JP2011525793A - 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本発明は、人工多能性幹(以下、iPSという)細胞の樹立効率の改善方法およびそのための薬剤に関する。より詳細には、本発明は、体細胞の核初期化工程においてp53の機能を阻害することによる、iPS細胞の樹立効率の改善方法、並びにp53の機能阻害物質を有効成分とするiPS細胞の樹立効率改善剤に関する。
近年、マウスおよびヒトのiPS細胞が相次いで樹立された。Yamanakaらは、Fbx15遺伝子座にネオマイシン耐性遺伝子をノックインしたレポーターマウス由来の線維芽細胞に、Oct3/4, Sox2, Klf4及びc-Myc遺伝子を導入し強制発現させることによって、iPS細胞を誘導した(1, 2)。Okitaら(3)は、Fbx15よりも多能性細胞に発現が限局しているNanogの遺伝子座に緑色蛍光タンパク質(GFP)及びピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウスを作製し、該マウス由来の線維芽細胞で上記4遺伝子を強制発現させ、ピューロマイシン耐性かつGFP陽性の細胞を選別することにより、遺伝子発現やエピジェネティック修飾が胚性幹(ES)細胞とほぼ同等のiPS細胞(Nanog iPS細胞)を樹立することに成功した。同様の結果が他のグループによっても再現された(4, 5)。その後、c-Myc遺伝子を除いた3因子によってもiPS細胞を作製できることが明らかとなった(6)。
1. WO 2007/069666 A1
2. Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006)
3. Okita, K. et al., Nature, 448: 313-317 (2007)
4. Wernig, M. et al., Nature, 448: 318-324 (2007)
5. Maherali, N. et al., Cell Stem Cell, 1: 55-70 (2007)
6. Nakagawa, M. et al., Nat. Biotethnol., 26: 101-106 (2008)
7. Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007)
8. WO 2008/118820 A2
9. Yu, J. et al., Science, 318: 1917-1920 (2007)
10. Park, I.H. et al., Nature, 451: 141-146 (2008)
本発明の目的は、iPS細胞の樹立効率を改善する手段を提供することであり、それを用いた効率的なiPS細胞の製造方法を提供することである。
[1] iPS細胞の樹立効率の改善方法であって、体細胞の核初期化工程においてp53の機能を阻害することを含む、方法。
[2] p53の化学的阻害物質を体細胞に接触させることによりp53の機能を阻害する、上記[1]記載の方法。
[3] p53のドミナントネガティブ変異体またはそれをコードする核酸を体細胞に接触させることによりp53の機能を阻害する、上記[1]記載の方法。
[4] p53に対するsiRNA、shRNAおよびそれらをコードするDNAからなる群より選択される核酸を体細胞に接触させることによりp53の機能を阻害する、上記[1]記載の方法。
[5] p53経路阻害物質を体細胞に接触させることによりp53の機能を阻害する、上記[1]記載の方法。
[6] p53の機能阻害物質を含有してなる、iPS細胞の樹立効率改善剤。
[7] 前記阻害物質が化学的阻害物質である、上記[6]記載の剤。
[8] 前記阻害物質がp53のドミナントネガティブ変異体またはそれをコードする核酸である、上記[6]記載の剤。
[9] 前記阻害物質がp53に対するsiRNA、shRNAおよびそれらをコードするDNAからなる群より選択される核酸である、上記[6]記載の剤。
[10] 前記阻害物質がp53経路阻害物質である、上記[6]記載の剤。
[11] 体細胞に核初期化物質およびp53の機能阻害物質を接触させることを含む、iPS細胞の製造方法。
[12] 前記阻害物質が化学的阻害物質である、上記[11]記載の方法。
[13] 前記阻害物質がp53のドミナントネガティブ変異体またはそれをコードする核酸である、上記[11]記載の方法。
[14] 前記阻害物質がp53に対するsiRNA、shRNAおよびそれらをコードするDNAからなる群より選択される核酸である、上記[11]記載の方法。
[15] 前記阻害物質がp53経路阻害物質である、上記[11]記載の方法。
[16] 核初期化物質がOct3/4、Klf4およびSox2、またはそれらをコードする核酸である、上記[11]記載の方法。
[17] 核初期化物質がOct3/4、Klf4、Sox2およびc-Myc、またはそれらをコードする核酸である、上記[11]記載の方法。
[18] 体細胞がT細胞である、上記[11]記載の方法。
[19] T細胞を初期化して得られる、T細胞抗原受容体(TCR)遺伝子が再構成されているiPS細胞。
[20] p53のドミナントネガティブ変異体またはp53に対するsiRNAもしくはshRNAをコードする外来性核酸を含む、iPS細胞。
本発明は、体細胞の核初期化工程においてp53の機能を阻害することによる、iPS細胞の樹立効率の改善方法を提供する。p53の機能を阻害する手段は特に制限されないが、好ましくは、体細胞にp53の機能阻害物質を接触させる方法が挙げられる。
p53の化学的阻害物質としては、例えば、WO 00/44364に開示されるpifithrin(PFT)-α及び-βに代表されるp53阻害剤、Stormら(Nat. Chem. Biol. 2, 474 (2006))に開示されるPFT-μ、それらの類縁体及びそれらの塩(例えば、塩酸酸、臭素酸塩等の酸付加塩など)等が挙げられるが、これらに限定されない。これらのうち、PFT-α及びその類縁体[2-(2-Imino-4,5,6,7-tetrahydrobenzothiazol-3-yl)-1-p-tolylethanone, HBr (製品名:Pifithrin-α)及び1-(4-Nitrophenyl)-2-(4,5,6,7-tetrahydro-2-imino-3(2H)-benzothiazolyl)ethanone, HBr(製品名:Pifithrin-α, p-Nitro)]、PFT-β及びその類縁体[2-(4-Methylphenyl)imidazo[2,1-b]-5,6,7,8-tetrahydrobenzothiazole, HBr(製品名:Pifithrin-α, Cyclic)及び2-(4-Nitrophenyl)imidazo[2,1-b]-5,6,7,8-tetrahydrobenzothiazole(製品名:Pifithrin-α, p-Nitro, Cyclic)]、PFT-μ[Phenylacetylenylsulfonamide(製品名:Pifithrin-μ)]は、Merck社より市販されている。
p53のドミナントネガティブ変異体としては、体細胞に内在的に発現する野生型p53タンパク質と競合的に作用して、その機能を阻害し得る限り特に制限はないが、例えば、マウスp53のDNA結合領域に位置する275位(ヒトの場合は278位)のプロリンをセリンに点変異させたp53P275S(de Vries, A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 2948-2953 (2002))、マウスp53の14-301位(ヒトp53では11-304位に対応)のアミノ酸を欠失させたp53DD(Bowman, T., Genes Develop., 10, 826-835 (1996))などが挙げられる。その他にも、例えば、マウスp53の58位(ヒトの場合は61位)のセリンをアラニンに点変異させたp53S58A、ヒトp53の135位(マウスの場合は132位)のシステインをチロシンに点変異させたp53C135Y、マウスp53の135位(ヒトの場合は138位)のアラニンをバリンに点変異させたp53A135V、172位(ヒトの場合は175位)のアルギニンをヒスチジンに点変異させたp53R172H、270位(ヒトの場合は273位)のアルギニンをヒスチジンに点変異させたp53R270H、マウスp53の278位(ヒトの場合は281位)のアスパラギン酸をアスパラギンに点変異させたp53D278Nなどが知られており、同様に使用することができる。
しかしながら、体細胞への導入の容易さを考慮すると、p53のドミナントネガティブ変異体は、タンパク質自体としてよりも、それをコードする核酸の形態で用いることがむしろ好ましい。したがって、本発明の別の好ましい実施態様において、p53機能阻害物質は、p53のドミナントネガティブ変異体をコードする核酸である。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAである。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。p53のドミナントネガティブ変異体をコードするcDNAは、該変異体タンパク質の作製について上記した手法によりクローニングすることができる。
ここでp53経路とは、p53を活性化し得るあらゆる上流のシグナルカスケードおよび活性化p53によって媒介されるあらゆる下流のシグナルカスケードを包含する意味で用いられる。したがって、p53経路阻害物質には、上記シグナル伝達経路のいずれかを阻害するいかなる物質も含まれるが、好ましい一実施態様においては、p53経路阻害物質はp53によりその転写が活性化されるp21の発現もしくは機能(Myc阻害活性)を阻害する物質であり、例えば、p21に対するsiRNA、shRNA、アンチセンス核酸、リボザイム等が挙げられる。p21の発現を阻害するこれらの核酸は、後記p53に対するsiRNA、shRNA、アンチセンス核酸、リボザイムと同様の方法により設計・合成し、体細胞に導入することができる。当該核酸は、それらを発現するベクターの形態で提供されてもよく、該ベクターは、後記p53に対するsiRNA、shRNA、アンチセンス核酸、リボザイムを発現するベクターと同様の方法により構築し、体細胞に導入することができる。
p53タンパク質の機能を阻害するその他の物質として、例えば、抗p53アンタゴニスト抗体もしくはそれをコードする核酸が挙げられる。抗p53アンタゴニスト抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、該抗体は、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール(PEG)等の蛋白質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。抗p53アンタゴニスト抗体は、p53またはその部分ペプチドを抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。また、公知の抗p53アンタゴニスト抗体として、例えば、PAb1801(Oncogene Science Ab-2)及びDO-1(Oncogene Science Ab-6)(Gire and Wynford-Thomas, Mol. Cell. Biol., 18, 1611-1621 (1998))等が挙げられる。抗p53アンタゴニスト抗体をコードする核酸は、抗p53モノクローナル抗体産生ハイブリドーマから常法により単離することができる。得られるH鎖及びL鎖遺伝子を連結して単鎖抗体をコードする核酸を作製することもできる。好ましくは、これらの抗体は上記PTD又はCPPに結合する。
p53に対するsiRNAは、配列番号1または3に示されるマウスまたはヒトのp53 cDNA配列情報に基づいて、例えば、Elbashirら(Genes Dev., 15, 188-200 (2001))の提唱する規則に従って設計することができる。siRNAの標的配列としては、原則的にはAA+(N)19であるが、AA+(N)21もしくはNA+(N)21であってもよい。また、センス鎖の5’末端がAAである必要はない。標的配列の位置は特に制限されるわけではないが、5’-UTR及び開始コドンから約50塩基まで、並びに3’-UTR以外の領域から標的配列を選択することが望ましい。標的配列のGC含量も特に制限はないが、約30-約50%が好ましく、GC分布に偏りがなく繰り返しが少ない配列が望ましい。尚、下記(b2)のsiRNAもしくはshRNAを発現するベクターの設計において、プロモーターとしてpolIII系プロモーターを使用する場合、ポリメラーゼの転写が停止しないように、4塩基以上TまたはAが連続する配列は選択しないようにすべきである。
[配列番号5]
5’-TTTGACTGGATGACTGCCATGGttcaagagaCCATGGCAGTCATCCAGTCTTTTTT-3’
[配列番号6]
5’-TTTGATATCCTGCCATCACCTCttcaagagaGAGGTGATGGCAGGATATCTTTTTT-3’
[配列番号7]
5’-TTTGGCCCAAGTGAAGCCCTCCttcaagagaGGAGGGCTTCACTTGGGCCTTTTTT-3’
[配列番号8]
5’-TTTGTGAAGCCCTCCGAGTGTCttcaagagaGACACTCGGAGGGCTTCACTTTTTT-3’
[配列番号9]
5’-TTTGCCCTCCGAGTGTCAGGAGttcaagagaCTCCTGACACTCGGAGGGCTTTTTT-3’
[配列番号10]
5’-TTTGTCTGTTATGTGCACGTACttcaagagaGTACGTGCACATAACAGACTTTTTT-3’
[配列番号11]
5’-TTTGTACTCTCCTCCCCTCAATttcaagagaATTGAGGGGAGGAGAGTACTTTTTT-3’
[配列番号12]
5’-TTTGCTATTCTGCCAGCTGGCGttcaagagaCGCCAGCTGGCAGAATAGCTTTTTT-3’
[配列番号13]
5’-TTTGACGTGCCCTGTGCAGTTGttcaagagaCAACTGCACAGGGCACGTCTTTTTT-3’
[配列番号14]
5’-TTTGAAGTCACAGCACATGACGttcaagagaCGTCATGTGCTGTGACTTCTTTTTT-3’
[配列番号15]
5’-TTTGTCACAGCACATGACGGAGttcaagagaCTCCGTCATGTGCTGTGACTTTTTT-3’
[配列番号16]
5’-TTTGGAAATTTGTATCCCGAGTttcaagagaACTCGGGATACAAATTTCCTTTTTT-3’
[配列番号17]
5’-TTTGTACATGTGTAATAGCTCCttcaagagaGGAGCTATTACACATGTACTTTTTT-3’
[配列番号18]
5’-TTTGACTCCAGTGGGAACCTTCttcaagagaGAAGGTTCCCACTGGAGTCTTTTTT-3’
[配列番号19]
5’-TTTGTCCTTTGCCCTGAACTGCttcaagagaGCAGTTCAGGGCAAAGGACTTTTTT-3’
[配列番号20]
5’-TTTGATCCGCGGGCGTAAACGCttcaagagaGCGTTTACGCCCGCGGATCTTTTTT-3’
[配列番号21]
5’-TTTGACCAAGAAGGGCCAGTCTttcaagagaAGACTGGCCCTTCTTGGTCTTTTTT-3’
[配列番号22]
5’-TTTGAAAGTGGGGCCTGACTCAttcaagagaTGAGTCAGGCCCCACTTTCTTTTTT-3’
[配列番号23]
5’-TTTGTTGGGGAATAGGTTGATAttcaagagaTATCAACCTATTCCCCAACTTTTTT-3’
[配列番号24]
5’-TTTGATTCTATCTTGGGCCCTCttcaagagaGAGGGCCCAAGATAGAATCTTTTTT-3’
[配列番号25]
5’-TTTGCAuTACAgGTACgTGTGTAgtgtgctgtccTACACATGTACTTGTAGTGTTTTTT-3’
[配列番号26]
5’-TTTGCAGTuTACTTuCCGCCgTAgtgtgctgtccTATGGCGGGAAGTAGACTGTTTTTT-3’
siRNAを発現するベクターには、タンデムタイプとステムループ(ヘアピン)タイプとがある。前者はsiRNAのセンス鎖の発現カセットとアンチセンス鎖の発現カセットをタンデムに連結したもので、細胞内で各鎖が発現してアニーリングすることにより2本鎖のsiRNA(dsRNA)を形成するというものである。一方、後者はshRNAの発現カセットをベクターに挿入したもので、細胞内でshRNAが発現しdicerによるプロセシングを受けてdsRNAを形成するというものである。プロモーターとしては、polII系プロモーター(例えば、CMV前初期プロモーター)を使用することもできるが、短いRNAの転写を正確に行わせるために、polIII系プロモーターを使用するのが一般的である。polIII系プロモーターとしては、マウスおよびヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーターなどが挙げられる。また、転写終結シグナルとして4個以上Tが連続した配列が用いられる。
p53遺伝子の発現を阻害する他の物質として、p53に対するアンチセンス核酸やリボザイムが挙げられる。
本発明において「核初期化物質」とは、体細胞からiPS細胞を誘導することができる物質であれば、タンパク性因子またはそれをコードする核酸(ベクターに組み込まれた形態を含む)、あるいは低分子化合物等のいかなる物質であってもよい。核初期化物質がタンパク性因子またはそれをコードする核酸の場合、好ましくは以下の組み合わせが例示される(以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する)。
(1) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(2) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2(ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A(活性型変異体), N-Myc, L-Mycで置換可能である。)
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, β-catenin (活性型変異体S33Y)
(4) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6
(6) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7
(7) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV6 E6, HPV16 E7
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmil
(以上、WO 2007/069666を参照(但し、上記(2)の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換、Klf4からKlf1もしくはKlf5への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008) を参照)。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Cell, 126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007) 等も参照。「Oct3/4, Klf2(またはKlf5), c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) も参照。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40 Large T」の組み合わせについては、Nature, 451, 141-146 (2008) も参照。)
(9) Oct3/4, Klf4, Sox2(Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008) を参照)
(10) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28(Science, 318, 1917-1920 (2007) を参照)
(11) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28, hTERT, SV40 Large T(Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008) を参照)
(12) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28(Cell Research (2008) 600-603を参照)
(13) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SV40 Large T(Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008) も参照)
(14) Oct3/4, Klf4(Nature 454:646-650 (2008)、Cell Stem Cell, 2:525-528(2008))を参照)
(15) Oct3/4, c-Myc(Nature 454:646-650 (2008) を参照)
(16) Oct3/4, Sox2 (Nature, 451, 141-146 (2008), WO2008/118820を参照)
(17) Oct3/4, Sox2, Nanog (WO 2008/118820を参照)
(18) Oct3/4, Sox2, Lin28 (WO 2008/118820を参照)
(19) Oct3/4, Sox2, c-Myc, Esrrb (ここで、EssrrbはEsrrgで置換可能である。Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(20) Oct3/4, Sox2, Esrrb (Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(21) Oct3/4, Klf4, L-Myc
(22) Oct3/4, Nanog
(23) Oct3/4
(24) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28, SV40LT (Science, 324: 797-801 (2009) を参照)
遺伝子名 マウス ヒト
Lin28 NM_145833 NM_024674
Lin28b NM_001031772 NM_001004317
Esrrb NM_011934 NM_004452
Esrrg NM_011935 NM_001438
p53の機能阻害物質に加え、公知の他のiPS細胞樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をさらに高めることが期待できる。そのようなiPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤[例えば、バルプロ酸 (VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA(例、HDAC1 siRNA SmartpoolO (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等)等の核酸性発現阻害剤など]、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤[例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA(例、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等)等の核酸性発現阻害剤など]、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、UTF1(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、Wnt Signaling(例えばsoluble Wnt3a)(Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008))、2i/LIF (2iはmitogen-activated protein kinase signallingおよびglycogen synthase kinase-3の阻害剤、PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))等が挙げられるが、それらに限定されない。前記において核酸性の発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
本発明においてiPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、哺乳動物(例えば、マウスまたはヒト)由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞(例、角質化表皮細胞)、粘膜上皮細胞(例、舌表層の上皮細胞)、外分泌腺上皮細胞(例、乳腺細胞)、ホルモン分泌細胞(例、副腎髄質細胞)、代謝・貯蔵用の細胞(例、肝細胞)、境界面を構成する内腔上皮細胞(例、I型肺胞細胞)、内鎖管の内腔上皮細胞(例、血管内皮細胞)、運搬能をもつ繊毛のある細胞(例、気道上皮細胞)、細胞外マトリックス分泌用細胞(例、線維芽細胞)、収縮性細胞(例、平滑筋細胞)、血液と免疫系の細胞(例、Tリンパ球)、感覚に関する細胞(例、桿細胞)自律神経系ニューロン(例、コリン作動性ニューロン)、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞(例、随伴細胞)、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞(例、星状グリア細胞)、色素細胞(例、網膜色素上皮細胞)、およびそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。細胞の分化の程度に特に制限はなく、未分化な前駆細胞(体性幹細胞も含む)であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞(体性幹細胞)が挙げられる。
[実施例1:p53欠損の効果]
実験系としてNanogレポーターを持つp53ホモ欠損マウスまたはヘテロ欠損マウスを使用した。p53はほぼすべての細胞で発現し、細胞の損傷による修復の際、細胞周期の停止あるいはアポトーシスの誘導を制御する遺伝子である。このマウスではp53遺伝子のexon 5をneomycin耐性遺伝子に置換し、機能を欠損させてある (Lawrence A. Donehower (1992). Nature 356, 215-221)。p53ホモ欠損マウスは正常に生まれるが、高頻度に腫瘍を形成することが報告されている。NanogレポーターはBACPAC Resourcesより購入したBAC(bacterial artificial chromosome)のNanog遺伝子座に緑色蛍光蛋白質(EGFP)とピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んで作成した(Okita K. et al., Nature 448, 313-317(2007))。マウスNanog遺伝子はES細胞や初期胚といった分化多能性細胞において特異的に発現する遺伝子である。また、このレポーターが陽性となったマウスiPS細胞はES細胞とほぼ同等の分化能力を持つことがわかっている。このNanogレポーターを有するNanogレポーターマウスを作製し(Okita K. et al., Nature 448, 313-317(2007))、これとp53欠損マウスを交配することによって、Nanogレポーターを持つp53ホモ欠損マウス、ヘテロ欠損マウスを作製した。
p53のドミナントネガティブ変異体を用いて内在性p53の機能を阻害し、iPS細胞の樹立効率への影響を検討した。ドミナントネガティブ変異体としてp53のゲノム結合領域に位置する第275位のプロリンをセリンに点変異させたp53P275Sを使用した(Annemieke de Vries (2002). PNAS 99, 2948-2953)。
iPS細胞の樹立効率に対するp53阻害剤の効果を調べた。初期化に使用するレトロウイルスは、前日に6 well培養プレート(Falcon)の1well当り0.6 x 106で播種したPlat-E細胞にレトロウイルス発現ベクター(pMXs-Oct3/4, pMXs-Sox2, pMXs-Klf4, pMXs-cMyc)を導入して作製した。培養液はDMEM/10% FCS (DMEM(Nacalai tesque)にウシ胎仔血清を10%加えたもの)を使用し、37℃、5% CO2で培養した。ベクターの導入のためにFuGene6 transfection reagent (Roche) 4.5μLをOpti-MEM I Reduced-Serum Medium (Invitrogen) 100μLに入れ、室温で5分間静置した。その後、各発現ベクターを1.5μg加え、さらに室温で15分静置してからPlat-Eの培養液に加えた。2日目にPlat-Eの上清を新しい培地に換え、3日目に培養上清を回収して0.45μm sterile filter (Whatman)で濾過し、polybrene (Nacalai)を4μg/mLとなるように加えてウイルス液とした。
Nanogレポーターマウス(以下、Nanog-GFP Tgマウス:17週齢オス) およびNanogレポーターを持つp53ホモ欠損マウス(以下、Nanog-GFP/Trp53-/-マウス:24週齢メス)を安楽死させた後、脾臓を摘出した。組織を機械的にすりつぶした後、CD90マイクロビーズ(Miltenyi biotec)およびMACSシステムを用いてCD90陽性細胞を得た。1 x 106個の細胞をT細胞培地(DMEM, 10% FBS, 10μl/1x106個 CD3/CD28 T cell expander(Invitrogen), 10 units/ml IL-2)に懸濁し、レトロネクチン(50μg/ml, Takara)でコートした24-wellプレートに播種した(1x106個/well)。
p53ホモ欠損マウスより単離したMEFと、p53を欠損していない通常のマウスより単離したMEFとで、発現パターンに違いがあるかどうかを調べるために、DNAマイクロアレイ解析を行った。解析は、各マウスより単離したMEF由来のtotal RNAを用いて、Cell, 131, 861-872 (2007) に記載の手法にて行った。結果を図9に示す。ES細胞において特異的に発現している遺伝子(線維芽細胞に比して、ES細胞で10倍以上発現している遺伝子)を検出したところ、p53欠損マウス由来のMEFでは、ワイルドタイプのMEFに比べて、これらES細胞特異的発現遺伝子が、格段に多く発現していた(図9(B))。逆に、線維芽細胞で特異的に発現している遺伝子(ES細胞に比して、線維芽細胞で10倍以上発現している遺伝子群)を検出したところ、p53欠損マウス由来のMEFでは、ワイルドタイプのMEFに比べて、これら線維芽細胞特異的発現遺伝子の発現が極端に少なかった(図9(C))。以上の結果より、p53を欠損させることで、ES細胞に近い状態となっていることが示された。
Nanog-GFPまたはOct3/4-GFPレポーターシステムを、iPS細胞の感受的且つ特異的な同定に用いた(Okita K. et al. Nature 448, 313 (2007))。Nanog-GFPレポーターも含む、ワイルドタイプ、p53+/-、またはp53-/-のMEFを、6 wellプレートに1 well当り1 x 105個で播種した。翌日(0日)、Plat-Eから作製したレトロウイルスを各細胞に感染させた。5日目に、セルソーター(FACS Aria, Beckton Dekinson)により1 well当り1細胞ずつ96プレートに播種しなおし、または100mm dish当り5000細胞を播種しなおした。4因子のプロトコルでは13日目に、3因子のプロトコルでは19日目にピューロマイシン(1.5μg/mL)選択を開始した。GFP陽性コロニーの数は、4因子のプロトコルでは21日目に、3因子のプロトコルでは28日目に測定した。その結果を図12に示す。
(A) 次いで、p53欠損がヒトiPS細胞の発生効率を促進するかどうかを調べた。この目的を達成するために、p53のドミナントネガティブ変異体(p275S又はDD(Bowman T. et al. Genes Dev 10(7), 826 (1996)))を3初期化因子又は4初期化因子と共にヒト成人皮膚線維芽細胞(HDF)に導入した。P275S変異体のレトロウイルスベクターは実施例6の記載と同様に作製した。DD変異体のレトロウイルスベクターは2ステップPCRにより作製した。1回目のPCRは、p53-DD-S(cgg ata tca gcc tca aga gag cgc tgc c; 配列番号39)及びp53-1223AS、並びにp53-DD-AS(ggc agc gct ctc ttg agg ctg ata tcc g; 配列番号40)及びp53-1Sの2つのプライマーセットを用いて行った。ドミナントネガティブ変異体、及び4初期化因子又は3初期化因子のレトロウイルスは、PLAT-E細胞において作製した。iPS細胞の発生については、各種レトロウイルスを含むPLAT-E上清を等量混ぜ合わせ、HDFに遺伝子導入した。
p53に結合し、p53を阻害するMDM2の効果を調べた。具体的には、レトロウイルスベクターを用いてヒトMDM2遺伝子(配列番号41)を4初期化因子又は3初期化因子とHDFに共導入し、実施例7と同様の方法でiPSコロニーを形成させた(n=4)。
次に、本発明者らは、実施例7(B)において3初期化因子及びp53 shRNAで作製した細胞が、in vitroの分化させた際に多能性であるかどうかを確認した。胚様体を形成させるため、細胞を採取し、ポリヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)でコートされたdishに移して8日間インキュベートした。浮遊培養をした後、形成された胚様体をゼラチンでコートされたプレート上に置き、別に6日間インキュベートした。インキュベート後、細胞を4% パラホルムアルデヒドで固定化し、透過処理をして、5% 正常ヤギ血清、1% BSA及び0.2% TritonX-100を含有するPBSでブロッキングした。免疫細胞化学により、分化マーカー(AFP, α-SMA, βIII-tublin)の発現を調べた。一次抗体として、anti-α-fetoprotein(AFP)(1:100, R&D systems)、anti-α-smooth muscle actin(α-SMA)(1:500, DAKO)及びanti-βIII-tublin(1:100, Chemicon)を用いた。Cy3標識抗マウスIgG(1:500, Chemicon)を二次抗体として用いた。核はHoechst 33342(Invitrogen)で染色した。その結果を図22に示す。iPS細胞は、内胚葉(AFP)、中胚葉(α-SMA)及び外胚葉(βIII-tublin)の三胚葉に分化した。iPSクローン間に分化能の有意差は見られなかった。
実施例7(B)で得られたヒトiPS細胞及び実施例9で得られた分化細胞における幹細胞マーカー(Oct3/4, Sox2, Nanog)及び分化マーカー(FoxA2及びSox17(内胚葉)、Msx1(中胚葉)、Map2及びPax6(外胚葉))を、Rever Tra Ace Kit(Takara)を用いてRT-PCRにより解析した。マーカーの増幅に用いたプライマー対は表1に示す。
iPS細胞発生の促進が見られる原因となるp53標的遺伝子を解明するため、p53ワイルドタイプMEFとp53-null MEFとの間、及びコントロールHDFとp53ノックダウンHDFとの間の遺伝子発現をDNAマイクロアレイにより比較した。MEFでは、p53-null MEFにおいて1590遺伝子が5倍超で増加し、1485遺伝子が5倍超で減少した。HDFでは、p53 shRNAにより290遺伝子が5倍超で増加し、430遺伝子が5倍超で減少した。マウスとヒトの間では、v-myb myeloblastosis viral oncogene homolog(MYB)とRAS oncogenes familyであるRAB39Bとを含む、増加した8遺伝子が共通である(表2)。2種の間では、p53、cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, Cip1)、BTG family, member 2 (BTG2)、zinc finger, matrin type 3 (ZMAT3)、及びMDM2を含む、減少した27遺伝子が共通である。
マウスOct3/4、Klf4およびSox2を発現する発現ベクター pCX-2A-Ms-OKS、及び、マウスc-Mycを発現する発現ベクター pCX-Ms-cMycは、いずれもScience, 322, pp.949-953 (2008)に従い作製した。
Claims (20)
- iPS細胞の樹立効率の改善方法であって、体細胞の核初期化工程においてp53の機能を阻害することを含む、方法。
- p53の化学的阻害物質を体細胞に接触させることによりp53の機能を阻害する、請求項1記載の方法。
- p53のドミナントネガティブ変異体またはそれをコードする核酸を体細胞に接触させることによりp53の機能を阻害する、請求項1記載の方法。
- p53に対するsiRNA、shRNAおよびそれらをコードするDNAからなる群より選択される核酸を体細胞に接触させることによりp53の機能を阻害する、請求項1記載の方法。
- p53経路阻害物質を体細胞に接触させることによりp53の機能を阻害する、請求項1記載の方法。
- p53の機能阻害物質を含有してなる、iPS細胞の樹立効率改善剤。
- 前記阻害物質が化学的阻害物質である、請求項6記載の剤。
- 前記阻害物質がp53のドミナントネガティブ変異体またはそれをコードする核酸である、請求項6記載の剤。
- 前記阻害物質がp53に対するsiRNA、shRNAおよびそれらをコードするDNAからなる群より選択される核酸である、請求項6記載の剤。
- 前記阻害物質がp53経路阻害物質である、請求項6記載の剤。
- 体細胞に核初期化物質およびp53の機能阻害物質を接触させることを含む、iPS細胞の製造方法。
- 前記阻害物質が化学的阻害物質である、請求項11記載の方法。
- 前記阻害物質がp53のドミナントネガティブ変異体またはそれをコードする核酸である、請求項11記載の方法。
- 前記阻害物質がp53に対するsiRNA、shRNAおよびそれらをコードするDNAからなる群より選択される核酸である、請求項11記載の方法。
- 前記阻害物質がp53経路阻害物質である、請求項11記載の方法。
- 核初期化物質がOct3/4、Klf4およびSox2、またはそれらをコードする核酸である、請求項11記載の方法。
- 核初期化物質がOct3/4、Klf4、Sox2およびc-Myc、またはそれらをコードする核酸である、請求項11記載の方法。
- 体細胞がT細胞である、請求項11記載の方法。
- T細胞を初期化して得られる、T細胞抗原受容体(TCR)遺伝子が再構成されているiPS細胞。
- p53のドミナントネガティブ変異体またはp53に対するsiRNAもしくはshRNAをコードする外来性核酸を含む、iPS細胞。
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