KR20110041430A - 유도된 다능성 줄기 세포의 효율적인 확립 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 체세포 핵 초기화 단계에서 p53 기능을 저해하는 것을 포함하는, 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포의 확립 효율의 개선 방법을 제공한다. p53 기능의 저해는, (1) p53 의 화학적 저해제, (2) p53 의 우성 음성 돌연변이 및 그것을 코딩하는 핵산, (3) p53 에 대한 siRNA 및 shRNA 및 그것을 코딩하는 DNA, 및 (4) p53 경로 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 물질을, 체세포 등에 접촉시킴으로써 달성된다. 본 발명은 또한 p53 기능의 저해제, 특히 (1) p53 의 화학적 저해제, (2) p53 의 우성 음성 돌연변이 및 그것을 코딩하는 핵산, (3) p53 에 대한 siRNA 및 shRNA 및 그것을 코딩하는 DNA, 및 (4) p53 경로 저해제를 함유하는, iPS 세포 확립 효율 개선제를 제공한다. 본 발명은 추가로, 핵 초기화 물질 및 p53 기능 저해제를 체세포와 접촉시키는 것을 포함하는, iPS 세포의 제조 방법을 제공한다.

Description

유도된 다능성 줄기 세포의 효율적인 확립 방법{METHOD OF EFFICIENTLY ESTABLISHING INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS}

본 발명은 유도된 다능성 줄기 (이후, iPS 로 지칭함) 세포의 확립 효율의 개선 방법 및 그것을 위한 약물에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 체세포 핵 초기화 단계에서 p53 기능을 저해함으로써 iPS 세포 확립 효율을 개선하는 방법, 및 활성 성분으로서의 p53 기능의 저해제를 이용한 iPS 세포의 확립 효율 개선제에 관한 것이다.

근년에, 마우스 및 인간 iPS 세포가 차례로 확립되었다. Yamanaka 등은 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 유전자를 리포터 마우스 유래의 섬유아세포에 도입하고 (여기서, 네오마이신 내성 유전자는 Fbx15 영역으로 넉인 (knocked-in) 됨) 세포로 하여금 그 유전자들을 발현하게 함으로써 iPS 세포를 유도했다 (1,2). Okita 등 (3) 은, 트랜스제닉 마우스를 제조하고 (여기서 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 푸로마이신 내성 유전자가, 다능성 세포에서 Fbx15 발현보다도 더욱 국소적으로 발현되는 Nanog 의 영역에 통합됨), 상기 마우스로부터 유도된 섬유아세포로 하여금 상기에 언급한 네가지 유전자를 발현하도록 하고, 푸로마이신 내성 GFP-양성 세포를 선별함으로써, 배아 줄기 (ES) 세포에서와 거의 동일한 유전자 발현 및 후생유전학적 개질 프로파일을 나타내는 iPS 세포 (Nanog iPS 세포) 를 확립함에 있어서 성공했다. 유사한 결과가 다른 그룹에서 확인되었다 (4,5). 이후, c-Myc 유전자를 제외한 세가지 인자를 이용하여 iPS 세포가 제조될 수 있음이 밝혀졌다 (6).

더욱이, Yamanaka 등은 인간 피부 섬유아세포에 마우스에서 사용했던 것과 동일한 상기 네가지 유전자를 도입함으로써 iPS 세포 확립에 성공했다 (1,7). 한편, Thomson 등의 그룹은 Klf4 및 c-Myc 대신에 Nanog 및 Lin28 을 이용하여 인간 iPS 세포를 제조했다 (8,9). Park 등 (10) 은, 네가지 인자 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 에 추가하여 인간 세포 불멸화 유전자로 공지되어 있는 TERT 및 SV40 large T 항원을 이용하여 인간 iPS 세포를 제조했다. 이에 따라, 다능성에 있어서 ES 세포에 필적하는 iPS 세포는, 정해진 인자들을 체세포에 도입함으로써 인간 및 마우스의 두 경우 모두에서 제조될 수 있다는 점이 증명되었다.

그러나, iPS 세포 확립 효율은 1% 미만으로 낮다. 특히, iPS 세포 확립의 극히 낮은 효율의 문제점은, 이들이, iPS 세포로부터 분화된 조직 또는 개체에서 종양생성을 유발할 우려가 있는, c-Myc 를 제외한 세가지 인자들 (Oct3/4, Sox2 및 Klf4) 을 체세포에 도입하여 제조되었을 때 나타난다.

인용한 참고문헌:

1. WO 2007/069666 A1

2. Takahashi, K. 및 Yamanaka, S., Cell , 126: 663-676 (2006)

3. Okita, K. 등, Nature , 448: 313-317 (2007)

4. Wernig, M. 등, Nature , 448: 318-324 (2007)

5. Maherali, N. 등, Cell Stem Cell , 1: 55-70 (2007)

6. Nakagawa, M. 등, Nat . Biotethnol ., 26: 101-106 (2008)

7. Takahashi, K. 등, Cell , 131: 861-872 (2007)

8. WO 2008/118820 A2

9. Yu, J. 등, Science , 318: 1917-1920 (2007)

10. Park, I.H. 등, Nature , 451: 141-146 (2008)

본 발명의 목적은 iPS 세포 확립 효율의 개선 수단을 제공하는 것이며; 본 발명의 또다른 목적은 상기 수단을 이용하여 iPS 세포를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 발명자들은 상기 언급한 목적 달성을 목표로 하여 집중적인 연구를 수행하여, 체세포 핵 초기화 단계에서 p53 기능을 저해함으로써, iPS 세포 확립 효율을 극적으로 개선시킬 수 있다는 것을 발견했다. 그러한 효과는 인간 세포에서 특히 두드러졌다. 또한, p53 기능을 저해함으로써, 심지어는 세가지 인자를 갖고서도, 통상적인 방법으로 한 것보다, 네가지 인자를 사용했을 때와 더 가까운 효율을 수득했다. 더욱이, 본 발명의 발명자들은, 통상적으로는 iPS 세포 확립이 어려운 것으로 여겨지는 T 림프구에 대해서도, p53 기능의 결실로 쉽게 iPS 세포 확립에 성공하여, 본 발명을 개발하게 되었다.

따라서, 본 발명은 하기의 것을 제공한다:

[1] 체세포 핵 초기화 단계에서 p53 기능을 저해하는 것을 포함하는, iPS 세포 확립 효율 개선 방법.

[2] 상기 [1] 에 있어서, p53 기능이, p53 의 화학적 저해제를 체세포와 접촉시켜서 저해되는 방법.

[3] 상기 [1] 에 있어서, p53 기능이, p53 의 우성 음성 돌연변이 또는 그것을 코딩하는 핵산을 체세포와 접촉시켜서 저해되는 방법.

[4] 상기 [1] 에 있어서, p53 기능이, p53 에 대한 siRNA 및 shRNA, 및 그것을 코딩하는 DNA 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산을 체세포와 접촉시켜서 저해되는 방법.

[5] 상기 [1] 에 있어서, p53 기능이, p53 경로 저해제를 체세포와 접촉시켜서 저해되는 방법.

[6] p53 기능 저해제를 함유하는, iPS 세포 확립 효율 개선제.

[7] 상기 [6] 에 있어서, 제 6 항에 있어서, 저해제가 화학적 저해제인 약제.

[8] 상기 [6] 에 있어서, 저해제가 p53 의 우성 음성 돌연변이 또는 그것을 코딩하는 핵산인 약제.

[9] 상기 [6] 에 있어서, 저해제가 p53 에 대한 siRNA 및 shRNA, 및 그것을 코딩하는 DNA 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산인 약제.

[10] 상기 [6] 에 있어서, 저해제가 p53 경로 저해제인 약제.

[11] 핵 초기화 물질 및 p53 기능의 저해제를 체세포와 접촉시키는 것을 포함하는 iPS 세포 제조 방법.

[12] 상기 [11] 에 있어서, 저해제가 화학적 저해제인 방법.

[13] 상기 [11] 에 있어서, 저해제가 p53 의 우성 음성 돌연변이 또는 그것을 코딩하는 핵산인 방법.

[14] 상기 [11] 에 있어서, 저해제가 p53 에 대한 siRNA 및 shRNA, 및 그것을 코딩하는 DNA 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산인 방법.

[15] 상기 [11] 에 있어서, 저해제가 p53 경로 저해제인 방법.

[16] 상기 [11] 에 있어서, 핵 초기화 물질이 Oct3/4, Klf4 및 Sox2, 또는 그것을 코딩하는 핵산인 방법.

[17] 상기 [11] 에 있어서, 핵 초기화 물질이 Oct3/4, Klf4, Sox2 및 c-Myc, 또는 그것을 코딩하는 핵산인 방법.

[18] 상기 [11] 에 있어서, 체세포가 T 세포인 방법.

[19] T 세포 항원 수용체 (TCR) 유전자가 재배열되고, T 세포를 핵 초기화하여 수득되는 iPS 세포.

[20] p53 의 우성 음성 돌연변이, 또는 p53 에 대한 siRNA 및 shRNA 를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하는 iPS 세포.

p53 기능의 저해제는 iPS 세포 확립 효율을 현저하게 증가시키는 것을 가능케하기 때문에, 그것은, 확립 효율이 통상적으로 매우 낮은 c-Myc 를 제외한 세가지 인자를 수단으로 하는 iPS 세포 유도에 특히 유용하다. c-Myc 는 특히 재활성화될 경우 종양형성을 유발할 것이라는 우려때문에, 세가지 인자를 이용한 iPS 세포 확립의 효율을 개선하는 것은 iPS 세포를 재생 의학에 적용함에 있어서의 가장 중요한 용도이다.

최종적으로 분화된 T 세포로부터 유도되는 iPS 세포는 내부에서 이미 재배열된 TCR 을 갖기 때문에, iPS 세포를 특별한 항원을 제시하는 세포 (예를 들어, 암세포, 감염된 세포 등) 를 인식하는 T 세포로부터 유도하고, 대량으로 증폭하고 세포독성 T 세포 (CTL) 로 다시 분화하도록 한다면, 그 iPS 세포는 T 세포 면역 치료제로서 유용하다.

도 1 은 iPS 세포 확립에 대한 P53 결핍 효과의 시험 결과를 보여준다. 도 1(A) 및 도 1(B) 는 각각 네가지 인자 (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) 의 도입으로 iPS 세포를 유도한 결과 및 세가지 인자 (Oct3/4, Sox2, Klf4) 로 iPS 세포를 유도한 결과를 보여준다. 도면에서, "p53+/-" 은 p53-헤테로-결핍 세포 (대조군) 을 나타내며; "p53-/-" 은 p53-호모-결핍 세포의 결과를 나타낸다. 도면에서, 좌표의 세로축은 GFP-양성 콜로니의 갯수를 나타낸다. 각 그래프는 3 회 실험을 나타낸다.
도 2 는 네가지 인자 (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) 로 감염된 p53-호모-결핍 세포로 인해 생겨난 GFP-양성 콜로니를 면역결핍 마우스에 피하주사하여 기형종이 형성된 것을 보여주는 사진이다.
도 3 (A) 내지 (D) 는 iPS 세포 확립에 대한 p53 의 우성 음성 돌연변이 (p53P275S) 의 도입 효과의 검사 결과를 보여준다. 도 3(A) 는 실험 과정의 개요를 보여준다. 도 3(B) 및 도 3(C) 는 각각 네가지 인자의 도입 결과 및 세가지 인자의 도입 결과를 보여준다. 도면에서, "P275S" 는 p53P275S 의 도입 결과를 보여준다. 도면에서, "DsRed" 및 "p53" 은 각각, p53P275S 를 대체하여 DsRedExpress 및 돌연변이가 없는 야생형 p53 의 도입 결과를 보여준다. 좌표의 세로축은 GFP-양성 콜로니의 갯수를 나타낸다. 도 3(D) 는 각각의 결과에 대응하는 콜로니의 사진을 보여준다.
도 3 (E) 내지 (G) 는 iPS 세포 확립시 p53 의 p53-호모-결핍 마우스로의 도입의 영향 검사 결과를 보여준다. 도 3(E) 및 도 3(F) 는 각각 네가지 인자 및 세가지 인자의 도입 결과를 보여준다. 도면에서, "DsRed" 는 DsRedExpress 의 도입 결과를 보여주며; "p53" 은 야생형 p53 의 도입 결과를 보여준다. 좌표의 세로축은 GFP-양성 콜로니의 갯수를 나타낸다. 도 3(G) 는 각각의 결과에 해당하는 콜로니의 사진을 보여준다.
도 4 는 iPS 세포의 확립시 p53 저해제인 피피트린 (Pifithrin) 을 이용한 처리 효과의 검사 결과를 보여준다. 도 4(A) 는 실험 과정의 개요를 보여주며; 도 4(B) 는 실험 결과를 보여준다. 도 4(B) 에서, "DMSO" 는 DMSO 을 이용한 처리 결과를 보여주며 (대조군); "피피트린 α, p-싸이클린, 니트로" 는 피피트린을 이용한 처리 결과를 보여준다. 좌표의 세로축은 GFP-양성 콜로니의 갯수를 나타낸다.
도 5 는 네가지 인자 (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) 로 감염된 Nanog-GFP/Trp53^-/- 마우스로부터 유도된 T 세포로부터 발생된 ES 형-세포가 GFP-양성임을 보여주는 사진 표시이다. 좌측 패널: 위상차 영상, 우측 패널: GFP-양성 콜로니 영상. 도면에서, 408E2, 408E7 및 408E8 은 클론 갯수를 나타낸다.
도 6 은 네가지 인자 (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) 로 감염된 Nanog-GFP/Trp53^-/- 마우스로부터 유도된 T 세포로부터 발생된 ES-형 세포가 ES-세포 특이적 유전자를 발현하는 것을 보여주는 RT-PCR 의 사진 표시이다. 도면에서, Oct3/4 내지 Zfp296 는 ES 세포 마커이며, FasL 내지 Ifng 는 T 세포 마커이다. Nat1 및 Trim28 은 양성 대조군이며, Oct3/4 Tg 내지 c-Myc Tg 는 도입된 네가지 인자의 발현을 확인해 준다. 도면에서, "CD90⁺T" 및 "비장" 은, 각각 iPS 세포 유도에 대한 세포 공급원으로서 제공된 T 세포 및 비장을 나타내며; 7B3 및 38D2 는 각각 Fbx15 iPS 세포 (Nature 448, 313-317(2007)) 및 Nanog iPS 세포 (Nature 448, 313-317(2007)) 를 나타낸다.
도 7 은 네가지 인자 (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) 로 감염시킨 Nanog-GFP/Trp53^-/- 마우스로부터 유도된 T 세포로부터 발생된 ES-형 세포가 ES 세포 마커 SSEA1 및 알칼리성 포스파타아제에 대해 양성임을 보여주는 사진 표시이다.
도 8 은 네가지 인자 (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) 로 감염된 Nanog-GFP/Trp53^-/- 마우스로부터 유도된 T 세포로부터 발생된 ES-형 세포가 세가지 배엽 층으로 분화될 잠재성을 보유한다는 것을, AFP, GATA4, α-SMA, Desmin, βIII-튜뷸린 및 GFAP 항체를 이용한 염색으로 확인시켜주는 결과를 보여주는 사진 표시이다.
도 9 는 p53-호모-결핍 마우스로부터 단리된 MEF 와 일반적인, 비-p53-결핍 마우스로부터 단리된 MEF 사이의 발현 패턴에 있어서의 차이점이 있는지 여부를 확인하기 위해 수행한 DNA 마이크로어레이 분석 결과의 그래프 표시이다. (A) 모든 유전자가 검출됨, (B) ES 세포에서만 특이적으로 발현되는 유전자가 검출됨, (C) 섬유아세포 (MEF) 에서만 특이적으로 발현되는 유전자가 검출됨.
도 10 은 네가지 인자 (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) 로 감염된 Nanog-GFP/Trp53^-/- 마우스의 T 세포로부터 유도된 ES-형 세포에서 발생된 성체 키메라성 마우스를 보여준다.
도 11 은 게놈 PCR 로 Tcrβ 의 V-(D)-J DNA 의 재배열을 확인시켜주는 결과를 보여주는 사진 표시이다. 도면에서, "GL" 은 생식세포 밴드를 나타낸다.
도 12 는 네가지 또는 세가지 인자에 의한 p53-무효 MEF 로부터의 iPS 생성을 보여준다. (a) iPS 세포가 Nanog-GFP 리포터 MEF 로부터 생성되었는데, 이는 p53 야생형인, 세가지 인자의 이형접합체 또는 동형접합체이다. 레트로바이러스 형질도입 후, 5000 개의 간 세포를 유세포분석기로 수집했다. GFP-양성 콜로니를 형질도입 28 일 후 계수하여, 그래프의 상단에 나타냈다. 3 회의 독립적인 실험의 데이터를 보여준다. (b) iPS 세포가 96-웰 플레이트의 웰 내에 단일한 구분된 세포 유래의 세가지 인자로부터 생성되었다. GFP-양성 콜로니를 형질도입 28 일 후 계수했다. 3 회의 독립적인 실험의 데이터를 보여준다. (c) iPS 세포가 96-웰 플레이트의 웰 내에 단일한 구분된 세포 유래의, c-Myc 을 포함하는 네가지 인자로부터 생성되었다. GFP-양성 콜로니를 형질도입 21 일 후 계수했다. 3 회의 독립적인 실험의 데이터를 보여준다.
도 13 은 야생형 또는 돌연변이 p53 을 이용하여 함께 형질도입한 세가지 인자에 의한 p53 이형접합성 또는 동형접합성 MEF 로부터의 iPS 생성을 보여준다. (a) 우성 양성 p53 돌연변이 (P275S) 또는 야생형을 발현하는 레트로바이러스는 세가지 인자를 이용하여 Oct3/4-GFP, p53 이형접합성 MEF 로 함께 형질도입했다. 레트로바이러스 형질도입 후, 5000 개의 세포를 수집하고, GFP-양성 콜로니를 형질도입 후 28 일째에 계수했다. 3 회의 독립적인 실험의 데이터를 보여준다. (b) 야생형 또는 돌연변이 p53 을 발현하는 레트로바이러스는 세가지 인자를 이용하여 Nanog-GFP, p53 동형접합성 MEF 로 함께 형질도입했다. 레트로바이러스 형질도입 후, 5000 개의 살아있는 세포를 형질도입 28 일째에 수집하고, GFP-양성 콜로니를 계수했다. 2 회의 독립적인 실험의 데이터를 보여준다.
도 14 내지 16 은 p53 이형접합성 또는 동형접합성 MEF 로부터 유도된 iPS 세포의 특징을 보여준다.
도 14 는 세가지 또는 네가지 인자에 의한, Nanog-GFP, p53-무효 MEF 로부터 유도된 iPS 세포의 상전이 영상 (상단) 및 형광 영상 (하단) 을 보여준다. 바아는 100 ㎛ 를 표시한다.
도 15 는 ES 세포 마커 유전자, p53 및 네가지 인자의 발현의 RT-PCR 분석을 보여준다. 특이적 프라이머 셋트를 이용함으로써, 전체 발현, 내재성 발현 및 트랜스유전자 발현을 구분해냈다.
도 16 은 세가지 (a) 또는 네가지 (b) 인자를 이용하여 p53-무효 iPS 세포로부터 유도된 기형종의 조직학적 검사를 보여준다. (a) 신경 조직 (상단 좌측), 연골 (상단 우측), 근육 (하단 좌측), 및 소화관형 상피 조직 (하단 우측) 의 헤마톡실린-에오신 염색을 보여준다. (b) 미분화 세포 (상단) 및 신경세포 조직 (하단) 의 헤마톡실린-에오신 염색을 보여준다.
도 17 내지 20 은 p53 억제에 의한 인간 iPS 세포 생성의 증가된 효율을 보여준다.
도 17 은 네가지 또는 세가지 인자에 의한 HDF 로부터의 iPS 생성에 대한 돌연변이 p53 공동 형질도입의 영향을 보여준다. P275S 또는 DD 를 발현하는 레트로바이러스 벡터를 네가지 또는 세가지 초기화 인자와 함께 HDF 로 형질도입했다. 네가지 인자 ((a), 5 x 10³ HDF 유래) 및 세가지 인자 ((b), 4 x 10⁴ HDF 유래) 에 의한 iPS 세포 콜로니의 갯수를 나타낸다. 도 17c 는 인간 iPS 세포로부터 유도된 기형종을 보여주는데, 이는 세가지 초기화 인가 및 p53DD 돌연변이를 이용하여 생성되었다. 신경 조직 (상단 좌측), 연골 (상단 우측), 근육 (하단 좌측), 및 소화관형 상피 조직 (하단 우측) 의 헤마톡실린-에오신 염색을 나타낸다.
도 18 은 p53 shRNA 에 의한 p53 생성의 억제를 보여준다. p53 shRNA 또는 대조군 RNA 에 대한 레트로바이러스 벡터를 HDF 에 형질도입했다. 형질도입 6 일 후, p53 단백질 수준은 웨스턴 블롯 분석으로 측정했다.
도 19 는 네가지 인자에 의한 HDF 로부터의 iPs 생성에 대한 p53 shRNA 공동 형질도입의 영향을 보여준다. p53 shRNA 또는 대조군 RNA 를 발현하는 레트로바이러스 벡터를, 네가지 초기화 인자와 함께 HDF 로 형질도입했다. RNAi-중재 넉다운을 구하기 위해, 마우스 p53 에 대한 레트로바이러스 벡터를 함께 도입했다. 4 회의 실험에서 iPS 콜로니의 갯수를 나타낸다.
도 20 은 세가지 인자에 의한 HDF 로부터의 iPS 생성에 대한 p53 shRNA 공동형질도입의 영향을 보여준다. p53 shRNA 또는 대조군 RNA 를 발현하는 레트로바이러스 벡터는 세가지 초기화 인자와 함께 HDF 에 형질도입했다. RNAi-중재 넉다운을 구하기 위해, 마우스 p53 에 대한 레트로바이러스 벡터를 함께 도입했다. 2 회의 실험에서 5 x 10⁴ HDFs (a) 또는 5 x 10⁵ HDFs (b) 로부터의 iPS 콜로니의 갯수를 나타낸다.
도 21 은 네가지 또는 세가지 초기화 인자에 의한 HDF 로부터의 iPS 생성에 대한 MDM2 공동 형질도입의 영향을 보여준다. MDM2, p53 shRNA 또는 RB shRNA 를 발현하는 레트로바이러스 벡터, 또는 대조군 벡터를, 네가지 인자 (a) 또는 세가지 인자 (b) 와 함께 HDF 에 형질도입했다. 5 x 10⁴ 개의 HDF 세포 유래의 iPS 콜로니의 갯수를 나타낸다.
도 22 는 iPS 클론으로부터 분화된 세포에서의 내배엽- (AFP), 중배엽- (α-SMA) 및 외배엽- (βIII-튜뷸린) 분화 마커의 발현을 증명하는 사진을 보여준다.
도 23 은 배양체 형성 후 미분화 세포 (U) 및 분화된 세포 (D) 에서의 마커 유전자 발현을 나타낸다. "Mock" 은 세가지 초기화 인자가 있는 공벡터 (pMKO.1-puro) 의 공동형질도입을 보여준다. "p53 shRNA-2" 는 세가지 초기화 인자가 있는 p53 shRNA-2 의 공동 형질도입을 보여준다.
도 24 는 p21 및 Myc 에 대한 p53 억제의 영향을 보여준다. p53 억제에 의해 조절되는 유전자 (4 개는 증가, 7 개는 감소) 는 네가지 초기화 인자와 함께 (a) 또는 네가지 초기화 인자 및 p53 shRNA 와 함께 (b) HDF 에 도입했다. 형질도입 후 24 일째 (a) 또는 28 일째 (b) 에, iPS 세포 콜로니의 갯수를 계수했다. **; DsRed 대조군과 비교한 p<0.01 (n=3). p53 또는 Myc 의 응답성 구성원을 포함하는 루시퍼라아제 리포터, 또는 중합효소 II 프로모터에 의해 구동되는 것을, mock 레트로바이러스 벡터, p53 shRNA, 네가지 초기화 인자 또는 Myc 을 제외한 세가지 인자와 함께 HDF 에 도입했다. 이틀이 지난 후, 루시퍼라아제 활성을 측정했다 (c). mock 대조군과 비교하여, **; p<0.01, *; p<0.05 (n=3).
도 25a 는 실험 과정의 개요를 보여준다. 도 25b 는 네가지 인자 (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) 의 도입 결과를 보여준다. 도면에서, "+/+" 는 야생형 세포 (대조군) 의 결과를 보여준다; "-/-" 는 p53-호모-결핍 세포에 대한 결과를 보여준다. 도면에서, 좌표의 세로축은 GFP-양성 콜로니의 갯수를 나타낸다. 도 25c 는 게놈에 대한 플라스미드 DNA 의 통합 시험 결과를 보여준다 (상단 패널: 게놈 PCR; 하단 패널: 서던 블롯 분석). 도 25d 는 수득한 세포 (상단 좌측: 위상차 영상, 상단 우측: GFP-양성 콜로니 영상, 하단 좌측: 위상차 영상과 GFP-양성 콜로니 영상의 취합) 및 수득한 ES-형 세포로부터 수득한 키메라성 마우스 (하단 좌측 패널) 의 사진을 보여준다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 체세포 핵 초기화 단계에서의 p53 기능 저해에 의한 iPS 세포 확립 효율 개선 방법을 제공한다. p53 기능 저해 수단의 선택은 특별히 한정되지 않으며; 바람직하게는, p53 기능의 저해제를 체세포와 접촉시키는 방법이 언급될 수 있다.

본원에 언급되는 바와 같이, "p53 기능의 저해제" 는, (a) p53 단백질의 기능 또는 (b) p53 유전자의 발현을 저해할 수 있는 한 임의의 물질일 수 있다. 즉, p53 단백질에 직접 작용하여 그의 기능을 저해하는 물질 및 p53 유전자에 직접 작용하여 그의 발현을 저해하는 물질 뿐만 아니라, p53 신호 전달에 관여하여 p53 단백질의 기능 또는 p53 유전자의 발현 저해를 초래하는 물질이 또한 본원에서 언급하는 "p53 기능의 저해제" 의 범위에 포함된다.

p53 단백질의 기능을 저해하는 물질의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, p53, p53 의 우성 음성 돌연변이 또는 그것을 코딩하는 핵산의 화학적 저해제, 항-p53 안타고니스트 항체 또는 그것을 코딩하는 핵산, p53-응답성 구성원의 콘센서스 서열을 포함하는 유인성 핵산, p53 경로를 저해하는 물질 등이 포함된다. 바람직하게는, p53, p53 의 우성 음성 돌연변이 또는 그것을 코딩하는 핵산의 화학적 저해제 및 p53 경로 저해제가 언급될 수 있다.

(a1) p53 의 화학적 저해제

p53 의 화학적 저해제의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 피피트린 (PFT)-α 및 -β 에 의해 정형화된 p53 저해제로서, WO 00/44364 에 개시된 것, Storm 등의 문헌 (Nat . Chem . Biol . 2, 474 (2006)) 에 개시된 PFT-μ, 그의 유사체 및 그의 염 (예를 들어, 산 부가염, 예컨대 히드로클로라이드 및 히드로브로마이드 등) 등이 포함된다. 그들의 PFT-μ 및 그의 유사체 [2-(2-이미노-4,5,6,7-테트라히드로벤조티아졸-3-일)-1-p-톨릴에타논, HBr (제품명: 피피트린-α) 및 1-(4-니트로페닐)-2-(4,5,6,7-테트라히드로-2-이미노-3(2H)-벤조티아졸릴)에타논, HBr (제품명: 피피트린-α,p-니트로)], PFT-β 및 그의 유사체 [2-(4-메틸페닐)이미다조[2,1-b]-5,6,7,8-테트라히드로벤조티아졸, HBr (제품명: 피피트린-α, 싸이클릭) 및 2-(4-니트로페닐)이미다조[2,1-b]-5,6,7,8-테트라히드로벤조티아졸 (제품명: 피피트린-α, p-니트로, 싸이클릭)], 및 PFT-μ [페닐아세틸레닐술폰아미드 (제품명: 피피트린-μ)] 이 Merck 로부터 시판되어 입수가능하다.

p53 의 화학적 저해제와 체세포와의 접촉은, 그 저해제를 수성 또는 비수성 용매 중에 적당한 농도로 용해시키고, 그 저해제 용액을 인간 또는 마우스로부터 단리한 체세포의 배양에 적합한 배지의 용액 (예를 들어, 약 5 내지 20% 소태아 혈청으로 보충한, 최소 필수 배지 (MEM), Dulbecco's Modified Eagle 배지 (DMEM), RPMI1640 배지, 199 배지, F12 배지 등) 에 첨가하여 저해제 농도를 p53 기능을 완전히 저해하면서도 세포독성은 유발하지 않는 범위가 되도록 하고, 세포를 주어진 기간 동안 배양하여 수행할 수 있다. 저해제 농도는 사용되는 저해제의 종류에 따라 가변적이며, 약 0.1 nM 내지 약 100 nM 의 범위에서 적당하게 선택한다. 접촉 기간은, 세포의 핵 초기화를 달성하기에 충분하기만 하면 특별히 제한되지 않으며; 일반적으로 저해제는 다능성 마커 양성 콜로니가 나타날 때까지 공존하도록 할 수 있다.

p53 유전자는 종양 억제자 유전자로서 공지되어 있으며; p53 기능의 영구적인 저해는 발암위험을 잠재적으로 증가시킨다. p53 의 화학적 저해제는, 배지에 대한 첨가로써 단순하게 세포에 도입가능하다는 장점 뿐만 아니라, iPS 세포 유도 후 그 저해제를 포함하는 배지를 제거함으로써 p53 기능의 저해를 쉽고 빠르게 종결시키는 능력도 있어 매우 유용하다.

(a2) p53 의 우성 음성 돌연변이

p53 의 우성 음성 돌연변이의 선택은, 돌연변이가 체세포 내에서 내재적으로 발현되는 야생형 p53 단백질에 대해 경쟁적으로 작용하여 그의 작용을 저해하는 한, 특별히 제한되지 않으며; 예를 들어, p53P275S, 마우스 p53 의 DNA-결합 영역에 위치한 위치 275 (인간의 경우, 위치 278) 의 프롤린을 세린으로 한 포인트 돌연변이 (de Vries, A., Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 99, 2948-2953 (2002)) 로 인해 생겨난 것; p53DD, 마우스 p53 의 위치 14 내지 301 (인간 p53 에서는, 위치 11 내지 304 에 대응) 에서의 아미노산 결실로 인해 생겨난 것 (Bowman, T., Genes Develop., 10, 826-835 (1996)) 등을 언급할 수 있다. 기타 공지된 돌연변이에는, 예를 들어, p53S58A, 마우스 p53 의 위치 58 (인간의 경우, 위치 61) 의 세린을 알라닌으로 한 포인트 돌연변이로 인해 생겨난 것; p53C135Y, 인간 p53 의 위치 135 (마우스의 경우, 위치 132) 의 시스테인을 티로신으로 한 포인트 돌연변이로 인해 생겨난 것; p53A135V, 마우스 p53 의 위치 135 (인간의 경우, 위치 138) 의 알라닌을 발린으로 한 포인트 돌연변이로 인해 생겨난 것; p53R172H, 위치 172 (인간의 경우, 위치 175) 의 아르기닌을 히스티딘으로 한 포인트 돌연변이로 인해 생겨난 것; p53R270H, 위치 270 (인간의 경우, 위치 273) 의 아르기닌을 히스티딘으로 한 포인트 돌연변이로 인해 생겨난 것; p53D278N, 마우스 p53 의 위치 278 (인간의 경우, 위치 281) 의 아스파르트산을 아스파라긴으로 한 포인트 돌연변이로 인해 생겨난 것 등이 포함되며; 이들은 동일한 방식으로 사용될 수 있다.

p53 의 우성 음성 돌연변이는, 예를 들어 하기에 기재된 기법으로 수득될 수 있다. 우선, 서열 식별 번호 1 또는 3 에 나타낸 마우스 또는 인간 p53 cDNA 서열 정보를 근거로 적당한 올리고뉴클레오티드를 프로브 또는 프라이머로 합성하고, 마우스 또는 인간 p53 cDNA 를 마우스 또는 인간 세포 또는 조직으로부터 유도된 mRNA, cDNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 혼성화 방법 또는 (RT-)PCR 방법을 이용하여 클로닝하고, 적당한 플라스미드에 서브클로닝한다. 돌연변이가 도입된 부위의 코돈 (예를 들어, p53P275S 의 경우, 서열 식별 번호 1 로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 951 내지 953 으로 나타내는 cct) 을 또다른 원하는 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, p53P275S 의 경우, tct) 로 치환한 형태에서, 해당 부위를 포함하는 프라이머를 합성하고, 상기 프라이머 및 p53 cDNA 를 혼입하고 있는 플라스미드를 템플레이트로 이용하여 역방향 PCR 을 수행함으로써, 원하는 우성 음성 돌연변이를 코딩하는 핵산을 수득하게 된다. p53DD 과 같은 결실 돌연변이의 경우, 프라이머는 결실시킬 부위의 바깥으로 고안될 수 있으며, 역방향 PCR 을 상기에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 우성 음성 돌연변이를 코딩하는, 그렇게 수득한 핵산을 숙주 세포에 도입하고 배양 세포 또는 그의 조건화된 배지로부터 재조합체를 회수함으로써, 원하는 우성 음성 돌연변이를 수득할 수 있다.

우성 음성 돌연변이와 체세포의 접촉은 세포에 대한 단백질 이동에 대하여 자체로 공지된 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 상기 방법에는, 예를 들어 단백질 이동 시약을 이용한 방법, 단백질 이동 도메인 (PTD)- 또는 세포 침투 펩티드 (CPP)-융합 단백질을 이용하는 방법, 마이크로인젝션 방법 등이 포함된다. 단백질 이동 시약은 시판되어 입수가능하며, 여기에는 BioPOTER Protein Delivery Reagent (Gene Therapy Systems), Pro-Ject^TM Protein Transfection Reagent (PIERCE) 및 ProVectin (IMGENEX) 과 같은, 양이온성 지질 기재의 것; Profect-1 (Targeting Systems) 과 같은, 지질 기재의 것; Penetrain Peptide (Q biogene) 및 Chariot Kit (Active Motif) 과 같은, 막 투과성 펩티드 기재의 것, 및 GenomONE (Ishihara Sangyo) 과 같은, HVJ 엔벨롭 (불활성화 센다이 바이러스) 기재의 것 등이 포함된다. 이동은, 하기에 기재된 바와 같은 일반적인 과정인, 상기 시약에 첨부된 프로토콜에 따라 수행될 수 있다. p53 의 우성 음성 돌연변이를 적당한 용매 (예를 들어, PBS 또는 HEPES 와 같은 완충액) 에 희석시키고, 이동 시약을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 약 5 내지 15 분 동안 인큐베이션하여 복합체를 형성하고, 상기 복합체를 혈청이 없는 배지로 배지 교체한 후 세포에 첨가하고, 그 세포를 37℃ 에서 한시간 내지 여러시간 인큐베이션한다. 이후, 배지를 제거하고, 혈청을 포함하는 배지로 교체한다.

개발한 PTD 에는, 단백질의 세포 침투 도메인을 이용하는 것, 예컨대 초파리로부터 유도된 AntP, HIV-유도성 TAT (Frankel, A. 등, Cell 55,1189-93 (1988) 또는 Green, M. & Loewenstein, P. M. Cell 55, 1179-88 (1988)), Penetratin (Derossi, D. 등, J. Biol. Chem. 269, 10444-50 (1994)), Buforin II (Park, C. B. 등, Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50 (2000)), Transportan (Pooga, M. 등, FASEB J. 12, 67-77 (1998)), MAP (모델 양친매성 펩티드) (Oehlke, J. 등, Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39 (1998)), K-FGF (Lin, Y. Z. 등, J. Biol. Chem. 270, 14255-14258 (1995)), Ku70 (Sawada, M. 등, Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003)), Prion (Lundberg, P. 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90 (2002)), pVEC (Elmquist, A. 등, Exp. Cell Res. 269, 237-44 (2001)), Pep-1 (Morris, M. C. 등, Nature Biotechnol. 19, 1173-6 (2001)), Pep-7 (Gao, C. 등, Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65 (2002)), SynB1 (Rousselle, C. 등, Mol. Pharmacol. 57, 679-86 (2000)), HN-I (Hong, F. D. & Clayman, G L. Cancer Res. 60, 6551-6 (2000)), 및 HSV-유도성 VP22 이 포함된다. PTD 로부터 유도된 CPP 에는 폴리아르기닌, 예컨대 11R (Cell Stem Cell, 4:381-384(2009)) 및 9R (Cell Stem Cell, doi:10.1016/j.stem.2009.05.005 (2009)) 이 포함된다. p53 의 우성 음성 돌연변이의 cDNA 및 PTD 또는 CPP 서열을 혼입하고 있는 융합 단백질 발현 벡터를 제조하여 융합 단백질의 재조합적 발현을 하도록 하고, 상기 융합 단백질은 이동에 이용하기 위해 회수한다. 상기 이동은, 단백질 이동 시약이 첨가되지 않는다는 점을 제외하고는, 상기에 기재된 바와 같이 달성될 수 있다.

팁 직경이 약 1 ㎛ 인 유리 바늘에 단백질 용액을 위치시키고 그 용액을 세포에 주입하는 방법인 마이크로인젝션은 단백질이 세포로 이동하도록 해준다.

상기 기재된 바와 같이, p53 기능의 영구적인 저해는 잠재적으로 발암 위험을 증가시키나; p53 의 우성 음성 돌연변이는 트랜스펙션된 세포 내의 프로테아제에 의한 분해를 겪고 점차 사라지며, 그에 따라 세포에서 내재적으로 발생하는 p53 기능이 회복되므로, 돌연변이 단백질의 이용은, 수득한 iPS 세포를 치료 목적으로 사용하는 경우에서와 같이 높은 안전성이 필요한 경우에 적합할 수 있다.

(a3) p53 의 우성 음성 돌연변이를 코딩하는 핵산

그러나, 체세포에 대한 도입의 용이성을 감안하면, p53 의 우성 음성 돌연변이를, 단백질 자체보다는, 단백질을 코딩하는 핵산의 형태로 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또다른 바람직한 구현 양태에서, p53 기능의 저해제는 p53 의 우성 음성 돌연변이를 코딩하는 핵산이다. 상기 핵산은 DNA 또는 RNA, 또는 DNA/RNA 키메라일 수 있으며, 바람직하게는 DNA 이다. 핵산은 이중가닥 또는 단일가닥일 수 있다. p53 의 우성 음성 돌연변이를 코딩하는 cDNA 는 돌연변이 단백질 제조와 관련하여 상기에 기재한 바와 같은 기법으로 클로닝될 수 있다.

단리한 cDNA 는 표적 체세포에서 기능할 수 있는 프로모터를 포함하는 적당한 발현 벡터로 삽입된다. 유용한 발현 벡터에는, 예를 들어 바이러스성 벡터, 예컨대 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스바이러스, 및 센다이 바이러스, 동물 세포에서의 발현을 위한 플라스미드 (예를 들어, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo) 등이 포함된다. 사용되는 벡터의 종류는 수득하는 iPS 세포의 의도하는 용도에 따라 적당히 선택될 수 있다.

발현 벡터에서의 사용에 유용한 프로모터에는, 예를 들어 SRα 프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV (싸이토메갈로바이러스) 프로모터, RSV (라우스 육종 바이러스) 프로모터, MoMuLV (몰로니 마우스 백혈병 바이러스) LTR, HSV-TK (헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제) 프로모터, EF-알파 프로모터 및 CAG 프로모터 등이 포함된다. MoMuLV LTR, CMV 프로모터, SRα 프로모터, EF-알파 프로모터, CAG 프로모터 등이 바람직하다.

발현 벡터는, 상기에서와 같이, 필요에 따라 프로모터, 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 시그널, 선별가능한 마커 유전자, SV40 복제 기원 등응 보유할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자의 예시에는 디히드로폴레이트 리덕타아제 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 푸로마이신 내성 유전자 등이 포함된다.

p53 의 우성 음성 돌연변이를 코딩하는 핵산을 보유하는 발현 벡터는 벡터 종류에 따라 자체로 공지된 기법으로 세포에 도입할 수 있다. 바이러스 벡터의 경우, 예를 들어, p53 의 우성 음성 돌연변이를 코딩하는 핵산을 포함하는 플라스미드를 적당한 패키지 세포 (예를 들어, Plat-E 세포) 또는 보체 세포주 (예를 들어, 293-세포) 에 도입하고, 배양 상청액 중의 제조된 바이러스 벡터를 회수하고, 그 벡터를 바이러스 벡터에 적합한 방법으로 세포에 감염시킨다. 예를 들어, 벡터로서 레트로바이러스 벡터를 이용하는 구체적인 수단은, WO2007/69666, Cell , 126, 663-676 (2006) 및 Cell , 131, 861-872 (2007) 에 개시되어 있다; 렌티바이러스 벡터가 벡터로 이용되는 경우, Science , 318, 1917-1920 (2007) 에서 개시된 것을 이용할 수 있다. iPS 세포를 치료 목적으로 이용하는 경우, p53 기능의 영구적인 저해는 잠재적으로 iPS 세포로부터 분화된 조직 및 장기에서 발암 위험을 증가시킨다; 따라서, p53 의 우성 음성 돌연변이를 코딩하는 핵산은 바람직하게는 일시적으로만 발현되며, 세포의 염색체로 통합되지 않는다. 이러한 관점에서, 염색체로의 통합이 드문 아데노바이러스 벡터의 이용이 바람직하다. 아데노 바이러스를 이용하는 구체적인 수단은 Science , 322, 945-949 (2008) 에 개시되어 있다. 아데노-연관 바이러스가 또한 염색체로의 통합 빈도가 낮고, 세포 독성 및 염증 유발 활성 측면에서 아데노바이러스 벡터보다 더 낮으므로, 또다른 바람직한 벡터로서 언급될 수 있다. 지속성 발현 유형 센다이 바이러스 벡터는 염색체 외부에서 안정하게 존재할 수 있고 필요할 때에 siRNA 를 이용하여 분해 및 제거될 수 있으므로, 바람직하게 사용된다. 지속성 발현 유형 센다이 바이러스 벡터에 관해서는, J. Biol . Chem ., 282, 27383-27391 (2007) 에 기재되어 있는 것이 이용될 수 있다.

레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터가 사용되는 경우, 트랜스유전자의 침묵화가 발생한 경우라고 하더라도, 다시 활성화될 수 있다; 그러므로, 예를 들어 p53 의 우성 음성 돌연변이를 코딩하는 핵산이, 불필요해졌을 때, Cre/loxP 시스템에 의해 잘려나가는 방법이 이용될 수 있다. 즉, 핵산의 양끝에 loxP 서열이 미리 배치되어 있으면, iPS 세포가 유도된 후, Cre 재조합 효소는 플라스미드 벡터 또는 아데노바이러스 벡터를 이용하여 세포에 작용하게 되어, loxP 서열에 의해 사이에 낀 영역이 잘려나갈 수 있다. LTR U3 영역의 인핸서-프로모터 서열은 돌연변이 삽입에 의해 그의 부근에서 숙주 유전자를 상향조절할 수 있기 때문에, 해당 서열의 결실에 의해 제조되는 3'-자가 불활성화 (SIN) LTR 를 이용하거나, 또는 SV40 의 것과 같은 폴리아데닐화 서열을 이용한 서열의 치환으로, 잘라내지 않고도 게놈 내에 잔존하는 loxP 서열 외부의 LTR 에 의해 내재 유전자의 발현 조절을 회피하는 것이 더욱 바람직하다. Cre-loxP 시스템 및 SIN LTR 을 이용하는 구체적인 수단은 Chang 등의, Stem Cells, 27: 1042-1049 (2009) 에 개시되어 있다.

한편, 비(非)바이러스 벡터인 플라스미드 벡터의 경우, 벡터는 리포펙틴법, 리포좀법, 전자천공법, 인산칼슘 공침법, DEAE 덱스트란법, 마이크로인젝션법, 유전자 총 (gene gun) 법을 이용하여 세포에 전해질 수 있다. 플라스미드 벡터를 이용하는 경우에는 또한, 그의 염색체에 대한 통합이 드물고, 트랜스유전자가 세포 내에서 DNase 에 의해 분해 및 제거되므로; iPS 세포가 치료 목적으로 이용되는 경우, 플라스미드 벡터의 이용이 또다른 바람직한 구현 양태일 수 있다. 플라스미드를 벡터로서 이용하는 구체적인 방법은, 예를 들어 Science , 322, 949-953 (2008) 등에 기재되어 있다.

또다른 바람직한 비(非)통합 유형 벡터는 에피좀 벡터인데, 이는 염색체 외부에서 자발적으로 복제가능하다. 에피좀 벡터를 이용하는 구체적인 방법은 Science, 324, 797-801(2009) 에 개시되어 있다.

아데노바이러스 또는 플라스미드를 이용하는 경우에는 또한, 트랜스유전자는 염색체에 통합될 수 있으므로; 서던 블롯 또는 PCR 로 염색체에 대한 유전자 삽입의 부재를 결국 확인해야 한다. 이러한 이유로, 상기 언급한 Cre-loxP 시스템과 같이, 트랜스유전자가 염색체로 통합된 후 유전자를 제거하는 방법을 이용하는 것이 유리할 수 있다. 또다른 바람직한 구현 양태에서, 트랜스유전자를 트랜스포존을 이용하여 염색체에 통합시킨 후, 트랜스포사아제로 하여금 플라스미드 벡터 또는 아데노바이러스 벡터를 이용하여 세포에 작용하도록 하여 트랜스유전자를 염색체로부터 완전히 제거하는 방법을 이용할 수 있다. 바람직한 트랜스포존의 예시로서, 인시목 곤충으로부터 유도된 트랜스포존인 piggyBac 등을 언급할 수 있다. piggyBac 트랜스포존을 이용하는 구체적인 방법은 Kaji, K. 등, Nature , 458: 771-775 (2009) Woltjen 등, Nature , 458: 766-770 (2009) 에 개시되어 있다. 또다른 구현예에서, 프로모터 영역 중의 테트라싸이클린 응답성 구성원 (Tet-OnR & Tet-Off R Gene Expression Systems, Clontech) 을 트랜스유전자 발현을 위해 이용할 수 있다.

(a4) p53 경로 저해제

본원에서, 용어 p53 경로는, p53 및 활성화된 p53 에 의해 중재되는 모든 하류방향 시그널 캐스캐이드를 활성화시킬 수 있는 모든 상류방향 시그널 캐스캐이드를 포함하는 의미로 이용된다. 따라서, p53 경로 저해제에는 상기 언급한 신호전달 경로의 임의의 하나를 저해하는 모든 물질들이 포함되나, 바람직한 구현 양태에서는, p53 경로 저해제는, 그의 전사가 p53 에 의해 활성화되는 p21 의 발현 또는 기능 (Myc 저해 활성) 을 저해하는 물질이며; 예를 들어 p21 에 대한 siRNA, shRNA, 안티센스 핵산, 리보자임 등이 언급될 수 있다. p21 의 발현을 저해하는 핵산은 하기에 기재하는 p53 에 대한 siRNA, shRNA, 안티센스 핵산 및 리보자임에 대한 방법과 동일하게 고안 및 합성될 수 있으며, 체세포에 도입될 수 있다. 핵산은 이들을 발현하는 벡터의 형태로 제공될 수 있고, 그 벡터는 하기에 기재하는 p53 에 대한 siRNA, shRNA, 안티센스 핵산 또는 리보자임을 발현하는 벡터에 대한 방법과 동일하게 구축될 수 있고, 체세포에 도입될 수 있다.

또다른 바람직한 구현 양태에서, p53 경로 저해제는 ARF-MDM2-p53 경로를 저해하는 물질이며; 예를 들어, ARF-MDM2-p53 경로 저해제로서는, p53 에 직접 결합하여 핵외 수송 또는 그의 유비퀴틴화를 촉진하는 MDM2 또는 그것을 코딩하는 핵산, p53 상의 MDM2 의 작용을 저해하는 p19^ARF, ATM (돌연변이화된 모세혈관 확장성 운동실조) (예를 들어, 상기 인자들에 대한 siRNA 및 shRNA) 의 발현 또는 기능을 저해하는 물질 등이 언급될 수 있다.

(a5) 기타 물질

p53 단백질의 기능을 저해하는 기타 물질의 예시로서, 항-p53 안타고니스트 항체 또는 그것을 코딩하는 핵산이 언급될 수 있다. 항-p53 안타고니스트는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 항체의 이소타입은 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 IgG, IgM 또는 IgA, 특히 바람직하게는 IgG 이다. 항체는, 완전한 항체 분자에 추가하여, 예를 들어 분절, 예컨대 Fab, Fab' 또는 F(ab')₂, 유전공학적 기술로 제조된 콘쥬게이트 분자, 예컨대 scFv, scFv-Fc, 미니바디 또는 디바디, 또는 단백질 안정화 작용을 가진 분자, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 로 개질된 그의 유도체일 수 있다. 항-p53 안타고니스트 항체는 p53 또는 그의 부분 펩티드를 항원으로서 이용하여 자체로 공지된 항체 또는 항-혈청 제조 방법에 의해 제조될 수 있다. 공지된 항-p53 안타고니스트 항체의 예시로서, PAb1801 (Oncogene Science Ab-2) 및 DO-1 (Oncogene Science Ab-6) (Gire 및 Wynford-Thomas, Mol . Cell . Biol ., 18, 1611-1621 (1998)) 등이 언급될 수 있다. 항-p53 안타고니스트 항체를 코딩하는 핵산은 항-p53 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 통상적인 방법으로 단리될 수 있다. 수득한 H-사슬 및 L-사슬 유전자는 함께 합해 단일 사슬 항체를 코딩하는 핵산을 제조할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 상기 언급한 PTD 또는 CPP 와 융합된다.

p53 단백질의 기능을 저해하는 또다른 물질로서, 항-p21 안타고니스트 항체 또는 그것을 코딩하는 핵산이 언급될 수 있다. 항-p21 안타고니스트 항체 및 그것을 코딩하는 핵산은 또한 상기 언급한 항-p53 안타고니스트 항체 및 그것을 코딩하는 핵산과 마찬가지로 제조될 수 있다.

p53 단백질의 기능을 저해하는 또다른 물질은 p53-응답성 구성원의 콘센서스 서열 (예를 들어, Pu-Pu-Pu-G-A/T-T/A-C-Py-Py-Py (Pu: 퓨린 염기, Py: 피리미딘 염기); 서열 식별 번호: 27) 을 포함하는 유인용 핵산이다. 상기 핵산은 자동화된 DNA/RNA 합성기를 이용하여 상기언급한 뉴클레오티드 서열 정보를 근거로 합성할 수 있다. 대안적으로, 그러한 유인용 핵산은 시판되어 입수가능하다 (예를 들어, p53 전사 인자 유인물 (transcription factor decoy) (GeneDetect.com)).

항-p53 안타고니스트 항체 및 항-p21 안타고니스트 항체 또는 그 항체들을 코딩하는 핵산은 각각 p53 의 우성 음성 돌연변이 또는 그 돌연변이를 코딩하는 핵산 언급시 기재했던 방법으로 세포에 도입될 수 있다. 상기언급한 유인용 핵산은 리포펙틴법 등에 의해 세포에 도입될 수 있다.

한편, p53 유전자의 발현을 저해하는 물질의 예시로서, p53 에 대한 siRNA 또는 shRNA, p53 에 대한 siRNA 또는 shRNA 를 발현하는 벡터, p53 에 대한 안티센스 핵산 및 p53 에 대한 리보자임 등이 언급될 수 있으며, p53 에 대한 siRNA 및 shRNA 및 siRNA 또는 shRNA 를 발현하는 벡터가 바람직하다.

(b1) p53 에 대한 siRNA 및 shRNA

p53 에 대한 siRNA 는 서열 식별 번호: 1 또는 3 으로 나타낸 마우스 또는 인간 p53 cDNA 서열 정보를 근거로 하여, 예를 들어, Elbashir 등 (Genes Dev ., 15, 188-200 (2001)) 에서 제안한 법칙에 따라 고안할 수 있다. siRNA 에 대한 표적 서열은, 일반적인 법칙으로서, AA+(N)₁₉ 이나, AA+(N)₂₁ 또는 NA+(N)₂₁ 일 수 있다. 센스 가닥의 5' 말단이 AA 일 필요는 없다. 표적 서열의 위치가 특별히 제한되지 않으나, 표적 서열은 3'-UTR 이외의 영역에서 뿐만 아니라, 개시 코돈으로부터 약 50 염기 떨어진 곳과 5'-UTR 사이에서 선택되는 것이 바람직하다. 표적 서열의 GC 함량은 특별히 제한되지 않으나, 그 함량은 바람직하게는 약 30 내지 약 50% 이며; GC 분포에 있어서 변칙이 없고, 반복이 적은 서열이 바람직하다. 하기 (b2) 의 siRNA 또는 shRNA 를 발현하는 벡터의 고안에서 polIII 프로모터가 프로모터로서 이용되는 경우, 중합효소 전사 중단을 방지하기 위해서는 연속하는 4 개 이상의 T 또는 A 염기의 서열을 선택해서는 안된다.

상기 언급한 법칙을 근거로 하여 선택되는 표적 서열 후보들은 표적 이외의 mRNA 에서의 연속하는 16 내지 17 개 염기의 서열에 대해 BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 와 같은 상동성 검색 소프트웨어 프로그램을 이용하여 상동성에 대해 검사하여, 선택한 표적 서열의 특이성을 확인한다. 특이성이 확인된 표적 서열에 대해서는, AA (또는 NA) 이후에 19 내지 21 개의 염기에서 TT 또는 UU 의 3'-말단 돌출부를 가진 센스 가닥 및 TT 또는 UU 의 3'-말단 돌출부를 가진 안티센스 가닥으로 이루어진 이중가닥 RNA 를 siRNA 로서 고안한다. 또한, shRNA 는, 루프 구조를 형성할 수 있는 임의로 선택된 링커 서열 (예를 들어, 약 8 내지 25 개의 염기) 을 적절히 선택하고, 상기 언급한 센스 및 안티센스 가닥을 링커 서열을 통해 라이게이션하여 고안할 수 있다.

siRNA 및/또는 shRNA 의 서열은 각종 웹사이트에서 무료로 이용가능한 검색 소프트웨어 프로그램을 이용하여 검색할 수 있다. 상기 사이트의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, siRNA Target Finder (http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html) 및 pSilencer ^TM 발현 벡터에 대한 삽입체 고안 도구 (http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html) 가 포함되며 (이들 두가지는 모두 Ambion 에서 제공됨), RNAi COdex 에서 제공하는 GeneSeer (http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi) 이 포함되며; 유사한 검색이 QIAGEN, Takara Bio, SiSearch, Dharmacon, Whitehead Institute, Invitrogen, Promega 등의 웹사이트에서 이용가능하다.

하기에 제시된 것은 Ambion (서열 식별 번호: 5 내지 24) 및 RNAi Codex (서열 식별 번호: 25 및 26) 의 웹사이트에서 이용가능한 소프트웨어 프로그램을 이용하여 고안된 마우스 p53 에 대한 shRNA 의 서열이다. 밑줄친 서열들은, 절단자를 이용한 절단 후 생겨난 dsRNA 의 센스 가닥 (굵은 글자) 및 안티센스 가닥 (3'-돌출부 "TT" 를 포함하지 않음) 이다. 소문자는 미스매치 또는 루프를 나타낸다.

[서열 식별 번호: 5]

5'-TTT GACTGGATGACTGCCATGG ttcaagagaCCATGGCAGTCATCCAGTCTTTTTT-3'

[서열 식별 번호: 6]

5'-TTT GATATCCTGCCATCACCTC ttcaagagaGAGGTGATGGCAGGATATCTTTTTT-3'

[서열 식별 번호: 7]

5'-TTT GGCCCAAGTGAAGCCCTCC ttcaagagaGGAGGGCTTCACTTGGGCCTTTTTT-3'

[서열 식별 번호: 8]

5'-TTT GTGAAGCCCTCCGAGTGTC ttcaagagaGACACTCGGAGGGCTTCACTTTTTT-3'

[서열 식별 번호: 9]

5'-TTT GCCCTCCGAGTGTCAGGAG ttcaagagaCTCCTGACACTCGGAGGGCTTTTTT-3'

[서열 식별 번호: 10]

5'-TTT GTCTGTTATGTGCACGTAC ttcaagagaGTACGTGCACATAACAGACTTTTTT-3'

[서열 식별 번호: 11]

5'-TTT GTACTCTCCTCCCCTCAAT ttcaagagaATTGAGGGGAGGAGAGTACTTTTTT-3'

[서열 식별 번호: 12]

5'-TTT GCTATTCTGCCAGCTGGCG ttcaagagaCGCCAGCTGGCAGAATAGCTTTTTT-3'

[서열 식별 번호: 13]

5'-TTT GACGTGCCCTGTGCAGTTG ttcaagagaCAACTGCACAGGGCACGTCTTTTTT-3'

[서열 식별 번호: 14]

5'-TTT GAAGTCACAGCACATGACG ttcaagagaCGTCATGTGCTGTGACTTCTTTTTT-3'

[서열 식별 번호: 15]

5'-TTT GTCACAGCACATGACGGAG ttcaagagaCTCCGTCATGTGCTGTGACTTTTTT-3'

[서열 식별 번호: 16]

5'-TTT GGAAATTTGTATCCCGAGT ttcaagagaACTCGGGATACAAATTTCCTTTTTT-3'

[서열 식별 번호: 17]

5'-TTT GTACATGTGTAATAGCTCC ttcaagagaGGAGCTATTACACATGTACTTTTTT-3'

[서열 식별 번호: 18]

5'-TTT GACTCCAGTGGGAACCTTC ttcaagagaGAAGGTTCCCACTGGAGTCTTTTTT-3'

[서열 식별 번호: 19]

5'-TTT GTCCTTTGCCCTGAACTGC ttcaagagaGCAGTTCAGGGCAAAGGACTTTTTT-3'

[서열 식별 번호: 20]

5'-TTT GATCCGCGGGCGTAAACGC ttcaagagaGCGTTTACGCCCGCGGATCTTTTTT-3'

[서열 식별 번호: 21]

5'-TTT GACCAAGAAGGGCCAGTCT ttcaagagaAGACTGGCCCTTCTTGGTCTTTTTT-3'

[서열 식별 번호: 22]

5'-TTT GAAAGTGGGGCCTGACTCA ttcaagagaTGAGTCAGGCCCCACTTTCTTTTTT-3'

[서열 식별 번호: 23]

5'-TTT GTTGGGGAATAGGTTGATA ttcaagagaTATCAACCTATTCCCCAACTTTTTT-3'

[서열 식별 번호: 24]

5'-TTT GATTCTATCTTGGGCCCTC ttcaagagaGAGGGCCCAAGATAGAATCTTTTTT-3'

[서열 식별 번호: 25]

5'-TTTG CAuTACAgGTACgTGTGTA gtgtgctgtccTACACATGTACTTGTAGTGTTTTTT-3'

[서열 식별 번호: 26]

5'-TTTG CAGTuTACTTuCCGCCgTA gtgtgctgtccTATGGCGGGAAGTAGACTGTTTTTT-3'

p53 에 대한 siRNA 는, 자동화된 DNA/RNA 합성기를 이용하여 상기 기재된 바와 같이 고안된 센스 가닥 올리고뉴클레오티드 및 안티센스 가닥 올리고뉴클레오티드를 각각 합성하고, 예를 들어 그 올리고뉴클레오티드를 적당한 어닐링 완충 용액에서 약 90 내지 약 95℃ 에서 약 1 분 동안 변성시키고, 이후 동일한 것을 약 30 내지 약 70℃ 에서 약 1 내지 약 8 시간 동안 어닐링하여 제조할 수 있다. p53 에 대한 shRNA 는 상기 기재된 바와 같이 고안된 shRNA 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 자동화된 DNA/RNA 합성기를 이용하여 합성하고, 그것을 상기에 기재된 바와 같이 셀프-어닐링시켜 제조할 수 있다.

siRNA 및 shRNA 를 내용물로 하는 뉴클레오티드 분자들이 자연발생적인 RNA 일 수도 있지만, 그 분자들은 안정성 (화학물 및/또는 효소에 대해) 또는 특이적 활성 (mRNA 에 대한 친화성) 증대를 위해 각종 화학물 개질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제와 같은 가수분해효소에 의한 분해를 방지하기 위해, siRNA 또는 shRNA 를 구성하는 각각의 뉴클레오티드의 인산 잔기 (포스페이트) 는 예를 들어 화학적으로 개질된 인산 잔기, 예컨대 포스포로티오에이트 (PS), 메틸포스포네이트 또는 포스포로디티오네이트로 치환될 수 있다. 각 뉴클레오티드의 당 (리보오스) 의 2'-위치의 히드록실기는 -H 또는 -OR (R 은, 예를 들어 CH₃(2'-O-Me), CH₂CH₂OCH₃(2'-O-MOE), CH₂CH₂NHC(NH)NH₂, CH₂CONHCH₃, CH₂CH₂CN 등을 나타낸다) 로 치환될 수 있다. 더욱이, 염기 부분 (피리미딘, 퓨린) 은 화학적으로 개질될 수 있으며; 예를 들어 피리미딘 염기의 5-위치에 대한 메틸기 또는 양이온성 관능기의 도입, 2-위치 카르보닐기의 티오카르보닐로의 치환 등이 언급될 수 있다.

RNA 의 당 부분의 배치에 관해서, 두 가지 유형이 지배적이다: C2'-엔도 (S 타입) 및 C3'-엔도 (N 타입); 단일 가닥 RNA 에서, 당 부분은 두가지의 평형이 일어나나, 이중가닥이 형성될 때, 배치는 N 타입으로 고정된다. 따라서, 당 부분의 배치가 2' 산소와 4' 탄소의 브릿지에 의해 N 타입으로 고정되어, 표적 RNA 에 대한 강한 결합성이 부여된 RNA 유도체인 BNA (LNA) (Imanishi, T. 등, Chem . Commun., 1653-9, 2002; Jepsen, J.S. 등, Oligonucleotides , 14, 130-46, 2004) 및 ENA (Morita, K. 등, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids , 22, 1619-21, 2003) 이 또한 바람직하게 사용될 수 있다.

그러나, 자연발생 RNA 중의 모든 리보뉴클레오시드 분자를 개질된 유형의 분자로 치환하는 것은 RNAi 활성 소실을 유도할 수 있으므로, RISC 복합체로 하여금 기능하도록 하는 최소한의 범위로 개질된 뉴클레오시드를 도입해야할 필요가 있다.

p53 에 대한 siRNA 는 또한, 예를 들어 Ambion (예를 들어, Ambion Cat# AM16708, siRNA ID# 69659, 69753, 69843, 187424, 187425, 187426), Santa Cruz (예를 들어, Santa Cruz Cat# sc-29436, 44219) 등 에서 구입할 수 있다.

인간 p53 에 대한 siRNA 및 shRNA 는 상기언급한 검색 소프트웨어 프로그램들 중 하나를 이용하여, 서열 식별 번호: 3 로 나타낸 인간 p53 cDNA 또는 검색서열 번호 (NM_000546) 등을 검색어로 넣어 고안 및 합성하거나, 또는 Ambion 등에서 구입할 수 있다. 구체적으로, 서열 5'- GACTCCAGTGGTAATCTACTG CTCGAGCAGTAGATTACCACTGGAGTC-3' (서열 식별 번호: 28; 굵은 글자는 p53 에 대한 표적 서열을 나타내며; 밑줄은 dsRNA 가 형성되는 위치이다) 을 가진, Science , 296, 550-553 (2002) 에 기재된 인간 p53 에 대한 shRNA 등이 언급될 수 있다.

p53 에 대한 siRNA 또는 shRNA 와 체세포와의 접촉은, 플라스미드 DNA 의 경우에서와 같이, 리포좀법, 폴리아민법, 전자천공법, 비드 방법 등을 이용하여 세포에 핵산을 도입하여 달성할 수 있다. Lipofectamine2000 및 Oligofectamine (Invitrogen) 와 같은 일반적인 트랜스펙션 시약에 추가하여, 예를 들어, siRNA 의 도입에 적합한 이동 시약, 예컨대 GeneEraser^TM siRNA 트랜스펙션 시약 (Stratagene) 이 시판되어 이용가능하다.

(b2) p53 에 대한 siRNA 또는 shRNA 를 발현하는 벡터

siRNA 를 발현하는 벡터는 탠덤 타입 및 스템 루프 (헤어핀) 타입으로 이용가능하다. 전자는 siRNA 의 센스 가닥에 대한 발현 카셋트 및 안티센스 가닥에 대한 발현 카셋트를 앞뒤로 라이게이션하여, 각 가닥이 세포에서 발현되도록 하고 어닐링시켜, 이중가닥 siRNA (dsRNA) 를 형성하도록 한 유형이다. 한편, 후자는 shRNA 에 대한 발현 카셋트를 벡터에 삽입하고, shRNA 를 세포에서 발현되도록 하고 다이서 (dicer) 로 프로세싱하여 dsRNA 를 형성하도록 하는 유형이다. polII 프로모터 (예를 들어, CMV 의 조기발현 (immediate-early) 프로모터) 를 프로모터로서 이용할 수도 있지만, 짧은 RNA 의 정확한 전사를 가능케 하기 위해 polIII 프로모터를 이용하는 것이 일반적이다. polIII 프로모터로서는, 마우스 및 인간 U6-snRNA 프로모터, 인간 H1-RNase P RNA 프로모터, 인간 발린-tRNA 프로모터 등이 언급될 수 있다. 전사 종결 시그널로서, 4 개 이상의 T 잔기가 연속하여 있는 서열이 이용된다.

이어서, 그렇게 구축된 siRNA 또는 shRNA 발현 카셋트는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터에 삽입된다. 그러한 벡터로서, 바람직하게는 p53 의 우성 음성 돌연변이를 코딩하는 핵산과 관련하여 기재한 것과 동일한 것을 이용할 수 있다 (바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스바이러스 및 센다이 바이러스; 동물 세포 발현 플라스미드 등). 사용되는 벡터는 우성 음성 돌연변이의 경우에서와 같이, 수득하는 세포의 의도하는 용도에 따라 적당히 선택할 수 있다. 대안적으로, p53 에 대한 shRNA 를 코딩하는 발현 벡터로서, 바이러스성 벡터, 예컨대 시판되어 이용가능한 플라스미드 (예를 들어, pMKO.1-puro p53 shRNA2: #10672 (Addgene 에서 시판하여 입수가능함) 등) 등을 기반으로 제조된 레트로바이러스 벡터를 또한 이용할 수 있다. 상기언급한 Cre-loxP 시스템 또는 piggyBac 트랜스포존 시스템이 또한 필요에 따라 이용가능하다.

p53 에 대한 siRNA 또는 shRNA 를 발현하는 벡터와 체세포의 접촉은 상기 기재된 바와 같이 제조한 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터를 세포에 도입하여 달성된다. 상기 유전자들의 이동은 p53 의 우성 음성 돌연변이를 코딩하는 핵산과 관련하여 기재된 것과 동일한 기술로 달성될 수 있다.

(b3) 기타 물질

p53 유전자의 발현을 저해하는 기타 물질로서, p53 에 대한 안티센스 핵산 및 리보자임이 언급될 수 있다.

안티센스 핵산은 DNA 또는 RNA, 또는 DNA/RNA 키메라일 수 있다. 안티센스 핵산이 DNA 인 경우, 표적 RNA 및 안티센스 DNA 에 의해 형성된 RNA:DNA 하이브리드는 내재하는 RNase H 에 의해 인식되어 표적 RNA 의 선택적인 분해를 가져올 수 있다. 따라서, RNase H 로 분해시킬 안티센스 DNA 의 경우, 표적 서열은 p53 mRNA 중의 서열 뿐만이 아니라, p53 유전자의 1 차적인 전사물의 인트론 영역 중의 서열일 수도 있다. 안티센스 핵산에 대한 표적 영역의 길이는, 안티센스 핵산의 혼성화가 p53 단백질로의 트랜슬레이션의 저해를 가져오는 한, 특별히 제한되지 않으며; 표적 영역은 p53 mRNA 의 전체 서열 또는 부분적인 서열일 수 있는데, 최소로는 약 15 개 염기의 서열일 수 있고, 최대로는 mRNA 전장 서열 또는 1 차적인 전사물일 수 있다. 합성의 용이성, 면역원성, 세포 및 기타 조직에서의 이동능력을 고려하면, 약 15 내지 약 40 개 염기, 특히 약 18 내지 약 30 개 염기로 이루어진 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 표적 서열의 위치에는, 이에 제한되지 않으나, 5'- 및 3'-UTR, 개시 코돈 부근 등이 포함된다.

리보자임은, 좁은 의미로는 핵산을 절단하는 효소 활성을 보유한 RNA 를 지칭하며, 본원에서는 리보자임이 서열 특이적 핵산 절단 활성을 갖는 한 DNA 까지를 포함하는 개념으로서 이해된다. 가장 다용도인 리보자임들 중 하나가 바이로이드 (viroid) 및 바이루소이드 (virusoid) 같은 감염성 RNA 에서 발현되는 자가-스플라이싱 RNA 이며, 해머헤드형, 헤어핀형 등이 공지되어 있다. 해머헤드형은 길이가 약 40 개 염기이며 효소 활성을 나타내고, 해머헤드 구조 부분 (총 약 10 개의 염기) 에 인접한 두 말단에서 여러개의 염기들이 mRNA 의 원하는 절단 부위에 상보적인 서열을 만들도록 하여 표적 mRNA 를 특이적으로 절단하는 것이 가능하다.

안티센스 핵산 또는 리보자임은 자동화 DNA/RNA 합성기를 이용하여 합성할 수 있다. 이들을 구성하는 뉴클레오티드 분자들은 또한 siRNA 에 대한 것과 동일한 개질을 가질 수 있으며, 그로 인해 안정성, 특이적 활성 등을 증가시킬 수 있다.

대안적으로, siRNA 의 경우와 마찬가지로, 안티센스 핵산 또는 리보자임이 또한 그것을 코딩하는 핵산의 형태로 이용될 수 있다.

상기언급한 p53 기능의 저해제는, 체세포 핵 초기화의 단계에서 p53 기능을 저해하기에 충분한 방식으로 체세포와 접촉시킬 필요가 있다. 본원에서, 체세포의 핵 초기화는 핵 초기화 물질을 체세포와 접촉시켜 달성될 수 있다.

(c) 핵 초기화 물질

본 발명에서, "핵 초기화 물질" 은, 단백질성 인자 또는 그것을 코딩하는 핵산 (벡터에 혼입된 형태 포함) 또는 저분자량 화합물과 같은, 체세포에서 iPS 세포를 유도할 수 있는 임의의 물질을 지칭한다. 핵 초기화 물질이 단백질성 인자 또는 그것을 코딩하는 핵산인 경우, 예를 들어 하기의 조합이 바람직하다 (이후, 단백질성 인자에 대한 명칭만을 나타냄).

(1) Oct3/4, Klf4, c-Myc

(2) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2 (본원에서, Sox2 는 Sox1, Sox3, Sox15, Sox17 또는 Sox18 로 대체가능; Klf4 는 Klf1, Klf2 또는 Klf5 로 대체가능; 추가로, c-Myc 는 T58A (활성 돌연변이), N-Myc, 또는 L-Myc 로 대체가능)

(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, β-카테닌 (활성 돌연변이 S33Y)

(4) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T

(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6

(6) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7

(7) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV6 E6, HPV16 E7

(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmil

[상기 전부에 대해서는, WO 2007/069666 참조 (상기 조합 (2) 에서 Sox2 를 Sox18 로 대체하고, Klf4 를 Klf1 또는 Klf5 로 대체하는 것에 대해서는, Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008) 참조); 조합 "Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2" 에 대해서는, 또한 Cell , 126, 663-676 (2006), Cell , 131, 861-872 (2007) 등을 참조; 조합 "Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40 Large T" 에 대해서는 또한, Nature, 451, 141-146 (2008) 참조]

(9) Oct3/4, Klf4, Sox2 [Nature Biotechnology , 26, 101-106 (2008) 참조]

(10) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28 [Science , 318, 1917-1920 (2007) 참조]

(11) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28, hTERT, SV40 Large T (Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008) 참조)

(12) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28 [Cell Research (2008) 600-603 참조]

(13) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SV40 Large T (또한, Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008) 참조)

(14) Oct3/4, Klf4 [또한, Nature , 454, 646-650 (2008); Cell Stem Cell , 2: 525-528 (2008) 참조]

(15) Oct3/4, c-Myc [Nature , 454, 646-650 (2008) 참조]

(16) Oct3/4, Sox2 [Nature , 451, 141-146 (2008), WO2008/118820 참조]

(17) Oct3/4, Sox2, Nanog (WO2008/118820 참조)

(18) Oct3/4, Sox2, Lin28 (WO2008/118820 참조)

(19) Oct3/4, Sox2, c-Myc, Esrrb (본원에서, Essrrb 는 Esrrg 로 대체가능; Nat. Cell Biol ., 11, 197-203 (2009) 참조)

(20) Oct3/4, Sox2, Esrrb (Nat . Cell Biol ., 11, 197-203 (2009) 참조)

(21) Oct3/4, Klf4, L-Myc

(22) Oct3/4, Nanog

(23) Oct3/4

(24) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28, SV40LT (Science , 324: 797-801 (2009) 참조)

상기 (1) 내지 (24) 에서, Oct3/4 대신에, Oct 패밀리의 다른 구성원, 예를 들어 Oct1A, Oct6 등이 또한 사용될 수 있다. Sox2 (또는 Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18) 대신에, Sox 패밀리의 다른 구성원, 예를 들어 Sox7 등이 또한 사용될 수 있다. c-Myc 대신에, Myc 패밀리의 다른 구성원, 예를 들어 L-Myc 등이 사용될 수 있다. Lin28 대신에, Lin 패밀리의 다른 구성원, 예를 들어 Lin28b 등이 또한 사용될 수 있다.

상기 (1) 내지 (24) 에 속하지 않지만, 그 중 임의의 것의 모든 구성원을 포함하며, 추가로 임의 선택된 기타 물질을 포함하는 조합이 또한 본 발명에서 "핵 초기화 물질" 의 범주에 포함될 수 있다. 핵 초기화 대상인 체세포가 핵 초기화를 유발하기에 충분한 수준으로 상기 (1) 내지 (24) 중 임의의 한가지의 하나 이상의 구성원들을 내재적으로 발현한다면, 해당하는 하나 이상의 구성원들을 제외한 나머지 구성원들만의 조합도 또한 본 발명에서 "핵 초기화 물질" 의 범주에 포함될 수 있다.

상기 조합들 중에서, 바람직한 핵 초기화 물질의 예시로서, Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog, Lin28 및 SV40 Large T 로부터 선택되는 하나 이상, 바람직하게는 두가지 이상, 더욱 바람직하게는 세가지 이상이 언급될 수 있다.

수득한 iPS 세포가 치료 목적으로 이용되는 경우, 상기 조합들 중에서도 바람직하게는 세가지 인자 Oct3/4, Sox2 및 Klf4 의 조합 [즉, 상기 (9)] 이 사용된다. 본 발명의 방법에서, 상기 언급한 세가지 인자만으로도 iPS 세포가 충분히 높은 효율로 수득될 수 있다. 즉, 세가지 인자만으로도, 네가지 인자 (Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc) 를 이용한 효율과 근접한 효율로 iPS 세포가 확립될 수 있다. 한편, 수득한 iPS 세포를 치료 목적으로 이용하지 않는다면 (예를 들어, 약물 발견 스크리닝 등을 위한 연구 수단으로서 이용) 상기 언급한 네가지 인자 뿐만 아니라, 다섯가지 인자 Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2 및 Lin28, 또는 상기 다섯가지 인자에 Nanog 를 더하여 포함되는 여섯개의 인자 [즉, 상기 (12)] 가 바람직하다. 상기 바람직한 조합에서, L-Myc 는 또한 c-Myc 대신 사용될 수 있다.

상기 언급한 단백질성 인자의 마우스 및 인간 cDNA 서열에 대한 정보는 WO 2007/069666 에 언급된 NCBI 접근 번호를 참조하여 이용가능하다. (공보에서, Nanog 는 "ECAT4" 로 기재되어 있고, Lin28, Lin28b, Esrrb 및 Esrrgd 에 대한 마우스 및 인간 cDNA 서열 정보는 각각 하기의 NCBI 접근 번호를 참조하여 입수가능하다); 당업자는 상기 cDNA 를 용이하게 입수할 수 있다.

유전자 명칭 마우스 인간

Lin28 NM_145833 NM_024674

Lin28b NM_001031772 NM_001004317

Esrrb NM_011934 NM_004452

Esrrg NM_011935 NM_001438

단백질성 인자는 핵 초기화 물질로서 이용하는 경우, 인자들은, 적당한 발현 벡터에 수득한 cDNA 를 삽입하고, 그 벡터를 숙주 세포에 도입하고, 배양된 세포 또는 그의 조건화된 배지로부터의 재조합 단백질성 인자를 회수하여 제조할 수 있다. 한편, 핵 초기화 물질로서 단백질성 인자를 코딩하는 핵산을 이용하는 경우, p53 의 우성 음성 돌연변이를 코딩하는 핵산의 경우에서와 마찬가지로, 수득한 cDNA 는 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 구축하고, 그 벡터는 핵 초기화 단계에 적용된다. 상기언급한 Cre-loxP 시스템 또는 piggyBac 트랜스포존 시스템은 필요에 따라 이용할 수 있다. 두가지 이상의 단백질성 인자를 코딩하는 핵산이 핵 초기화 물질로서 세포에 도입되는 경우, 그 핵산은 별도의 벡터에 의해 담지될 수 있으며, 다수의 핵산이 나란히 합해져 폴리시스트로닉 벡터를 수득할 수 있다. 후자의 경우, 효율적인 폴리시스트로닉 발현을 가능하게 하기 위해서, 수족구병 바이러스의 2A 자가절단 펩티드 (Science , 322, 949-953, 2008 등 참조), IRES 서열 등, 바람직하게는 2A 서열을 개별 핵산들 사이에 라이게이션시키는 것이 바람직하다.

p53 기능이 저해되는 경우, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 통해 염색체에 통합된 트랜스유전자는 유전자 침묵화에 대해 내성인 경향이 있다. 따라서, 외인성 핵 초기화 물질의 불필요한 지속적 발현을 방지하기 위해서는, 플라스미드 벡터의 이용이 유리하다.

핵 초기화 물질과 체세포의 접촉은, (a) 그 물질이 단백질성 인자인 경우에는, p53 의 우성 음성 돌연변이를 코딩하는 상기 언급한 핵산과 와 마찬가지로 수행될 수 있으며; (b) 그 물질이 단백질성 인자 (a) 를 코딩하는 핵산인 경우, p53 의 우성 음성 돌연변이를 코딩하는 상기 언급된 핵산과 같이 수행될 수 있고; (c) 그 물질이 저분자량 화합물인 경우, 상기언급한 p53 의 화학적 저해제와 같이 수행될 수 있다.

상기에 기재한 바와 같이, p53 기능의 저해제는 체세포 핵 초기화 단계에서 p53 을 저해하기에 충분한 방식으로 체세포와 접촉시켜야 한다. 이러한 필요조건이 충족되는 한, 핵 초기화 물질 및 p53 기능의 저해제는 체세포에 동시에 접촉시키거나, 또는 한가지를 먼저 접촉시킬 수 있다. 한 구현 양태에서, 예를 들어 핵 초기화 물질이 단백질성 인자를 코딩하는 핵산이고, p53 기능의 저해제가 화학적 저해제인 경우, 전자는 트랜스펙션 처리부터 단백질성 인자의 대량발현까지 걸리는 시간이 있지만, 후자는 p53 기능을 신속하게 저해할 수 있으므로, 세포는 트랜스펙션 처리 후 주어진 시간 동안 배양된 후, p53 의 화학적 저해제를 배지에 첨가할 수 있다. 또다른 구현 양태에서, 예를 들어, 핵 초기화 물질 및 p53 기능의 저해제가 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터의 형태로 이용되는 경우, 두가지 모두를 동시에 세포에 도입할 수 있다.

아데노바이러스 또는 비(非)바이러스 발현 벡터를 체세포에 도입하기 위한 취급의 반복 횟수는 특별히 제한되지 않으며, 트랜스펙션은 단번에 또는 선택하는 임의의 횟수로 (예를 들어, 1 회 내지 10 회, 1 회 내지 5 회 등) 수행할 수 있다. 두가지 이상 종류의 아데노바이러스 또는 비바이러스 발현 벡터를 체세포에 도입하는 경우, 바람직하게는 모든 종류의 아데노바이러스 또는 비바이러스 발현 벡터를 동시에 체세포에 도입하나; 그러한 경우일지라도, 트랜스펙션은 단번에 또는 선택하는 임의의 횟수로 (예를 들어, 1 회 내지 10 회, 1 회 내지 5 회 등) 수행할 수 있으며, 바람직하게는 트랜스펙션은 2 회 이상 (예를 들어, 3 회 또는 4 회) 반복하여 수행할 수 있다.

(d) iPS 세포 확립 효율 개선제

p53 기능 저해제에 추가하여, 또다른 널리 공지된 세포 확립 효율 개선제를 체세포에 접촉시킴으로써, 세포의 확립 효율이 더 많이 증가될 것으로 예측된다.

iPS 세포 확립 효율 개선제의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 히스톤 디아세틸라아제 (HDAC) 저해제 [예를 들어, 발프로산 (VPA) (Nat . Biotechnol ., 26(7): 795-797 (2008)], 저분자량 저해제, 예컨대 트리코스타틴 A, 나트륨 부티레이트, MC 1293 및 M344, 핵산-기재 발현 저해제, 예컨대 HDAC 에 대한 siRNA 및 shRNA (예를 들어, HDAC1 siRNA Smartpool (Millipore), HDAC1 에 대한 HuSH 29mer shRNA 구축물 (OriGene) 등), 등], G9a 히스톤 메틸트랜스퍼라아제 저해제 [예를 들어, 저분자량 저해제, 예컨대 BIX-01294 (Cell Stem Cell , 2: 525-528 (2008)], 핵산-기재 발현 저해제, 예컨대 G9a 에 대한 siRNA 및 shRNA [예를 들어, G9a siRNA (인간) (Santa Cruz Biotechnology) 등) 등], L-채널 칼슘 아고니스트 (예를 들어, Bayk8644) [Cell Stem Cell , 3, 568-574 (2008)], UTF1 [Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008)], Wnt 신호전달 유도제 (예를 들어, 가용성 Wnt3a) [Cell Stem Cell , 3, 132-135 (2008)], 2i/LIF [2i 은 미토겐-활성화 단백질 키나아제 신호전달 및 글리코겐 합성효소 키나아제-3 의 저해제이다, PloS Biology , 6(10), 2237-2247 (2008)] 등이 포함된다. 상기에 언급한 바와 같이, 핵산-기재 발현 저해제는 siRNA 또는 shRNA 를 코딩하는 DNA 를 보유하는 발현 벡터의 형태일 수 있다.

상기언급한 핵 초기화 물질의 구성성분들 중에서, SV40 large T 는, 예를 들어, iPS 세포 확립 효율 개선제의 범주에 포함될 수 있는데, 이는 이들이 체세포 핵 초기화에 필수적인 것은 아니고 보조적인 인자인 것으로 여겨지기 때문이다. 핵 초기화에 대한 메카니즘이 불분명한 상황에서, 핵 초기화에 필수적이진 않은 보조적인 인자들이 핵 초기화 물질 또는 iPS 세포 확립 효율 개선제로서 편리하게 여겨질 수 있다. 이에 따라, 체세포 핵 초기화 프로세스가 핵 초기화 물질(들) 및 iPS 세포 확립 효율 개선제(들)의 체세포와의 접촉으로 인한 총체적인 사건으로 간주되기 때문에, 당업자는 이들 두가지를 항상 구분할 필요는 없는 것으로 보인다.

iPS 세포 확립 효율 개선제와 체세포의 접촉은, p53 기능 저해제가 하기와 같은 각 세가지 경우에 상기 기재된 바와 같이 달성될 수 있다: 개선제가 (a) 단백질성 인자이거나, (b) 단백질성 인자를 코딩하는 핵산이거나, 또는 (c) 저분자량 화합물임.

(e) 체세포의 공급원

포유류 기원 (예를 들어, 마우스, 인간) 의, 생식세포를 제외한 임의의 세포들을 본 발명에서의 iPS 세포 제조를 위한 출발 물질로서 이용할 수 있다. 예시에는, 각질화 상피 세포 (예를 들어, 각질화 표피 세포), 점막 상피 세포 (예를 들어, 혀 표층의 상피 세포), 외분비샘 상피 세포 (예를 들어, 젖샘 세포), 호르몬 분비 세포 (예를 들어, 부신수질), 대사 또는 저장을 위한 세포 (예를 들어, 간세포), 접면을 구성하는 내막 상피 세포 (예를 들어, 타입 I 폐포 세포), 폐쇄관의 내막 상피 세포 (예를 들어, 혈관 내피 세포), 수송 능력을 가진 섬모를 가진 세포 (예를 들어, 기도 상피 세포), 세포외 매트릭스 분비를 위한 세포 (예를 들어, 섬유아세포), 괄약성 세포 (예를 들어, 평활근 세포), 혈액 및 면역계의 세포 (예를 들어, T 림프구), 감각 관련 세포 (예를 들어, 샘세포 (bacillary cells)), 자율신경계 신경세포 (예를 들어, 콜린성 신경세포), 감각 기관의 지주세포 및 말초 신경세포 (예를 들어, 위성 세포), 중추 신경계의 신경 세포 및 아교 세포 (예를 들어, 별아교 세포), 색소 세포 (예를 들어, 망막 색소 상피 세포), 그의 전구 세포 (조직 전구 세포) 등이 포함된다. 세포 분화 정도에 대해서는 제한이 없다; 심지어 미분화 전구 세포 (체세포 줄기세포를 포함) 및 최종적으로 분화된 성숙 세포가 본 발명에서 체세포의 공급원으로서 비슷하게 사용될 수 있다. 본원에서, 미분화 전구 세포의 예시로서는 조직 줄기 세포 (체세포 줄기 세포), 예컨대 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 및 치수 줄기 세포가 포함된다.

본 발명의 방법에 따르면, iPS 세포는 심지어, 일반적으로는 iPS 세포를 확립하기 어려운 것으로 전해지는, 최종적으로 분화된 체세포로부터도 효율적으로 수득될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현 양태에서, T 세포가 체세포로 이용된다. T 세포는 CD4-양성 또는 CD8-양성일 수 있으며, CD4/CD8 이중-양성 분화 단계의 세포일 수 있다. T 세포는 비장, 림프절, 말초혈액, 제대혈 등으로부터 자체로 공지된 방법, 예를 들어 CD4, CD8 또는 CD3 와 같은 세포 표면 마커에 대한 항체를 이용하는 유세포분석 및 세포 분류기를 이용하여 단리될 수 있다. 마우스의 경우, 체세포를 T 세포의 함량비가 높은 비장 또는 림프절로부터 수집하는 것이 바람직하고; 인간의 경우, 침습성이 낮고 제조가 용이하다는 점에서, T 세포를 말초혈액, 제대혈 등으로부터 제조하는 것이 바람직하다.

수집할 체세포의 공급원으로서 제공되는 포유류의 선택은 특별히 제한되지 않으나; 수득한 세포를 인간에서 재생 의학을 위해 사용하는 경우, 이식 거부가 발생하지 않는다는 점에서, 환자 자신 또는 동일한 HLA 타입의 또다른 사람으로부터 체세포를 수집하는 것이 바람직하다. 수득한 iPS 세포가 인간에게 투여 (이식) 되지 않지만, 예를 들어 환자의 약물 수용성 또는 부작용을 평가하기 위한 스크리닝을 위한 세포의 공급원으로서 사용되는 경우, 약물 수용성 또는 부작용과 관련한 동일한 유전자적 다형성을 가진 환자 또는 또다른 사람 유래의 체세포를 수집하는 것이 마찬가지로 필요하다.

마우스 또는 인간과 같은 포유류로부터 분리된 체세포는 세포 종류에 따라 그의 배양에 적합한 것으로 자체 공치된 배지를 이용하여 예비배양될 수 있다. 상기 배지의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 약 5 내지 20% 소태아 혈청을 포함하는 최소 필수 배지 (MEM), Dulbecco's Modified Eagle 배지 (DMEM), RPMI1640 배지, 199 배지, F12 배지 및 이들의 배합물 등이 포함된다. 5% 이하의 낮은 혈청 농도에서의 예비배양의 수행으로, iPS 세포 확립의 효율이 개선된다는 보고가 있다 (예를 들어, WO 2009/006997). T 세포를 체세포로 이용하는 경우, 세포는 싸이토카인, 예컨대 인터류킨 (IL)-1, IL-7, 줄기 세포 인자 (SCF) 또는 Flt3 리간드를 함유하는 배지를 이용하여 예비배양하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 핵 초기화 물질과 p53 기능의 저해제 (및 iPS 세포 확립 효율을 개선시키는 또다른 물질) 과 접촉시키는 양이온성 리포좀과 같은 트랜스펙션 시약을 사용하는 경우, 배지를 미리 혈청이 없는 배지로 교체하여 이동 효율 감소를 예방하는 것이 때때로 바람직하다. 핵 초기화 물질을 세포에 접촉시킨 후, 세포는 예를 들어, ES 세포의 배양에 적합한 조건 하에 배양될 수 있다. 마우스 세포의 경우, 배양은 일반 배지에 분화 억제제로서 백혈병 저해 인자 (LIF) 를 첨가하여 수행한다. 한편, 인간 세포의 경우, 기본적인 섬유아세포 성장 인자 (bFGF) 및/또는 줄기세포 인자 (SCF) 를 LIF 대신에 첨가하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 세포는, 피더 세포로서, 방사선 조사 또는 항생제를 처리하여 세포 분열을 종결시킨 마우스 배아 유래 섬유아세포 (MEF) 의 공존 하에 배양한다. MEF 로서 STO 세포 등이 일반적으로 이용되나, iPS 세포 유도를 위해서는, SNL 세포 [McMahon, A.P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-085 (1990)] 등이 일반적으로 이용된다. 피더 세포와의 공동배양은 핵 초기화 물질의 접촉 전, 접촉시 또는 접촉 후 (예를 들어, 1 내지 10 일 후) 시작할 수 있다.

iPS 세포의 후보 콜로니는 약물 내성 및 리포터 활성을 표식자로서 이용하는 방법 및 형상의 육안 검사를 근거로 하는 방법으로 선별할 수 있다. 전자의 예시로서, 약물 내성 및/또는 리포터 활성에 대해 양성인 콜로니를 재조합 체세포를 이용하여 선별하고, 여기서 약물 내성 유전자 및/또는 리포터 유전자는 다능성 세포에서 특이적으로 많이 발현되는 유전자 (예를 들어, Fbx15, Nanog, Oct3/4 등, 바람직하게는 Nanog 또는 Oct3/4) 의 영역을 표적으로 한다. 상기 재조합 체세포의 예시에는, Fbx15 영역 [Takahashi & Yamanaka, Cell , 126, 663-676 (2006)] 에 대해 넉-인 (knocked-in) 된 βgeo (β-갈락토시다아제 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제의 융합 단백질을 코딩함) 유전자를 가진 MEF 또는 Nanog 유전자 영역에 통합된 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자 및 푸로마이신 내성 유전자가 있는 트랜스제닉 마우스 유래의 MEF [Okita 등, Nature , 448, 313-317 (2007)] 등이 포함된다. 한편, 형상의 육안 검사를 근거로 하는 후자 방법의 예시에는 Takahashi 등이 Cell, 131, 861-872 (2007) 에 기재한 방법이 포함된다. 리포터 세포를 이용하는 방법이 편리하고 효율적이긴 하지만, 안전성의 관점에서, iPS 세포를 인간 치료의 목적으로 제조한 경우 육안 검사로 콜로니를 선별하는 것이 바람직하다. 세가지 인자 Oct3/4, Klf4 및 Sox2 를 핵 초기화 물질로 이용하는 경우, 확립된 클론의 갯수는 감소하나, 결과로서 수득되는 콜로니는 대부분 ES 세포에 필적하는 높은 품질의 iPS 세포이므로; 그러한 iPS 세포는 리포터 세포의 이용없이도 효율적으로 확립될 수 있다.

iPS 세포로서 선별된 콜로니 세포의 동정은 Nanog (또는 Oct3/4, Fbx15) 리포터에 대한 양성 반응 (GFP 양성, β-갈락토시다아제 양성 등) 및 선별 마커 (푸로마이신 내성, G418 내성 등) 에 대한 양성 반응 뿐만 아니라, 상기 기재한 바와 같은 육안으로 확인가능한 ES 세포형 콜로니의 형성에 의해 확인될 수 있다. 그러나, 더 높은 정확성을 위해서, 각종 ES-세포 특이적 유전자의 발현을 분석하고 선별된 세포를 마우스에 이식하고 기형종 형성을 확인하는 것과 같은 시험을 수행하는 것도 가능하다. 이러한 시험 방법은 당업자에게 자명하며, 대표적인 확인 시험은 하기 실시예에 기재한다.

이와 같이 확립한 iPS 세포는 여러가지 목적을 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, ES 세포에 대한 보고된 분화 유도 방법을 이용하여, iPS 세포의 각종 세포 (예를 들어, 심근 세포, 혈액 세포, 신경 세포, 혈관 내피 세포, 인슐린 분비 세포 등) 로의 분화를 유도할 수 있다. 따라서, 환자 또는 환자와 동일한 HLA 타입을 가진 다른 개체로부터 수집한 체세포를 이용하는 iPS 세포 유도는 자가 이식 또는 동종이계 이식에 의한 줄기세포 요법을 가능하게 하는데, 여기서 iPS 세포는 원하는 세포 (즉, 환자의 손상된 장기 세포, 질병에 대해 치료 효과를 가진 세포 등) 로 분화되며, 이것이 환자에게 이식된다. 더욱이, iPS 세포로부터 분화된 기능성 세포 (예를 들어, 간 세포) 는 또한, 해당하는 기존의 세포주보다 생체내에서 기능성 세포의 실제 상태를 더 잘 반영하는 것으로 생각되어, 약제학적 후보 화합물 등의 유효성 및 독성에 대한 시험관내 스크리닝에 적합하게 이용될 수 있다.

p53 의 우성 음성 돌연변이 또는 p53 에 대한 siRNA 또는 shRNA 를 코딩하는 핵산 등이 체세포에 도입되고 그곳에서 발현되도록 하는 양태에서 p53 의 저해가 수행되는 경우, 수득된 iPS 세포는 외인성 핵산의 오염으로 인해 통상 공지된 iPS 세포와는 다른 신규한 세포이다. 특히, 외인성 핵산이 레트로바이러스, 렌티바이러스 등을 이용하여 체세포에 도입되는 경우, 외인성 핵산은 일반적으로 수득한 세포의 게놈에 통합되어 외인성 핵산을 포함하는 것의 표현형이 안정하게 유지된다. 외인성 핵산이 지속성 센다이 바이러스 벡터를 이용하여 도입되는 경우, 외인성 핵산은 수득한 iPS 세포의 세포질에서 안정하게 나타날 수 있어, 외인성 핵산을 포함하는 것의 표현형도 마찬가지로 안정하게 유지된다.

본 발명은 또한 TCR 유전자가 재배열되고, T 세포의 핵 초기화로 수득되는 iPS 세포를 제공한다. T 세포 초기화 방법으로서, T 세포를 상기 기재된 바와 같이 p53 기능을 저해하기 위한 조건 하에 핵 초기화 물질과 접촉시키는 방법을 언급할 수 있다. T 세포로부터 유도된 세포 (T-iPS 세포) 에서, 그것이 유도되어 온 T 세포 내의 TCR 재배열은 보존된다. 이제까지 iPS 세포가 B 세포로부터 유도된 경우는 일부 있었지만, T 세포로부터 유도된 iPS 세포 확립에 관해서는 보고된 바 없다. TCR 의 재배열은 T-iPS 세포로부터 분화된 세포에서조차 보존되므로, 상기 기재된 펩티드들 중 하나를 제시하는 세포 (예를 들어, 암세포, 감염된 세포 등) 를 특이적으로 손상시킬 수 있는 T 세포는, 예를 들어 암 항원 펩티드 또는 바이러스와 같은 병원체의 세포 표면으로부터 유도된 펩티드로 활성화시킨 항원-제시 세포 (예를 들어, 마크로파지, 수상 세포 등) 를 특이적으로 인식할 수 있는 T 세포 클론으로부터 T-iPS 세포를 확립하고, 그 iPS 세포를 본 발명의 방법을 이용하여 시험관내에서 대량 증폭하고, T 세포로 그의 분화를 유도하여 대량으로 제조할 수 있으며, 통상적인 T 세포 면역요법과 함께 T 세포 면역치료제로서 제조할 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예를 수단으로 하여 더욱 상세히 설명될 것이나, 본 발명은 이로인해 전혀 제한되지 않는다.

실시예

[실시예 1: p53 결핍의 영향]

Nanog 리포터를 가진 p53 호모 결핍 마우스 또는 헤테로 결핍 마우스를 실험 시스템으로서 이용했다. p53 은 대부분의 모든 세포에서 발현되는 유전자이며, 손상된 세포의 수리 동안의 세포 주기 종결 또는 아폽토시스를 조절한다. 상기 마우스는 엑손 5 를 네오마이신 내성 유전자로 치환하여 p53 유전자의 기능이 유도되었다 (Lawrence A. Donehower (1992). Nature 356, 215-221). p53 호모 결핍 마우스는 정상적으로 태어나지만, 빈번하게 발암을 겪는 것으로 보고되었다. Nanog 리포터는 녹색 형광 단백질 (EGFP) 및 푸로마이신 내성 유전자를 BACPAC Resources (Okita K. 등, Nature 448, 313-317(2007)) 로부터 구입한 BAC (박테리아 인공 염색체) 의 Nanog 영역에 삽입하여 제조했다. 마우스 Nanog 유전자는 ES 세포 및 초기 배아와 같은 다능성 세포에서 특이적으로 발현되는 유전자이다. 상기 리포터에 대해 양성으로 되는 마우스 iPS 세포는 ES 세포의 것과 거의 동등하게 분화에 대한 잠재성을 갖는 것으로 공지되어 있다. 그러한 Nanog 리포터를 가진 Nanog 리포터 마우스 (Okita K. 등, Nature 448, 313-317(2007)) 를 제조하고, 그 마우스를 p53 결핍 마우스와 교배시킴으로써, Nanog 리포터를 가진 p53 호모 결핍 마우스 및 헤테로 결핍 마우스를 제조했다.

핵 초기화에 이용한 레트로바이러스는 각각의 레트로바이러스 발현 벡터 (pMXs-Oct3/4, pMXs-Sox2, pMXs-Klf4, pMXs-cMyc: Cell, 126, 663-676 (2006)) 를, 하루 전날 6-웰 배양 플레이트 (Falcon) 에 웰 당 0.6 x 10⁶ 개의 세포가 되도록 넣은 Plat-E 세포 (Morita, S. 등, Gene Ther . 7, 1063-1066) 에 도입함으로써 제조했다. 사용한 배양액은 DMEM/10% FCS (10% 소태아 혈청을 보충한 DMEM (Nacalai tesque)) 였고, 세포를 37℃ 및 5% CO₂ 에서 배양했다. 벡터 이동을 위해, 4.5 ㎕ 의 FuGene6 트랜스펙션 시약 (Roche) 을 100 ㎕ 의 Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (Invitrogen) 에 넣고, 상기 혼합물을 실온에서 5 분간 정치시켰다. 이후, 1.5 ㎍ 의 각 발현 벡터를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15 분 더 정치시킨 후, Plat-E 배양액에 첨가했다. 제 2 일째에, Plat-E 상청액을 신선한 배지 공급물로 교체하고; 제 3 일째에, 배양 상청액을 회수하여 0.45 ㎛ 멸균 필터 (Whatman) 를 통해 여과하고, 폴리브렌 (Nacalai) 을 첨가하여 4 ㎍/mL 의 농도를 수득하고, 이를 바이러스 액체로 이용했다.

섬유아세포 (MEF) 는 마우스 Nanog 리포터를 가진 태아 p53 호모 결핍 마우스 (수정 후 13.5 일째) 로부터 단리했다. Nanog 유전자 발현의 부재때문에, MEF 는 EGFP 를 발현하지 않으며, 녹색 형광을 발광하지 않는다. 마찬가지로, 푸로마이신 내성 유전자의 발현 부재때문에, MEF 에는 항생제인 푸로마이신이 듣는다. 마찬가지로, 0.1% 젤라틴 (Sigma) 으로 코팅된 6-웰 배양 플레이트(Falcon) 에 웰 당 1 x 10⁵ 개의 세포로 첨가했다. 사용된 배양액은 DMEM/10% FCS 였으며, 세포는 37℃ 및 5% CO₂ 에서 배양했다. 이튿날, 레트로바이러스 액체를 첨가하여 밤새 감염시켜 유전자를 도입했다.

바이러스 감염 후 3 일째에 시작하여, LIF-보충 ES 세포 배양 배지 (DMEM (Nacarai tesque) 에 15% 소태아 혈청, 2 mM L-글루타민 (Invitrogen), 100 μM 불필수 아미노산 (Invitrogen), 100 μM 2-메르캅토에탄올 (Invitrogen), 50 U/mL 페니실린 (Invitrogen) 및 50 ㎍/mL 스트렙토마이신 (Invitrogen) 을 첨가하여 제조) 를 이용하여 세포를 배양했다. 감염 5 일째에, MEF 에 대한 배지를 제거하고, 1 mL 의 PBS 를 첨가하여 세포를 세척했다. PBS 를 제거한 후, 0.25% 트립신/1 mM EDTA (Invitrogen) 을 첨가하고, 반응을 37℃ 에서 약 5 분 동안 진행했다. 세포가 떠오른 후, 세포를 ES 세포 배양 배지의 첨가로 현탁시키고, 5 x 10³ 개의 세포를, 미리 피더 세포를 첨가한 100-mm 디쉬에 첨가했다. 피더 세포는 미토마이신 C 로 처리해 세포 분열을 중단시킨 SNL 세포였다 (McMahon, A.P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)). 후속하여, 콜로니가 관찰될 때까지, ES 세포 배양 배지를 이틀마다 신선한 공급물로 교체했다. 푸로마이신 (1.5 ㎍/mL) 을 이용한 선별을, 네가지 인자 (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) 로 감염시킨 세포에 대해서는 13 일째에, 세가지 인자 (Oct3/4, Sox2, Klf4) 로 감염시킨 세포에 대해서는 19 일째에 수행했다. 콜로니는, 네가지 인자에 대해서는 약 10 일째에, 세가지 인자에 대해서는 약 20 일째에 보였으며, 점차 GFP-양성이 되었다.

GFP-양성 콜로니는 네가지 인자에 대해서는 21 일째에, 세가지 인자에 대해서는 28 일째에 계수했다. 3 회 실험의 전체 결과를 도 1 에 제시한다. p53 호모 결핍 세포와의 비교에서, 대조군을 이루는 p53 헤테로 결핍 세포에서는, GFP-양성 콜로니가 네가지 인자에 대해서는 약 2 배, 세가지 인자에 대해서는 약 9 배 증가했다.

이후, GFP-양성 콜로니를, 네가지 인자에 대해서는 21 일째에, 세가지 인자에 대해서는 28 일째에 수집하고, 트립신 처리 후, 피더 세포 상에서의 배양을 계속했다 (이러한 시간 포인트는 계대 배양 세대 하나로 취급됨). 1 x 10⁶ 개의 세포를 면역결핍 마우스에 피하주사하는 경우, 2 주 후 기형종 형성이 관찰되기 시작하며; 세가지 인자 또는 네가지 인자를 도입하는지 여부와 상관없이, 결과로 수득되는 GFP-양성 콜로니를 iPS 세포로서 식별했다. 네가지 인자에 대한 결과를 도 2 에 제시한다.

상기 결과로부터, p53 의 결실 (넉-아웃) 로 인해 세포 확립 효율이 증가된다는 것이 증명되었다.

[실시예 2: 우성 음성 돌연변이를 이용한 연구]

내재성 p53 의 기능은 p53 의 우성 음성 돌연변이를 이용하여 저해되며, iPS 세포 확립 효율에 대한 그의 영향을 연구했다. 사용한 우성 음성 돌연변이는, p53 의 게놈 결합 영역에 위치한 위치 275 의 프롤린을 세린으로 한 포인트 돌연변이를 유발하여 제조한 p53P275 였다 (Annemieke de Vries (2002). PNAS 99, 2948-2953).

핵 초기화에 이용하는 레트로바이러스는, 레트로바이러스 발현 벡터 (pMXs-Oct3/4, pMXs-Sox2, pMXs-Klf4, pMXs-cMyc, pMXs-p53P275S) 를, 전날에 6-웰 배양 플레이트 (Falcon) 에 웰 당 0.6 x 10⁶ 개의 세포를 첨가한 Plat-E 세포에 도입하여 제조했다 (pMXs-p53P275S 의 제조 방법에 대해서는, 하기의 실시예 6 참조). 사용한 배양액은 DMEM/10% FCS (10% 소태아 혈청을 보충한 DMEM (Nacalai tesque)) 였고, 37℃ 및 5% CO₂ 에서 배양했다. 벡터 이동을 위해, 4.5 ㎕ 의 FuGene6 트랜스펙션 시약 (Roche) 을 100 ㎕ 의 Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (Invitrogen) 에 넣고, 상기 혼합물을 실온에서 5 분 동안 정치시켰다. 이후, 1.5 ㎍ 의 각 발현 벡터를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15 분 더 정치시킨 후, Plat-E 배양액에 첨가했다. 제 2 일째에, Plat-E 상청액을 신선한 배지 공급물로 교체하고; 제 3 일째에 배양물 상청액을 회수하고 0.45 ㎛ 멸균 필터 (Whatman) 를 통해 여과하고, 폴리브렌 (Nacalai) 을 첨가하여 4 ㎍/mL 의 농도를 수득하고, 이것을 바이러스 액체로서 이용했다.

섬유아세포 (MEF) 를 Nanog 리포터를 가진 태아 p53 헤테로 결핍 마우스 (수정 후 13.5 일째) 로부터 단리했다. 피더 세포를 미리 넣어둔 6-웰 배양 플레이트를 준비하여, MEF 를, 네가지 인자에 대해서는 웰 당 4 x 10³ 개의 세포를, 세가지 인자에 대해서는 웰 당 2 x 10⁴ 개의 세포를 넣었다. 사용한 피더 세포는 미토마이신 C 를 처리하여 세포 분열을 종결시킨 SNL 세포였다. 사용한 배양액은 DMEM/10% FCS 였으며, 37℃ 및 5% CO₂ 에서 배양했다. 이튿날, Plat-E 로부터 회수한 바이러스 액체에서 세포를 밤새 배양하여 유전자를 도입했다. 감염 후 3 일째에 시작하여, 세포를 LIF-보충 ES 세포 배양 배지를 이용하여 배양했다. 후속하여, 콜로니가 나타날 때까지 ES 세포 배양 배지를 신선한 공급물로 이틀마다 교체했다. 푸로마이신 (1.5 ㎍/mL) 을 이용한 선별은, 네가지 인자 (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) 및 P275S 의 두가지 모두로 감염시킨 세포에 대해서는 감염 13 일 째에, 세가지 인자 (Oct3/4, Sox2, Klf4) 및 P275S 의 두가지 모두로 감염시킨 세포에 대해서는 감염 19 일째에 시작했다. 콜로니는, 네가지 인자에 대해서는 약 10 일째에, 세가지 인자에 대해서는 약 20 일째에 보였고, 점차 GFP-양성이 되었다.

GFP-양성 콜로니를, 네가지 인자에 대해서는 21 일째에, 세가지 인자에 대해서는 28 일째에 계수했다. 실험 과정의 개요는 도 3(A) 에 제시하며, 실험 결과는 도 3(B) 내지 (D) 에 제시한다. p53P275S 대신에 돌연변이가 없는 p53 또는 적색 형광 단백질 (DsRedExpress) 을 혼입한 세포와 비교하면, P275S 를 혼입한 세포에서는, GFP-양성 콜로니의 갯수가 네가지 인자에 대해서는 약 4 배, 세가지 인자에 대해서는 약 3 배 증가했다.

상기 기재한 세가지 인자 또는 네가지 인자 및 p53 또는 DsRedExpress 의 두가지 모두를 태아 p53 호모-결핍 마우스로부터 단리한 MEF 로 도입한 결과를 도 3(E) 내지 (G) 에 제시한다. 대조군 DsRedExpress 을 혼입한 세포와 비교하면, p53 를 혼입한 세포에서는 GFP-양성 콜로니 갯수가 감소했다.

상기 결과로부터, 내재성 p53 기능의 저해로, 세포 확립 효율이 증가한다는 것이 증명되었다.

[실시예 3: p53 저해제를 이용한 연구]

세포 확립 효율에 대한 p53 저해제의 영향을 검사했다. 핵 초기화에 이용하는 레트로바이러스는, 레트로바이러스 발현 벡터 (pMXs-Oct3/4, pMXs-Sox2, pMXs-Klf4, pMXs-cMyc) 를, 전날 웰 당 0.6 x 10⁶ 개의 세포를 넣은 6-웰 배양 플레이트 (Falcon) 에 넣은 Plat-E 세포에 도입하여 제조했다. 사용한 배양액은 DMEM/10% FCS (10% 소태아 혈청으로 보충한 DMEM (Nacalai tesque)) 였고, 37℃ 및 5% CO₂ 에서 배양했다. 벡터 이동을 위해, 4.5 ㎕ 의 FuGene6 트랜스펙션 시약 (Roche) 을 100 ㎕ 의 Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (Invitrogen) 에 넣고, 항기 혼합물을 실온에서 5 분 동안 정치시켰다. 이후, 1.5 ㎍ 의 각 발현 벡터를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15 분 동안 더 정치시킨 후, Plat-E 배양액에 넣었다. 제 2 일째에, Plat-E 상청액을 신선한 배지 공급물로 교체하고; 제 3 일째에, 배양 상청액을 회수하고, 0.45 ㎛ 멸균 필터 (Whatman) 를 통해 여과하고, 폴리브렌 (Nacalai) 을 첨가하여 4 ㎍/mL 의 농도를 수득하고, 이를 바이러스액으로 사용했다.

섬유아세포 (MEF) 를, Nanog 리포터를 가진 태아 p53 헤테로 결핍 마우스 (수정 후 13.5 일째) 로부터 단리했다. 상기 MEF 를, 0.1% 젤라틴 (Sigma) 으로 코팅한 6-웰 배양 플레이트(Falcon) 에 웰 당 1 x 10⁵ 개의 세포가 되도록 넣었다. 사용한 배양액은 DMEM/10% FCS 였으며, 세포는 37℃ 및 5% CO₂ 에서 배양했다. 이튿날, 세포를 Plat-E 로부터 회수한 바이러스액으로 밤새 감염시켜 유전자를 도입했다. 감염 후 제 3 일째에 시작하여, 세포는 LIF-보충 ES 세포 배양 배지를 이용하여 배양했다. 감염 후 제 5 일째에, MEF 에 대한 배지를 제거하고, 세포를 1 mL 의 PBS 를 첨가하여 세척했다. PBS 를 제거한 후, 0.25% 트립신/1 mM EDTA (Invitrogen) 을 첨가하고, 반응을 37℃ 에서 약 5 분 동안 진행시켰다. 세포가 떠오른 후, 세포를 ES 세포 배양 배지의 첨가로 현탁시키고, 8 x 10² 개의 세포를, 미리 피더 세포를 넣어둔 6-웰 배양 플레이트에 넣었다. 제 6 일째에 시작하여, 피피트린α, p-니트로, 싸이클릭 (MERCK), 6 nM 을 배지에 첨가하고, 배양을 계속했다. 피피트린은 DMSO 중의 용액으로 사용했다. 감염 후 16 일째에 시작하여, 푸로마이신 (1.5 ㎍/mL) 을 이용한 선별을 수행했다. 콜로니는 10 일째에 나타났고, 점차 GFP-양성이 되었다. GFP-양성 콜로니를 제 20 일째에 계수했다. 결과를 도 4 에 제시한다. DMSO 로 처리한 세포와 비교해서, 피피트린으로 처리한 세포에서 GFP-양성 콜로니의 갯수가 약 4 배 증가했다. 상기 결과로부터, p53 기능의 저해로 세포 확립 효율이 증가한다는 것이 증명되었다.

[실시예 4: T 세포 유래의 iPS 확립에서의 p53 결핍의 영향]

Nanog 리포터 마우스 (이후, Nanog-GFP Tg 마우스: 17-주령 수컷) 및 Nanog 리포터를 가진 p53 호모 결핍 마우스 (이후, Nanog-GFP/Trp53^-/- 마우스: 24 주령 암컷) 를 안락사시킨 후, 비장을 적출했다. 조직을 기계적으로 분쇄한 후, CD90 마이크로비드 (Miltenyi biotec) 및 MACS 시스템을 이용하여 CD90-양성 세포를 수득했다. 1 x 10⁶ 개의 세포를 T 세포 배양 배지 (DMEM, 10% FBS, 10 ㎕/1x10⁶ 개의 세포 CD3/CD28 T 세포 증량제 (Invitrogen), 10 유닛/ml IL-2) 에 현탁시키고, 레트로넥틴 (50 mg/ml, Takara) 으로 코팅한 24-웰 플레이트에 넣었다 (1x10⁶ 개의 세포/웰).

이튿날, 배지를 네가지 인자 (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) 를 보유한 레트로바이러스를 함유하는 1 ml 의 배지 (실시예 1 과 동일한 방식으로 제조, 8 ㎍/ml 폴리브렌 및 10 유닛/ml IL-2 으로 보충한 바이러스 함유 상청액) 로 교체하고, 원심분리를 3000 rpm 에서 30 분 동안 수행하고 (스핀 감염법 (spin infection method)), 세포를 37℃ 에서 밤새 배양했다. 이튿날, 배지를 T 세포 배양 배지로 교체한 후, 배지 교환은 이틀마다 수행했다.

T 세포 확립 후 12 일째에, 세포를 미토마이신-처리 SNL-PH 세포 (5 x 10⁴ 개의 세포/100-mm 디쉬) 에 다시 넣었다. 이튿날 시작하여, 세포를 1.5 ㎍/ml 푸로마이신을 첨가한 ES 배지로 배양했다.

T 세포 확립 후 17 일째에, 11 개의 GFP-양성 콜로니를 관찰했는데, 이를 집어내어 24-웰 SNL-PH 플레이트에 넣었다. 그 결과, 3 개의 ES-형 세포 클론을 수득했다 (408E2, E7, E8). 상기 클론들은 마우스 ES 세포형 형태를 나타냈으며, Nanog-GFP 에 대해 양성이었다 (도 5). ES 세포 특이적 유전자 (Oct3/4, Sox2, Nanog, Cripto, Dax1, ERas, Fgf4, Esg1, Rex1) 의 발현은 RT-PCR 로 확인했다 (도 6). 혼입된 외인성 유전자의 침묵화는 불완전했다 (도 6). 상기 클론들 중 그 어느것도 T 세포 마커 (FasL, GzmA, GzmB, Ifng) 를 나타내지 않았다 (Rever Tra Ace 키트로, Takara 에서 제조한 것 이용). 항-SSEA1 항체 (Santacruz) 를 이용한 염색으로 그의 발현을 확인하고, 클론들은 또한 알칼리성 포르파타아제 활성에 대해 양성이었다 (도 7). 더욱이, 배아체 형성에 의한 시험관내 분화 유도 결과로서, AFP (R&D systems), GATA4 (Santacruz), α-SMA (DAKO), Desmin (Neomarker), βIII-튜뷸린 (Chemicon) 및 GFAP (DAKO) 항체들을 이용한 염색은 그의 발현을 확인시켰으며; 클론들이 세가지 배엽으로 분화하는 것에 대한 잠재성을 보유한다는 것을 발견했다 (도 8). 상기 클론들이 또한 키메라성 마우스 발생에 기여한다는 것이 또한 확인되었다 (데이터는 나타내지 않음). 따라서, 결과로 수득한 GFP-양성 콜로니를 iPS 세포로 동정했다.

Nanog-GFP Tg 마우스-유도성 T 세포를 이용한 점만 다르고 동일한 시험을 수행했을 때, GFP-양성 콜로니가 전혀 생성되지 않았다. 상기 실험 결과들로부터, p53 의 결실 (불활성화) 로 iPS 세포 확립이 촉진되며, p53 의 불활성화에 의해, iPS 세포는 최종적으로 분화된 T 세포로부터 확립될 수 있다는 것이 증명되었다.

상기 기재된 바와 같이 T 세포로부터 확립된 세포를 ICR-마우스-유도성 배반포에 마이크로인젝션하여, 성체 키메라성 마우스를 제작했다 (도 10). 그러나, 모든 키메라성 마우스는 7 주 이내에 발암을 겪었다.

이후, 상기 확립된 세포, 각종 키메라 조직 및 키메라의 종양을, T 세포 수용체 유전자 (Tcrβ 유전자의 V-(D)-J DNA) 의 재배열에 대해 PCR 로 검사했다. 구체적으로, 상기 검사는, Curr Biol 11(19), 1553 (2001) 에 기재된 방법에 따라 수행했다. 간략하게, Tcrβ 유전자의 Dβ2-Jβ2 재배열화를 검출하려는 시도는, 프라이머 셋트 Dβ2 (GTAGGCACCTGTGGGGAAGAAACT; 서열 식별 번호: 29) 및 Jβ2 (TGAGAGCTGTCTCCTACTATCGATT; 서열 식별 번호: 30) 을 이용하여 게놈 DNA 상에서 PCR 증폭을 수행하고, 수득한 PCR 생성물을 1.2% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 시도했다. 그 결과, 재배열된 T 세포 수용체의 밴드가 검출되었고; iPS 세포는 T 세포로부터 유도된 것으로 확인되었다. 키메라성 종양 중의 재배열된 밴드는 iPS 세포의 것만큼 진했으며, 이는 종양이 세포로부터 유도되었을 것이란 것을 시사했다 (도 11).

[실시예 5: 마이크로어레이 분석]

p53 호모 결핍 마우스로부터 단리된 MEF 및 일반적인, 비-p53 호모 결핍 마우스로부터 단리된 MEF 사이에 발현 패턴 사이가 있는지 여부를 알기 위해, DNA 마이크로어레이 분석을 수행했다. 분석은 각각의 마우스로부터 단리된 MEF 로부터 유도된 전체 RNA 를 이용하여, Cell, 131, 861-872(2007) 에 기재된 있는 기술로 수행했다. 결과를 도 9 에 제시한다. ES 세포에서 특이적으로 발현되는 유전자 (섬유아세포에서보다 ES 세포에서 10 배 이상 더 높은 수준으로 발현되는 유전자) 를 검출하기 위해 시도했다; p53-결핍 마우스로부터 유도된 MEF 에서는, 야생형 MEF 에 비해, ES 세포에서 특이적으로 발현하는 상기 유전자들이 훨씬 더 많이 발현되었다 (도 9(B)). 역으로, 섬유아세포에서 특이적으로 발현하는 유전자 (ES 세포에서보다 섬유아세포에서 10 배 이상 더 높은 수준으로 발현되는 유전자) 를 검출하기 위해 시도했다; p53-결핍 마우스로부터 유도된 MEF 에서는, 야생형 MEF 에 비해, 섬유아세포에서 특이적으로 발현하는 상기 유전자의 발현이 매우 낮았다 (도 9(C)). 상기 결과로부터, p53 을 결실시켜, ES 세포에 근접한 상태가 만들어졌음을 보였다.

[실시예 6: p53 결핍의 효과 및 우성 음성 돌연변이의 도입]

세포의 민감하고 특이적인 동정을 위해 Nanog-GFP 또는 Oct3/4-GFP 리포터 시스템 (Okita K. 등 Nature 448, 313 (2007)) 을 이용했다. 야생형, p53^+/-, 또는 p53^-/- MEF 는, 또한 Nanog-GFP 리포터를 포함하는데, 이것을 6 웰 플레이트의 각 웰에 1x 10⁵ 개의 세포씩 시딩했다. 세포를 이튿날 (제 0 일) Plat-E 로부터 제조한 레트로바이러스로 감염시켰다. 5 일째에, 세포 분류기 (FACS Aria, Beckton Dekinson) 로 96-플레이트의 웰마다 1 개의 세포를, 또는 100 mm 디쉬마다 5000 개의 세포를 다시 시딩했다. 푸로마이신 선별 (1.5 ㎍/ml) 을, 네가지 인자 프로토콜에서는 13 일째에, 세가지 인자 프로토콜에서는 19 일째에 시작했다. GFP 양성 콜로니의 갯수를, 네가지 인자 프로토콜에 대해서는 21 일째에, 세가지 인자 프로토콜에 대해서는 28 일째에 측정했다. 결과는 도 12 에 제시한다.

Myc 이 배제된 세가지 인자를 Nanog-GFP, p53-야생형 MEF 에 도입하는 경우, 5000 개의 형질도입한 섬유아세포에서 1 내지 18 개의 GFP-양성 콜로니를 수득했다 (도 12a). Nanog-GFP, p53-이형접합성 돌연변이 MEF 로부터, 7 내지 81 개의 GFP-양성 콜로니를 관찰했다. 대조적으로, Nanog-GFP, p53-무효 섬유아세포로부터는, 38 내지 478 개의 GFP-양성 콜로니가 나타났다.

이어서, 단일 섬유아세포로부터 세포를 생성해내는 시도를 했다. 유세포분석기를 이용하여, 한가지 Nanog-GFP 세포 (p53 야생형, 이형접합성 돌연변이 또는 동형접합성 돌연변이) 를 플레이팅했는데, 이는 96-웰 플레이트의 웰에 다시 플레이팅하기 5 일 전에 세가지 인자로 형질유도했다. 다시 플레이팅한 후 23 일째에, p53 야생형 섬유아세포가 있는 96-웰 플레이트마다 0 또는 1 개의 웰에서 GFP-양성 콜로니를 봤다 (도 12b). 대조적으로, p53-이형접합성 섬유아세포 및 p53-무효 섬유아세포가 있는 96-웰 플레이트에서 각각, 약 2 개 및 약 10 개의 웰에서 GFP-양성 콜로니를 봤다. 이러한 데이터는, p53 기능의 소실이 직접적인 핵 초기화의 효율을 현격하게 증가시키며, 10% 이하의 형질유도된 세포가 Myc 이 배제된 세가지 인자가 있는 iPS 세포가 될 수 있다는 점을 보여줬다.

c-Myc 를 포함하는 네가지 인자를 이용하여 동일한 실험을 수행했다. p53 야생형 섬유아세포가 있는 96-웰 플레이트마다 0 또는 1 개의 웰에서 GFP-양성 콜로니를 봤다 (도 12c). 대조적으로, p53-이형접합성 섬유아세포 및 p53-무효 섬유아세포가 있는 96-웰 플레이트에서 각각, 약 9 개 및 약 25 개의 웰에서 GFP-양성 콜로니를 봤다. 이러한 데이터는, Myc 레트로바이러스의 첨가가 직접적인 핵 초기화의 효율을 20% 까지 더 증가시킨다는 것을 보여줬다.

세포 생성에서의 p53 의 억제적인 역할을 확인하기 위해, 두가지 설정의 실험을 수행했다. 먼저, 세포 생성에 대한 p53 의 우성 음성 돌연변이의 영향을 시험했다. 마우스 p53 유전자의 상보적 DNA 를, p53-1S (CAC CAG GAT GAC TGC CAT GGA GGA GTC; 서열 식별 번호: 31) 및 p53-1223AS (gtg tct cag ccc tga agt cat aa; 서열 식별 번호: 32) 을 이용한 RT-PCR 로 증폭하고, pENTER-D-TOPO (Invitrogen) 에 서브클로닝했다. 서열 확인 후, Gateway cloning technology (Invitrogen) 에 의해 cDNA 를 pMXs-gw 로 이동시켰다. p53 돌연변이에 대한 레트로바이러스 벡터는 2 단계 PCR 로 제조했다. P275S 돌연변이 (Annemieke de Vries (2002), 상기 문헌) 에 대해서는, 첫번째 PCR 은 두가지 프라이머 셋트, p53-P275S-S (tgt ttg tgc ctg ctc tgg gag aga ccg c; 서열 식별 번호: 33) 및 p53-1223AS, 및 p53-P275S-AS (gcg gtc tct ccc aga gca ggc aca aac a; 서열 식별 번호: 34) 및 p53-1S 를 이용하여 수행했다. D278N 돌연변이 (Shinmura K. 등 Oncogene 26(20), 2939 (2007)) 에 대해서는, 첫번째 PCR 은 두가지 프라이머 셋트, p53-D278N-S (tgc cct ggg aga aac cgc cgt aca gaa; 서열 식별 번호: 35) 및 p53-1223AS, 및 p53-D278N-AS (ttc tgt acg gcg gtt tct ccc agg gca; 서열 식별 번호: 36) 및 p53-1S 을 이용하여 수행했다. S58A 돌연변이 (Cecchinelli B. 등 Cell Death Differ 13(11), 1994 (2006)) 에 대해서는, 첫번째 PCR 은 두가지 프라이머 셋트, p53-S58A-S (ttt gaa ggc cca GCt gaa gcc ctc cga; 서열 식별 번호: 37) 및 p53-1223AS, 및 p53-S58A-AS (tcg gag ggc ttc aGC tgg gcc ttc aaa; 서열 식별 번호: 38) 및 p53-1S 를 이용하여 수행했다. 각각의 첫번째 PCR 의 두가지 PCR 생성물을 혼합하고, 프라이머 셋트, p53-1S 및 p53-1223AS 을 이용한 이차적인 PCR 에 대한 템플레이트로 이용했다. 상기 돌연변이는 pENTR-D-TOPO 에 클로닝하고, 이후 Gateway cloning technology 에 의해 pMXs-gw 로 옮겼다. 수득한 p53 돌연변이를 발현하는 레트로바이러스를 세가지 인자를 이용하여 Oct4-GFP, p53^+/- 또는 p53^-/- MEF 로 함께 형질도입했다. 결과는 도 13 에 제시한다.

우성 음성 돌연변이 P275S 를 p53-이형접합성 MEF 인 Oct4-GFP 에 도입하는 경우, GFP-양성 콜로니 (도 13a) 갯수의 실질적인 증가를 봤다. 대조적으로, 야생형 p53 는 세포 생성 효율을 감소시켰다.

두번째로, 야생형 p53 또는 전이활성-음성 돌연변이 (D278N 또는 S58A) 를 코딩하는 cDNA 를 pMX 레트로바이러스 벡터 (Morita S. 등 Gene Ther 7(12), 1063 (2000)) 에 위치시키고, 그것을 세가지 핵 초기화 인자에 대해 레트로바이러스를 이용하여 p53-무효 MEF 인 Nanog-GFP 에 도입했다. 야생형 p53 이 GFP-양성 콜로니의 갯수를 현격히 감소시키는 것을 관찰했다 (도 13b). 전이활성-음성 p53 돌연변이는, 대조적으로, 야생형 단백질보다 더 약한 효과를 보였다. 이러한 데이터는, p53 의 소실이 직접적인 핵 초기화의 효율에서 관찰되는 증가에 원인제공을 한다는 것을 확인시켜줬다.

이어서, 세가지 인자에 의해 생성된, GFP-양성인 p53-무효 세포의 클론 10 개를 무작위로 증량시켰다. 모든 클론들이 마우스 ES 세포의 것과 유사한 형태를 보였다 (도 14, 좌측). 세가지 인자에 의해 생성된 iPS 세포는 ES 세포의 것과 필적하는 수준으로 ES 세포 마커 유전자를 발현했다 (도 15, 좌측). 세가지 트랜스유전자의 발현은 유효하게 침묵화되었다. 누드 마우스로의 이식시, 이들은 각종 조직을 포함하는 기형종을 일으켰다 (도 16a). 이들 데이터는 p53-무효 MEF 유래의 세가지 인자에 의해 생성되는 iPS 세포의 다능성을 확인시켜줬다.

c-Myc 을 포함하는 네가지 인자에 의해 생성되는 iPS 세포가 또한 ES 세포의 것과 구분되지 않는 형태를 보여준다는 것을 발견했다 (도 14, 우측). 그러나, ES-세포 마커의 발현은 ES 세포에서보다 상기 세포에서 더 적었다 (도 15, 우측). 추가로, 네가지 인자의 트랜스유전자 발현은 이들 세포에서 활성인 채로 남아 있었다. 이러한 관찰사실과 일치하게, 누드 마우스에서 이들 세포로부터 유도된 종양들은 대부분 미분화된 세포로 이루어져 있고, 오직 적은 영역에서만 분화된 조직이 있었다 (도 16b). 따라서, p53-무효 배경에서는 c-Myc 은 레트로바이러스의 침묵화를 억제하며 분화를 저해한다.

[실시예 7: 인간 세포의 확립에 대한 p53 억제의 영향]

(A) p53 이 인간 iPS 세포 생성의 효율을 증가시키는지 여부를 시험했다. 이러한 목적을 위해, p53 의 우성 음성 돌연변이 (p275S 또는 DD (Bowman T. 등 Genes Dev 10(7), 826 (1996))) 를 성인 인간 피부 섬유아세포 (HDF) 에, 세가지 또는 네가지 핵 초기화 인자와 함께 도입했다. P275S 돌연변이에 대한 레트로바이러스 벡터는 실시예 6 에 기재된 바와 같이 만들었다. DD 돌연변이에 대한 레트로바이러스 벡터는 2 단계 PCR 로 만들었다. 첫번째 PCR 은 두가지 프라이머 셋트, p53-DD-S (cgg ata tca gcc tca aga gag cgc tgc c; 서열 식별 번호: 39) 및 p53-1223AS, 및 p53-DD-AS (ggc agc gct ctc ttg agg ctg ata tcc g; 서열 식별 번호: 40) 및 p53-1S 를 이용하여 수행했다. 우성 음성 돌연변이, 및 네가지 또는 세가지 핵 초기화 인자에 대한 레트로바이러스를 PLAT-E 세포에서 제조했다. iPS 세포 생성을 위해, 각각의 레트로바이러스를 포함하는 동량의 PLAT-E 상청액을 혼합하고 HDF 에 형질도입했다.

iPS 세포 콜로니의 갯수가 두가지 독립적인 p53 우성 음성 돌연변이와 함께 현저히 증가한다는 것을 발견했다 (도 17a, b). SCID 마우스의 고환으로 이식하는 경우, 세가지 인자로 생성된 인간 iPS 세포 및 p53DD 돌연변이에서는 세가지 배엽층의 각종 조직을 포함하는 기형종이 발생했다 (도 17c).

(B) 또다른 실험에서, 인간 p53 (shRNA2; Stewart S.A. 등 RNA 9(4), 493 (2003)) 에 대한 shRNA 의 영향을 검사했다. shRNA 발현에 대한 레트로바이러스 벡터인, pMKO.1-puro (Addgene #8452), pMKO.1-puro p53 shRNA1 (Addgene #10671) 및 pMKO.1-puro p53 shRNA2 (Addgene #10672; shRNA 서열은 서열 식별 번호: 28 에 제시함) 을 Addgene 로부터 입수했다. shRNA, 및 네가지 또는 세가지 핵 초기화 인자에 대한 레트로바이러스를 PLAT-E 세포에서 제조했다. iPS 세포 생성을 위해, 각각의 레트로바이러스를 포함하는 동량의 PLAT-E 상청액을 혼합하고 HDF 에 형질도입했다.

p53 shRNA2 이 HDF 에서 p53 단백질 수준을 유효하게 억제하는지 여부를 확인했다 (도 18). 네가지 인자와 함께 도입하는 경우, p53 shRNA 는 인간 iPS 세포 콜로니의 갯수를 현격하게 감소시켰다 (도 19). 안티센스 서열에 1 개 뉴클레오티드 결실을 포함하는 대조군 shRNA (shRNA1) 는 그러한 효과를 나타내지 않았다(도 18 및 도 19). 마우스 p53 의 공동도입이 shRNA2 의 효과를 억제했다. 유사한 결과가 세가지 핵 초기화 인자와의 공동도입시 수득되었다 (도 20). 상기 데이터는 p53 이 마우스에서 뿐만 아니라 인간에서도 직접적인 핵 초기화를 억제한다는 것을 증명했다.

[실시예 8: MDM2 에 의한 p53 의 기능 저해]

p53 에 결합하여 저해하는 MDM2 의 영향을 검사했다. 구체적으로, 인간 MDM2 유전자 (서열 식별 번호: 41) 를 네가지 또는 세가지 핵 초기화 인자와 함께 레트로바이러스 벡터를 이용하여 HDF 에 도입하고, iPS 콜로니를 실시예 7 과 동일한 방법으로 형성했다 (n = 4).

그 결과, MDM2 유전자의 공동도입은 세포 확립 효율을 개선시켰다 (도 21). MDM2 는 또한 또다른 종양 억제인자, 레티노블라스토마 (Retinoblastoma) (Rb) 와 상호작용하고 저해하지만, shRNA 에 의한 Rb 의 억제는 세포 생성 효율을 증가시키지 않았다. 상기 데이터는 MDM2 의 영향이 p53 기능의 억제에 기인하는 것임을 시사한다.

[실시예 9: 시험관내 분화 유도 및 면역염색]

이후, 본 발명의 발명자들은 실시예 7(B) 에서 세가지 핵 초기화 인자 및 p53 shRNA 로 생성된 세포가 다능성인지 여부를 시험관내 분화에 의해 확인했다. 배아체 형성을 위해, 세포를 수합하고 폴리-히드록시에틸 메타크릴레이트 (HEMA)-코팅된 디쉬에 옮기고, 8 일 동안 인큐베이션했다. 배양물 부유 후, 형성된 배아체들을 젤라틴-코팅된 플레이트 상에 플레이팅하고, 또다시 6 일 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 5% 정상 염소 혈청, 1% BSA 및 0.2% TritonX-100 을 함유하는 PBS 로 블로킹했다. 분화 마커 (AFP, α-SMA, βIII-튜뷸린) 의 발현은 면역세포화학으로 검사했다. 1 차 항체로서, 항-α-페토프로틴 (AFP) (1:100, R&D systems), 항-α-평활근 액틴 (α-SMA) (1:500, DAKO) 및 항-βIII-튜뷸린 (1:100, Chemicon) 을 사용했다. Cy3-표지된 항-마우스 IgG (1:500, Chemicon) 를 2 차 항체로서 사용했다. 핵을 Hoechst 33342 (Invitrogen) 로 염색했다. 결과는 도 22 에 제시한다. 세포는 내배엽 (AFP), 중배엽 (α-SMA) 및 외배엽 (βIII-튜뷸린) 과 같은 세가지 배엽층으로 분화했다. iPS 클론들 사이에서, 분화 잠재성에 있어서, 현저한 차이점은 발견되지 않았다.

[실시예 10: 미분화 마커 및 분화 마커의 RT-PCR 분석]

실시예 7(B) 에서 수득한 인간 세포 및 실시예 9 에서 수득한 분화된 세포에서의 줄기 세포 마커 (Oct3/4, Sox2, Nanog) 및 분화 마커 (FoxA2 및 Sox17 (내배엽), Msx1 (중배엽), Map2 및 Pax6 (외배엽)) 의 발현은 Rever Tra Ace Kit (Takara) 를 이용한 RT-PCR 로 분석했다. 마커 분화에 이용한 프라이머 쌍들은 표 1 에 제시한다.

그 결과, 세가지 핵 초기화 인자 및 p53 shRNA 를 이용하여 생성된 세포는 Nanog, 내재성 Oct3/4, 및 내재성 Sox2 를 ES 세포에서의 것과 필적하는 수준으로 발현했다 (도 23, 레인 U). 배아체-중재 분화 후, 상기 세포들은 세가지 배엽층의 마커 유전자를 발현했다 (도 23, 레인 D). 상기 데이터는 p53 이 마우스에서 뿐만 아니라 인간에서도 직접적인 핵 초기화를 저해한다는 것을 증명한다.

[실시예 11: p53 억제에 의한 iPS 세포 확립 효율 개선에 있어서의 p21 의 역할]

관찰된 iPS 세포 생성 증강에 원인을 제공하는 p53 표적 유전자를 더 설명하기 위해, p53 야생형 MEF 및 p53-무효 MEF 사이에서, 및 대조군 HDF 및 p53 넉다운 HDF 사이에서 유전자 발현을 DNA 마이크로어레이로 비교했다. MEF 에서는 1590 개의 유전자는 증가했고, 1485 개의 유전자는 p53-무효 MEF 에서보다 5 배가 넘게 감소했다. HDF 에서는, 290 개의 유전자가 증가했고, 430 개의 유전자는 p53 shRNA 에서보다 5 배가 넘게 감소했다. 마우스 및 인간 사이에서는, v-myb 골수아세포증 바이러스성 발암유전자 동종체 (MYB) 및 RAS 발암유전자 패밀리, RAB39B 를 포함하는 여덟가지의 증가된 유전자가 공통적이다 (표 2). 두 종 사이에서는 p53, 싸이클린 의존성 키나아제 저해제 1A (p21, Cip1), BTG 패밀리, 멤버 2 (BTG2), 징크 핑거, 마트린 타입 3 (ZMAT3) 및 MDM2 을 포함하는 27 가지의 감소된 유전자가 공통적이다.

이들 중에서, 네가지의 증가된 유전자 및 일곱가지의 감소된 유전자를 레트로바이러스를 이용해, 네가지 핵 초기화 인자와 함께 또는 네가지 인자 및 p53 shRNA 와 함께 HDF 로 형질유도했다. 상기 표적 유전자들 중 일부는 관찰된 iPS 세포 생성 증강에 원인을 제공한다면, 야생형 섬유아세포에서 증가된 유전자의 세포 생성 강화는 p53 억제의 효과를 모방할 것이고, 감소된 유전자 및 p53 shRNA 의 공동발현은 p53 억제의 효과와 대응할 것이라고 추리했다. 네가지의 증가된 유전자들 중, p53 단백질에 결합하여 분해하는 MDM2 의 강제적인 발현에 의해 p53 억제 효과를 모방하는 것은 없었다 (도 24a). 일곱가지의 감소된 유전자들 중, 오직, 마우스로부터 유도된 p53 및 p21 만이 p53 shRNA 의 영향에 유효하게 대응했다 (도 24b). 추가로, p21 의 강제적인 발현은 p53-무효 MEF 로부터의 iPS 세포 생성을 현격히 감소시켰다. 이러한 데이터는, 마우스 및 인간의 두가지 모두에서 iPS 세포 생성 동안 p53 표적으로서의 p21 의 중요성을 강조했다.

p53-p21 의 억제는 Rb 의 불활성화를 초래했다. 그러나, shRNA 에 의한 Rb 의 억제는 세포 생성 효율을 증가시키지 않았다 (도 21). 이러한 데이터는, 세포 생성에 대한 p53-p21 억제의 효과가, 적어도 부분적으로는, Rb 조절 이외의 메카니즘에 기인한다는 점을 시사한다.

p21 단백질은 Myc 에 결합하여 그의 전사 활성을 억제한다 (Kitaura, H. 등, J Biol . Chem ., 275(14), 10477-10483 (2000)). 이는 p53-p21 억제에 의한 세포 생성 효율 증가의 한 원인이 될 수 있다. p53-응답성 구성원 또는 Myc 응답성 구성원에 의해 구동되는 루시퍼라아제 리포터를 도입함으로써 HDF 에서의 Myc 활성을 평가했다 (도 24c). p53 활성이 shRNA 에 의해 감소된다는 것을 확인했다. 이들 넉다운 세포에서, Myc 활성은 현저히 증강되었다. 그 효과는 c-Myc 를 포함하는 네가지 인자의 도입으로 관찰되었던 것보다 더 강했다. 이들 데이터는, Myc 의 활성화가 p53-p21 억제에 의해 증강된 세포 생성에 기여한다는 점을 시사한다.

[실시예 12: 플라스미드 도입에 의한 iPS 세포의 확립]

마우스 Oct3/4, Klf4 및 Sox2 을 발현하는 발현 벡터 pCX-2A-Ms-OKS, 및 마우스 c-Myc 를 발현하는 발현 벡터 pCX-Ms-cMyc 를 모두 Science, 322, pp. 949-953 (2008) 에 따라 제조했다.

섬유아세포 (MEF) 는 마우스 Nanog 리포터를 가진 태아 p53 호모 결핍 마우스 (수정 후 13.5 일) 및 야생형 마우스 태아 (수정 후 13.5 일) 로부터 분리해 냈다. MEF 는 0.1% 젤라틴 (Sigma) 으로 코팅한 6-웰 배양 플레이트(Falcon) 에 웰 당 1.3 x 10⁵ 개의 세포로 넣었다. 사용한 배양액은 DMEM/10% FBS (10% 소태아 혈청을 보충한 DMEM (Nacalai tesque)) 였으며, 세포를 37℃ 및 5% CO₂ 에서 배양했다. 이튿날, FuGene6 트랜스펙션 시약 (Roche) 또는 Lipofectamin LTX (Invitrogen) 을 사용하고, 시약에 첨부된 프로토콜에 따라서, pCX-2A-Ms-OKS 및 pCX-Ms-cMyc 을 한번에 도입했다 (제 0 일). 도입한 지 7 일이 될 때까지 매일 도입을 반복했다. 도입 제 4 일째에, 배지를 LIF-보충 ES 세포 배양 배지 (15% 소태아 혈청, 2 mM L-글루타민 (Invitrogen), 100 μM 불필수 아미노산 (Invitrogen), 100 μM 2-메르캅토에탄올 (Invitrogen), 50 U/mL 페니실린 (Invitrogen) 및 50 ㎍/mL 스트렙토마이신 (Invitrogen) 을 DMEM (Nacarai Tesque) 에 첨가하여 제조함) 로 교체했다. 후속하여, 콜로니가 관찰될 때까지 LIF-보충 ES 세포 배양 배지를 이틀마다 신선한 공급물로 교체했다. 푸로마이신 (1.5 ㎍/mL) 을 이용한 선별을 도입 후 21 일째에 수행하고, 도입 후 33 일째에 GFP-양성 콜로니를 계수했다. 시간 계획표의 요약을 도 25a 에 제시하며, 수득한 GFP-양성 콜로니의 갯수를 도 25b 에 제시한다. 4 개의 유전자를 플라스미드에 의해 야생형 MEF 에 도입한 경우 (도 25b 에서 +/+), GFP-양성 콜로니가 형성되지 않았다. 4 개의 유전자를 플라스미드에 의해 p53 호모 결핍 MEF 에 도입한 경우 (도 25b 에서 -/-), 다수의 GFP-양성 콜로니가 수득되었다.

플라스미드 DNA 의 게놈으로의 통합을 시험하기 위해, 플라스미드의 각 부분을 증폭할 수 있는 16 종의 PCR 프라이머를 고안하고 (Science, 322, pp. 949-953 (2008), 도 2A 참조), 그로부터의 11 종의 프라이머를 게놈 PCR 에 사용했다. 결과는 도 25c 에 제시한다. 외인성 DNA 의 증폭은 수득한 12 개의 GFP-양성 클론들 중 6 개의 클론에서 관찰되었다 (도 25c: 상단 패널). 추가로, Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 를 프로브로서 사용한 서던 블롯 분석에 의해, 외인성 유전자의 통합은 상기 클론들에서 검출되지 않았다 (도 25c: 하단 패널). 상기 결과는 상기 세포가 pCX-2A-Ms-OKS 및 pCX-Ms-cMyc 플라스미드를 숙주 게놈으로 통합하지 않음을 밝혀낸다.

수득한 세포의 사진은 도 25d 에 제시한다 (상단 좌측: 위상차 영상, 상단 우측: GFP-양성 콜로니 영상, 하단 좌측: 위상차 영상 및 GFP-양성 콜로니 영상의 취합). 세포가 마우스 ES 세포의 것과 구분되지 않는 모양으로 형태를 갖추고, GFP-양성이므로, iPS 세포 확립이 확인되었다. 추가로, 플라스미드 통합이 없는 iPS 클론을 ICR-마우스 유도성 배반포에 주사했다. 결과는 도 25d, 하단 우측 패널에 제시한다. 털 색깔로 판단하건대, 성체 키메라는 iPS 클론으로부터 온 것일 수 있다. 결과는, 플라스미드 통합이 없는 세포가 다능성을 갖는다는 점을 확인시켜줬다.

본 발명은 바람직한 구현예에 주안점을 두어 기재되었지만, 당업자에게는 그러한 바람직한 구현예가 개질될 수 있다는 점이 자명하다. 본 발명은, 본 발명이 본 명세서에 상세하게 기재된 것 이외의 방법으로도 구현될 수 있다는 점을 내포한다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구의 범위의 요지 및 범주에서 포함하는 모든 개질을 포함한다.

특허 및 특허 출원을 포함하는, 본원에 인용된 임의의 공개문헌에 개시된 내용들은, 그것이 본원에 개시된 정도까지 본원에 전부 참고 문헌으로 포함된다.

본 출원은 U.S. 임시 특허 출원 61/076,487, 61/095,573, 61/194,700, 61/200,307 및 61/209,686 을 기반으로 하며, 그의 내용은 본원에 참고문헌으로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Kyoto University <120> METHOD OF EFFICIENTLY ESTABLISHING INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS <130> 091382 <150> US 61/076,487 <151> 2008-06-27 <150> US 61/095,573 <151> 2008-09-09 <150> US 61/194,700 <151> 2008-09-30 <150> US 61/200,307 <151> 2008-11-25 <150> US 61/209,686 <151> 2009-03-10 <160> 60 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1782 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (129)..(1301) <400> 1 aagttctgta gcttcagttc attgggacca tcctggctgt aggtagcgac tacagttagg 60 gggcacctag cattcaggcc ctcatcctcc tccttcccag cagggtgtca cgcttctccg 120 aagactgg atg act gcc atg gag gag tca cag tcg gat atc agc ctc gag 170 Met Thr Ala Met Glu Glu Ser Gln Ser Asp Ile Ser Leu Glu 1 5 10 ctc cct ctg agc cag gag aca ttt tca ggc tta tgg aaa cta ctt cct 218 Leu Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Gly Leu Trp Lys Leu Leu Pro 15 20 25 30 cca gaa gat atc ctg cca tca cct cac tgc atg gac gat ctg ttg ctg 266 Pro Glu Asp Ile Leu Pro Ser Pro His Cys Met Asp Asp Leu Leu Leu 35 40 45 ccc 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Ile His Tyr Asn 220 225 230 235 tac atg tgt aac agt tcc tgc atg ggc ggc atg aac cgg agg ccc atc 950 Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile 240 245 250 ctc acc atc atc aca ctg gaa gac tcc agt ggt aat cta ctg gga cgg 998 Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg 255 260 265 aac agc ttt gag gtg cgt gtt tgt gcc tgt cct ggg aga gac cgg cgc 1046 Asn Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg 270 275 280 aca gag gaa gag aat ctc cgc aag aaa ggg gag cct cac cac gag ctg 1094 Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu 285 290 295 ccc cca ggg agc act aag cga gca ctg ccc aac aac acc agc tcc tct 1142 Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser 300 305 310 315 ccc cag cca aag aag aaa cca ctg gat gga gaa tat ttc acc ctt cag 1190 Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln 320 325 330 atc cgt ggg cgt gag cgc ttc gag atg ttc cga gag ctg aat gag gcc 1238 Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala 335 340 345 ttg gaa ctc aag gat gcc cag gct ggg aag gag cca ggg ggg agc agg 1286 Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg 350 355 360 gct cac tcc agc cac ctg aag tcc aaa aag ggt cag tct acc tcc cgc 1334 Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg 365 370 375 cat aaa aaa ctc atg ttc aag aca gaa ggg cct gac tca gac tga 1379 His Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp 380 385 390 cattctccac ttcttgttcc ccactgacag cctcccaccc ccatctctcc ctcccctgcc 1439 attttgggtt ttgggtcttt gaacccttgc ttgcaatagg tgtgcgtcag aagcacccag 1499 gacttccatt tgctttgtcc cggggctcca ctgaacaagt tggcctgcac tggtgttttg 1559 ttgtggggag gaggatgggg agtaggacat accagcttag attttaaggt ttttactgtg 1619 agggatgttt gggagatgta agaaatgttc ttgcagttaa gggttagttt acaatcagcc 1679 acattctagg taggggccca cttcaccgta ctaaccaggg aagctgtccc tcactgttga 1739 attttctcta acttcaaggc ccatatctgt gaaatgctgg catttgcacc tacctcacag 1799 agtgcattgt gagggttaat gaaataatgt acatctggcc ttgaaaccac cttttattac 1859 atggggtcta gaacttgacc cccttgaggg tgcttgttcc ctctccctgt tggtcggtgg 1919 gttggtagtt tctacagttg ggcagctggt taggtagagg gagttgtcaa gtctctgctg 1979 gcccagccaa accctgtctg acaacctctt ggtgaacctt agtacctaaa aggaaatctc 2039 accccatccc acaccctgga ggatttcatc tcttgtatat gatgatctgg atccaccaag 2099 acttgtttta tgctcagggt caatttcttt tttctttttt tttttttttt ttctttttct 2159 ttgagactgg gtctcgcttt gttgcccagg ctggagtgga gtggcgtgat cttggcttac 2219 tgcagccttt gcctccccgg ctcgagcagt cctgcctcag cctccggagt agctgggacc 2279 acaggttcat gccaccatgg ccagccaact tttgcatgtt ttgtagagat ggggtctcac 2339 agtgttgccc aggctggtct caaactcctg ggctcaggcg atccacctgt ctcagcctcc 2399 cagagtgctg ggattacaat tgtgagccac cacgtccagc tggaagggtc aacatctttt 2459 acattctgca agcacatctg cattttcacc ccacccttcc cctccttctc cctttttata 2519 tcccattttt atatcgatct cttattttac aataaaactt tgctgccacc tgtgtgtctg 2579 aggggtg 2586 <210> 4 <211> 393 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro 65 70 75 80 Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser 85 90 95 Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly 100 105 110 Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro 115 120 125 Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln 130 135 140 Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met 145 150 155 160 Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys 165 170 175 Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln 180 185 190 His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp 195 200 205 Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu 210 215 220 Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser 225 230 235 240 Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr 245 250 255 Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val 260 265 270 Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn 275 280 285 Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr 290 295 300 Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys 305 310 315 320 Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu 325 330 335 Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp 340 345 350 Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His 355 360 365 Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met 370 375 380 Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp 385 390 <210> 5 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA against p53 <400> 5 tttgactgga tgactgccat ggttcaagag accatggcag tcatccagtc tttttt 56 <210> 6 <211> 56 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sapiens <220> <221> CDS <222> (279)..(1772) <400> 41 cgagcttggc tgcttctggg gcctgtgtgg ccctgtgtgt cggaaagatg gagcaagaag 60 ccgagcccga ggggcggccg cgacccctct gaccgagatc ctgctgcttt cgcagccagg 120 agcaccgtcc ctccccggat tagtgcgtac gagcgcccag tgccctggcc cggagagtgg 180 aatgatcccc gaggcccagg gcgtcgtgct tccgcgcgcc ccgtgaagga aactggggag 240 tcttgaggga cccccgactc caagcgcgaa aaccccgg atg gtg agg agc agg caa 296 Met Val Arg Ser Arg Gln 1 5 atg tgc aat acc aac atg tct gta cct act gat ggt gct gta acc acc 344 Met Cys Asn Thr Asn Met Ser Val Pro Thr Asp Gly Ala Val Thr Thr 10 15 20 tca cag att cca gct tcg gaa caa gag acc ctg gtt aga cca aag cca 392 Ser Gln Ile Pro Ala Ser Glu Gln Glu Thr Leu Val Arg Pro Lys Pro 25 30 35 ttg ctt ttg aag tta tta aag tct gtt ggt gca caa aaa gac act tat 440 Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser Val Gly Ala Gln Lys Asp Thr Tyr 40 45 50 act atg aaa gag gtt ctt ttt tat ctt ggc cag tat att atg act aaa 488 Thr Met Lys Glu Val Leu Phe Tyr Leu Gly Gln Tyr Ile Met Thr Lys 55 60 65 70 cga tta tat gat gag aag caa caa cat att gta tat tgt tca aat gat 536 Arg Leu Tyr Asp Glu Lys Gln Gln His Ile Val Tyr Cys Ser Asn Asp 75 80 85 ctt cta gga gat ttg ttt ggc gtg cca agc ttc tct gtg aaa gag cac 584 Leu Leu Gly Asp Leu Phe Gly Val Pro Ser Phe Ser Val Lys Glu His 90 95 100 agg aaa ata tat acc atg atc tac agg aac ttg gta gta gtc aat cag 632 Arg Lys Ile Tyr Thr Met Ile Tyr Arg Asn Leu Val Val Val Asn Gln 105 110 115 cag gaa tca tcg gac tca ggt aca tct gtg agt gag aac agg tgt cac 680 Gln Glu Ser Ser Asp Ser Gly Thr Ser Val Ser Glu Asn Arg Cys His 120 125 130 ctt gaa ggt ggg agt gat caa aag gac ctt gta caa gag ctt cag gaa 728 Leu Glu Gly Gly Ser Asp Gln Lys Asp Leu Val Gln Glu Leu Gln Glu 135 140 145 150 gag aaa cct tca tct tca cat ttg gtt tct aga cca tct acc tca tct 776 Glu Lys Pro Ser Ser Ser His Leu Val Ser Arg Pro Ser Thr Ser Ser 155 160 165 aga agg aga gca att agt gag aca gaa gaa aat tca gat gaa tta tct 824 Arg Arg Arg Ala Ile Ser Glu Thr Glu Glu Asn Ser Asp Glu Leu Ser 170 175 180 ggt gaa cga caa aga aaa cgc cac aaa tct gat agt att tcc ctt tcc 872 Gly Glu Arg Gln Arg Lys Arg His Lys Ser Asp Ser Ile Ser Leu Ser 185 190 195 ttt gat gaa agc ctg gct ctg tgt gta ata agg gag ata tgt tgt gaa 920 Phe Asp Glu Ser Leu Ala Leu Cys Val Ile Arg Glu Ile Cys Cys Glu 200 205 210 aga agc agt agc agt gaa tct aca ggg acg cca tcg aat ccg gat ctt 968 Arg Ser Ser Ser Ser Glu Ser Thr Gly Thr Pro Ser Asn Pro Asp Leu 215 220 225 230 gat gct ggt gta agt gaa cat tca ggt gat tgg ttg gat cag gat tca 1016 Asp Ala Gly Val Ser Glu His Ser Gly Asp Trp Leu Asp Gln Asp Ser 235 240 245 gtt tca gat cag ttt agt gta gaa ttt gaa gtt gaa tct ctc gac tca 1064 Val Ser Asp Gln Phe Ser Val Glu Phe Glu Val Glu Ser Leu Asp Ser 250 255 260 gaa gat tat agc ctt agt gaa gaa gga caa gaa ctc tca gat gaa gat 1112 Glu Asp Tyr Ser Leu Ser Glu Glu Gly Gln Glu Leu Ser Asp Glu Asp 265 270 275 gat gag gta tat caa gtt act gtg tat cag gca ggg gag agt gat aca 1160 Asp Glu Val Tyr Gln Val Thr Val Tyr Gln Ala Gly Glu Ser Asp Thr 280 285 290 gat tca ttt gaa gaa gat cct gaa att tcc tta gct gac tat tgg aaa 1208 Asp Ser Phe Glu Glu Asp Pro Glu Ile Ser Leu Ala Asp Tyr Trp Lys 295 300 305 310 tgc act tca tgc aat gaa atg aat ccc ccc ctt cca tca cat tgc aac 1256 Cys Thr Ser Cys Asn Glu Met Asn Pro Pro Leu Pro Ser His Cys Asn 315 320 325 aga tgt tgg gcc ctt cgt gag aat tgg ctt cct gaa gat aaa ggg aaa 1304 Arg Cys Trp Ala Leu Arg Glu Asn Trp Leu Pro Glu Asp Lys Gly Lys 330 335 340 gat aaa ggg gaa atc tct gag aaa gcc aaa ctg gaa aac tca aca caa 1352 Asp Lys Gly Glu Ile Ser Glu Lys Ala Lys Leu Glu Asn Ser Thr Gln 345 350 355 gct gaa gag ggc ttt gat gtt cct gat tgt aaa aaa act ata gtg aat 1400 Ala Glu Glu Gly Phe Asp Val Pro Asp Cys Lys Lys Thr Ile Val Asn 360 365 370 gat tcc aga gag tca tgt gtt gag gaa aat gat gat aaa att aca caa 1448 Asp Ser Arg Glu Ser Cys Val Glu Glu Asn Asp Asp Lys Ile Thr Gln 375 380 385 390 gct tca caa tca caa gaa agt gaa gac tat tct cag cca tca act tct 1496 Ala Ser Gln Ser Gln Glu Ser Glu Asp Tyr Ser Gln Pro Ser Thr Ser 395 400 405 agt agc att att tat agc agc caa gaa gat gtg aaa gag ttt gaa agg 1544 Ser Ser Ile Ile Tyr Ser Ser Gln Glu Asp Val Lys Glu Phe Glu Arg 410 415 420 gaa gaa acc caa gac aaa gaa gag agt gtg gaa tct agt ttg ccc ctt 1592 Glu Glu Thr Gln Asp Lys Glu Glu Ser Val Glu Ser Ser Leu Pro Leu 425 430 435 aat gcc att gaa cct tgt gtg att tgt caa ggt cga cct aaa aat ggt 1640 Asn Ala Ile Glu Pro Cys Val Ile Cys Gln Gly Arg Pro Lys Asn Gly 440 445 450 tgc att gtc cat ggc aaa aca gga cat ctt atg gcc tgc ttt aca tgt 1688 Cys Ile Val His Gly Lys Thr Gly His Leu Met Ala Cys Phe Thr Cys 455 460 465 470 gca aag aag cta aag aaa agg aat aag ccc tgc cca gta tgt aga caa 1736 Ala Lys Lys Leu Lys Lys Arg Asn Lys Pro Cys Pro Val Cys Arg Gln 475 480 485 cca att caa atg att gtg cta act tat ttc ccc tag ttgacctgtc 1782 Pro Ile Gln Met Ile Val Leu Thr Tyr Phe Pro 490 495 tataagagaa ttatatattt ctaactatat aaccctagga atttagacaa cctgaaattt 1842 attcacatat atcaaagtga gaaaatgcct 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Claims (20)

1. 체세포 핵 초기화 단계에서 p53 기능을 저해하는 것을 포함하는, iPS 세포 확립 효율 개선 방법.
2. 제 1 항에 있어서, p53 기능이, p53 의 화학적 저해제를 체세포와 접촉시켜서 저해되는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, p53 기능이, p53 의 우성 음성 돌연변이 또는 그것을 코딩하는 핵산을 체세포와 접촉시켜서 저해되는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, p53 기능이, p53 에 대한 siRNA 및 shRNA, 및 그것을 코딩하는 DNA 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산을 체세포와 접촉시켜서 저해되는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, p53 기능이, p53 경로 저해제를 체세포와 접촉시켜서 저해되는 방법.
6. p53 기능 저해제를 함유하는, iPS 세포 확립 효율 개선제.
7. 제 6 항에 있어서, 저해제가 화학적 저해제인 약제.
8. 제 6 항에 있어서, 저해제가 p53 의 우성 음성 돌연변이 또는 그것을 코딩하는 핵산인 약제.
9. 제 6 항에 있어서, 저해제가 p53 에 대한 siRNA 및 shRNA, 및 그것을 코딩하는 DNA 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산인 약제.
10. 제 6 항에 있어서, 저해제가 p53 경로 저해제인 약제.
11. 핵 초기화 물질 및 p53 기능의 저해제를 체세포와 접촉시키는 것을 포함하는 iPS 세포 제조 방법.
12. 제 11 항에 있어서, 저해제가 화학적 저해제인 방법.
13. 제 11 항에 있어서, 저해제가 p53 의 우성 음성 돌연변이 또는 그것을 코딩하는 핵산인 방법.
14. 제 11 항에 있어서, 저해제가 p53 에 대한 siRNA 및 shRNA, 및 그것을 코딩하는 DNA 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산인 방법.
15. 제 11 항에 있어서, 저해제가 p53 경로 저해제인 방법.
16. 제 11 항에 있어서, 핵 초기화 물질이 Oct3/4, Klf4 및 Sox2, 또는 그것을 코딩하는 핵산인 방법.
17. 제 11 항에 있어서, 핵 초기화 물질이 Oct3/4, Klf4, Sox2 및 c-Myc, 또는 그것을 코딩하는 핵산인 방법.
18. 제 11 항에 있어서, 체세포가 T 세포인 방법.
19. T 세포 항원 수용체 (TCR) 유전자가 재배열되고, T 세포를 핵 초기화하여 수득되는 iPS 세포.
20. p53 의 우성 음성 돌연변이, 또는 p53 에 대한 siRNA 및 shRNA 를 코딩하는 외인성 핵산을 함유하는 iPS 세포.

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