.
  • the buffering agent used for this purpose the pH and the concentration thereof are as described above.
  • the kit of the present invention includes instructions for use in a method for detecting FOXB1 gene expression (for example, FOXB1 mRNA expression or FOXB1 protein expression) in the cells of the present invention, or differentiation of the cells of the present invention. Instructions for carrying out the method for determining the state may be included.
  • the “instructions” are the instruction manuals, package inserts, pamphlets (leaflets), etc. of the kits in which the features, principles, operation procedures, judgment procedures, etc. of the method are substantially described in text or diagrams. Means.
  • Example 1 Differentiation induction treatment was performed by culturing human iPS cells in a bFGF-free medium, and expression of FOXB1 mRNA and a known differentiation marker was detected by RT-qPCR.
  • RNA was extracted from the cells recovered in (1) above using a commercially available nucleic acid extraction reagent kit ISOGEN (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) according to the instruction manual.
  • Binding Buffer 5.5 M guanidine hydrochloride (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 20 mM Tris-HCl pH6.6
  • Econospin sica membrane spin column for nucleic acid purification
  • Manufactured by Gene Design Co., Ltd. Manufactured by Gene Design Co., Ltd.
  • 500 ⁇ L of Wash Buffer 2 mM Tris-HCl pH 7.5 (Nippon Gene Co., Ltd.), 80% ethanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and centrifuged at 12000 ⁇ g for 1 minute at room temperature. The tube solution was removed.
  • elution Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) was added and centrifuged at 12000 ⁇ g at room temperature for 1 minute to collect Total RNA. Thereafter, ethanol precipitation was performed, and the resulting precipitate was dissolved in 9.5 ⁇ L of distilled water.
  • FOXB1 mRNA amplification primer CTGTAGTCGCCACTCGCCAT (SEQ ID NO: 4, GenBank Accession No. NM_012182: 1176-1195 (base sequence complementary to the 1176-1195th base sequence of GenBank Accession No. NM_012182).
  • CTGTAGTCGCCACTCGCCAT GenBank Accession No. NM_012182: 1176-1195 (base sequence complementary to the 1176-1195th base sequence of GenBank Accession No. NM_012182).
  • ⁇ FOXA1 mRNA amplification primers CAGCCGTTCTCGAACATGTTG (SEQ ID NO: 13, GenBank Accession No. NM_004496: 901-921 )
  • CAACATGTTCGAGAACGGCTG SEQ ID NO: 14, GenBank Accession No.
  • NM_021784: 923-934) ⁇ FOXA3 mRNA amplification primers, CTCCAGCTTGAAGCGTTTCTG (SEQ ID NO: 15, GenBank Accession No. NM_004497: 825-845 ) -OCT3 / 4 mRNA amplification primer, CTCACTCGGTTCTCGATACTG (SEQ ID NO: 16, GenBank Accession No. NM_002701: 778-798), And amplification primers NANOG mRNA, CTTCAGGTTGCATGTTCATGG (SEQ ID NO: 17, GenBank Accession No.
  • FGF5 mRNA amplification primer GGTTTCTCACAAGGCCAAGAG (SEQ ID NO: 18, GenBank Accession No. NM_004464: 1050-1070) GAPDH mRNA amplification primer, GCTGTAGCCAAATTCGTTGTC (SEQ ID NO: 19, GenBank Accession No. NM_002046: 1131-1151) (GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)
  • the resulting mixture was incubated at 72 ° C. for 3 minutes and then immediately ice-cooled.
  • binding buffer 5.5M guanidine hydrochloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 20 mM Tris-HCl pH6.6 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • Econospin sica membrane spin column for nucleic acid purification, manufactured by Gene Design Co., Ltd.
  • the base sequence of each primer used is as follows. The following primers are all manufactured by Sigma-Aldrich.
  • the FOXB1 gene (base sequence represented by SEQ ID NO: 1), 986 to 1102, the 117 bp region (SEQ ID NO: 3) (GenBank Accession No. NM_012182 position 986) -1102) is amplified.
  • NANOG cDNA GenBank Accession No. NM_024865: 870-891, 972-992
  • Forward primer CAACCACTCCTGGAACACTCAG (SEQ ID NO: 28)
  • Reverse primer GAATTTGGCTGGAACTGCATG (SEQ ID NO: 29)
  • Amplification chain length 123 bp
  • FGF5 cDNA GenBank Accession No.NM_004464: 906-927, 1020-1040
  • Forward primer CAACCACTCCTGGAACACTCAG (SEQ ID NO: 30)
  • Reverse primer GAATTTGGCTGGAACTGCATG (SEQ ID NO: 31)
  • Amplification chain length 135bp
  • GAPDH cDNA GenBank Accession No.NM_002046: 1013-1034, 1106-1127
  • Forward primer CTACACTGAGCACCAGGTGGTC (SEQ ID NO: 32)
  • Reverse primer CCAGGAAATGAGCTTGACAAAG (SEQ ID NO: 33)
  • Amplification chain length 115bp
  • the obtained mixture was set in a CFX96 Touch real-time PCR analysis system (Bio-Rad Laboratories, Inc.) and subjected to 40 cycles of 98 ° C. for 2 minutes, 98 ° C. for 10 seconds ⁇ 58 ° C. for 10 seconds ⁇ 68 ° C. for 30 seconds.
  • each obtained Ct value was corrected with the CPD value of GAPDH .
  • the expression level of each differentiation marker is relative to the ⁇ Ct value (bFGF-added medium (bFGF (+) medium)).
  • the Ct value of each marker of cells cultured for 6 days is “1”, and bFGF-free medium relative to that value It was obtained by determining the relative Ct value of the same marker of cells cultured for 6 days in (bFGF ( ⁇ ) medium).
  • the expression level ( ⁇ ) on the 6th day in the bFGF ( ⁇ ) medium is 6 days in the bFGF (+) medium culture. It was lower than the expression level ( ⁇ ). From this, it was confirmed that the hiPS cells cultured on bFGF ( ⁇ ) medium on the 6th day are in a state of cell differentiation.
  • OCT3 / 4 mRNA which is an undifferentiated marker for cells
  • FOXA1 mRNA, FOXA2 mRNA, and FOXA3 mRNA which are markers for early differentiation of cells
  • FGF5 is not shown in FIG. 1 because it was below the detection limit in this study.
  • the expression level ( ⁇ ) on the 6th day in the bFGF ( ⁇ ) medium is compared with the expression level ( ⁇ ) on the 6th day in the bFGF (+ medium). It was confirmed that it increased 27.5 times.
  • FOXB1 mRNA is useful as a cell differentiation marker, and that the cell differentiation state can be determined by detecting FOXB1 mRNA.
  • FOXB1 mRNA can determine the differentiation state of cells at the early stage of differentiation such that expression of known markers such as OCT3 / 4 mRNA, FOXA1 mRNA, FOXA2 mRNA, FOXA3 mRNA has not changed yet. .
  • FGF5 was known to be highly expressed at the early stage of differentiation among known differentiation markers.
  • results in FIG. 1 indicate that FOXB1 mRNA can determine the differentiation state of cells at an early stage of differentiation such that FGF5 has not yet been expressed.
  • the determination method of the present invention is useful for early screening of cells, quality control of stem cells, and the like because cell differentiation can be determined in the early stage of culture after induction of differentiation. Furthermore, from the above, by carrying out the determination method of the present invention, effects such as shortening of the culture period and cost reduction of the medium cost can be expected.
  • Example 2 Mouse ES cells were subjected to differentiation induction treatment by culturing in a LIF-free medium, and expression of Foxb1 mRNA and a known differentiation marker was detected by RT-qPCR.
  • Stem cell culture and differentiation induction treatment mES cells (D3 strain, ATCC, b723512), LIF added (1000Unit) or non-added medium (StemSure DMEM, StemSure Serum replacement, MEM non-essential amino acid solution, L-glutamine solution , StemSure 2-mercaptoethanol solution, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and subcultured three times, and cells were collected on the first and fifth days at the start of the culture.
  • mES cells D3 strain, ATCC, b723512
  • LIF added 1000Unit
  • non-added medium StemSure DMEM, StemSure Serum replacement, MEM non-essential amino acid solution, L-glutamine solution , StemSure 2-mercaptoethanol solution, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • RNA was extracted from the cells recovered in (1) above using a commercially available nucleic acid extraction reagent kit ISOGEN (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) according to the instruction manual.
  • Binding Buffer 5.5 M guanidine hydrochloride (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 20 mM Tris-HCl pH6.6
  • Econospin sica membrane spin column for nucleic acid purification
  • Manufactured by Gene Design Co., Ltd. Manufactured by Gene Design Co., Ltd.
  • 500 ⁇ L of Washing Buffer (2 mM Tris-HCl pH 7.5 (Nippon Gene Co., Ltd.), 80% ethanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and centrifuged at 12000 ⁇ g, room temperature for 1 minute. And the tube solution was removed.
  • elution Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) was added and centrifuged at 12000 ⁇ g at room temperature for 1 minute to collect Total RNA. Thereafter, ethanol precipitation was performed, and the resulting precipitate was dissolved in 9.5 ⁇ L of distilled water.
  • ⁇ Oct3 / 4 amplification primers mRNA GTTCTTAAGGCTGAGCTGCAAG (SEQ ID NO: 34, GenBank Accession No. NM_013633: 614-635 ) And amplification primers Nanog mRNA, CTGGTAGAAGAATCAGGGCTGC (SEQ ID NO: 35, GenBank Accession No. NM_028016: 409-430 ) Amplification primer for Sox2 mRNA, GTTCATGTAGGTCTGCGAGCTG (SEQ ID NO: 36, GenBank Accession No.
  • NM_011443: 1060-1081 ⁇ Rexl mRNA amplification primers, GTTCGGAAAACTCACCTCGTATG (SEQ ID NO: 37, GenBank Accession No. NM_009556: 636-658 ) Fgf5 mRNA amplification primer, GGAGCCATTGACTTTGCCATC (SEQ ID NO: 38, GenBank Accession No. NM_010203: 538-558) Gapdh mRNA amplification primer, CATACCAGGAAATGAGCTTGAC (SEQ ID NO: 39, GenBank Accession No. NM_001289726: 1008-1029)
  • the obtained mixture was incubated at 72 ° C. for 3 minutes and then immediately cooled on ice.
  • 5 ⁇ Buffer (Toyobo Co., Ltd.) 4 ⁇ L, 2.5 mM NTP dNTPs (Nippon Gene Co., Ltd.) 4 ⁇ L, RNase Inhibitor, super (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.5 ⁇ L (20U), ReverTra Ace (Toyobo) 1 ⁇ L (100 U) was added and mixed, and incubated at 42 ° C. for 50 minutes.
  • binding buffer 5.5 M guanidine hydrochloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 20 mM Tris-HCl (pH 6.6) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • the solution was transferred to Econospin (silica membrane spin column for nucleic acid purification, manufactured by Gene Design Co., Ltd.) and centrifuged at 12000 ⁇ g at room temperature for 1 minute to remove the tube solution.
  • the base sequence of each Primer used is as follows. The following primers are all manufactured by Sigma-Aldrich.
  • the 954-1078th 125 bp region (SEQ ID NO: 9) of the mouse Foxb1 gene (base sequence represented by SEQ ID NO: 7). ) (Position 954-1078 of GenBank Accession No. NM_022378) is amplified.
  • Sox2 cDNA GenBank Accession No. NM_011443: 937-958, 1039-1059
  • Forward primer CTACAGCATGATGCAGGAGCAG (SEQ ID NO: 44)
  • Reverse primer GTCATGGAGTTGTACTGCAGG (SEQ ID NO: 45)
  • Amplification chain length 123 bp
  • Rex1 cDNA GenBank Accession No. NM_009556: 520-541, 613-633
  • Forward primer CCAGTCCAGAATACCAGAGTGG (SEQ ID NO: 46)
  • Reverse primer GCACTCTAGGTATCCGTCAGG (SEQ ID NO: 47)
  • Amplification chain length 114bp
  • Fgf5 cDNA GenBank Accession No. NM_010203: 366-386, 448-468
  • Forward primer CAGAAGTAGCGCGACGTTTTC (SEQ ID NO: 48)
  • Reverse primer GCTCCACTGGAAACTGCTATG (SEQ ID NO: 49)
  • Amplification chain length 103bp
  • Gapdh cDNA GenBank Accession No.NM_001289726: 840-860, 911-932
  • Forward primer CCTGCCAAGTATGATGACATC (SEQ ID NO: 50)
  • Reverse primer GACAACCTGGTCCTCAGTGTAG (SEQ ID NO: 51)
  • Amplification chain length 93bp
  • the obtained mixture was set in a CFX96 Touch real-time PCR analysis system (Bio-Rad Laboratories, Inc.) and subjected to 40 cycles of 98 ° C. for 2 minutes, 98 ° C. for 10 seconds ⁇ 58 ° C. for 10 seconds ⁇ 68 ° C. for 30 seconds.
  • CFX manager software Bio-Rad Laboratories, Inc. was used for data analysis, and the obtained Ct values were corrected with Gapdh Ct values.
  • the expression level of each differentiation marker is relative to the ⁇ Ct value (bFGF-added medium (bFGF (+) medium)).
  • the Ct value of each marker of cells cultured for a predetermined day is “1”, and bFGF-free medium relative to that value It was obtained by calculating the relative value of the Ct value of the same marker of cells cultured for the same day in (bFGF ( ⁇ ) medium).
  • Results are shown in FIG. In FIG. 2, (1) shows the result of detecting the expression of Foxb1 mRNA, (2) shows the result of detecting the expression of Fgf5 mRNA, (3) shows the result of detecting the expression of Oct3 / 4 mRNA, (4 ) Shows the result of detecting the expression of Nanog mRNA, (5) shows the result of detecting expression of Sox2 mRNA, and (6) shows the result of detecting expression of Rex1 mRNA.
  • Fgf5 mRNA which is a differentiation marker at the early stage of cell differentiation (Fig. 2 (2))
  • the expression level increased on the fifth day of culture (mES Day5 (-)) in LIF (-) medium, but the degree of increase was about 17 times the expression level (mES (+)) on the first day of culture.
  • the expression level (mES Day5 (-)) on the fifth day of culture in the LIF (-) medium is the expression level (mES on the first day of culture). Compared with (+)), it increased about 90 times.
  • Foxb1 mRNA is useful as a differentiation marker for cells, and by detecting Foxb1 mRNA, the differentiation state of cells can be determined at an early stage of differentiation rather than detecting conventional undifferentiated markers or differentiation markers. I understood that I can judge.
  • the determination method of the present invention is useful for early screening of cells, quality control of stem cells, and the like because cell differentiation can be determined in the early stage of culture after induction of differentiation. From the above, by implementing the determination method of the present invention, effects such as shortening of the culture period and cost reduction of the medium cost can be expected.
  • the fraction after electrophoresis is transferred to a PVDF membrane by a semi-driving method.
  • Block Ace (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) is dissolved in PBS-T (Phosphate Buffered Saline with Tween TM 20, pH 7.4) to obtain a blocking solution.
  • PBS-T Phosphate Buffered Saline with Tween TM 20, pH 7.4
  • the PVDF membrane after the transfer is immersed in this blocking solution and subjected to blocking treatment at room temperature for 1 hour, and then the PVDF membrane is washed and immersed in the blocking solution.
  • the peroxidase-labeled anti-human FOXB1 protein antibody obtained in 2) above is added to the blocking solution and immersed at room temperature for about 1 hour.
  • the PVDF membrane is washed, luminescence is generated with ECL TM Prime Western Blotting Detection Reagent (peroxidase chemiluminescence substrate, manufactured by GE Healthcare), and detection is performed with an exposure time of 10 seconds using LAS4000 (manufactured by FUJIFILM Corporation).
  • ECL TM Prime Western Blotting Detection Reagent peroxidase chemiluminescence substrate, manufactured by GE Healthcare
  • detection is performed with an exposure time of 10 seconds using LAS4000 (manufactured by FUJIFILM Corporation).
  • LAS4000 manufactured by FUJIFILM Corporation
  • the differentiation state of stem cells can be determined at the initial stage of differentiation.
  • the present invention can also be applied to stem cell quality control and differentiated cell preparation / isolation methods. Furthermore, since the present invention can determine differentiated cells at the early stage of culture, it is useful for early screening of cells and quality control of stem cells, and can be expected to shorten the culture period and reduce the cost of the medium.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明の課題は、細胞の分化状態を、分化の初期段階で判定することができる方法を提供することにある。　本発明は、「被検細胞のFOXB1遺伝子の発現を検出し、その結果に基づいて判定を行う、細胞の分化状態の判定方法。」及び「FOXB1遺伝子由来のmRNA又は蛋白質から選択される、分化マーカー。」に関する。

Description

細胞の分化状態の判定方法、及びこれに用いられる新規な分化マーカー
　本発明は、細胞の新規な分化マーカーに関する。
　ES細胞（Embryonic Stem cell、胚性幹細胞）やiPS細胞（Induced Pluripoent Stem Cell、人工多能性幹細胞）等の多能性幹細胞は、その多能性を維持するために、例えばフィーダー細胞と共培養する、フィーダー層由来の条件培地で培養する、培地へbasic FGF (bFGF/FGF2、basic Fibroblast Growth Factor、塩基性繊維芽細胞増殖因子)やLIF（leukemia inhibitory factor）を添加する、等の処理が必要である。さもないと、多能性幹細胞は、環境や細胞のコンディションが原因で多分化能を失い、容易に分化してしまうことがある。そのため、多能性幹細胞の未分化状態（多能性を持つ状態）や分化状態を正確に知ることは重要である。
　また、再生医療の分野では、多能性幹細胞を目的の細胞に分化させてから移植を行う。しかし、その移植させる細胞に未分化のままの細胞が混入している場合には、それが腫瘍形成の原因になる危険性がある。そこで、多能性幹細胞を分化誘導処理して得られた細胞中に、未分化細胞が混入しているかどうかを判定する技術は、重要である。
　しかしながら、細胞の分化状態を、細胞の外見から判断することは難しい。
　そこで、細胞の分化状態を判定する方法として、分化状態の指標となるマーカーを検出し、その結果に基づいて判定する方法が行われている。例えば、多能性幹細胞のマーカーとして、Oct3/4、Nanog、Sox2、Rex1、Alkaline Phosphatase、TRA-1-60、LIF-R等が知られている。多能性幹細胞は、未分化状態でこれらのマーカーを発現しているので、これらのマーカーを検出することにより、細胞が未分化状態を維持しているか否かを判断することができる。
　しかしこれらの未分化マーカーを用いた判定方法では、ある程度分化した状態（例えば三胚葉のいずれかにまで分化した状態）の細胞でないと分化状態を判定できない。また、これらの未分化マーカーを用いた判定方法による判定結果は、細胞の培養条件によって大きく影響を受ける場合もあった。そのため、細胞が未分化状態（多能性）を維持しているのか、将来分化する分化能を獲得した状態なのかを、細胞の分化の初期段階で判断することは困難であった。
　ところで、Fox (Forkhead box)と呼ばれる、フォークヘッド又はウイングド・ヘリックス DNA 結合ドメインを持った転写因子の一群が知られており（非特許文献１）、またヒトでは 約50 種類存在していることが知られている。Foxの発現蛋白質は、主に発生調節因子、組織特異的調節因子、細胞周期調節因子として機能していることがわかっている。例えば、FOXA1、FOXA2、FOXA3等は初期分化マーカーとして知られている（非特許文献２）。
　しかし、その作用がほとんど解明されていないものもある。例えば、アフリカツメガエルの胚を用いた実験結果に基づき、FOXB1は、神経組織の形成に何らかの関与をしていることが報告された（非特許文献３）。しかし、FOXB1の具体的な作用はまだ解明されていない。
Eddy H van Roon, et al. Clinical Epigenetics 2013, Jan 16; 5(1):2. doi: 10.1186/1868-7083-5-2 鈴木淳史, 生化学, 2012, vol.84, No.8, pp.675-679 Takebayashi-Suzuki K. et al., Developmental Biology, 2011, vol.360, pp.11-29
　本発明は上述した状況に鑑みなされたもので、細胞の分化状態を、分化の初期段階で判定することができる方法を提供することを課題とする。
　本発明は、上記課題を解決する目的でなされたもので、以下の構成よりなる。
（１）被検細胞のFOXB1遺伝子の発現を検出し、その結果に基づいて判定を行う、細胞の分化状態の判定方法。
（２）FOXB1遺伝子由来のmRNA又は蛋白質から選択される、分化マーカー。
　basic FGF (bFGF, FGF2、basic Fibroblast Growth Factor、塩基性繊維芽細胞増殖因子)を添加した培地でES細胞やiPS細胞等の多能性幹細胞を培養すると、多能性幹細胞は長期にわたって、その未分化状態を維持したまま増殖することが知られている。
　本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、bFGF無添加培地でiPS細胞を培養すると（分化誘導処理）、培養開始後３～５日で、iPS細胞のFOXB1 mRNAの発現が検出され、しかもその発現量が顕著に増加する現象を確認した。また、bFGFを添加した培地で培養し未分化状態を維持したiPS細胞には、FOXB1 mRNAの発現が認められないことも確認した。そして更に研究の結果、FOXB1 mRNAが、ES細胞やiPS細胞の分化マーカーとして有用であること、その発現を測定することにより、分化の初期段階の細胞を選別することができることを見出し、本発明を完成させるに到った。
　本発明の判定方法を実施することにより、細胞の分化状態を、分化の初期段階で判定することができる。また、本発明の判定方法は、幹細胞の品質管理や分化細胞の調製・単離方法へ応用することができる。更に本発明の判定方法は、細胞の分化状態を分化誘導処理後の培養初期に判定できることから、細胞の早期スクリーニングに有用であり、培養期間の短縮、培地代の経費削減などが期待できる。
実施例１において得られた、FGF5非存在下で６日間培養したヒトiPS細胞の、各分化マーカー mRNAの発現を検出した結果を示すグラフである。 実施例２において得られた、LIF非存在下で所定期間培養したマウスES細胞の、各分化マーカーmRNAの発現を検出した結果を示すグラフである。図２において、(1)はFoxb1 mRNAの発現を検出した結果を、(2)はFgf5 mRNAの発現を検出した結果を、(3)はOct3/4 mRNAの発現を検出した結果を、(4)はNanog mRNAの発現を検出した結果を、(5)はSox2 mRNAの発現を検出した結果を、(6)はRex1 mRNAの発現を検出した結果を、それぞれ示す。
　本発明の細胞の分化状態の判定方法に供される被検細胞としては、公知の分化誘導処理を施した幹細胞、未分化状態を維持する処理を施した幹細胞、公知の多能性誘導処理を施して体細胞を脱分化させた細胞、等が挙げられる。
　本発明に係る幹細胞とは、いわゆる自己複製能力と様々な細胞に分化し得る分化能を有する未分化な細胞である。例えば多分化能（多能性）を有するES細胞、iPS細胞、ntES細胞（nuclear transfer Embryonic Stem Cell）、EG細胞（Embryonic Cell、胚性生殖細胞）、EC細胞（Embryonic Cell、胚性癌幹細胞）等の多能性幹細胞が挙げられる。
　幹細胞を分化誘導処理する方法としては、自体公知の方法であればよく、特に限定されない。例えば、公知の分化誘導物質で細胞を処理した後培養する方法、bFGFやLIFを含有しない培地で培養する等の、幹細胞が分化誘導される環境で培養する方法等が挙げられる。
　幹細胞の分化を誘導する物質（分化誘導物質）としては、例えば神経細胞への分化を誘導するレチノイン酸（Retinoic Acid）、心筋細胞への分化を誘導するスペルミン（Spermine），酪酸ナトリウム（Sodium Butyrate），トリコスタチンA（Trichostatin A）、マウスES細胞のインスリン産生細胞への分化を誘導するDNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（DNA Methyltransferase Inhibitor）等が知られている。
　「未分化状態」とは、例えば、細胞が、上記した自己複製能力を有する状態にあり、且つ様々な細胞に分化し得る分化能を有する状態にあることを意味する。
　「未分化状態を維持する処理」とは、幹細胞の未分化状態を維持する公知の処理であればよいが、例えばフィーダー細胞との共培養、培地中へのbFGFやLIFの添加処理等が挙げられる。
　被検細胞の由来動物としては、例えばヒト、ウシ、ウマ、イヌ、モルモット、マウス、ラット等の哺乳動物が挙げられる。
　本発明に係るFOXB1遺伝子とは、判定に供される細胞が由来する動物種に存在するFOXB1蛋白質をコードする遺伝子DNA、RNA等を意味する。また、FOXB1蛋白質の同族体、変異体、及び誘導体などをコードする遺伝子も包含される。更に、これら遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列及びこれを含む遺伝子や、FOXB1遺伝子と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有する塩基配列を有する遺伝子なども包含される。
　具体的には、例えばヒトFOXB1遺伝子としては、配列番号１で表される塩基配列（ヒトFOXB1 mRNAの塩基配列）に対応する遺伝子、配列番号２で表される蛋白質をコードする塩基配列を有する遺伝子、これらの塩基配列の１～数個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個、更に好ましくは１～２個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換、又は付加された塩基配列を有する遺伝子、又はこれらの塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有する塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
　例えばマウスFoxb1遺伝子としては、配列番号７で表される塩基配列（マウスFoxb1 mRNAの塩基配列）に対応する遺伝子、配列番号８で表される蛋白質をコードする塩基配列を有する遺伝子、これらの塩基配列の１～数個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個、更に好ましくは１～２個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換、又は付加された塩基配列を有する遺伝子、又はこれらの塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有する塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
　本発明に係るFOXB1 mRNAとしては、判定に供される細胞が由来する動物種に存在するFOXB1遺伝子から転写されたmRNA、例えば上記したFOXB1遺伝子由来のmRNAが挙げられる。
　FOXB1遺伝子由来のmRNAとしては、例えばヒトFOXB1 mRNAとしては、以下のものが挙げられる。
・配列番号１で表される塩基配列（GenBank Accession No. NM_012182）を有するmRNA、
・配列番号１で表される塩基配列の１～数個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個、更に好ましくは１～２個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換、又は付加された塩基配列を有するmRNA、
・配列番号１で表される塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有する塩基配列を有するmRNA、
・配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするmRNA、
・配列番号２で表されるアミノ酸配列の１～数個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個、更に好ましくは１～２個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、又は付加されたアミノ酸配列をコードするmRNA、
・配列番号２で表されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードするmRNA。
　マウスFoxb1 mRNAとしては、例えば以下のものが挙げられる。
・配列番号７で表される塩基配列（GenBank Accession No. NM_022378）を有するmRNA、
・配列番号７で表される塩基配列の１～数個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個、更に好ましくは１～２個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換、又は付加された塩基配列を有するmRNA、
・配列番号７で表される塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有する塩基配列を有するmRNA、
・配列番号８で表されるアミノ酸配列をコードするmRNA、
・配列番号８で表されるアミノ酸配列の１～数個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個、更に好ましくは１～２個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、又は付加されたアミノ酸配列をコードするmRNA、
・配列番号８で表されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードするmRNA。
　なお、本明細書では特にFOXB1遺伝子（ヒト遺伝子）とFoxb1遺伝子（ヒト以外の動物の遺伝子）を区別せずに記載する場合がある。すなわち、「FOXB1遺伝子」と「Foxb1遺伝子」の両方を併せて、単に「FOXB1遺伝子」と記載する場合がある。また、本明細書では特に「FOXB1 mRNA」（ヒトmRNA）と「Foxb1 mRNA」（ヒト以外の動物由来のmRNA）を区別せずに記載する場合がある。すなわち、「FOXB1 mRNA」と「Foxb1 mRNA」の両方を併せて、単に「FOXB1 mRNA」と記載する場合がある。
　本発明に係るFOXB1蛋白質としては、判定に供される被検細胞が由来する動物種に存在するFOXB1遺伝子から翻訳された蛋白質が挙げられる。このようなFOXB1蛋白質の同族体、変異体、及び誘導体であってもよい。
　例えばヒトFOXB1蛋白質としては、例えば以下のものが挙げられる。
・配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
・配列番号２で表されるアミノ酸配列の１～数個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個、更に好ましくは１～２個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質、
・配列番号２で表されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質。
　マウスFOXB1蛋白質としては、例えば以下のものが挙げられる。
・配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
・配列番号８で表されるアミノ酸配列の１～数個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個、更に好ましくは１～２個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質、
・配列番号８で表されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質。
＜Ｉ．本発明の細胞の分化状態の判定方法＞
　本発明の細胞の分化状態の判定方法（以下、単に「本発明の判定方法」と記載する場合がある。）は、「被検細胞のFOXB1遺伝子の発現を検出し、その結果に基づいて判定を行う、細胞の分化状態の判定方法。」である。
　本発明の判定方法に係る、FOXB1遺伝子、FOXB1 mRNA、FOXB1蛋白質の具体例は上記した通りである。
＜Ｉ－１．FOXB1遺伝子の発現を検出する方法＞
　FOXB1遺伝子の発現を検出する方法としては、FOXB1 mRNAの発現を検出する方法、又はFOXB1蛋白質の発現を検出する方法が挙げられる。
　本発明において「発現を検出する」という場合、「FOXB1遺伝子が発現したか否か（例えばFOXB1 mRNA又はFOXB1蛋白質の存在の有無）を検出する」場合と、「FOXB1遺伝子が発現した量（例えばFOXB1 mRNAの量、又はFOXB1蛋白質の量）を測定する」場合を含む。
　被検細胞のFOXB1 mRNA又はFOXB1蛋白質の発現を検出する方法を以下に説明する。
　なお、分化誘導処理後の被検細胞のFOXB1遺伝子の発現を検出する場合は、分化誘導処理後の被検細胞がFOXB1 mRNA又はFOXB1蛋白質を検出できる程度にまで発現させた後に、行う。具体的には、被検細胞（幹細胞）を分化誘導処理した後、上限は７日以内、好ましくは６日以内、より好ましくは５日以内、下限は１日以上、好ましくは２日以上、更に好ましくは３日以上培養後に細胞を採取して、以下のFOXB1遺伝子の発現の検出を行えばよい。この間、定期的に（例えば毎日）細胞を採取して、FOXB1遺伝子の発現の検出を行ってもよい。
（１）FOXB1 mRNAの発現を検出する方法
　FOXB1 mRNAの発現を検出する方法は、自体公知のmRNAを検出する方法であれば特に制限されず、公知の方法から適宜選択すればよい。
　例えば、逆転写反応-ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR：Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction、例えば逆転写反応-定量的ポリメラーゼ連鎖反応：RT-qPCR：Reverse Transcription-Quantitative Polymerase Chain Reaction）、コンペティティブPCR、in situ PCR、in situ ハイブリダイゼーション、DNAアレイ法、ノーザンハイブリダイゼーション（Northern hybridization）、Fluorescence in situ hybridization(FISH)法、ドットブロット、RNaseプロテクションアッセイ、RT-LAMP法、SmartFlareTM法（金ナノ粒子に結合した標的RNAに対する相補鎖(捕捉鎖)と、捕捉鎖の相補鎖に蛍光分子が結合しているレポーター鎖を用いる検出方法）、標的RNAに対応する配列を有し、還元反応を引き金として蛍光を発生する２本１組のプローブ(Reduction-triggered Fluorescence activation probe、RETF probe)を用いた検出方法、芳香族求核置換反応を利用した検出方法（標的核酸に相補的なDNA鎖又はRNA鎖を2-シアノ-4-ニトロベンゼンスルホニル基(CNs)で保護したアミノクマリンで修飾したプローブ(CNs-AMCAプローブ)と、標的核酸に相補的なDNA鎖又はRNA鎖をチオフェノール基で修飾したプローブ(MBAプローブ)を用いた検出方法）等の方法が挙げられる。
　in situ PCR、in situ ハイブリダイゼーション、SmartFlareTM法、芳香族求核置換反応を利用した検出方法等の検出方法は、被検細胞を破壊せずにFOXB1 mRNAの検出を行うことができる。
　以下に、RT-PCR及びノーザンハイブリダイゼーションを例にとり、FOXB1 mRNAの発現を検出する方法を説明する。
１）RT-PCR
　標的のFOXB1遺伝子（例えばFOXB1 mRNA）を鋳型とし、逆転写反応によりcDNAを合成後、PCRによるDNAの増幅を行う［Kawasaki, E. S., et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc., SanDiego, 21-27 (1991)］。逆転写反応及びDNAの増幅反応の条件は特に限定されるものではなく、適宜最適な条件を採用すればよい。また、当該標的の遺伝子（例えばFOXB1 mRNA）の増幅領域は、必ずしも該遺伝子の全長である必要はなく、増幅産物の確認に支障が無ければ、当該遺伝子の一部領域であってもよい。そしてその増幅産物（cDNA）の有無や多少（量）を検出することにより、FOXB1 mRNAの存在や量を検出・測定することができる。増幅産物の検出は、電気泳動等の増幅産物を検出する常法で行えばよい。
　具体的には、例えばまず公知の方法で、被検細胞からmRNAを抽出・分離する。次いでFOXB1 mRNAの塩基配列に対応する塩基配列を有するヌクレオチド鎖を増幅用プライマーとして用い、上記で得られたmRNAを鋳型としてRT-PCRを実施し、FOXB1 mRNA又はその一部領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖DNA（cDNA）を合成・増幅する。増幅されたDNA（増幅産物）を、通常のノーザンハイブリダイゼーション等により、検出する。そして、その結果に基づいて、FOXB1 mRNAの存在や量を検出する。
　上記で使用する増幅用プライマーとしては、ヒトのFOXB1 mRNAを検出する場合の増幅プライマーとしては、配列番号１で表される塩基配列から設計されたプライマーが挙げられる。そのようなプライマーとして、例えば配列番号４で表される塩基配列を有するプライマーが挙げられる。マウスのFoxb1 mRNAを検出する場合の増幅プライマーとしては、配列番号７で表される塩基配列から設計されたプライマーが挙げられる。そのようなプライマーとしては、例えば配列番号１０で表される塩基配列を有するプライマーが挙げられる。
　該増幅用プライマーを設計する方法及びその合成方法は、この分野の常法に従った方法が挙げられる。また、FOXB1 mRNA増幅用のプライマーは各種市販されているので、それを用いてもよい。
　上記の方法で増幅されたcDNAを鋳型として用い、FOXB1 mRNAの塩基配列をもとにFOXB1 mRNAの標的の領域が増幅できるように調製したプライマー対を用いて、常法に従って更にPCR等の核酸増幅反応を行い、増幅産物の有無や多小（量）を検出すれば、FOXB1 mRNAの存在や量をより正確に検出できる。増幅産物の検出は、電気泳動等の常法で行えばよい。
　上記の方法で増幅されたcDNAを鋳型として用いた核酸増幅反応、及び増幅産物の検出は、リアルタイム増幅検出法により行ってもよい。リアルタイム増幅検出法による検出法としては、例えばリアルタイムPCR検出法が挙げられる。
　リアルタイムPCR検出法の例としては、インターカレーター（例えばSYBRTM Green I）を利用してリアルタイムPCRを行う通常のインターカレーター法、TaqManTMリアルタイムPCR法、MGB Eclipse Probe System法、Molecular Beacons Probe Technology法、LUX Fluorogenic Primer法、Quenching probe-PCR（QP）法、サイクリングプローブ法等が挙げられるが、これに限定されない。
　上記核酸増幅反応（リアルタイムPCRを含む。）に用いられる「FOXB1 mRNAの標的領域が増幅できるように調製したプライマー対」としては、FOXB1 mRNAの塩基配列又はその特定領域（部分配列）を増幅するプライマー対が挙げられる。
　そのようなプライマー対としては、例えばヒトのFOXB1 mRNA（配列番号１で表される塩基配列）又はその特定領域（部分配列）を増幅するプライマー対が挙げられる。配列番号１で表される塩基配列から常法により設計すればよい。具体的には、例えば配列番号１で表される塩基配列の986～1102番目の、117bpの領域（配列番号３）を標的とした場合、配列番号５で表される塩基配列を有するプライマーと配列番号６で表される塩基配列を有するプライマーのプライマー対が挙げられる。
　また、例えばマウスのFoxb1 mRNA（配列番号７で表される塩基配列）又はその特定領域（部分配列）を増幅するプライマー対も挙げられる。配列番号７で表される塩基配列から常法により設計すればよい。具体的には、例えば配列番号７で表される塩基配列の954～1078番目の、125bpの領域（配列番号９）を標的とした場合、配列番号１１で表される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２で表される塩基配列を有するプライマーのプライマー対が挙げられる。
　これらプライマー対を構成するプライマーは、この分野の常法により化学合成すればよい。また、市販されているプライマー又はプライマー対を用いてもよい。
　RT-PCR法によるヒトFOXB1 mRNAの検出法を例にとって具体的に示すと、以下の通りである。
　被検細胞から常法により抽出し、DNase処理したTotal RNA 500ng～10μgに、FOXB1 mRNAの増幅プライマー（例えば配列番号４の塩基配列を有するプライマー）1～10μMを1μL加え、65～80℃、2～5分間 保温した後、氷冷下で、5×Buffer 4μL、2.5mM dNTPs 4μL、RNase Inhibitor 0.5μL (20U)、逆転写酵素(ReverTra Ace) 1μL(100U)を加え、蒸留水にて全量20μLにして混合し、37～50℃、20～60分間保温することにより逆転写反応を行う。その後常法により、得られたcDNAを回収する。
　次いで、得られたcDNA 1μL、蒸留水5μL、2×PCR Buffer 12.5μL、2 mM dNTPs 4μL、DNAポリメラーゼ(KOD FX Neo) 0.5μL（0.5Ｕ）、フォワードプライマー（例えば配列番号５の塩基配列を有するプライマー） 5～10μMを1μL、リバースプライマー（例えば配列番号６の塩基配列を有するプライマー） 5～10μMを1μL混合する。次いで、例えば94℃ 2分間、98℃ 10秒間→58℃ 10秒間→68℃ 30秒間の反応を28～40サイクル程度行う。常法により増幅産物の検出・解析を行い、FOXB1 mRNAを検出する。
　インターカレーターを用いた検出方法は、例えば以下の方法で実施すればよい。即ち、上記の方法で、cDNAを回収した後、インターカレーター（例えばSYBRTM Green I）及び例えば上記と同様のフォワードプライマーとリバースプライマーを用い、上記で得られたcDNAを鋳型として用いて、Taq DNA ポリメラーゼ等のポリメラーゼを用い、リアルタイムPCRを行う。そして、増幅産物の増幅量と相関してインターカレーションするインターカレーターの蛍光強度を測定することにより増幅産物の検出・解析を行い、FOXB1 mRNAを検出する。
　RT-PCRによる増幅産物の検出・解析を、TaqManプローブなどを二つ用いたDualプローブ法によるqPCRで行ってもよい。
　上記の方法で増幅されたcDNAを鋳型として核酸増幅反応を実施した後の増幅産物の検出・解析は、キャピラリー電気泳動（Ｊ.Chromatogr. 593 253－258 （1992）、Anal.Chem. 64 1926－1932 （1992）、WO2007/027495等）、又はキャピラリーチップ電気泳動で行ってもよい。すなわち、cDNAを回収した後、例えば蛍光物質等の標識物質で標識したプライマーやインターカレーターを用いて核酸増幅反応を実施する。次いで、キャピラリーチップ電気泳動を行って、分離された標識PCR増幅産物由来のシグナルを検出器で検出すればよい。検出器としては、示差屈折検出器、蛍光検出器、UV検出器等の機器等を用いればよい。中でも、UV検出器、蛍光検出器が好ましく、蛍光検出器がより好ましい。例えばLiBASys（島津製作所（株）製）等の自動免疫分析装置を用いれば、PCRから電気泳動までの操作をリアルタイムに行うことができる。
　RT-PCRは、SYBRTM Green I等を含む市販のqPCR用キット（KOD SYBR qPCR Mix(東洋紡(株)製)等）を用いて行ってもよい。
２）ノーザンハイブリダイゼーション
　ノーザンハイブリダイゼーションによりFOXB1 mRNAを検出する方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。例えば、被検細胞から抽出・分離したmRNAを適当な担体に固定化する。そして、固定化したmRNAと、FOXB1 mRNAに相補的な塩基配列を有するヌクレオチド鎖を検出可能な標識物質で標識した標識プローブ（cDNAでもよい）とのハイブリダイゼーションを行う。固定化したmRNAとハイブリダイゼーションした標識プローブの標識物質由来のシグナルを検出することにより、FOXB1 mRNAを検出することができる。ここで使用するプローブは、FOXB1 mRNAの塩基配列の相補配列の全部からなるものであっても、その一部の塩基配列からなるものであってもよい。また、この検出法に、該プローブを固定化したマイクロアレイ、DNAチップを用いることもできる。
　上記標識プローブに用いられる標識物質としては、放射性同位体や酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなど公知の標識物質であれば何れも用いることができる。
　例えば、放射性同位体としては32P，33P，35S等、酵素としてはアルカリホスファターゼ，西洋ワサビペルオキシダーゼ等、蛍光物質としてはCyanine Dye系のCy3，Cy5（アマシャムバイオサイエンス株式会社）や、Alexa555、Alexa647（インビトロジェン社）フルオレセイン等、発光物質としてはAcridinium Esterを含む化学発光試薬等が挙げられる。
　プローブを標識する方法としては、この分野で通常行われているオリゴヌクレオチドの標識方法が挙げられ、標識物質毎に適宜方法を選択すればよい。
　また、標識プローブの標識物質に由来する標識（シグナル）を測定する方法は、標識物質の種類により異なる。標識物質が有している性質に応じた常法により、測定すればよい。
　なお、本発明に係るFOXB1 mRNAを検出する方法に用いられる試薬中には、この分野で通常用いられる試薬類、例えば緩衝剤、安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害せず、PCR等の核酸増幅反応やハイブリダイゼーション反応を阻害しないものを用いることができる。また、その濃度も、この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
　緩衝液の具体例としては、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常のPCR等の核酸増幅反応やハイブリダイゼーション反応を実施する場合に用いられている緩衝液は全て挙げられる。そのpHも特に限定されないが、例えば5～9の範囲が挙げられる。
　また、必要に応じて核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素など）、酵素に応じた基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰなど）、また二本鎖インターカレーター（エチジウムブロマイド、SYBRTM Greenなど）あるいはFAMやTAMRA等の標識検出物質などが用いられる。
（２）FOXB1蛋白質の発現を検出する方法
１）細胞を破壊せずに検出する方法
　FOXB1蛋白質は転写因子であるので、細胞の核内に存在する。
　細胞を破壊せずに核内物質を染色する技術技術を用いて、細胞を破壊せずに核内のFOXB1蛋白質を検出することが出来る。例えば、Triton TM、NP-40、Tween 20 TM、Saponin、Digitonin TM、Leucoperm TMなどの界面活性剤を含む緩衝液を用い、被検細胞の核膜を部分的に可溶化する。すると細胞膜の構造を壊さずに抗体が通れるぐらいの間隙が出来る。次に、蛍光物質等で標識した抗FOXB1抗体で核蛋白質の染色を行えば、核内のFOXB1蛋白質を検出することができる。
　また、核内物質を染色する各種試薬も市販されている。そこで、これらの市販の試薬を用いて核内のFOXB1蛋白質を染色して、FOXB1蛋白質の発現を検出してもよい。
２）細胞を破壊して検出する方法
　また、細胞を破壊する以下の方法を行って、FOXB1蛋白質を検出することもできる。
　まず被検細胞培養物を濾過又は遠心分離などの常法で処理して細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁する。次いで、界面活性剤処理、超音波処理、リゾチーム処理、凍結融解などの方法で細胞膜等を破壊した後、遠心分離や濾過などの方法でFOXB1蛋白質を含有する抽出液を得る。
　次いで、得られた抽出液中のFOXB1蛋白質を、蛋白質を検出する自体公知の方法で検出すればよい。
　抽出液中のFOXB1蛋白質を検出する方法としては、例えばFOXB1蛋白質に対して親和性を有する物質（例えば抗体等）を用いた、いわゆる酵素免疫測定法（EIA）、放射免疫測定法（RIA）、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、蛍光免疫測定法（FIA）、ウエスタンブロット、免疫組織化学法、抗体アレイ法、簡易イムノクロマトグラフィーによる測定法、等の自体公知の免疫学的測定法に準じた方法、及びこれらと高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、電気泳動、キャピラリー電気泳動、キャピラリーチップ電気泳動等を組み合わせた方法等が挙げられる。その測定原理としては、例えばサンドイッチ法、競合法、二抗体法等が挙げられるが、これに限定されない。これらの測定法の具体的な条件は、当業者が適宜設定し得る。
　また、例えば、免疫比ろう法、免疫比濁法等の免疫凝集法に準じた測定法で、FOXB1蛋白質を検出してもよい。これらの検出法も、自体公知の方法に準じて行えばよい。
　上記１）及び２）の方法において、FOXB1蛋白質を検出するために用いられる抗FOXB1蛋白質抗体（以下、「抗FOXB1抗体」と記載する。）は、FOXB1蛋白質やその部分ペプチド、又はそれらの塩を認識し得る抗体が挙げられる。
　また、抗体の種類は特に限定されない。例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよく、これらを単独であるいはこれらを適宜組み合わせて用いる等は任意である。また、これら抗体は、要すればペプシン，パパイン等の酵素を用いて消化してF（ab'）2、Fab'、或はFabとして使用してもよい。更に、FOXB1蛋白質に対する市販の抗体を用いることもできる。
　抗FOXB1抗体の具体例としては、例えば「配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対する抗体」や「配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対する抗体」等が挙げられる。
　抗FOXB1抗体は、標識物質で標識されていてもよい。抗FOXB1抗体を標識するために用いられる標識物質としては、抗体を標識する際に用いられる通常の標識物質であればよい。例えばEIA(ELISA)に於いて用いられるアルカリホスファターゼ，β-ガラクトシダーゼ，パーオキシダーゼ，マイクロペルオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース-6-リン酸脱水素酵素，アセチルコリンエステラーゼ，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、例えばRIAで用いられる99mＴc，131Ｉ，125Ｉ，14Ｃ，3Ｈ等の放射性同位元素、例えばＦＩＡで用いられるフルオレセイン，ダンシル，フルオレスカミン，クマリン，ナフチルアミン或はこれらの誘導体等の蛍光性物質、例えばルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス(2,4,6-トリフロロフェニル)オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール，ナフトール，アントラセン或はこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル，3-アミノ-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキシル，2,6-ジ-t-ブチル-α-(3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソ-2,5-シクロヘキサジエン-1-イリデン)-p-トリルオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられる。
　抗FOXB1抗体をこれら標識物質で標識する方法としては、通常行われている抗体の標識方法が挙げられ、使用する標識物質ごとに適宜方法を選択すればよい。
　標識物質に由来する標識（シグナル）を測定する方法は、標識物質の種類により異なる。標識物質が有している性質に応じた常法により、測定すればよい。
　上記したFOXB1蛋白質を検出するために用いられる、試薬及びその検出時の濃度、検出を実施するに際しての測定条件等（反応温度、反応時間、反応時のｐＨ，測定波長、測定装置等）は、すべて自体公知の上記した如き免疫学的測定法の測定操作法に準じて設定すれば良く、使用する自動分析装置、分光光度計等も通常この分野で使用されているものは何れも例外なく使用し得る。
＜Ｉ－２．細胞の分化状態の判定方法＞
　上記の方法により被検細胞のFOXB1遺伝子の発現を検出し、得られた結果に基づいて、以下の方法により、被検細胞の分化状態を判定する。
　本発明において「分化した／された」又は「分化した状態」とは、細胞が「分化の初期段階」の状態、「将来分化する分化能を獲得した（分化誘導された）」状態、及び「分化した」状態のいずれかの状態にある場合を含む。
　好ましくは、本発明において「分化した／された」又は「分化した状態」とは、細胞が「分化の初期段階」の状態又は「将来分化する分化能を獲得した（分化誘導された）」状態のいずれかの状態にある場合である。
　本発明において「分化の初期段階」とは、分化誘導処理後の早期、具体的には分化誘導処理を行ってから７日目まで、好ましくは６日目まで、より好ましくは３～５日目まで、の時期をいう。
　又は、本発明において「分化の初期段階」とは、幹細胞が三胚葉のいずれかに分化する前の段階、及び分化誘導処理後であって、未分化マーカー（例えばOCT3/4、NANOG、SOX2等）の発現が消失する前の段階、を包含する。
　本発明の分化状態の判定方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
（１）FOXB1 mRNAの発現を検出した結果に基づいて判定する方法
　FOXB1 mRNAを検出した結果に基づいて判定する方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
　１）上記の方法で被検細胞のFOXB1 mRNAの検出を行って、FOXB1 mRNAが検出された場合に、その被検細胞は分化した状態である（「その細胞群の中に分化した状態の細胞が存在する」場合を含む。以下同じ。）、と判定される。
　２）上記の方法で被検細胞のFOXB1 mRNAの検出を行うと共に、比較として未分化状態であることが確認された幹細胞を用いて同様にFOXB1 mRNAの検出を行う。そして、被検細胞のFOXB1 mRNAの検出量が、比較対象の幹細胞のFOXB1 mRNAの検出量より多い場合に、その被検細胞は分化した状態である、と判定される。この時、被検細胞のFOXB1 mRNAの検出量が比較対象の幹細胞のFOXB1 mRNAの検出量と比較して多いかどうかについては、両者を比較して相対的に判断すればよい。
　例えば、公知のΔΔCt法（比較Ct法）で、比較対象の幹細胞のFOXB1 mRNAの発現量(検出量)に対する被検細胞のFOXB1 mRNAの発現量（検出量）の相対値を求め、その相対値をもとに、上記の判定を行えばよい。
　３）未分化状態であることが確認された幹細胞のFOXB1 mRNA量をあらかじめ測定する。そして、被検細胞のFOXB1 mRNAの検出量が、あらかじめ測定された幹細胞のFOXB1 mRNAの検出量より多い場合に、その被検細胞は分化した状態である、と判定される。
　４）被検細胞が分化した状態か否かを判断し得るFOXB1 mRNA量の境界値（カットオフ値）をあらかじめ設定する。そして、被検細胞のFOXB1 mRNA検出量が当該境界値より高いかどうかで被検細胞の分化状態を判定する。この場合、被検細胞のFOXB1 mRNAの検出量がカットオフ値よりも高い場合に、その被検細胞は分化した状態である、と判定される。
　上記の方法において、FOXB1 mRNA及び被検細胞等のFOXB1 mRNAの検出方法の具体例は、上記した通りである。
（２）FOXB1蛋白質を検出した結果に基づいて判定する方法
　FOXB1蛋白質を検出した結果に基づいて判定する方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
　１）上記の方法で被検細胞のFOXB1蛋白質の検出を行って、FOXB1蛋白質が検出された場合に、その細胞が分化した状態である（「その細胞群の中に分化した状態の細胞が存在する」場合を含む。以下同じ。）、と判定される。
　２）上記の方法で被検細胞のFOXB1蛋白質の検出を行うと共に、比較として未分化状態であることが確認された幹細胞を用いて同様にFOXB1蛋白質の検出を行う。そして、被検細胞のFOXB1蛋白質の検出量が、比較対象の幹細胞のFOXB1蛋白質の検出量より多い場合に、その被検細胞は分化した状態である、と判定される。この時、被検細胞のFOXB1蛋白質の検出量が比較対象の幹細胞のFOXB1蛋白質の検出量と比較して多いかどうかについては、両者を比較して相対的に判断すればよい。
　３）未分化状態であることが確認された幹細胞のFOXB1蛋白質量をあらかじめ測定する。そして、被検細胞のFOXB1蛋白質の検出量が、あらかじめ測定された幹細胞のFOXB1蛋白質の検出量より多い場合に、その被検細胞は分化した状態である、と判定される。
　４）被検細胞が分化した状態か否かを判断し得るFOXB1蛋白質量の境界値（カットオフ値）をあらかじめ設定する。そして、被検細胞のFOXB1蛋白質検出量が当該境界値より高いかどうかで被検細胞の分化状態を判定する。この場合、被検細胞のFOXB1蛋白質の検出量がカットオフ値よりも高い場合に、その被検細胞は分化した状態である、と判定される。
　上記の方法において、FOXB1蛋白質及び被検細胞等のFOXB1蛋白質の検出方法の具体例は、上記した通りである。
　本発明の判定方法の具体例として、分化誘導処理した幹細胞の分化状態を判定する方法を例に取り、以下に説明する。
　iPS細胞又はES細胞等の幹細胞（被検細胞）を、公知の方法で分化誘導処理する。次いで分化誘導処理後上限は７日以内、好ましくは６日以内、より好ましくは５日以内、下限は１日以上、好ましくは２日以上、更に好ましくは３日以上培養した後に細胞を採取して、上記の方法でFOXB1遺伝子の発現（FOXB1 mRNA又はFOXB1蛋白質の発現）を検出する。次いで、細胞の分化状態は以下１）～４）のいずれかの方法で判定することが出来る。
　１）FOXB1遺伝子の発現が確認された場合（FOXB1 mRNA又はFOXB1蛋白質が検出された場合）に、その細胞は分化した状態である（「その細胞群の中に分化した状態の細胞が存在する」場合を含む。以下同じ。）と判定される。
　２）比較として未分化状態であることが確認された幹細胞を用いて同様にFOXB1遺伝子発現量の検出を行う。そして、被検細胞のFOXB1遺伝子の発現量（FOXB1 mRNA又はFOXB1蛋白質の検出量）が、比較対象の幹細胞のFOXB1遺伝子の発現量より多い場合に、その被検細胞は分化した状態である、と判定される。
　３）あらかじめ測定された、未分化状態であることが確認された未分化幹細胞のFOXB1遺伝子の発現量（FOXB1 mRNA又はFOXB1蛋白質の検出量）と、被検細胞のFOXB1遺伝子の発現量とを比較する。被検細胞のFOXB1遺伝子の発現量（FOXB1 mRNA又はFOXB1蛋白質の検出量）が比較対象の幹細胞のFOXB1遺伝子の発現量と比較して多い場合に、その被検細胞は分化した状態である、と判定される。
　４）被検細胞が分化した状態であるか否かを判断し得る、FOXB1遺伝子発現量の境界値（カットオフ値）をあらかじめ設定しておく。被検細胞のFOXB1遺伝子の発現量（FOXB1 mRNA又はFOXB1蛋白質の検出量）が当該境界値より高い場合に、その被検細胞は分化した状態である、と判定される。
　その他、分化誘導処理を行っていない幹細胞について、本発明の分化状態の判定方法を実施すれば、その幹細胞が未分化状態を維持しているか否かを確認することもできる。すなわち、分化誘導処理を行っていない幹細胞について、例えば上記１）～４）のいずれかの方法で、FOXB1遺伝子の発現（FOXB1 mRNA又はFOXB1蛋白質の発現）を検出する。そして、FOXB1遺伝子の発現が確認されなかった場合、又はFOXB1遺伝子の発現量が上記２）～４）の方法における比較対象の量よりも低かった場合に、その細胞又はその細胞群の細胞は、未分化状態を維持している、と判定される。
（３）本発明の応用
　本発明の判定方法は、更に以下の方法に応用することができる。
１）細胞のスクリーニング方法への応用
　ある細胞群を含有する試料に対して、本発明の方法により細胞群を構成する細胞のFOXB1 mRNAを検出する。FOXB1 mRNAが検出された場合にはその試料に分化した状態の細胞（「分化した状態」の意味は前記した通り。以下同じ。）が存在すると判定される。FOXB1 mRNAが検出されない場合にはその試料に分化した状態の細胞が存在しないと判定される。
　また、ある細胞群を含有する試料に対して、本発明の方法により細胞群を構成する細胞のFOXB1蛋白質を検出する。FOXB1蛋白質が検出された場合にはその試料に分化した状態の細胞が存在すると判定される。FOXB1蛋白質が検出されない場合にはその試料に分化した状態の細胞が存在しないと判定される。
２）幹細胞の品質管理への応用
　公知の分化誘導処理を施した幹細胞に対して、本発明の方法によりFOXB1遺伝子の発現を検出する（FOXB1 mRNA又はFOXB1蛋白質を検出する）ことにより、当該細胞が分化した状態にあるか、又は未分化の状態のままの幹細胞が混入している状態かを判定できる。そのため、本発明の方法は分化細胞の品質管理に応用することができる。
　また、公知の未分化状態を維持する処理を施した幹細胞に対して、本発明の方法によりFOXB1遺伝子の発現を検出する（FOXB1 mRNA又はFOXB1蛋白質を検出する）ことにより、当該細胞が未分化状態を維持しているかを確認できる。そのため、本発明の方法は幹細胞の品質管理に応用することができる。
３）培地の品質検査方法への応用
　幹細胞を、その未分化状態を維持したまま培養するためには、その培地が、例えば分化誘導因子を含まず、未分化細胞の未分化状態を維持したまま培養できる培地である必要がある。本発明の分化状態の判定方法を用いれば、そのような培地の品質検査を行うことができる。
　例えば、幹細胞を判定対象の培地中で数日間、例えば３～７日程度、通常は５～６日程度培養した後、細胞のFOXB1 mRNAの発現を検出する。FOXB1 mRNAが検出されなかった場合に、当該培地が細胞の未分化状態を維持しながら培養できる培地であると判定される。又は培養後の当該細胞中のFOXB1蛋白質の発現を検出し、FOXB1蛋白質が検出されなかった場合に、当該培地が細胞の未分化状態を維持しながら培養できる培地であると判定される。
４）分化細胞の調製・単離方法への応用
　本発明の方法を応用して、分化細胞を調製・単離することができる。
　例えば、上記の「(２)FOXB1蛋白質の発現を検出する方法」に記載した「１）細胞を破壊しないで検出する方法」で、標識物質で標識した抗FOXB1蛋白質抗体を、分化した状態の細胞を含むか又は含むと予想される細胞と反応させた後、蛍光標識された細胞のみをフローサイトメトリーなどの方法により分離、精製すれば、分化した状態の細胞を調製・単離することができる。
　更に、上記と同様の方法で、蛍光標識されていない細胞のみをフローサイトメトリーなどの方法により分離、精製すれば、未分化幹細胞を調製・単離することができる。
５）分化誘導因子のスクリーニング方法への応用
　本発明を、ある物質が幹細胞の分化誘導能を有するか確認する方法に応用することができる。
　幹細胞を被検物質で処理する方法はその被検物質毎に異なるので、それぞれの被検物質に対応した方法で幹細胞を処理した後、本発明の分化状態の判定方法を実施すればよい。
　例えば、幹細胞を、被検物質を含有する培地中で数日間、例えば３～７日、通常は５～６日程度培養した後、培養細胞のFOXB1 mRNAの発現を検出する。そして、FOXB1 mRNAが検出された場合に、被検物質は幹細胞の分化を誘導する物質であることが確認される。又は当該培養細胞中のFOXB1蛋白質の発現を検出する。そして、FOXB1蛋白質が検出された場合に、被検物質は幹細胞の分化を誘導する物質であることが確認される。
＜ＩI．本発明の分化マーカー＞
　本発明の分化マーカーとしては、「FOXB1遺伝子由来のmRNA又は蛋白質から選択される、分化マーカー。」が挙げられる。具体的には、本発明の分化マーカーは、細胞の分化マーカーである。細胞（被検細胞）の具体例は上記した通りである。
　「FOXB1遺伝子由来のmRNA又は蛋白質」としては、上記した本発明に係るFOXB1 mRNA及びFOXB1蛋白質が挙げられる。その具体例は、上記した通りである。
　より具体的には、例えば下記(i)～(vii)から選択される分化マーカーが挙げられる。
（i）配列番号１又は配列番号７で表される塩基配列を有するmRNA、
（ii）配列番号１又は配列番号７で表される塩基配列の、１～数個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個、更に好ましくは１～２個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換、又は付加された塩基配列を有するmRNA、
（iii）配列番号１又は配列番号７で表される塩基配列と、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有する塩基配列を有するmRNA、
（iv）配列番号２又は配列番号８で表されるアミノ酸配列をコードするmRNA、
（v）配列番号２又は配列番号８で表されるアミノ酸配列の１～数個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個、更に好ましくは１～２個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、又は付加されたアミノ酸配列をコードするmRNA、
（vi）配列番号２又は配列番号８で表されるアミノ酸配列と、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードするmRNA、
（vii）配列番号２又は配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（viii）配列番号２又は配列番号８で表されるアミノ酸配列の、１～数個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個、更に好ましくは１～２個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質、
（ix）配列番号２又は配列番号８で表されるアミノ酸配列と、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上、更により好ましくは９７％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質。
＜ＩＩＩ．本発明に係る分化状態判定用キット＞
　本発明に係る細胞の分化状態判定用キットとしては、FOXB1遺伝子の発現を検出する試薬を備えたキット、又はFOXB1遺伝子の発現量を測定する試薬を備えたキットが挙げられる。
　例えば、以下のものが挙げられる。
（ａ）FOXB1 mRNAの発現を検出するか又はその発現量を測定するために使用されるプライマー、又はそれらの標識物を備えたキット
（ｂ）FOXB1蛋白質の発現を検出するか又はその発現量を測定するために使用されるFOXB1蛋白質に対する抗体（FOXB1蛋白質を認識する抗体、好ましくはFOXB1蛋白質に特異的に結合する抗体）又は該抗体の標識物等を備えたキット
　上記キットを構成する構成試薬の好ましい態様及び具体例は上記した通りである。
　上記（ａ）のキットに含まれる「FOXB1 mRNAの発現を検出するか又はその発現量を測定するために使用されるプライマー」の例としては、例えば「配列番号１若しくは配列番号７で表される塩基配列又はその部分配列を検出するために用いられるプライマー」が挙げられる。
　上記（ａ）のキットに含まれる「配列番号１若しくは配列番号７で表される塩基配列又はその部分配列を検出するために用いられるプライマー」としては、例えば
(ａ－１)逆転写反応で得られたcDNAを鋳型としてPCRを行う際に用いられるプライマー対、又は
(ａ－２)逆転写反応に用いられる増幅プライマーと、逆転写反応で得られたcDNAを鋳型としてPCRを行う際に用いられるプライマー対の組合せ、
が挙げられる。
　（ａ－１）の「逆転写反応で得られたcDNAを鋳型としてPCRを行う際に用いられるプライマー対」を構成するプライマーは、必要に応じて少なくとも一方が標識物質で標識されていてもよい。
　該プライマー対の具体例としては、「配列番号５で表される塩基配列を有するプライマーと配列番号６で表される塩基配列を有するプライマーとのプライマー対」又は「配列番号１１で表される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２で表される塩基配列を有するプライマーとのプライマー対」が挙げられる。
　(ａ－２)の「逆転写反応に用いられる増幅プライマーと、逆転写反応で得られたcDNAを鋳型としてPCRを行う際に用いられるプライマー対の組合せ」の具体例としては、「配列番号４で表されるプライマーと、配列番号５で表される塩基配列を有するプライマーと配列番号６で表される塩基配列を有するプライマーとのプライマー対、との組合せ」又は「配列番号１０で表されるプライマーと、配列番号１１で表される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２で表される塩基配列を有するプライマーとのプライマー対、との組合せ」が挙げられる。これらのプライマーのいずれかが、標識物質で標識されていてもよい。
　上記（ａ）のキットには、更にRT-PCRに使用する逆転写酵素や、必要に応じて更に核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ等）、酵素に応じた基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰなど）、また二本鎖インターカレーター（SYBRTM Green、エチジウムブロマイドなど）あるいはFAMやTAMRA等の標識検出物質等を含んでいてもよい。
　また、上記(ａ－１)又は（ａ－２）を構成要件として含むキットには、例えば緩衝剤、安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害せず、PCRやハイブリダイゼーション反応を阻害しないものが含まれていてもよい。また、その濃度も、この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
　緩衝液の具体例を挙げると、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常のPCRやハイブリダイゼーション反応を実施する場合に用いられている緩衝液は全て挙げられる。そのpHも特に限定されないが、例えば5～9の範囲が挙げられる。
　上記（ｂ）のキットに含まれる「FOXB1蛋白質の発現を検出するか又はその発現量を測定するために使用されるFOXB1蛋白質に対する抗体」の具体例は上記した通りである。
　例えば「配列番号２又は配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対する抗体」が挙げられる。
　上記(ｂ)のキットに含まれる試薬中には、この分野で通常用いられる試薬類、例えば緩衝剤、増感剤、界面活性剤、防腐剤（例えばアジ化ナトリウム、サリチル酸、安息香酸等）、安定化剤（例えばアルブミン、グロブリン、水溶性ゼラチン、界面活性剤、糖類等）、賦活剤、共存物質の影響回避剤その他この分野で用いられているものであって、共存する試薬との安定性を阻害したり、抗原抗体反応を阻害しないものを有していてもよい。またこれら試薬類等の濃度範囲等も、自体公知の該測定方法において通常用いられる濃度範囲等を適宜選択して用いればよい。緩衝剤等の具体例、そのpH及び濃度は上記したキット（ａ）に関する説明に記載したものと同じである。
　また、本発明に係る細胞の分化状態判定用キットを構成する試薬等（例えばキット（ａ）に含まれる上記（ａ－１）、（ａ－２）、キット（ｂ）に含まれるFOXB1蛋白質に対する抗体等）は、適当な緩衝液中に懸濁させた懸濁液等の溶液状態のもの、又はこれを凍結した凍結品や凍結乾燥した凍結乾燥品であってもよい。この目的に用いられる緩衝剤等の具体例、そのpH及び濃度は上記した通りである。
　更にまた本発明のキットには、本発明に係る細胞のFOXB1遺伝子の発現（例えばFOXB1 mRNAの発現又はFOXB1蛋白質の発現）を検出する方法に使用するための説明書、又は本発明の細胞の分化状態を判定する方法を実施するための説明書等を含ませておいてもよい。当該「説明書」とは、当該方法における特徴・原理・操作手順、判定手順等が文章又は図表等により実質的に記載されている当該キットの取扱説明書、添付文書、あるいはパンフレット（リーフレット）等を意味する。
　以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１．
　ヒトiPS細胞をbFGF無添加培地で培養することにより分化誘導処理し、FOXB1 mRNA及び公知の分化マーカーの発現を、RT-qPCRにより検出した。
（１）幹細胞の培養と分化誘導処理
　hiPS細胞(201B7株、京都大学iPS 細胞研究所（iPSアカデミアジャパン(株）)を、bFGF添加（100ng/mL）又は無添加の培地（StemSure hPSC Medium、和光純薬工業（株）製）で3回継代培養し、培養6日目に細胞を回収した。
（２）Total RNA の抽出
　市販の核酸抽出試薬であるキットISOGEN（(株)ニッポンジーン製）を用い、現品説明書に従って、上記(１)で回収した細胞から、Total RNAを抽出した。
（３）DNase処理
　上記(２)で抽出したTotal RNAの１μgに、全量17μLになるように蒸留水を加え、10X Reaction Buffer（プロメガ(株)製）を2μL、RQ1 RNase-Free DNase（プロメガ(株)製）を1μL(1U)加え混合し、37℃、20分間インキュベートした。次いで、Stop Buffer(20mM EGTA、プロメガ(株)製）を1μL加え混合し、65℃、10分間インキュベートした。得られた反応物に結合Buffer（5.5Mグアニジン塩酸塩 (和光純薬工業(株)製)、20mM Tris-HCl pH6.6）を100μL加え混合した後、エコノスピン（核酸精製用シリカメンブレンスピンカラム、(株)ジーンデザイン製）に移し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。次いで、洗浄Buffer（2mM Tris-HCl pH7.5 ((株)ニッポンジーン製)、80% エタノール (和光純薬工業(株)製)）を500μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。更に12000×g、室温、1分間遠心分離した後、チューブを新しいチューブに交換した。溶出Buffer（10mMTris-HCl pH8.0、(株)ニッポンジーン製）を50μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離してTotal RNAを回収した。その後、エタノール沈殿を行い、得られた沈殿物を蒸留水9.5μLに溶解した。
（４）逆転写反応
　上記(３)でDNase処理したTotal RNA 9.5μＬに、下記の各mRNAを標的とする増幅プライマーを含む混合Primer（各５μM）1μLを加えた。下記プライマーは、すべてシグマアルドリッチ社製である。
・FOXB1 mRNAの増幅プライマー、CTGTAGTCGCCACTCGCCAT（配列番号４、GenBank Accession No. NM_012182 : 1176-1195（GenBank Accession No. NM_012182の塩基配列の1176-1195番目の塩基配列に相補的な塩基配列である。以下同様。）、
・FOXA1 mRNAの増幅プライマー、CAGCCGTTCTCGAACATGTTG（配列番号１３、GenBank Accession No. NM_004496 : 901-921）
・FOXA2 mRNAの増幅プライマー、CAACATGTTCGAGAACGGCTG（配列番号１４、GenBank Accession No. NM_021784 : 923-934）
・FOXA3 mRNAの増幅プライマー、CTCCAGCTTGAAGCGTTTCTG（配列番号１５、GenBank Accession No. NM_004497 : 825-845）
・OCT3/4 mRNAの増幅プライマー、CTCACTCGGTTCTCGATACTG（配列番号１６、GenBank Accession No. NM_002701 :  778-798）、
・NANOG mRNAの増幅プライマー、CTTCAGGTTGCATGTTCATGG（配列番号１７、GenBank Accession No. NM_024865 : 1109-1129）
・FGF5 mRNAの増幅プライマー、GGTTTCTCACAAGGCCAAGAG（配列番号１８、GenBank Accession No. NM_004464 : 1050-1070）
・GAPDH mRNAの増幅プライマー、GCTGTAGCCAAATTCGTTGTC（配列番号１９、GenBank Accession No. NM_002046 : 1131-1151）
（GAPDH：グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）
　得られた混合物を、72℃、3分間インキュベートした後、直ちに氷冷した。次いで、5×Buffer（東洋紡(株)製）4μL、2.5mM dNTPs（(株)ニッポンジーン製）4μL、RNase Inhibitor, super（和光純薬工業(株)製）0.5μL(20U)、ReverTra AceＴＭ（RTase、逆転写酵素、東洋紡(株)製）1μL(100U)を加え混合し、42℃、50分間インキュベートした。得られた反応物に結合Buffer（5.5Mグアニジン塩酸塩(和光純薬工業(株)製)、20mM Tris-HCl pH6.6 (和光純薬工業(株)製)）を100μL加え混合した後、エコノスピン（核酸精製用シリカメンブレンスピンカラム、(株)ジーンデザイン製）に移し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。次いで、洗浄Buffer（2mM Tris-HCl pH7.5 ((株)ニッポンジーン製)、80%エタノール (和光純薬工業(株)製)）を500μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。更に12000×g、室温、1分間遠心分離した後、チューブを新しいチューブに交換した。溶出Buffer（10mMTris-HCl pH8.5、(株)ニッポンジーン製）を25μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離した。得られた沈殿物を蒸留水 １μLに溶解させてcDNAを回収した。
　なお、本実験系にゲノムDNAが混在していないことを確認するために、同じ試料を用い、ReverTra AceＴＭを加えない以外は上記と同様の反応を行った。
（５）qPCR反応
　上記(４)で得られたcDNA 1μLと、蒸留水7μL、KOD SYBR qPCR Mix（東洋紡）10μL、各フォワードプライマー（2μM）1μL、各リバースプライマー（2μM）1μLを混合した。
　使用した各プライマーの塩基配列は、以下の通りである。下記プライマーは、すべてシグマアルドリッチ社製である。
FOXB1 cDNA、GenBank Accession No. NM_012182 : 986-1007、1082-1102
フォワードプライマー: CTTCGCCATCGAGAACATCATC（配列番号５）
リバースプライマー: CCCATGGTAGTCAACTGGTTG（配列番号６）
増幅鎖長 : 117bp
※配列番号５のフォワードプライマーと配列番号６のリバースプライマーは、それぞれFOXB1 cDNA、GenBank Accession No. NM_012182の986-1007番目の塩基配列及び、1082-1102番目の塩基配列をもとに設計された。以下同様。
　よって、このプライマーペアを用いた核酸増幅反応により、FOXB1遺伝子（配列番号１で表される塩基配列）の986～1102番目の、117bpの領域（配列番号３）（GenBank Accession No. NM_012182のposition 986-1102）が増幅される。
FOXA1 cDNA、GenBank Accession No. NM_004496 : 725-745、811-832
フォワードプライマー: CTGAGCGAGATCTACCAGTGG（配列番号２０）
リバースプライマー: GAAGCAGTCATTGAAGGACAGC（配列番号２１）
増幅鎖長 : 108bp
FOXA2 cDNA、GenBank Accession No. NM_021784 : 762-782、842-863
フォワードプライマー: CAGTGGATCATGGACCTCTTC（配列番号２２）
リバースプライマー: CACCTTCAGGAAACAGTCGTTG（配列番号２３）
増幅鎖長 : 102bp
FOXA3 cDNA、GenBank Accession No. NM_004497 : 605-626、696-716
フォワードプライマー: GATGCTGACCTTGAGTGAAATC（配列番号２４）
リバースプライマー: GTCGTTGAAAGACAGCGAGTG（配列番号２５）
増幅鎖長 : 128bp
OCT3/4 cDNA、GenBank Accession No. NM_002701 : 631-651、722-743
フォワードプライマー: CTTTGAGGCTCTGCAGCTTAG（配列番号２６）
リバースプライマー: CTGCTTTGCATATCTCCTGAAG（配列番号２７）
増幅鎖長 : 113bp
NANOG cDNA、GenBank Accession No. NM_024865 : 870-891、972-992
フォワードプライマー: CAACCACTCCTGGAACACTCAG（配列番号２８）
リバースプライマー: GAATTTGGCTGGAACTGCATG（配列番号２９）
増幅鎖長 : 123bp
FGF5 cDNA、GenBank Accession No. NM_004464 : 906-927、1020-1040
フォワードプライマー: CAACCACTCCTGGAACACTCAG（配列番号３０）
リバースプライマー: GAATTTGGCTGGAACTGCATG（配列番号３１）
増幅鎖長 : 135bp
GAPDH cDNA、GenBank Accession No. NM_002046 : 1013-1034、1106-1127
フォワードプライマー: CTACACTGAGCACCAGGTGGTC（配列番号３２）
リバースプライマー: CCAGGAAATGAGCTTGACAAAG（配列番号３３）
増幅鎖長 : 115bp
　得られた混合物をCFX96 Touch リアルタイム PCR 解析システム（Bio-Rad Laboratories, Inc.）にセットし98℃ 2分間、98℃ 10秒間→58℃ 10秒間→68℃ 30秒間を40サイクル行った。
　データの解析はCFX マネージャーソフトウェア（Bio-Rad Laboratories, Inc.）を用い、得られた各々のCt値をGAPDHのCt値で補正した。各分化マーカーの発現量は、ΔΔCt値による相対値（bFGF添加培地（bFGF(+)培地）で６日間培養した細胞の各マーカーのCt値を「１」とし、その値に対する、bFGF無添加培地（bFGF(-)培地）で６日間培養した細胞の同マーカーのCt値の相対値）を求めることにより得た。
（６）結果
　結果を図１に示す。図１において、bFGF(+)培地で６日間培養した細胞の各マーカーのCt値を「１」とした（カラム■で示す。）。そして、その値に対する、bFGF(-)培地で６日間培養した細胞の、同じマーカーのCt値の相対値を各マーカーの発現量とし、図１にカラム□で示す。また、それぞれの相対値を、図１の各カラムの上部に記載した。
　図１の結果から明らかな通り、細胞の未分化マーカーであるNANOG mRNAの場合、bFGF(-)培地で培養6日目の発現量（□）は、bFGF(+)培地培養で６日目の発現量（■）よりも低かった。このことから、bFGF(-)培地で培養6日目のhiPS細胞は、細胞分化が進行している状態であることが確認できた。
　細胞の未分化マーカーであるOCT3/4 mRNA、細胞の初期分化マーカーであるFOXA1 mRNA，FOXA2 mRNA，及びFOXA3 mRNAの場合、bFGF(+)培地で培養６日目の発現量（■）とbFGF(-)培地で培養6日目の発現量（□）との間には、大きな違いはなかった。
　FGF5は、今回の検討では検出限界以下であったため、図１には示していない。
　一方、本発明の分化マーカーであるFOXB1 mRNAの場合、bFGF(-)培地で培養6日目の発現量（□）は、bFGF(+の培地で培養６日目の発現量（■）と比較して27.5倍に増加したことが確認された。
　以上のことから、FOXB1 mRNAが細胞の分化マーカーとして有用であり、FOXB1 mRNAを検出することで、細胞の分化状態を判定することができることが明らかになった。
　また、FOXB1 mRNAは、OCT3/4 mRNA、FOXA1 mRNA，FOXA2 mRNA，FOXA3 mRNA等の公知のマーカーの発現がまだ変化していないような、分化の初期段階で細胞の分化状態を判定できることが分かった。
　また、FGF5は、公知の分化マーカーの中では最も分化初期の段階で発現が高くなることが知られていた。しかし図１の結果から、FOXB1 mRNAは、FGF5がまだ発現していないような、更に分化の初期段階で細胞の分化状態を判定できることがわかった。
　更に、本発明の判定方法は、細胞の分化を分化誘導後の培養初期で判定できることから、細胞の早期スクリーニングや幹細胞の品質管理等に有用である。更に以上のことから、本発明の判定方法を実施することにより、培養期間の短縮、培地代の経費削減などの効果が期待できる。
実施例２．
　マウスES細胞をLIF無添加培地で培養することにより分化誘導処理し、Foxb1 mRNA及び公知の分化マーカーの発現を、RT-qPCRにより検出した。
（１）幹細胞の培養と分化誘導処理
　mES細胞(D3株、ATCC、b723512)を、LIF添加（1000Unit）又は無添加の培地（StemSure DMEM、StemSure Serum replacement、MEM非必須アミノ酸溶液、L-グルタミン溶液、StemSure 2-メルカプトエタノール溶液、和光純薬工業(株)製）で3回継代培養し、培養開始時、1日目、5日目に細胞を回収した。
（２）Total RNA の抽出
　市販の核酸抽出試薬であるキットISOGEN（(株)ニッポンジーン製）を用い、現品説明書に従って、上記(１)で回収した細胞から、Total RNAを抽出した。
（３）DNase処理
　上記(２)で抽出したTotal RNAの1μgに、全量17μLになるように蒸留水を加え、10X Reaction Buffer（プロメガ(株)製）を2μL、RQ1 RNase-Free DNase（プロメガ(株)製）を1μL(1U)加え混合し、37℃、20分間インキュベートした。次いで、Stop Buffer(20mM EGTA、プロメガ(株)製）を1μL加え混合し、65℃、10分間インキュベートした。得られた反応物に結合Buffer（5.5Mグアニジン塩酸塩 (和光純薬工業(株)製)、20mM Tris-HCl pH6.6）を100μL加え混合した後、エコノスピン（核酸精製用シリカメンブレンスピンカラム、(株)ジーンデザイン製）に移し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。次いで、洗浄Buffer（2mM Tris-HCl pH7.5、((株)ニッポンジーン製)、80% エタノール(和光純薬工業(株)製)）を500μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。更に12000×g、室温、1分間遠心分離した後、チューブを新しいチューブに交換した。溶出Buffer（10mMTris-HCl pH8.0、(株)ニッポンジーン製）を50μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離してTotal RNAを回収した。その後、エタノール沈殿を行い、得られた沈殿物を蒸留水9.5μLに溶解した。
（４）逆転写反応
　上記(３)でDNase処理したTotal RNA 9.5μLに、下記の各mRNAを標的とする増幅プライマーを含む混合Primer（各5μM）1μLを加えた。下記プライマーは、すべてシグマアルドリッチ社製である。
・Foxb1 mRNAの増幅プライマー、GTAGTCGCCACTAGTCATGGAG（配列番号１０、GenBank Accession No. NM_022378 : 1140-1161（GenBank Accession No. NM_022378の塩基配列の1140-1161番目の塩基配列に相補的な塩基配列である。以下同様。）、
・Oct3/4 mRNAの増幅プライマー、GTTCTTAAGGCTGAGCTGCAAG（配列番号３４、GenBank Accession No. NM_013633 : 614-635）
・Nanog mRNAの増幅プライマー、CTGGTAGAAGAATCAGGGCTGC（配列番号３５、GenBank Accession No. NM_028016 : 409-430）
・Sox2 mRNAの増幅プライマー、GTTCATGTAGGTCTGCGAGCTG（配列番号３６、GenBank Accession No. NM_011443 : 1060-1081）
・Rex1 mRNAの増幅プライマー、GTTCGGAAAACTCACCTCGTATG（配列番号３７、GenBank Accession No. NM_009556 : 636-658）
・Fgf5 mRNAの増幅プライマー、GGAGCCATTGACTTTGCCATC（配列番号３８、GenBank Accession No. NM_010203 : 538-558）
・Gapdh mRNAの増幅プライマー、CATACCAGGAAATGAGCTTGAC（配列番号３９、GenBank Accession No. NM_001289726 :1008-1029）
　得られた混合物を、72℃、3分間インキュベートした後、直ちに氷冷した。次いで、5×Buffer（東洋紡(株)製）4μL、2.5mM dNTPs（(株)ニッポンジーン製）4μL、RNase Inhibitor, super（和光純薬工業(株)製）0.5μL(20U)、ReverTra Ace（東洋紡(株)製）1μL(100U)を加え混合し、42℃、50分間インキュベートした。得られた反応物に結合Buffer（5.5Mグアニジン塩酸塩 (和光純薬工業(株)製)、20mM Tris-HCl pH6.6 (和光純薬工業(株)製)）を100μL加え混合した後、エコノスピン（核酸精製用シリカメンブレンスピンカラム、(株)ジーンデザイン製）に移し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。次いで、洗浄Buffer（2mM Tris-HCl pH7.5 ((株)ニッポンジーン製)、80%エタノール(和光純薬工業(株)製))を500μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。更に12000×g、室温、1分間遠心分離した後、チューブを新しいチューブに交換した。溶出Buffer（10mMTris-HCl pH8.5、(株)ニッポンジーン製）を25μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離した。得られた沈殿物を蒸留水１μLに溶解させてcDNAを回収した。
　なお、本実験系にゲノムDNAが混在していないことを確認するために、同じ試料を用い、ReverTra AceＴＭを加えない以外は上記と同様の反応を行った。
（５）qPCR反応
　上記(４)で得られた各cDNA 1μLと、蒸留水7μL、KOD SYBR qPCR Mix（東洋紡）10μL、各フォワードプライマー（2μM）1μL、各リバースプライマー（2μM）1μLを混合した。
　使用した各Primerの塩基配列は、以下の通りである。下記プライマーは、すべてシグマアルドリッチ社製である。
Foxb1 cDNA、GenBank Accession No. NM_022378: 954-976、1056-1078
Forward primer : CTTTGCTATCGAGAACATCATCG（配列番号１１）
Reverse primer : GAGAGCTGCCCATGGTAGTTAAC（配列番号１２）
増幅鎖長 : 125bp
※配列番号１１のForward primerと配列番号１２のReverse primerは、それぞれFoxb1 cDNA、GenBank Accession No. NM_022378の954-976番目の塩基配列及び、1056-1078番目の塩基配列をもとに設計された。以下同様。
　よって、このプライマーペアを用いた核酸増幅反応により、マウスFoxb1遺伝子（配列番号７で表される塩基配列）の954～1078番目の、125bpの領域（配列番号9
）（GenBank Accession No. NM_022378のposition 954-1078）が増幅される。
Oct3/4 cDNA、GenBank Accession No. NM_013633: 483-504、567-587
Forward primer : CTAGAACAGTTTGCCAAGCTGC（配列番号４０）
Reverse primer : GCTGAACACCTTTCCAAAGAG（配列番号４１）
増幅鎖長 : 105bp
Nanog cDNA、GenBank Accession No. NM_028016: 264-284、342-363
Forward primer : GAAGCATCGAATTCTGGGAAC（配列番号４２）
Reverse primer : CTGTGCAGAGCATCTCAGTAGC（配列番号４３）
増幅鎖長 : 100bp
Sox2 cDNA、GenBank Accession No. NM_011443: 937-958、1039-1059
Forward primer : CTACAGCATGATGCAGGAGCAG（配列番号４４）
Reverse primer : GTCATGGAGTTGTACTGCAGG（配列番号４５）
増幅鎖長 : 123bp
Rex1 cDNA、GenBank Accession No. NM_009556: 520-541、613-633
Forward primer : CCAGTCCAGAATACCAGAGTGG（配列番号４６）
Reverse primer : GCACTCTAGGTATCCGTCAGG（配列番号４７）
増幅鎖長 : 114bp
Fgf5 cDNA、GenBank Accession No. NM_010203: 366-386、448-468
Forward primer : CAGAAGTAGCGCGACGTTTTC（配列番号４８）
Reverse primer : GCTCCACTGGAAACTGCTATG（配列番号４９）
増幅鎖長 : 103bp
Gapdh cDNA、GenBank Accession No. NM_001289726 : 840-860、911-932
Forward primer : CCTGCCAAGTATGATGACATC（配列番号５０）
Reverse primer : GACAACCTGGTCCTCAGTGTAG（配列番号５１）
増幅鎖長 : 93bp
　得られた混合物をCFX96 Touch リアルタイム PCR 解析システム（Bio-Rad Laboratories, Inc.）にセットし、98℃ 2分間、98℃ 10秒間→58℃ 10秒間→68℃ 30秒間を40サイクル行った。
　データの解析はCFX マネージャーソフトウェア（Bio-Rad Laboratories, Inc.）を用い、得られた各々のCtの値をGapdhのCt値で補正した。各分化マーカーの発現量は、ΔΔCt値による相対値（bFGF添加培地（bFGF(+)培地）で所定日間培養した細胞の各マーカーのCt値を「１」とし、その値に対する、bFGF無添加培地（bFGF(-)培地）で同日間培養した細胞の同マーカーのCt値の相対値）を求めることにより得た。
（６）結果
　結果を図２に示す。図２において、(1)はFoxb1 mRNAの発現を検出した結果を、(2)はFgf5 mRNAの発現を検出した結果を、(3)はOct3/4 mRNAの発現を検出した結果を、(4)はNanog mRNAの発現を検出した結果を、(5)はSox2 mRNAの発現を検出した結果を、(6)はRex1 mRNAの発現を検出した結果を、それぞれ示す。
　図２において、LIF(+)培地で培養初日（mES(+)）の細胞の各マーカーのCt値、LIF(+)培地で１日間培養した細胞の各マーカーのCt値、及びLIF(+)培地で５日間培養した細胞の各マーカーのCt値をそれぞれ「１」とした。そして、その値に対する、LIF(-)培地で同日間培養した細胞の、同じマーカーのCt値の相対値を、各条件下での各マーカーの発現量として図２に示す。また、それぞれの場合の相対値を、図２の各カラムの上部に記載した。
　図２の結果から明らかな通り、細胞の未分化マーカーであるOct3/4 mRNA（図２(３)）、Nanog mRNA（図２(４)）、Sox2 mRNA（図２(５)）及びRex1 mRNA（図２(６)）の場合、LIF(-)培地で培養5日目（mES Day5(-)）までは発現量が低下していた。このことから、ES細胞をLIF(-)培地で培養することにより分化が進行していることが確認された。しかし、LIF(-)培地で培養５日では、まだこれらの未分化マーカーは発現していた。
　細胞の分化初期の分化マーカーであるFgf5 mRNAの場合（図２(２)）、LIF(-)培地で培養5日目（mES Day5(-)）には発現量が増加したが、増加の程度は培養初日の発現量（mES (+)）の約17倍程度であった。
　一方、本発明の分化マーカーであるFoxb1 mRNAの場合（図２(１)）、LIF(-)培地で培養5日目の発現量（mES Day5(-)）は、培養初日の発現量（mES (+)）と比較して、約90倍に増加した。
　以上の結果から明らかな通り、Foxb1 mRNAの発現は、現在分化マーカーとして最も有望であるとされるFgf5 mRNAと同程度の早期に検出されたが、発現量の上昇はFgf5 mRNA より顕著であった。
　以上のことから、Foxb1 mRNAが細胞の分化マーカーとして有用であること、及びFoxb1 mRNAを検出することで、従来の未分化マーカーや分化マーカーを検出するよりも分化の初期段階で細胞の分化状態を判定できることがわかった。
　また、本発明の判定方法は、細胞の分化を分化誘導後の培養初期で判定できることから、細胞の早期スクリーニングや幹細胞の品質管理等に有用である。更に以上のことから、本発明の判定方法を実施することにより培養期間の短縮、培地代の経費削減などの効果が期待できる。
実験例１．ヒトFOXB1蛋白質の検出１
１）抗ヒトFOXB1蛋白質抗体固定化マイクロプレートの調製
　抗ヒトFOXB1蛋白質抗体の溶液（50ｍM MOPS緩衝液(pH7.0)）をELISA用マイクロプレート（Nunk社製）の各ウェルに分注後２４時間静置して、抗ヒトFOXB1蛋白質抗体を固定化したマイクロプレートを得る。
２）ペルオキシダーゼ標識抗ヒトFOXB1蛋白質抗体の調製
　上記１）で使用した抗ヒトFOXB1蛋白質抗体とはエピトープが異なる抗ヒトFOXB1蛋白質抗体を、常法によりペルオキシダーゼ標識する。
３）試料の調製
　分化誘導処理後３日目のhiPS細胞を回収し、ソニケーションによりhiPS細胞を破壊して、細胞のライセートを得る。得られたライセートを緩衝液に溶解させて試料とする。
４）測定
　上記３）で調製した試料を、上記１)で調製した抗ヒトFOXB1蛋白質抗体固定化マイクロプレートの各ウェルに添加し、３７℃で１時間程度反応させる。次いで各ウェルを緩衝液で回洗浄する。
　上記２）で調製したペルオキシダーゼ標識ヒト抗FOXB1蛋白質抗体をそれぞれ各ウェルに分注し、３７℃で１時間程度反応させる。各ウェルを緩衝液で、次いで蒸留水で洗浄し、ＴＭＢ（3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン）溶液(和光純薬工業(株)製)を各ウェルに50μLずつ添加し、25℃、30分間反応させる。その後、反応停止液（１Mりん酸溶液）を各ウェルに50μL ずつ添加して反応を停止させる。４５０nmにおける吸光度を、Vmax (モレキュラーデバイス社製) を用いて測定する。
　その結果、ヒトFOXB1蛋白質が検出された場合には、試料として用いたhiPS細胞は分化した状態であると判定される。又は、試料として用いたhiPS細胞の細胞群には、分化した状態の細胞が含まれると判定される。
実験例２．ヒトFOXB1蛋白質の検出２
１）試料の調製
　分化誘導処理後３日目のhiPS細胞を回収し、ソニケーションによりhiPS細胞を破壊して、細胞のライセートを得る。得られたライセートを緩衝液に溶解させて試料とする。
２）ペルオキシダーゼ標識抗ヒトFOXB1蛋白質抗体の調製
　抗ヒトFOXB1蛋白質抗体を常法によりペルオキシダーゼ標識する。
３）ウエスタンブロッティング
　上記１）で得られた試料をSuperSepTM(電気泳動用ゲル、和光純薬工業（株）,5-20%のグラジェントゲル)にアプライして、SDS-PAGE電気泳動（定電流25mA）を行う。次いで、泳動後の画分を、セミドライブロッティング法にてPVDFメンブレンに転写する。
　PBS-T(Phosphate Buffered Saline with TweenTM 20、pH 7.4)にブロックエース(DSファーマバイオメディカル（株）製)を溶解させてブロッキング液とする。このブロッキング液に上記転写後のPVDFメンブレンを浸漬させ、1時間室温にてブロッキング処理した後、PVDFメンブレンを洗浄し、ブロッキング液に浸漬させる。
　次いで、上記２）で得られたペルオキシダーゼ標識抗ヒトFOXB1蛋白質抗体をブロッキング液に加えて室温で1時間程度浸漬させる。PVDFメンブレンを洗浄し、ECLTM Prime Western Blotting Detection Reagent(ペルオキシダーゼの化学発光基質、GE Healthcare製)で発光させ、LAS4000(富士フイルム（株）製)を用い、露光時間10秒で検出する。
　その結果、ヒトFOXB1蛋白質が検出された場合には、試料として用いたhiPS細胞は分化した状態であると判定される。又は、試料として用いたhiPS細胞の細胞群には、分化した状態の細胞を含むと判定される。
　本発明によれば、幹細胞の分化状態を、分化の初期段階で判定することができる。また、本発明は、幹細胞の品質管理や分化細胞の調製・単離方法へ応用することができる。更に本発明は培養初期で分化した細胞を判定きることから、細胞の早期スクリーニングや幹細胞の品質管理に有用であり、培養期間の短縮、培地代の経費削減などが期待できる。

Claims (13)

  1. 被検細胞のFOXB1遺伝子の発現を検出し、その結果に基づいて判定を行う、細胞の分化状態の判定方法。
  2. FOXB1遺伝子の発現の検出を、FOXB1 mRNA又はFOXB1蛋白質を検出することにより行う、請求項１に記載の方法。
  3. FOXB1 mRNAが検出された場合に、その細胞が分化した状態であると判定する、請求項２に記載の方法。
  4. FOXB1 mRNAが下記から選択される、請求項２又は３に記載の方法：
    （１）配列番号１又は配列番号７で表される塩基配列を有するmRNA、
    （２）配列番号１又は配列番号７で表される塩基配列の、１～数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換、又は付加された塩基配列を有するmRNA、
    （３）配列番号１又は配列番号７で表される塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列を有するmRNA
    （４）配列番号２又は配列番号８で表されるアミノ酸配列をコードするmRNA、
    （５）配列番号２又は配列番号８で表されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、又は付加されたアミノ酸配列をコードするmRNA、又は
    （６）配列番号２又は配列番号８で表されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするmRNA。
  5. FOXB1 mRNAの検出をRT-PCR法により行う、請求項２～４のいずれかに記載の方法
  6. FOXB1蛋白質が検出された場合に、その細胞が分化した状態であると判定する、請求項２に記載の方法。
  7. FOXB1蛋白質が下記から選択される、請求項２又は６に記載の方法：
    （１）配列番号２又は配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
    （２）配列番号２又は配列番号８で表されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質、又は
    （３）配列番号２又は配列番号８で表されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質。
  8. 被検細胞がiPS細胞又はES細胞である、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. FOXB1遺伝子由来のmRNA又は蛋白質から選択される、分化マーカー。
  10. FOXB1遺伝子由来のmRNAが下記から選択される、請求項９に記載の分化マーカー：
    （１）配列番号１又は配列番号７で表される塩基配列を有するmRNA、
    （２）配列番号１又は配列番号７で表される塩基配列の、１～数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換、又は付加された塩基配列を有するmRNA、
    （３）配列番号１又は配列番号７で表される塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列を有するmRNA
    （４）配列番号２又は配列番号８で表されるアミノ酸配列をコードするmRNA、
    （５）配列番号２又は配列番号８で表されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、又は付加されたアミノ酸配列をコードするmRNA、又は
    （６）配列番号２又は配列番号８で表されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするmRNA。
  11. FOXB1遺伝子由来の蛋白質が下記から選択される、請求項９に記載の分化マーカー：
    （１）配列番号２又は配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
    （２）配列番号２又は配列番号８で表されるアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質、又は
    （３）配列番号２又は配列番号８で表されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質。
  12. 幹細胞の分化マーカーである、請求項９～１１のいずれかに記載の分化マーカー。
  13. 幹細胞がiPS細胞又はES細胞である、請求項１２に記載の分化マーカー。
PCT/JP2017/003130 2016-02-15 2017-01-30 細胞の分化状態の判定方法、及びこれに用いられる新規な分化マーカー WO2017141672A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016026197 2016-02-15
JP2016-026197 2016-02-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017141672A1 true WO2017141672A1 (ja) 2017-08-24

Family

ID=59625706

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/003130 WO2017141672A1 (ja) 2016-02-15 2017-01-30 細胞の分化状態の判定方法、及びこれに用いられる新規な分化マーカー

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2017141672A1 (ja)

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HOMO SAPIENS FORKHEAD BOX B1 (FOXB1), MRNA, 2017, Retrieved from the Internet <URL:https://www.ncbi.nlm.nib.gov/nuccore/105554436> *
MUS MUSCULUS FORKHEAD BOX B1 (FOXB1), MRNA, Retrieved from the Internet <URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuceore/NM_022378> *
SAUTER C.N. ET AL.: "Differentiation of murine embryonic stem cells induces progesterone receptor gene expression", EXPERIMENTAL CELL RESEARCH, vol. 311, 2005, pages 251 - 264, XP005166104, DOI: doi:10.1016/j.yexcr.2005.09.005 *
SIMANDI Z. ET AL.: "OCT4 Acts as an Integrator of Pluripotency and Signal-Induced Differentiation", MOLECULAR CELL, vol. 63, 18 August 2016 (2016-08-18), pages 647 - 661, XP029689718 *
TAPIA N. ET AL.: "Dissecting the role of distinct OCT4-SOX2 heterodimer configurations in pluripotency", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 5, no. 13533, 2015, pages 1 - 9, XP055602534 *
WURTELE H. ET AL.: "Genome-wide scanning of HoxB1 - associated loci in mouse ES cells using an open-ended Chromosome Conformation Capture methodology", CHROMOSOME RESEARCH, vol. 14, 2006, pages 477 - 495, XP019393026, DOI: doi:10.1007/s10577-006-1075-0 *
YAMAGUCHI YL. ET AL.: "Sall4 is essential for mouse primordial germ cell specification by suppressing somatic cell program genes", STEM CELLS, vol. 33, 2015, pages 289 - 300, XP055602538 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cuadros et al. Hepatitis A virus cellular receptor 1/kidney injury molecule-1 is a susceptibility gene for clear cell renal cell carcinoma and hepatitis A virus cellular receptor/kidney injury molecule-1 ectodomain shedding a predictive biomarker of tumour progression
Juusola et al. Multiplex mRNA profiling for the identification of body fluids
Steilmann et al. The interaction of modified histones with the bromodomain testis-specific (BRDT) gene and its mRNA level in sperm of fertile donors and subfertile men
AU2017201050A1 (en) Telomere length measurement in formalin-fixed, paraffin embedded (FFPE) samples by quantitative PCR
KR20130100906A (ko) 취약 ｘ 증후군 （ｆｘｓ） 치료에 유용한 예측용 마커
EP3277834B1 (en) Methods of capturing sperm nucleic acids
US9783853B2 (en) Recurrent gene fusions in cancer
CN108220428B (zh) 用于检测胃癌的组合物及其试剂盒和用途
US20120122087A1 (en) 5-Hydroxymethylcytosine as a biomarker for early detection, treatment and prognostic monitoring of cancer
WO2009089464A1 (en) Mutations in contaction associated protein 2 (cntnap2) are associated with increased risk for ideopathic autism
US20110229889A1 (en) DOPAMINERGIC NEURON PROLIFERATIVE PROGENITOR CELL MARKER Msx1/2
JP4926965B2 (ja) ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカーＮａｔｏ３
JP2021506298A (ja) 頭頸部癌を検出するための組成物および方法
Jiang et al. Histone modification in constitutive heterochromatin versus unexpressed euchromatin in human cells
KR101828812B1 (ko) 줄기세포의 세포노화 검출용 키트
JP6593335B2 (ja) 幹細胞の分化状態の判定方法及びこれに用いられる新規な分化マーカー
Abhyankar et al. Characterization of an Entamoeba histolytica high-mobility-group box protein induced during intestinal infection
WO2012115493A2 (ko) 암에 대한 바이오마커 및 이를 이용한 암 진단
WO2017141672A1 (ja) 細胞の分化状態の判定方法、及びこれに用いられる新規な分化マーカー
JP2010502192A5 (ja)
JP6220405B2 (ja) 染色されたＦＦＰＥＴ切片からマイクロダイセクションした材料のＲＴ−ｑＰＣＲ分析
Korfanty et al. SPEN protein expression and interactions with chromatin in mouse testicular cells
Zeleny et al. Sexing of beef—A survey of possible methods
Meng et al. A modified immunofluorescence in situ hybridization method to detect long non‑coding RNAs and proteins in frozen spinal cord sections
JP2006349658A (ja) 神経系癌幹細胞の検出試薬、神経系癌幹細胞を分離する方法、神経系癌幹細胞、及び神経芽腫の予後診断薬。

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17752935

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17752935

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP