CN113692442A - 诱导多能干细胞的制造方法以及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种诱导多能干细胞的制造方法，包括：向哺乳动物的体细胞导入初始化因子并用神经干细胞培养基进行培养得到诱导神经干细胞样细胞的工序；和用生长培养基对所述诱导神经干细胞样细胞进行培养得到诱导多能干细胞的工序，所述初始化因子包含OCT家族、SOX家族、KLF家族、MYC家族、LIN28家族以及P53功能抑制物质。

Description

诱导多能干细胞的制造方法以及试剂盒

技术领域

本发明涉及诱导多能干细胞的制造方法以及试剂盒。本申请基于2019年4月17日在日本申请的特愿2019-078907号而主张优先权，将其内容援引于此。

背景技术

由人类、小鼠的体细胞建立iPS细胞的技术在不断被改进和简化，建立iPS细胞的效率也将高于以往。另一方面，有特别难以从成年体的体细胞建立iPS细胞的动物(多能性诱导耐受性动物)存在。作为多能性诱导耐受性动物，已知有狗、猪、狨猴、猫、牛、马等。

例如，在源自狗胚胎的成纤维细胞中持续表达初始化因子，由此可以建立狗iPS细胞(例如参考非专利文献1)。另外，通过使用仙台病毒可以从源自狗胚胎的成纤维细胞建立狗iPS细胞(例如参考非专利文献2)。另外，通过在源自猪胚胎的成纤维细胞中持续表达初始化因子，可以建立猪iPS细胞(例如参考非专利文献3)。

非专利文献

非专利文献1：Nishimura T et al.,Feeder-independent canine induced pluripotent stem cells maintained under serum-free conditions.Mol.Reprod.Dev.,vol.84,329-339,2017.

非专利文献2：Tsukamoto M et al.,Generation of Footprint-Free CanineInduced Pluripotent Stem Cells Using Auto-Erasable Sendai VirusVector.StemCells Dev.,27,1577-1586,2018.

非专利文献3：Du X et al.,Barriers for Deriving Transgene-Free Pig iPSCells with Episomal Vectors.Stem Cells,vol.33,3228-3238,2015.

发明内容

本发明的目的在于，提供一种从哺乳动物的体细胞建立iPS细胞的新技术。

本发明包含如下方案。

[1]一种诱导多能干细胞的制造方法，包括：向哺乳动物的体细胞导入初始化因子并用神经干细胞培养基进行培养而得到诱导神经干细胞样细胞的工序；和用生长培养基对上述诱导神经干细胞样细胞进行培养而得到诱导多能干细胞的工序，上述初始化因子包含OCT家族、SOX家族、KLF家族、MYC家族、LIN28家族以及P53功能抑制物质。

[2]在[1]所述的诱导多能干细胞的制造方法中，上述初始化因子还包含从由KDM家族、GLIS家族以及NANOG构成的组中选择的一种以上。

[3]在[1]或[2]所述的制造方法中，上述体细胞源自成年体。

[4]在[1]～[3]中任一项所述的制造方法中，上述神经干细胞培养基包含MAP激酶抑制剂、GSK3β抑制剂以及TGFβ抑制剂。

[5]在[1]～[4]中任一项所述的制造方法中，上述生长培养基包含bFGF。

[6]一种诱导多能干细胞，是由[1]～[5]中任一项所述的制造方法制造的诱导多能干细胞。

[7]一种试剂盒，用于从多能性诱导耐受性动物的体细胞制造诱导多能干细胞，包含：含有OCT家族、SOX家族、KLF家族、MYC家族、LIN28家族以及P53功能抑制物质的初始化因子；和含有MAP激酶抑制剂、GSK3β抑制剂以及TGFβ抑制剂的神经干细胞培养基。

[8]在[7]所述的试剂盒中，上述初始化因子还包含从由KDM家族、GLIS家族以及NANOG构成的组中选择的一种以上。

[9]在[7]或[8]所述的试剂盒中，还包含含有bFGF的生长培养基。

根据本发明，可以提供从哺乳动物的体细胞建立iPS细胞的新技术。

附图说明

图1是示意性地表示用于使初始化因子表达的EP-A载体组(vector set)的图。

图2是示意性地表示用于使初始化因子表达的EP-B载体组的图。

图3的(a)、(b)是实验例1中的细胞的照片。(a)是在明视野下对导入EP-A载体组并用生长培养基培养4天后的细胞拍摄得到的照片。(b)是对导入EP-A载体组并用生长培养基培养4天后的细胞的EGFP的荧光进行拍摄得到的照片。

图4的(a)、(b)是实验例1中的细胞的照片。(a)是向E01F导入EP-A载体组并用生长培养基培养30天后的细胞的照片。图4的(b)是向E02M导入EP-A载体组并用生长培养基培养30天后的细胞的照片。

图5是表示用于从狨猴体细胞建立iPS细胞的工序的图。

图6的(a)～(d)是实验例2中的iNSL细胞的照片。(a)是向E01F导入EP-A载体组之后用神经干细胞培养基进行培养形成的集落的照片。(b)是向E01F导入EP-B载体组之后用神经干细胞培养基进行培养形成的集落的照片。(c)是向E02M导入EP-A载体组之后用神经干细胞培养基进行培养形成的集落的照片。(d)是向E02M导入EP-B载体组之后用神经干细胞培养基进行培养形成的集落的照片。

图7是表示对实验例2中的、使用狨猴胚胎成纤维细胞时的集落形成能力进行计算得到的结果的图形。

图8的(a)、(b)是表示实验例2中的经碱性磷酸酶染色的结果的图。(a)是表示向E01F导入EP-A载体组并用神经干细胞培养基进行培养而得到的集落的经碱性磷酸酶染色的结果的图。(b)是表示向E01F导入EP-B载体组并用神经干细胞培养基进行培养而得到的集落的经碱性磷酸酶染色的结果的图。

图9是实验例3中的、iNSL细胞和iPS细胞的照片。(a)是向狨猴胚胎成纤维细胞(E01F)导入EP-A载体组并用神经干细胞培养基进行培养而形成的集落的照片。(b)是向狨猴胚胎成纤维细胞(E01F)导入EP-A载体组并用神经干细胞培养基进行培养之后用生长培养基进行培养而形成的集落的照片。(c)是向狨猴胚胎成纤维细胞(E02M)导入EP-B载体组并用神经干细胞培养基进行培养而形成的集落的照片。(d)是向狨猴胚胎成纤维细胞(E02M)导入EP-B载体组并用神经干细胞培养基进行培养之后用生长培养基进行培养而形成的集落的照片。

图10是表示对实验例3中的、狨猴iPS细胞中ES细胞标志物的表达进行分析的结果的图。

图11是表示对实验例3中的、将狨猴iPS细胞供于碱性磷酸酶染色的结果的图。

图12是表示对实验例3中的、狨猴iPS细胞中ES细胞标志物的表达进行分析的结果的图。

图13是表示对实验例3中的、狨猴iPS细胞中ES细胞标志物的表达进行分析的结果的图。

图14是表示对实验例3中的、狨猴iPS细胞中ES细胞标志物的表达进行分析的结果的图。

图15是表示对实验例3中的、狨猴iPS细胞有无表达载体(vector)进行分析的结果的图。

图16是表示对实验例4中的、从狨猴iPS细胞分化出的三个胚层中的标志物的表达进行分析的结果的图。

图17是表示对实验例4中的、由在KSR培养基中培养的狨猴iPS细胞所表达的AFP的表达进行分析的结果的图。

图18是表示对实验例4中的、由在含有FBS的培养基中培养的狨猴iPS细胞所表达的AFP的表达进行分析的结果的图。

图19是表示对实验例4中的、由狨猴iPS细胞形成的畸胎瘤进行分析的结果的图。

图20是实验例5中的、源自成年狨猴的成纤维细胞的iNSL细胞的照片。

图21是表示实验例5中的、源自成年狨猴的成纤维细胞的iNSL细胞的集落形成能力的图。

图22是表示实验例5中的、源自成年狨猴的成纤维细胞的iNSL细胞的碱性磷酸酶染色的结果的图。

图23是实验例5中的、源自成年狨猴的成纤维细胞的、狨猴iPS细胞的集落的照片。

图24是表示实验例5中的、源自成年狨猴的成纤维细胞的iPS细胞的碱性磷酸酶染色的结果的图。

图25是表示对实验例5中的、源自成年狨猴的成纤维细胞的狨猴iPS细胞中ES细胞标志物的表达进行分析的结果的图。

图26是表示对实验例5中的、源自成年狨猴的成纤维细胞的狨猴iPS细胞中ES细胞标志物的表达进行分析的结果的图。

图27是表示对实验例5中的、源自成年狨猴的成纤维细胞的狨猴iPS细胞中ES细胞标志物的表达进行分析的结果的图。

图28是表示对实验例5中的、源自成年狨猴的成纤维细胞的狨猴iPS细胞中ES细胞标志物的表达进行分析的结果的图。

图29是表示对实验例5中的、源自成年狨猴的成纤维细胞的狨猴iPS细胞中ES细胞标志物的表达进行分析的结果的图。

图30是表示对实验例5中的、从源自成年狨猴的成纤维细胞的狨猴iPS细胞分化出的三个胚层中标志物的表达进行分析的结果的图。

图31是表示对实验例5中的、从源自成年狨猴的成纤维细胞的狨猴iPS细胞分化出的三个胚层中标志物的表达进行分析的结果的图。

图32是表示对实验例5中的、由源自成年狨猴的成纤维细胞的狨猴iPS细胞形成的畸胎瘤进行分析的结果的图。

图33是表示对实验例5中的、源自成年狨猴的成纤维细胞的狨猴iPS细胞中是否有载体残留进行分析的结果的图。

图34是实验例6中的、狨猴iNSL细胞的照片。

图35是表示对实验例6中的、在狨猴iNSL细胞中残留的载体进行分析的结果的图。

图36是表示对实验例6中的、狨猴iNSL细胞的内源性的OCT4、NANOG、SOX2、KLKF4、ZFP42的表达进行分析的结果的图。

图37是表示对实验例6中的、狨猴iNSL细胞的DPPA5以及TERT的表达进行分析的结果的图。

图38是表示对实验例6中的、狨猴iNSL细胞的内源性以及外源性的、OCT4、NANOG、KLF4、Lin28的表达进行分析的结果的图。

图39是表示对实验例6中的、狨猴iNSL细胞中PAX6的表达进行分析的结果的图。

图40是表示对实验例6中的、狨猴iNSL细胞中SOX1和ZFP521的表达进行分析的结果的图。

图41是表示对实验例6中的、狨猴iNSL细胞中T和SOX17的表达进行分析的结果的图。

图42是实验例6中的、神经分化试验(assay)的时间表。

图43是表示实验例6中的、从得到的诱导神经干细胞分化出的细胞进行Hoechst染色以及通过抗βIII-tubulin抗体进行免疫染色的结果的图。

图44是表示实验例6中的、分化成神经细胞的细胞当中βIII-tubulin的表达已得到确认的细胞的比例的图形。

图45是表示实验例7中的聚类分析的结果的图。

图46是表示对实验例7中的、基因表达量进行分析的结果的图。

图47是表示实验例7中的主成分分析的结果的图。

图48是实验例8中的、由狗iPS细胞形成的集落的照片。

图49是表示对实验例8中的、狗iPS细胞中OCT4、SOX2、NANOG的表达进行分析的结果的图。

图50是实验例8中的由狗iPS细胞形成的畸胎瘤的照片。

图51是表示对实验例8中的、由狗iPS细胞形成的畸胎瘤内的、骨、软骨、神经细胞、视网膜、皮脂腺、毛囊上皮、腺体组织进行分析的结果的图。

图52是表示对实验例8中的、在狗iPS细胞中是否有载体残留进行分析的结果的图。

图53是实验例9中的猪iPS细胞的集落的照片。

图54是表示对实验例9中的、猪iNSL细胞以及猪iPS细胞中OCT4、SOX2、NANOG的表达进行分析的结果的图。

图55是实验例10中的、雪貂iPS细胞的集落的照片。

图56是表示对实验例10中的、雪貂iNSL细胞以及雪貂iPS细胞中OCT4、SOX2、NANOG的表达进行分析的结果的图。

具体实施方式

[基因名称以及蛋白质名称的表示法]

在本说明书中，人类基因以及人类蛋白质、多能性诱导耐受性动物的基因以及蛋白质用大写字母表示。但是，因情况不同，存在人类基因和其他物种的基因可以用大写字母表示而不对它们进行严格区分的情况。另外，存在人类蛋白质和其他物种的蛋白质可以用大写字母表示而没有严格的区分的情况。

本说明书中，例如所谓“SOX2”的表示法是指SOX2蛋白质以及对其进行编码的核酸双方。另外，例如所谓“初始化因子”的表示法是指初始化蛋白质以及对其进行编码的核酸双方。另外，例如所谓“SOX家族”的表示法是指SOX蛋白质以及对其进行编码的核酸双方。

[细胞名称的表示法]

本说明书中，有时会将诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell)称为iPS细胞或iPSC。另外，有时会将诱导神经干细胞样细胞(induced neural stem cell likecell)称为iNSL细胞或iNSLC。

[制造方法]

在1个实施方式中，本发明提供一种诱导多能干细胞的制造方法，包括：向哺乳动物的体细胞导入初始化因子并用神经干细胞培养基进行培养而得到诱导神经干细胞样细胞的工序(a)；和用生长培养基对诱导神经干细胞样细胞进行培养而得到诱导多能干细胞的工序(b)，初始化因子包含OCT家族、SOX家族、KLF家族、MYC家族、LIN28家族以及P53功能抑制物质。本实施方式中，哺乳动物可以是多能性诱导耐受性动物。

本说明书中，多能性诱导耐受性动物是指该动物的成年体的体细胞中即便组合OCT家族、SOX家族、KLF家族、MYC家族的初始化因子使其表达也无法建立iPS细胞的哺乳动物。

作为多能性诱导耐受性动物，例如可以举出猴子、猪、雪貂、绵羊、猫、狗、马、牛、山羊、兔等，但不限于这些。作为猴子，例如可以举出狨猴。

本实施方式中，就作为用于制作iPS细胞的材料使用的多能性诱导耐受性动物的体细胞而言，例如可以举出源自胚胎的体细胞、源自成年体的体细胞。作为体细胞，可以举出脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、骨细胞、肌细胞、血管细胞、免疫细胞、上皮细胞、神经细胞、肝细胞、胰腺细胞、它们的前体细胞等。上述的体细胞可以是未分化的细胞或分化的细胞。

狨猴、狗、猪、雪貂是典型的多能性诱导耐受性动物。如后述的实施例所述，通过本实施方式的制造方法，从狨猴、狗、猪以及雪貂的成年体的体细胞使初始化因子在细胞内瞬时表达，由此可以建立细胞内不具有表达初始化因子的表达构建体的iPS细胞。

本实施方式中，对于哺乳动物的体细胞，优选连同初始化因子一起导入具有对EBNA-1进行编码的核酸的非附加型(episomal)载体。

(初始化因子)

本实施方式中，初始化因子包含OCT家族、SOX家族、KLF家族、MYC家族、LIN28家族以及P53功能抑制物质。

作为OCT家族，例如可以举出OCT3/4、OCT1、OCT2、OCT6等。作为OCT家族，优选OCT3/4。

作为SOX家族，例如可以举出SOX2、SOX1、SOX3、SOX15、SOX17等。

作为KLF家族，例如可以举出KLF1、KLF2、KLF4、KLF5等。

作为MYC家族，可以举出C-MYC、N-MYC、L-MYC等。

作为LIN28家族，可以举出LIN28、LIN28B等。

NANOG是具有同源域(homeodomain)的转录因子。如果使NANOG与OCT4、SOX2、LIN28一起在体细胞表达，则可以建立iPS细胞(例如参考Yu J et al.,Science,318,1917-1920(2007))。

本说明书中，就P53功能抑制物质而言，只要是对P53蛋白质的功能进行抑制的物质或对P53基因的表达进行抑制的物质，可以是任意物质(例如参考国际公开第2009/157593号)。

作为对P53蛋白质的功能进行抑制的物质，可以举出P53的显性负性突变体、对P53蛋白质的功能进行抑制的化学物质、抗P53拮抗剂抗体、含有P53反应元件的共有序列的诱饵核酸、P53通路的抑制物质等。

作为对P53基因的表达进行抑制的物质，可以举出针对P53的siRNA、shRNA等。

作为P53的显性负性突变体，优选是小鼠P53的14-301位(在人类P53中对应于11-304位)的氨基酸缺失的P53DD(例如，Bowman,T.,Genes&Development,10,826-835(1996))。

初始化因子还可以含有从由KDM家族、GLIS家族以及NANOG构成的组中选择的一种以上。

初始化因子优选包含OCT家族、SOX家族、KLF家族、MYC家族、LIN28家族、P53功能抑制物质、KDM家族、GLIS家族以及NANOG。

KDM家族具有Lysine Demethylase(赖氨酸区甲基化酶)活性，对组蛋白H3的K9进行脱甲基化。作为KDM家族，已知有KDM1、KDM2、KDM3、KDM4、KDM5、KDM6。KDM4D或KDM4A的强制表达，对组蛋白H3的第9个赖氨酸残基进行脱甲基化，促进体细胞的初始化(例如参考Matoba et al.,Cell,159,884-895(2014)；Chung YG et al.,Cell Stem Cell,17,758-766(2015))。

就用作初始化因子的KDM家族而言，没有特别限定，可以举出KDM1、KDM2、KDM3、KDM4、KDM5、KDM6。作为KDM家族，优选KDM4A、KDM4D。

GLIS家族(GLI Similar家族)是锌指(Zinc Finger)型转录因子。作为GLIS家族，已知有GLIS1、GLIS2、GLIS3。GLIS1的强制表达会促进iPS细胞的形成(例如参考Maekawa etal.,Nature,474,225-229(2011))。另外，GLIS1、GLIS2、GLIS3在干细胞中发挥各种作用(例如参考Scoville DW et al.,Stem Cell Investig,4：80(2017)。)。

就用作初始化因子的GLIS家族而言，没有特别限定，可以举出GLIS1、GLIS2、GLIS3。作为GLIS家族，优选GLIS1。

初始化因子可以包含ESRR家族。

ESRR家族(雌激素相关受体(Estrogen-related receptor)家族)是核受体。作为ESRR家族，已知有ESRRA、ESRRB、ESRRG。如果连同OCT4以及SOX2一起使ESRRB或ESRRG强制表达，则可以初始化体细胞(例如参考Feng B et al.,Nat.Cell.Biol.,vol.11,197-203(2009))。

就用作初始化因子的ESRR家族而言，没有特别限定，可以举出ESRRB、ESRRG。

作为初始化因子的组合，如国际公开2015/056804号所记载的那样，可以举出表1中例示的组合，但不限于这些。

【表1】

初始化因子的组合
	OCT3/4，KLF4，C-MYC
OCT3/4，KLF4，C-MYC，SOX2
	OCT3/4，KLF4，SOX2
OCT3/4，SOX2，NANOG，LIN28
	OCT3/4，KLF4，C-MYC，SOX2，NANOG，LIN28
OCT3/4，KLF4
	OCT3/4，C-MYC
OCT3/4，SOX2
	OCT3/4，SOX2，NANOG
OCT3/4，SOX2，LIN28
	OCT3/4，SOX2，C-MYC，ESRRB
OCT3/4，SOX2，ESRRB
	OCT3/4，KLF4，L-MYC
OCT3/4，NANOG
	OCT3/4
OCT3/4，KLF4，C-MYC，SOX2，NANOG，LIN28
	OCT3/4，SOX2，KLF4，L-MYC，LIN28
OCT3/4，SOX2，KLF4，L-MYC，LIN28，GLIS1

初始化因子只要具有初始化多能性诱导耐受性体细胞的活性，就可以具有突变。在初始化因子具有突变的情况下，初始化因子优选对表1例示的NCBI登录号所确定的蛋白质或mRNA具有80％以上的序列同一性，更优选具有90％以上的序列同一性，进一步优选具有95％以上的序列同一性。

在这里，氨基酸序列的序列同一性是表示目标的氨基酸序列(目标氨基酸序列)相对于成为参照的氨基酸序列(参照氨基酸序列)匹配的比例的值。相对于参照氨基酸序列的、目标氨基酸序列的序列同一性例如可以如下所示求出。首先，对参照氨基酸序列以及目标氨基酸序列进行比对。在这里，各氨基酸序列可以按照序列同一性成为最大的方式含有缺口。接着，在参照氨基酸序列以及目标氨基酸序列中，算出匹配的氨基酸的数量，按照下述式(1)，可以求出序列同一性。

序列同一性(％)＝匹配的氨基酸的数量/目标氨基酸序列的总氨基酸数×100…(1)

同样，相对于参照碱基序列的、目标碱基序列的序列同一性例如可以如下所示求出。首先，对参照碱基序列以及目标碱基序列进行比对。在这里，各碱基序列可以按照序列同一性成为最大的方式含有缺口。接着，在参照碱基序列以及目标碱基序列中，算出匹配的碱基的数量，按照下述式(2)，可以求出序列同一性。

序列同一性(％)＝匹配的碱基的数量/目标碱基序列的总碱基数×100…(2)

本实施方式中，初始化因子所源自的动物物种，相对于导入初始化因子的体细胞所源自的动物物种，可以相同，也可以不同。只要是本领域技术人员，就可以从数据库中获得所希望的动物物种的初始化因子的氨基酸序列或mRNA序列。

初始化因子可以是由表2例示的NCBI登录号所确定的mRNA、这些mR NA所编码的蛋白质、对这些mRNA进行转录的基因(例如参考专利5098028号公报、专利6381442号公报、国际公开2015/030111号、国际公开2015/056804号。)。表1所示的登录号是人类的cDNA序列。

【表2】

名称	登录号
		OCT3/4	NM_002701
OCT1	NM_002697
		OCT2	NM_002698
OCT6	NM_002699
		SOX2	NM_003106
SOX1	NM_005986
		SOX3	NM_005634
SOX15	NM_006942
		SOX17	NM_022454
KLF1	NM_006563
		KLF4	NM_004235
KLF2	NM_016270
		KLF5	NM_001730
C-MYC	NM_002467
		N-MYC	NM_005378
L-MYC	NM_005376
		LIN28	NM_024674
LIN28B	NM_001004317
		KDM1	NM_015013
KDM2	NM_012308
		KDM3	NM_018433
KDM4A	NM_014663
		KDM4D	NM_018039
KDM5	NM_001042603
		KDM6	NM_001291415
GLIS1	NM_147193
		GLIS2	NM_032575
GLIS3	NM_001042413
		NANOG	NM_152676
ESRRB	NM_004452
		ESRRG	NM_001438

本实施方式的初始化因子，可以以蛋白质的形态导入，还可以以对该蛋白质进行编码的mRNA、表达载体等核酸的形态导入。

如后述的实施例所述，初始化因子优选包含OCT4、SOX2、KLF4、L-MYC、LIN28以及mP53DD。

另外，如后述的实施例所述，初始化因子优选包含OCT4、SOX2、KLF4、L-MYC、LIN28、mP53DD、KLF2、KDM4D、GLIS1以及NANOG。

(工序(a))

本工序中，向哺乳动物的体细胞导入初始化因子并用神经干细胞培养基进行培养，由此得到诱导神经干细胞样细胞。在这里，哺乳动物可以是多能性诱导耐受性动物。

在初始化因子是蛋白质或RNA的情况下，作为将初始化因子摄入到细胞中的方法，可以使用显微注射、电穿孔等常规方法。

在初始化因子是蛋白质的情况下，作为将初始化因子摄入到细胞的方法，例如可以举出使用蛋白质导入试剂的方法、使用蛋白质导入域(PTD)融合蛋白质的方法、显微注射法等。

作为蛋白质导入试剂，例如可以举出BioPORTER(Gelantis)、Pro-Deliver IN(OZBioscience)、Ab-DeliverIN(OZBioscience)、PULSin Kit(Polyplus-transfection SAS)、Proteinfectin(Targeting Systems)、Fuse-ItP(NIPPON Genetics)等阳离子性脂质型导入试剂；Chariot(Active motif)、Xfect Protein(Clontech)、JBS Transduction Kit(Jena Bioscience)、Cellvader(GE Healthcare)等膜穿透性肽型导入试剂；Profect-1(Targeting Systems)等脂质型导入试剂；GenomONETM-Neo(FD)(Cosmo Bio)等HVJ包膜型导入试剂等公知的试剂。

作为导入mRNA的试剂，例如可以举出TransIT-mRNA Transfection Reagent(TaKaRa)、Lipofectamine MessengerMAX^TM(Thermo Fisher Scientific)、Xfect^TM RNATransfection Reagent(Clonetech)等公知的试剂。

初始化因子可以是对初始化因子进行编码的DNA和已连结启动子的表达构建体。作为启动子，可以在目标细胞中具有活性，还可以是能通过药剂等诱导活性的表达诱导型启动子。

作为启动子，例如可以是在几乎全部的细胞中具有强启动子活性的、巨细胞病毒·启动子(CMV启动子)、CMV early enhancer/chicken beta actin(CA G启动子)等，还可以是具有组织特异性启动子活性的启动子等。

作为表达诱导型启动子，例如可以举出多西环素诱导型启动子、Cumate诱导型启动子、热休克启动子、光诱导启动子等，但并不限于此。另外，可以是通过由loxP位点夹着的蛋白质翻译终止密码子、多聚腺苷酸序列在Cre重组酶作用时来诱导表达的系统。

上述的表达构建体例如可以被整合到转座子载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、质粒载体、附加型载体等。

作为载体，优选载体未整合到基因组或暂时整合到基因组但能通过人工操作从基因组中除去的载体。

例如，在上述的构建体整合到转座子的情况下，向细胞导入而使转座酶发挥作用，由此能够容易地整合到细胞的染色体中。另外，也可以通过使转座酶发挥作用，将整合到染色体中的上述构建体从染色体切出并除去，不留任何痕迹。转座子例如可以是piggyBac、Sleeping Beauty、TolII、mariner等。

或者，在上述的构建体的两端配置loxP序列，建立iPS细胞之后，使Cre重组酶发挥作用，可以除去由loxP序列夹着的序列。

作为载体，优选附加型载体。作为附加型载体，例如可以举出含有源自EBV、SV40等的、在哺乳动物细胞内自主复制所需的序列的载体。

作为在哺乳动物细胞内自主复制所需的序列，可以举出在哺乳动物细胞内发挥功能的复制起始点、对与复制起始点结合并控制复制的蛋白质进行编码的基因等。

具体而言，关于源自EBV的载体，可以举出复制起始点oriP和EBNA-1基因。关于SV40的载体，可以举出复制起始点ori和SV40 large Tantigen基因。

作为将载体导入细胞的方法，例如可以举出脂转染法、DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法、显微注射法、电穿孔法、基因枪法、病毒载体法等。

作为实施电穿孔法的装置，例如可以使用NEPA21(Nepagene公司)、4D-Nucleofector(Lonza公司)、Neon(Thermo Fisher Scientific公司)、Gene Pulser Xcell(Bio-Rad公司)、ECM839(BTX Harvard Apparatus公司)等。

作为将载体导入到细胞的方法，可以使用转染用试剂。作为转染用试剂，例如可以使用Lipofectamine2000(Thermo Fisher Scientific公司)、StemFect(STEMGEN公司)、FuGENE6/HD(Promega公司)、CRISPRMAX(Thermo Fisher Scientific公司)、jetPRIME Kit(Polyplus Transfection公司)、DreamFect(Oz Bioscience公司)、GenePorter3000(OzBioscience公司)、磷酸钙法用试剂等。

接着，工序(a)中，将已导入初始化因子的多能性诱导耐受性动物的体细胞在神经干细胞培养基中进行培养。神经干细胞培养基优选含有MAP激酶抑制剂、GSK3β抑制剂以及TGFβ抑制剂。

神经干细胞培养基进而可以含有白血病抑制因子(Leukemia InhibitoryFactor：LIF)作为分化抑制因子，含有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为生长因子。

作为GSK3β抑制剂，例如可以举出CHIR99021、SB-415286、SB-2167、indirubin-3’-Monoxime、Kenpaullone等，但其中特别优选CHIR99021、Kenpaullone。另外，作为GSK抑制剂向培养基的添加浓度，例如可以举出0.1～10μM，优选1～3μM。

作为TGF-β抑制剂，例如可以举出A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、SD-208、LY-36494、SJN-2511等。其中，优选A83-01。另外，作为TGF-β抑制剂向培养基的添加浓度，例如可以举出0.1～10μM，优选0.5～1μM。

MAP激酶抑制剂例如可以抑制MAPK、ERK、MEK、MEKK、ERK1、ERK2、Raf、MOS、p21ras、GRB2、SOS、JNK、c-jun、SAPK、JNKK、PAK、RAC、p38等MAP激酶通路的构成因子。

作为MAP激酶抑制剂，例如可以举出PD0325901、PD184352、VX-745、SB202190、茴香霉素、PD98059、SB203580、U0126、AG126、芹菜素、HSP25激酶抑制剂、5-碘代杀结核菌素、MAP激酶反义寡核苷酸、对照MAP激酶寡核苷酸、MAP激酶级联抑制剂、MAP激酶抑制剂组1、MAP激酶抑制剂组2、MEK抑制剂组、奥洛莫辛(Olomoucine)、异奥洛莫辛、N9异丙基奥洛莫辛、p38MAP激酶抑制剂、PD169316、SB202474、SB202190盐酸盐、SB202474二盐酸盐、SB203580sulfones、Ioto-SB203580、SB220025、SC68376、SKF-86002、酪氨酸激酶抑制剂(Tyrphostin)AG126、U0124、U0125、ZM336372等(例如参考专利第6218229号公报。)。其中，优选PD0325901。另外，作为MAP激酶抑制剂向培养基的添加浓度，例如可以举出0.01～10μM，优选0.03～1μM。

(工序(b))

本工序中，将在工序(a)中得到的诱导神经干细胞样细胞用生长培养基进行培养，得到诱导多能干细胞。

如后述的实施例所述，通过将在工序(a)中得到的诱导神经干细胞样细胞在生长培养基中进行培养，可以得到诱导多能干细胞。作为生长培养基，可以使用用于培养ES细胞的公知的培养基，但不限于此，只要是适合培养ES细胞的培养基，可以为任意培养基。如后述的实施例所述，生长培养基可以含有bFGF(FGF2)。

如后述的实施例所述，生长培养基可以是20％KSR(Knockout serumreplacement,Thermo Fisher Scientific)以及4～10ng/mL bFGF的、Dulbecco改良Eagle培养基。

[诱导多能干细胞]

在1个实施方式中，本发明提供通过上述的制造方法制造的诱导多能干细胞。

如后述的实施例所述，本实施方式的iPS细胞内源性表达作为多能干细胞标志物的、OCT4、NANOG、SOX2、KLF4、LIN28、ZFP42、TRA-1-60、SSEA4。另外，本实施方式的iPS细胞可以分化成内胚层、中胚层、外胚层。另外，本实施方式的iPS细胞形成畸胎瘤，可以分化成已分化的腺上皮、血管、软骨、脂肪细胞、神经细胞。

本实施方式的iPS细胞通过使上述的初始化因子在体细胞内表达来制造。因此，会有导入对初始化因子进行编码的基因的情况。

但是，例如在使用附加型载体等导入基因并在培养的中途除去该基因的情况下，不可能对初始化因子进行检测。

本实施方式的iPS细胞和例如ES细胞在基因表达模式等方面可能存在差异。但是，不能确定是否存在这种差异，而且为了识别这种差异并通过基因表达模式等来识别本实施例的iPS细胞，需要进行大量的试错，但实际上是不可能的。因此，可以说本实施方式的iPS细胞通过由上述制造方法来制造从而进行识别是可行的。

除了上述的初始化因子之外，在工序(a)中，可以通过使能够改善公知的iPS细胞的建立效率的效率改善物质接触多能性诱导耐受性动物的体细胞，改善建立iPS细胞的效率。

如国际公开2015/056804号所记载的那样，作为iPS细胞的建立效率改善物质，例如可以举出组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂[例如，丙戊酸(VPA)(Nat.Biotechnol.,26(7)：795-797(2008))、曲古柳菌素(trichostatin)A、丁酸钠、MC1293、M344等低分子抑制剂、针对HDAC的siRNA以及shRNA(例如HDAC1 siRNA Smartpool(商标)(Millipore)、HuSH29mer shRNA Constructs against HDAC1(OriGene)等)等核酸性表达抑制剂等]、DNA甲基转移酶抑制剂(例如5’-azacytidine)(Nat.Biotechnol.,26(7)：795-797(2008))、G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂[例如BIX-01294(Cell Stem Cell,2：525-528(2008))等低分子抑制剂、针对G9a的siRNA以及shRNA(例如G9a siRNA(human)(Santa Cruz Biotechnology)等)等核酸性表达抑制剂等]、L-channel calcium agonist(例如Bayk8644)(Cell Stem Cell,3,568-574(2008))、UTF1(Cell Stem Cell,3,475-479(2008))、Wnt Signaling活性化剂(例如soluble Wnt3a)(Cell Stem Cell,3,132-135(2008))、2i/LIF(2i是丝裂原活化蛋白激酶信号(mitogen-activated protein kinase signalling)以及糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3)的抑制剂、PloS Biology,6(10),2237-2247(2008))、ES细胞特异性miRNA(例如miR-302-367簇(Mol.Cell.Biol.doi：10.1128/MCB.00398-08)、miR-302(RNA(2008)14：1-10)、miR-291-3p,miR-294以及miR-295(以上，Nat.Biotechnol.27：459-461(2009)))、3'-磷酸肌醇依赖性激酶-1(3’-phosphoinositide-dependent kinase-1(PDK1))激活剂(例如PS48(Cell Stem Cell,7：651-655(2010))等)、神经肽Y(WO2010/147395)、前列腺素类(例如前列腺素E2以及前列腺素J2)(WO2010/068955)等，但不限于这些。

上述的工序(a)、工序(b)中，可以通过在低氧条件下培养体细胞、iNSL细胞、iPS细胞，改善iPS细胞的建立效率。例如，作为培养细胞时的气氛中的氧浓度，18％以下的条件。

[试剂盒]

在1个实施方式中，本发明提供用于从多能性诱导耐受性动物的体细胞制造诱导多能干细胞的试剂盒，其包含：含有OCT家族、SOX家族、KLF家族、MYC家族、LIN28家族以及P53功能抑制物质的初始化因子；和含有MAP激酶抑制剂、GSK3β抑制剂以及TGFβ抑制剂的神经干细胞培养基。

例如，在将本实施方式的试剂盒所附带的初始化因子导入到多能性诱导耐受性动物的体细胞之后，在本实施方式的试剂盒所附带的神经干细胞培养基中进行培养，由此可以制造iPS细胞。上述的MAP激酶抑制剂、GSK3β抑制剂以及TGFβ抑制剂可以是制造方法中上述的抑制剂。

上述的试剂盒可以进一步包含含有bFGF的生长培养基。作为生长培养基，只要是能够对ES细胞进行培养的培养基，可以是任意生长培养基，可以是公知的培养基。

通过使用本实施方式的试剂盒，即便是多能性诱导耐受性动物的体细胞，也可以容易地制造诱导多能干细胞。

本实施方式的试剂盒所附带的初始化因子可以进一步含有从由KDM家族、GLIS家族以及NANOG构成的组中选择的一种以上。

初始化因子优选包含OCT家族、SOX家族、KLF家族、MYC家族、LIN28家族、P53功能抑制物质、KDM家族、GLIS家族以及NANOG。

上述的初始化因子可以是在制造方法中上述的、对蛋白质或蛋白质进行编码的核酸。

就本实施方式的试剂盒所附带的P53功能抑制物质而言，只要是在制造方法中如上所述对P53蛋白质的功能进行抑制的物质或对P53基因的表达进行抑制的物质，可以是任何物质。

本实施方式的试剂盒可以是用于使初始化因子表达的表达构建体以及具有对EBNA-1进行编码的核酸的非附加型载体。作为表达构建体，可以举出在制造方法中上述的、在启动子的下游连结有对初始化因子进行编码的基因片段连结的构建体。

【实施例】

以下通过实施例对本发明进行说明，本发明并不限于以下的实施例。

需要说明的是，实施例的图1～56中，E01F、E02M是指狨猴的胚胎成纤维细胞的细胞株名称，I5061F、CM421F是指成年狨猴的成纤维细胞的细胞株名称。另外，这些细胞株名称的记载有时是指iPS细胞、iNSL细胞所源自的细胞。另外，EP-A是指EP-A载体组，EP-B是指EP-B载体组。另外，EP-A、EP-B的记载有时是指向细胞导入的载体组。

[实验例1]

(初始化因子的导入和用生长培养基进行的培养)

在向狨猴的体细胞导入初始化因子之后，不用神经干细胞培养基对得到的细胞进行培养，直接用生长培养基(ES细胞培养基)进行培养。

首先，准备向以下所述的载体插入的初始化基因表达构建体。初始化基因是OCT4、SOX2、KLF4、L-MYC、LIN28、mP53DD、KLF2、NANOG、KDM4D、GLIS1。

OCT4、SOX2、KLF4、L-MYC、LIN28、KLF2、NANOG、KDM4D、GLIS1是人类的基因。mP53DD蛋白质是小鼠的P53蛋白质的C末端有缺失的显性负性体(Okita K et al.,An EfficientNon-viral Method to Generate Integration-Free Human iPS Cells from Cord Bloodand Peripheral Blood Cells,Stem Cells,vol.31,458-466,2013)。

导入到狨猴体细胞的表达构建体如图1、2所示。表达构建体具有以下所述的构造。

表达OCT4的pCE-hOCT3/4，在CAG启动子的下游具有OCT4基因的ORF，进而在EBV(Epstein-BarrVirus)启动子的下游具有EBNA1基因(EBV Nuclear Antigen 1)的ORF和EBV的复制起点OriP。

表达SOX2和KLF4的pCE-hSK，在CAG启动子的下游具有SOX2的ORF、口蹄疫病毒的2A序列、和KLF4的ORF，在EBV启动子的下游具有EBNA1基因的ORF和EBV的复制起点OriP。

表达L-MYC和LIN28的pCE-hUL，在CAG启动子的下游具有L-MYC的ORF、口蹄疫病毒的2A序列、和LIN28的ORF，在EBV启动子的下游具有EBNA1基因的ORF和EBV的复制起点OriP。

表达mP53DD的pCE-mP53DD，在CAG启动子的下游具有mP53DD的ORF，在EBV启动子的下游具有EBNA1基因的ORF和EBV的复制起点OriP。

表达EGFP的pCXLE-EGFP，在CAG启动子的下游具有EGFP的ORF，在EBV启动子的下游具有EBNA1基因的ORF和EBV的复制起点OriP。

表达EBNA1的pCXB-EBNA1，在CAG启动子的下游具有EBNA1基因的ORF。

表达KLF2和NANOG的pCE-K2N，在CAG启动子的下游具有KLF2的ORF、口蹄疫病毒的2A序列、和NANOG的ORF，在EBV启动子的下游具有EBNA1基因的ORF和EBV的复制起点OriP。

表达KDM4D和GLIS1的pCE-KdGI，在CAG启动子的下游具有KDM4D的ORF、口蹄疫病毒的2A序列、和GLIS1的ORF，在EBV启动子的下游具有EBNA1基因的ORF和EBV的复制起点OriP。6

EP-A载体组含有pCE-hOCT3/4、pCE-hSK、pCE-hUL、pCE-mP53DD、pCXLE-EGFP、pCXB-EBNA1。

EP-B载体组含有pCE-hOCT3/4、pCE-hSK、pCE-hUL、pCE-mP53DD、pCXLE-EGFP、pCXB-EBNA1、pCE-K2N、pCE-KdGI。

作为生长培养基，使用含有20％KSR(Knockout serum replacement，ThermoFisher Scientific)以及4～10ng/mLbFGF的、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM培养基)。生长培养基的组成如下述表3所示。

【表3】

DMEM培养基
	20％KSR(Thermo Fisher Scientific)
10ng/mL bFGF
	1％NEAA(Thermo Fisher Scientific)
2mM L-谷氨酰胺
	0.1mM 2-巯基乙醇

向狨猴的胚胎成纤维细胞(E01F)导入EP-A载体组，不用神经干细胞培养基进行培养，直接在生长培养基中进行培养。结果示于图3。

图3的(a)是对导入EP-A载体组并用生长培养基培养4天后的细胞在明视野拍摄得到的照片。图3的(b)是对导入EP-A载体组并用生长培养基培养4天后的细胞的EGFP的荧光进行拍摄得到的照片。

其结果，向狨猴细胞导入EP-A载体组，表达作为标志物的EGFP得到确认。

向狨猴的胚胎成纤维细胞(E01F、E02M)导入EP-A载体组，将得到的细胞在ES细胞培养用培养基中培养30天。结果示于图4。图4的(a)是向E01F导入EP-A载体组并用生长培养基培养30天后的细胞的照片。图4的(b)是向E02M导入EP-A载体组并用生长培养基培养30天后的细胞的照片。

其结果，不在神经干细胞培养基中培养已导入EP-A载体组的狨猴细胞，而是直接在ES细胞培养用培养基中进行培养，即便如此，也无法确认细胞的集落、细胞块。根据该结果可以明确，即便在使狨猴细胞表达初始化因子之后，在ES细胞培养用培养基中进行培养，也没有形成狨猴iPS细胞。

[实验例2]

(初始化因子的导入和在神经干细胞培养基中进行的培养)

向狨猴胚胎成纤维细胞导入初始化因子并用神经干细胞培养基进行培养，使狨猴细胞脱分化。

用于从狨猴体细胞建立iPS细胞的工序示于图5。首先，通过电穿孔，向狨猴体细胞导入初始化因子表达构建体。接着，使用含有10％牛胚胎血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培养基，对得到的细胞进行培养。

接着，使用MEF作为饲养细胞，对得到的细胞进行培养。接着，将得到的细胞在神经干细胞培养基进行培养。

作为神经干细胞培养基，使用含有MAP激酶抑制剂(PD0325901)、GSK3β抑制剂(CHIR99021)以及TGFβ抑制剂(A83-01)的培养基。神经干细胞培养基的组成示于下述表4。

【表4】

DMEM/F12培养基：Neurobasal培养基1∶1
	1％N2 Supplement(Thermo Fisher Scientific)
2％B27 Supplement(Thermo Fisher Scientific)
	0.05％AlubuMAX(Thermo Fisher Scientific)
1％NEAA(Thermo Fisher Scientific)
	2mM L-谷氨酰胺
0.1mM 2-巯基乙醇
	1％KSR(Thermo Fisher Scientific)
0.1μM PD0325901(CAS：391210-10-9)
	1μM CHIR99021(CAS：252917-06-9)
0.5μM A83-01(CAS：909910-43-6)
	10μM Forskolin(CAS：66575-29-9)
10ng/ml hLIF(Thermo Fisher Scientific)

表4中，DMEM/F12培养基是将DMEM和Ham’s F-12以1：1混合后的培养基。Neurobasal培养基是Thermo Fisher Scientific公司制造的。

向狨猴胚胎成纤维细胞(E01F、E02M)导入EP-A载体组或EP-B载体组并用神经干细胞培养基进行培养。结果示于图6。

图6的(a)是向E01F导入EP-A载体组之后用神经干细胞培养基进行培养形成的集落的照片。图6的(b)是向E01F导入EP-B载体组之后用神经干细胞培养基进行培养形成的集落的照片。图6的(c)是向E02M导入EP-A载体组之后用神经干细胞培养基进行培养形成的集落的照片。图6的(d)是向E02M导入EP-A载体组之后用神经干细胞培养基进行培养形成的集落的照片。

其结果表明，已导入EP-A载体组或EP-B载体组的狨猴细胞均形成集落。

进而，对已导入EP-A载体组或EP-B载体组导入的狨猴细胞的、集落形成能力进行计算。结果示于图7。图7是表示对使用狨猴胚胎成纤维细胞时的集落形成能力进行计算得到的结果的图形。

另外，将上述的集落供于碱性磷酸酶染色。结果示于图8。图8的(a)是表示将E01导入到FEP-A载体组并用神经干细胞培养基进行培养而得到的集落的经碱性磷酸酶染色的结果的图。图8的(b)是表示将E01导入到FEP-B载体组并用神经干细胞培养基进行培养而得到的集落的经碱性磷酸酶染色的结果的图。

其结果表明，已导入EP-A载体组或EP-B载体组的狨猴细胞的集落，被碱性磷酸酶染色进行染色。

其结果提示这些集落进行脱分化，处于未分化的状态。此后，形成这些集落的细胞称为诱导神经干细胞样细胞、iNSLC(induced Neural Stem Cell LIK E Cell)、iNSL细胞。

[实验例3]

(狨猴iPS细胞的建立)

向狨猴胚胎成纤维细胞导入初始化因子并用神经干细胞培养基进行培养之后，用生长培养基(ES细胞培养基)进行培养，建立狨猴iPS细胞。神经干细胞培养基、生长培养基使用与实验例1、2相同的培养基。

向狨猴胚胎成纤维细胞(E01F、E02M)导入EP-A载体组或EP-B载体组。接着，将得到的细胞在神经干细胞培养基进行培养之后，用生长培养基进行培养。

结果示于图9。图9的(a)是向狨猴胚胎成纤维细胞(E01F)导入EP-A载体组并用神经干细胞培养基进行培养而形成的集落的照片。图9的(b)是向狨猴胚胎成纤维细胞(E01F)导入EP-A载体组并用神经干细胞培养基进行培养之后用生长培养基进行培养而形成的集落的照片。图9的(c)是向狨猴胚胎成纤维细胞(E02M)导入EP-B载体组并用神经干细胞培养基进行培养而形成的集落的照片。图9的(d)是向狨猴胚胎成纤维细胞(E02M)导入EP-B载体组并用神经干细胞培养基进行培养之后用生长培养基进行培养而形成的集落的照片。

其结果，向狨猴胚胎成纤维细胞导入初始化因子并用神经干细胞培养基进行培养之后用生长培养基进行培养时，观察到形状与由ES细胞形成的集落类似的集落。

接着，关于狨猴ES细胞(No.40ESC)、上述的狨猴iPS细胞(源自E01F的、A-2-2、A-2-6、A-2-7、源自E02M的、B-0-6、B-0-7、B-0-11)的集落，供于Hoechst染色、使用抗TRA-1-60抗体、抗SSEA4抗体的免疫染色。TRA-1-60、SSEA4是在ES细胞中表达的基因。结果示于图10。

图10是表示对狨猴iPS细胞中ES细胞标志物的表达进行分析的结果的图。其结果表明，这些狨猴iPS细胞与ES细胞一样表达TRA-1-60、SSEA4。

接着，将上述的狨猴iPS细胞的集落供于碱性磷酸酶染色。结果示于图11。图11是表示将狨猴iPS细胞供于碱性磷酸酶染色的结果的图。其结果表明，这些集落与未分化细胞一样通过碱性磷酸酶染色进行染色。

接着，将上述的狨猴iPS细胞的集落供于Hoechst染色、使用抗OCT4抗体、抗NANOG抗体的免疫染色。结果示于图12。图12是表示对狨猴iPS细胞中ES细胞标志物的表达进行分析的结果的图。其结果表明，与ES细胞一样，这些狨猴iPS细胞的集落表达OCT4和NANOG。

接着，关于上述的狨猴iPS细胞、狨猴ES细胞(No.40、DSY127)、狨猴胚胎成纤维细胞，通过qRT-PCR对内源性的OCT4、内源性的NANOG、内源性的SOX2、内源性的KLF4基因的表达、ZFP42基因(Zinc finger protein 42)、DPPA基因(Developmental PluripotencyAssociated 2)、TERT基因(Telomerase Reverse Transcriptase)的表达进行分析。结果示于图13、图14。

图13、图14是表示对狨猴iPS细胞中ES细胞标志物的表达进行分析的结果的图。其结果表明，狨猴iPS细胞与狨猴ES细胞一样，内源性表达OCT4、NANOG、SOX2、KLF4、DRPA5、ZFP42、TERT基因。

接着，通过PCR法对狨猴iPS细胞中是否有EP-A载体组或EP-B载体组所含的载体残留进行分析。结果示于图15。图15是表示多狨猴iPS细胞有无表达载体进行分析的结果的图。

其结果表明，关于E01F A-2-2iPSC、E01F A-2-3iPSC、E01F A-2-5iPSC、E01F A-2-6iPSC、E01F A-2-7iPSC、E02M B-0-6iPSC、E02M B-0-7iPSC，细胞内没有EP-A载体组或EP-B载体组残留。

以上的结果表明，将已导入EP-A载体组或EP-B载体组的狨猴细胞在神经干细胞培养基进行培养之后，在生长培养基中进行培养时，即便失去载体组，ES细胞的标志物基因也会表达。

[实验例4]

(狨猴iPS细胞的多能性)

使在实验例3中得到的狨猴iPS细胞分化成内胚层、中胚层、外胚层，对各胚层的标志物基因的表达进行分析，验证狨猴iPS细胞的多能性。

首先，对狨猴iPS细胞(A-2-2、A-2-6、A-2-7、B-0-7)进行悬浮培养，使其分化成各胚层。

接着，使用针对各蛋白质的抗体，对内胚层分析甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein(AFP))的表达，对中胚层分析α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin(αSMA))的表达，对外胚层分析微管结合蛋白2(Microtubule associated protein 2(MAP2))、βIII-微管蛋白(βIII-tubulin)的表达。另外，同时也进行Hoechst染色。结果示于图16。

图16是表示对从狨猴iPS细胞分化出的三个胚层中标志物的表达进行分析的结果的图。其结果表明，由狨猴iPS细胞形成的各胚层，在各胚层有特征性标志物基因表达。

另外，对于由狨猴iPS细胞形成的胚状体，使用KnockOut Serum Replacement培养基(KSR培养基)或含有牛胚胎血清10％的培养基进行培养，通过qRT-PCR分析培养2周或4周之后的、AFP的表达。结果示于图17、18。

图17是表示对在KSR培养基中培养的狨猴iPS细胞所表达的AFP的表达进行分析的结果的图。图18是表示对在含有FBS的培养基中培养的狨猴iPS细胞中AFP的表达进行分析的结果的图。

图17、18中，EB表示胚状体，2w表示2周后，4w表示4周后。其结果表明，由狨猴iPS细胞形成的胚状体表达AFP。

进而，将得到的狨猴iPS细胞(A-2-2、A-2-7、B-0-7)注入到免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)的睾丸，2～3个月后取出在睾丸内形成的畸胎瘤，观察从内胚层、中胚层、外胚层分化出的组织。

更具体而言，就从胚层分化出的腺上皮、从中胚层分化出的血管、软骨、脂肪细胞而言，通过苏木精-伊红染色(HE染色)进行观察，就从外胚层分化出的神经细胞而言，通过HE染色、基于抗神经丝200kDa的抗体的免疫染色进行观察。结果示于图19。

图19是表示对由狨猴iPS细胞形成的畸胎瘤进行分析的结果的图。其结果表明，畸胎瘤中形成已分化的腺上皮、血管、软骨、脂肪细胞、神经细胞。

[实验例5]

(从成年狨猴细胞的iPS细胞的建立)

向成年狨猴的成纤维细胞导入EP-A载体组或EP-B载体组并用神经干细胞培养基进行培养，建立iNSL细胞。进而，将得到的iNSL细胞在生长培养基中进行培养，建立iPS细胞。

使用成年狨猴的成纤维细胞(I5061F、CM421F)，利用上述的方法建立狨猴iNSL细胞。结果示于图20。图20是源自成年狨猴的成纤维细胞的、iNSL细胞的照片。

其结果表明，源自成年狨猴的成纤维细胞的iNSL细胞形成细胞块以及集落。

接着，计算出源自成年狨猴的成纤维细胞的iNSL细胞的、集落形成能力。结果示于图21。图21是表示源自成年狨猴的成纤维细胞的iNSL细胞的集落形成能力的图。

图21中，“+VPA”是表示加入组蛋白脱乙酰化抑制剂(丙戊酸(Valproic Acid))2天。其结果表明，可以从成年狨猴的成纤维细胞以良好的重现性建立iNSL细胞。

接着，对上述的iNSL细胞进行碱性磷酸酶染色。结果示于图22。图22是表示源自成年狨猴的成纤维细胞的iNSL细胞的、碱性磷酸酶染色的结果的图。

其结果表明，源自成年狨猴的成纤维细胞的iNSL细胞表达碱性磷酸酶。即，表明源自成年狨猴的成纤维细胞的iNSL细胞具有未分化性。

接着，与实验例3一样，将上述的iNSL细胞在生长培养基中进行培养，得到狨猴iPS细胞。结果示于图23。图23是源自成年狨猴的成纤维细胞的、狨猴iPS细胞的集落的照片。其结果表明，用生长培养基培养的狨猴iPS细胞，形成与ES细胞的集落类似的集落。

接着，将得到的狨猴iPS细胞供于碱性磷酸酶染色。结果示于图24。图24是表示源自成年狨猴的成纤维细胞的iPS细胞的、碱性磷酸酶染色的结果的图。其结果提示建立的狨猴iPS细胞未分化。

接着，使用抗TRA-1-60抗体、抗SSEA4抗体对得到的狨猴iPS细胞进行免疫染色。同时，使用Hoechst进行染色。结果示于图25。

图25是表示对源自成年狨猴的成纤维细胞的狨猴iPS细胞中ES细胞标志物的表达进行分析的结果的图。其结果表明，得到的狨猴iPS细胞与ES细胞一样表达TRA-1-60、SSEA4。

接着，就得到的狨猴iPS细胞而言，通过qRT-PCR对内源性的、OCT4、NANOG、SOX2、KLF4、Lin28基因的表达、ZFP42基因、DPPA基因、TERT基因的表达进行分析的。结果示于图26～29。

图26～29是表示对源自成年狨猴的成纤维细胞的狨猴iPS细胞中ES细胞标志物的表达进行分析的结果的图。其结果表明，得到的狨猴iPS细胞与狨猴ES细胞一样表达上述的基因。

接着，通过与实验例4一样的方法使得到的狨猴iPS细胞分化成内胚层、中胚层、外胚层，对各胚层的标志物基因的表达进行分析。

接着，使用针对各蛋白质的抗体，对内胚层分析AFP的表达，对中胚层分析αSMA的表达，对外胚层分析MAP2、βIII-tubulin的表达。另外，同时也进行Hoechst染色。结果示于图30、31。

图30、图31是表示对从源自成年狨猴成纤维细胞的狨猴iPS细胞分化出的三个胚层中标志物的表达进行分析的结果的图。其结果表明，从得到的狨猴iPS细胞分化形成的各胚层，在各胚层表达特征性的标志物基因。

进而，与实验例4一样，从得到的狨猴iPS细胞制作畸胎瘤，观察从内胚层、中胚层、外胚层分化出的组织。就从内胚层分化出的腺上皮、从中胚层分化出的血管而言，通过HE染色进行观察，就从外胚层分化出的神经细胞而言，通过HE染色、基于抗神经丝200kDa的抗体的免疫染色进行观察。结果示于图32。

图32是表示对从源自成年狨猴的成纤维细胞的狨猴iPS细胞形成的畸胎瘤进行分析的结果的图。其结果表明，畸胎瘤中形成已分化的腺上皮、血管、神经细胞。

另外，就得到的狨猴iPS细胞而言，通过PCR法分析是否有EP-A载体组或EP-B载体组所含的载体残留。结果示于图33。

图33是表示对源自成年狨猴的成纤维细胞的狨猴iPS细胞是否有载体残留进行分析的结果的图。其结果表明，得到的狨猴iPS细胞中没有载体残留。

[实验例6]

(iNSL细胞的基因表达模式的分析)

向狨猴的胚胎成纤维细胞或成年狨猴的成纤维细胞导入EP-A载体组或EP-B载体组之后用神经干细胞培养基进行培养，得到诱导神经干细胞样细胞(iNSL细胞)。对得到的iNSL细胞的、基因表达模式以及向神经细胞的分化能力进行分析。

首先，向狨猴的胚胎成纤维细胞导入EP-A载体组或EP-A载体组之后，在神经干细胞培养基中培养。结果示于图34。图34是狨猴iNSL细胞的照片。其结果确认得到iNSL细胞。

接着，通过PCR法分析得到的iNSL细胞是否有EP-A载体组或EP-B载体组残留。结果示于图35。图35是表示对iNSL细胞中残留的载体进行分析的结果的图。

其结果表明，导入载体组后，10次传代后的iNSL细胞中有EP-A载体组或EP-B载体组残留。

接着，通过qRT-PCR分析得到的iNSL细胞的基因表达模式。结果示于图36、图37。图36是表示对iNSL细胞的、内源性的、OCT4、NANOG、SOX2、KLKF4、ZFP42的表达进行分析的结果的图。图37是表示对iNSL细胞的、DPPA5以及TERT的表达进行分析的结果的图。

其结果表明，得到的iNSL细胞内源性表达SOX2、TERT，但未内源性表达OCT4、NANOG、KLF4、ZFP42、DPPA5。

接着，通过qRT-PCR分析得到的iNSL细胞的、结合内源性基因表达和外源性(基于载体组的基因表达)基因表达的基因表达量。图38是表示对iNSL细胞的、内源性以及外源性的、OCT4、NANOG、KLF4、Lin28的表达进行分析的结果的图。

其结果表明，在结合内源性基因表达和外源性基因表达的基因表达量中，有OCT4、KLF4、Lin28表达，但没有NANOG表达。

接着，对于得到的iNSL细胞，通过qRT-PCR分析作为神经干细胞的标志物的PAX6(Paired box 6)、SOX1(Sry-type HMG box 1)、ZFP521(Zinc Finger Protein 521)的表达。结果示于图39、图40。

图39是表示对iNSL细胞中PAX6的表达进行分析的结果的图。图40是表示对iNSL细胞中SOX1和ZFP521的表达进行分析的结果的图。其结果表明，狨猴ES细胞中没有PAX6表达，但得到的诱导神经干细胞表达PAX6、SOX1、ZFP521。

接着，对于得到的诱导神经干细胞，通过qRT-PCR分析作为中胚层标志物的T(TBXT)、作为内胚层标志物的SOX17(Sry-type HMG box 17)的表达。结果示于图41。

图41是表示对iNSL细胞中T和SOX17的表达进行分析的结果的图。其结果确认T以及SOX17在狨猴ES细胞中有表达，但在得到的诱导神经干细胞中没有表达。

接着，关于狨猴ES细胞、狨猴iPS细胞、狨猴诱导神经干细胞，通过unbiasedneuronal differentiation assay(无偏神经元分化试验)，分析向神经干细胞的分化能力。图42是神经分化试验的时间表。具体而言，进行7天悬浮培养之后，附着培养7天。结果示于图43、图44。

图43是表示对得到的诱导神经干细胞分化出的细胞进行Hoechst染色以及基于抗βIII-tubulin抗体的免疫染色的结果的图。其结果表明，从得到的诱导神经干细胞分化出的细胞在分化成神经细胞。

图44是表示分化成神经细胞的细胞当中βIII-tubulin的表达已得到确认的细胞的比例的图形。其结果表明，从狨猴ES细胞、狨猴iPS细胞分化出的细胞没有表达βIII-tubulin，但从狨猴诱导神经干细胞分化出的细胞表达βIII-tubulin。

以上的结果表明，向狨猴的成年体的成纤维细胞导入EP-A载体组或EP-B载体组并用神经干细胞培养基进行培养而得到的iNSL细胞，获得神经干细胞的性状。

另外，不将iNSL细胞转移到生长培养基而继续在神经干细胞培养基中培养时，不管iNSL细胞是否保留载体，都会保留神经干细胞的性状，不会获得ES细胞的性状。

其结果表明，无法直接从多能性诱导耐受性动物的成年体的体细胞制作iPS细胞，但一旦向神经干细胞脱分化之后，进而向iPS细胞脱分化是可能的。

[实验例7]

(狨猴iPS细胞和iNSL细胞的基因图谱)

对狨猴的、ES细胞、iPS细胞、iNSL细胞的基因表达谱进行聚类分析。

对于狨猴的、ES细胞、iPS细胞、iNSL细胞，根据详尽的基因表达谱进行聚类分析。结果示于图45。其结果表明，狨猴iPS细胞与狨猴ES细胞具有高类似性，狨猴iNSL细胞与狨猴成纤维细胞具有高类似性。

接着，对反映各簇的类似性的40个基因分析各细胞中的表达量。结果示于图46。其结果可以在狨猴iPS细胞和狨猴诱导神经干细胞中提取表达量具有特征的基因。

对各细胞的基因表达谱进行了主成分分析。结果示于图47。其结果表明，各细胞分成成纤维细胞组、ES细胞以及iPS细胞组、以及诱导神经干细胞组。

[实验例8]

(狗iPS细胞的建立)

向狗的成纤维细胞导入EP-B载体组，建立狗iPS细胞。

结果示于图48。图48是由狗iPS细胞形成的集落的照片。其结果表明，狗iPS细胞形成与ES细胞所形成的集落类似的集落。

对得到的狗iPS细胞分析ES细胞的标志物的表达。结果示于图49。图49是表示通过RT-PCR分析狗iPS细胞中OCT4、SOX2、NANOG的表达的结果的图。

其结果表明，狗iPS细胞表达OCT4、SOX2、NANOG。即，提示狗iPS细胞具有与ES细胞类似的性状。

将狗iPS细胞注入到免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)的睾丸，2～3个月后，摘出在睾丸内形成的畸胎瘤，观察畸胎瘤。结果示于图50。

将得到的畸胎瘤供于苏木精-伊红染色，观察各组织。结果示于图51。图51是表示对骨、软骨、神经细胞、视网膜、皮脂腺、毛囊上皮、腺体组织进行分析的结果的图。

通过PCR法分析是否有向得到的狗iPS细胞导入的载体残留。结果示于图52。其结果确认狗iPS细胞中有表达载体残留。

[实验例9]

(猪iPS细胞的建立)

向猪的成纤维细胞中导入EP-B载体组，建立猪iNSL细胞以及猪iPS细胞。

图53是得到的猪iPS细胞的集落的照片。表明猪iPS细胞形成与ES细胞所形成的集落类似的集落。

接着，通过RT-PCR分析猪iPS细胞和猪iNSL细胞中ES细胞的标志物的表达。图54是表示对猪iNSL细胞以及猪iPS细胞中OCT4、SOX2、NANOG的表达进行分析的结果的图。

其结果表明，猪iPS细胞表达OCT4、SOX2、NANOG。另外，表明猪iNSL细胞表达SOX2。

[实验例10]

(雪貂iPS细胞的建立)

向雪貂的成纤维细胞导入EP-B载体组，建立雪貂iNSL细胞以及雪貂iPS细胞。

图55是得到的雪貂iPS细胞的集落的照片。表明雪貂iPS细胞形成与ES细胞所形成的集落类似的集落。

接着，分析雪貂iPS细胞中ES细胞的标志物的表达。图56示出通过RT-PCR分析雪貂iNSL细胞以及雪貂iPS细胞中OCT4、SOX2、NANOG的表达的结果。

其结果表明，雪貂iPS细胞表达OCT4、SOX2、NANOG。另外，表明雪貂iNSL细胞表达SOX2。

工业方面可利用性

本发明可以提供由哺乳动物的体细胞建立iPS细胞的新技术。

Claims (9)

1.一种诱导多能干细胞的制造方法，其特征在于，包括：

向哺乳动物的体细胞导入初始化因子并用神经干细胞培养基进行培养而得到诱导神经干细胞样细胞的工序；和

用生长培养基对所述诱导神经干细胞样细胞进行培养而得到诱导多能干细胞的工序，

所述初始化因子包含OCT家族、SOX家族、KLF家族、MYC家族、LIN28家族以及P53功能抑制物质。

2.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞的制造方法，其特征在于，

所述初始化因子还包含选自由KDM家族、GLIS家族以及NANOG构成的组中的一种以上。

3.根据权利要求1或2所述的诱导多能干细胞的制造方法，其特征在于，

所述体细胞源自成年体。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的诱导多能干细胞的制造方法，其特征在于，

所述神经干细胞培养基包含MAP激酶抑制剂、GSK3β抑制剂以及TGFβ抑制剂。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的诱导多能干细胞的制造方法，其特征在于，

所述生长培养基包含bFGF。

6.一种诱导多能干细胞，其特征在于，

是由权利要求1～5中任一项所述的诱导多能干细胞的制造方法制造的诱导多能干细胞。

7.一种试剂盒，用于从多能性诱导耐受性动物的体细胞制造诱导多能干细胞，其特征在于，包含：

含有OCT家族、SOX家族、KLF家族、MYC家族、LIN28家族以及P53功能抑制物质的初始化因子；和

含有MAP激酶抑制剂、GSK3β抑制剂以及TGFβ抑制剂的神经干细胞培养基。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，

所述初始化因子还包含选自由KDM家族、GLIS家族以及NANOG构成的组中的一种以上。

9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，

还包含含有bFGF的生长培养基。

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