JP6593335B2 - 幹細胞の分化状態の判定方法及びこれに用いられる新規な分化マーカー - Google Patents
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Description
(1)幹細胞のFOXB2遺伝子の発現を検出し、その結果に基づいて判定を行う、細胞の分化状態の判定方法。
(2)FOXB2遺伝子由来のmRNA又は蛋白質から選択される、分化マーカー。
・配列番号1で表される塩基配列(GenBank Accession No. NM_001013735)を有するmRNA
・配列番号1で表される塩基配列と70%、好ましくは80%、より好ましくは95%更により好ましくは97%以上の配列相同性を有する塩基配列を有するmRNA
・配列番号2で表されるアミノ酸配列をコードするmRNA
・配列番号2で表されるアミノ酸配列の1〜数個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、あるいは置換されたアミノ酸配列をコードするmRNA
・配列番号2で表されるアミノ酸配列と70%、好ましくは80%、より好ましくは95%、更により好ましくは97%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードするmRNA。
・配列番号34で表される塩基配列(GenBank Accession No. NM_008023)を有するmRNA
・配列番号34で表される塩基配列と70%、好ましくは80%、より好ましくは95%、更により好ましくは97%以上の配列相同性を有する塩基配列を有するmRNA
・配列番号35で表されるアミノ酸配列をコードするmRNA
・配列番号35で表されるアミノ酸配列の1〜数個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、あるいは置換されたアミノ酸配列をコードするmRNA
・配列番号2で表されるアミノ酸配列と70%、好ましくは80%、より好ましくは95%、更により好ましくは97%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードするmRNA
・配列番号2で表されるアミノ酸配列又はその1個若しくは数個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するもの
・配列番号2で表されるアミノ酸配列と70%、好ましくは80%、より好ましくは95%、更により好ましくは97%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するもの
・配列番号35で表されるアミノ酸配列又はその1個若しくは数個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するもの
・配列番号35で表されるアミノ酸配列と70%、好ましくは80%、より好ましくは95%、更により好ましくは97%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するもの
本発明の細胞の分化状態の判定方法は、「幹細胞のFOXB2遺伝子の発現を検出し、その結果に基づいて判定を行う、細胞の分化状態の判定方法。」である。
FOXB2遺伝子の発現を検出する方法としては、FOXB2 mRNAの発現を検出する方法、又はFOXB2蛋白質の発現を検出する方法が挙げられる。
FOXB2 mRNAの発現を検出する方法は、自体公知のmRNAを検出する方法であれば特に制限されず、公知の方法から適宜選択すればよい。
RT-PCR法とは、標的のFOXB2遺伝子(例えばFOXB2 mRNA)を鋳型とし、逆転写反応によりcDNAを合成後、PCRによるDNAの増幅を行う方法〔Kawasaki, E. S., et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc., SanDiego, 21-27 (1991)]である。逆転写反応及びDNAの増幅反応の条件は特に限定されるものではなく、適宜最適な条件を採用することができる。また、当該標的の遺伝子(例えばFOXB2 mRNA)の増幅領域は、必ずしも全長である必要はなく、増幅産物の確認に支障が無ければ、当該遺伝子の一部領域であってもよい。増幅されたcDNA量(mRNA量に相当する)は、例えば、上記DNA増幅反応液を電気泳動に供した後、目的増幅断片に特異的にハイブリダイズするプローブを用いることで検出すればよい。
ノーザンハイブリダイゼーション法よりFOXB2 mRNAを検出する方法としては、例えば、被検細胞から抽出・分離したmRNAを適当な担体に固定し、これとFOXB2 mRNAに相補的な塩基配列を有する標識プローブ(cDNAでもよい)とハイブリダイゼーションを行い、その程度を検出することにより、被検細胞のFOXB2 mRNAを検出する方法が挙げられる。ここで使用するプローブは、FOXB2 mRNAの塩基配列の相補配列の全部からなるものであっても、その一部の塩基配列からなるものであってもよい。また、この検出法に、該プローブを固定化したマイクロアレイ、DNAチップを用いることもできる。
1)細胞を破壊しないで検出する方法
FOXB2 蛋白質は転写因子であるので、細胞の核内に存在する。
また、細胞を破壊する以下の方法を行って、FOXB2蛋白質を検出することもできる。
上記の方法により幹細胞のFOXB2遺伝子の発現を検出して得られた結果に基づいて、被検細胞の分化状態を判定する。
(1)FOXB2 mRNAの発現を検出した結果に基づいて判定する方法
FOXB2 mRNAを検出した結果に基づいて判定する方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
1)上記方法により被検細胞のFOXB2 mRNAの検出を行って、FOXB2 mRNAが検出された場合に、その被検細胞は分化した状態である、と判定される。
FOXB2蛋白質を検出した結果に基づいて判定する方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
1)上記方法により被検細胞のFOXB2蛋白質の検出を行って、FOXB2蛋白質が検出された場合に、その細胞が分化した状態である、と判定される。
本発明の細胞の分化状態の判定方法は、更に以下の方法に応用することができる。
ある細胞群を含有する試料に対して、本発明の方法により細胞群を構成する細胞のFOXB2 mRNAを検出する。そして、FOXB2 mRNAが検出された場合にはその試料に分化した状態の細胞(「分化した状態」の意味は前記した通り。以下同じ。)が存在すると判定し、FOXB2 mRNAが検出されない場合にはその試料に分化した状態の細胞が存在しないと判定すればよい。又は、FOXB2蛋白質の発現を検出し、FOXB2蛋白質が検出された場合にはその試料に分化した状態の細胞が存在すると判定し、FOXB2蛋白質が検出されない場合にはその試料に分化した状態の細胞が存在しないと判定すればよい。
公知の分化誘導処理を施した幹細胞に対して本発明の方法によりFOXB2遺伝子の発現を検出する(FOXB2 mRNA又はFOXB2蛋白質を検出する)ことにより、当該細胞が分化した状態にあるか、又は未分化幹細胞が混入している状態かを判定できる。そのため、本発明の方法は分化細胞の品質管理に応用することができる。
未分化幹細胞を、その未分化状態を維持したまま培養するためには、その培地が、例えば分化誘導因子を含まず、未分化細胞の未分化状態を維持したまま培養できる培地である必要がある。本発明の分化状態の判定方法を用いれば、そのような培地の品質検査を行うことができる。
本発明の方法を応用して、分化細胞を調製・単離することができる。
更に、上記と同様の方法で、蛍光標識されていない細胞のみをフローサイトメトリーなどの方法により分離、製製すれば、未分化幹細胞を調製・単離することができる。
本発明を、ある物質が未分化幹細胞の分化誘導能を有するか確認する方法に応用することができる。
<II.本発明の分化マーカー>
(i)配列番号1若しくは配列番号34で表される塩基配列を有するmRNA
(ii)配列番号1若しくは配列番号34で表される塩基配列と70%、好ましくは80%、より好ましくは95%、更により好ましくは97%以上の配列相同性を有する塩基配列を有するmRNA
(iii)配列番号2若しくは配列番号35で表されるアミノ酸配列をコードするmRNA
(iv)配列番号2若しくは配列番号35で表されるアミノ酸配列の1〜数個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするmRNA
(v)配列番号2若しくは配列番号35で表されるアミノ酸配列と70%、好ましくは80%、より好ましくは95%、更により好ましくは97%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードするmRNA
(vi)配列番号2若しくは配列番号35で表されるアミノ酸配列又はその1個若しくは数個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質
(vii)配列番号2若しくは配列番号35で表されるアミノ酸配列と70%、好ましくは80%、より好ましくは95%、更により好ましくは97%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質
が挙げられる。
本発明に係る細胞の分化状態判定用キットとしては、FOXB2遺伝子の発現を検出する試薬を備えたキット、又はFOXB2遺伝子の発現量を測定する試薬を備えたキットが挙げられる。
(a)FOXB2 mRNAの発現を検出するか又はその発現量を測定するために使用されるプライマー、又はそれらの標識物を備えたキット
(b)FOXB2蛋白質の発現を検出するか又はその発現量を測定するために使用されるFOXB2蛋白質に対する抗体(FOXB2蛋白質を認識する抗体、好ましくはFOXB2蛋白質に特異的に結合する抗体)又は該抗体の標識物等を備えたキット
(a−1)逆転写反応で得られたcDNAを鋳型としてPCRを行う際に用いられるプライマー対、又は
(a−2)逆転写反応に用いられる増幅プライマーと、逆転写反応で得られたcDNAを鋳型としてPCRを行う際に用いられるプライマー対の組合せ、が挙げられる。
(a−1)のプライマー対の具体例としては、「配列番号9で表される塩基配列を有するプライマーと配列番号10で表される塩基配列を有するプライマーとのプライマー対」又は「配列番号45で表される塩基配列を有するプライマーと配列番号46で表される塩基配列を有するプライマーとのプライマー対」が挙げられる。
分化誘導処理したhiPS細胞の、FOXB2 mRNA及び公知の未分化マーカーの発現を、RT-PCR法により検出した。
(1)幹細胞の培養と分化誘導処理
hiPS細胞(201B7株、京都大学iPS 細胞研究所(iPSアカデミアジャパン株式会社))、及び比較として、分化した細胞であるHDF細胞(ヒト正常細胞由来繊維芽細胞、ロンザジャパン(株)製)を、bFGF添加(100ng/mL)又は無添加の培地(StemSure hPSC Medium、和光純薬工業(株)製)で3回継代培養し、培養5日目に細胞を回収した。
市販の核酸抽出試薬であるキットISOGEN(ニッポンジーン製)を用い、現品説明書に従って、上記(1)で回収した細胞から、Total RNAを抽出した。
上記(2)で抽出したTotal RNAの1μgに、全量17μLになるように蒸留水を加え、10X Reaction Buffer(プロメガ(株)製)を2μL、RQ1 RNase-Free DNase(プロメガ(株)製)を1μL(1U)を加え混合し、37℃、20分間インキュベートした。その後、Stop Buffer(20mM EGTA)(プロメガ(株)製)を1μL加え混合し、65℃、10分間インキュベートした。その後、反応物に結合Buffer(5.5Mグアニジン塩酸塩(和光純薬工業(株)製)、20mM Tris-HCl pH6.6)を100μL加え混合した後、エコノスピン(核酸精製用シリカメンブレンスピンカラム、(株)ジーンデザイン製)に移し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。次いで、チューブに洗浄Buffer(2mM Tris-HCl pH7.5((株)ニッポンジーン)、80% エタノール(和光純薬工業(株)製))を500μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。更に12000×g、室温、1分間遠心分離した後、エコノスピン(mRNAが結合している)を新しいチューブに交換し、溶出Buffer(10mMTris-HCl pH8.0)(ニッポンジーン(株)製)を50μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離してTotal RNAを回収した。その後、エタノール沈殿を行い、得られた沈殿物を蒸留水9.5μLに溶解した。
上記(3)でDNase処理したTotal RNA 9.5μLに、下記の各mRNAを標的とする増幅プライマーを含む混合Primer(各5μM)1μLを加えた。下記プライマーは、すべてシグマアルドリッチ社製である。
・OCT3/4 mRNAの増幅プライマー、GTTCTTGAAGCTAAGCTGCAG (配列番号5、GenBank Accession No. NM_002701 : 641-661)、
・NANOG mRNAの増幅プライマー、GTTCTGGAACCAGGTCTTCAC (配列番号6、GenBank Accession No. NM_024865 : 631-651)、
・SOX2 mRNAの増幅プライマー、GACCACACCATGAAGGCATTC (配列番号7、GenBank Accession No. NM_003106 : 572-592)、
・GAPDH mRNAの増幅プライマー、GTCTACATGGCAACTGTGAGG (配列番号8、GenBank Accession No. NM_002046 : 1303-1323)
(GAPDH:グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)
上記(4)で得られたcDNA 1μLと、蒸留水5μL、2×PCR Buffer for KOD FX Neo (東洋紡)12.5μL、2 mM dNTPs(東洋紡)4μL、KOD FX Neo(東洋紡)0.5μL(0.5U)、各フォワードプライマー(10μM)1μL、各リバースプライマー(10μM)1μLを混合した。
フォワードプライマー: CTACTCTTACATCTCGCTGACCG(配列番号9)
リバースプライマー: GAATCTTGATGAAGCAGTCGTTG(配列番号10)
増幅鎖長 : 179bp
※配列番号9のフォワードプライマーと配列番号10のリバースプライマーは、それぞれFOXB2 cDNA、GenBank Accession No. NM_001013735の45-67番目の塩基配列及び、201-223番目の塩基配列をもとに設計された。以下同じ。
フォワードプライマー: CTTGGAGACCTCTCAGCCTGAG(配列番号11)
リバースプライマー: CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG(配列番号12)
増幅鎖長 : 196bp
フォワードプライマー: CACCTATGCCTGTGATTTGTGG(配列番号13)
リバースプライマー: CATTGAGTACACACAGCTGGGTG(配列番号14)
増幅鎖長 : 267bp
フォワードプライマー: GTATCAGGAGTTGTCAAGGCAGAG(配列番号15)
リバースプライマー: CAGCTCCGTCTCCATCATGTTG(配列番号16)
増幅鎖長 : 434bp
フォワードプライマー: GTCACCAGGGCTGCTTTTAAC(配列番号17)
リバースプライマー: GGCATTGCTGATGATCTTGAG(配列番号18)
増幅鎖長 : 399bp
上記(5)で得られたPCR増幅産物5μLと、6×Loading Buffer Double Dye(ニッポンジーン(株)製)1μLとを混合し、これを1.5%アガロースゲルにて電気泳動した。染色はGelRed核酸ゲル染色液(和光純薬工業(株)製)にて行った。
結果を図1に併せて示す。
(1)幹細胞の培養と分化誘導処理
hiPS細胞(201B7株、京都大学iPS 細胞研究所(iPSアカデミアジャパン株式会社))をbFGF添加又は無添加の培地(StemSure hPSC Medium、和光純薬工業(株)製)で培養し、培養3日目、5日目、7日目に、細胞を回収した。
実施例1(2)と同様の方法で、上記(1)で回収した培養3日目、5日目、7日目の細胞から、それぞれTotal RNAを抽出した。
実施例1(3)と同様の方法で上記(2)で抽出したTotal RNA、及びHMSC-bm細胞のTOTAL RNAの1μgを、それぞれDNAase処理した。
上記(3)でDNase処理したTotal RNA 9.5μLに、下記のプライマーを含む混合Primer(各5μM)1μLを加えた。下記プライマーは、すべてシグマアルドリッチ社製である。
・OCT3/4 mRNAの増幅プライマー、GTTCTTGAAGCTAAGCTGCAG (配列番号5、GenBank Accession No. NM_002701 : 641-661)、
・NANOG mRNAの増幅プライマー、GTTCTGGAACCAGGTCTTCAC (配列番号6、GenBank Accession No. NM_024865 : 631-651)、
・SOX2 mRNAの増幅プライマー、GACCACACCATGAAGGCATTC (配列番号7、GenBank Accession No. NM_003106 : 572-592)、
・GAPDH mRNAの増幅プライマー、GTCTACATGGCAACTGTGAGG (配列番号8、GenBank Accession No. NM_002046 : 1303-1323)
上記(4)で得られたcDNA 1μL、蒸留水5μL、2×PCR Buffer for KOD FX Neo(東洋紡(株)製)12.5μL、2 mM dNTPs(東洋紡(株)製)4μL、KOD FX Neo(東洋紡(株)製)0.5μL(0.5U)、各Forward primer(10μM)1μL、各Reverse primer(10μM)1μLを混合した。
フォワードプライマー: CTACTCTTACATCTCGCTGACCG(配列番号9)
リバースプライマー: GAATCTTGATGAAGCAGTCGTTG(配列番号10)
増幅鎖長 : 179bp
フォワードプライマー: CTTGGAGACCTCTCAGCCTGAG(配列番号11)
リバースプライマー: CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG(配列番号12)
増幅鎖長 : 196bp
フォワードプライマー: CACCTATGCCTGTGATTTGTGG(配列番号13)
リバースプライマー: CATTGAGTACACACAGCTGGGTG(配列番号14)
増幅鎖長 : 267bp
フォワードプライマー: GTATCAGGAGTTGTCAAGGCAGAG(配列番号15)
リバースプライマー: CAGCTCCGTCTCCATCATGTTG(配列番号16)
増幅鎖長 : 434bp
フォワードプライマー: GTCACCAGGGCTGCTTTTAAC(配列番号17)
リバースプライマー: GGCATTGCTGATGATCTTGAG(配列番号18)
増幅鎖長 : 399bp
PCR増幅産物5μLと、6×Loading Buffer Double Dye(ニッポンジーン(株)製)1μLとを混合し、これを1.5%アガロースゲルにて電気泳動した。染色はGelRed核酸ゲル染色液(和光純薬工業(株)製)にて行った。
結果を図2に併せて示す。
(1)幹細胞の培養と分化誘導処理
hiPS細胞(201B7株、京都大学iPS 細胞研究所(iPSアカデミアジャパン株式会社))、及び比較として、分化した細胞であるHDF細胞(ヒト正常細胞由来繊維芽細胞、ロンザジャパン(株)製)を、bFGF添加(100ng/mL)又は無添加の培地(StemSure hPSC Medium、和光純薬工業(株)製)で3回継代培養し、培養6日目に細胞を回収した。
市販の核酸抽出試薬であるキットISOGEN((株)ニッポンジーン製)を用い、現品説明書に従って、上記(1)で回収した細胞から、Total RNAを抽出した。
実施例1(3)と同様の方法で、上記(2)で抽出したTotal RNAの1μgを、それぞれDNase処理した。
上記(3)でDNase処理したTotal RNA 9.5μLに、下記の各mRNAを標的とする増幅プライマーを含む混合Primer(各5μM)1μLを加えた。下記プライマーは、すべてシグマアルドリッチ社製である。
・FOXB2 mRNAの増幅プライマー、CAGAAGCTACCCTTGCCAG(配列番号4、GenBank Accession No. NM_001013735 : 242-260)
・OCT3/4 mRNAの増幅プライマー、GTTCTTGAAGCTAAGCTGCAG(配列番号5、GenBank Accession No. NM_002701 : 641-661)
・NANOG mRNAの増幅プライマー、GTTCTGGAACCAGGTCTTCAC(配列番号6、GenBank Accession No. NM_024865 : 631-651)
・SOX2 mRNAの増幅プライマー、GACCACACCATGAAGGCATTC(配列番号7、GenBank Accession No. NM_003106 : 572-592)
・FGF5 mRNAの増幅プライマー、 CTCCCTGAACTTGCAGTCATC(配列番号19、GenBank Accession No. NM_004464 : 709-729)
・CDX2 mRNAの増幅プライマー、CCTGAGGAGTCTAGCAGAGTC(配列番号20、GenBank Accession No. NM_001265 : 1359-1379)
・GATA4 mRNAの増幅プライマー、GATTACGCAGTGATTATGTCCC(配列番号21、GenBank Accession No. NM_001308094 : 1110-1131)
・GATA6 mRNAの増幅プライマー、CATCTTGACCCGAATACTTGAG(配列番号22、GenBank Accession No. NM_005257 : 1961-1982)
・SOX17 mRNAの増幅プライマー、CCCAGGAGTCTGAGGATTTCC(配列番号23、GenBank Accession No. NM_022454 : 1515-1535)
・GAPDH mRNAの増幅プライマー、GTCTACATGGCAACTGTGAGG(配列番号8、GenBank Accession No. NM_002046 : 1303-1323)
上記(4)で得られたcDNA 1μL、蒸留水5μL、2× PCR Buffer for KOD FX Neo(東洋紡(株)製)12.5μL、2 mM dNTPs(東洋紡(株)製)4μL、KOD FX Neo(東洋紡(株)製)0.5μL(0.5U)、各Forward primer(10μM)1μL、各Reverse primer(10μM)1μLを混合した。
Forward primer : CTACTCTTACATCTCGCTGACCG(配列番号9)
Reverse primer : GAATCTTGATGAAGCAGTCGTTG(配列番号10)
増幅鎖長 : 179bp
Forward primer : CTTGGAGACCTCTCAGCCTGAG(配列番号11)
Reverse primer : CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG(配列番号12)
増幅鎖長 : 196bp
Forward primer : CACCTATGCCTGTGATTTGTGG(配列番号13)
Reverse primer : CATTGAGTACACACAGCTGGGTG(配列番号14)
増幅鎖長 : 267bp
Forward primer : GTATCAGGAGTTGTCAAGGCAGAG(配列番号15)
Reverse primer : CAGCTCCGTCTCCATCATGTTG(配列番号16)
増幅鎖長 : 434bp
Forward primer : GCAGAGCAGTTTCCAGTGGAG(配列番号24)
Reverse primer : GTATTCCTACAATCCCCTGAGAC(配列番号25)
増幅鎖長 :176bp
Forward primer : CAAATATCGAGTGGTGTACACG(配列番号26)
Reverse primer : GACACTTCTCAGAGGACCTGG(配列番号27)
増幅鎖長 :274bp
Forward primer : CAGCTCCTTCAGGCAGTGAGAG(配列番号28)
Reverse primer : CGGGAGACGCATAGCCTTGTG(配列番号29)
増幅鎖長 :246bp
Forward primer : GCTTGTGGACTCTACATGAAAC(配列番号30)
Reverse primer : GCTGCAATCATCTGAGTTAGAAG(配列番号31)
増幅鎖長 :183bp
Forward primer : CGGAATTTGAACAGTATCTGC(配列番号32)
Reverse primer : GCTCCTCCAGGAAGTGTGTAAC(配列番号33)
増幅鎖長 :226bp
Forward primer : GTCACCAGGGCTGCTTTTAAC(配列番号17)
Reverse primer : GGCATTGCTGATGATCTTGAG(配列番号18)
増幅鎖長 : 399bp
上記(5)で得られたPCR増幅産物5μLと、6×Loading Buffer Double Dye((株)ニッポンジーン製)1μLとを混合し、これを1.5%アガロースゲルにて電気泳動した。染色はGelRed核酸ゲル染色液(和光純薬工業(株)製)にて行った。
結果を図3に併せて示す。
マウスES細胞をLIF無添加培地で培養して分化誘導処理し、FOXB2 mRNA及び公知の未分化マーカーの発現を、RT-PCR法により検出した。
mES細胞(D3株、ATCC、b723512)を、LIF添加(1000Unit)又は無添加の培地(StemSure DMEM、StemSure Serum replacement、MEM非必須アミノ酸溶液、L-グルタミン溶液、StemSure 2-メルカプトエタノール溶液、和光純薬工業(株)製)で3回継代培養し、培養3日目、5日目、7日目、に細胞を回収した。
市販の核酸抽出試薬であるキットISOGEN((株)ニッポンジーン製)を用い、現品説明書に従って、上記(1)で回収した細胞から、Total RNAを抽出した。
上記(2)で抽出したTotal RNAの1μgに、全量17μLになるように蒸留水を加え、10X Reaction Buffer(プロメガ(株)製)を2μL、RQ1 RNase-Free DNase(プロメガ(株)製)を1μL(1U)を加え混合し、37℃、20分間インキュベートした。その後、Stop Buffer(20mM EGTA)(プロメガ(株)製)を1μL加え混合し、65℃、10分間インキュベートした。その後、反応物に結合Buffer(5.5Mグアニジン塩酸塩(和光純薬工業(株)製)、20mM Tris-HCl pH6.6)を100μL加え混合した後、エコノスピン(核酸精製用シリカメンブレンスピンカラム、(株)ジーンデザイン製)に移し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。次いで、チューブに洗浄Buffer(2mM Tris-HCl pH7.5((株)ニッポンジーン製)、80% エタノール(和光純薬工業(株)製)を500μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。更に12000×g、室温、1分間遠心分離した後、エコノスピン(mRNAが結合している)を新しいチューブに交換し、溶出Buffer(10mMTris-HCl pH8.0)((株)ニッポンジーン製)を50μL添加し、12000×g、室温、1分間遠心分離してTotal RNAを回収した。その後、エタノール沈殿を行い、得られた沈殿物を蒸留水9.5μLに溶解した。
上記(3)でDNase処理したTotal RNA 9.5μLに、下記の各mRNAを標的とする増幅プライマーを含む混合Primer(各5μM)1μLを加えた。下記プライマーは、すべてシグマアルドリッチ社製である。
・Foxb2 mRNAの増幅プライマー、CATGATGAACTTGTAGATGTC(配列番号37、GenBank Accession No. NM_008023 : 302-322)
・Oct3/4 mRNAの増幅プライマー、CATGTTCTTAAGGCTGAGCTGC(配列番号38、GenBank Accession No. NM_013633 : 617-638)
・Nanog mRNAの増幅プライマー、CTGAATCAGACCATTGCTAGTC(配列番号39、GenBank Accession No. NM_028016 : 388-408)
・Sox2 mRNAの増幅プライマー、CAACGATATCAACCTGCATGG(配列番号40、GenBank Accession No. NM_011443 : 2120-2140)
・Klf2 mRNAの増幅プライマー、GAACTGGTGGCAGAGTCATTTTC(配列番号41、GenBank Accession No. NM_008452 : 1205-1227)
・Esrrb mRNAの増幅プライマー、GATTCGAGACGATCTTAGTCAATG(配列番号42、GenBank Accession No. NM_011934 : 957-980)
・Fgf5 mRNAの増幅プライマー、GACGCATAGGTATTATAGCTG(配列番号43、GenBank Accession No. NM_010203 : 729-749)
・Gapdh mRNAの増幅プライマー、CTTGATGTCATCATACTTGGC(配列番号44、GenBank Accession No. NM_001289726 :843-863)
上記(4)で得られたcDNA 1μL、蒸留水5μL、2× PCR Buffer for KOD FX Neo(東洋紡(株)製)12.5μL、2 mM dNTPs(東洋紡(株)製)4μL、KOD FX Neo(東洋紡(株)製)0.5μL(0.5U)、各Forward primer(10μM)1μL、各Reverse primer(10μM)1μLを混合した。
使用した各Primerの塩基配列は、以下の通りである。下記プライマーは、すべてシグマアルドリッチ社製である。
Forward primer : CTTTCCAAGAGGCGTTAAGGC(配列番号45)
Reverse primer : CTCAGAGGCAGCATCTTCTCAG(配列番号46)
増幅鎖長 : 169bp
Forward primer : GAACCTGGCTAAGCTTCCAAG(配列番号47)
Reverse primer : GCTTGGCAAACTGTTCTAGCTC(配列番号48)
増幅鎖長 : 339bp
Forward primer : GCATTAGACATTTAACTCTTCTTTC(配列番号49)
Reverse primer : CTTGAAGAGGCAGGTCTTCAG(配列番号50)
増幅鎖長 : 299bp
Forward primer : GAATCGGACCATGTATAGATCTG(配列番号51)
Reverse primer : CATTTGATTGCCATGTTTATCTCG(配列番号52)
増幅鎖長 : 208bp
Forward primer : GAAGCCTTATCATTGCAACTGG(配列番号53)
Reverse primer : CTGTCCTAAGGTCCAATAAATAGC(配列番号54)
増幅鎖長 : 273bp
Forward primer : GCAAGAGCTACGAGGACTGTAC(配列番号55)
Reverse primer : GTTTGGTGATCTCACATTCATTG(配列番号56)
増幅鎖長 : 231bp
Forward primer : GAACATAGCAGTTTCCAGTGG(配列番号57)
Reverse primer : GTTGCTGAAAACTCCTCGTATTC(配列番号58)
増幅鎖長 : 195bp
Forward primer : GTTCCAGTATGACTCCACTCACG(配列番号59)
Reverse primer : CATTGCTGACAATCTTGAGTGAG(配列番号60)
増幅鎖長 : 311bp
上記(5)で得られたPCR増幅産物5μLと、6×Loading Buffer Double Dye((株)ニッポンジーン製)1μLとを混合し、これを1.5%アガロースゲルにて電気泳動した。染色はGelRed核酸ゲル染色液(和光純薬工業(株)製)にて行った。
結果を図4に併せて示す。
(1)幹細胞の培養と分化誘導処理
hiPS細胞(201B7株、京都大学iPS 細胞研究所(iPSアカデミアジャパン株式会社))を以下の培地で培養した。
結果を図5に示す。
1)抗ヒトFOXB2蛋白質抗体固定化ELISA用マイクロプレートの調製
抗ヒトFOXB2蛋白質抗体の溶液(50mM MOPS緩衝液(pH7.0))をELISA用マイクロプレート(Nunk社製)の各ウェルに分注後24時間静置して、抗ヒトFOXB2蛋白質抗体を固定化したマクロプロレートを得る。
2)ペルオキシダーゼ標識抗FOXB2蛋白質抗体の調製
抗ヒトFOXB2蛋白質抗体を常法によりペルオキシダーゼ標識する。
3)試料の調製
分化誘導後3日目のhiPS細胞を回収し、ソニケーションによりhiPS細胞を破壊して、細胞のライセートを得る。得られたライセートを緩衝液に溶解させて試料とする。
4)測定
上記3)で調製した試料を、上記1)で調製した抗FOXB2蛋白質抗体固定化ELISA用マイクロプレートの各ウェルに添加し、37℃で1時間程度反応させる。次いで各ウェルを緩衝液で回洗浄する。
上記2)で調製したペルオキシダーゼ標識抗FOXB2蛋白質抗体をそれぞれ各ウェルに分注し、37℃で1時間程度反応させる。各ウェルを緩衝液で、次いで蒸留水で洗浄し、TMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)溶液(和光純薬工業(株)製)を各ウェルに50μLずつ添加し、25℃、30分間反応させる。その後、反応停止液(1Mりん酸溶液)を各ウェルに50μL ずつ添加して反応を停止させる。450nmにおける吸光度を、Vmax (モレキュラーデバイス社製) を用いて測定する。
その結果、FOXB2蛋白質が検出された場合には、試料として用いたhiPS細胞は分化した状態であると判定される。又は、試料として用いたhiPS細胞の細胞群には、分化した状態の細胞が含まれると判定される。
1)試料の調製
分化誘導後3日目のhiPS細胞を回収し、ソニケーションによりhiPS細胞を破壊して、細胞のライセートを得る。得られたライセートを緩衝液に溶解させて試料とする。
2)ペルオキシダーゼ標識抗FOXB2蛋白質抗体の調製
抗ヒトFOXB2蛋白質抗体を常法によりペルオキシダーゼ標識する。
3)ウエスタンブロッティング
上記1)で得られた試料をSuperSepTM(電気泳動用ゲル、和光純薬工業(株),5-20%のグラジェントゲル)にアプライして、SDS-PAGE電気泳動(定電流25mA)を行う。次いで、泳動後の画分を、セミドライブロッティング法にてPVDFメンブレンに転写する。
PBS-T(Phosphate Buffered Saline with TweenTM 20、pH 7.4)にブロックエース(DSファーマバイオメディカル(株)製)を溶解させてブロッキング液とする。このブロッキング液に上記転写後のPVDFメンブレンを浸漬させ、1時間室温にてブロッキング処理した後、PVDFメンブレンを洗浄し、ブロッキング液に浸漬させる。
次いで、上記2)で得られたペルオキシダーゼ標識抗ヒトFOXB2蛋白質抗体をブロッキング液に加えて室温で1時間程度浸漬させる。PVDFメンブレンを洗浄し、ECLTM Prime Western Blotting Detection Reagent(ペルオキシダーゼの化学発光基質、GE Healthcare製)で発光させ、LAS4000(富士フイルム(株)製)を用い、露光時間10秒で検出する。
その結果、FOXB2蛋白質が検出された場合には、試料として用いたhiPS細胞は分化した状態であると判定される。又は、試料として用いたhiPS細胞の細胞群には、分化した状態の細胞を含むと判定される。
した状態の細胞が含まれる判定される。
Claims (6)
- 分化誘導処理を施したiPS細胞若しくはES細胞、又は未分化状態を維持する処理を施したiPS細胞若しくはES細胞のFOXB2 mRNAを検出し、下記(1)又は(2)の方法により判定を行う、iPS細胞又はES細胞の分化状態の判定方法:
(1)分化誘導処理後又は未分化状態を維持する処理後7日目までにFOXB2 mRNAが検出された場合に、その細胞が分化した状態であると判定する、判定方法、
(2)下記から選択される判定方法:
(i)未分化状態であることを確認した対照のiPS細胞のFOXB2 mRNAを検出し、分化誘導処理後又は未分化状態を維持する処理後7日目までの被検細胞のFOXB2 mRNAの検出量が、対照のiPS細胞のFOXB2 mRNAの検出量より多い場合に、該iPS細胞は分化した状態であると判定する、又は
(ii)未分化状態であることを確認した対照のES細胞のFOXB2 mRNAを検出し、分化誘導処理後又は未分化状態を維持する処理後7日目までの被検細胞のFOXB2 mRNAの検出量が、対照のES細胞のFOXB2 mRNAの検出量より多い場合に、該ES細胞は分化した状態であると判定する。 - FOXB2 mRNAが下記(1)〜(2)から選択される、請求項1に記載の方法:
(1)配列番号1又は配列番号34で表される塩基配列を有するmRNA、
(2)配列番号1又は配列番号34で表される塩基配列と97%以上の相同性を有するmRNA。 - FOXB2 mRNAが下記(1)〜(3)から選択される、請求項1に記載の方法:
(1)配列番号2若しくは配列番号35で表されるアミノ酸配列をコードするmRNA、
(2)配列番号2若しくは配列番号35で表されるアミノ酸配列の1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするmRNA、
(3)配列番号2若しくは配列番号35で表されるアミノ酸配列と97%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードするmRNA。 - FOXB2 mRNAの検出をRT-PCR法により行う、請求項1に記載の方法
- 下記(1)〜(4)から選択されるいずれか一つのプライマーセットを構成要件として含む、iPS細胞又はES細胞の分化状態の判定用キット:
(1)配列番号9で表される塩基配列を有するプライマー、及び配列番号10で表される塩基配列を有するプライマー、
(2)配列番号45で表される塩基配列を有するプライマー、及び配列番号46で表される塩基配列を有するプライマー。
(3)配列番号4で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号9で表される塩基配列を有するプライマー、及び配列番号10で表される塩基配列を有するプライマー、
(4)配列番号37で表される塩基配列を有するプライマー、配列番号45で表される塩基配列を有するプライマー、及び配列番号46で表される塩基配列を有するプライマー。 - 配列番号9で表される塩基配列を有するプライマーと配列番号10で表される塩基配列を有するプライマーの少なくとも一方、又は配列番号45で表される塩基配列を有するプライマーと配列番号46で表される塩基配列を有するプライマーの少なくとも一方が標識物質で標識された、請求項5に記載のキット。
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