KR20100097649A - 포유 동물 체세포용 배지 및 이를 위한 첨가제 - Google Patents

포유 동물 체세포용 배지 및 이를 위한 첨가제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포유 동물의 체세포를 배양할 때, 배지에의 혈청의 첨가를 가능한 한 억제하거나 또는 혈청을 첨가하지 않고 포유 동물의 체세포를 효과적으로 증식시킬 수 있는 포유 동물 체세포용 배지 및 그것을 구성하기 위한 첨가제가 개시되어 있다. 내피 세포 분화 유전자(Edg) 패밀리 리셉터에 대한 리간드와, 세로토닌 리셉터에 대한 리간드를 배지에 배합함으로써 배지가 혈청을 전혀 또는 소량밖에 함유하지 않는 경우이어도 효과적으로 포유 동물의 체세포를 증식시킬 수 있다.

Description

포유 동물 체세포용 배지 및 이를 위한 첨가제{MEDIUM FOR MAMMALIAN SOMATIC CELLS AND ADDITIVE THEREFOR}
본 발명은 포유 동물의 체세포를 체외에서 배양할 때에 사용되는 배지 및 그 배지를 구성하기 위한 첨가제에 관한 것이다.
인간을 포함하는 포유류의 다분화능을 갖는 세포와 이들 세포가 분화된 세포를 포함하는 체세포는 세포 치료나 재생 의료에 사용할 수 있는 중요한 세포이다. 이들 세포를 배양하여 증식시키는 것은 세포 치료용 세포의 생산성이나 이들의 의료 연구의 진행을 촉진시키는 관점에서 중요하다.
체세포는 통상, 10% 정도의 혈청을 첨가한 혈청 배지에서 증식하는 것이 알려져 있다. 혈청으로서는 통상, 배양하고자 하는 체세포가 유래되는 개체 유래의 혈액, 예를 들면, 배양하는 체세포를 채취한 환자의 혈액으로부터 얻은 자기 유래의 혈청이나 소혈청 등의 이종 유래의 혈청이 사용된다.
그러나, 자기 유래의 혈청을 사용하는 경우에는 환자의 혈액을 비교적 대량으로 사용하지 않으면 안되므로 환자의 부담이 크다는 문제가 있다. 또한, 이종 유래의 혈청을 사용하는 경우에는 미지의 바이러스나 프리온 등의 감염성 병원체가 혼입되어 있을 가능성이 있다는 문제가 있다.
또한, 어느 혈청이나 그 성분이 완전히 해명되어 있는 것은 아니고, 사용하는 혈청의 기원이나 시판 제품의 로트에 의해 함유 성분이 다를 가능성이 있으므로 혈청을 대량으로 사용하여 배양하는 경우에는 얻어지는 배양 세포의 품질을 일정하게 하는 것이 어렵다는 문제점도 있다.
따라서, 혈청을 사용하지 않거나 또는 그 사용량을 가능한 한 억제한 배지에서 체세포를 증식시키는 것이 요구되고 있다.
일본 특허공표 평11-506610호(특허문헌 1)에는 최소 필수 배지, 혈청 알부민, 철원, 인슐린 및 글루타민을 함유하는 인간 간엽계 세포용 무혈청 배지가 개시되어 있다. 이 무혈청 배지에는 인간 간엽계 세포의 유사 핵분열 촉진 활성을 갖는 세로토닌을 첨가해도 좋은 것이 기재되어 있다. 그러나, 세로토닌을 첨가한 무혈청 배지에서 간엽계 간세포를 배양해도 증식이 비교적 늦고, 또한 단기간에 세포의 형질이 변화되어 증식성이 저하된다는 문제가 있었다.
일본 특허공표 2006-505248호(특허문헌 2)에는 리소인지질 수용체, 즉, 내피 세포 분화 유전자(Edg) 패밀리 리셉터의 리간드, 예를 들면, 리소포스파티딘산(LPA), 스핑고신1인산(S1P) 등을 함유하는 인간 배성간(ES) 세포의 분화를 조절하기 위한 무혈청 배지가 개시되어 있다. LPA는 지방 전구 세포의 지방 세포로의 분화를 억제하는 효과{J. Biol. Chem. Vol.280, 15, 14656-14662(2005); 비특허문헌 1}도 알려져 있다. 또한, LPA는 세포 증식 촉진 효과를 갖는 것도 알려져 있지만(Sci. STKE, Vol.2005, Issue 292, pp. pe35, 12 July 2005; 비특허문헌 2, American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. Vol.34, pp.274-285, 2006; 비특허문헌 3), 세포 증식 촉진 효과는 혈청 함유 배지에서 확인된 것이며, 무혈청 배지 또는 1% 이하의 저혈청 배지에서의 세포 증식 촉진 효과는 알려져 있지 않다.
또한, WO 2007/080919(특허문헌 3)에는 인간 골수 유래 간엽계 간세포의 무혈청 배지에 대해서 기재되어 있고, 배양 조건으로서 ITS 첨가물(인슐린, 트랜스페린, 셀렌 함유 첨가물) 외에 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 간세포 성장 인자(HGF), 트랜스포밍 성장 인자(TGF-β), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)가 필수라는 것이 기재되어 있지만 첨가하는 성장 인자를 3종 이하로 하면 증식성이 저하된다는 문제가 있었다.
인간을 포함하는 포유류의 다분화능을 갖는 세포의 증식에는 사이토카인이나 성장 인자가 영향을 주는 것이 알려져 있다. 예를 들면, 혈소판 유래 증식 인자(PDGF), 염기성 섬유아세포 증식 인자(bFGF), 상피 세포 증식 인자(EGF) 등을 들 수 있다(Folia Histochemica Et Cytobiological Vol.44, No.4, pp.215-230, 2006; 비특허문헌 6, J Cell Biochem. Vol.64, 2, pp.278-94, 1997; 비특허문헌 7).
In vitro에서의 인간을 포함하는 포유류의 체세포의 배양시에 N-아세틸-L-시스테인(NAC)은 아포토시스를 저해함으로써 세포사(細胞死)를 줄이는 효과가 있는 것이 알려져 있다(Molecular Human Reproduction Vol.8, No3.3, pp.228-236, 2002; 비특허문헌 8, J Leukoc Biol. Vol.76, No.1, pp.152-61, 2004; 비특허문헌 9).
일본 특허공표 평11-506610호 공보 일본 특허공표 2006-505248호 공보 WO, 2007/080919
J. Biol. Chem. Vol.280, 15, 14656-14662(2005) Sci. STKE, Vol.2005, Issue 292, p.pe35, 12 July 2005 American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. Vol.34, pp.274-285, 2006 Science. Vol.294, pp.1875-1878, 2001 J Biol Chem. Vol.277, No.29, pp.25851-25854, 2002 Folia Histochemica Et Cytobiological Vol.44, No.4, pp.215-230, 2006 J Cell Biochem. Vol.64, 2, pp.278-94, 1997 Molecular Human Reproduction Vol.8, No3.3, pp.228-236, 2002 J Leukoc Biol. Vol.76, No.1, pp.152-61, 2004
본 발명은 포유 동물의 체세포를 배양할 때, 배지로의 혈청의 첨가를 가능한 한 억제하거나 또는 혈청을 첨가하지 않고 포유 동물의 체세포를 효과적으로 증식시킬 수 있는 포유 동물 체세포용 배지 및 그것을 구성하기 위한 첨가제를 제공하는 것을 과제로 한다.
본원 발명자들은 예의 연구의 결과, 내피 세포 분화 유전자(Edg) 패밀리 리셉터에 대한 리간드와, 세로토닌 리셉터에 대한 리간드를 배지에 배합함으로써 배지가 혈청을 전혀 또는 소량밖에 함유하지 않는 경우이어도 효과적으로 포유 동물의 체세포를 증식시킬 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명은 내피 세포 분화 유전자(Edg) 패밀리 리셉터에 대한 리간드와, 세로토닌 리셉터에 대한 리간드를 함유하는 포유 동물 체세포용 배지를 제공한다. 또한, 본 발명은 내피 세포 분화 유전자(Edg) 패밀리 리셉터에 대한 리간드와, 세로토닌 리셉터에 대한 리간드를 함유하는 포유 동물 체세포용 배지의 첨가제를 제공한다.
(발명의 효과)
본 발명의 배지 및 배지 첨가제는 체세포를 배양할 때에 종래 배지에 첨가되고 있던 혈청을 사용하지 않거나 또는 그 첨가량을 저감시킨 조건하에서 체세포를 효율적으로 증식시키는 것을 가능하게 한다. 따라서, 혈청을 사용함으로써 발생되고 있던 문제, 즉 환자에게의 부담, 감염성 병원체의 혼입 등을 해결할 수 있다. 또한, 혈청을 첨가하는 경우라도 첨가하는 혈청의 로트 사이의 편차에 기인하는 세포의 증식성의 편차를 억제할 수 있다. 또한, 혈청으로서 인간 혈청을 이용해도 체세포를 효율적으로 증식시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 배양 방법에 의해 혈청의 사용량을 억제하여 체세포를 배양할 수 있으므로 안정적인 품질의 배양 체세포를 제공할 수 있다. 따라서, 얻어지는 배양 체세포는 감염성 병원체의 혼입의 문제가 최소한으로 억제된 안정된 품질의 배양 체세포로 할 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 얻어진 인간 지방 조직 유래 간세포(hMADS)의 집단 배화수(集團倍化數)의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 2는 실시예 1에서 얻어진 인간 지방 조직 유래 간세포(hMADS)의 집단 배화수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3은 실시예 1에서 얻어진 인간 지방 조직 유래 간세포(hMADS)의 집단 배화수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 인간 지방 조직 유래 간세포(hMADS)의 지방 세포로의 분화(A) 및 골세포로의 분화(B)를 나타낸다.
도 5는 실시예 2에서 얻어진 인간 골수 유래 간엽계 간세포(hMSC)의 집단 배화수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6은 실시예 2에서 얻어진 인간 골수 유래 간엽계 간세포(hMSC)의 집단 배화수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 7은 실시예 2에서 얻어진 인간 골수 유래 간엽계 간세포(hMSC)의 집단 배화수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 8은 실시예 2에서 얻어진 인간 골수 유래 간엽계 간세포(hMSC)의 집단 배화수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 9는 인간 골수 유래 간엽계 간세포(hMSC)의 지방 세포로의 분화(A) 및 골세포로의 분화(B)를 나타낸다.
도 10은 실시예 3에서 얻어진 인간 섬유아세포(hFB)의 집단 배화수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 11은 실시예 4에서 얻어진 인간 골수 유래 간엽계 간세포(hMSC)의 집단 배화수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 12는 실시예 4에서 얻어진 인간 골수 유래 간엽계 간세포(hMSC)의 집단 배화수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 13은 실시예 4에서 얻어진 인간 골수 유래 간엽계 간세포(hMSC)의 집단 배화수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 14는 실시예 4에서 얻어진 인간 골수 유래 간엽계 간세포(hMSC)의 집단 배화수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 15는 실시예 4에서 얻어진 다른 로트의 소 태아 혈청(FCS)을 함유하는 배지에서 14일간 배양한 인간 골수 유래 간엽계 간세포(hMSC)의 집단 배화수를 나타내는 도면이다.
도 16은 실시예 5에서 얻어진 인간 혈청을 함유하는 배지에서 배양한 인간 골수 유래 간엽계 간세포(hMSC)의 집단 배화수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 17은 실시예 5에서 얻어진 인간 혈청을 함유하는 배지에서 배양한 인간 골수 유래 간엽계 간세포(hMSC)의 집단 배화수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 18은 실시예 6에서 얻어진 인간 골수 유래 간엽계 간세포(hMSC)의 집단 배화수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 19는 실시예 6에서 얻어진 인간 골수 유래 간엽계 간세포(hMSC)의 지방 세포로의 분화(A) 및 골세포로의 분화(B)를 나타낸다.
도 20은 실시예 7에서 얻어진 인간 골수 유래 간엽계 간세포(hMSC)의 집단 배화수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 21은 실시예 7에서 얻어진 인간 골수 유래 간엽계 간세포(hMSC)의 지방 세포로의 분화(A) 및 골세포로의 분화(B)를 나타낸다.
본 명세서에 있어서 「체세포」란, 다세포 생물을 구성하는 세포 중 생식 세포 이외의 세포이며, 어떤 목적으로 특화하여 그 이외의 세포는 되지 않는 분화된 세포와, 몇종류인가의 다른 기능을 갖는 세포로 분화되는 능력을 갖는 세포를 포함한다. 전자의 세포는 성체의 기능성 세포이며, 피부 세포, 신경 세포, 근육 세포, 혈액계 세포, 섬유아세포, 간장 세포, 연골 세포, 지방 세포 등 생체 내의 각 기관을 형성하는 세포를 포함한다. 후자는 간세포라고 불리며, 상기 분화된 세포 중 적어도 1종류 이상의 분화 세포로 분화 전환할 수 있는 세포이며, 배성 간세포 및 체성 간세포를 포함한다. 「체성 간세포」는 몇종류인가의 다른 기능을 갖는 세포로 분화되는 능력을 갖는 간세포 및 전구 세포 중 배성 간세포를 제외한 세포이며, 유도 다기능 간세포, 조혈 간세포, 간엽계 간세포, 신경 간세포, 피부 간세포, 간 간세포, 췌장 간세포 등을 포함한다.
본 발명의 배지 중에서 배양되는 세포로서는 포유 동물의 체세포이면 조금도 한정되지 않고, 바람직한 예로서 선유아세포 등의 간엽계 세포, 지방 조직 유래 간세포나 골수 유래 간엽계 간세포 등의 체성 간세포를 들 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 배지에는 내피 세포 분화 유전자(Edg) 패밀리 리셉터에 대한 리간드가 필수 성분으로서 함유된다. 여기에서, Edg 패밀리 리셉터는 그 유전자 배열의 상동성이 높은 G단백질 공역형 리셉터의 일군이며, 현재까지 인간, 생쥐, 양 등의 포유류에서 Edg-1~Edg-8이 동정되어 있다(비특허문헌 4, 5). 이들 중 Edg-2, Edg-4 및 Edg-7은 LPA 리셉터로서 기능하고, Edg-1, Edg-3, Edg-5, Edg-6 및 Edg-8은 S1P 리셉터로서 기능하는 것이 알려져 있다. 또한, 「리셉터에 대한 리간드」란, 상기 리셉터와 특이적으로 결합하는 물질이며, 생체 내에 존재하는 천연의 리간드 뿐만 아니라, 아고니스트나 안태고니스트로서 알려지는 천연 또는 합성된 다른 화합물도 포함한다.
Edg 패밀리 리셉터에 대한 리간드(이하, 편의적으로 「Edg 리간드」라고 부르는 경우가 있음)로서는 리소포스파티딘산(LPA) 및 그 염, 스핑고신1인산(S1P) 및 Edg 패밀리 리셉터의 아고니스트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 복수종의 화합물이 바람직하다.
Edg 패밀리 리셉터의 아고니스트란, Edg 패밀리 리셉터와 결합하여 LPA 및 S1P와 마찬가지로 작용하는 물질이며, 예를 들면, 디히드로스핑고신1인산, 혈소판 활성화 인자(PAF), 스핑고실포스포릴콜린, 알킬LPA아날로그, FTY720 등을 들 수 있다.
LPA란, 하기의 일반식(I):
R-O-CH2CH(OH)CH2PO4H2 (I)
(식 중 R은 탄소수 10~30의 알킬기, 탄소수 10~30의 알케닐기 또는 탄소수 10~30의 아실기임)
으로 나타내어지는 화합물이다.
상기 식(I)의 R기에 대한 아실기의 탄소수는 카르보닐기의 탄소수를 포함하지 않는다.
LPA의 염으로서는 종래 공지의 염을 사용할 수 있고, 예를 들면, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 암모늄염 등을 들 수 있다.
LPA 또는 LPA의 염으로서는 예를 들면, 1-올레오일리소포스파티딘산나트륨염, LPA 칼륨염 등을 들 수 있다.
Edg 리간드는 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상의 것을 조합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 배지는 세로토닌 리셉터에 대한 리간드(이하, 편의적으로 「세로토닌 리간드」라고 부르는 경우가 있음)를 더 함유한다. 세로토닌 리셉터는 주로 중추 신경계에 있는 G단백질 결합 리셉터의 일종이다. 세로토닌 리간드로서는 세로토닌, 그 염 및 세로토닌 아고니스트로부터 선택되는 1개 또는 복수종의 화합물이 바람직하다. 세로토닌은 5-히드록시트립타민이라고도 불리며, 신경 전달 물질로서 작용하는 것이 알려져 있다. 세로토닌 아고니스트란, 세로토닌 리셉터와 결합해서 세로토닌과 마찬가지로 작용하는 것이 알려져 있는 물질이며, 예를 들면, 입사피론, 제로핀, 부스피론, 1-[2-(4-아미노페닐)에틸]-4-(3-비플루오로메틸페닐)피페라진(PADD), N,N-디프로필-5-카르복시아미드트립타민(DP-5CT), α-메틸-5-히드록시트립타민(HT), 2-메틸-5-HT 등을 들 수 있다. 세로토닌의 염은 종래 공지의 염을 사용할 수 있고, 예를 들면, 염산염 등을 들 수 있다.
세로토닌 리간드는 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상의 것을 조합하여 사용할 수도 있다.
배지 중의 Edg 리간드의 농도(복수 종류의 것이 함유되는 경우에는 그 합계 농도)는 통상 0.01~100μM 정도이다. Edg 리간드가 리소포스파티딘산(LPA) 및 그 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 경우에는 그 배지 중의 농도는 0.25~10μM가 바람직하다. 또한, Edg 리간드가 스핑고신1인산(S1P)인 경우에는 그 배지 중의 농도는 0.01μM~0.2μM가 바람직하다. 또한, 배지 중의 세로토닌 리간드의 농도(복수 종류의 것이 함유되는 경우에는 그 합계 농도)는 0.1~100μM가 바람직하며, 0.25~20μM가 더욱 바람직하다.
본 발명의 배지는 항산화제를 더 함유하는 것이 바람직하다. 항산화제의 바람직한 예로서는 N-아세틸시스테인(NAC), L-시스테인, 카탈라아제, 슈퍼옥시드 디스뮤타아제 및 2-메르캅토에탄올로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종, 더욱 바람직하게는 N-아세틸시스테인 및 L-시스테인으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 들 수 있다. 이들 항산화제는 아포토시스 저해 작용을 갖는 것이 알려져 있고, 따라서, 배양 세포의 유지, 증식에 유효하다. 항산화제는 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상의 것을 조합하여 사용할 수도 있다.
배지 중의 항산화제의 농도(복수 종류의 것이 함유되는 경우에는 그 합계 농도)는 0.01mM~10mM가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.1mM~1mM이다.
본 발명의 배지는 동물 혈청 알부민을 더 함유하는 것이 바람직하다. 알부민은 혈청의 주요 성분이며, 혈액 중에서는 약물의 수송 등의 역할을 하고 있는 것이 알려져 있다. 동물 혈청 알부민을 함유함으로써 배양 세포의 증식이 한층 더 촉진된다. 동물 혈청 알부민의 바람직한 예로서 인간 혈청 알부민(HSA) 및 유전자 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA), 소혈청 알부민(BSA) 등을 들 수 있다. 이들 알부민은 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상의 것을 조합하여 사용할 수도 있다.
배지 중의 알부민의 농도(복수 종류의 것이 함유되는 경우에는 그 합계 농도)는 0.0001~10중량%가 바람직하며, 0.0001~1중량%가 더욱 바람직하다.
본 발명의 배지는 성장 인자를 더 함유하는 것이 바람직하다. 성장 인자를 함유함으로써 배양 세포의 증식이 한층 더 촉진된다. 성장 인자의 바람직한 예로서는 상피 성장 인자(EGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 트랜스포밍 성장 인자(TGF), 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF), 혈관 내피 세포 증식 인자(VEGF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 에리스로포이에틴(EPO), 트롬보포이에틴(TPO), 간세포 증식 인자(HGF) 등을 들 수 있고, 더욱 바람직한 예로서 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 상피 성장 인자(EGF)를 들 수 있다. 이들 성장 인자 자체는 모두 이 분야에 있어서 주지이다. 성장 인자는 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상의 것을 조합하여 사용할 수도 있다. 특히, 하기 실시예에 구체적으로 나타내어지는 바와 같이, 성장 인자로서 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)와 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)의 2종류만을 함유하는 것이라도 간엽계 간세포의 증식이 충분히 달성되므로 간엽계 간세포의 배양에 사용되는 배지에서는 배지 중에 함유되는 성장 인자는 이들 2종류의 성장 인자만이라도 충분하다.
본 발명의 배지는 혈소판 유래 성장 인자 리셉터(PDGFR)에 대한 리간드(PDGF)를 더 함유하고 있어도 좋고, 특히, 간엽계 간세포를 배양하는 배지에서는 이것을 함유하는 것이 바람직하다. PDGFR은 주로 간엽계 세포에 있는 티로신 키나아제 관련형 수용체의 일종이며, 이것에 대한 리간드를 함유함으로써 간엽계 간세포를 효율적으로 세포를 증식시킬 수 있다. PDGFR의 리간드로서는 PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD 등을 예시할 수 있고, 이들은 모두 주지이다. PDGFR의 리간드는 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상의 것을 조합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 배지는 염기성 선유아세포 성장 인자 리셉터(FGFR)에 대한 리간드(FGF)를 함유하고 있어도 좋고, 특히 간엽계 간세포를 배양하는 배지에서는 이것을 함유하는 것이 바람직하다. FGFR은 주로 간엽계 세포에 존재하는 것이 알려져 있고, 이것에 대한 리간드를 함유함으로써 간엽계 간세포의 수명을 개선시킨다. PDGFR의 리간드로서는 염기성 선유아세포 성장 인자(bFGF)와 산성 선유아세포 성장 인자(aFGF) 등 합계 20종 이상 존재하는 것이 알려져 있다. 예를 들면, FGF-1, FGF-4 등을 들 수 있다. 특히 bFGF는 조직의 형성에 강하게 관여하고 있는 것이 알려져 있다. 이들은 모두 주지이다.
성장 인자의 농도(복수 종류의 것이 함유되는 경우에는 그 합계 농도)는 0.1~100ng/mL가 바람직하며, 1~10ng/mL가 더욱 바람직하다.
본 발명의 배지는 계면활성제를 더 함유하고 있어도 좋다. 저농도의 계면활성제를 함유함으로써 세포막에의 악영향을 감소시키는 효과 등이 있다고 여겨진다. 한편, 고농도의 계면활성제를 배지에 첨가하면 세포 증식 저해나 세포사의 유도를 하는 것이 알려져 있다. 계면활성제로서는 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산에스테르(상품명 Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 등), 알킬페녹시폴리에틸렌글리콜(상품명 Triton X-100 등), 알킬페닐폴리에틸렌글리콜(상품명 Triton X-114, NP-40 등)의 비이온성 계면활성제가 바람직하다. 계면활성제는 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상의 것을 조합하여 사용할 수도 있다.
계면활성제의 농도(복수 종류의 것이 함유되는 경우에는 그 합계 농도)는 통상, 0.1~100ng/mL이며, 바람직하게는 1~10ng/mL이다.
본 발명의 배지는 통상의 포유 동물 세포용 배지와 마찬가지로 혈청을 함유하고 있어도 좋지만 Edg 리간드 및 세로토닌 리간드의 양자를 함유함으로써 혈청을 함유하지 않거나 저농도로밖에 함유하지 않는 배지이어도 세포를 효율적으로 증식시킬 수 있으므로 배지가 무혈청 배지 또는 저혈청 배지인 경우에 본 발명의 위력이 가장 잘 발휘된다. 즉, 본 발명의 배지에 있어서의 혈청의 함유량은 배지 전량에 대하여 0~5중량%가 바람직하며, 보다 바람직하게는 0~1중량%이다. 또한, 본 명세서 및 특허 청구 범위에 있어서 혈청을 함유하지만 그 함유량이 5중량% 이하, 바람직하게는 1중량%인 배지를 저혈청 배지라고 부른다.
본 발명의 배지는 상기한 Edg 리간드 및 세로토닌 리간드, 바람직하게는 상기한 항산화제, 동물 혈청 알부민, 성장 인자 및 계면활성제 중 1종 이상을 더 함유하는 것을 제외하고, 공지의 포유 동물 세포용 배지와 동일해도 좋다. 따라서, 기본적으로 공지의 기초 배지, 바람직하게는 무혈청 또는 저혈청 기초 배지에 상기 한 2종류의 필수 성분, 바람직하게는 상기한 바람직한 성분 중 1종 이상을 더 첨가함으로써 본 발명의 배지를 얻을 수 있다.
종래 공지의 무혈청 기초 배지로서는 이글 배지와 같은 최소 필수 배지(MEM), 둘베코 개변 이글 배지(DMEM), 최소 필수 배지α(MEM-α), 간엽계 세포 기초 배지(MSCBM), Ham's F-12 및 F-10 배지, DMEM/F12 배지, Williams 배지 E, RPMI-1640 배지, MCDB 배지, 199 배지, Fisher 배지, Iscove 개변 둘베코 배지(IMDM), McCoy 개변 배지 등을 들 수 있다.
본 발명의 배지는 포유 동물 세포용 배지에 더 함유시키는 것이 주지인 각종 첨가제를 함유하고 있어도 좋다. 이러한 주지의 첨가제로서 아미노산류, 무기염류, 비타민류 및 탄소원이나 항생 물질 등의 다른 첨가제를 예시할 수 있다.
아미노산류로서는 글리신, L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파라긴산, L-시스테인, L-시스틴, L-글루타민산, L-글루타민, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 및 L-발린을 예시할 수 있다.
무기염류로서는 염화칼슘, 황산동, 질산철(III), 황산철, 염화마그네슘, 황산마그네슘, 염화칼륨, 탄산수소나트륨, 염화나트륨, 인산수소2나트륨, 인산2수소나트륨, 황산아연 및 셀렌산을 예시할 수 있다.
비타민류로서는 콜린, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B4, 비타민 B5, 비타민 B6, 비타민 B7, 비타민 B12, 비타민 B13, 비타민 B15, 비타민 B17, 비타민 Bh, 비타민 Bt, 비타민 Bx, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 F, 비타민 K, 비타민 M 및 비타민 P를 예시할 수 있다.
이들 첨가제를 포유 동물 세포용 배지에 첨가하는 것 자체는 공지이며, 각 첨가제의 첨가량도 공지의 배지와 동일해도 좋고, 또한 루틴한 시험에 의해 적당히 설정할 수도 있다. 예를 들면, 아미노산류의 첨가량은 통상, 각 아미노산마다 5mg/L~500mg/L정도, 바람직하게는 10mg/L~400mg/L 정도이며, 무기염류의 첨가량은 통상, 각 무기염류마다 0mg/L~10g/L 정도, 바람직하게는 0.01mg/L~7g/L 정도이며, 비타민류의 첨가량은 각 비타민마다 0.01mg/L~500mg/L 정도, 바람직하게는 0.05mg/L~300mg/L 정도이다.
다른 첨가제로서는 (1) 코르티코스테론, 프로게스테론 등의 증식 인자, (2) 페니실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신 및 카나마이신 등의 항생 물질, (3) 글루코오스, 갈락토오스, 프룩토오스 및 슈크로스 등의 탄소원, (4) 마그네슘, 철, 아연, 칼슘, 칼륨, 나트륨, 동, 셀렌, 코발트, 주석, 몰리브덴, 니켈 및 규소 등의 미량 금속 및 아데노신5'-1인산, 코르티코스테론, 에탄올아민, 인슐린, 환원형 글루타티온, 리포산, 히포크산틴, 페놀 레드, 프로게스테론, 푸트레신, 피루빈산, 티미딘, 트리요오드티로닌, 트랜스페린 및 락토페린 등의 다른 첨가제를 예시할 수 있다. 이들 첨가제의 첨가량도 종래와 동일해도 좋고, 또한 각 첨가제의 목적에 따라 루틴한 시험에 의해 적당히 설정할 수도 있다. 통상, 0.001mg/L~5g/L, 특히 0.1~3g/L 정도이다.
본 발명의 배지는 체세포의 증식 또는 유지를 위한 배양에 사용할 수 있는 것 외에 배양하는 세포가 간세포인 경우에는 간세포의 분화 유도를 위해서 사용할 수도 있다. 간세포의 분화 유도에 사용하는 경우에는 분화 유도제가 더 첨가된다. 분화 유도제로서는 사이토카인(각종 인터류킨, 에리스로포이에틴, 트롬보포이에틴 등), 콜로니 자극 인자(예를 들면, G-CSF 등), 스테로이드 호르몬(덱사메타손 등), 인돌(인도메타신 등), 티아졸리딘 유도체(로시글리타존 등) 등을 예시할 수 있다. 이들 중 1개 또는 복수종을 사용할 수 있다. 분화 유도제의 첨가량도 종래와 동일해도 좋고, 통상, 배지 전량에 대하여 1×10-10~1×10-6중량% 정도 첨가된다.
본 발명의 배지는 상기한 각종 첨가제 중 1종 또는 복수종을 함유할 수 있고, 통상, 복수의 첨가제를 조합하여 함유한다.
본 발명의 배지 중에서의 포유 동물 체세포의 배양 자체는 종래와 동일한 방법에 의해 행할 수 있고, 통상, 30~37℃의 온도 및 5% CO2 환경하 및 5~21% O2 환경하에서 행해진다.
본 발명은 또한 상기한 본 발명의 배지를 구성하기 위한 첨가제도 제공한다. 따라서, 본 발명의 첨가제는 상기한 Edg 리간드 및 세로토닌 리간드를 함유한다. 바람직하게는 상기한 바람직한 각종 성분을 더 함유한다. 또한, 상기한 각종 첨가제 중 1종 또는 복수종을 함유하고 있어도 좋다. 본 발명의 첨가제는 물 또는 기초 배지에 용해함으로써 상기한 본 발명의 배지를 부여하는 조성을 갖는 것이 간편하여 바람직하다. 이 경우에는 첨가제에 함유되는 각종 성분의 배합 비율은 배지에 있어서의 각 성분의 함유량의 비율과 동일하게 된다. 또한, 기초 배지로서는 종래부터 포유 동물 세포의 배양에 사용되고 있는 상기한 각종 배지를 예시할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 「%」는 특별히 언급이 없는 한, 「중량%」를 의미하고, 각종 첨가물의 농도는 배지 중에서의 최종 농도를 의미한다. 따라서, 예를 들면, 「2.5ng/mL의 염기성 섬유아세포 증식 인자(bFGF)를 첨가한 저혈청 배지 C」는 bFGF의 저혈청 배지 C 중에서의 최종 농도가 2.5ng/mL가 되는 양을 첨가한 것을 의미한다.
실시예 1
실시예 1: 인간 지방 조직 유래 간세포(hMADS)의 배양
(1-1) 리간드의 제조
세로토닌 리간드로서 2.1mg의 세로토닌 염산염(Sigma사제)을 10mL의 DMEM(LONZA사제)에 용해하여 리간드 1(S-1)을 제조했다. 또한, Edg 리간드로서 2.3mg의 1-올레일리소포스파티딘산나트륨염(LPA: CAYMAN사제)을 10mL의 PBS에 용해하여 리간드 2(S-2)를 제조했다. 또한, 2.1mg의 세로토닌 염산염 및 2.3mg의 LPA를 10mL의 PBS에 용해하여 리간드 3(S-3)을 제조했다.
(1-2) hMADS의 증식
아미노산류(상기한 전체 아미노산류), 무기염류(상기한 전체 무기염류), 비타민류(상기한 전체 비타민류) 및 다른 첨가제(아데노신5'-1인산, 코르티코스테론, 에탄올아민, D-갈락토오스, D-글루코오스, 인슐린, 환원형 글루타티온, 리포산, 히포크산틴, 페놀 레드, 프로게스테론, 푸트레신, 피루빈산, 티미딘, 트리요오드티로닌 및 트랜스페린)를 함유하는 배지에 7×10-4%의 2-메르캅토에탄올(2-Me), 100U/mL의 페니실린·스트렙토마이신(GIBCO사제), 0.5%의 소 태아 혈청(FCS) 및 2.5ng/mL의 염기성 섬유아세포 증식 인자(bFGF)를 첨가한 저혈청 배지 C를 얻었다.
저혈청 배지 C에 (1-1)에서 제조한 S-1 및/또는 S-2를 각종 농도로 첨가한 저혈청 배지를 얻었다. 구체적으로는 이하의 농도로 S-1 및/또는 S-2를 첨가했다.
저혈청 배지 C에 0%의 S-1 및 0.2%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.2% S-2),
저혈청 배지 C에 0.001%의 S-1 및 0.2%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.2% S-2, 0.001% S-1),
저혈청 배지 C에 0.01%의 S-1 및 0.2%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.2% S-2, 0.01% S-1),
저혈청 배지 C에 0.1%의 S-1 및 0.2%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.2% S-2, 0.1% S-1),
저혈청 배지 C에 1%의 S-1 및 0.2%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.2% S-2, 1% S-1),
저혈청 배지 C에 10%의 S-1 및 0.2%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.2% S-2, 10% S-1),
저혈청 배지 C에 0.1%의 S-1 및 0%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.1% S-1),
저혈청 배지 C에 0.1%의 S-1 및 0.002%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.1% S-1, 0.002% S-2),
저혈청 배지 C에 0.1%의 S-1 및 0.02%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.1% S-1, 0.02% S-2),
저혈청 배지 C에 0.1%의 S-1 및 0.2%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.1% S-1, 0.2% S-2),
저혈청 배지 C에 0.1%의 S-1 및 0.5%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.1% S-1, 0.5% S-2),
저혈청 배지 C에 0.1%의 S-1 및 1%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.1% S-1, 1% S-2),
저혈청 배지 C에 0.1%의 S-1 및 2%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.1% S-1, 2% S-2),
저혈청 배지 C에 1%의 S-1 및 0%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(1% S-1),
저혈청 배지 C에 0%의 S-1 및 1%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(1% S-2),
저혈청 배지 C에 1%의 S-1 및 1%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(1% S-1, 1% S-2).
또한, 1%의 S-1은 약 10μM, 1%의 S-2는 약 5μM에 상당한다.
DMEM/F12에 1% 비필수 아미노산(GIBCO사제), 7×10-4%의 2-ME, 100U/L의 페니실린·스트렙토마이신, 10% FCS, 2.5ng/mL의 bFGF를 첨가하여 종래의 혈청 함유 배지를 얻었다(종래 배지).
이들 배지 10mL를 각각 직경 100㎜의 배양 접시에 넣어 초기 세포수 10,000세포/mL로 hMADS를 파종하고, 37℃에서 5% CO2 환경하에서 배양을 행했다.
배양 개시로부터 21일 동안의 집단 배화수(n)의 변화를 세포 계대(繼代)마다의 세포수를 혈구 계측반을 이용하여 계측한 결과로부터 계산했다. 집단 배화수란, 세포 분열이 행해진 횟수(n)이다. 세포 분열에서는 1개의 세포가 2개로 분열되므로 n회의 분열이 행해지면 세포수는 2n이 된다. 집단 배화수는 이하의 식에 기초하여 구해진다.
집단 배화수(n)= Log(2)[(P1 계측 세포수/P1 파종 세포수)×(P2 계측 세포수/P2 파종 세포수)×…]
(상기 식 중 P1, P2…는 제 1 계대, 제 2 계대 …를 나타냄.)
집단 배화수가 1회 많은 것은 세포수가 2배 많은 것을 나타내고, 2회 많은 것은 세포수가 4배 많은 것을 나타내므로 집단 배화수가 x회 많으면 세포수는 2x배 많은 것을 나타낸다.
결과를 도 1~3에 나타낸다.
도 1은 S-2의 농도를 일정하게 한 경우의 집단 배화수의 변화를 나타낸다.
도 1에서는 종래 배지(○), 저혈청 배지 C(▲), 0.2% S-2(×), 0.2% S-2, 0.001% S-1(-), 0.2% S-2, 0.01% S-1(*), 0.2% S-2, 0.1% S-1(+), 0.2% S-2, 1% S-1(△) 및 0.2% S-2, 10% S-1(◆)의 집단 배화수를 나타낸다.
도 2는 S-1의 농도를 일정하게 한 경우의 집단 배화수의 변화를 나타낸다.
도 2에서는 종래 배지(○), 저혈청 배지 C(▲), 0.1% S-1(×), 0.1% S-1, 0.002% S-2(-), 0.1% S-1, 0.02% S-2(*), 0.1% S-1, 0.2% S-2(+), 0.1% S-1, 0.5% S-2(△), 0.1% S-1, 1% S-2(◆) 및 0.1% S-1, 2% S-2(◇)의 집단 배화수를 나타낸다.
또한, 상기 저혈청 배지 C에 S-3을 1% 첨가한 경우의 결과를 도 3에 나타낸다.
도 3에서는 종래 배지(○), 저혈청 배지 C(▲), 1% S-1(◆), 1% S-2(■) 및 1% S-3(●)의 집단 배화수를 나타낸다.
(1-3) hMADS의 지방 세포로의 분화
(1-2)의 종래 배지 및 저혈청 배지 C에 S-3을 첨가한 배지를 이용하여 수계대 유지한 세포를 21000세포/㎠의 세포 밀도로 지방 세포 분화 배지(DMEM, 10% FCS, 500μM 이소부틸메틸크산틴(IBMX), 1μM 덱사메타손, 1μM 인슐린, 1μM 로시글리타존) 0.1mL를 함유하는 96구멍 배양 플레이트의 웰에 옮기고, 37℃, 5% CO2에 의해 10일간 배양함으로써 지방 세포로의 분화 유도를 행했다. 지방 세포로의 분화는 오일 레드 O 염색에 의해 확인했다. 결과를 도 4의 (A)에 나타낸다.
(1-4) hMADS의 골세포로의 분화
(1-2)의 종래 배지 및 저혈청 배지 C에 S-3을 첨가한 배지를 이용하여 수계대 유지한 세포를 10000세포/㎠의 세포 밀도로 골세포 분화 배지(DMEM, 10% FCS, 200μM 아스코르빈산, 0.1μM 덱사메타손, 10mM β-글리세로포스페이트) 0.5mL를 함유하는 24구멍 배양 플레이트의 웰에 옮기고, 37℃, 5% CO2에 의해 15일간 배양함으로써 골세포로의 분화 유도를 행했다. 골세포로의 분화는 알리자린 레드 S 염색에 의해 확인했다. 결과를 도 4의 (B)에 나타낸다.
도 4의 결과로부터 저혈청 배지 C에 S-3을 첨가한 배지에서 배양한 hMADS는 10% 혈청을 함유하는 종래 배지에서 배양한 세포와 동일한 정도로 염색되고, 따라서, 동일한 정도로 지방 세포 및 골세포로 분화된 것을 알 수 있다. 따라서, 이들 배지에서 배양한 세포는 모두 미분화성 유지 능력을 갖고 있고, 간세포로서의 분화 능력에 차가 없는 것을 알 수 있다.
또한, (1-2)에서 사용한 FCS 대신에 인간 혈청을 사용해도 도 1~4에서 나타내는 증식 및 분화의 경향은 변하지 않는 것이 확인되었다.
실시예 2
실시예 2: 인간 골수 유래 간엽계 간세포(hMSC)의 배양
(2-1) 리간드의 제조
세로토닌 리간드로서 2.1mg의 세로토닌 염산염(Sigma사제)을 10mL의 DMEM(LONZA사제)에 용해하여 리간드 1(S-1)을 제조했다.
또한, Edg 리간드로서 2.3mg의 1-올레일리소포스파티딘산나트륨염(LPA: CAYMAN사제)을 10mL의 PBS에 용해하여 리간드 2(S-2)를, 1.9mg의 스핑고신-1-인산(S1P: CAYMAN사제)을 10mL의 DMEM에 용해하여 리간드 2(S-2')를 제조했다.
또한, 2.1mg의 세로토닌 염산염 및 2.3mg의 LPA를 10mL의 PBS에 용해하여 리간드 3(S-3)을 제조했다.
(2-2) hMSC의 증식
실시예 1에서 조제한 기초 배지로부터 히포크산틴 및 티미딘 및 일부의 무기염류{황산동, 질산철(III), 황산철, 염화마그네슘, 인산수소2나트륨, 황산아연}를 제외한 기초 배지에 100U/mL의 페니실린·스트렙토마이신(GIBCO사제) 및 0.5%의 FCS를 첨가한 저혈청 배지 C1을 얻었다. 또한, 상기 기초 배지에 100U/mL의 페니실린·스트렙토마이신(GIBCO사제) 및 1.0%의 FCS를 첨가한 저혈청 배지 C2를 얻었다.
저혈청 배지 C1에 (2-1)에서 제조한 S-1 및/또는 2를 각종 농도로 첨가한 저혈청 배지를 얻었다. 구체적으로는 이하의 농도로 S-1 및/또는 S-2를 첨가했다.
저혈청 배지 C1에 0%의 S-1 및 0.2%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.2% S-2),
저혈청 배지 C1에 0.001%의 S-1 및 0.2%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.2% S-2, 0.001% S-1),
저혈청 배지 C1에 0.01%의 S-1 및 0.2%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.2% S-2, 0.01% S-1),
저혈청 배지 C1에 0.1%의 S-1 및 0.2%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.2% S-2, 0.1% S-1),
저혈청 배지 C1에 1%의 S-1 및 0.2%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.2% S-2, 1% S-1),
저혈청 배지 C1에 10%의 S-1 및 0.2%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.2% S-2, 10% S-1),
저혈청 배지 C1에 0.1%의 S-1 및 0%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.1% S-1),
저혈청 배지 C1에 0.1%의 S-1 및 0.002%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.1% S-1, 0.002% S-2),
저혈청 배지 C1에 0.1%의 S-1 및 0.02%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.1% S-1, 0.02% S-2),
저혈청 배지 C1에 0.1%의 S-1 및 0.2%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.1% S-1, 0.2% S-2),
저혈청 배지 C1에 0.1%의 S-1 및 1%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.1% S-1, 1% S-2),
저혈청 배지 C1에 0.1%의 S-1 및 2%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(0.1% S-1, 2% S-2),
저혈청 배지 C1에 1%의 S-1 및 0%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(1% S-1),
저혈청 배지 C1에 0%의 S-1 및 1%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(1% S-2),
저혈청 배지 C1에 1%의 S-1 및 1%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(1% S-1, 1% S-2),
저혈청 배지 C1에 0.5%의 FCS, 1%의 S-1 및 1%의 S-2를 첨가한 저혈청 배지(1% S-3, 1% FCS).
저혈청 배지 C2에 (2-1)에서 제조한 S-1 및/또는 2'를 각종 농도로 첨가한 저혈청 배지를 얻었다. 구체적으로는 이하의 농도로 S-1 및 /또는 S-2'를 첨가했다.
저혈청 배지 C2에 1%의 S-1 및 0.1%의 S-2'를 첨가한 저혈청 배지(0.1% S-2', 1% S-1),
저혈청 배지 C2에 1%의 S-1 및 0.02%의 S-2'를 첨가한 저혈청 배지(0.02% S-2', 1% S-1),
저혈청 배지 C2에 1%의 S-1 및 0.01%의 S-2'를 첨가한 저혈청 배지(0.01% S-2', 1% S-1),
저혈청 배지 C2에 1%의 S-1 및 0.002%의 S-2'를 첨가한 저혈청 배지(0.002% S-2', 1% S-1),
저혈청 배지 C2에 1%의 S-1 및 0.0002%의 S-2'를 첨가한 저혈청 배지(0.0002% S-2', 1% S-1).
10% FCS, L-글루타민 및 항생 물질을 함유하는 인간 간엽계 간세포 전용 배지 키트(hMSC Bullet Kit, LONZA사제)를 종래 배지로 했다.
이들 배지 10mL를 각각 직경 100㎜의 배양 접시에 넣어 초기 세포수 10,000세포/mL로 hMSC를 파종하고, 37℃에서 5% CO2 환경하에서 배양을 행했다.
도 5~7에 대해서는 배양 개시로부터 19일 동안의 집단 배화수(n)의 변화를, 도 8에 대해서는 배양 개시로부터 18일 동안의 집단 배화수(n)의 변화를 세포 계대마다의 세포수를 혈구 계측반을 이용하여 계측한 결과를 이용하여 계산했다. 결과를 도 5~8에 나타낸다.
도 5는 S-2의 농도를 일정하게 한 경우의 집단 배화수의 변화를 나타낸다.
도 5에서는 종래 배지(○), 저혈청 배지 C1(▲), 0.2% S-2(×), 0.2% S-2, 0.001% S-1(-), 0.2% S-2, 0.01% S-1(*), 0.2% S-2, 0.1% S-1(+), 0.2% S-2, 1% S-1(△), 0.2% S-2, 10% S-1(◆), 1% S-1(□), 1% S-2(■) 및 1% S-1, 1% S-2(●)의 집단 배화수를 나타낸다.
도 6은 S-1의 농도를 일정하게 한 경우의 집단 배화수의 변화를 나타낸다.
도 6에서는 종래 배지(○), 저혈청 배지 C1(▲), 0.1% S-1(×), 0.1% S-1, 0.002% S-2(-), 0.1% S-1, 0.02% S-2(*), 0.1% S-1, 0.2% S-2(+), 0.1% S-1, 1% S-2(◆), 0.1% S-1, 2% S-2(◇), 1% S-1(□), 1% S-2(■) 및 1% S-1, 1% S-2(●)의 집단 배화수를 나타낸다.
또한, 상기 저혈청 배지 C1에 S-3을 1% 첨가한 경우의 결과를 도 7에 나타낸다.
도 7에서는 종래 배지(○), 저혈청 배지 C1(▲), 1% S-1(◆), 1% S-2(■) 1% S-3(●) 및 1% S-3, 1% FCS(◇)의 집단 배화수를 나타낸다.
도 8은 S-1의 농도를 일정하게 한 경우의 집단 배화수의 변화를 나타낸다.
도 8에서는 종래 배지(○), 0.1% S-2', 1% S-1(△), 0.02% S-2', 1% S-1(◆), 0.01% S-2', 1% S-1(■), 0.002% S-2', 1% S-1(◇), 0.0002% S-2', 1% S-1(□)의 집단 배화수를 나타낸다.
(2-3) hMSC의 지방 세포로의 분화
(2-2)의 종래 배지 및 1% S-3, 1% FCS를 이용하여 수계대 유지한 세포를 20000세포/㎠의 세포 밀도로 지방 세포 분화 배지(DMEM, 10% FCS, 500μM 이소부틸메틸크산틴(IBMX), 1μM 덱사메타손, 1μM 인슐린, 1μM 로시글리타존) 0.1mL를 함유하는 96구멍 배양 플레이트의 웰에 옮기고, 37℃, 5% CO2에 의해 14일간 배양함으로써 지방 세포로의 분화 유도를 행했다. 지방 세포로의 분화는 오일 레드 O 염색에 의해 확인했다. 결과를 도 9의 (A)에 나타낸다.
(2-4) hMSC의 골세포로의 분화
(2-2)의 종래 배지 및 1% S-3, 1% FCS를 이용하여 수계대 유지한 세포를 3000세포/㎠의 세포 밀도로 골세포 분화 배지(DMEM, 10% FCS, 200μM 아스코르빈산, 0.1μM 덱사메타손, 10mM β-글리세로포스페이트) 0.5mL를 함유하는 24구멍 배양 플레이트의 웰에 옮기고, 37℃, 5% CO2에 의해 14일간 배양함으로써 골세포로의 분화 유도를 행했다. 골세포로의 분화는 알리자린 레드 S 염색에 의해 확인했다. 결과를 도 9의 (B)에 나타낸다.
도 9의 결과로부터 1% S-3, 1% FCS에서 배양한 hMSC는 10% 혈청을 함유하는 종래 배지에서 배양한 세포와 동일한 정도로 염색되고, 따라서, 동일한 정도로 지방 세포 및 골세포로 분화된 것을 알 수 있다. 따라서, 이들 배지에서 배양한 세포는 모두 미분화성 유지 능력을 갖고 있고, 간세포로서의 분화 능력에 차가 없는 것을 알 수 있다.
또한, (2-2)에서 사용한 FCS 대신에 인간 혈청을 사용해도 도 5~9에서 나타내는 증식 및 분화의 경향은 변하지 않는 것이 확인되었다.
또한, Edg 리간드로서 LPA 대신에 S1P를 이용해도 분화의 경향은 변하지 않는 것이 확인되었다.
실시예 3
아미노산류(상기한 전체 아미노산류), 무기염류(상기한 전체 무기염류), 비타민류(상기한 전체 비타민류) 및 다른 첨가제(아데노신5'-1인산, 코르티코스테론, 에탄올아민, D-갈락토오스, D-글루코오스, 인슐린, 환원형 글루타티온, 리포산, 히포크산틴, 페놀 레드, 프로게스테론, 푸트레신, 피루빈산, 티미딘, 트리요오드티로닌 및 트랜스페린)를 함유하는 배지에 7×10-4%의 2-ME, 100U/L의 페니실린·스트렙토마이신, 0.5% FCS, 2.5ng/mL bFGF 및 1%의 (1-1)에서 제조한 S-3을 첨가한 저혈청 배지 3(1% S-3 LS)을 얻었다.
또한, FCS를 함유하지 않는 이외에는 상기 저혈청 배지 3과 동일한 조성으로 무혈청 배지 3(1% S-3 SF)을 얻었다.
DMEM/F12에 1mg/L의 비필수 아미노산(GIBCO사제), 7×10-4%의 2-ME, 100U/L의 페니실린·스트렙토마이신, 10% FCS, 2.5ng/mL의 bFGF를 첨가하여 종래의 혈청 함유 배지를 얻었다(종래 배지).
이들 배지 10mL를 각각 직경 100㎜의 배양 접시에 넣어 초기 세포수 10,000세포/mL로 hFB를 파종하고, 37℃에서 5% CO2 환경하에서 배양을 행했다.
배양 개시로부터 22일 동안의 집단 배화수(n)를 세포 계대마다의 세포수를 혈구 계측반을 이용하여 계측한 결과를 이용하여 계산했다. 결과를 도 10에 나타낸다.
도 10에서는 종래 배지(○), 1% S-3 LS(●) 및 1% S-3 SF(▲)의 집단 배화수를 나타낸다.
실시예 4
실시예 4: 혈청 로트차의 경감 효과(hMSC의 배양)
(4-1) 리간드의 제조
2.1mg의 세로토닌 염산염 및 2.3mg의 LPA를 10ml의 PBS에 용해하여 리간드 3(S-3)을 제조했다.
(4-2) hMSC의 증식
실시예 1에서 조제한 기초 배지로부터 히포크산틴 및 티미딘 및 일부의 무기염류{황산동, 질산철(III), 황산철, 염화마그네슘, 인산수소2나트륨, 황산아연}를 제외한 기초 배지에 100U/ml의 페니실린·스트렙토마이신(GIBCO사제) 및 로트가 다른 FCS를 각각 1.0% 첨가한 저혈청 배지 C2(FCS 1~4)를 얻었다.
저혈청 배지 C2(FCS 1~4)에 (4-1)에서 제조한 1%의 S-3을 첨가하여 저혈청 배지{1% S-3, 1% FCS(1~4)}를 얻었다.
DMEM에 L-글루타민, 항생 물질 및 상기 4종류의 로트에 대응하는 FCS(1~4)를 각각 10% 첨가하여 종래의 혈청 함유 배지를 얻었다{종래 배지(FCS 1~4)}.
이들 배지 10mL를 각각 직경 100㎜의 배양 접시에 넣어 초기 세포수 10,000세포/mL로 hMSC를 파종하고, 37℃에서 5% CO2 환경하에서 배양을 행했다.
배양 개시로부터 18일 동안의 집단 배화수(n)의 변화를 세포 계대마다의 세포수를 혈구 계측반을 이용하여 계측한 결과를 이용하여 계산했다. FCS의 로트를 바꿨을 때의 집단 배화수의 변화를 도 11~14에 나타낸다. 도 11~14에서는 종래 배지(FCS 1~4)를 (○)로, 저혈청 배지{1% S-3, 1% FCS(1~4)}를 (●)로 나타냈다.
또한, 종래 배지(FCS 1~4) 및 저혈청 배지{1% S-3, 1% FCS(1~4)}를 이용하여 14일간 배양했을 때의 집단 배화수(n)를 통합하여 도 15에 나타낸다.
도 11~15의 결과로부터 저혈청 배지(1% S-3, 1% FCS)에서는 10% 혈청을 함유하는 종래 배지와 비교해서 FCS의 제조 로트차에 의한 세포 증식에의 영향이 저감되어 있는 것을 알 수 있다.
실시예 5
실시예 5: 인간 혈청에서의 배양(hMSC의 배양)
(5-1) 리간드의 제조
2.1mg의 세로토닌 염산염 및 2.3mg의 LPA를 10ml의 PBS에 용해하여 리간드 3(S-3)을 제조했다.
(5-2) hMSC의 증식
실시예 1에서 조제한 기초 배지로부터 히포크산틴 및 티미딘 및 일부의 무기염류{황산동, 질산철(III), 황산철, 염화마그네슘, 인산수소2나트륨, 황산아연}를 제외한 기초 배지에 100U/ml의 페니실린·스트렙토마이신(GIBCO사제) 및 로트가 다른 인간 혈청 HS를 각각 1.0% 첨가한 저혈청 배지 C3(HS1, 2)을 얻었다.
저혈청 배지 C3(HS1, 2)에 (5-1)에서 제조한 1%의 S-3을 첨가하여 저혈청 배지{1% S-3, 1% HS(1, 2)}를 얻었다.
DMEM에 L-글루타민, 항생 물질 및 상기 2종류의 로트에 대응하는 인간 혈청 HS(1, 2)를 각각 10% 첨가하여 종래의 혈청 함유 배지를 얻었다{종래 배지(HS1, 2)}.
이들 배지 10mL를 각각 직경 100㎜의 배양 접시에 넣어 초기 세포수 10,000세포/mL로 hMSC를 파종하고, 37℃에서 5% CO2 환경하에서 배양을 행했다.
배양 개시로부터 18일 동안의 집단 배화수(n)의 변화를 세포 계대마다의 세포수를 혈구 계측반을 이용하여 계측한 결과를 이용하여 계산했다. HS의 로트를 바꿨을 때의 집단 배화수의 변화를 도 16, 17에 나타낸다. 종래 배지(HS1, 2)를 (○)로, 저혈청 배지{1% S-3, 1% HS(1, 2)}를 (●)로 나타냈다.
도 16, 17의 결과로부터 인간 혈청을 사용한 저혈청 배지(1% S-3, 1% HS)에서의 배양도 가능한 것을 알 수 있다.
실시예 6
실시예 6: 인간 골수 유래 간엽계 간세포(hMSC)의 배양 2
수중에 아미노산류(상기한 전체 아미노산류), 무기염류{황산동, 질산철(III), 황산철, 염화마그네슘, 인산수소2나트륨, 황산아연을 제외한 상기한 전체 무기염류), 비타민류(상기한 전체 비타민류) 및 다른 첨가제(아데노신5'-1인산, 코르티코스테론, 에탄올아민, D-갈락토오스, D-글루코오스, 인슐린, 환원형 글루타티온, 리포산, 페놀 레드, 프로게스테론, 푸트레신, 피루빈산, 트리요오드티로닌 및 트랜스페린)를 함유하는 기초 배지에 1ng/ml의 혈소판 유래 증식 인자(PDGF), 2.5ng/ml의 염기성 섬유아세포 증식 인자(bFGF), 0.02중량%의 인간 혈청 알부민 및 500μM의 N-아세틸시스테인(NAC), 100U/ml의 페니실린·스트렙토마이신(GIBCO사제) 및 1%의 (1-1)에서 제조한 S-3을 첨가한 무혈청 증식 배지 A를 얻었다.
DMEM에 100U/mL의 페니실린·스트렙토마이신 및 10% FBS를 첨가하여 종래의 혈청 함유 배지를 얻었다(종래 배지 A).
이들 배지 10mL를 각각 직경 100㎜의 배양 접시에 넣어 초기 세포수 15,000세포/mL로 hMSC를 파종하고, 37℃에서 5% CO2 환경하에서 배양을 행했다.
배양 개시로부터 18일간의 집단 배화수(n)의 변화를 계대 배양마다의 세포수를 혈구 계측반을 이용하여 계측한 결과를 이용하여 계산했다.
결과를 도 18에 나타낸다. 도 18에 나타내어지는 바와 같이, 본 발명의 무혈청 증식 배지 A 중에서 배양하면 무혈청임에도 불구하고, 또한 성장 인자를 2종류밖에 함유하고 있지 않음에도 불구하고, 집단 배가수는 혈청을 함유하는 종래 배지 A에서 배양한 경우와 동등했다.
hMSC의 지방 세포로의 분화
종래 배지 A 및 무혈청증식 배지 A에서 수계대 유지한 세포를 30000세포/㎠의 세포 밀도로 지방 세포 분화 배지(DMEM, 10% FCS, 500μM의 IBMX, 1μM의 덱사메타손, 1μM의 인슐린, 1μM의 로시글리타존) 0.3mL를 함유하는 48구멍 배양 플레이트의 웰에 옮기고, 37℃, 5% CO2에 의해 14일간 배양함으로써 지방 세포로의 분화 유도를 행했다. 지방 세포로의 분화는 오일 레드 O 염색에 의해 확인했다.
결과를 도 19의 (A)에 나타낸다. 도 19의 (A)에 나타내어지는 바와 같이, 본 발명의 무혈청 증식 배지 A에서 세포를 수계대 유지한 후, 분화 유도를 가한 경우에는 혈청을 함유하는 종래 배지 A에서 수계대 유지한 경우보다 약간 적으면서도 대체로 종래 배지와 동일한 정도로 세포가 염색되어 지방 세포로의 명백한 분화가 확인되었다.
hMSC의 골세포로의 분화
종래 배지 및 무혈청 증식 배지 A에서 수계대 유지한 세포를 3000세포/㎠의 세포 밀도로 골세포 분화 배지(DMEM, 10% FCS, 200μM의 아스코르빈산, 0.1μM의 덱사메타손, 10mM의 β-글리세로포스페이트) 0.7mL를 함유하는 12구멍 배양 플레이트의 웰에 옮기고, 37℃, 5% CO2에 의해 21일간 배양함으로써 골세포로의 분화 유도를 행했다. 골세포로의 분화는 알리자린 레드 S 염색에 의해 확인했다.
결과를 도 19의 (B)에 나타낸다. 도 19의 (B)에 나타내어지는 바와 같이, 본 발명의 무혈청 증식 배지 A에서 세포를 수계대 유지한 후, 분화 유도를 가한 경우에는 혈청을 함유하는 종래 배지 A에서 수계대 유지한 경우와 동일한 정도로 염색되어 골세포로의 분화가 확인되었다.
실시예 7
실시예 7: 인간 골수 유래 간엽계 간세포(hMSC)의 배양 3
수중에 아미노산류(상기한 전체 아미노산류), 무기염류{황산동, 질산철(III), 황산철, 염화마그네슘, 인산수소2나트륨, 황산아연을 제외한 상기한 전체 무기염류}, 비타민류(상기한 전체 비타민류) 및 다른 첨가제(아데노신5'-1인산, 코르티코스테론, 에탄올아민, D-갈락토오스, D-글루코오스, 인슐린, 환원형 글루타티온, 리포산, 페놀 레드, 프로게스테론, 푸트레신, 피루빈산, 트리요오드티로닌 및 트랜스페린)를 함유하는 기초 배지에 0.02중량%의 인간 혈청 알부민 및 500μM의 N-아세틸시스테인(NAC), 100U/ml의 페니실린·스트렙토마이신(GIBCO사제) 및 1%의 (1-1)에서 제조한 S-3을 첨가한 무혈청 증식 배지 B를 얻었다.
얻어진 무혈청 증식 배지 B 및 실시예 6에서 조제한 무혈청 증식 배지 A 및 종래 배지 A의 각 배지 10mL를 각각 직경 100㎜의 배양 접시에 넣어 초기 세포수 20,000세포/mL로 hMSC를 파종하고, 37℃에서 5% CO2 환경하에서 배양을 행했다.
배양 개시로부터 21일간의 집단 배화수(n)의 변화를 계대 배양마다의 세포수를 혈구 계측반을 이용하여 계측한 결과를 이용하여 계산했다.
결과를 도 20에 나타낸다. 도 20에 나타내어지는 바와 같이, 성장 인자를 함유하지 않는 본 발명의 무혈청 배지 B 중에서 배양한 경우라도 성장 인자를 함유하는 본 발명의 무혈청 배지 B 중에서 배양한 경우나 종래 배지 A 중에서 배양한 경우보다 집단 배화수는 감소하지만 세포는 증식할 수 있었다.
hMSC의 지방 세포로의 분화
종래 배지 A 또는 무혈청 증식 배지 A 또는 무혈청 증식 배지 B에서 수계대 유지한 세포를 30000세포/㎠의 세포 밀도로 지방 세포 분화 배지(DMEM, 10% FCS, 500μM의 IBMX, 1μM의 덱사메타손, 1μM의 인슐린, 1μM의 로시글리타존) 0.3mL를 함유하는 48구멍 배양 플레이트의 웰에 옮기고, 37℃, 5% CO2에 의해 14일간 배양함으로써 지방 세포로의 분화 유도를 행했다. 지방 세포로의 분화는 오일 레드 O 염색에 의해 확인했다.
결과를 도 21의 (A)에 나타낸다. 도 21의 (A)에 나타내어지는 바와 같이, 3종류의 배지 각각에서 계대 유지한 후 분화 유도를 가한 세포는 동일한 정도로 염색되어 성장 인자를 함유하지 않는 본 발명의 무혈청 배지 B 중에서 계대 유지한 후에 분화 유도를 가한 경우라도 혈청을 함유하는 종래 배지와 동등하게 분화가 확인되었다.
hMSC의 골세포로의 분화
종래 배지 A 또는 무혈청 증식 배지 A 또는 무혈청 증식 배지 B에서 수계대 유지한 세포를 3000세포/㎠의 세포 밀도로 골세포 분화 배지(DMEM, 10% FCS, 200μM의 아스코르빈산, 0.1μM의 덱사메타손, 10mM의 β-글리세로포스페이트) 0.7mL를 함유하는 12구멍 배양 플레이트의 웰에 옮기고, 37℃, 5% CO2에 의해 21일간 배양함으로써 골세포로의 분화 유도를 행했다. 골세포로의 분화는 알리자린 레드 S 염색에 의해 확인했다.
결과를 도 21의 (A)에 나타낸다. 도 21의 (A)에 나타내어져 있는 바와 같이, 무혈청 증식 배지 A 또는 무혈청 증식 배지 B에서 수계대 유지한 후, 분화 유도를 가한 세포는 종래 배지 A에서 수계대 유지한 경우와 동일한 정도로 염색되어 골세포로의 분화가 확인되었다. 본 발명의 무혈청 증식 배지는 성장 인자를 함유하지 않는 경우라도 골세포로의 분화 능력을 유지하는 것이 명백하게 되었다.

Claims (23)

  1. 내피 세포 분화 유전자(Edg) 패밀리 리셉터에 대한 리간드와, 세로토닌 리셉터에 대한 리간드를 함유하는 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포용 배지.
  2. 제 1 항에 있어서,
    무혈청 또는 저혈청 배지인 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포용 배지.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 내피 세포 분화 유전자 패밀리 리셉터에 대한 상기 리간드의 배지 중의 농도는 0.01~100μM, 상기 세로토닌 리셉터에 대한 상기 리간드의 배지 중의 농도는 0.1~100μM인 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포용 배지.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 내피 세포 분화 유전자 패밀리 리셉터에 대한 상기 리간드는 리소포스파티딘산(LPA) 및 그 염, 스핑고신1인산(S1P) 및 상기 내피 세포 분화 유전자(Edg) 패밀리 리셉터의 아고니스트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포용 배지.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 내피 세포 분화 유전자 패밀리 리셉터에 대한 상기 리간드는 리소포스파티딘산(LPA) 및 그 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상이며, 그 배지 중의 농도는 0.25~10μM, 상기 세로토닌 리셉터에 대한 상기 리간드의 배지 중의 농도는 0.25~20μM인 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포용 배지.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세로토닌 리셉터에 대한 상기 리간드는 세로토닌, 그 염 및 상기 세로토닌 리셉터의 아고니스트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포용 배지.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항산화제를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포용 배지.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 항산화제는 N-아세틸시스테인 및 L-시스테인으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포용 배지.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 항산화제의 배지 중의 농도는 0.01mM~10mM인 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포용 배지.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    동물 혈청 알부민을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포용 배지.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈청 알부민의 배지 중의 농도는 0.0001~10중량%인 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포용 배지.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    성장 인자를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포용 배지.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 성장 인자는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 상피 성장 인자(EGF)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포용 배지.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 배지 중에 함유되는 상기 성장 인자는 상기 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 및 상기 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)의 2종류인 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포용 배지.
  15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 성장 인자의 배지 중의 농도는 0.1~100ng/mL인 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포용 배지.
  16. 내피 세포 분화 유전자(Edg) 패밀리 리셉터에 대한 리간드와, 세로토닌 리셉터에 대한 리간드를 함유하는 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포용 배지의 첨가제.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 내피 세포 분화 유전자 패밀리 리셉터에 대한 상기 리간드는 리소포스파티딘산(LPA) 및 그 염, 스핑고신1인산(S1P) 및 상기 내피 세포 분화 유전자(Edg) 패밀리 리셉터의 아고니스트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포용 배지의 첨가제.
  18. 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서,
    상기 세로토닌 리셉터에 대한 상기 리간드는 세로토닌, 그 염 및 상기 세로토닌 리셉터의 아고니스트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포용 배지의 첨가제.
  19. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항산화제를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포용 배지의 첨가제.
  20. 제 16 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    동물 혈청 알부민을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포용 배지의 첨가제.
  21. 제 16 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    성장 인자를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포용 배지의 첨가제.
  22. 제 16 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    물 또는 기초 배지에 용해함으로써 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 배지를 부여하는 조성을 갖는 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포용 배지의 첨가제.
  23. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 배지 중에서 포유 동물 체세포를 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유 동물 체세포의 배양 방법.
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