CN112921000B - 一种构建胶质瘤体外3d培养和分析体系的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肿瘤细胞三维培养和分析技术领域,具体公开了一种胶质瘤体外3D培养和分析体系的构建方法及应用,所述方法步骤包括,基于脑内组分及弹性模量配制基质胶,将悬滴培养的胶质瘤肿瘤多细胞球包埋入基质胶,并结合高内涵细胞成像进行检测和量化分析,从而获得胶质瘤体外3D培养和分析体系;本发明所述培养和分析体系的构建方法中基质胶生化组成及弹性模量更接近脑部实际情况,模型中细胞迁徙过程相较于目前常用检测细胞迁徙能力的划痕实验和Transwell实验,理论上更加符合胶质瘤细胞在脑部的实际迁徙特征,可在检测细胞迁徙能力过程中提供了更多的信息维度,能够更好地为量化胶质瘤细胞的迁徙能力及深入探究胶质瘤迁徙相关机制提供模型支持。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤细胞三维培养和分析技术,具体涉及一种构建胶质瘤体外3D培养和分析体系的构建方法及应用。
背景技术
胶质母细胞瘤细胞通常可侵袭至距离原发灶数厘米远的部位,甚至能迁移进入对侧脑半球(Michael D et al 2015)(K.Kallenberg 2013)。但区别于其它恶性实体瘤,胶质母细胞瘤并不依赖血管腔或淋巴腔进行转移扩散。而主要是沿血管壁及脑实质进行浸润性扩散(Vishnu Anand Cuddapah et al 2014)。脑部大血管和毛细血管后小静脉被两层基底膜包围,毛细血管被一层复合基底膜包围(Michael Sixt et al 2001)(Reese T.S,Karnovsky M.J 1967),基底膜是由50-100nm厚的ECM分子组成的特殊细胞外基质,富含层粘连蛋白、纤维连接蛋白、玻连蛋白以及硫酸肝素蛋白聚糖等(Vishnu Anand Cuddapah etal 2014)(Gabriel Benton et al 2014),脑实质中的基质则主要由蛋白聚糖以及其结合物——透明质酸和肌腱蛋白等组成(Zimmermann D R,Dours Zimmermann M T 2008),其中透明质酸是一种非硫酸糖胺聚糖,占据大脑细胞外体积的绝大部分。恶性胶质瘤中的透明质酸含量高于正常脑组织,体外实验也显示透明质酸可促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移(Koochekpour S et al 1995,Radotra B,McCormick D 1997,Hayen W et al 1999,GieseA et al 1995)。此外随着生物物理与肿瘤进展串扰之间的研究越来越多,发现在2D聚丙烯酰胺基质上培养的胶质母细胞瘤细胞其形态、增殖能力受ECM刚度的调节(Ulrich TA etal 2009)(Sen S et al 2009),此外在基于透明质酸的3D可调节刚度水凝胶中,胶质母细胞瘤细胞的形态、运动与水凝胶的刚性亦具有依赖关系(Ananthanarayanan B et al2011)。
为更有效的治疗胶质母细胞瘤患者,延长患者生存时间,需更深入地了解胶质母细胞瘤侵袭、迁移的相关机制及影响因素。作为研究肿瘤侵袭、迁移的重要手段,目前使用较多的肿瘤相关研究模型有2D细胞培养以及动物模型。通过2D细胞培养模型,肿瘤的分子和遗传机制得到了广泛研究。但简化的2D培养方法不能模拟癌症或正常组织的原位环境,也不能再现细胞的三维形态,甚至可能改变细胞间的相互作用(Edna Cukierman et al2001)。动物模型的优势在于为肿瘤提供了三维微环境,以模拟人类肿瘤环境的复杂性,常用的模型是人类肿瘤异种移植模型,包括接种人类癌细胞或部分肿瘤组织。但异种移植模型的一个主要挑战是如何观察肿瘤在治疗过程中的生长或消退,尽管随着体内动物成像的进展,对治疗反应的监测是可行的,但依旧存在昂贵和操作繁琐的不足(Loudos G et al2011)。此外动物模型得到的部分实验结果在临床实验中疗效并不显著(Eder JP Jr et al2002),表明动物模型可能无法提供足够准确的信息以便应用到临床。因此,构建能够尽可能模拟体内真实肿瘤微环境的新型3D肿瘤培养和分析体系对了解肿瘤细胞侵袭、迁移机制具有重要意义。
肿瘤多细胞球是将肿瘤细胞经过一定条件诱导,使肿瘤细胞自发聚集成球生长,形成类似体内无血管肿瘤结节的体外3D肿瘤模型。其中悬滴法是在下垂的液滴中培养肿瘤多细胞球,当中的微重力环境可使肿瘤细胞自发聚集(KelmJM et al 2003)。因模型具有三维结构,多细胞肿瘤球中氧气浓度从外至内依次降低,直径在400-500μm的肿瘤多细胞球其核心可出现坏死细胞区(Nyga A et al 2011)(Mehta G et al 2012)(Lin R Z et al2008),重现了实体肿瘤微环境中的低氧、低PH、局部坏死等特征,能够更真实的模拟体内实体肿瘤微环境。
目前常用的探究肿瘤细胞迁徙能力(迁移和侵袭)的方法主要是划痕实验(迁移)和Transwell实验(侵袭),其所用细胞是源于2D单层培养的细胞,细胞未在体外经历肿瘤微环境的影响。此外均是在2D平面上的实验,不能完全模拟体内实际情况,量化迁徙能力的指标也较为单一:划痕实验为一定时间内划痕面积或宽度随时间推移的变化,Transwell实验为计数一定时间内进入Transwell下室的细胞量。
作为模拟体内真实肿瘤组织及其微环境的体外模型,通过将肿瘤多细胞球包埋在人工细胞外基质中,肿瘤多细胞球与人工细胞外基质相互作用,可更好的模拟肿瘤细胞在体内的侵袭与迁移过程。人工细胞外基质有Matrigel和CollagenⅠ及透明质酸(HA)等。Matrigel是鼠EHS肿瘤中的提取物,其中含有基底膜的主要成分,包埋在Matrigel中培养的肿瘤细胞可持续增殖,并且表现出与恶性肿瘤类似的侵袭行为。CollagenⅠ也是细胞外基质的主要成分,在肿瘤血管基底膜中亦同样存在(Giesexs A,Westphal M.1996),在肿瘤的侵袭、迁移过程中,细胞外基质结构不断变化,胶原蛋白发生周期性的降解、沉积、交联和变硬(Min Fang et al 2014)。透明质酸(HA)是天然存在的多糖,是脑组织的主要ECM成分,局部HA含量的变化通常与神经胶质瘤进展有关,恶性神经胶质瘤表达的HA水平高于正常脑组织。人们认为,细胞内HA积累的增加将建立有利于恶性细胞迁移,增殖和侵袭过程的微环境。此外,细胞外HA的增加与改变胶质瘤增殖和运动性的细胞内信号通路的激活有关。
因此,有必要构建一种胶质瘤体外3D培养和分析体系,用以模拟体内真实肿瘤微环境及其体内迁徙特征,为深入探究胶质瘤细胞迁徙机制提供模型支持。
发明内容
鉴于此,本发明的目的在于提供一种构建胶质瘤体外3D培养和分析体系的方法及应用,用以模拟体内真实肿瘤微环境及其体内迁徙特征,为深入探究胶质瘤细胞迁徙机制提供模型支持。
本发明的一个目的在于,提出一种构建胶质瘤体外3D培养和分析体系的基质凝胶,包括Collagen I、Matrigel和透明质酸;进一步地,所述基质凝胶的弹性模量为1.0×102-1.0×103Pa。
优选地,所述Collagen I的浓度为0.5mg/ml,所述Matrigel的浓度为3mg/ml。
本发明的另一个目的在于,提出一种胶质瘤体外3D培养和分析体系的构建方法,包括如下步骤:基于脑内组分及弹性模量配制基质胶,将悬滴培养生成的胶质瘤细胞系来源肿瘤多细胞球包埋入基质胶,并结合高内涵细胞成像获得胶质瘤体外3D培养和分析体系;所述基质胶包括Collagen I、Matrigel和透明质酸;所述肿瘤多细胞球的直径为400-500μm。
根据本发明的实施例,所述基质胶中,所述Collagen I的浓度为0.5mg/ml,所述Matrigel的浓度为3mg/ml Matrigel。
根据本发明的实施例,所述胶质瘤细胞系为DBTRG或U251,所述肿瘤多细胞球的成球浓度为2w cell/20μl。
本发明还有一个目的在于,提出以上所述构建方法获得的3D培养和分析体系。
本发明另外一个目的在于,提出一种以上所述3D培养和分析体系的迁徙能力量化方法,包括如下步骤:对体系中的胶质瘤细胞球迁徙情况进行高内涵细胞成像,然后量化分析迁徙能力指标获得迁徙能力数据;所述迁徙能力指标包括迁徙距离、面积,以及单细胞的运动速度、方向。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
1.本发明提出构建3D培养和分析体系的基质胶在生化组成以及物理参数上更贴近脑部细胞外基质,使用的细胞球具有三维结构,更加符合体内实体胶质瘤生长微环境。
2.本发明提出构建的3D培养和分析体系,胶质瘤细胞在其0.5mg/mlCollagen I+3mg/ml Matrigel+HA基质凝胶中的迁徙相较于目前常用检测细胞迁徙能力的划痕实验和Transwell实验理论上更加符合胶质瘤细胞在脑部的实际迁徙特征,此外相较于划痕实验和Transwell实验,在检测细胞迁徙能力过程中提供了更多的信息维度,例如单细胞迁徙的方向性和速度。可以作为模拟体内真实胶质瘤微环境的体外3D培养和分析模型,为深入探究胶质瘤细胞迁徙机制提供模型支持。
附图说明
图1为本发明所述胶质瘤体外3D培养和分析体系的构建方法流程图。
图2为本发明成球浓度下悬滴培养72h后生成细胞球直径的结果。
图3为本发明基质凝胶弹性模量与不含透明质酸基质凝胶的对比结果。
图4为本发明DBTRG及U251细胞球在基质凝胶中迁徙距离的对比结果。
图5为本发明DBTRG及U251细胞球在基质凝胶中迁徙增加面积的对比结果。
图6为本发明DBTRG及U251细胞球在基质凝胶中迁徙的方向及速度的对比结果。
图7为本发明DBTRG及U251细胞系的Transwell实验对比结果。
图8为本发明DBTRG及U251细胞系的传统划痕实验对比结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的前提下,对本发明的方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
本发明基于人类大脑中的基质成分及弹性模量参数构建一种胶质瘤体外3D培养和分析体系,所述基质胶包括Collagen I、Matrigel和透明质酸;进一步地,所述基质胶根据人脑实际弹性模量1.0×102-1.0×103Pa的区间来选择,优选地,所述Collagen I的浓度为0.5mg/ml,所述Matrigel的浓度为3mg/ml;通过恒定频率的振幅扫描以确定基质胶的线性粘弹性变形范围,上述基质胶的弹性模量参数处于人脑实际弹性模量1.0×102-1.0×103Pa的区间内。
本发明提出的的肿瘤培养模型具有三维结构,能够更真实的模拟体内实体肿瘤微环境,由于多细胞肿瘤球中氧气浓度从外至内依次降低,直径在400μm-500μm的肿瘤多细胞球其核心可出现坏死细胞区,重现了实体肿瘤微环境中的低氧、低PH、局部坏死等特征,基于该特征,本发明提供了可生成直径400μm-500μm左右肿瘤多细胞球的成球浓度,并作为构建具三维结构细胞球模型的条件。以U251细胞系为例,可生成直径400μm-500um左右肿瘤多细胞球的成球浓度为2w cell/20μl。
在上述条件的基础上,本发明分别以DBTRG与U251细胞系来源肿瘤多细胞球在基质胶中进行3D培养和分析体系的构建并成功地对细胞迁徙过程进行了高内涵细胞成像,并对胶质瘤细胞在基质凝胶中60h内的迁徙距离、迁徙面积、单细胞迁徙速度和方向性进行量化获得在基质胶中的迁徙能力数据,最终表明该3D培养和分析体系可以较好的量化胶质瘤细胞迁徙能力。
本发明所述胶质瘤体外3D培养分析模型的构建及迁徙能力的量化方法流程图如图1所示。
以下是本发明的实验实施例,用于阐述及证明发明的实施过程及结论。
本发明所述实验材料与试剂来源如下:
试剂名称 | 来源及型号 |
Collagen I | Gibco-A1048301 |
Matrigel | Corning-354234 |
HA | 常州药物研究所有限公司 |
多孔板 | Nest公司 |
DMEM、RPMI简单培养基 | Hyclone公司 |
胎牛血清 | Gibco公司 |
甲基纤维素 | Solarbio-M8070 |
实施例1.DBTRG、U251细胞系可生成具坏死核心细胞球的成球浓度探究
1.将液氮中冻存的胶质母细胞瘤细胞系DBTRG、U251进行复苏并传代培养;
2.细胞传代时获得DBTRG、U251的细胞悬液,并使用含有质量体积分数为0.24%甲基纤维素的RPMI、DMEM完全培养基将细胞悬液稀释至2.5kcell/20μl、5k cell/20μl、1wcell/20μl、2w cell/20μl的浓度;
3.吸取20ul细胞悬液滴入24孔板的底部中央,盖上24孔板盖子后将24孔板倒置。后在24孔板盖中加入5ml左右PBS缓冲液,防止培养过程中细胞培养基蒸发;
4.将倒置的24孔板放入细胞培养箱中进行培养,并在72h的时间内每间隔12h对细胞悬液进行成像,观察各浓度细胞悬液中肿瘤多细胞球的成球情况。经计算及统计分析,可生成直径400μm-500μm肿瘤多细胞球的成球浓度为2wcell/20μl,并将其作为后续实验的成球浓度。图2中给出了各成球浓度下悬滴培养72h后生成细胞球的直径,可以看出在2wcell/20μl浓度条件下,可生成直径400μm-500μm肿瘤多细胞球。
实施例2.未含有及含有透明质酸的基质凝胶弹性模量参数量化
(一)配制0.5mg/ml Collagen I+3mg/ml Matrigel的混合凝胶:
1.取出分装于2ml离心管并分别于4℃和-20℃冰箱中保存的Collagen I和Matrigel基质胶,将其置于碎冰内存放(全程冰上操作);
2.使用10×PBS、1N NaOH、dH2O将3mg/ml的Collagen I稀释至1mg/ml备用,具体方法依照以下公式:
vt=所需胶原凝胶的总体积,所需胶原蛋白体积(v1)=(最终浓度胶原)×(总体积(vt))除以初始胶原蛋白浓度。
所需的10xPBS体积(v2)=总体积(vt)/10;
所需1N NaOH体积(v3)=(v1)×0.025;
所需dH2O体积(v4)=(vt)–(v1+v2+v3)。
3.分别使用RPMI和DMEM简单培养基将Matrigel基质胶稀释至6mg/ml两个浓度;
4.将1mg/ml CollagenⅠ和6mg/ml Matrigel等量混合,制成终浓度为0.5mg/mlCollagen I+3mg/ml Matrigel的混合凝胶。
(二)配制0.5mg/ml Collagen I+3mg/ml Matrigel+HA的混合凝胶:
1.按照(一)中上述方法使用RPMI和DMEM简单培养基将Matrigel基质胶稀释至9mg/ml;
2.将1.5mg/ml CollagenⅠ和9mg/ml Matrigel以及分子量为900KDa的透明质酸凝胶(HA)等体积混合,制成0.5mg/ml Collagen I+3mg/ml Matrigel+HA的混合凝胶。
(三)两种基质凝胶弹性模量参数确定
1.使用振荡剪切流变仪测定两种基质凝胶的弹性模量,使用20mm顶板;
2.设置流变板之间的间隙为0.1mm,取50μl的混合凝胶滴入平行板中,让凝胶在37℃温度下凝固30min。
3.进行恒定频率的振幅扫描以确定样品的线性粘弹性变形范围,然后在线性范围内的应变振幅下进行频率扫描。以0.5%的应变幅度测试0.05Hz至100Hz的频率。如图3所示,0.5mg/ml Collagen I+3mg/ml Matrigel+HA混合凝胶的弹性模量参数处于人脑实际弹性模量1.0×102-1.0×103Pa的区间内。
实验例1.DBTRG、U251细胞球包埋0.5mg/ml Collagen I+3mg/ml Matrigel+HA中进行迁徙
1.取96孔板,每孔加入50μl的混合凝胶作为体外迁徙介质,分别将DBTRG、U251肿瘤多细胞球包埋其中,置于细胞培养箱中30min至凝胶凝固。
2.将96孔板置于高内涵细胞成像系统中,每间隔30min进行一次成像,持续60h。
实验例2.DBTRG与U251细胞系来源肿瘤多细胞球在基质凝胶中60h内的迁徙距离量化
1.分别叠加DBTRG、U251细胞球在基质胶中迁徙第0h和第60h的照片
1)打开Image J,依次选择“Image”-“color”-“merge channels”;
2)选择要合并的两张图片,分别为迁徙的第0h和第60h的照片;
3)第一个通道选择第0h的照片,第四个通道选择第60h的照片,进行合并;
4)合并后在“Image”-“Adjust”-“Brightness/Contrast”中进行调整,使第一个时间点的照片显示为黑色;
5)保存图片为jpeg格式。
2.测量叠加后图片中迁徙第60h细胞球与第0h细胞球在上、下、左、右四个方向上的间隔距离
1)在Powerpoint软件中向叠加后照片添加上、下、左、右四条测距辅助线,辅助线起点为各方向上第0h细胞球外侧边缘,终点为第60h细胞球外侧边缘;
2)打开Image J,使用“Straight Line”工具画一条水平且长度与图片比例尺相同的直线,点击“Analyze”-“Set scale”设置,使水平直线的长度与比例尺所代表的实际长度一致;
3)在Image J中使用“Straight Line”工具沿四条测距辅助线画出长度与之一致的直线,软件中显示的数值则为实际细胞球经过60h迁徙后在各个方向上的实际迁徙距离,单位um;
3.计算细胞球在基质凝胶中的平均迁徙距离(x±S)。
1)将细胞球在四个方向上迁徙距离的数值输入graphpad prism 9;
2)计算其在基质中的平均迁徙距离:平均值±标准差。
两种细胞球在基质凝胶中迁徙距离的结果如图4所示,在60h的迁徙结束后,DBTRG细胞系来源的肿瘤多细胞球迁徙平均距离远于U251细胞系来源的肿瘤多细胞球(图4B)。图4A中黑色圆形区域是迁徙第0h细胞球图像,黑色区域周围灰色部分是迁徙第60h的细胞球图像。
实验例3.DBTRG、U251细胞系在基质凝胶中迁徙面积量化:
1.获取细胞迁徙图片后清除杂乱背景
1)将各时间点细胞迁徙照片导入Photoshop 2020;
2)应用“污点修复画笔工具”去除细胞迁徙区域外的较大杂乱背景;
3)调整“画笔工具”的大小;
4)在“通道”中选择红色通道,右击选择“复制通道”,“目标”-“文档”中选择新建,设置图片名称;
5)在“图像(I)”-“模式(M)”中将图片格式设置为“灰度(G)”,后将图片保存;
6)重新导入照片后依次点击“滤镜(T)”-“风格化”-“查找边缘”;
7)依次点击“图像(I)”-“调整(J)”-“色阶(L)”,调整色阶并导出照片,重新进入Image J计算面积。
2.细胞侵袭后面积计算(Image J)
1)设置比例尺:使用直线工具测量比例尺的像素长度,之后在“Analyze”的“setscale”中输入像素长度和已知长度,单位选择“μm”之后框选“Global”;
2)在“Image”的“Type”中将16bit的彩色图转化为8bit的黑白图;
3)点击“process”中的“sharpen”(可以省略);
4)点击“process”中的“Find Edges”(可以在调整阈值后进行);
5)点击“Image”中的“Adjust”中的“Threshold”调整阈值,尽量使红色区域填满需要测量的部分,同时使不需要测量的区域尽可能少的出现红色,处理完之后点击apply;
6)若细胞中心有空心,则apply之后继续点击一至两次“process”中的“FindEdges”,直至要测量的中心区域被覆盖;
7)之后点击“Analyze”中的“Analyze particles”,调整合适的参数,并勾选显示轮廓,输出待测区域面积。
细胞球在基质凝胶中的迁徙增加面积如图5所示,在60h的迁徙结束后,DBTRG细胞系来源的肿瘤多细胞球迁徙增加面积大于U251细胞系来源的肿瘤多细胞球(图5B)。图5A中左列三个细胞球是U251细胞球迁徙第60h的投影,右列三个细胞球是DBTRG细胞球迁徙第60h的投影,二者面积分别减去初始细胞球面积即为迁徙增加面积。
实施例4.DBTRG与U251细胞系来源肿瘤多细胞球在基质凝胶中60h内的单细胞迁徙速度和方向性量化
1.将mp4格式的时间序列视频导入ImageJ:首先安装插件“FFMPEG”,之后依次点击“File”-“Import”-“Movie(FFMPEG)”导入视频;
2.设置比例尺:使用直线工具测量比例尺的像素长度,之后在“Analyze”的“setscale”中输入像素长度和已知长度,单位选择“μm”之后框选“Global”;
3.打开ImageJ的手动追踪插件:依次点击“Plugins”-“Tracking”-“ManualTrcking”;
4.在手动追踪插件“Manual Tracking”中设置参数:“Time interval”中选择视频每一帧之间的时间间隔,本实施例中选择30min;“x/y calibration”表示每像素相当于实际多少μm,本实施例中填写1.62μm;“z calibration”在本实施例中选择0。“Search squaresize for centring”、“Dot size”、“Line width”、“Font size”在本实施例中依次填写5.0、5.0、2.0、12.0;
5.设置好参数以后点击“Add track”,选择目标细胞进行追踪,一个细胞追踪结束后点击“End track”,再退回第一帧重新点击“Add track”,选择新的目标细胞继续添加新的轨迹;
6.所有轨迹完成后,将结果保存为csv格式,在“Track”这一列前添加一列以1起依次加1的数字,之后将文件转存为txt格式;
7.打开量化单个细胞迁徙特征软件“Chemotaxis And Migration Tool”,导入txt格式的数据,设置后应用,输出细胞在一定时间内迁徙的速度和方向性指标。
细胞球在基质凝胶中迁徙的方向及速度结果如图6所示,图6A中给出了迁徙的轨迹图,图6B表示在60h的迁徙结束后,DBTRG细胞系来源的肿瘤多细胞球中单个细胞的迁徙速度高于U251细胞系来源的肿瘤多细胞球;DBTRG细胞系来源的肿瘤多细胞球中单个细胞的迁徙方向性小于U251细胞系来源的肿瘤多细胞球,但并没有显著性差异。(认为迁徙方向性数值越接近于1,细胞迁徙路径越接近于直线,迁徙的能力越强)。
对比例.DBTRG、U251细胞系迁徙能力应用经典划痕实验及Transwell实验进行量化比较
1)划痕实验:待六孔板中的DBTRG、U251细胞均达到80%-90%汇合时,吸去细胞培养液,用PBS洗涤三次,每次使用1ml。之后分别向培养瓶中加入不含血清的RPMI、DMEM简单培养基过夜培养,第二天吸去简单培养基,用白色移液枪头在六孔板每个孔中划三条直线,后分别加入4ml不含血清的RPMI、DMEM简单培养基,在显微镜下拍照划痕区域。后将六孔板置于细胞培养箱中37℃、5%CO2条件下培养,每隔24h取出拍照,持续48h。后使用Image J分析划痕区域在48h内的面积减小量,并用GraphPad Prism 9进行统计分析。
2)Transwell实验:将Matrigel基质胶于冰上融化,分别使用无血清的RPMI和DMEM简单培养基将Matrigel基质胶稀释10倍。后将Transwell小室置于24孔板中,转移50μlMatrigel基质胶至Transwell小室上方,置于细胞培养箱过夜至基质胶凝固。第二天在Transwell小室上分别加入50μl无血清的RPMI和DMEM简单培养基保持30min。DBTRG、U251细胞系经胰酶消化后,分别用低血清的RPMI和DMEM培养基将细胞密度调整至2.0×105/ml,Transwell小室上方加入200μl细胞悬液,下室分别加入500μl RPMI和DMEM完全培养基。37℃、5%CO2细胞培养箱中培养48h,结束后取出Transwell上室用4%多聚甲醛固定、结晶紫染色,显微镜下成像拍照。后使用Image J计数穿过膜的细胞数量,并用GraphPad Prism 9进行统计分析。
两种细胞系的Transwell实验结果如图7所示,图7A为侵袭48h后的示意图,图7B中看出DBTRG细胞系的侵袭能力强于U251细胞系。两种细胞系的划痕实验结果如图8所示,图8A为划痕前后的示意图,图8B中看出DBTRG细胞系的迁移能力强于U251细胞系。
综合以上实验结果,经过本发明提供的3D培养和分析体系,较好地模拟了胶质瘤细胞系DBTRG及U251在脑部迁徙的过程,通过量化分析,胶质瘤细胞系DBTRG的迁徙能力强于U251细胞系,与经典实验方法划痕实验和transwell实验的结论一致,表明该体系可以较好的量化胶质瘤细胞迁徙能力。由于使用的细胞球具有三维结构,更加符合体内实体胶质瘤生长微环境,另一方面所用的迁徙介质由于含有透明质酸在生化组成以及物理参数上更贴近脑部细胞外基质,体系中细胞迁徙过程相较于目前常用检测细胞迁徙能力的划痕实验和Transwell实验理论上更加符合胶质瘤细胞在脑部的实际迁徙特征,此外相较于划痕实验和Transwell实验,在检测细胞迁徙能力过程中提供了更多的信息维度,例如单细胞迁徙的方向性和速度。可更好的模拟胶质瘤细胞在体内的迁徙过程并为量化胶质瘤细胞的迁徙能力及深入探究胶质瘤迁徙相关机制提供新型3D培养和分析体系。
本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述,因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和改进,故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下,本发明并不限于特定的细节、代表性的方案和描述的实施例。
Claims (3)
1.一种胶质瘤体外3D培养和分析体系的迁徙能力量化方法,其特征在于,包括如下步骤:
基于脑内组分及弹性模量配制基质凝胶,将胶质瘤细胞系来源的肿瘤多细胞球包埋入基质凝胶,并结合高内涵细胞成像获得胶质瘤体外3D培养和分析体系;
对体系中的胶质瘤多细胞球迁徙情况进行高内涵细胞成像,然后量化分析迁徙能力指标获得迁徙能力数据;所述迁徙能力指标包括迁徙距离、面积,以及单细胞的运动速度、方向性;
所述基质凝胶包括Collagen I、Matrigel和透明质酸;所述肿瘤多细胞球的直径为400-500µm;Collagen I 的浓度为0.5mg/ml,Matrigel的浓度为3mg/ml。
2.根据权利要求1所述的迁徙能力量化方法,其特征在于,所述基质凝胶的弹性模量为1.0×102 - 1.0×103 Pa。
3.根据权利要求1所述的迁徙能力量化方法,其特征在于,所述胶质瘤细胞系为DBTRG或U251,所述肿瘤多细胞球的成球浓度为2w cell / 20 µl。
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Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1416462A (zh) * | 2000-01-11 | 2003-05-07 | 杰龙公司 | 人多能干细胞生长和分化的技术 |
CN101182464A (zh) * | 2006-05-16 | 2008-05-21 | 贝克顿·迪金森公司 | 用于细胞培养的经细胞外基质包被的表面 |
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---|---|---|---|---|
CN1416462A (zh) * | 2000-01-11 | 2003-05-07 | 杰龙公司 | 人多能干细胞生长和分化的技术 |
CN101182464A (zh) * | 2006-05-16 | 2008-05-21 | 贝克顿·迪金森公司 | 用于细胞培养的经细胞外基质包被的表面 |
CN103160468A (zh) * | 2011-12-19 | 2013-06-19 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 人肿瘤侵袭转移型类组织的体外三维模型及其构建和评价 |
CN104312975A (zh) * | 2014-09-25 | 2015-01-28 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 一种胶质瘤干细胞的体外三维培养模型及应用 |
WO2019025070A1 (en) * | 2017-07-31 | 2019-02-07 | Università Degli Studi Di Genova | THREE DIMENSIONAL HYDROGEL SCAFFOLD FOR CELL CULTURE AND METHOD OF PRODUCING THE SAME |
Non-Patent Citations (1)
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3D培养脑胶质瘤模型耐放射作用的机理研究;韩辉;《中国优秀硕士论文全文数据库,医药卫生科技辑》;20200415;第8、40-41页 * |
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