JP2006505248A - 幹細胞における分化を制御する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、幹細胞の分化を調節することができる、方法、培地および組成物を提供する。出願人は、リゾリン脂質受容体のアゴニストおよびクラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドは、幹細胞の自然分化防止に有用であることを発見した。該リガンドおよびアゴニストは、単独で使用してもよく、両者が相乗作用を有する場合、組み合せて使用してもよい。また、該方法および培地を使用して製造された細胞、ならびに本明細書に記載の組成物を使用して幹細胞関連疾患を治療する方法も提供する。幹細胞分化の調節に有用な他の作用物質を発見するのに有用な化合物を同定する方法も開示する。

Description

本発明は、幹細胞の自然分化を阻害する方法に関する。本発明は、未分化状態で幹細胞を増殖させるのに有用な培地、幹細胞分化を阻害するのに有用な作用物質を同定する方法、および幹細胞関連疾患を処置する方法にも関する。

概して、幹細胞は、一連の成熟機能細胞を生じさせることができる未分化の細胞である。たとえば、造血幹細胞は、様々なタイプの最終的に分化した血球のいずれかを生じさせることが可能である。胚性幹（ＥＳ）細胞は、胚に由来し、また多能性であるため、器官、細胞型または組織型に、あるいは、少なくとも潜在的に、完全な胚に発達できる能力を有する。ＥＳ細胞は、三胚葉（中胚葉、外胚葉、内胚葉）を代表する組織、および発生を支持する胚外組織に分化することができる能力を有する、胚盤胞の内部細胞塊に由来する可能性もある。

ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ細胞）は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性細胞系である。これらの細胞は、３つの胎芽胚葉（中胚葉、外胚葉、内胚葉）を代表する機能組織、および発達を維持する胚外組織に分化する能力を有する。これらの異なる細胞運命をもたらす能力を有するため、ｈＥＳ細胞は、さらなる治療効果の可能性が大いにあると考えられる。

しかし、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの定型的な培養中に、樹立したｈＥＳ細胞系は、自然に分化する傾向を有する。これらの細胞の多能性は、それらの未分化状態と関係があるため、この自然分化を制限する方法を発見することが望ましい。マウス胚性幹細胞で見られるものとは違って、白血病抑制因子（ＬＩＦ）は、ｈＥＳ細胞の自然分化を防止しない［１］。したがって、最適状態でｈＥＳ細胞を成長させ、次いで維持する一般的な方法は、高用量のウシ胎児血清を加えた培地中、一次マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）により構成される、支持細胞層上で培養することである。

しかし、血清は、ｈＥＳ細胞の成長および分化に悪影響を及ぼす可能性を有するかもしれない多種多様な生物学的に活性な化合物を含む。さらに、動物血清中で培養された細胞が、その後、ヒトでの移植または生物学的治療薬の製造に使用されるのであれば、バイオセーフティの問題がある。

こうした問題点に関して、また、ｈＥＳ細胞を成長させるための無血清培養システムを確立するためには、ｈＥＳ細胞の成長に及ぼす有益な影響に関与する血清中の具体的な因子を同定することが非常に重要である。このように、伝統的な培養システムに代わる手法、たとえば、ノックアウト血清代替（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）［２，３］等の血清代替培地の使用が望ましい。

スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）およびリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）は、活性化した血小板によって放出される、（それぞれ、１および５μＭまでの濃度で）血清中に存在する［４］、２つの小さい生理活性リゾリン脂質であり、発生上の三胚葉に由来する広範囲の細胞型に作用する。これらのリゾリン脂質の作用の多くは、以前に内皮分化遺伝子（Ｅｄｇ）受容体と名づけられた、特異的リゾリン脂質Ｇ−タンパク質結合受容体（ＬＰＬ受容体）が介在するように思われる。

これまでに、８つの異なる哺乳動物ＬＰＬ／Ｅｄｇ受容体が同定されている：Ｓ１Ｐ₁／Ｅｄｇ−１、Ｓ１Ｐ₂／Ｅｄｇ−５、Ｓ１Ｐ₃／Ｅｄｇ−３、Ｓ１Ｐ₄／Ｅｄｇ−６およびＳ１Ｐ₅／Ｅｄｇ８は、Ｓ１Ｐ特異的であるが、ＬＰＡ₁／Ｅｄｇ−２、ＬＰＡ₂／Ｅｄｇ−４およびＬＰＡ₃／Ｅｄｇ−７は、ＬＰＡ特異的である（総説に関しては、［５，６］参照）。これらの各受容体は、少なくとも１つのＧタンパク質に結合しており、特定の情報伝達経路を、活性化または阻害することができる。たとえば、これらの受容体は全て、Ｇ_i/oタンパク質に結合している（総説に関しては、［５，６］参照）。

これらのＧ_i/oタンパク質を著明に活性化することにより、Ｓ１ＰおよびＬＰＡは、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼファミリーのメンバーである、細胞外シグナル制御キナーゼ１および２（ＥＲＫ１／２）を刺激することができ、したがって、細胞増殖または分化等の、主要な細胞事象の制御に関与する。Ｓ１ＰおよびＬＰＡは、発達の非常に早い段階から、増殖、分化、死または遊走等の、多数の細胞事象に関与する強力な生物因子である（総説に関しては、［５］参照）。

ＳＩＰは、少なくともＳ１Ｐ₁およびＳ１Ｐ₂を介して、哺乳動物の血管形成を刺激する［７−１０］。したがって、Ｓ１Ｐ₁ノックアウトマウスは、血管成熟障害を示す。さらに、ゼブラフィッシュでは、正常な心臓発生にはＳ１Ｐが必要である［１１］。したがって、これらの動物では、Ｓ１Ｐ受容体Ｍｉｌ（哺乳動物のＳ１Ｐ₂受容体に非常によく似ている）をコード化する遺伝子ｍｉｌの突然変異は、心臓前駆細胞の遊走を障害する［１１］。

他方では、ＬＰＡは、主として神経形成に関与しているようである［１２］。たとえば、ＬＰＡは、たぶんＬＰＡ₂を介して、細胞周期形態学的変化および培養された皮質神経芽細胞の細胞遊走を刺激する。さらに、ＬＰＡは、たぶんＬＰＡ₂を介して、有糸分裂後ニューロンの、それらの最終目的地への遊走を制御する。最後に大切なことを言うが、ＬＰＡ₁ノックアウトマウスは、おそらく発生上の障害のため、異常な大脳皮質および嗅球を呈し、ＬＰＡ₁は、正常な脳の発生に不可欠であることがわかる［１３］。

血清の中で、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、多種の細胞の強力なマイトジェンとして広く記載されている主要なタンパク質成長因子である。ＰＤＧＦは、走化性、アクチン再編成を誘発し、またアポトーシスを防止することが証明されている。この成長因子は、異なるチロシンキナーゼ受容体ＰＤＧＦＲ−αおよびＰＤＧＦＲ−βを介して作用するポリペプチド鎖Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの二量体アイソフォームのファミリーに属する。

Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦは、生物学的応答を誘発する、さらなる作用も有する。したがって、Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦは、平滑筋細胞遊走、増殖および血管成熟を制御することが可能である。さらに、ホブソン（Ｈｏｂｓｏｎ）ら（２００１）およびローゼンフェルト（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ）ら（２００１）は、ＰＤＧＦで刺激された細胞運動は、ＨＥＫ２９３細胞およびＭＥＦでは、Ｓ１Ｐ₁依存的であることを示し［１４，１５］、クルク（Ｋｌｕｋ）ら（２００３）は、血管平滑筋およびＭＥＦでは、この作用がＳ１Ｐ₁と無関係であることを示した。［１６］。最後に重要なことを言うが、ＰＤＧＦは、酵素スフィンゴシンキナーゼを刺激することができ、これはＳ１Ｐ細胞内濃度［１７］の上昇、Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞［１７］および血管平滑筋細胞［１８］におけるＰＤＧＦ誘導性増殖の原因である作用を引き起こすと提唱されている。

文献、作用、材料、装置、物品等々に関する論考は、単に本発明の状況を提供するために、本明細書に含まれるに過ぎない。これらの事柄のいずれかまたは全ては、本出願の各クレームの優先日以前にオーストラリアに存在したため、先行技術の基礎の一部を形成したり、または本発明に関連する分野で共通の一般知識であったりすることを示唆または意味するものではない。

［発明の概要］
一態様において、本発明は、幹細胞の自然分化を調節する方法であって、ＬＰＬ受容体のアゴニストおよび／またはクラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドの存在下で、幹細胞をインキュベートするステップを含む方法を提供する。

別の態様において、本発明は、ＬＰＬ受容体のアゴニストおよび／またはクラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドを含む、幹細胞の自然分化を調節するために有用な、無血清または実質的に無血清の培地を提供する。

本発明の別の態様は、幹細胞分化の障害を治療または予防する方法であって、ＬＰＬ受容体のアゴニストおよび／またはクラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドを含有する組成物を、治療または予防を必要としている動物に投与するステップを含む、方法を提供する。

本発明の別の態様は、クラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体リガンドおよび／またはＬＰＬ受容体アゴニストを含む医薬組成物を提供する。

さらなる態様において、本発明は、幹細胞から増殖性未分化幹細胞集団を製造する方法であって、ＬＰＬ受容体のアゴニストおよび／またはクラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドの存在下で幹細胞をインキュベートするステップを含む方法を提供する。

別の態様において、本発明は、幹細胞から増殖性未分化幹細胞集団を製造する方法であって、ＬＰＬ受容体のアゴニストおよび／またはクラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドの存在下で、幹細胞をインキュベートするステップを含む方法を提供する。

［発明の説明］
本発明者は、培養中のｈＥＳ細胞の運命調節における、ＬＰＬ受容体アゴニストＳ１Ｐ、ジヒドロＳ１ＰおよびＬＰＡ、ならびにクラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンド、ＰＤＧＦの、役割を調査した。

本発明者は、ＬＰＬ受容体、ＰＤＧＦＲ−αおよびＰＤＧＦＲ−βの発現ならびにこれらのアゴニストによるＥＲＫ刺激により、ｈＥＳ細胞は、Ｓ１Ｐ、ジヒドロＳ１Ｐ、ＬＰＡおよびＰＤＧＦの標的細胞であることを立証した。さらに、本発明者は、Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦは、ｈＥＳ細胞の自然分化をわずかに阻害するが、Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦの両者とのコインキュベーションは、ｈＥＳ細胞の自然分化を強力に低減させることを発見した。これらの知見は、幹細胞および特にｈＥＳ細胞用の、無血清培地を確定する基礎となる。

本発明最初の説明および特許請求の範囲を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびこの単語の変形、たとえば「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」は、他の添加物、ステップ、または完全物（ｉｎｔｅｇｅｒ）を除外するつもりはない。

第１の態様において、本発明は、幹細胞の自然分化を調節する方法であって、ＬＰＬ受容体のアゴニストの存在下で幹細胞をインキュベートするステップを含む方法を提供する。

第２の態様において、本発明は、幹細胞の自然分化を調節する方法であって、クラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドの存在下で幹細胞をインキュベートするステップを含む方法を提供する。

第３の態様において、本発明は、幹細胞の自然分化を調節する方法であって、ＬＰＬ受容体のアゴニストおよびクラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドの存在下で幹細胞をインキュベートするステップを含む方法を提供する。

スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）は、ＬＰＬ受容体のアゴニストであり、細胞培養中の幹細胞表現型の自然消失を少なくとも部分的に阻害する能力を有する。本方法は、幹細胞の増殖能力に影響を及ぼさないことも分かっている。

好ましくは、該ＬＰＬ受容体は、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２およびＳ１Ｐ３からなる群より選択される。

本明細書で使用されるとき、用語「幹細胞の分化を調節する」は、細胞分化の阻害または増進を含む。本用語は、細胞分化の部分的な阻害または増進も含む。本方法の好ましい形態では、該調節は、分化の阻害である。

一般的に、該アゴニストは、リン脂質である。

本明細書で使用されるとき、用語「リン脂質」は、２つの脂肪酸部分に結び付いた主鎖およびリン酸基を含む分子を指す。脂肪酸分子が結び付いた主鎖は、多様であり、たとえば、グリセロールまたはスフィンゴシンに基づいていてもよい。一般的なリン脂質の線図を以下に示す。

用語「リゾリン脂質」は、脂肪酸鎖の１つが除去されているリン脂質分子を指す。脂肪酸鎖の除去は、ホスホリピダーゼＡ２等の酵素でリン脂質を処理することにより遂行することが可能である。

該リン脂質またはリゾリン脂質は、スフィンゴシン主鎖を有してもよく、特に、リゾリン脂質は、リン酸化アミノアルコールであってもよい。好ましくは、該アゴニストは、Ｓ１Ｐ、ジヒドロＳ１Ｐ、ＬＰＡ、ＰＡＦおよびＳＰＣまたはそれらの機能的同等物からなる群から選択される。

本発明の極めて好ましい形態において、該リゾリン脂質は、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）またはその機能的同等物である。Ｓ１Ｐは、活性化血小板により放出される、血清中に存在する小さい生物活性リン脂質であり、下記の構造を有する。

当業者は、リン脂質およびリゾリン脂質等の生物活性分子は、多数の方法で変えることができ、その後も生物学的活性を保持できることを理解するであろう。したがって、本発明の範囲は、ＬＰＬ受容体アゴニスト活性を保持する、リン脂質およびリゾリン脂質の変化形を含む。本発明の範囲は、ＬＰＬ受容体の合成ペプチド性アゴニストも含む。

当業者は、幹細胞の分化能力を調節する能力について、リン脂質またはリゾリン脂質をテストするために使用することができる方法に精通するであろう。適当な方法は、本明細書中に見つけられ、幹細胞特異的マーカーに向けられるＧＣＴＭ−２等の抗体との反応性、および光学顕微鏡法による細胞の単純な形態学的評価を包含する。

たとえば、ニューロン系統または内胚葉系統への幹細胞の分化に対するアゴニストの作用は、ＰＣＴ／ＡＵ０１／００２７８およびＰＣＴ／ＡＵ０１／００７３５で示されたような、マーカー発現の分析により研究することができる。

該リン脂質またはリゾリン脂質は、血清等の生物源から抽出することが可能である。加えて、マスト細胞および単球は、Ｓ１Ｐを産生することができ、脂肪細胞はＬＰＡを産生することができるが、ＬＰＡおよびＳ１Ｐの主なソースは、活性化血小板である。あるいは、リン脂質は、有機化学の分野で周知の手順で、合成することができる。

ＬＰＬ受容体アゴニストに暴露されていた細胞が、実質的に、増殖能力に悪影響を受けないことが好ましい。したがって、本明細書に記載の方法および組成物の利点は、多能性の損失を招かずに、ｈＥＳ細胞集団を拡大できることである。ｈＥＳ細胞の増殖能力を決定する方法は当業者に周知であり、本明細書に記載の細胞増殖マーカーＰＣＮＡの検出を含む。

一般に、該リガンドは、ＰＤＧＦまたはその機能的同等物である。

該チロシンキナーゼ受容体は、ＰＤＧＦＲ−αであってもよく、ＰＤＧＦＲ−βであってもよい。

好ましい実施形態において、該ＰＤＧＦは、２タイプの受容体に結合するＰＤＧＦａａ、ＰＤＧＦａｂまたはＰＤＧＦｂｂである。

該方法は、ＴＮＦα、ＮＧＦ（神経成長因子）、ムスカリン性アセチルコリンアゴニスト、血清またはホルボールエステル類（やはり、他の細胞型で、Ｓ１Ｐと相加作用または相乗作用を有する化合物である）の使用も含んでもよい。

該幹細胞は、胎児組織に由来しても、成体組織に由来してもよい。

該幹細胞は、一般的に、ＥＳ細胞である。好ましくは、該幹細胞は、ｈＥＳ細胞である。本明細書で使用されるとき、用語「胚性幹細胞」は、全三胚葉を代表する組織に分化することができる着床前発生期に由来する培養細胞系を意味する。

これらの細胞は以下の通りである：
−ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ １−６Ｏ、ＧＣＴＭ−２、アルカリホスファターゼおよびＯｃｔ−４を発現する。
−明確な細胞境界を有する扁平なコロニーとして増殖する。
−全三胚葉の派生物に分化する
−支持細胞依存的である（支持細胞からの培養上澄または支持細胞の細胞外マトリックスによって再構成されない、増殖に対する支持細胞効果）
−単独の細胞への分離に極めて敏感であり、および支持細胞層上であっても低いクローニング効率を示す
−白血病抑制因子に応答しない

第４の態様において、本発明は、ＬＰＬ受容体のアゴニストおよびクラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドを含む、ＬＰＬ受容体を有する幹細胞の自然分化を調節するために有用な無血清培地を提供する。

第５の態様で、本発明は、クラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドを含む、幹細胞の自然分化を調節するために有用な無血清培地を提供する。

該培地は、未分化状態でヒト胚性幹細胞等の幹細胞を増殖させるのに有用である。

一般的に、該リガンドは、ＰＤＧＦまたはその機能的同等物である。

該チロシンキナーゼ受容体は、ＰＤＧＦＲ−αであってもよく、ＰＤＧＦＲ−βであってもよい。

好ましい実施形態において、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦａａ、ＰＤＧＦａｂまたはＰＤＧＦｂｂである。

該培地は、ＴＮＦα、ＮＧＦ（神経成長因子）、ムスカリン性アセチルコリンアゴニスト、血清またはホルボールエステル類（やはり、Ｓ１Ｐと相加作用または相乗作用を有する化合物である）も含んでもよい。

一般に、アゴニストはリン脂質である。

好ましくは、該アゴニストは、Ｓ１Ｐ、ＬＰＡ、ＰＡＦ、ジヒドロＳ１ＰおよびＳＰＣまたはそれらの機能的同等物からなる群から選択される。

該幹細胞は、胎児組織に由来しても、成体組織に由来してもよい。

該幹細胞は、一般に胚性幹細胞である。

好ましくは、該幹細胞は胚組織由来である。

一般に、該幹細胞は、ヒト起源である。

基礎培地は、一般に、リン脂質およびリガンドならびに緩衝剤を加えた標準無血清培地である。適当な緩衝剤は、２ＳｍＭヘペス（Ｈｅｐｅｓ）である。

該培地は、多能性幹細胞の分化の阻害に役立つ。

該細胞培養培地は、ｈＥＳ細胞等の幹細胞の増殖および／または維持に有用な、当該技術分野で周知の基礎培地のいずれかを基礎としてもよい。このような培地としては、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ））、ノックアウト−ＤＭＥＭ（ＫＮＯＣＫＯＵＴ−ＤＭＥＭ）またはｈＥＳ培地等があるが、これらに限定されない。本発明の好ましい形態では、該培地は、インスリン、トランスフェリンおよびセレンを加えた、ＤＭＥＭを基礎とする。

培地中のＬＰＬアゴニストの最適濃度は、通常の実験で決定することができる。しかし、本発明の好ましい形態において、該アゴニストがＳ１Ｐである場合、該アゴニストは、０．１〜１０μＭの濃度で培地中に存在する。本発明の極めて好ましい形態において、該アゴニストは、約１０μＭの濃度で培地中に存在する。最適濃度は、アゴニストの種、培養される幹細胞系、使用する基礎培地、他の培養条件、たとえば温度、二酸化炭素濃度、および湿度を含む多数のパラメーターによって変化するであろうことが予期される。

培地中のリガンドの最適濃度は、通常の実験で決定することができる。しかし、本発明の好ましい形態において、該リガンドがＰＤＧＦａａ、ＰＤＧＦａｂまたはＰＤＧＦｂｂである場合、該リガンドは、１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在する。本発明の極めて好ましい形態において、該リガンドは、２０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在する。やはり、最適濃度は、アゴニストの種類、培養される幹細胞系、使用する基礎培地、他の培養条件、たとえば温度、二酸化炭素濃度、および湿度を含む多数のパラメーターによって変化するであろうことが予期される。

ｈＥＳ細胞を、支持細胞で培養することがしばしば必要であり、また本発明は、このような支持細胞の使用を含む方法を意図することを、当業者は理解する。アゴニストの濃度を、使用する支持細胞系に応じて最適化することも必要である。

第５の態様において、本発明は、本発明の細胞培養培地で増殖および／または維持された幹細胞を提供する。

本発明の細胞は、生物学および医学で多くの用途がある。多能性および不死という特性は、ＥＳ細胞に特有であり、研究者は、ヒト生物学および医学における多くの問題点に初めて取り組むことが可能になる。特に、どのような代替培養システムも、必要とする単分化能幹細胞の増殖を支援できない場合、ＥＳ細胞は、移植手順で使用するためのドナー組織の不足に潜在的に対処することができる。しかし、ヒト医学−基礎発生学的研究、機能的ゲノム学、成長因子および創薬、毒物学、および細胞移植におけるＥＳ細胞技術の広範囲にわたる潜在用途のほとんど全てが、増殖を高め、したがってＥＳ細胞を大規模で増殖して、遺伝子修飾をそれらに導入し、それらの分化を指令することが可能であるという仮説に基づいていることに注目すべきである。

本発明は、幹細胞から増殖性未分化幹細胞集団を製造する方法であって、ＬＰＬ受容体のアゴニストおよびクラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドの存在下で、幹細胞をインキュベートするステップを含む方法を提供する。

本発明は、幹細胞から増殖性未分化幹細胞集団を製造する方法であって、クラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドの存在下で幹細胞をインキュベートするステップを含む方法も提供する。

本発明は、さらに、幹細胞から増殖性未分化幹細胞集団を製造する方法であって、ＬＰＬ受容体のアゴニストの存在下で幹細胞をインキュベートするステップを含む方法を提供する。

したがって、これらの方法は、幹細胞集団の拡大を提供する。

本発明は、これらの方法の少なくとも１つによって産生される未分化幹細胞集団も提供する。

好ましくは、ＬＰＬ受容体は、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２およびＳ１Ｐ３からなる群から選択される。

一般に、アゴニストはリン脂質である。

好ましくは、該アゴニストは、Ｓ１Ｐ、ジヒドロＳ１Ｐ、ＬＰＡ、ＰＡＦおよびＳＰＣまたはそれらの機能的同等物からなる群から選択される。本発明の極めて好ましい形態において、該リゾリン脂質は、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）またはその機能的同等物である。

一般に、該リガンドは、ＰＤＧＦまたはその機能的同等物である。

該チロシンキナーゼ受容体は、ＰＤＧＦＲ−αであってもよく、ＰＤＧＦＲ−βであってもよい。

好ましい実施形態において、該ＰＤＧＦは、２タイプの受容体に結合するＰＤＧＦａａ、ＰＤＧＦａｂまたはＰＤＧＦｂｂである。

該リガンドは、ＴＮＦα、ＮＧＦ（神経成長因子）、ムスカリン性アセチルコリンアゴニスト、血清またはホルボールエステル類であってもよい。

該幹細胞は、胎児組織に由来しても、成体組織に由来してもよい。

該幹細胞は、一般にＥＳ細胞である。好ましくは、該幹細胞は、ｈＥＳ３０細胞である。

本発明のもう１つの態様は、ＬＰＬ受容体のアゴニストを含有する組成物を、それを必要としている動物に投与するステップを含む、幹細胞分化の障害を治療または予防する方法である。医薬組成物の調製方法は、米国ペンシルバニア州イーストンのマック・パブリッシング・カンパニー発行、レミントンの薬学、１８版（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳＡ、）（その内容を本明細書に援用する）等の教科書に記載の通り、当該技術分野で周知である。

本発明は、ＬＰＬ受容体のアゴニストを含有する組成物を、それを必要としている動物に投与するステップを含む、幹細胞分化の障害を治療または予防する方法も提供する。

本発明は、クラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドを含有する組成物を、それを必要としている動物に投与するステップを含む、幹細胞分化の障害を治療または予防する方法も提供する。

本発明のもう１つの態様は、ＬＰＬ受容体のアゴニストおよびクラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドを含有する組成物を、それを必要としている動物に投与するステップを含む、幹細胞分化の障害を治療または予防する方法である。

本発明は、本明細書に記載の幹細胞を投与するステップを含む、幹細胞分化の障害を治療または予防する方法も提供する。幹細胞分化の障害は、当業者に周知であり、下記を含むが、下記に限定されない：
急性白血病
急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）
急性混合型白血病
急性未分化白血病
慢性白血病
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）
若年性慢性骨髄性白血病（ＪＣＭＬ）
若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）
骨髄異形成症候群
不応性貧血（ＲＡ）
環状鉄芽球を伴う不応性貧血（ＰＡＲＳ）
芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ）
移行期にある芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ−Ｔ）
慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）
幹細胞障害
再生不良性貧血（重症）
ファンコニ貧血
発作性の夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）
赤芽球癆
骨髄増殖性疾患
急性骨髄線維症
特発性骨髄様化生（骨髄線維症）
真性赤血球増加症
本態性血小板血症
リンパ球増殖性疾患
非ホジキンリンパ腫
ホジキン病
食細胞障害
チェディアック・東症候群
慢性肉芽種症
好中球アクチン欠乏症
細網異形成症
先天性代謝異常症
ムコ多糖症（ＭＰＳ）
ハーラー症候群（ＭＰＳ−ＩＨ）
シェイエ症候群（ＭＰＳ−ＩＳ）
ハンター症候群（ＭＰＳ−ＩＩ）
サンフィリポ症候群（ＭＰＳ−１１１）
モルキオ症候群（ＭＰＳ−ＩＶ）
マロトー・ラミー（Ｍａｒｏｔｅａｕｘ−Ｌａｍｙ）症候群（ＭＰＳ−ＶＩ）
スライ（Ｓｌｙ）症候群、β−グルクロニダーゼ欠乏症（ＭＰＳ−ＶＩＩ）
副腎白質萎縮症
ムコリピドーシスＩＩ（Ｉ細胞病）
クラッベ病
ゴーシェ病
ニーマンピック病
ウォルマン病
異染性白質ジストロフィー
組織球症
家族性赤血球貪食性リンパ組織球増多症
組織球症−Ｘ
血球貪食
先天性赤血球異常症
βサラセミア
鎌形赤血球症
先天性免疫系障害
運動失調−末梢血管拡張
コストマン（Ｋｏｓｔｍａｎｎ）症候群
白血球粘着不全症
ディジョージ症候群
裸リンパ球症候群
オメン症候群
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）
アデノシンデアミナーゼ欠乏症を伴うＳＣＩＤ
Ｔ＆Ｂ細胞欠損ＳＣＩＤ（Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｔ ＆ Ｂ Ｃｅｌｌ ＳＣＩＤ）
Ｔ細胞欠損、正常Ｂ細胞ＳＣＩＤ（Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌｓ，Ｎｏｒｍａｌ Ｂ Ｃｅｌｌ ＳＣＩＤ）
分類不能原発性免疫不全症
ウィスコット・アルドリッチ（Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ）症候群
Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患
他の先天性疾患
レッシュ・ナイハン（Ｌｅｓｃｈ−Ｎｙｈａｎ）症候群
軟骨異形成症（Ｃａｒｔｉｌａｇｅ−Ｈａｉｒ Ｈｙｐｏｐｌａｓｉａ）
グランズマン血小板無力症
大理石骨病
先天性血小板異常
無巨核球症／先天的血小板減少症
形質細胞疾患
多発性骨髄腫
形質細胞白血病
ワルデンストレーム（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ）マクログロブリン血症
他の悪性腫瘍
乳癌
ユーイング（Ｅｗｉｎｇ）肉腫
神経芽細胞腫
腎細胞癌

このように、本明細書に記載の組成物の投与によるか、本明細書に記載の方法で産生された幹細胞集団を投与することにより、幹細胞関連疾患を有する患者を治療するために、本発明を使用することが可能である。

該用物質は、一般にリン脂質である。該リン脂質は、リゾリン脂質であってもよく、またスフィンゴシン主鎖を有してもよい。好ましくは、該アゴニストは、Ｓ１Ｐ、ジヒドロＳ１Ｐ、ＬＰＡ、ＰＡＦおよびＳＰＣまたはそれらの機能的同等物からなる群から選択される。Ｓ１ＰおよびジヒドロＳ１Ｐは、ＳＰＣと同様に、スフィンゴシン主鎖を有するリゾリン脂質であり、ＬＰＡはグリセロール主鎖を有するリゾリン脂質であり、ＰＡＦは、グリセロール主鎖を有するリン脂質である。

該チロシンキナーゼ受容体は、ＰＤＧＦＲ−αであっても、ＰＤＧＦＲ−βであってもよく、リガンドは、ＰＤＧＦまたはその機能的同等物であってもよい。

好ましい実施形態において、該ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦａａ、ＰＤＧＦａｂまたはＰＤＧＦｂｂである。

該方法は、ＴＮＦα、ＮＧＦ（神経成長因子）、ムスカリン性アセチルコリンアゴニスト、血清またはホルボールエステル類（やはり、他の細胞型で、Ｓ１Ｐと相加作用または相乗作用を有する化合物である）の使用も含んでもよい。

クラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体リガンドおよびＬＰＬ受容体アゴニストを含む医薬組成物も提供する。該組成物は、ＴＮＦα、ＮＧＦ（神経成長因子）、ムスカリン性アセチルコリンアゴニスト、血清またはホルボールエステル類（やはり、他の細胞型で、Ｓ１Ｐと相加作用または相乗作用を有する化合物である）の使用も含んでもよい。

当業者は、該アゴニストの調合物および剤形も提供することができるであろう。さらに、所与の臨床症状に最適な投与量は、通常の実験で決定できるであろう。

該組成物は、非経口的に投与することが可能である。非経口的投与用には、該アゴニストおよび／またはリガンドは、無菌の水性媒体または有機媒体と混合して、注射可能な溶液または懸濁液を形成することができる。次いで、この方法で調製した注射可能な溶液を、静脈内、腹腔内、皮下、または筋内に注射することができる。さらなる投与方法としては、当業者に一般に知られている方法により、局所、舌下、肛門および膣の投与方法などが可能であるが、この限りではない。

医薬組成物の調製に使用するアゴニストまたはリガンドの量は、治療する状態の重症度および投与経路を考慮に入れて、当該技術分野で周知の原則に従って変えるべきである。概して、このような医薬組成物は、温血動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトに投与されるのであろうから、有効量を、通常は、１回でまたは分割して投与される日用量を、受ける。投与量は、治療する状態または疾患、患者の特徴および使用される剤形または調合物を含む、多数の因子によって異なる。このような偏差は、本発明の範囲内である。

医薬組成物を調製するのに適当な薬学的に許容し得る担体は、不活性な固体賦形剤または希釈剤および無菌の水性溶液または有機溶液である。アンタゴニストおよび／またはリガンドは、上述の範囲による所望の投与量を提供するのに十分な量で、このような医薬組成物中に存在する。したがって、経口投与用には、該アゴニストおよび／またはリガンドは、適当な固体または液体担体あるいは希釈剤と混合して、カプセル剤、錠剤、粉剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤等々を形成することが可能である。該医薬組成物は、必要に応じて、香味料、甘味料、賦形剤等々の、さらなる成分を含有してもよい。制御放出性、徐放性、および遅延放出性の経口または非経口組成物を使用することが可能である。

錠剤、ピル剤、カプセル剤等々は、トラガカント、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチン等の１種以上の結合剤；第二リン酸カルシウム等の１種以上の賦形剤；コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、アルギン酸等の１種以上の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等１種以上の滑沢剤；およびショ糖、乳糖またはサッカリン等の甘味料も含有してもよい。投薬量単位剤形がカプセル剤、たとえばゲルカプセル剤であるとき、上記のタイプの材料のほかにもまたは代わりに、脂肪グリセリドまたは脂肪グリセリド類の混合物等の液体担体を含有してもよい。剤形は、経口懸濁液も包含してもよい。

コーティングとして、または投薬量単位の物理的形態をいくぶん変えるために、様々な他の材料が存在してもよい。たとえば、錠剤は、セラック、糖または両者で被覆されていてもよい。シロップ剤またはエレキシル剤は、有効成分に加えて、甘味料としてのショ糖、保存料としてのメチルパラベンおよびプロピルパラベン、チェリー風味オレンジ風味等の色素および香味料も含有してもよい。

注射可能な用途に適当な剤形としては、無菌の溶液または分散液、および無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製用無菌粉末などがある。いかなる場合でも、該剤形は、注射器内に組み入れ、それから注射できるほど十分に流動的でなければならず、また製造条件および貯蔵条件で、実質的に安定していなければならない。加えて、該剤形は、実質的に無菌でなければならず、また、細菌および真菌等の微生物の汚染から守って保存しなければならない。滅菌は、微生物リテーニングフィルターによる濾過により、組成物中への滅菌剤の組み入れにより、あるいは照射または加熱が適切で且つ当該調合物と相容れる場合、組成物を照射または加熱することにより、達成することが可能である。

さらなる剤形としては、坐剤、舌下錠剤、局所用剤形等々があり、これらは、当業者に一般に知られている方法により、調製することが可能である。

本発明は、リゾリン脂質（ＬＰＬ）受容体およびＰＤＧＦ受容体を有する幹細胞の自然分化を調節するために、ＬＰＬ受容体のアゴニストおよびクラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドの使用を提供する。

本発明は、また、幹細胞の自然分化の調節に、クラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドの使用を提供する。

本発明は、さらに、リゾリン脂質（ＬＰＬ）受容体を有する幹細胞の自然分化を調節するために、ＬＰＬ受容体のアゴニストの使用を提供する。

好ましくは、該ＬＰＬ受容体は、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２およびＳ１Ｐ３からなる群から選択される。

一般に、アゴニストはリン脂質である。該リン脂質またはリゾリン脂質は、スフィンゴシン主鎖を有してもよく、特に、該リゾリン脂質は、リン酸化アミノアルコールであってもよい。好ましくは、該アゴニストは、Ｓ１Ｐ、ジヒドロＳ１Ｐ、ＬＰＡ、ＰＡＦおよびＳＰＣまたはそれらの機能的同等物からなる群から選択される。本発明の極めて好ましい形態において、該リゾリン脂質は、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）またはその機能的同等物である。

一般に、該リガンドは、ＰＤＧＦまたはその機能的同等物である。

該チロシンキナーゼ受容体は、ＰＤＧＦＲ−αであってもよく、ＰＤＧＦＲ−βであってもよい。

好ましい実施形態において、該ＰＤＧＦは、２タイプの受容体に結合する、ＰＤＧＦａａ、ＰＤＧＦａｂまたはＰＤＧＦｂｂである。

他の細胞型で、Ｓ１Ｐと相加作用または相乗作用を有する化合物として、ＴＮＦα、ＮＧＦ（神経成長因子）、ムスカリン性アセチルコリンアゴニスト、血清またはホルボールエステル類を、使用してもよい。

該幹細胞は、胎児組織に由来しても、成体組織に由来してもよい。

該幹細胞は、一般にＥＳ細胞である。好ましくは、該幹細胞は、ｈＥＳ細胞である。

本発明は、幹細胞から増殖性未分化幹細胞集団を製造する際に、ＬＰＬ受容体のアゴニストおよびクラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドの使用を提供する。

本発明は、また、幹細胞から増殖性未分化幹細胞集団を製造する際に、クラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドの使用を提供する。

本発明は、さらに、幹細胞から増殖性未分化幹細胞集団を製造する際に、ｏｆａｎＬＰＬ受容体のアゴニストの方法の使用を提供する。

好ましくは、該ＬＰＬ受容体は、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２およびＳ１Ｐ３からなる群から選択される。

一般に、アゴニストはリン脂質である。

好ましくは、該アゴニストは、Ｓ１Ｐ、ジヒドロＳ１Ｐ、ＬＰＡ、ＰＡＦおよびＳＰＣまたはそれらの機能的同等物からなる群から選択される。本発明の極めて好ましい形態において、該リゾリン脂質は、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）またはその機能的同等物である。

一般に、該リガンドは、ＰＤＧＦまたはその機能的同等物である。

該チロシンキナーゼ受容体は、ＰＤＧＦＲ−αであってもよく、ＰＤＧＦＲ−βであってもよい。

好ましい実施形態において、該ＰＤＧＦは、２タイプの受容体に結合する、ＰＤＧＦａａ、ＰＤＧＦａｂまたはＰＤＧＦｂｂである。

該リガンドは、また、ＴＮＦα、ＮＧＦ（神経成長因子）、ムスカリン性アセチルコリンアゴニスト、血清またはホルボールエステル類であってもよい。

該幹細胞は、胎児組織に由来しても、成体組織に由来してもよい。

該幹細胞は、一般にＥＳ細胞である。好ましくは、該幹細胞は、ｈＥＳ細胞である。

本発明のもう１つの態様は、幹細胞分化の障害を治療または予防する方法における、ＬＰＬ受容体のアゴニストおよびクラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドを含有する組成物の使用である。

本発明は、また、幹細胞分化の障害を治療または予防する方法において、クラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドを含有する組成物の使用を提供する。

該アゴニストは、一般にリン脂質である。該リン脂質は、リゾリン脂質であってもよく、またスフィンゴシン主鎖を有してもよい。好ましくは、該アゴニストは、Ｓ１Ｐ、ジヒドロＳ１Ｐ、ＬＰＡ、ＰＡＦおよびＳＰＣからなる群から選択される。Ｓ１ＰおよびジヒドロＳ１Ｐは、ＳＰＣと同様、スフィンゴシン主鎖を有するリゾリン脂質であり、ＬＰＡは、グリセロール主鎖を有するリゾリン脂質であり、ＰＡＦは、グリセロール主鎖を有するリン脂質である。

該チロシンキナーゼ受容体は、ＰＤＧＦＲ−αであっても、ＰＤＧＦＲ−βであってもよく、また該リガンドは、ＰＤＧＦまたはその機能的同等物であってもよい。

好ましい実施形態において、該ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦａａ、ＰＤＧＦａｂまたはＰＤＧＦｂｂである。

該方法は、ＴＮＦα、ＮＧＦ（神経成長因子）、ムスカリン性アセチルコリンアゴニスト、血清またはホルボールエステル類（他の細胞で、やはり、Ｓ１Ｐと相加作用または相乗作用を有する化合物である）の使用も含んでもよい。

略語
ｄＨ−Ｓ１Ｐ：ジヒドロ−スフィンゴシン−１−リン酸；ＥＤＧ：内皮分化遺伝子；ＥＲＫ：細胞外シグナル制御キナーゼ；ＭＡＰキナーゼ：マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ；ＭＥＦ：マウス胚線維芽細胞；ｈＥＳ細胞：ヒト胚性幹細胞；ＬＰＡ：リゾホスファチジン酸；ＬＰＬ：リゾリン脂質；ＰＡＦ：血小板活性化因子；ＰＣＮＡ：増殖性細胞核抗原；ＰＤＧＦ：血小板由来成長因子；ＰＤＧＦＲ：血小板由来成長因子受容体；Ｓ１Ｐ：スフィンゴシン−１−リン酸；ＳＰＣ：スフィンゴシルホスホリルコリン；ＳＰＫ：スフィンゴシンキナーゼ。

次に、下記の非限定的な実施例を参考にしながら、本発明をさらに十分に説明する。

本発明を実行する最良の方法および他の方法
実施例１
＜細胞培養＞
ｈＥＳ−３細胞は、既述¹のとおりに培養した。該無血清培地は、インスリン／トランスフェリン／セレンを１％、β−メルカプトエタノールを０．１ｍＭ、ＮＥＡＡを１％、グルタミンを２ｍＭ、ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）を２５ｍＭ、ペニシリンを５０Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシンを５０ｍｇ／ｍｌ（全てインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手）加えたＤＭＥＭ（ピルビン酸ナトリウムを含まない、グルコース４５００ｍｇ／ｌ、オーストラリア、ビクトリー州のマウント・ウェーバリーにあるインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍｏｕｎｔ Ｗａｖｅｒｌｅｙ，ＶＩＣ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ））で構成されていた。培地は２日ごとに交換し、細胞は、毎週継代した。Ｓ１Ｐおよびジヒドロ−Ｓ１Ｐは、バイオモール（Ｂｉｏｍｏｌ）（米国ペンシルバニア州プリマス・ミーティング（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ，ＵＳＡ））から入手し、メタノールに溶解した。ＬＰＡは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（オーストラリアのニューサウスウェールズ州キャッスル・ヒル（Ｃａｓｔｌｅ Ｈｉｌｌ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ））から入手し、エタノールに溶解した。全ての脂質の即時希釈液は、０．１％無脂肪酸ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含有する水で作った。ヒトＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢは、プレプロテック・インコーポレーティッド（ＰｒｅｐｒｏＴｅｃｈ Ｉｎｃ．）（米国ニュージャージー州ロッキー・ヒル（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ））から入手した。

ＲＴ−ＰＣＲ実験。
既述¹のとおりに、総ＲＮＡをｈＥＳ細胞から抽出し、逆転写（ＲＴ）した。マウス（データ示さず）またはヒトＤＮＡ標的配列（表１）の特異的検出用に設計されたセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を用いたＰＣＲで、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（オーストラリアのウエスタン・オーストラリア州パースにある、バイオテック・インターナショナル・リミテッド（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ．，Ｐｅｒｔｈ，ＷＡ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して、既述¹⁸のとおりに、ｃＤＮＡサンプルを増幅した。特異的増幅ＤＮＡ断片を、１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動で、大きさに従って分け、エチジウムで染色した。分子サイズ（ｂｐ）は、１ｋｂプラスＤＮＡラダーマーカー（Ｍ）を使用して算出した。アンプリコンを精製し、配列決定した。実験は、ｈＥＳ−２およびｈＥＳ−３を用いて実施した。

＜免疫蛍光測定法＞
幾つかの実験では、ＭＥＦとともに、またはＭＥＦなしで、８ウェル・チャンバスライド上にプレーティングしたｈＥＳ−３細胞を、プレーティングの翌日に、エタノールまたはパラホルムアルデヒド（ＰＤＧＦＲの場合）で固定した。その他では、単層培養を得るために、ｈＥＳ−３細胞を機械的に分離し、次いで、ＭＥＦなしで、８ウェル・チャンバスライド上にプレーティングし、最初の処理の４日後に、エタノールで固定した。下記の抗体：抗ヒトＰＤＧＦＲ−αまたはＰＤＧＦＲ−β（ＲアンドＤ・システムズ・インコポレーティッド（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．））、ＧＣＴＭ−２、および／またはＰＣＮＡ（オーストラリア、ビクトリア州のボロニアにあるケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｂｏｒｏｎｉａ，ＶＩＣ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ））、ＴＲＡ−１−６０、Ｏｃｔ−４を使用して、免疫染色を実施した。核は、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）−３３３４２により、明白に示された。スライドを載せ、Ｘ１０、Ｘ２０およびＸ４０で、ライカ（Ｌｅｉｃａ）顕微鏡を用いて、蛍光顕微鏡法で観察した。ネガティブコントロールに染色が存在しないことにより、特異性が確認された。一部の実験では、包括的な+集団内の、ＧＣＴＭ−２陽性（ＧＣＴＭ２＋）、ＰＣＮＡ陽性（ＰＣＮＡ＋）およびＧＣＴＭ２＋／ＰＣＮＡ＋細胞の比率を決定するために、細胞を計数した。

＜ＧＣＴＭ−２定量化＞
ＭＥＦとともにプレーティングしたｈＥＳ−３細胞を、エタノールで固定し、ＧＣＴＭ−２で、次いで、アルカリホスファターゼ結合二次抗体（ダコ（Ｄａｋｏ））で、免疫染色した。アルカリホスファターゼの活性は、リン酸４−ニトロフェニル（ドイツ、マンハイムにあるロシュ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ））の溶液を加え、次いで４０５ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を読み取ることにより、検出した。該技術を、ＧＣＴＭ−２陽性細胞の比率の適切な指標として検証するために、ＧＣＴＭ−２を発現することが知られている、奇形癌細胞系ＧＣＴ２７Ｃ４を用いて、検量線を作成した。これは、細胞数と４０５ｎｍで読み取ったＯＤとの間で、線形相関を示した（データ示さず）。

＜ウエスタンブロット・分析＞
２４時間、ＭＥＦなしでプレーティングしたｈＥＳ−３細胞は、さらに１８時間、血清が枯渇していた。Ｕ０１２６（シグマ（Ｓｉｇｍａ），３０μＭ，１時間）で前処理した細胞、または前処理していない細胞を、異なる試薬の存在下で５分間インキュベートし、上澄の除去および１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含有する還元性ローディングバッファーの添加により溶解した。タンパク溶解物（約８０μｇ）を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％ポリアクリルアミド、ｗ／ｖ）で分離し、ニトロセルロース（アマシャム、ハイボンド・ニトロセルロース（Ｈｙｂｏｎｄ−ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ））に移し、二重リン酸化ＭＡＰＫペプチド（米国ウィスコンシン州マジソンにあるプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ））に対して生じさせたウサギポリクローナル抗活性マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰＫ）抗体を使用して、免疫ブロットを実施した。ペルオキシダーゼ結合二次抗体（ダコ（Ｄａｋｏ））は、化学発光検出試薬（アマシャムのＥＬＣ（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ））の存在下、オートラジオグラフィー用フィルムの露光により検出した。抗体を剥離し、次いで、ウサギポリクローナル抗ＥＲＫ１／２抗体（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））で、次にペルオキシダーゼ結合二次抗体（ダコ（Ｄａｋｏ））で、膜をリプローブした。ウサギポリクローナル抗活性ｐ３８（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））またはウサギポリクローナル抗活性ＪＮＫ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））抗体でプローブした膜も、上述と同じ手順を使用して実施した。

＜タンパク質定量化＞
ｈＥＳ−３細胞を溶解し、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）色素結合テストに基づく比色アッセイ（オーストラリア、ニューサウスウェールズ州のリエージェンツ・パークにあるバイオ・ラド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｅｇｅｎｔｓ Ｐａｒｋ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ））を使用して、タンパク質の量を決定した。

＜統計解析＞
各セットの実験は、少なくとも３回実施した（ｎは、異なる細胞培養で実施した、独立した実験の数を指す）。データは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。差の有意性は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてスチューデント・ニューマン・クールズ検定法（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ Ｋｅｕｌｓ ｔｅｓｔ）を使用することにより、評価した。Ｐ＜０．０５という値を有意であると考え、それぞれ＊で示した。

＜結果＞
ｈＥＳ細胞（図１Ａ）は、３つのＳ１Ｐ受容体：Ｓ１Ｐ₁、Ｓ１Ｐ₂およびＳ１Ｐ₃、ならびにＬＰＡ受容体：ＬＰＡ₁、ＬＰＡ₂およびＬＰＡ３（図１Ｂ）のそれぞれに関するｍＲＮＡ転写物を発現したが、これらの細胞は、Ｓ１Ｐ₄およびＳ１Ｐ₅に関するｍＲＮＡを発現しなかった（データ示さず）。免疫染色で明らかにされるとおり、ｈＥＳ細胞は、ＰＤＧＦＲ−α（図１Ｃ）およびＰＤＧＦＲ−β（図１Ｃ）に関するｍＲＮＡ転写物、ならびに対応するタンパク質も発現した（図１Ｅ−Ｊ）。ＭＥＦは、Ｓ１Ｐ₁、Ｓ１Ｐ₂、Ｓ１Ｐ₃、ＬＰＡ₁およびＬＰＡ₂、ＰＤＧＦＲ−αおよびＰＤＧＦＲ−βを発現したが、他者^1-6により以前に明らかにされているとおり、Ｓ１Ｐ₄もＳ１Ｐ₅もＬＰＡ₃も発現しなかった（データ示さず）。ＭＡＰキナーゼＥＲＫは、細胞増殖および分化に関与するため、我々は、ｈＥＳ細胞におけるそれらの活性化に対するＳ１Ｐ、ＬＰＡおよびＰＤＧＦ−ＡＢ（ＰＤＧＦ）の作用を試験した。５分後、Ｓ１Ｐ、ＬＰＡおよびＰＤＧＦは、ＭＥＫインヒビターＵ０１２６（３０μＭ）の存在下で完全に阻害された作用（図１Ｋ）である、ｈＥＳ細胞におけるＥＲＫのリン酸化を、刺激した（図１Ｋ）。

次に、Ｓ１Ｐ、ＬＰＡおよびＰＤＧＦが、ｈＥＳ細胞の運命を調節できるかどうかを試験した。ｈＥＳ細胞は、無血清培地中、ＭＥＦ上で増殖させたとき、自然に分化した。図２に示すとおり、このような条件で８日後（対照）、コロニーは、血清の除去前に観察されたものより大きく（図２Ａ）、またｈＥＳ細胞は、異なる種類の細胞を生じさせた（図２Ｂ）。８日後、ＬＰＡ（５０μＭまで）は、形態学によって確認されるとおり、コロニーの成長に対して明白な作用を示さなかった（データ示さず）が、Ｓ１Ｐ（１０μＭ）またはＰＤＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、コロニーは、対照条件に比べて、より扁平で、かつあまり分化していないようであった（図２Ｃ，２Ｄ）。そこで、処理の８日後、アルカリホスファターゼの活性を測定することにより、細胞のＧＣＴＭ−２レベルを定量化したとき、Ｓ１ＰまたはＰＤＧＦで処理した細胞は、対照細胞より、ＧＣＭＴ２＋が、それぞれ、１６．６±４．１％（ｎ＝７）および１６．６±７．０％（ｎ＝７）多かった（図２Ｆ）。特筆すべきは、Ｓ１Ｐ（１０μＭ）およびＰＤＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）の両者との共インキュベーションにより、一方または他方の作用物質の存在下では見られない自然分化の強い阻害を引き起こし（図２Ｅ）、対照細胞の場合より、ＧＣＴＭ２＋細胞のパーセンテージが４０．１±７．５％（ｎ＝７）高かった（図２Ｆ）。ＧＣＴＭ−２は幹細胞マーカーであるため、これらの結果から、無血清培地中でＰＤＧＦおよびＳ１Ｐを合わせることにより、ｈＥＳ細胞の自然分化を強く防止することが示唆される。

ｈＥＳ細胞に対するＳ１ＰおよびＰＤＧＦの作用を確認するために、我々は、１）細胞を機械的に分離してからプレーティングすること、および２）ＭＥＦおよび血清の非存在下で増殖させることによって、細胞を強制的に分化させる実験を実施した。Ｓ１Ｐまたは／およびＰＤＧＦを培地に加え、それらが分化および増殖に及ぼす作用を、増殖のマーカーであるＰＣＮＡ、およびＧＣＴＭ−２で細胞を免疫染色することによって定量化した（図３）。血清を含まない培地中で４日後、対照細胞の大部分は分化しており、ＧＣＴＭ２＋細胞は、わずか３０．８±７．７％（ｎ＝１３）であった（図３Ａ）。それに反して、Ｓ１Ｐ（１０μＭ）またはＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかを培地に加えたとき、それぞれ、細胞の４７．９±３．８％（ｎ＝１３）または５３．７±１３．２％（ｎ＝３）がＧＣＴＭ２＋であり、また、Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦの両者が存在する場合には、細胞の５３．７±３．５％（ｎ＝３）がＧＣＴＭ２＋であった。ｈＥＳ細胞集団内で、大部分がＰＣＮＡを発現し、これらの幹細胞の大半が依然として増殖していたことが分かる（図３Ｂ）。しかし、対照細胞とＳ１Ｐまたは／およびＰＤＧＦで処理した細胞との間で、ｈＥＳ細胞の増殖速度に統計学的有意差はなかった（図３Ｂ）。結局、これらのデータから、Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦは、ｈＥＳ細胞の増殖期よりむしろ、血清の非存在下で増殖したｈＥＳ細胞の分化に主に作用することが示唆される。さらに、ｈＥＳ細胞は、ＭＥＦの非存在下で培養されたため、これらの実験は、Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦが、ｈＥＳ細胞を直接標的にできることを明白に示す。

我々は、次に、Ｓ１Ｐの受容体依存的作用を模倣することしかできないＳ１Ｐ類縁体である、ジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸（ジヒドロ−Ｓ１Ｐ、１０μＭ）の作用を調査した。細胞のＧＣＴＭ２レベルを測定することにより、我々は、Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦの存在下でみられる作用は、ジヒドロ−Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦによって模倣され（対照の１２５．７±９．７％（ｎ＝３））、Ｓ１Ｐの作用は、受容体依存的であることを示す（図２Ｆ）ことを証明した。次いで、我々は、ｈＥＳ細胞の自然分化の阻害に際して、ＰＤＧＦのどのアイソフォームが最強であるかを調査した。Ｓ１Ｐとともに添加したとき、アイソフォームＢＢが最も強く（対照の１８２．０±２６．０％（ｎ＝２））、その後にＡＢが続き（対照の１２５．７±９．７％（ｎ＝３））、ＡＡは僅かな作用しか引き起こさなかった（対照の１２０．５±４．５％（ｎ＝２））５（図２Ｆ）。

＜継代＞
該ｈＥＳ細胞は、血清を含まない、ＰＤＧＦおよびＳ１Ｐで、少なくとも１８継代、首尾よく継代されていた。１３継代後、細胞は、幹細胞マーカーＧＣＴＭ−２、Ｏｃｔ−４およびＴＧ３０に関して、陽性に染色した。７継代後、細胞は、ＳＰＫ１およびＳＰＫ２に関するｍＲＮＡを発現し、酵素ならびに幹細胞マーカーＯｃｔ−４、およびクリプト（Ｃｒｙｐｔｏ）の確かな発現を示した。８継代後、ＰＤＧＦおよびＳ１Ｐを含む無血清条件で培養したとき、これらの細胞は、正常な核型を維持することを証明するために、ｈＥＳ細胞の核型分析を実行する。

＜考察＞
ｈＥＳ細胞は、培養中に自然に分化する（それらの多能性の損失につながる現象）ため、この分化を防止することができる化合物の同定は、特に興味深い。この研究で、我々は、ｈＥＳ細胞が、Ｓ１Ｐ、ＬＰＡおよびＰＤＧＦの標的であることを初めて記述した。

ＲＴ−ＰＣＲ分析で明らかにされるとおり、これらの細胞は、受容体Ｓ１Ｐ₁、Ｓ１Ｐ₂、Ｓ１Ｐ₃、ＬＰＡ₁、ＬＰＡ₂およびＬＰＡ₃に関するｍＲＮＡを発現する。齧歯類またはヒトで実施された研究を参考にすると、これらの受容体は体内で広く発現される（総説に関しては、^9,10参照）。これらの細胞でＳ１Ｐ₄およびＳ１Ｐ₅が発現しないことは、これらの受容体が、高度に分化した組織で主に発現すること、たとえば、Ｓ１Ｐ₄およびＳ１Ｐ₅の場合はリンパ球系組織で、Ｓ１Ｐ₅の場合は脳の白色で¹²、主に発現することと一致している。さらに、ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫染色で明らかにされるとおり、ｈＥＳ細胞は、ＰＤＧＦ受容体αおよびβを発現する。ｈＥＳ細胞では、ＰＤＧＦおよびＳ１Ｐの両者を添加することにより、自然分化が非常に強く阻害され、これらの２つの分子がクロストークすることが示唆される。これらの複合作用は、１）線維芽細胞¹⁴および他の細胞型^15,16で示されたとおり、ＰＤＧＦは、細胞内Ｓ１Ｐの形成を刺激し、次いで、これが、たとえば、カルシウムホメオスタシスの制御¹³およびアポトーシスの抑制において、第２のメッセンジャーの役割を果たすのであろうが、今まで、Ｓ１Ｐの細胞内標的は不明のままであったこと；２）Ｓ１Ｐは、その受容体を介して細胞外に作用し、したがって、細胞増殖に関与する、ＭＡＰキナーゼ等の、異なる細胞内情報伝達経路を活性化すること、に起因する可能性がある。細胞内Ｓ１Ｐおよび細胞外Ｓ１Ｐの両者の存在は、Ｓ１ＰまたはＰＤＧＦの存在下で見られるものより強い分化阻害につながる可能性がある。また、両分子が存在することを必要とする、ＰＤＧＦシグナルとＳ１Ｐシグナルとの間の新たな架橋も報告されている。このようなメカニズムは、最近、カツマ（Ｋａｔｓｕｍａ）ら（２００２）により、メサンギウム細胞で、初めて記述された。

他者により明らかにされたとおり、Ｓ１Ｐ、ＬＰＡおよびＰＤＧＦ受容体は、ＭＥＦ⁷で発現され、これらの分子は、多数の情報伝達経路を制御することができる。そこで、イシイら（２００１）は、これらの細胞において、Ｓ１Ｐは、ホスホリパーゼＣを活性化し、ｃＡＭＰの産生を阻害し、Ｒｈｏを活性化する⁷ことを示した。ＭＥＦでは、ＰＤＧＦは遊走を刺激する。ＰＤＧＦおよびＳ１Ｐの存在下でみられる、ｈＥＳ細胞に対する作用は、ある程度、ＭＥＦを介した作用に起因する可能性がある。

Ｓ１Ｐ、ＬＰＡおよびＰＤＧＦは全て、ウシおよびヒトを含む、異なる種に由来する血清中に存在する。しかし、これらの分子の濃度は、種ごとに異なる。したがって、このことによって、細胞培養系を補足するために使用される血清の能力の種依存的変動ばかりではなく、種内バッチ間変動もある、現在の細胞培養技術でよくみられる現象を説明できると考えられる。

要するに、血清中に存在する脂質およびタンパク質の中で、Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦの両者が、ｈＥＳ細胞の自然分化の制御における重要な要素であることが、これらのデータから示唆される。分化を阻害できる能力を有する化合物を同定することにより、ｈＥＳ細胞増殖により適した単純な培地の設計が可能になる。さらに、治療的観点で、無血清環境でｈＥＳ細胞の培養を可能にする化合物を決定することが重要である。

実施例２
＜細胞培養＞
ｈＥＳ−３細胞は、既述⁴のとおりに培養した。無血清培地は、インスリン／トランスフェリン／セレンを１％、β−メルカプトエタノールを０．１ｍＭ、ＮＥＡＡを１％、グルタミンを２ｍＭ、ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）を２５ｍＭ、ペニシリンを５０Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシンを５０ｍｇ／ｍｌ（全てインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手）加えたＤＭＥＭ（ピルビン酸ナトリウムを含まない、グルコース４５００ｍｇ／ｌ、オーストラリア、ビクトリー州のマウント・ウェーバリーにあるインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍｏｕｎｔ Ｗａｖｅｒｌｅｙ，ＶＩＣ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ））で構成されていた。培地は２日ごとに交換し、細胞は、毎週継代した。Ｓ１Ｐおよびジヒドロ−Ｓ１Ｐは、バイオモール（Ｂｉｏｍｏｌ）（米国ペンシルバニア州プリマス・ミーティング（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ，ＵＳＡ））から入手した。ＬＰＡは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（オーストラリアのニューサウスウェールズ州キャッスル・ヒル（Ｃａｓｔｌｅ Ｈｉｌｌ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ））から入手した。全ての脂質の即時希釈液は、０．１％無脂肪酸ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含有する水で作った。Ｓ１Ｐおよびジヒドロ−Ｓ１Ｐは、１０ｍＭで使用した。ヒトＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢは、プレプロテック・インコーポレーティッド（ＰｒｅｐｒｏＴｅｃｈ Ｉｎｃ．）（米国ニュージャージー州ロッキー・ヒル（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ））から入手し、２０ｎｇ／ｍｌで使用した。

＜ＲＴ−ＰＣＲ実験＞
既述¹のとおりに、総ＲＮＡをｈＥＳ細胞から抽出し、逆転写（ＲＴ）した。マウス（データ示さず）またはヒトＤＮＡ標的配列（表１）の特異的検出用に設計されたセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を用いたＰＣＲで、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（オーストラリアのウエスタン・オーストラリア州パースにある、バイオテック・インターナショナル・リミテッド（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ．，Ｐｅｒｔｈ，ＷＡ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ））を使用して、既述¹⁸のとおりに、ｃＤＮＡサンプルを増幅した。特異的増幅ＤＮＡ断片を、１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動で、大きさに従って分け、エチジウムで染色した。分子サイズ（ｂｐ）は、１ｋｂプラスＤＮＡラダーマーカー（Ｍ）を使用して算出した。アンプリコンを精製し、配列決定した。実験は、ｈＥＳ−２およびｈＥＳ−３を用いて実施した。

＜免疫蛍光測定法＞
細胞は、パラホルムアルデヒド４％（ＰＤＧＦＲ染色の場合）または１００％エタノールで固定し、下記の抗体：抗ヒトＰＤＧＦＲ−αまたはＰＤＧＦＲ−β（米国ミネソタ州のミネアポリスにある、ＲアンドＤ・システムズ・インコポレーティッド（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ））、ＧＣＴＭ−２（本研究所）、ＴＲＡ−１−６０（シェフィールド大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ）のＰ．アンドリューズ（Ｐ．Ａｎｄｒｅｗｓ）から寄贈）、Ｏｃｔ−４（米国カリフォルニア州のサンタ・クルズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＴＧ−３０（本研究所）を使用して、既述¹のとおりに、免疫染色した。核は、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）−３３３４２（ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））で対比染色した。ネガティブコントロールに染色が存在しないことにより、特異性が確認された。

＜スフィンゴシンキナーゼ活性＞
ＭＥＦなしで２４時間プレーティングし、さらに１８時間、血清が枯渇していたｈＥＳ−３細胞を、ＰＤＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、様々な時間、インキュベートして、回収し、５０ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０％グリセロール、０．０５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭ Ｎａ₃ＶＯ₄、１０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよびプロテアーゼインヒビターｓ（ドイツ、マンハイムのロシュから販売されているコンプリート（商標）（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ^TM，Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有する溶解緩衝液中で超音波処理（４°℃にて、２Ｗで３０秒）して、溶解した。ＳＰＫ活性は、既述¹⁹のとおりに、Ｄ−エリスロ−スフィンゴシンおよび基質としての［α³²Ｐ］ＡＴＰを使用して決定した。細胞ホモジネート中のタンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準として使用して、クーマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）試薬（オーストラリア、ニューサウスウェールズ州のリエージェンツ・パークにあるバイオ・ラド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｅｇｅｎｔｓ Ｐａｒｋ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ））で、測定した。

＜ＧＣＴＭ−２定量化＞
細胞は、１００％エタノールで固定し、ＧＣＴＭ−２で、続いてアルカリホスファターゼ結合二次抗体（ダコ（Ｄａｋｏ））で、免疫染色した。アルカリホスファターゼ活性は、リン酸４−ニトロフェニル（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））の溶液を加えることによって検出し、反応生成物の濃度は、４０５ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を読み取ることによって検出した。次いで、該技術を、ＧＣＴＭ−２陽性細胞の比率の正確な指標として検証するために、ＧＣＴＭ−２を発現することが知られている、奇形癌細胞系ＧＣＴ２７Ｃ４を用いて、検量線を作成した。これは、細胞数と４０５ｎｍで読み取ったＯＤとの間で、線形相関を示した（データ示さず）。

＜ｈＥＳ細胞のニューロン誘導＞
ｈＥＳ−３細胞ｓ（継代１１、１３〜１５）は、ＰＣＴ／ＡＵ０１／００７３５に既述のとおり、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）処理によってノギン細胞に分化し、次いでニューロスフェアに、最後にニューロンに分化した。

＜統計解析＞
全ての実験は、少なくとも３回実施した。データは、少なくとも３つの独立した実験の、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。差の有意性は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてスチューデント・ニューマン・クールズ検定法（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ Ｋｅｕｌｓ ｔｅｓｔ）を使用することにより、評価した。Ｐ＜０．０５という値を有意（＊）であると考えた。

＜結果＞
ｈＥＳ細胞は、３つのＳ１Ｐ受容体：Ｓ１Ｐ₁、Ｓ１Ｐ₂およびＳ１Ｐ₃、ならびにＬＰＡ受容体のそれぞれに関するｍＲＮＡ転写物を発現した（図４Ａ〜Ｂ）。しかし、これらの細胞は、Ｓ１Ｐ₄およびＳ１Ｐ₅に関するｍＲＮＡを発現しなかった。マウス胚性幹細胞とは違って、ｈＥＳ細胞は、免疫染色で明らかにされるとおり、ＰＤＧＦＲ−αおよびＰＤＧＦＲ−βに関するｍＲＮＡ転写物（図４Ｃ）ならびに対応するタンパク質も発現した（図４Ｅ〜Ｊ）。他者^6-8,18,19によって以前に明らかにされているとおり、我々は、ＭＥＦがＳ１Ｐ₁、Ｓ１Ｐ₂、Ｓ１Ｐ₃、ＬＰＡ₁、ＬＰＡ₂、ＰＤＧＦＲ−αおよびＰＤＧＦＲ−βを発現したことを示す。したがって、同時培養システムにおいて、Ｓ１Ｐ、ＬＰＡおよびＰＤＧＦは、いずれの細胞型でも活性であり得る。

次に、我々は、Ｓ１Ｐ、ＬＰＡおよびＰＤＧＦが、ｈＥＳ細胞の増殖または運命に影響する可能性があるかどうかを試験した。ｈＥＳ細胞は、無血清培地中、ＭＥＦ上で増殖させたとき、異なる種類の細胞に、自然に分化した。無血清培地中で２週間後、ＬＰＡ（５０μＭまで）は、ｈＥＳ細胞コロニーのサイズまたは形態学に明白な作用を示さなかったが、Ｓ１Ｐ（１０μＭ）またはＰＤＧＦ−ＡＢ（ＰＤＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、コロニーは、対照条件に比べて、より扁平で、かつあまり分化していないようであった。さらに、Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦの共インキュベーションは、自然分化の強い阻害を引き起こした。これらの作用を定量化するために、我々は、異なるアゴニストで２週間処理した細胞における幹細胞表面抗原ＧＣＭＴ−２（ＧＣＴＭ２＋）の発現を測定するために、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイを使用した。したがって、Ｓ１ＰまたはＰＤＧＦで処理した細胞は、それぞれ、ＧＣＭＴ２＋が対照より１８．０±１７．０％（ｎ＝３）および５０．３±１８．４％（ｎ＝３）多く、Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦの両者で処理した細胞は、対照より、ＧＣＭＴ２＋が１５２．７±５４．９％（ｎ＝３）多かった（図５Ａ）。同一技術を使用して、我々は、Ｓ１Ｐと、ＰＤＧＦ−ＡＡまたはＰＤＧＦ−ＢＢのいずれかにより処理した細胞が、Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦでみられたものに似たＧＣＴＭ２発現を示すことを証明した（ＰＤＧＦ−ＢＢ：対照の２９４．３±７７．３％、ｎ＝３、ＰＤＧＦ−Ｍ：対照の２２０．３±４９．０％、ｎ＝３；図５Ａ）。さらに、ＰＤＧＦと組み合せたＳ１Ｐの作用は、ＰＤＧＦと組み合せた、ジヒドロスフィンゴシン−１−リン酸（ジヒドロ−Ｓ１Ｐ、１０ｍＭ）（受容体依存的作用に似たＳ１Ｐ類縁体である）の使用によって模倣された（対照の２２７．０±５９．９％（ｎ＝３）、図５Ａ）。さらに、ジヒドロ−Ｓ１Ｐはそれ自身、ｈＥＳ細胞に対して、Ｓ１Ｐより強力な作用を有する（対照の２２３．０±２７．０％、ｎ＝３；図５Ａ）。総合すると、無血清培地中でＰＤＧＦおよびＳ１Ｐを組み合せることにより、ｈＥＳ細胞の自然分化が防止されることが、これらの結果から示唆される。ＰＤＧＦ−ＡＡは、ＰＤＧＦＲ−αに結合するだけであるが、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢは、両受容体に結合するため、この作用は、Ｓ１Ｐの受容体および両ＰＤＧＦＲに依存する。さらに、ｈＥＳ細胞をＭＡＰキナーゼキナーゼインヒビターＵ０１２６（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１０ｍＭ）で７日間処理することにより、ＧＣＴＭ２発現に対するＰＤＧＦおよびＳ１Ｐの作用が完全に阻害され（図５Ｂ）、細胞外シグナル制御キナーゼの活性化には、ｈＥＳ細胞を未分化に維持する必要があることが強く示唆される。ＳＰＫは、ＰＤＧＦ情報伝達経路における重要な分子であるため、我々は、ｈＥＳ細胞内にＳＰＫ転写物が存在することを証明し、ＳＰＫ−１ｍＲＮＡおよびＳＰＫ−２ｍＲＮＡの両者の発現を示した（図４Ｄ）。我々は次に、ＰＤＧＦが、ｈＥＳ細胞におけるＳＰＫ活性を調節するかどうかを調査した（図５Ｄ）。ＰＤＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）は、ｈＥＳ細胞におけるＳＰＫ活性を、時間依存的様式で増強した（図５Ｄ）。この作用は、少なくとも６０分間続き、３０分間のインキュベーション後、ＳＰＫ活性は、基礎値の１．６倍に達した（７５．３±３．９２ｎｍｏｌ／分／ｍｇ、ｎ＝３）（図５Ｄ）。対照的に、ＰＤＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）は、ＭＥＦで、ＳＰＫの有意な統計学的活性化を誘導しなかった。さらに、ＰＫの非特異的インヒビターであるジメチルスフィンゴシン（ＤＭＳ、３μＭ、図５Ｃ）でｈＥＳＩ細胞を７日間処理することにより、ＰＤＧＦおよびＳ１Ｐの作用が阻害され、ｈＥＳの未分化状態の維持にＳＰＫが関与していることが示唆された。

今日まで、Ｓ１Ｐ（１０μＭ）およびＰＤＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を加えた無血清培地で、１９継代、ｈＥＳ細胞を増殖させてきた。これらの細胞は、ＳＰＫ−１ｍＲＮＡおよびＳＰＫ−２ｍＲＮＡ（図６Ｂ）を依然として発現するため、ＳＰＫのＰＤＧＦ−活性化は、ｈＥＳ細胞の増殖に関与していると考えることができる。ＲＴ−ＰＣＲ研究は、ｈＥＳ細胞が、Ｏｃｔ−４およびクリプトに関するｍＲＮＡを発現することを示し（図６Ｂ）、免疫染色は、幹細胞マーカーＧＣＴＭ−２、Ｏｃｔ−４、ＴＧ−３０およびＴｒａ−１−６０に対する免疫活性を示した（図６Ｃ−Ｆ）。これらのｈＥＳ細胞は、正常な核型を示した（図６Ｇ）。さらに、これらのＨＥＳ細胞は、依然としてノギン処理に応答し、また、βチューブリン（図６１）、Ｍａｐ２、ネスチン、シナプトフィシン、Ｎ−ｃａｍおよびＮＦ２００に対する免疫染色によって確認されたとおり、ニューロスフェア（図６Ｈ）および神経細胞を形成することができた（ペラ（Ｐｅｒａ）ら提出）。要するに、Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦの存在下で増殖したＨＥＳ細胞は、通常の血清条件で増殖したＨＥＳ細胞の特徴を保持することが、これらのデータから分かる。

＜考察＞
この研究で、我々は、ｈＥＳ細胞が、Ｓ１Ｐ、ＬＰＡおよびＰＤＧＦの標的であることを初めて示し、また、強い生物学的作用を発揮するためには、細胞外Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦが一緒に存在する必要があるため、我々は、Ｓ１ＰシグナルとＰＤＧＦシグナルとの間の相互作用も示す。カツマ（Ｋａｔｓｕｍａ）ら（２００２）¹⁷は、Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦを使用することにより増殖が増進する、メサンギウム細胞における類似したメカニズムを報告した。ｈＥＳ細胞では、Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦの両者を添加することにより、これらの細胞が未分化状態で維持され、また、分化を追跡することが可能になる。これらの複合作用は、（ｉ）Ｓ１Ｐが、その受容体を介して細胞外に作用し、細胞内情報伝達経路を調節すること、および（ｉｉ）線維芽細胞¹⁴および他の細胞型^15,16で示されたとおり、分泌されるか、または、たとえば、カルシウムホメオスタシスの制御¹³、またアポトーシスの抑制において、細胞内メッセンジャーの役割を果たすかのいずれかであろう、細胞内Ｓ１Ｐの形成を、ＰＤＧＦが刺激すること、に起因する可能性がある。Ｓ１Ｐが分泌されるか、または第２のメッセンジャーの役割を果たすかどうかは、さらに調査する必要がある。しかし、ｈＥＳ細胞の未分化状態での維持は、ＰＤＧＦおよびＳ１Ｐの両者が存在するときに限って起こるため、ＰＤＧＦに応答して産生される細胞内Ｓ１Ｐは、その細胞表面受容体が、培地に予め添加されたＳ１Ｐで既に占められている公算が高いので、細胞内で作用すると我々は考えることができた。我々の知る限り、この研究は、ＰＤＧＦＲ−βのみの代わりに、Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦＲの２つのアイソマーを含むクロストークを報告する最初の研究である。Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦは、ｈＥＳ細胞の自然分化の制御における重要な要素であることが、これらのデータから分かる。Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦを、分化を阻害できる力を有する化合物として同定することにより、ｈＥＳ細胞増殖により適した単純な無血清培地の設計が可能になる。

以下の材料および方法は、実施例３〜５に関連する。

＜試薬＞
Ｓ１ＰおよびＬＰＡは、バイオモール（Ｂｉｏｍｏｌ）（米国ペンシルバニア州プリマス・ミーティング（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ，ＵＳＡ））から入手して、メタノールに溶解した。用時調製したアゴニストの希釈液は、０．１％無脂肪酸ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含有する水で作った。プロテアーゼ、バナジン酸ナトリウムおよびＵ０１２６は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）から入手した。カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（米国カリフォルニア州サン・ディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））から入手した。百日咳（ＰＴＸ）は、リスト・バイオロジカル・ラボラトリーズ（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（米国カリフォルニア州キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＣＡ，ＵＳＡ））から入手した。ＧＣＴＭ−２、Ｏｃｔ−４、ＰＣＮＡ、Ｈｏｅｃｈｓｔ−３３３４２。

＜細胞培養＞
ｈＥＳ−３細胞は、既述［１］のとおり培養した。ヒト幹細胞は、ＭＭＣ処理した線維芽細胞の支持細胞層上で増殖させた。線維芽細胞は、ゼラチン処理した皿にプレーティングした。ヒト由来の線維芽細胞およびマウス由来の線維芽細胞の組合せは、それぞれ、およそ２５，０００細胞／ｃｍ²および７０，０００細胞／ｃｍ²の密度で使用した。幹細胞の培養の前に、該線維芽細胞を、最高４８時間までプレーティングした。マウス線維芽細胞のみで、幹細胞の増殖を支持することができた。しかし、ヒト線維芽細胞も幹細胞を支持することができたが、一様でない、不安定な、支持細胞層を作った。そこで、増殖のよりよい支持および分化の防止を増大し、達成するために、ヒト線維芽細胞をマウス線維芽細胞と組み合せた。

ヒト幹細胞の増殖に使用した培地は、２０％ＦＢＳ（ユタ州のハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｕｔａｈ））（２−メルカプトエタノール−０．１ｍＭ（ギブコ（ＧＩＢＣＯ））、非必須アミノ酸−ＮＥＡＡ １％（ギブコ（ＧＩＢＣＯ））、グルタミン２ｍＭ．（ギブコ（ＧＩＢＣＯ））、ペニシリン５０ｕ／ｍｌ、およびストレプトマイシン５０ｍｇ／ｍｌ（ギブコ（ＧＩＢＣＯ））を加えたＤＭＥＭ５（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）、ピルビン酸ナトリウムを含まない、グルコース４５００ｍｇ／Ｌを含む）であった。

直接観察するために、マウス胚支持細胞（ＭＥＦ）とともに、またはなしで、ｈＥＳ−３細胞を、１２ウェル・プレート内に塗布した（ウェル当たり３コロニー）。プレーティングの翌日に、インスリン、トラスフェリンおよびセレンを含有する無血清培地中で、細胞を異なる作用物質とインキュベートした。培地を、第２日、およびその後２日ごとに交換した。

免疫染色の場合、単層培養を得るために、ｈＥＳ−３細胞を機械的分離した後、チャンバスライド上に塗布した。プレーティングの翌日に、血清枯渇培地中で、細胞を異なる作用物質とインキュベートした。培地を第２日に交換し、最初の処理の４日後に細胞を固定した。

免疫ブロット分析の場合、ＭＥＦなしで、細胞を２４ウェル・プレートに移し（ウェル当たり８コロニー）、２４時間後に、血清の非存在下で１８時間増殖させた。

一部の実験では、細胞を、Ｕ０１２６（３０μＭ）で１時間、ＰＴＸ（１００μｇ／ｍｌ）で１８時間、前処理した。

＜ＲＴ−ＰＣＲ実験＞
細胞をＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼで処理することにより、ｈＥＳコロニーを除去した。供給業者の説明書に従って、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））オリゴ（Ｏｌｉｇｏ）（ｄＴ）₂₅（ノルウェーのオスロにあるダイナル（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ））を使用し、ｈＥＳ培養から精製ｍＲＮＡを抽出した。供給業者のプロトコールに従って、スーパースクリプト（商標）ＩＩ Ｒナーゼ Ｈ^- リバーストランスクリプターゼ（Ｒｎａｓｅ Ｈ^- Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用して、ＲＴを実施した。氷で冷却した後、ヒトＥｄｇ−１、Ｅｄｇ−２、Ｅｄｇ−３、Ｅｄｇ−４、Ｅｄｇ−５、Ｅｄｇ−６、Ｅｄｇ−７およびＥｄｇ−８ＤＮＡ標的配列の特異的検出用にデザインされたセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー（オーストラリアのキャッスル・ヒルにあるシグマ・ジェノシス（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ，ＣａｓｔｌｅＨｉｌｌ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）が合成実施）を用いたＰＣＲで、ｃＤＮＡサンプルを増幅した。Ｅｄｇ−１、Ｅｄｇ−３、Ｅｄｇ−５、Ｅｄｇ−６およびＥｄｇ−８に使用したプライマーは、以前に、フォロン（Ｈｏｒｎｕ）ら（２００１）［１］により設計された。これらのプライマー対は以下のとおりである。

5'-CCACAACGGGAGCAATAACT-3'（センス）および
5'-GTAAATGATGGGGTTGGTGC-3'（アンチゲンス）（予想されるＰＣＲ産物：４８０ｂｐ）Ｅｄｇ−１用；

5'-TCAGGGAGGGCAGTATGTTC-3'（センス）および
5'-CTGAGCCTTGAAGAGGATGG-3'（アンチセンス）（５０５ｂｐ）Ｅｄｇ−３用；

5'-CCAATACCTTGCTCTCTCTGGC-3'（センス）および
5'-CAGAAGGAGGATGCTGAAGG-3'（アンチセンス）（５０２ｂｐ）Ｅｄｇ−５用；

5'-CGGCTCATTGTTCTGCACTA-3'（センス）および
5'-GATCATCAGCACCGTCTTCA-3'（アンチセンス）（７０１ｂｐ）Ｅｄｇ−６用；

5'-TTCTGATACCAGAGTCCGGG-3'（センス）および
5'-CAAGGCCTACGTGCTCTTCT-3' （アンチセンス）（４６０ｂｐ）Ｅｄｇ−８用。

Ｅｄｇ−２およびＥｄｇ−４用として、Ｇｏｅｔｚｌ ｅｔ ａｌ. (１９９９) によりデザインされたプライマー対が使用された。
5'-GCTCCACACACGGATGAGCAACC-3'（センス）および
5'-GTGGTCATTGCTGTGAACTCCAGC-3'（アンチセンス）（６２１ｂｐ）Ｅｄｇ−２用；

5'-AGCTGCACAGCCGCCTGCCCCGT-3'（センス）および
5'-TGCTGTGCCATGCCAGACCTTGTC-3'（アンチセンス）（７７５ｂｐ）Ｅｄｇ−４用。

Ｅｄｇ−７用として、Goetlz et al. (2000)によりデザインされたプライマー対が使用された。
5'-CCATAGCAACCTGACCAAAAAGAG-3'（センス）および
5'-TCCTTGTAGGAGTAGATGATGGGG-3'（アンチセンス）（４８２ｂｐ）。

６７ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１６．６ｍＭ ［ＮＨ₄］₂ＳＯ₄、０．４５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを含む緩衝液中に、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（オーストラリアのウエスタン・オーストラリア州パースにある、バイオテック・インターナショナル・リミテッド（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ．，Ｐｅｒｔｈ，ＷＡ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ））０．２５単位および２μＭの各プライマーを含有する混合物（２５μｌ）で、ＰＣＲ実験を実施した。逆転写酵素で処理されていないｍＲＮＡとの対照反応により、汚染ゲノムＤＮＡが存在しないことを確認した。ＰＣＲ実験は、下記のステップ：９４℃で５分間の初期変性、３５サイクルの９４℃で３０秒間の変性、５２℃（Ｅｄｇ−１、Ｅｄｇ−３、Ｅｄｇ−５、Ｅｄｇ−６、Ｅｄｇ−８）または５６℃（Ｅｄｇ−２、Ｅｄｇ−４、Ｅｄｇ−７）で２分間のアニーリング、７４℃で２分間の伸長、および７４℃で７分間の最終伸長、で実行した。特異的増幅ＤＮＡ断片は、１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動で精製し、臭化エチジウムで染色し、写真撮影した。アンプリコンを精製し、配列決定した。

＜免疫蛍光測定法＞
細胞をＰＢＳで洗浄し、ＭｅＯＨで固定し、特異的幹細胞マーカー抗体ＧＣＴＭ−２、および特異的細胞増殖マーカーＰＣＮＡを使用して免疫染色を実施した。次いで、細胞を洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ−３３３４２（１μｇ／ｍｌ）で核を染色した。スライドを載せ、次いで蛍光顕微鏡で観察した。次いで、全集団内の増殖性幹細胞の比率を決定するために、細胞を計数した。

＜ウエスタンブロット分析＞
１ｍＭバナジン酸ナトリウムを含有する還元性ローディングバッファー（２％ＳＤＳ、６２．５ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ） ｐＨ６．８、０．１Ｍ ＤＴＴ、０．０１％ブロモフェノール・ブルー）を加えることによって上澄を除去した後、ｈＥＳ３細胞を溶解した。サンプルを１０分間煮沸し、１３０００ｇで１５分間遠心分離し、タンパク質溶解物（およそ８０μｇ）を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％ポリアクリルアミド、ｗ／ｖ）で分離した。タンパク質をニトロセルロース（ハイボンド−ＥＣＬ（Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ），アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に移し、二重リン酸化ＭＡＰＫペプチド（米国ウィスコンシン州マジソンにあるプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ））に対して生じさせたウサギポリクローナル抗活性マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰＫ）抗体を用いて、免疫ブロットを実行した。ペルオキシダーゼ結合二次抗体（ダコ（Ｄａｋｏ））は、化学発光検出試薬（ＥＣＬ，アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））の存在下、オートラジオグラフィー用フィルムの露光により検出した。１００ｍＭメルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、６２．５ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ ｐＨ６．７を含有する緩衝液中、５０℃で３０分間、膜をインキュベートすることにより、抗体を剥離した。次いで、ウサギポリクローナル抗ＥＲＫ１／２抗体（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））で、次にペルオキシダーゼ結合二次抗体（ダコ（Ｄａｋｏ））で、該膜をリプローブした。

ウサギポリクローナル抗活性ｐ３８（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））またはウサギポリクローナル抗活性ＪＮＫ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））またはマウスポリクローナルＧＣＴＭ−２抗体のいずれかでプローブしたブロットも、上述と同じ手順を使用して実施した。

＜タンパク質定量化＞
ｈＥＳ３細胞を溶解し、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）色素結合テストに基づく比色アッセイ（オーストラリア、ニューサウスウェールズ州のリエージェンツ・パークにあるバイオ・ラド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｅｇｅｎｔｓ Ｐａｒｋ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ））を使用して、それらの量を測定した。

各セットの実験は、少なくとも３回実施した（ｎは、異なる細胞培養で実施した、独立した実験の数を指す）。

実施例３
図７Ａに示す結果は、ｈＥＳ細胞が、３つのＳ１Ｐ受容体、Ｅｄｇ−１、Ｅｄｇ−３およびＥｄｇ−５に関するｍＲＮＡ転写物を発現したことを示すが、これらの細胞は、Ｅｄｇ−６およびＥｄｇ−８に関するｍＲＮＡは発現しないようである（データ示さず）。さらに、ｈＥＳ細胞は、ＬＰＡ受容体、Ｅｄｇ−２、Ｅｄｇ−４およびＥｄｇ−７のそれぞれに関するｍＲＮＡ転写物を発現する（図７Ｂ）。全ての精製ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列を分析し、ヒト受容体遺伝子における対応する領域と全く同じであることを明らかにした。

実施例４
出願人は、次に、Ｓ１Ｐが、ｈＥＳ細胞の運命を調節できるかどうかを試験した。ｈＥＳ細胞は、血清枯渇培地中、ＭＥＦ上で増殖させたとき、自然に分化した。図８に示すとおり、このような条件で８日後、ｈＥＳ細胞コロニーは、嚢胞構造を形成した、拡大した扁平な細胞を含んでいた（図２Ａ，２Ｂ）。１２日後でも、ＬＰＡ（５０μＭまで）は、コロニーの成長に影響しないようであった（データ示さず）。Ｓ１Ｐが存在すると（１０μＭ、８日）、コロニーは、対照条件の場合より小型で且つあまり分化していなかった（図８Ｃ）。Ｓ１Ｐの作用は、１２日間の処理後に、より明白であった。（図８Ｄ，ＢＥ）。細胞分化に対するＳ１Ｐの阻害作用、およびＬＰＡの作用の欠如は、ＭＥＦなしでｈＥＳ細胞を増殖させたときにもみられ、Ｓ１Ｐが、支持細胞に直接作用しなかったことが示唆される（ｎ＝３、データ示さず）。

ＥＳ細胞の自然分化に対するＳＰ１の作用を理解し、定量化するために、二重免疫染色実験を実行した。その目的のために、出願人は、増殖性幹細胞の比率を決定するために、２つの特異的抗体（１つは、幹細胞マーカーとしてのＧＣＴＭ−２、もう１つは、細胞周期のＳ期中に発現されるだけのマーカーである、増殖に関する、ＰＣＮＡ）を使用した（図９）。血清を含まない培地中で４日後には、該細胞のわずか１６％が、依然としてＧＣＴＭ−２を発現していたことによって明らかにされるとおり、対照細胞の大部分が分化していた（図９Ａ，９Ｃおよび９Ｅ）（図１０Ａ）。それに反して、Ｓ１Ｐ（１０μＭ）を培地に加えると、細胞の６８％がＧＣＴＭ−２陽性であり、細胞の大部分が幹細胞のままであったことが示唆される（図９Ｂ，９Ｄ，９Ｆおよび１０Ｂ）。これらの細胞集団内で、大部分がＰＣＮＡを発現し、これらの幹細胞の大部分が依然として増殖していたことが示唆される（図９Ｇおよび９Ｈ）。しかし、対照細胞とＳ１Ｐ処理細胞との間で、ｈＥＳ細胞の増殖速度の著明な差は認められなかった（図１０）。要するに、Ｓ１Ｐは、ｈＥＳ細胞の増殖期に対して作用するというよりむしろ、血清の非存在下で見られるｈＥＳ細胞の分化に対して主に作用することが、これらのデータから示唆される。

実施例５
ＢＭＡＰキナーゼＥＲＫは、細胞増殖および分化にしばしば関与していたため、次に、ＥＲＫの活性化に対するＳ１Ｐの作用を調査した。５分後、Ｓ１Ｐは、ＭＥＫインヒビターＵ０１２６（３０μＭ）の存在下で完全に阻害された（図１０Ａ）作用である、ｈＥＳ細胞におけるＥＲＫのリン酸化を刺激した（図１０）。Ｓ１Ｐは、ＥＲＫを、少なくとも６０分間、濃度依存的様式で、刺激した（図１ＯＢ，１ＯＣ）。

以上の結果から、ヒトＥＳ細胞をＳ１Ｐで処理した結果として、自然分化の阻害が生じることが、明らかに分かる。Ｓ１Ｐは、血清の主要成分であり、したがって、ヒトＥＳ培養における仔牛血清の有益な作用の多くの原因である公算が高い。ヒトＥＳ細胞は、Ｓ１ＰおよびＬＰＡに関する受容体を発現するが、後者のリゾリン脂質は、ヒトＥＳ細胞上で不活性である。このことから、Ｅｄｇ受容体ファミリーの特定のメンバーが、ヒトＥＳ細胞の挙動に対して独特の作用を有することが示唆される。

［参考文献］

ｈＥＳ細胞が、Ｓ１Ｐ、ＬＰＡおよびＰＤＧＦの標的であることを示す図である。ＬＰＬ受容体（Ａ，Ｂ）、ＰＤＧＦＲ−αおよびＰＤＧＦＲ−β（Ｃ）、ＳＰＫ−１およびＳＰＫ−２（Ｄ）のＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴあり（＋）またはなし（−）。ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２（Ｅ，Ｈ）、ＰＤＧＦＲ−αｃ（Ｆ）またはＰＤＧＦＲ−β（Ｉ）およびＧＣＴＭ−２（Ｇ．Ｊ）抗体を用いた、ｈＥＳ細胞の免疫染色。Ｓ１Ｐ、ＬＰＡおよびＰＤＧＦは、ｈＥＳ細胞におけるＥＲＫリン酸化を刺激する。（Ｋ）ウエスタンブロット実験は、ｈＥＳ細胞からのタンパク質融解物を使用して実施した。細胞は、Ｕ０１２６（３０μＭ、１時間）で前処理して、または前処理しないで、Ｓ１Ｐ（Ｓ，１０μＭ）、ＬＰＡ（Ｌ，５０Ｍ）またはＰＤＧＦ（Ｐ．２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下（Ｃ、対照）で、５分間インキュベートした。Ｅｒｋ１およびＥｒｋ２のリン酸化（Ｐ−Ｅｒｋ１およびＰ−Ｅｒｋ２）は、材料および方法に記述したとおりに、ポリクローナル抗活性ＭＡＰキナーゼを用いた免疫ブロットで評価した。剥離手順後、同一ブロットをモノクローナル抗ＭＡＰキナーゼでリプローブし、Ｅｒｋ１およびＥｒｋ２の検出を可能にした。これらのデータは、少なくとも３つの独立した実験の結果を代表する。 Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦが、ｈＥＳ細胞の自然分化を阻害することを示す図である。（Ａ）培地から血清が枯渇する前に、ＭＥＦで増殖させたｈＥＳ細胞。（Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ）Ｓ１Ｐ（１０μＭ）（Ｃ）、ＰＤＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）（Ｄ）、Ｓ１Ｐ（１０μＭ）プラスＰＤＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）（Ｅ）の存在下または非存在下（Ｂ）で、８日後に、血清なしで増殖させたｈＥＳ細胞。（Ｆ）Ｓ１Ｐ（１０μＭ）、ＰＤＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｓ１Ｐ（１０μＭ）プラスＰＤＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下（対照）で、血清なしで増殖させたｈＥＳ細胞。Ａ〜Ｅでは、データは、少なくとも３つの独立した実験を代表する。Ｆでは、血清の非存在下で８日間、アルカリホスファターゼ活性のパーセンテージとして表したデータ（対照の％）は、それぞれ三重に実行された少なくとも２つの独立した実験の平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）である。 Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦは、ＭＥＦと関係なく、ｈＥＳ細胞の自然分化を阻害することを示す図である。機械的に分離し、Ｓ１Ｐ（１０μＭ）または／およびＰＤＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下（対照）、血清枯渇培地で４日間培養したｈＥＳ細胞。（Ａ）ＧＣＴＭ２＋細胞数の定量化。（Ｂ）ＰＣＮＡ＋／ＧＣＴＭ２＋細胞の定量化。これらのデータは、少なくとも３つの独立した実験で得た結果の平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）である。 ｈＥＳ細胞が、Ｓ１Ｐ、ＬＰＡおよびＰＤＧＦの標的であることを示す図である。ＬＰＬ受容体（Ａ，Ｂ）、ＰＤＧＦＲ−αおよびＰＤＧＦＲ−β（Ｃ）、ＳＰＫ−１およびＳＰＫ−２（Ｄ）のＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴあり（＋）またはなし（−）。ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２（Ｅ，Ｈ）、ＰＤＧＦＲ−α（Ｆ）またはＰＤＧＦＲ−β（Ｉ）およびＧＣＴＭ−２（Ｇ，Ｊ）抗体を用いたｈＥＳ細胞の免疫染色。Ｓ１Ｐ、ＬＰＡおよびＰＤＧＦは、ｈＥＳ細胞におけるＥＲＫリン酸化を刺激した。 血清の非存在下で、Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦが、ｈＥＳ細胞の自然分化を阻害することを示す図である。（Ａ〜Ｃ）表示のアゴニストありまたはなし（対照）のｈＥＳ細胞。ジヒドロ−Ｓ１Ｐ：ＤＨＳ１Ｐ。（Ｄ）ｈＥＳ細胞をＰＤＧＦとインキュベートした後の、スフィンゴシンキナーゼ活性測定。 ｈＥＳ細胞の特性決定を示す図である。（Ａ）Ｓ１Ｐ＋ＰＤＧＦの存在下で増殖させたｈＥＳ細胞、１４継代．（Ｂ）Ｏｃｔ−４、クリプト、ＳＰＫ１およびＳＰＫ２に関する特異的プライマーを使用して、Ｓ１ＰおよびＰＤＧＦの存在下で増殖させた、ｈＥＳ細胞由来のｍＲＮＡを使用したＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴあり（＋）またはなし（−）。７継代。Ｓ１Ｐ＋ＰＤＧＦの存在下で増殖させたｈＥＳ細胞の、ＧＣＴＭ−２（Ｃ）、Ｏｃｔ−４（Ｄ）、ＴＧ−３０（Ｅ）またはＴＲＡ−１−６０（Ｆ）を用いた免疫染色、１３継代。（Ｇ）Ｓ１Ｐ＋ＰＤＧＦの存在下で増殖させたｈＥＳ細胞の核型分析、８継代。（Ｈ）ニューロスフェアへのニューロン分化。（Ｉ）βチューブリン免疫染色。 Ｅｄｇ受容体ｍＲＮＡが、ｈＥＳ細胞で発現されることを示す図である。Ｅｄｇ受容体に特異的なプライマーを使用し、ｈＥＳ細胞から単離したｍＲＮＡを使用して、ＲＴ−ＰＣＲ実験を実施した。いずれの場合にも、実験は、リバーストランスクリプターゼの存在下（＋）または非存在下（−）のいずれでも実施した。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、１．５％アガロースゲル電気泳動で分離し、臭化エチジウム蛍光で明らかに見えるようにした。該産物の分子サイズ（ｂｐで示す）は、１ｋＢプラスＤＮＡラダーマーカー（Ｍ）を使用して算出した。これらのデータは、それぞれ、ｈＥＳ細胞の異なる培養から調製されたｍＲＮＡで、実行された少なくとも６つの独立した実験を代表する。 Ｓ１Ｐが、ｈＥＳ細胞の自然分化を阻害することを示す図である。Ｓ１Ｐの非存在下（Ｂ，Ｄ）または存在下（Ｃ，Ｅ、１０μＭ）で、（Ａ）血清枯渇前に、支持細胞層で増殖させたｈＥＳ細胞、（Ｂ）８日後、（Ｂ．Ｃ）および１２後（Ｄ，Ｅ）に、血清なしで増殖させたｈＥＳ細胞。これらのデータは、少なくとも３つの独立した実験を代表する。 Ｓ１Ｐが、ｈＥＳ細胞の自然分化を阻害することを示す図である。ＰＣＮＡおよびＧＣＴＭ−２に対する抗体を使用して、二重染色実験を実施した。これらのデータは、少なくとも３つの独立した実験を代表する。 Ｓ１Ｐが、ｈＥＳ細胞におけるＥＲＫリン酸化を刺激することを示す図である。ｈＥＳ細胞からのタンパク質溶解物を使用して、ウエスタンブロット実験を実施した。（Ａ）細胞は、Ｕ０１２６（３０μＭ、１時間）で前処理するか、または前処理せずに、Ｓ１Ｐ（１０μＭ）の非存在下（Ｃ、対照）または存在下で、５分間インキュベートした。（Ｂ）Ｓ１Ｐ（１０μＭ）の非存在下または存在下で、細胞を、異なる時間、インキュベートした。（Ｃ）細胞を、様々な濃度のＳ１Ｐと５分間インキュベートした。材料よび方法に記載のとおりに、ポリクローナル抗活性ＭＡＰキナーゼを用いた免疫ブロットで、Ｅｒｋ１およびＥｒｋ２のリン酸化（Ｐ−Ｅｒｋ１およびＰＥｒｋ２）を評価した。剥離手順後、モノクローナル抗−ＭＡＰキナーゼで、同一ブロットをリプローブし、Ｅｒｋ１およびＥｒｋ２の検出を可能にした。これらのデータは、少なくとも３つの独立した実験を代表する。

Claims (108)

1. 幹細胞の自然分化を調節する方法であって、前記幹細胞を、ＬＰＬ受容体のリガンドの存在下でインキュベートするステップを含む方法。
2. 幹細胞の自然分化を調節する方法であって、前記幹細胞を、クラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体の存在下でインキュベートするステップを含む方法。
3. 幹細胞の自然分化を調節する方法であって、前記幹細胞を、ＬＰＬ受容体のアゴニストおよびクラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドの存在下でインキュベートするステップを含む方法。
4. 前記調節が分化の阻害である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記ＬＰＬ受容体が、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３からなる群から選択される、請求項１、３または４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記アゴニストがリン脂質である、請求項１、３、４または５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記アゴニストが、Ｓ１Ｐ、ジヒドロＳ１Ｐ、ＬＰＡ、ＰＡＦおよびＳＰＣまたはそれらの機能的同等物からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
8. 前記アゴニストが、Ｓ１Ｐまたはその機能的同等物である、請求項７に記載の方法。
9. 前記アゴニストが、ジヒドロＳ１Ｐまたはその機能的同等物である、請求項７に記載の方法。
10. 前記チロシンキナーゼ受容体が、ＰＤＧＦＲ−αまたはＰＤＧＦＲ−βである、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記リガンドが、ＰＤＧＦまたはその機能的同等物である、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記ＰＤＧＦが、ＰＤＧＦａａ、ＰＤＧＦａｂまたはＰＤＧＦｂｂである、請求項１１に記載の方法。
13. ＴＮＦα、ＮＧＦ（神経成長因子）、ムスカリン性アセチルコリンアゴニスト、あるいは血清またはホルボールエステルの使用を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記幹細胞が、胎児組織または成体組織に由来する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記幹細胞がＥＳ細胞である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記幹細胞がｈＥＳ細胞である、請求項１４に記載の方法。
17. ＬＰＬ受容体のアゴニストを含む、幹細胞の自然分化を調節するのに有用な、無血清または実質的に無血清の培地。
18. クラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドを含む、幹細胞の自然分化を調節するのに有用な、無血清または実質的に無血清の培地。
19. ＬＰＬ受容体のアゴニストおよびクラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドを含む、幹細胞の自然分化を調節するのに有用な、無血清または実質的に無血清の培地。
20. 前記調節が分化の阻害である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の培地。
21. 前記培地が無血清である、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の培地。
22. 前記ＬＰＬ受容体が、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３からなる群から選択される、請求項１７、１９、２０または２１のいずれか１項に記載の培地。
23. 前記アゴニストがリン脂質である、請求項１７、１９、２０、２１または２２のいずれか１項に記載の培地。
24. 前記アゴニストが、からなる群から選択されるＳ１Ｐ、ジヒドロＳ１Ｐ、ＬＰＡ、ＰＡＦおよびＳＰＣまたはそれらの機能的同等物からなる群から選択される、請求項２３に記載の培地。
25. 前記アゴニストが、Ｓ１Ｐまたはその機能的同等物である、請求項２４に記載の培地。
26. 前記アゴニストが、ジヒドロＳ１Ｐまたはその機能的同等物である、請求項２４に記載の培地。
27. 前記チロシンキナーゼ受容体が、ＰＤＧＦＲ−αまたはＰＤＧＦＲ−βである、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の培地。
28. 前記リガンドが、ＰＤＧＦまたはその機能的同等物である、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の培地。
29. 前記ＰＤＧＦが、ＰＤＧＦａａ、ＰＤＧＦａｂまたはＰＤＧＦｂｂである、請求項２８に記載の培地。
30. ＴＮＦα、ＮＧＦ（神経成長因子）、ムスカリン性アセチルコリンアゴニスト、あるいは血清またはホルボールエステルを含む、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の培地。
31. 前記幹細胞が、胎児組織または成体組織に由来する、請求項１７〜３０のいずれか１項に記載の培地。
32. 前記幹細胞がＥＳ細胞である、請求項３１に記載の培地。
33. 前記幹細胞がｈＥＳ細胞である、請求項３１に記載の培地。
34. 前記基礎培地が、標準無血清培地である、請求項１７〜３３のいずれか１項に記載の培地。
35. ２５ｍＭのヘペス（Ｈｅｐｅｓ）を含む、請求項１７〜３４のいずれか１項に記載の培地。
36. 前記基礎培地が、インスリン、トランスフェリンおよびセレンを加えたＤＭＥＭに基づく、請求項３４または３５に記載の培地。
37. 前記アゴニストが、Ｓ１Ｐであり、且つ０．１〜１０μＭの濃度で培地中に存在する、請求項１７または１９〜３６のいずれか１項に記載の培地。
38. 前記アゴニストが、約１０μＭの濃度で培地中に存在する、請求項１７または１９〜３７のいずれか１項に記載の培地。
39. 前記リガンドが、１〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在し、ＰＤＧＦａａ、ＰＤＧＦａｂまたはＰＤＧＦｂｂである、請求項１８〜３８のいずれか１項に記載の培地。
40. 前記リガンドが、２０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在する、請求項１８〜３９のいずれか１項に記載の培地。
41. 未分化状態の、幹細胞、好ましくはヒト胚性幹細胞を増殖させる際の、請求項１７〜４０のいずれか１項に記載の培地の使用。
42. 請求項１５〜３５のいずれか１項に記載の細胞培養培地で、増殖および／または維持された幹細胞。
43. 請求項４２に記載の幹細胞に由来する幹細胞。
44. 請求項４３または４４に記載の幹細胞に由来する、少なくとも部分的に分化した幹細胞。
45. 幹細胞分化の障害を治療または予防する方法であって、ＬＰＬ受容体のアゴニストを含有する組成物を、治療または予防を必要としている動物に投与するステップを含む方法。
46. 幹細胞分化の障害を治療または予防する方法であって、クラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドを含有する組成物を、治療または予防を必要としている動物に投与するステップを含む方法。
47. 幹細胞分化の障害を治療または予防する方法であって、ＬＰＬ受容体のアゴニストおよびクラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドを含有する組成物を、治療または予防を必要としている動物に投与するステップを含む方法。
48. 前記調節が分化の阻害である、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
49. 前記ＬＰＬ受容体が、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３からなる群から選択される、請求項４５または４７に記載の方法。
50. 前記アゴニストがリン脂質である、請求項４５、４７、４８または４９のいずれか１項に記載の方法。
51. 前記アゴニストが、Ｓ１Ｐ、ジヒドロＳ１Ｐ、ＬＰＡ、ＰＡＦおよびＳＰＣまたはそれらの機能的同等物からなる群から選択される、請求項４５または４７〜５０のいずれか１項に記載の方法。
52. 前記アゴニストが、Ｓ１Ｐまたはその機能的同等物である、請求項５１に記載の方法。
53. 前記アゴニストが、ジヒドロＳ１Ｐまたはその機能的同等物である、請求項５１に記載の方法。
54. 前記チロシンキナーゼ受容体が、ＰＤＧＦＲ−αまたはＰＤＧＦＲ−βである、請求項４６〜５３のいずれか１項に記載の方法。
55. 前記リガンドが、ＰＤＧＦまたはその機能的同等物である、請求項４６〜５４のいずれか１項に記載の方法。
56. 前記ＰＤＧＦが、ＰＤＧＦａａ、ＰＤＧＦａｂまたはＰＤＧＦｂｂである、請求項５５に記載の方法。
57. ＴＮＦα、ＮＧＦ（神経成長因子）、ムスカリン性アセチルコリンアゴニスト、あるいは血清またはホルボールエステルの使用を含む、請求項４５〜５６のいずれか１項に記載の方法。
58. 前記幹細胞が、胎児組織または成体組織に由来する、請求項４５〜５７のいずれか１項に記載の方法。
59. 前記幹細胞がＥＳ細胞である、請求項５８に記載の方法。
60. 前記幹細胞がｈＥＳ細胞である、請求項５８に記載の方法。
61. クラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体リガンドおよび／またはＬＰＬ受容体アゴニストを含む医薬組成物。
62. ＴＮＦα、ＮＧＦ（神経成長因子）、ムスカリン性アセチルコリンアゴニスト、あるいは血清またはホルボールエステルを含む、請求項６１に記載の医薬組成物。
63. 幹細胞から増殖性未分化幹細胞集団を製造する方法であって、ＬＰＬ受容体のアゴニストの存在下で、前記幹細胞をインキュベートするステップを含む方法。
64. 幹細胞から増殖性未分化幹細胞集団を製造する方法であって、クラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドの存在下で、前記幹細胞をインキュベートするステップを含む方法。
65. 幹細胞から増殖性未分化幹細胞集団を製造する方法であって、ＬＰＬ受容体のアゴニストおよびクラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドの存在下で、前記幹細胞をインキュベートするステップを含む方法。
66. 前記ＬＰＬ受容体が、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２およびＳ１Ｐ３からなる群から選択される、請求項６３または６５に記載の方法。
67. 前記アゴニストがリン脂質である、請求項６３、６５または６６のいずれか１項に記載の方法。
68. 前記アゴニストが、Ｓ１Ｐ、ジヒドロＳ１Ｐ、ＬＰＡ、ＰＡＦおよびＳＰＣまたはそれらの機能的同等物からなる群から選択される、請求項６３、６５、６６または６７のいずれか１項に記載の方法。
69. 前記アゴニストが、Ｓ１Ｐまたはその機能的同等物である、請求項６８に記載の方法。
70. 前記アゴニストが、ジヒドロＳ１Ｐまたはその機能的同等物である、請求項６８に記載の方法。
71. 前記リガンドが、ＰＤＧＦまたはその機能的同等物である、請求項６４〜７０のいずれか１項に記載の方法。
72. 前記チロシンキナーゼ受容体が、ＰＤＧＦＲ−αまたはＰＤＧＦＲ−βである、請求項６４〜７１のいずれか１項に記載の方法。
73. 前記ＰＤＧＦが、ＰＤＧＦａａ、ＰＤＧＦａｂまたはＰＤＧＦｂｂである、請求項７１に記載の方法。
74. ＴＮＦα、ＮＧＦ（神経成長因子）、ムスカリン性アセチルコリンアゴニスト、あるいは血清またはホルボールエステルの使用を含む、請求項６４〜７３のいずれか１項に記載の方法。
75. 前記幹細胞が、胎児組織または成体組織に由来する、請求項６４〜７４のいずれか１項に記載の方法。
76. 前記幹細胞がＥＳ細胞である、請求項７５に記載の方法。
77. 前記幹細胞が、ｈＥＳ細胞である、請求項７５に記載の方法。
78. 請求項６３〜７７のいずれか１項に記載の方法の少なくとも１法によって、または請求項１７〜４０のいずれか１項に記載の培地を使用して、製造された未分化の幹細胞の集団。
79. 幹細胞の自然分化を調節するための、ＬＰＬ受容体のアゴニストの使用。
80. 幹細胞の自然分化の調節における、クラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドの使用。
81. 幹細胞の自然分化の調節における、ＬＤＬ受容体およびクラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のアゴニストのリガンドの使用。
82. 前記ＬＰＬ受容体が、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２およびＳ１Ｐ３からなる群から選択される、請求項７９または８１に記載の使用。
83. 前記アゴニストがリン脂質である、請求項７９、８１または８２のいずれか１項に記載の使用。
84. 前記アゴニストが、Ｓ１Ｐ、ジヒドロＳ１Ｐ、ＬＰＡ、ＰＡＦおよびＳＰＣまたはそれらの機能的同等物からなる群から選択される、請求項７９、８１、８２または８３のいずれか１項に記載の使用。
85. 前記アゴニストが、Ｓ１Ｐまたはその機能的同等物である、請求項８４に記載の使用。
86. 前記アゴニストが、ジヒドロＳ１Ｐまたはその機能的同等物である、請求項８４に記載の使用。
87. *
    前記リガンドが、ＰＤＧＦまたはその機能的同等物である、請求項８０〜８６のいずれか１項に記載の使用。
88. 前記チロシンキナーゼ受容体が、ＰＤＧＦＲ−αまたはＰＤＧＦＲ−βである、請求項８０〜８７のいずれか１項に記載の使用。
89. 前記ＰＤＧＦが、ＰＤＧＦａａ、ＰＤＧＦａｂまたはＰＤＧＦｂｂである、請求項８７に記載の使用。
90. 前記幹細胞が、胎児組織または成体組織に由来する、請求項７９〜８９のいずれか１項に記載の使用。
91. 前記幹細胞がＥＳ細胞である、請求項９０に記載の使用。
92. 前記幹細胞がｈＥＳ細胞である、請求項９０に記載の使用。
93. 幹細胞から増殖性未分化幹細胞集団を製造する際の、ＬＰＬ受容体のアゴニストの使用。
94. 幹細胞から増殖性未分化幹細胞集団を製造する際の、クラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドの使用。
95. 幹細胞から増殖性未分化幹細胞集団を製造する際の、ＬＰＬ受容体のアゴニストおよびクラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドの使用。
96. 幹細胞分化の障害を治療または予防する方法における、ＬＰＬ受容体のアゴニストを含有する組成物の使用。
97. 幹細胞分化の障害を治療または予防する方法における、クラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドを含有する組成物の使用。
98. 幹細胞分化の障害を治療または予防する方法における、クラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドを含有する組成物の使用。
99. 幹細胞の自然分化を調節することができる化合物を同定する方法であって、
    ＬＰＬ受容体を被験化合物に暴露するステップと、
    前記被験化合物の前記ＬＰＬ受容体への結合を決定するステップと
    を含む方法。
100. 幹細胞の自然分化を調節することができる化合物を同定する方法であって、
     クラスＩＩＩチロシンキナーゼ受容体のリガンドを、被験化合物に暴露するステップと、
     前記被験化合物の前記チロシンキナーゼ受容体への結合を決定するステップと
     を含む方法。
101. 前記調節が分化の阻害である、請求項９９または１００に記載の方法。
102. 前記ＬＰＬ受容体が、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３からなる群から選択される、請求項９９または１０１に記載の方法。
103. 前記チロシンキナーゼ受容体が、ＰＤＧＦ受容体である、請求項１００または１０１に記載の方法。
104. 前記ＰＤＧＦ受容体が、ＰＤＧＦＲ−αまたはＰＤＧＦＲ−βである、請求項１０３に記載の方法。
105. 前記ＰＤＧＦが、ＰＤＧＦａａ、ＰＤＧＦａｂまたはＰＤＧＦｂｂである、請求項１０３に記載の方法。
106. 前記幹細胞が、胎児組織または成体組織に由来する、請求項９６〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
107. 前記幹細胞がＥＳ細胞である、請求項１０６に記載の方法。
108. 前記幹細胞がｈＥＳ細胞である、請求項１０６に記載の方法。
     

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