KR20200105664A - Bap 또는 ba 세포를 제조하는 방법 - Google Patents

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앤-로르 파비안느 버나뎃 하프너
라이오넬 아돌프 테오도르 메이어
오로르 사빈 힉
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아나제네시스 바이오테크놀로지스 에스.에이.에스.
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Abstract

본 발명은, BAP 또는 BA 세포를 제조하는 방법, 수득된 BAP 또는 BA 세포 모집단 및 의약으로서의 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

BAP 또는 BA 세포를 제조하는 방법
본 발명은, BAP(갈색 지방세포 전구세포, Brown Adipocyte Progenitor) 또는 BA(갈색 지방세포, Brown Adipocyte) 세포를 제조하는 방법, BAP 또는 BA 세포 모집단(population) 및 의약으로서의 이들의 용도에 관한 것이다.
포유류에서는, 2개의 주요 타입의 지방세포, 즉 갈색 지방세포(BA) 및 백색 지방세포(WA)가 공존하고, 이들은 모두, 반대의 기능을 가지면서 에너지 균형의 조절에 관여한다. 백색 지방 조직(WAT)은 전신으로 분산되고, 주로 에너지 저장에 관여하고 있다. WAT와 대조적으로, 갈색 지방 조직(BAT)는 에너지 소비에서 특화되어 있다. 활성화된 BAT는 대사 기질을 소비하고, 지방을 연소시켜, 탈커플링 단백질(UCP)-1을 통해 열을 생성한다. 이 조직은 신생아 및 동면중의 종에서 대량으로 발견된다. 인간에서는, 시간의 경과와 함께 BAT의 양이 감소하고, 성인에서는 약간의 침착물만이 발견될 수 있다.
BA는 상당한 치료 가능성을 갖고; 지방을 연소시켜 열을 생성하고, 신체의 항온성을 조절하고, 체중 감량을 촉진시키거나 혈당증 등의 대사 파라미터를 조절하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, BAP 및/또는 BA의 세포 공급원은 클리닉에서 긴급히 필요하다.
본 발명은 BAP 세포를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계:
a) 다능성 세포(pluripotent cell)를, Wnt 신호전달 경로의 활성제를 포함하는 배양 배지에서 배양하여 유도 근축 중배엽 전구세포(iPAM) 세포를 수득하는 단계,
b) 상기 iPAM 세포를 근원성 배양 배지에서 배양하는 단계,
c) 임의로, 단계 b)의 종료시에 수득된 세포를, 혈청 또는 이의 등가물(equivalent)을 포함하고 임의로 추가로 FGF2 또는 이의 등가물을 포함하는 배양 배지에서 추가로 배양하는 단계,
d) 단계 b) 또는 c)의 종료시에 수득된 세포를 계대배양(passaging)하고 이들을 배양 접시에 씨딩(seeding)하여 BAP를 선택하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 방법이 하기 단계:
바람직하게는, BAP 세포를 수득하는 방법에 정의된 바와 같은 단계 a), 단계 b), 임의의 단계 c), 및 단계 d)를 포함하고, 이어서 하기 단계:
e) 선택된 BAP 세포, 바람직하게는 단계 d)의 종료시에 수득가능한 것들을, 혈청 또는 이의 등가물을 포함하는 지방생성 배양 배지에서 배양하여 BA 세포를 수득하는 단계를 포함하는, BA 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
한 가지 실시형태에서, 단계 a)는, 골 형태형성 경로(BPM) 신호전달 경로의 억제제 및 임의로 DMSO를 추가로 포함하는 배양 배지에서 수행할 수 있다.
바람직한 실시형태에서,
a) 상기 Wnt 신호전달 경로는 표준 Wnt/베타 카테닌 신호전달 경로 및/또는 Wnt/PCP 신호전달 경로이고,
b) 상기 억제제 또는 상기 BMP 신호전달 경로는 노긴(Noggin), 코르딘(Chordin), 코르딘-유사 1-3, 폴리스타틴(Follistatin), 폴리스타틴-유사 1-5, Dan 계열의 멤버(member) 및 이의 변이체 및 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 실시형태에서, 단계 b)에 사용된 근원성 배양 배지는, 배양 배지, 혈청 또는 이의 등가물, BMP 수용체의 억제제, c-MET 수용체의 활성제 및 IGF 또는 인슐린 수용체의 활성제를 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어진다.
한 가지 실시형태에서, 단계 e)의 지방생성 배양 배지가 배양 배지, TGF베타/액티빈/NODAL 경로(바람직하게는 SB431542), EGF 수용체(바람직하게는 EGF(상피 성장 인자))의 활성제, 아스코르브산, 및 코르티코이드 수용체(바람직하게는 하이드로코르티손)의 활성제를 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어진다.
추가의 실시형태에서, BA 세포 또는 BA 세포의 모집단은 UCP1의 발현을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 본원에 정의된 방법에 의해 수득할 수 있는 BA 세포의 모집단으로서, UCP1을 발현하는 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%를 포함하는, BA 세포의 모집단에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 본원에 정의된 방법에 의해 수득할 수 있는 BAP 세포의 모집단으로서, 본원에 정의된 BA 모집단으로 전환되는 상기 모집단의 능력을 특징으로 하는, 모집단에 관한 것이다.
바람직하게는, BAP 또는 BA 세포의 상기 모집단은 의약으로서 사용하기 위한 것이다. 보다 바람직하게는, 상기 의약은 BA 또는 BAP 세포 활성과 관련된 질환 또는 병태(condition) 및 바람직하게는 대사성 질환 또는 병태, 예컨대, 비만 관련 병상(obesity-related pathology), 대사 증후군, 진성 당뇨병, 고지방증, NASH(비-알콜성 지방성 간염), 에너지 균형(섭취량 대 소비량)을 치료하기 위한 것이다.
본 발명은 또한, 스크리닝(screening) 목적을 위한, 본원에 정의된 BAP 또는 BA 세포의 모집단의 용도에 관한 것이다.
도 1. 인간 갈색 지방세포 전구세포(hBAP)를 유도하고 hiPS 세포로부터 인간 갈색 지방세포(hBA)를 생성하는 프로세스. 유도 근축 중배엽(iPAM)의 생성 후, 세포는 근원성 분화를 겪는다. 이어서, BAP는 이들 세포로부터 유도하고, 갈색 지방세포로 분화하도록 유도된다.
도 2. hiPSC로부터 인간 갈색 지방세포 전구세포를 유도하기 위한 실험 도식. 0일로부터 22일까지, 일련의 분화 배지에 의해, 마트리겔-코팅된(matrigel-coated) 배양 플레이트 상의 hiPS 세포로부터 iPAM 및 근원성 계통을 연속적으로 유도한다. 12일부터 22일까지, 트립신을 사용하여 세포를 분리하고, 코팅되지 않은 배양 플레이트에 씨딩한다. 수회 계대 후, 세포 모집단은 BAP가 농후하다.
도 3. hiPS 세포로부터 BAP 유도. BAP의 유도 동안 세포 모집단의 위상차 광 사진. 세포는 연속적 계대를 통해 균일한 형태를 획득한다(스케일 바 = 1,000㎛).
도 4. BAP의 지방생성 가능성. mRNA는 미분화 BAP(Und.) 또는 상이한 계대(P5, P6, P7, P8 및 P9)에서 17일간 분화된 BAP로부터 제조했다. 6개 지방생성 마커는 qPCR에 의해 분석했다.
도 5. 갈색 지방세포의 특성화. BAP 분화는 17일간 상이한 계대(P5, P6, P7, P8 및 P9)에서 유도하고, UCP1, 지질 액적(droplet) 및 핵은 면역염색에 의해 가시화했다(스케일 바 = 50㎛).
도 6. 인간 갈색 지방세포 전구세포(hBAP)를 유도하고 hiPS 세포로부터 인간 갈색 지방세포(hBA)를 생성하는 프로세스. 유도 근축 중배엽(iPAM)의 생성 후, 세포는 근원성 분화를 겪는다. 이어서, BAP는 이들 세포로부터 유도하고, 갈색 지방세포로 분화하도록 유도된다.
도 7. hiPSC로부터 인간 갈색 지방세포 전구세포를 유도하기 위한 실험 도식. 0일부터 22일까지, 일련의 분화 배지에 의해, 마트리겔-코팅된 배양 플레이트 상의 hiPS 세포로부터 iPAM 및 근원성 계열을 연속적으로 유도한다. 12일로부터 22일까지, 트립신을 사용하여 세포를 분리하고, 코팅되지 않은 배양 플레이트에 씨딩한다. 수회 계대 후, 세포 모집단은 BAP가 농후하다.
도 8. hiPS 세포로부터 BAP 유도. 16일에서 BAP의 유도 동안 세포 모집단의 위상차 광 사진. 세포는 연속 계대를 통해 균일한 형태를 획득한다(스케일 바 = 1,000㎛).
도 9. 초기 계대에서 BAP의 지방생성 가능성. mRNA는 미분화 BAP(Und.) 또는 상이한 계대(P1, P2, P3, P4 및 P5)에서 17일간 분화된 BAP로부터 제조했다. 6개 지방생성 마커는 qPCR에 의해 분석했다.
도 10. 초기 계대에서 갈색 지방세포의 특성화. 분화는 상이한 계대(P1, P2, P3, P4 및 P5)에서 16일에 유도된 BAP에 대해 17일간 유도했다. UCP1, 지질 액적 및 핵은 면역염색에 의해 가시화했다. (B) UCP1을 발현하고 지질 액적을 제시하는 세포 모집단의 정량화.
도 11. 계대 후기에서 BAP의 지방생성 가능성. mRNA는 미분화 BAP(Und.) 또는 상이한 계대(P5, P6, P7, P8 및 P9)에서 17일간 분화된 BAP로부터 제조했다. 6개 지방생성 마커는 qPCR에 의해 분석했다.
도 12. 계대 후기에서 갈색 지방세포의 특성화. BAP 분화는 17일간 상이한 계대(P5, P6, P7, P8 및 P9)에서 유도했다. (A) UCP1, 지질 액적 및 핵은 면역염색에 의해 가시화했다. (B) UCP1을 발현하고 지질 액적을 제시하는 세포 모집단의 정량화.
도 13. 상이한 종점에서 유도된 BAP로부터 갈색 지방세포의 특성화. BAP는, 혈청을 함유하는 배지에서의 배양 단계 후 12일로부터 22일까지 유도하고, 5회 계대배양하고, 17일간 지방세포로 분화했다. (A) UCP1, 지질 액적 및 핵은 면역염색에 의해 가시화했다. (B) UCP1을 발현하고 지질 액적을 제시하는 세포 모집단의 정량화. (C) mRNA는 미분화 BA(Und.) 또는 17일간 분화된 BAP(분화)로부터 제조하고, 지방생성 마커는 qPCR에 의해 분석했다. (D) 12일부터 16일까지 유도된 BAP는 17일간 분화하도록 유도하고, 이어서 지방분해는 10μM 포르스콜린으로 자극한다.
도 14. 혈청을 함유하는 배지에서 배양 단계의 효과. (A) BAP는 20일부터 혈청을 함유하는 배지에서의 배양 단계의 존재(1) 또는 부재(2)(즉, 임의 단계 c))하에 유도하고, 17일간 지방세포의 분화를 겪었다. UCP1, 지질 액적 및 핵은 면역염색에 의해 가시화했다.
도 15. 방법 2와의 비교. 방법 2에 따라 hiPS 세포를 근축 중배엽 계통으로 유도했다. 8일에, 세포는 근원성 배지(a) 또는 2개 지방생성 배지(b 및 c)에서 유지시킨다. mRNA는 20일 및 30일로부터 제조했다. BAP 및 BA는 방법 1에 따라 hiPS 세포로부터 또한 생성한다. mRNA는, 방법 1에 기재된 바와 같이, 미분화 BAP(Und.) 또는 17일간 분화된 BAP(Diff.)로부터 제조했다. 2개 지방생성 마커는 qPCR에 의해 분석했다.
도 16. 방법 3.1과의 비교. 근축 중배엽의 유도 후, 방법 3.1을 사용하여 세포를 분화시킨다. mRNA는 20일부터 30일까지 제조했다. BAP 및 BA도 또한 방법 1에 따라 hiPS 세포로부터 생성한다. mRNA는, 방법 1에 기재된 바와 같이, 미분화 BAP(Und.) 또는 17일간 분화된 BAP(Diff.)로부터 제조했다. 2개 지방생성 마커는 qPCR에 의해 분석했다.
도 17. 방법 3.2와의 비교. 근축 중배엽의 유도 후, 방법 3.2를 사용하여 세포를 분화시킨다. 8일에, 세포는 2개의 상이한 지방생성 배지(3.2. a 및 b)에서 유지시킨다. BAP 및 BA는 또한 방법 1에 따라 hiPS 세포로부터 생성한다. mRNA는, 방법 1에 기재된 바와 같이, 미분화 BAP(Und.) 또는 17일간 분화된 BAP(Diff.)로부터 제조했다. 2개 지방생성 마커는 qPCR에 의해 분석했다.
도 18. 방법 4와의 비교. 방법 4 또는 방법 1에 기재된 바와 같이, BAP를 hiPS 세포로부터 생성했다. (A) BAP 분화는 17일간 P5에서 유도했다. UCP1, 지질 액적 및 핵은 면역염색에 의해 가시화했다. (B) mRNA는 미분화 BAP(Und.) 또는 P5에서 17일간 분화된 BAP(Diff)로부터 제조했다. 2개 지방생성 마커는 qPCR에 의해 분석했다.
도 19. 방법 5와의 비교. (A) 방법 5에 기재된 바와 같이 hiPS 세포 분화 동안 세포 모집단의 위상차 광 사진. BAP 및 BA는 또한 방법 1에 따라 hiPS로부터 생성한다. (B) mRNA는, 방법 1에 기재된 바와 같이, 미분화 BAP(Und.) 또는 17일간 분화된 BAP(Diff.)로부터 제조했다. 2개 지방생성 마커는 qPCR에 의해 분석했다. (C) 분화의 17일 후, UCP1, 지질 액적 및 핵은 BA 배양에서 면역형광에 의해 가시화한다.
도 20. 비교 실험의 개요. hiPS 세포는 방법 2, 방법 3.1, 3.2 및 방법 4를 사용하여 분화시킨다. 시험된 각 방법에 대해, BAP(Und.) 및 BA(Diff.)도 또한 방법 1에 따라 hiPS 세포로부터 생성한다. mRNA는 상이한 조건으로부터 제조했고, 갈색 지방생성 UCP1의 발현은 qPCR에 의해 분석했다.
BAP 세포를 제조하는 방법
제1 양태에서, BAP 세포를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계:
a) 다능성 세포를, Wnt 신호전달 경로의 활성제를 포함하는 배양 배지에서 배양하여 유도 근축 중배엽 전구세포(iPAM) 세포를 수득하는 단계,
b) 상기 iPAM 세포를 근원성 배양 배지에서 배양하는 단계,
c) 임의로, 단계 b)의 종료시에 수득된 세포를, 혈청 또는 이의 등가물을 포함하고 임의로 추가로 FGF2 또는 이의 등가물을 포함하는 배양 배지에서 추가로 배양하는 단계,
d) 단계 b) 또는 c)의 종료시에 수득된 세포를 계대배양하고 이들을 배양 접시에 씨딩하여 BAP를 선택하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
제2 양태에서, 바람직한 실시형태에서, BAP 세포는 상기 정의된 바와 같은 방법(즉, 단계 a), 단계 b), 임의 단계 c) 및 단계 d))를 사용하여 제조되고, 상기 방법이 하기 단계:
e) 단계 d)의 종료시에 수득가능한 선택된 BAP 세포를, 혈청 또는 이의 등가물을 포함하는 지방생성 배양 배지에서 배양하여 BA 세포를 수득하는 단계를 추가로 포함하는, BA 세포를 제조하는 방법이 제공된다.
양 방법의 문맥에서, 하나는 BAP 또는 BA 세포의 제조를 지칭한다. 표현 BAP 또는 BA 세포는 BAP 또는 BA 세포를 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어지는 모집단으로 대체될 수 있다. BAP 및 BA 세포는 본원에서 이후에 동정(identifying)된다.
본 발명의 방법 또는 방법을 지칭할 때에 달리 명기하지 않는 한, 특히 명시하지 않는 한, BAP를 제조하는 방법 또는 BA 세포를 제조하는 방법을 지칭한다.
단계 a
본 발명의 방법의 단계 a)에서 배양된 세포는 바람직하게는 다능성 세포이다.
본원에서 사용되는 용어 "다능성 세포"는, 다양한 상이한 세포 계열을 생성시킬 수 있는 포유동물 미분화 세포를 지칭한다. 전형적으로, 다능성 세포는 이하의 마커 Oct4, SOX2, Nanog, SSEA 3 및 4, TRA 1/81를 발현할 수 있다[참조: International Stem Cell Initiative recommendations, 2007]. 세포에서 소정 마커의 발현 또는 존재는 "적용의 문맥에서 적용되는 정의"란 제목의 일반적 부분에서 개시된 바와 같이 평가할 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 다능성 세포는 포유동물 다능성 세포이다. 바람직하게는, 상기 다능성 세포는 인간 다능성 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 다능성 세포는 비인간 포유동물 다능성 세포이다.
한 가지 실시형태에서, 다능성 세포는 줄기 세포이다. 바람직하게는, 상기 줄기 세포는 배아 줄기 세포이다. 또는, 상기 줄기 세포는 성체 줄기 세포이다. 성체 줄기 세포가 사용되는 경우에, 이는 BAP 또는 BA 세포가 기관 제한된 줄기 세포 또는 간엽계 줄기 세포(MSC)로부터 생성될 수 있음을 의미한다.
또 다른 실시형태에서, 다능성 세포는 인간 배아 줄기 세포(hES 세포)이다. 또 다른 실시형태에서, 다능성 세포는 비-인간 포유동물 배아 줄기 세포이다. 전형적으로, 하기 표에 기재된 것과 같은 hES 세포주[참조: Loser et al., 2010]를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다:
Figure pct00001
한 가지 실시형태에서, 다능성 세포는 비-인간 배아 줄기 세포, 예컨대, 마우스 줄기 세포, 설치류 줄기 세포 또는 영장류 줄기 세포이다.
한 가지 실시형태에서, 다능성 세포는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)이다. 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)는 특정 유전자의 "강제" 발현을 유도함으로써 비다능성, 통상은 성체 체세포로부터 인공적으로 유도된 다능성 줄기 세포의 일종이다. iPSC는 마우스 세포[참조: Takahashi and Yamanaka, 2006]로부터 2006년에 및 인간 세포[참조: Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007]로부터 2007년에 최초로 생성되었다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Wnt 신호전달 경로"는 2개의 경로: "표준 Wnt/베타 카테닌 신호전달 경로" 및 "Wnt/PCP 신호전달 경로"로 나뉠 수 있는 신호전달 경로를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표준 Wnt/베타 카테닌 신호전달 경로" 또는 "Wnt/PCP 신호전달 경로"는, 이의 일반적 의미에서, 배발생 및 암에서의 역할에 대해 가장 잘 공지되어 있지만 또한 성체 동물의 정상 생리학적 프로세스에 관여하는, 단백질 및 다른 생물활성 분자(지질, 이온, 당...)의 네트워크를 나타낸다. "표준 Wnt/베타 카테닌 신호전달 경로"는 글리코겐 신타제 키나제 3β(GSK-3β)의 Wnt 의존적 억제를 특징으로 하여, β-카테닌의 후속 안정화를 유도하고, 이어서 핵으로 이동하여 전사 인자로서 작용한다. "Wnt/PCP 신호전달 경로"는 GSK-3β 또는 β-카로틴을 포함하지 않고, 칼슘 의존성 신호전달, 평면 세포 극성(PCP) 분자, 작은 GTPase 및 C-Jun N-말단 키나제(JNK) 신호전달을 포함하는 몇몇 신호전달 분지를 포함한다. 이들 경로는 다수의 리뷰, 예컨대, 문헌[참조: Clevers, 2006; Montcouquiol et al., 2006; Schlessinger et al., 2009]에 잘 기재되어 있다.
한 가지 실시형태에서, Wnt 신호전달 경로는 표준 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, Wnt 신호전달 경로는 Wnt/PCP 신호전달 경로이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, Wnt 신호전달 경로는 표준 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로 및 Wnt/PCP 신호전달 경로이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "활성제" 또는 "Wnt 신호전달 경로의 활성제"(달리 명시하지 않는 한)는, Wnt 신호전달 활성을 증강 또는 촉진 또는 활성화시키는 물질을 나타낸다. 예를 들면, 표준 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로의 경우, 이 활성은 LEF/TCF 결합 부위 리포터의 확립된 다량체를 사용하는 Wnt 리포터 활성, 및/또는 GSK-3β의 억제, 및/또는 표준 Wnt 표적 유전자, 예컨대, T, Tbx6, Msgn1 또는 Axin2의 활성화에 의해 측정할 수 있다. 따라서, Wnt 신호전달 활성의 활성화는, 상기 특정된 Msgn1 리포터 활성(Chal J et al 2015)의 Wnt의 증가인 것으로 평가될 수 있다. 이러한 증가는 적어도 1%, 5% 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 그 이상일 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명에 따르는 표준 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로 또는 Wnt/PCP 신호전달 경로의 활성제는 척추동물 종으로부터 유래하는 또는 변형된 R-스폰딘 계열의 멤버이다.
한 가지 실시형태에서, R-스폰딘 계열의 멤버는 포유동물 R-스폰딘 계열의 멤버이다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따르는 R-스폰딘 계열의 멤버는 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따르는 R-스폰딘 계열의 멤버는 R-스폰딘 3이다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따르는 R-스폰딘 계열의 멤버는 R-스폰딘 2이다.
척추동물 재조합 R-스폰딘은 상업적으로 구입할 수 있거나, 순화 배양 배지로서 생산될 수 있다. 이는, R-스폰딘 단백질의 코딩 서열을 함유하는 작제물을 경쟁 세포, 예컨대, COS 세포로 발현시키는 것을 수반한다. R-스폰딘 단백질은 배양 배지에서 분비된다. 순화 배지는 다능성 세포에 직접 적용되거나, 기초 배지에서 사전희석시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "R-스폰딘3" 또는 "R-스폰딘2"는 Wnt 신호전달 경로를 활성화하는 척추동물에서 분비 단백질의 계열의 멤버를 지칭한다. 인간 R-스폰딘3 단백질의 예시적 서열은, 수탁 번호 NP_116173.2(서열번호 1)하에 데이터베이스에 기탁되어 있다. 마우스 R-스폰딘3 단백질의 예시적 서열은 수탁 번호 NP_082627.3(서열번호 2)하에 데이터베이스에 기탁되어 있다. 인간 R-스폰딘2 단백질의 예시적 서열은 수탁 번호 NP_848660.3(서열번호 3)하에 데이터베이스에 기탁되어 있다. 마우스 R-스폰딘2 단백질의 예시적 서열은 수탁 번호 NP_766403.1(서열번호 4)하에 데이터베이스에 기탁되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "R-스폰딘3"은, 이러한 기능적 변이체가 본 발명의 목적을 위한 분화 인자의 유리한 특성을 보유하는 조건에서, R-스폰딘3 야생형(천연 존재) 단백질의 임의의 기능적 변이체도 포함한다. 한 가지 실시형태에서, 상기 기능적 변이체는, 가장 밀접하게 관련된 공지된 천연 R-스폰딘3 폴리펩타이드 서열, 예를 들면, 각각 서열번호 1 또는 서열번호 2의 인간 또는 마우스 폴리펩타이드 R-스폰딘3과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖고 관련된 야생형 단백질과 동일한 Wnt 활성화 활성을 실질적으로 보유하는, R-스폰딘3의 기능적 동족체이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 기능적 변이체는, 예를 들면, 야생형 R-스폰딘3 단백질의 적어도 50, 100 또는 200개 연속 아미노산을 포함하고 동일한 Wnt 활성화 활성을 실질적으로 보유하는, R-스폰딘3의 단편이다. 또 다른 실시형태에서, 이러한 기능적 변이체는, 참조 Q9BXY4-2 및 CAI20142.1(서열번호 5)에 기재된 바와 같이, 인간 R-스폰딘3의 이소형 2 등의 R-스폰딘3 유전자 생성물 이소형으로 이루어질 수 있다. 이러한 문맥에서, "실질적으로"는 바람직하게는 이러한 기능적 변이체의 활성이, 이것이 유도되는 야생형 또는 천연 존재 분자의 활성의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%인 것을 의미한다. 이러한 문맥에서, 이것이 유도되는 야생형 또는 천연 존재 분자의 활성은 바람직하게는 Wnt 신호전달 경로를 활성화하는 활성을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "R-스폰딘2"는 또한, 이러한 기능적 변이체가 본 발명의 목적을 위한 분화 인자의 유리한 특성을 보유한다는 조건에서, R-스폰딘2 야생형(천연 존재) 단백질의 임의의 기능적 변이체를 포함한다. 한 가지 실시형태에서, 상기 기능적 변이체는, 가장 밀접하게 관련된 공지된 천연 R-스폰딘2 폴리펩타이드 서열, 예를 들면, 각각 서열번호 3 또는 서열번호 4의 인간 또는 마우스 폴리펩타이드 R-스폰딘2와 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖고 관련된 야생형 단백질과 동일한 Wnt 활성화 활성을 실질적으로 보유하는 R-스폰딘2의 기능적 동족체이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 기능적 변이체는, 예를 들면, 야생형 R-스폰딘2 단백질의 적어도 50, 100 또는 200개 연속 아미노산을 포함하고 동일한 Wnt 활성화 활성을 실질적으로 보유하는, R-스폰딘2의 단편이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 기능적 변이체는, 예컨대, 각각 참조 Q6UXX9-2(서열번호 6) 또는 참조 Q6UXX9-3(서열번호 7)하에 기재된, 인간 R-스폰딘2의 이소형 2 또는 이소형 3 등의 R-스폰딘2 유전자 생성물 이소형으로 이루어질 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 a)에 사용된 활성제는 R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 2의 조합이다. 한 가지 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 a)에 사용된 활성제는 서열번호 5의 인간 R-스폰딘-3 이소형 2일 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 a)에 사용된 활성제는 서열번호 6의 인간 R-스폰딘-2 이소형 2 또는 서열번호 7의 인간 R-스폰딘-2 이소형 3일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 적절한 양의 약리학적 GSK-3β 억제제, 예를 들면, 화학적 화합물 CHIR99021 또는 이의 등가물을 세포 환경에 직접 도입하는 것은, 단독으로 또는 R-스폰딘과 조합하여, 시스템에서 Wnt 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 대안으로 사용된다. CHIR99201의 등가물은 문헌[참조: Huang et al 2017]에 기재된 CHIR98014이다.
본원에 사용된 바와 같이, "글리코겐 신타제 키나제 3β"의 용어 "GSK-3β"는, 특정 세포 기질 상의 특정 세린 및 트레오닌 아미노산 상의 포스페이트 분자의 부가를 매개하는 세린/트레오닌 단백질 키나제를 나타낸다. GSK-3β의 억제제가 Wnt 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있다는 것은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: Cohen and Goedert, 2004; Sato et al., 2004; Taelman et al., 2010; Wu and Pan, 2010]을 참조한다.
바람직한 실시형태에서, GSK-3β의 억제제는 CHIR99021 또는 이의 등가물이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유도 근축 중배엽 전구세포 세포" 또는 "iPAM"은, 임의의 세포 유형에서 유래하지만 근축 중배엽의 전구세포 세포의 특징을 나타내는 세포를 지칭한다. 한 가지 실시형태에서, iPAM 세포는 하기 특성을 특징으로 한다:
a) 이들은 근축 중배엽 전구세포 세포의 바이오마커 특징, 예컨대, Tbx6, EphrinA1, EphrinB2, EPHA4, PDGFR알파, Sall1, Sall4, Dll1, Dll3, Papc(Pcdh8), Lfng, Hes7, Ripply1, Ripply2, Brachyury(T), Cdx2, Cdx4, Evx1, Cxcr4, Ill7rd, Fgf8, Fgf17, Gbx2, Wnt3a, Wnt5b, Rspo3, SP5, SP8, Has2, Dkk1, Dact1, Pax3, Pax7, Mesp1, Mesp2 또는 Msgn1 유전자, 우선적으로는, 예를 들면, Msgn1 프로모터를 포함하는 유전자 리포터 검정으로 측정할 때에 Msgn1 유전자(Chal J et al 2015)을 발현하고;
b) 이들은, 적어도 골격, 진피 또는 근세포 계열로 분화할 수 있는 다능성 세포이고;
c) 임의로, 이들은 장기간 자가-재생 특성을 가질 수 있고, 예를 들면, 이들은 6개월 이상 배양에서 유지될 수 있다.
상기 유도 근축 중배엽 전구세포(iPAM) 세포의 다능성은, 예를 들면, WO 2013/030243에 정의된 프로토콜을 사용하여, 예를 들면, 골격, 진피 또는 근세포 계열로의 시험관내 분화에 의해 시험관내에서 시험될 수 있다. 본 발명에서, 본 발명자들은 이들 iPAM 세포가 BAP 및 BA 세포로 분화할 수 있음을 입증했다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "다능성"은, 환경 및 배양 조건에 따라 하나 이상의 세포 계통으로 분화할 수 있는 세포를 지칭한다. 다능성이고 모든 종류의 체세포 계통으로 분화할 수 있는 유도 및 배야 줄기 세포와는 대조적으로, 본 발명의 유도 근축 중배엽 전구세포 세포는 제한된 분화 능력을 갖는다.
한 가지 실시형태에서, 단계 a)에서 다능성 세포의 배양에 사용되는 R-스폰딘3의 농도는 0.1ng/ml 내지 500ng/ml, 바람직하게는 1ng/ml 내지 500ng/ml 및 보다 바람직하게는 5ng/ml 내지 30ng/ml이다.
한 가지 실시형태에서, 단계 a)에서 다능성 세포의 배양에 사용되는 R-스폰딘2의 농도는 1ng/ml 내지 500ng/ml, 바람직하게는 5ng/ml 내지 30ng/ml이다. 한 가지 실시형태에서, R-스폰딘3 또는 R-스폰딘2의 농도는 약 10ng/ml 또는 10ng/ml이다. 10ng/ml의 농도에서는, 유도 근축 중배엽 전구세포(iPAM) 세포에서 다능성 세포의 50% 초과, 최대 70%까지가 분화된다.
한 가지 실시형태에서, 다능성 세포는 R-스폰딘3 또는 R-스폰딘2와 함께 1 내지 15일간 또는 보다 짧은 기간 동안 배양된다. 특정 실시형태에서, 다능성 세포는 R-스폰딘3 또는/및 R-스폰딘2와 함께 적어도 10일 동안 10ng/ml의 농도로 배양된다.
한 가지 실시형태에서, CHIR99021의 농도는 1 내지 5μM 또는 2 내지 4μM 또는 3μM이다.
바람직한 실시형태에서, 단계 a)의 배양 배지는 골 형태형성 단백질(BMP) 신호전달 경로의 억제제 및 임의로 DMSO를 추가로 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "BMP 신호전달 경로의 억제제"(또한 달리 명시하지 않는 한 "억제제")는, BMP(골 형태형성 단백질) 신호전달 경로의 활성화 저하를 야기하는 천연 또는 합성의 임의의 화합물을 나타내고, 이는 BMP 유형 I 및 유형 II 수용체로 구성되는 헤테로복합체에 대한 이량체 BMP 단백질의 결합을 특징으로 하고, Smad1/5/8의 포스포릴화를 유도하는 포스포릴화 캐스케이드를 야기하고, 표적 유전자 활성화, 예컨대, Id 유전자를 야기한다. 전형적으로, BMP 신호전달 경로의 억제제는 단백질 Smad 1, 5 및 8의 포스포릴화 수준의 저하를 야기한다[참조: Gazzero and Minetti, 2007].
당업자는, 소정 화합물이 BMP 신호전달 경로의 억제제인지를 평가하는 방법을 알고 있다. 전형적으로, 상기 화합물의 존재하에서 세포를 배양한 후, 상기 화합물의 부재하에서 배양된 세포와 비교하여 포스포릴화된 Smad 1, 5 또는 8의 수준이 저하되는 경우, 화합물은 BMP 신호전달 경로의 억제제인 것으로 간주된다. 포스포릴화된 Smad 단백질의 수준은, 상기 Smad 단백질의 포스포릴화된 형태에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 측정할 수 있다. 저하는 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상의 것일 수 있다.
표적 유전자 활성화, 예컨대, Id 유전자는 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)을 통해 직접 Id1/2/3 전사물(mRNA) 생성에 의해 통상 측정될 수 있고, 발현 수준은 상기 화합물의 부재하에 대조군 상황과 비교할 수 있다.
BMP 신호전달 경로의 억제제는, BMP 길항제, BMP 유형 I 및/또는 유형 II 수용체 활성(BMP 유형 I/II 수용체 억제제)를 차단하는 화학적 화합물, BMP 유형 I 및/또는 유형 II 유전자 발현의 억제제, 또는 BMP 신호전달 경로의 임의의 하류 단계를 억제하는 분자일 수 있다. BMP 신호전달의 억제제는 천연 또는 합성 화합물일 수 있다. BMP 신호전달 경로의 억제제가 단백질인 경우, 이는 정제된 단백질 또는 재조합 단백질 또는 합성 단백질일 수 있다.
한 가지 실시형태에서, BMP 신호전달 경로의 억제제는 BMP 유형 I 수용체 억제제이다.
재조합 단백질을 생산하는 다수의 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 당업자는, 소정 단백질의 서열 또는 상기 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 지식으로부터, 표준 분자 생물학 및 생화학 기술을 사용하여 상기 단백질을 용이하게 생성할 수 있다.
본 발명의 한 가지 실시형태에서, BMP 신호전달 경로의 억제제는 노긴, 코르딘 및 관련된 단백질(코르딘-유사 1/2/3), 폴리스타틴 및 관련된 단백질(폴리스타틴-유사 1/2/3/4/5), Dan 계열의 단백질(세르베루스1, 그렘린 1 및 2, Cerl-2(Coco), SOST(Sclerostin), SOSTDC1(Wise)을 포함) 및 BMP 신호전달 경로를 억제하는 이의 변이체 및 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, BMP 신호전달 경로의 억제제는 BMP-1/톨로이드-유사 단백질, TWSG1(트위스트된 낭배형성), TMEFF(Tomoregulins), Biglycan, TSK(Tsukushi), BMPER(Crossveinless 2), Ogon(Sizzled), AMN(Amnionless), CTGF(Connective Tissue Growth Factor), 및 HSPG(Glypican3 및 Syndecan4를 포함)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, BMP 신호전달 경로의 억제제는 노긴이다. 노긴은 포유동물 노긴, 바람직하게는 뮤린 노긴(GenPept 수탁 번호 NP_032737에 의해 예시된 마우스 노긴, 서열번호 10) 또는 인간 노긴(GenPept 수탁 번호 EAW94528에 의해 예시된 인간 노긴, 서열번호 11)일 수 있다. 이는 정제된 것이거나 재조합체일 수 있다. 이는 단량체 또는 이량체 형태일 수 있다.
한 가지 실시형태에서, BMP 신호전달 경로의 억제제는 BMP 신호전달 형질도입 캐스케이드를 억제하는 화합물이다. 한 가지 실시형태에서, BMP 신호전달 형질도입 캐스케이드를 억제하는 화합물은 합성 또는 화학적 화합물이다.
또 다른 실시형태에서, BMP 신호전달 경로의 억제제는 BMP 유형 I 수용체의 억제제이다. 본원에 사용된 바와 같이, "골 형태형성 단백질"의 용어 "BMP 유형 I 수용체"는, 특정 세포 기질 상의 특정 세린 및 트레오닌 아미노산 상의 포스페이트 분자의 부가를 매개하는 세린/트레오닌 단백질 키나제 활성을 갖는 막관통 단백질을 나타낸다. BMP 유형 I 수용체의 억제제가 BMP 신호전달 경로를 차단할 수 있다는 것은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: Yu BP et al, 2008]을 참조한다. 바람직한 실시형태에서, BMP 유형 I 수용체의 억제제는 도르소모르핀, 구조-활성 연구에 의해 생성된 화학적 화합물 또는 임의의 유도체이다[참조: Cuny GD et al., 2008]. 화합물 C)로서 또한 공지된 도르소모르핀 (6-[4-(2-피페리딘-1-일-에톡시)페닐]-3-피리딘-4-일-피라졸로[1,5-a]피리미딘은 BMP 유형 I 수용체(ALK2, 3, 및 6)를 특이적으로 억제한다[참조: Yu PB et al., 2008]. 바람직한 억제제 또는 BMP 수용체는 LDN193189이다. LDN193189는 BMP 유형 I 수용체 Alk2 및 Alk3의 억제제이다.
재조합 노긴은 R&D 시스템즈 또는 Peprotech로부터 구입할 수 있거나, 상기 기재된 표준 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
전형적으로, BMP 신호전달 경로의 억제제는 본 발명의 방법의 단계 a)의 배양 배지에 1 내지 10000ng/ml, 바람직하게는 5 내지 1000ng/ml, 바람직하게는 5 내지 500ng/ml, 바람직하게는 10 내지 200ng/ml, 보다 더 바람직하게는 약 200ng/ml의 농도로 첨가된다.
전형적으로, 노긴은 본 발명의 방법의 단계 a)의 배양 배지에 1 내지 1000ng/ml, 바람직하게는 10 내지 200ng/ml, 보다 더 바람직하게는 약 200ng/ml 또는 200ng/ml 범위의 농도로 첨가된다.
전형적으로, 도르소모르핀은 본 발명의 방법의 단계 a)의 배양 배지에 0.1 내지 2μM, 바람직하게는 1μM 범위의 농도로 첨가된다.
LDN193189의 농도는 300 내지 600nM 또는 400 내지 500nM 또는 약 500nM 또는 500nM일 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 다능성 세포는 BMP 신호전달 경로의 억제제와 함께 1 내지 4일간 배양된다.
한 가지 실시형태에서, 단계 a)의 배양 배지는 다능성 세포의 유도 근축 중배엽 전구세포(iPAM) 세포로의 분화를 개선하기 위해 본 발명에 따르는 Wnt 활성제 및 BMP 신호전달 경로의 억제제를 포함한다.
한 가지 실시형태에서, 이 방법은
a) Wnt 신호전달 경로가 표준(canonical) Wnt/베타 카테닌 신호전달 경로 및/또는 Wnt/PCP 신호전달 경로이고,
b) 억제제 또는 BMP 신호전달 경로가 노긴, 코르딘, 코르딘-유사 1-3, 폴리스타틴, 폴리스타틴-유사 1-5, Dan 계열의 멤버 및 이의 변이체 및 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택되도록 하는 것이다.
한 가지 실시형태에서, Wnt 활성제는 R-스폰딘3이고, BMP 신호전달 경로의 억제제는 노긴이다.
또 다른 실시형태에서, 단계 a)에 사용되는 배양 배지는, 다능성 세포의 유도 근축 중배엽 전구세포(iPAM) 세포로의 분화를 추가로 개선하기 위해 DMSO(디메틸 설폭사이드) 또는 DMSO의 등가물을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "등가물"은, 극성 및 비극성 화합물 둘 다를 용해하는 용매인 DMSO와 동일한 특성을 나타내는 물질을 의미한다.
한 가지 실시형태에서, 단계 a)에 사용되는 배양 배지는 다능성 세포의 유도 근축 중배엽 전구세포(iPAM) 세포로의 분화를 개선하기 위해 R-스폰딘 3, 노긴 및 DMSO를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 단계 a)에 사용되는 배양 배지는 다능성 세포의 유도 근축 중배엽 전구세포(iPAM) 세포로의 분화를 개선하기 위해 R-스폰딘 3 및 DMSO를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 단계 a)에 사용되는 배양 배지는 다능성 세포의 유도 근축 중배엽 전구세포(iPAM) 세포로의 분화를 개선하기 위해 R-스폰딘 2, 노긴 및 DMSO를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 단계 a)에 사용되는 배양 배지는 다능성 세포의 유도 근축 중배엽 전구세포(iPAM) 세포로의 분화를 개선하기 위해 R-스폰딘 2 및 DMSO를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 단계 a)에 사용되는 배양 배지는 다능성 세포의 유도 근축 중배엽 전구세포(iPAM) 세포로의 분화를 개선하기 위해 R-스폰딘 3, 도르소모르핀 및 DMSO를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 단계 a)에 사용되는 배양 배지는 다능성 세포의 유도 근축 중배엽 전구세포(iPAM) 세포로의 분화를 개선하기 위해 R-스폰딘 2, 도르소모르핀 및 DMSO를 포함한다.
여전히 또 다른 실시형태에서, 단계 a)에 사용되는 배양 배지는 다능성 세포의 유도 근축 중배엽 전구세포(iPAM) 세포로의 분화를 개선하기 위해 R-스폰딘 3, R-스폰딘 2, 노긴 및 DMSO를 포함한다.
여전히 또 다른 실시형태에서, 단계 a)에 사용되는 배양 배지는 다능성 세포의 유도 근축 중배엽 전구세포(iPAM) 세포로의 분화를 개선하기 위해 R-스폰딘 3, R-스폰딘 2 및 DMSO를 포함한다.
여전히 또 다른 실시형태에서, 단계 a)에 사용되는 배양 배지는 다능성 세포의 유도 근축 중배엽 전구세포(iPAM) 세포로의 분화를 개선하기 위해 R-스폰딘 3, R-스폰딘 2, 도르소모르핀 및 DMSO를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 시스템 내의 R-스폰딘 인자의 활성을 증가시키기 위해 하기 대안을 사용할 수 있다:
1. 상기 R-스폰딘 인자 또는 변형된 형태의 R-스폰딘을 코딩하는(encoding) 유전자의 내인성 발현을 증강시키는 것,
2. 조절 서열에 작동적으로 연결된 R-스폰딘 인자의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 분화되는 다능성 세포에 도입하거나 R-스폰딘 인자의 RNA를 코딩하는 세포에 도입함으로써 상기 R-스폰딘 인자의 이소성 발현을 가능하게 하는 것,
3. 적절한 양의 R-스폰딘 인자를, 예를 들면, 배양 배지 또는 조절된 배지 중의 재조합 R-스폰딘 인자(R-스폰딘1, 2, 3 또는 4의 계열)로서 또는 기질 코팅으로서 세포 환경에 직접 도입하는 것,
4. 상기 표적 세포에서 R-스폰딘 인자 신호전달에 관여하는 유전자의 내인성 발현을 활성화 또는 억제하는 것; 또는
5. R-스폰딘 인자 발현 수준의 조절, 성숙 및 상기 표적 세포에서 전체적 조절에 관여하는 단백질을 과발현하는 것.
한 가지 실시형태에서, 단계 a)의 배양 배지는 다능성 세포의 유도 근축 중배엽 전구세포(iPAM) 세포로의 분화를 개선하기 위해 CHIR99021, 및 도르소모르핀인 본 발명에 따르는 BMP 신호전달 경로의 억제제를 포함한다.
한 가지 실시형태에서, 단계 a)의 배양 배지는 다능성 세포의 유도 근축 중배엽 전구세포(iPAM) 세포로의 분화를 개선하기 위해 CHIR99021, 도르소모르핀 및 DMSO를 포함한다.
한 가지 실시형태에서, 단계 a)의 배양 배지는 다능성 세포의 유도 근축 중배엽 전구세포(iPAM) 세포로의 분화를 개선하기 위해 R-스폰딘2, R-스폰딘3 및 CHIR99021의 조합인 Wnt 활성제; 및 노긴 및 도르소모르핀의 조합인 BMP 신호전달의 억제제를 포함한다.
여전히 또 다른 실시형태에서, 단계 a)의 배양 배지는 다능성 세포의 유도 근축 중배엽 전구세포(iPAM) 세포로의 분화를 개선하기 위해 R-스폰딘 3, R-스폰딘 2, CHIR99021, 도르소모르핀 및 DMSO를 포함한다.
여전히 또 다른 실시형태에서, 단계 a)의 배양 배지는 다능성 세포의 유도 근축 중배엽 전구세포(iPAM) 세포로의 분화를 개선하기 위해 R-스폰딘 3, R-스폰딘 2, CHIR99021, 노긴 및 DMSO를 포함한다.
여전히 또 다른 실시형태에서, 단계 a)의 배양 배지는 CHIR99021 및 LDN-193189을 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서도, 단계 a)의 배양 배지는 CHIR99021(3μM) 및 LDN-193189(500nM)을 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어진다.
바람직한 실시형태에서, 활성제는 R-스폰딘 계열의 멤버이다.
또 다른 실시형태에서, 활성제는 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 활성제는 R-스폰딘 2 또는 R-스폰딘 3이다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 활성제는 GSK-3β의 억제제, 예컨대, CHIR99021이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명에 따르는 억제제는 BMP/TGF베타 계열의 분비된 길항제이다.
또 다른 실시형태에서, BMP 신호전달 경로의 억제제는 노긴, 코르딘, 코르딘-유사 1/2/3, 폴리스타틴, 폴리스타틴-유사 1/2/3/4/5, 세르베루스 1, 그렘린 1/2를 포함하는 Dan 계열의 멤버로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직한 실시형태에서, 억제제는 노긴 또는 폴리스티틴이다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 억제제는 BMP 신호전달의 화학적 억제제, 예컨대, 도르소모르핀이다.
단계 a)의 기간은 적절한 양의 iPAM 세포 또는 iPAM 세포 모집단이 수득되는 한 중요하지 않다. 기간은 또한 BMP 억제제의 존재 및 DMSO의 존재에 따라 또한 달라질 수 있다. 통상적으로, 단계 a)의 기간은 3 내지 12일 또는 4 내지 11일 또는 5 내지 10일 또는 6 내지 9일의 범위일 수 있거나, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12일일 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 다능성 세포, 바람직하게는 iPS, 보다 바람직하게는 hiPS 세포는 트립신을 사용하여 단일 세포로 분리되고, 3.104 내지 9.104 세포/cm2 범위의 밀도로 씨딩된다. 바람직한 밀도는 5.5.104 세포/cm2이다. 배양은 Rock-1 억제제(10μM)가 보충된 mTESR-1 배지에서 마트리겔-코딩된 접시에서 수행할 수 있다. 1일 후, 배지는 Rock-1 억제제의 부재하에 신선한 mTESR-1로 교환할 수 있다. 배지(바람직하게는 ITS(1%)가 보충된 DMEM)에는 3일로부터 FGF-2(20ng/ml)가 보충될 수 있다. 배지는 6일까지 매일 갱신할 수 있다.
근축 중배엽 전구세포 세포의 유일한 특이적 마커는 Msgn1이다[참조: Yoon JK et al 2015]. Msgn1의 발현은, 본 출원의 맥락에서 적용되는 제목 정의의 부분에서 설명된 바와 같이 평가할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, Msgn1 유전자는 메소게닌1을 코딩하는 유전자를 지칭한다. 본 발명의 문맥에서, Msgn1 유전자는 Msgn1을 코딩하는 포유동물 유전자, 바람직하게는 뮤린 또는 인간 유전자를 지칭한다. 마우스 및 인간에서 메소게닌1을 코딩하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 예는 각각 서열번호 8(NM_019544.1) 및 서열번호 9(NM_001105569.1)에 제공되어 있다.
한 가지 실시형태에서, Msgn1은, 발현이 유전자 발현의 정량적 검정으로 검출가능한 경우, 발현되는 것으로 간주된다. 또 다른 실시형태에서, Msgn1은, 발현 수준이 본래 다능성 세포, 또는 마우스 다능성 세포의 LIF(백혈병 억제 인자) 부재하 또는 인간 다능성 세포의 FGF(섬유아세포 성장 인자) 부재하에 비특이적 조건, 예컨대, 기초 배양 배지의 부재하에 분화하는 세포에서 관찰된 발현 수준보다 현저히 더 높은 경우에 발현되는 것으로 간주된다. 대조군 및 시험 세포 사이의 발현 수준은 구조적으로 발현된 유전자, 예컨대, GAPDH 또는 베타 액틴을 사용하여 정규화할 수 있다.
근축 중배엽 전구세포 세포의 다른 바이오마커 특징은, 제한 없이, 하나 이상의 하기 단백질: Tbx6, EphrinA1, EphrinB2, EPHA4, PDGFR알파, Sall1, Sall4, Dll1, Dll3, Papc(Pcdh8), Lfng, Hes7, Ripply1, Ripply2, Brachyury(T), Cdx2, Cdx4, Evx1, Cxcr4, Ill7rd, Fgf8, Fgf17, Gbx2, Wnt3a, Wnt5b, Rspo3, SP5, SP8, Has2, Dkk1, Dact1, Pax3, Pax7, Mesp1, Mesp2를 포함한다.
이들 iPAM 모집단은, 전형적으로, iPAM 세포에 추가하여 다른 세포 유형을 포함할 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 단계 a)의 종료시에 수득되는 모집단은 이들이, iPAM 세포의 적어도 하나의 바이오마커 특징, 예를 들면, Msgn1을 발현하는 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 및 바람직하게는 적어도 90%를 포함한다는 것을 특징으로 한다. 상기 마커의 존재 또는 발현의 평가는 바람직하게는 본 발명의 문맥에서 적용되는 제목 정의의 부분에서 설명된 바와 같이 수행할 수 있다.
iPAM 세포를 포함하는 모집단은 적절한 성장 조건하에서 무기한으로 배양할 수 있다.
iPAM 세포의 특이적 마커를 발현하는 세포를 선택함으로써 iPAM 세포를 정제하거나 모집단을 iPAM 세포로 농후화시킬 수 있다. 한 가지 실시형태에서, iPAM 세포의 모집단의 정제 또는 농후화를 위한 iPAM 세포에 특이적인 마커는 Msgn1일 수 있다.
정제 또는 iPAM 세포 농후화(enrichment)는 세포 선별 기술, 예컨대, iPAM 세포의 상기 세포 표면 마커의 특이적 결합제를 포함하는 형광 활성화된 세포 선별(FACS) 또는 자기 비드, 또는 iPAM 마커의 형광 리포터를 사용하여 달성할 수 있다.
따라서, 정제 또는 농후화 후, 모집단은 iPAM 세포의 바이오마커 특징, 예를 들면, Msgn1을 발현하는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 또는 95% 이상의 세포를 포함할 수 있다.
단계 b
단계 a)의 종료시에 수득된 iPAM 세포를 포함하는 IPAM 세포 또는 모집단은 후속적으로 근원성 배양 배지에서 배양시킨다. 상기한 바와 같이, 단계 a)의 종료시에 수득된 세포는 최초로 iPAM 세포의 존재에 대해 추가로 농후화 또는 정제할 수 있다.
본원에 사용되는 근원성 배양 배지는, 근육 세포 및/또는 근육 세포의 전구세포의 생성을 촉진, 자극, 유도하는 배양 배지이다. 근육 세포의 전구세포의 마커는 Pax7일 수 있다(Zammit, et al 2006). 초기의 근육 세포의 마커는 데스민 또는 미오게닌일 수 있다(Paulin et al 2004, Buckingham et al 2014). 성숙 근육 세포의 마커는 알파 액티닌일 수 있다(Beggs et al 1992). 이들 마커 각각의 발현은 본 출원의 문맥에서 적용되는 제목 정의의 부분에서 설명된 바와 같이 평가할 수 있다.
근원성 배양 배지는 배양 배지, 혈청 또는 이의 등가물(바람직하게는 KSR), BMP 수용체의 억제제, c-MET 수용체의 활성제 및 IGF 또는 인슐린 수용체의 활성제를 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어질 수 있다.
본 출원의 문맥에서 배양 배지는 포유동물 세포를 배양하기에 적절한 배지이다. 적절한 배양 배지는 당업자에게 공지되어 있고, DMEM, RPMI 1640, MEM, Ham's F12, IMDM, 레이보비츠 배지 Medium 199를 포함한다. 바람직한 배양 배지는 DMEM이다.
혈청은 소 혈청일 수 있다. 바람직한 소 혈청은 소태아 혈청이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 혈청의 등가물은 문헌[참조: Chal et al 2015]에 기재된 바와 같은 KSR(녹아웃 혈청 치환)이다. 바람직한 억제제 또는 BMP 수용체는 LDN193189이다. LDN193189는 BMP 유형 1 수용체 Alk2 및 Alk3의 억제제이다. c-MET 수용체의 바람직한 활성제는 HGF(간세포 성장 인자)이다. IGF 또는 인슐린 수용체의 바람직한 활성제는 IGF-1(인슐린 성장 인자-1)이다.
제1 실시형태에서, 근원성 배양 배지는 배양 배지, 혈청 또는 이의 등가물(바람직하게는 KSR), BMP 수용체의 억제제(바람직하게는 LDN193189), c-MET 수용체의 활성제(바람직하게는 HGF) 및 IGF 또는 인슐린 수용체의 활성제(바람직하게는 IGF1)을 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어진다. 이러한 제1 실시형태에서 바람직한 근원성 배양 배지는 배양 배지, KSR, LDN193189, HGF 및 IGF-1을 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어진다.
제2 실시형태에서, 근원성 배양 배지는 배양 배지, 혈청 또는 이의 등가물(바람직하게는 KSR), c-MET 수용체의 활성제(바람직하게는 HGF) 및 IGF 또는 인슐린 수용체의 활성제(바람직하게는 IGF1)를 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어진다. 이러한 제2 실시형태에서 바람직한 근원성 배양 배지는 배양 배지, KSR, HGF 및 IGF-1을 포함한다.
제3 실시형태에서, 근원성 배양 배지는 배양 배지, 혈청 또는 이의 등가물(바람직하게는 KSR) 및 IGF 또는 인슐린 수용체의 활성제(바람직하게는 IGF1)를 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어진다. 이러한 제3 실시형태에서 바람직한 근원성 배양 배지는 배양 배지, KSR 및 IGF-1을 포함한다.
바람직한 단계 b)에서, 제1 실시형태의 근원성 배양 배지가 먼저 사용되고, 이어서 제3 실시형태의 근원성 배양 배지가 사용되고, 이어서 제2 실시형태의 근원성 배양 배지가 사용된다. 제1 실시형태의 근원성 배양 배지에서의 배양은 1 내지 3일 또는 2일의 기간을 가질 수 있다. 제3 실시형태의 근원성 배양 배지에서의 배양은 3 내지 6일 또는 4 내지 5일 또는 4일의 기간을 가질 수 있다. 제2 실시형태의 근원성 배양 배지에서의 배양은 8 내지 12일 또는 9 내지 11일 또는 10일의 기간을 가질 수 있다.
바람직한 방법에서, 단계 b)는, 배양 배지, KSR, LDN193189, HGF 및 IGF-1을 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어지는 근원성 배양 배지를 사용하여 수행한다.
바람직한 농도는 하기의 것이다; 5 내지 10%의 소 혈청 또는 소태아 혈청(fetal bovine serum), 8 내지 20% 또는 10 내지 18% 또는 12 내지 16% 또는 13 내지 16% 또는 14 내지 16% 또는 15%의 KSR. LDN193189의 바람직한 농도는 300 내지 600nM 또는 400 내지 500nM 또는 약 500nM 또는 500nM이다. HGF의 농도는 8 내지 12ng/ml 또는 9 내지 11ng/ml 또는 약 10ng/ml 또는 10ng/ml일 수 있다. IGF-1의 농도는 0.8 내지 4ng/ml 또는 1 내지 3ng/ml 또는 1.5 내지 2.5ng/ml 또는 약 2ng/ml 또는 2ng/ml일 수 있다.
이러한 제1 실시형태에서 바람직한 근원성 배양 배지는 배양 배지, KSR(15%), LDN193189(500nM), HGF(10ng/ml) 및 IGF-1(2ng/ml)을 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어진다.
단계 b)의 기간은 중요하지는 않다. 기간은 또한 단계 b)의 개시시에 사용되는 iPAM 세포의 수 및/또는 근원성 배양 배지에 존재하는 성분의 동일성에 따라 달라질 수 있다. 통상, 단계 b)의 기간은 2 내지 18일, 3 내지 18일 또는 4 내지 17일 또는 5 내지 16일 또는 6 내지 16일의 범위일 수 있다.
단계 c)
이 단계는 임의적이다. 이 단계는 단계 b)의 종료시에 수득되는 세포 또는 세포의 모집단을, 혈청 또는 이의 등가물을 포함하고 추가로 FGF2(섬유아세포 성장 인자 2) 또는 이의 등가물을 임의로 포함하는 배양 배지에서 배양하는 것을 포함한다. FGF2(섬유아세포 성장 인자 2)는 bFGF(기본 섬유아세포 성장 인자)와 동일하다. 세포가 근육 경로를 향해 분화하는 것을 유발하는 근원성 배양 배지가 더이상 존재하지 않기 때문에, 이 단계는 존재하는 BAP 세포의 수를 증가시키거나 BAP 세포의 수를 농후화시키는 것을 목적으로 한다.
혈청은 소 혈청, 바람직하게는 소태아 혈청일 수 있다. 혈청은 5 내지 10%, 바람직하게는 10% 존재할 수 있다. 혈청의 등가물을 KSR이다.
임의로, 단계 c)에서 FGF2 또는 이의 등가물이 존재할 수 있다. 이는 단계 c)가 FGF2의 존재 없이 수행될 수 있음을 의미한다.
FGF2의 농도는 3 내지 7ng/ml 또는 4 내지 6ng/ml 또는 약 5ng/ml 또는 5ng/ml일 수 있다. KSR의 농도는 단계 b)와 동일할 수 있다.
단계 c)의 기간은 중요하지는 않다. 기간은 또한 단계 c)의 개시시에 사용되는 근원성 세포의 수 및/또는 단계 b)의 근원성 배양 배지에 존재하는 성분의 동일성 및/또는 단계 b)의 기간에 따라 달라질 수 있다. 통상, 단계 c)의 기간은 3 내지 15일 또는 4 내지 15일, 또는 5 내지 15일 또는 6 내지 15일 또는 3 내지 12일 또는 4 내지 11일 또는 5 내지 10일 또는 3 내지 9일 또는 4 내지 8일 또는 5 내지 7일 또는 6일의 범위일 수 있다.
배지는 2일마다 갱신할 수 있다.
단계 d)
단계 d)에서, 단계 b) 또는 c)의 종료시에 수득되는 세포 또는 세포의 모집단은 상기 세포 또는 상기 세포의 모집단을 계대배양하고 이들을 배양 접시에 씨딩함으로써 추가로 배양할 수 있다. 세포의 씨딩에 사용되는 밀도는 조직 배양 등급 플레이트 상에서 3.104 내지 9.104 세포/cm2 범위일 수 있고, 바람직하게는 세포 밀도는 5.104 세포/m2이다.
단계 b) 또는 c)의 종료시에 수득되는 세포 또는 세포 모집단은 일부 BAP 세포를 이미 포함할 수 있다. 단계 d)는 이들을 추가로 농후화 및 확장하기 위한 것이다. 단계 d)의 배양 배지는 특정 분화의 임의의 드라이버를 포함하지 않을 수 있다. 단계 d)의 배양 배지는 배지, 예컨대, 본원에 이미 수록된 것들을 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어질 수 있다. DMEM은 세포의 증식을 촉진 또는 용이하게 하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 근원성 또는 지방생성 분화를 유도하는 화합물은 단계 d)의 배지에 존재하지 않을 수 있다. 통상, 이 배지는 DMEM, 글루코즈, 혈청 또는 이의 등가물 및 FGF2 또는 이의 등가물을 포함할 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 소 혈청이 상기 배지에 존재한다. 한 가지 실시형태에서, 소태아 혈청이 상기 배지에 존재한다. 한 가지 실시형태에서, KSR는 혈청의 등가물로부터 사용된다. 한 가지 실시형태에서, 5 내지 10% 소 혈청 또는 소태아 혈청이 상기 배지에 존재한다. KSR의 농도는 단계 b)에서 정의된 것들과 동일할 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 3 내지 8ng/ml 또는 4 내지 7 또는 4 내지 6 또는 5ng/ml FGF2가 상기 배지에 존재한다. 한 가지 실시형태에서, 글루코즈는 0.5 내지 6g/L, 또는 0.8 내지 5g/L 또는 1 내지 4.5g/l 존재한다. 바람직하게는 글루코즈는 1g/L으로 존재한다.
단계 d)에서 BAP 세포의 농후화 및 확장은 수득된 세포 모집단의 균질성을 평가함으로써 모니터링할 수 있다. 균질성은 세포의 형태, 세포의 증식 능력 및/또는 소정 마커의 발현과 관련하여 평가될 수 있다. 균질한 세포 모집단의 바람직한 형태는, 방추형을 의미하는 섬유아세포-유사 형태이다. 형태는 현미경하에 관찰할 수 있다.
또한, 바람직한 실시형태에서, 균질한 세포 모집단은 24 내지 72시간 이내에 90 내지 100% 컨플루언스(confluence)에 도달할 때까지 고도로 증식한다. 통상, 컨플루언트 세포 또는 컨플루언트로 되는 세포(90 내지 100% 컨플루언트)가 50 000 세포/cm2의 밀도로 배양 접시에 씨딩된다. 바람직한 실시형태에서, 세포 모집단은, 24 내지 72시간 이내에 컨플루언스에 도달하는 경우, 균질하고 매우 증식성인 것으로 한다.
단계 d)의 기간은 중요하지는 않다. 기간은 또한 단계 c)의 개시시에 사용되는 세포의 수 및/또는 근원성 배양 배지에 존재하는 성분의 동일성에 따라 달라질 수 있다. 단계 d) 동안 계대의 수는 2 내지 10, 3 내지 9 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 계대 또는 최대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 계대의 범위일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 계대의 수는 4 내지 9, 보다 바람직하게는 적어도 4 또는 4이다. 통상, 각 계대는 2 내지 3일의 기간을 갖는다. 통상, 단계 d)의 기간은 3 내지 27일 또는 4 내지 26일 또는 5 내지 25일 또는 8 내지 12일의 범위일 수 있다. 이 기간은 씨딩된 초기 세포의 수에 따라 수정될 필요가 있다.
단계 d)는 단계 b) 또는 c)의 종료시에 수득되는 세포를 계대배양하고 이들을 배양 접시에 씨딩함으로써 BAP 세포를 확장 및 농후화하는 것을 목적으로 한다. BAP 세포 또는 BAP 세포의 모집단은 본원에서 이후에 정의된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 또한, BA 세포를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계:
바람직하게는, 상기 정의된 바와 같은 단계 a), 단계 b), 임의 단계 c) 및 단계 d)를 포함하고, 하기 단계:
e) 선택된 BAP 세포, 바람직하게는 단계 d)의 종료시에 수득가능한 것들을 혈청 또는 이의 등가물을 포함하는 지방생성 배쟝 배지에서 배양하여 BA 세포를 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법에 관한 것이다.
단계 e)
바람직하게는, 단계 d)의 종료시에 수득되거나 수득가능한 세포 또는 바람직하게는 단계 d)의 종료시에 수득되거나 수득가능한 세포의 모집단은 BA 또는 BA 세포의 모집단을 수득하기 위한 지방생성 배양 배지에서 추가로 배양된다.
본원에 사용되는 지방생성 배양 배지는, BA 세포의 생성을 촉진, 자극, 유도하는 배양 배지이다. BA 세포는 지방세포의 특수한 아집단을 나타낸다. BA 세포가 아닌 일부 지방세포는 또한 단계 e)의 종료시에 존재할 수 있다. BA 세포는 UCP1의 발현을 특징으로 한다. 지방세포는 FABP4의 발현을 특징으로 한다. UCP1 및 FABP4의 발현은 본 출원의 문맥에서 적용되는 제목 정의의 기재 부분에서 정의된 바와 같이 평가할 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 단계 e)의 지방생성 배양 배지가 배양 배지, TGF베타/액티빈/NODAL 경로의 억제제(바람직하게는 SB431542), EGF(상피 성장 인자) 수용체의 활성제(바람직하게는 EGF), 아스코르브산, 및 코르티코이드 수용체의 활성제(바람직하게는 하이드로코르티손)을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어지는 방법이 수행된다. 인도메타신은 본원에 정의된 지방생성 배양 배지 중의 어느 하나에 첨가될 수 있다. 이는 이러한 배지에서 통상 사용되는 분자이다. 바람직한 실시형태에서, 단계 e)의 지방생성 배양 배지가 배양 배지, SB431542, EGF, 아스코르브산, 및 하이드로코르티손을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어지는 방법이 수행된다.
제1 실시형태에서, 지방생성 배양 배지는, 배양 배지, TGF-베타/액티빈/NODAL 경로의 억제제(바람직하게는 SB431542), EGF(상피 성장 인자) 수용체의 활성제(바람직하게는 EGF), PPAR감마 활성제(바람직하게는 로시글리타존), 인슐린, T3 호르몬, 아스코르브산, 코르티코이드 수용체의 활성제(즉, 바람직하게는 하이드로코르티손 및 덱사메타손), 및 사이클릭 AMP 및 사이클릭 AMP 포스포디에스테라제의 비-특이적 억제제(바람직하게는 IBMX)을 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어질 수 있다. 바람직한 제1 실시형태에서, 지방생성 배양 배지는 배양 배지, SB431542, EGF, 로시글리타존, 인슐린, T3 호르몬, 아스코르브산, 하이드로코르티손, 덱사메타손 및 IBMX을 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어진다.
제2 실시형태에서, 지방생성 배양 배지는 배양 배지, TGF-베타/액티빈/NODAL 경로의 억제제(바람직하게는 SB431542), EGF(상피 성장 인자) 수용체의 억제제(바람직하게는 EGF), PPAR감마 활성제(바람직하게는 로시글리타존), 인슐린, T3 호르몬, 아스코르브산 및 코르티코이드 수용체의 활성제(바람직하게는 글루코코르티코이드, 보다 바람직하게는 하이드로코르티손)를 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어질 수 있다. 바람직한 제2 실시형태에서, 제2 실시형태의 지방생성 배양 배지는 배양 배지, SB431542, EGF, 로시글리타존, 인슐린, T3 호르몬, 아스코르브산 및 하이드로코르티손을 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어진다.
본 발명의 문맥에서, TGF-베타/액티빈/NODAL 경로의 억제제는 바람직하게는, ALK5, ALK4 및 ALK7을 억제하지만 바람직하게는 BMP 유형 I 수용체 ALK2, ALK3, 및 ALK6을 억제하지 않는 화합물이다. 이러한 바람직한 화합물은 제조업자: Stemcell technologies로부터의 SB431542이다.
본 발명의 문맥에서, PPAR감마 활성제는 티아졸리딘디온 부류로부터의 항-당뇨병 약물일 수 있고, 바람직하게는 로시글리타존(제조업자 Prestwick)이다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 티아졸리딘디온 부류의 화합물은 퍼옥시좀 증식인자-활성화된 수용체(PPAR), 특히 PPAR감마의 세포내 수용체 부류를 활성화시킴으로써 작용한다.
본 발명의 문맥에서, 코르티코이드 수용체는 글루코코르티코이드 수용체 및 미네랄로코르티코이드 수용체를 포함한다. 코르티코이드 수용체의 바람직한 활성제는 글루코코르티코이드, 보다 바람직하게는 하이드로코르티손을 포함한다.
EGF 수용체의 바람직한 활성제는 EGF, 보다 바람직하게는 인간 EGF이다. 인간 EGF는 서열번호 12에 의해 나타내어진다. 한 가지 실시형태에서, hEGR의 기능적 변이체가 사용될 수 있다. 기능적 변이체는, 인간 EGF 서열번호 12와 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖고 관련된 야생형 인간 EGF와 동일한 EGF 수용체 활성화 활성을 실질적으로 보유하는 인간 EGF의 기능적 동족체이다. 이러한 문맥에서, 실질적으로 동일한 활성화 활성은 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%를 의미할 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 제1 및 제2 실시형태의 지방생성 배양 배지는 배양 배지, 예컨대, DMEM(둘베코 변형된 이글 배지, Gibco) 및 혈청 또는 혈청의 등가물을 포함한다. 바람직하게는, 존재하는 혈청은 소 혈청, 보다 바람직하게는 소태아 혈청이다. 보다 더 바람직하게는 5 내지 10%의 소 혈청 및 가장 바람직하게는 10%. 보다 더 바람직하게는 5 내지 10%의 소태아 혈청 및 가장 바람직하게는 10%의 소태아 혈청. 한 가지 실시형태에서, 혈청이 존재하지 않는 경우, KSR을 사용함으로써 이를 치환할 수 있다. KSR의 바람직한 농도는 본원에 이미 정의되어 있다.
단계 e)의 바람직한 실시형태에서, 세포는 최초로 제1 실시형태의 지방생성 배양 배지 및 후속적으로 제2 실시형태의 지방생성 배양 배지에서 배양된다. 통상, 제1 지방생성 배양 배지에서의 배양은 2 내지 15일 또는 3 내지 14일 또는 4 내지 13일 또는 2 내지 10일 또는 2 내지 8일 또는 3일의 기간을 가질 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 기간은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일이다.
바람직한 농도는 다음과 같다: 2 내지 8μM 또는 3 내지 7μM 또는 4 내지 6μM 또는 약 5μM 또는 5μM의 SB431542. 아스코르브산의 바람직한 농도는 10 내지 50㎍/ml 또는 12.5 내지 40㎍/ml 또는 15 내지 30㎍/ml 또는 약 25.5㎍/ml 또는 25.5㎍/ml이다. EGF의 농도는 8 내지 12ng/ml 또는 9 내지 11ng/ml 또는 약 10ng/ml 또는 10ng/ml일 수 있다. 하이드로코르티손의 농도는 1 내지 7㎍/ml 또는 2 내지 6㎍/ml 또는 3 내지 5㎍/ml 또는 약 4㎍/ml 또는 4㎍/ml일 수 있다. 로시글리타존의 농도는 0.5μM 내지 2μM, 또는 0.75 내지 1.5μM 또는 0.9 내지 1.2μM 또는 1μM일 수 있다. 인슐린의 농도는 2 내지 15㎍/ml 또는 5 내지 12.5㎍/ml 또는 8 내지 11㎍/ml 또는 10㎍/ml일 수 있다. T3 호르몬의 농도는 100 내지 300pM 또는 150 내지 250pM 또는 200pM의 범위일 수 있다. 덱사메타손의 농도는 0.5μM 내지 2μM, 또는 0.75 내지 1.5μM 또는 0.9 내지 1.2μM 또는 1μM의 범위일 수 있다. IBMX의 농도는 300 내지 700μM 또는 400 내지 600μM 또는 500μM의 범위일 수 있다.
바람직하게는, 바람직한 제1 실시형태의 지방생성 배양 배지는 배양 배지, SB431542(5μM), EGF(10ng/ml), 로시글리타존(1μM), 인슐린(10mg/ml), T3 호르몬(0.2nM), 아스코르브산(25.5㎍/ml), 하이드로코르티손(4㎍/ml), 덱사메타손(1μM) 및 IBMX(500μM)를 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어진다.
바람직하게는, 바람직한 제2 실시형태의 지방생성 배양 배지는 배양 배지, SB431542(5μM), EGF(10ng/ml), 로시글리타존(1μM), 인슐린(10mg/ml), T3 호르몬(0.2nM), 아스코르브산(25.5㎍/ml) 및 하이드로코르티손(4㎍/ml)을 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어진다.
이들 바람직한 지방생성 배양 배지의 각각에서 배양 배지는 바람직하게는 DMEM이다. 또한, 이들 바람직한 지방생성 배양 배지의 각각에서 배양 배지는 10% FBS 및 저 글루코즈가 보충된다. 당해 기술분야에서, 당업자는, "고 글루코즈" 또는 "DMEM 고 글루코즈"가 4g/l인 것에 대하여, "저 글로코즈" 또는 "DMEM 저 글루코즈"가 1g/l인 것을 알고 있다. 세포는, 단계 e)의 개시시에 3.104 내지 9.104 세포/cm2 범위의 밀도로, 바람직하게는 5.104 세포/cm2를 사용하여 씨딩될 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 세포는 유도 배지, 즉 DMEM으로 구성된 배지에서 유지된다. 한 가지 실시형태에서, 상기 배지는 FBS(10%) 및 FGF-2(5ng/ml)가 보충된다.
단계 e)의 기간은 중요하지는 않다. 기간은 또한 단계 b)의 개시시에 사용되는 iPAM 세포의 수 및/또는 근원성 배양 배지에 존재하는 성분의 동일성 및/또는 단계 c)가 수행는지의 여부, 단계 d)가 수행되는 방식, 예를 들면, 단계 d) 동안 계대의 수에 따라 달라질 수 있다. 통상, 단계 e)의 기간은 3 내지 18일 또는 4 내지 17일 또는 5 내지 16일 또는 6 내지 16일의 범위일 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명의 방법은 수득된 BA 세포가 UCP1의 발현을 특징으로 하는 것이다. BA 세포 및 UCP1의 발현은 상세한 설명의 하기 섹션에서 추가로 기재되어 있다. 바람직한 인간 UCP1 아미노산 서열은 서열번호 13으로서 본원에서 동정된다.
당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 기재된 방법은 생체외 또는 시험관내 방법이다.
또한, BA 세포를 수득하는 방법은, 그 자체가 BAP 세포를 수득하는 방법의 단계 a), b), 임의 단계 c) 및 단계 d)를 포함할 필요가 없다는 것도 당업자에게 명백하다. 당업자가 BAP 세포를 수득할 수 있는 한, 그는 상기 정의된 바와 같이 단계 e)를 적용할 수 있고 BA 세포를 수득할 것이다.
본 발명의 방법으로부터 수득가능한 BAP, BA 세포, 또는 BAP, BA 세포의 모집단
본 발명은 추가로, 바람직하게는 상기 기재된 방법으로부터 수득할 수 있는, BAP, BA 세포 자체 또는 BAP, BA 세포 자체의 모집단에 관한 것이다. 본 발명이 또한 BAP 또는 BA 세포를 포함하는 BAT(갈색 지방세포 조직)에 관한 것임은 당업자에게 명백하다. 본 출원 전체에 걸쳐, BAP 또는 BA 세포를 포함하는 조성물 또는 BAP 또는 BA 세포를 포함하는 모집단을 언급하는 경우, 이러한 조성물 또는 이러한 모집단은 이러한 세포를 포함하는 조직으로 간주될 수 있다. BAT는 BA 및 BAP 세포를 포함하는 조직이다.
한 가지 실시형태에서, BAP 세포는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간 BAP 세포이다. 한 가지 실시형태에서, BAP 세포의 모집단은 인간 BAP 세포의 모집단이다. 한 가지 실시형태에서, BA 세포는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간 BA 세포이다. 한 가지 실시형태에서, BA 세포의 모집단은 인간 BA 세포의 모집단이다.
BA 세포 또는 BA 세포의 모집단은 전형적으로 BA 세포에 추가하여 다른 세포 유형을 포함할 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 본 발명의 BA 세포의 모집단은 이들이, BA 세포의 적어도 하나의 바이오마커 특징, 예를 들면, UCP1(비커플링 단백질 1)을 발현하는, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 및 바람직하게는 적어도 90%의 세포를 포함한다는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 마커는 UCP1이다. UCP1은 성숙 BA 단계를 제외하는 유일한 마커인 것으로 추정된다[참조: Nedergaard et al 2001, Canon et al 2004]. 발현될 수 있는 다른 마커는 PGC1알파, FABP4, CIDEA, PLIN1, PPAR감마, EBF2, ZIC2, DIO2 및 지질 액적의 동시 존재(즉, 적어도 하나의 지질 액적)이다. 본원에 수록된 UCP1 및/또는 PGC1알파 및/또는 임의의 기타 마커의 발현의 평가는 본원의 문맥에서 적용되는 제목 정의 부분에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 지질 액적의 검출은 중성 지질 염색을 사용하여 수행할 수 있다.
BA 세포에 특이적인 마커를 발현하는 세포를 선택함으로써 BA 세포를 정제할 수 있거나 모집단을 BA 세포로 농후화시킬 수 있다. 한 가지 실시형태에서, BA 세포의 모집단의 정제 또는 농후화를 위한 BA 세포에 특이적인 마커는, 하나 이상의 하기 마커: UCP1, 임의로 PGC1알파, FABP4, CIDEA, PLIN1, PPAR감마 중의 어느 하나와 조합하여, EBF2, ZIC2 및/또는 DIO2 중에서 선택될 수 있다. BA 세포는 또한, 본원에서 앞에 설명된 바와 같이, 적어도 하나의 지질 액적의 존재에 대해 선택될 수 있다.
BA 세포의 정제 또는 농후화는 세포 선별 기술, 예컨대, 형광 활성화 세포 선별(FACS) 또는 BA 세포의 상기 세포 표면 마커의 특이적 결합제를 포함하는 자기 비드, 또는 BA 마커를 위한 형광 리포터를 사용하여 달성할 수 있다.
따라서, 정제 또는 농후화 후, 모집단은 BA 세포의 바이오마커 특징, 예를 들면, UCP1, 임의로 PGC1알파, FABP4, CIDEA, PLIN1, PPAR감마 중의 어느 하나와 조합하여, EBF2, ZIC2 및/또는 DIO2를 발현하는, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%; 70%, 80%, 90% 이상 또는 95% 이상의 세포를 포함할 수 있다. BA 세포는 또한, 본원에서 앞서 설명된 바와 같은 적어도 하나의 지질 액적을 포함할 수 있다.
수득된 BA 세포의 기능을 특징으로 하는 또 다른 방법은 지방분해의 활성제, 예컨대, 포르스콜린 또는 이소프로테레놀을 사용한 치료시에 유리 글리세롤을 방출하는 이들의 능력을 평가하는 것이다. 바람직하게는, 치료는 포르스콜린에 의한 것이다. 보다 바람직하게는, 치료는 포르스콜린을 사용하여 10mM에서 24시간 동안이다. 방출된 유리 글리세롤의 증가는 무처리 세포와 비교하여 처리된 세포에서 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 또는 심지어 적어도 60%이다. 이러한 유리 글리세롤 방출은 지방분해의 증가를 나타낸다. 본 발명의 방법은 고수율(적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80% 또는 심지어 85%)의 지방세포, 바람직하게는 기능적인 갈색 지방세포를 수득하게 한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은, 상기 기재된 바와 같은 방법으로부터 수득가능한 BA 세포의 모집단을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 가지 실시형태에서, BA 세포의 모집단은 BA 세포로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어질 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 또한, BAP 세포에 추가하여 다른 세포 유형을 전형적으로 포함할 수 있는 BAP 세포 또는 BAP 세포의 모집단에 관한 것이다. 한 가지 실시형태에서, 본 발명의 BAP 세포의 모집단은, BAP의 상기 모집단이 본 발명의 방법에 의해 수득가능하고, 본원에 정의된 BA 세포의 모집단으로 전환되는 능력을 갖는 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 세포를 포함하는 것을 특징으로 한다. 한 가지 실시형태에서, 상기 전환은, 단계 e)에 따라서, 혈청 또는 이의 등가물을 포함하는 지방생성 배양 배지에서 BAP 세포 또는 BAP 세포의 모집단을 배양한 후에 평가된다. 상기 BA 세포는 UCP1을 발현한다. 발현할 수 있는 다른 마커는 PGC1알파, FABP4, CIDEA, PLIN1, PPAR감마, EBF2, ZIC2, DIO2이다. 이들 BA 세포는 또한, 지질 액적(즉, 적어도 하나의 지질 액적)의 부수적 존재를 특징으로 할 수 있다. 본원에 수록된 UCP1 및 기타 다른 마커의 발현의 평가는 본원의 문맥에서 적용되는 제목 정의 부분에서 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 지질 액적의 검출은 중성 지질 염색을 사용하여 수행할 수 있다.
BAP 세포의 모집단 또는 BAP 세포를 포함하는 모집단은, 당업자에게 공지된 적절한 성장 조건하에 1 내지 2개월 동안 배양할 수 있다[참조: Wdziekonski et al 2010].
본 발명의 방법을 적용함으로써 BAP 세포를 정제하거나 모집단을 BAP 세포로 농후화시킬 수 있다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은, 상기 기재된 방법으로부터 수득가능한 BAP 세포의 모집단을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 가지 실시형태에서, BAP 세포의 모집단은 BAP 세포로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어질 수 있다.
BAP 또는 BA 세포 또는 BAP 또는 BA 세포의 모집단의 용도
BAP 세포는 유리하게는 분화 조건하에 시험관내에서 배양되어, 본원에서 앞에 정의된 바와 같이 갈색 지방세포(BA)를 생성할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 방법에 의해 수득가능한 BAP 또는 BA 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 가지 실시형태에서, 이러한 조성물은 약제학적 조성물이다. BAP 또는 BA 세포, 또는 BAP 또는 BA 세포를 포함하는 모집단, 또는 이들 세포 또는 세포의 모집단을 포함하는 조성물은 의약으로서 사용될 수 있다. 의약은 BAP 또는 BA 세포 활성과 관련된 임의의 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 질환 또는 병태의 예는 대사성 질환, 예컨대, 비만 관련 병상, 대사 증후군, 진성 당뇨병, 고지방증, NASH(비-알콜성 지방성 간염), 에너지 균형(섭취량 대 소비량)을 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한, 본원에 기재된 질환에 대한 의약의 제조를 위한, BAP 세포 또는 BAP 세포를 포함하는 모집단 또는 이들 세포 또는 세포의 모집단을 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 양태는, 본 발명의 모집단으로서 BAP 또는 BA 세포를 포함하는 모집단의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 모집단은, 다양한 용도, 특히 연구 또는 치료 분야에서 사용될 수 있다. 주요 치료 분야의 하나는 세포 요법 또는 재생 의료이다. 재생 의료는, 본원에서 설명된 바와 같이 수득된 BAP 또는 BA 세포를 포함하는 모집단의 이식에 의해 생체내 또는 시험관내 또는 생체외에서 손상된 조직 또는 세포를 재생시킴으로써 조직 또는 세포(즉, BA 또는 BAP 또는 이와 관련)의 기능부전, 손상 또는 실패에 기인하는 임의의 질환을 잠재적으로 치유하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 한 가지 양태에서, 본 발명은, 포유동물, 예를 들면, 인간 환자에게 이식하기 위한 세포 요법 제품으로서 사용하기 위한 본 발명의 모집단에 관한 것이다.
한 가지 특정 실시형태에서, 본 발명은, 본 발명에 따라 수득된 BA 세포의 모집단을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은, 예를 들면, UCP1을 발현하는 적어도 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 적어도 109 세포를 포함하는 BA 세포의 모집단을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 이러한 조성물은 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함한다.
한 가지 실시형태에서, BAP 세포는, BA 계통으로의 이들의 분화를 유도하기 위해, 다양한 세포 유형과 함께 추가로 배양되거나 추가로 공배양된다. 또 다른 실시형태에서, BAP 세포는 수용자 숙주에 직접 이식된다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 모집단을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 모집단을 포함하는 조성물은 세포 요법 또는 재생 의료에서 사용될 수 있다.
추가의 양태에서, BAP 또는 BA 세포 또는 BAP 또는 BA 세포의 모집단은 스크리닝 목적을 위해 사용될 수 있다. 예는, BAP 세포의 증식, 생존 및/또는 BA 세포로의 추가 분화를 유도하는 화합물의 능력을 스크리닝하기 위한 BAP 세포 또는 BAP 세포의 모집단의 사용이다. 또 다른 예는, 성숙 BA 세포의 활성화를 연구하여, 이들의 에너지 소비를 유도하는 것이다.
이 문헌 및 이의 특허청구범위에서, 동사 "포함하는" 및 이의 활용형은 비제한적 의미로 사용되어, 단어에 계속하는 항목이 포함되지만 특히 언급되지 않은 항목이 제외되지 않는 것을 의미한다. 추가로, 동사 "이루어진"은 "본질적으로 이루어진"으로 치환될 수 있고, 본원에 정의된 방법 또는 세포 모집단 또는 조성물은 추가의 단계(들), 각각 구체적으로 동정된 것 이외의 추가의 성분(들)을 포함할 수 있음을 의미하고, 상기 추가 단계(들) 또는 성분(들)은 각각 본 발명의 고유한 특징을 변경하지 않는다. 또한, 동사 "이루어진"은 "본질적으로 이루어진"으로 치환될 수 있고, 본원에 정의된 방법이 구체적으로 동정된 것 이외의 추가의 단계(들)를 포함할 수 있음을 의미하고, 상기 추가 단계(들)는 본 발명의 고유한 특징을 변경하지 않는다. 또한, 부정 관사("a" 또는 "an")에 의한 요소에 대한 언급은, 당해 문맥이 1개 및 1개만의 요소가 존재하는 것을 명확하게 요구하지 않는 한, 하나 이상의 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 부정관사("a" 또는 "an")은 통상 "적어도 하나"를 의미한다. 단어 "약" 또는 "대략"은, 수치(예를 들면, 약 10)과 관련하여 사용되는 경우, 바람직하게는, 당해 값이 그 값의 0.1% 이상 또는 이하인 소정 값(10의)일 수 있음을 의미한다. 본 명세서에서 인용되는 모든 특허 및 참고문헌은 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 도입된다.
하기 실시예는 예시만을 목적으로 제공되고, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것을 의도하지 않는다.
본원의 맥락에서 적용되는 정의
마커
적용에서 수회, 세포 또는 세포 모집단은 마커의 발현을 특징으로 한다. 이러한 마커의 예는 Oct4, SOX2, Nanog, SSEA 3 및 4, TRA 1/81, Tbx6, EphrinA1, EphrinB2, EPHA4, PDGFR알파, Sall1, Sall4, Dll1, Dll3, Papc(Pcdh8), Lfng, Hes7, Ripply1, Ripply2, Brachyury(T), Cdx2, Cdx4, Evx1, Cxcr4, Ill7rd, Fgf8, Fgf17, Gbx2, Wnt3a, Wnt5b, Rspo3, SP5, SP8, Has2, Dkk1, Dact1, Pax3, Pax7, Mesp1, Mesp2 Msgn1, pax7, 데스민, 미오게닌, 알파 액티닌, UCP1, PGC1알파, FABP4, CIDEA, PLIN1, PPAR감마, EBF2, ZIC2, DIO2이다.
세포 또는 세포 모집단은, 상기 마커의 발현이 검출될 수 있는 경우, 소정 마커를 발현하는 것으로 말할 수 있다. 상기 마커의 상기 발현의 검출은, 유전자 발현을 측정하는 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법, 특히 정량적 방법, 예컨대, 실시간 정량적 PCR 또는 마이크로어레이, 또는 유전자 리포터 발현을 사용하는 방법(상기 유전자 리포터는 WO 2013/030243의 실험 부분에 기재된 바와 같은 Msgn1 프로모터를 포함한다) 또는 정성적 방법, 예컨대, 세포 표면 마커를 포함하는 특정 바이오마커를 나타내는 세포를 동정하는 면역염색 또는 세포 선별 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
서열 동일성
"서열 동일성"은, 서열을 비교함으로써 측정할 때, 2개 이상의 핵산(뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, RNA, DNA) 서열 사이의 관계로서 본원에서 정의된다. 당해 기술분야에서, "동일성"은 또한, 경우에 따라, 이러한 서열의 스트링 사이의 정합에 의해 결정할 때, 핵산 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성" 및 "유사성"은 공지된 방법에 의해 용이하게 계산할 수 있고, 문헌[참조: Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)]에 기재된 것들을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
동일성을 결정하는 방법은, 시험된 서열 사이의 최대 정합을 제공하도록 설계된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 일반적으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램으로 코딩화된다. 2개 서열 사이의 동일성 및 유사성을 결정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은, 예를 들면, GCG 프로그램 팩키지(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BestFit, BLASTP, BLASTN, 및 FASTA(Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))를 포함한다. BLAST X 프로그램은 NCBI 및 다른 공급원(BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))으로부터 공개적으로 입수가능하다. 공지된 Smith Waterman 알고리즘을 또한 사용하여 동일성을 결정할 수 있다.
핵산 비교를 위한 파라미터는 다음을 포함한다: 알고리즘: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); 비교 매트릭스: matches=+10, mismatch=0; 갭 페널티(Gap Penalty): 50; 갭 길이 페널티: 3. 위스콘신주 매디슨에 위치된 Genetics Computer Group의 갭 프로그램으로서 이용가능. 상기는 핵산 비교를 위한 디폴트 파라미터(default parameter)이다.
본원에 사용된 바와 같이, 2개 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는, 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이고(즉, 동일성 % = 동일성 위치의 #/위치의 전체 #×100), 이는 2개 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있다. 서열의 비교 및 2개 서열 사이의 동일성 퍼센트의 결정은 이하에 기재된 바와 같이 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
2개 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는, ALIGN 프로그램(버젼 2.0)에 도입되어 있는 이. 마이어 및 더블유. 밀러(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17,1988)의 알고리즘을 사용하고, PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하여 결정할 수 있다.
임의로, 아미노산 유사성의 정도를 결정할 때에, 당업자는, 당업자에게 명백한 바와 같이, 소위 "보존적" 아미노산 치환을 고려할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은, 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 호환성을 지칭한다. 예를 들면, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바림직한 보존적 아미노산 치환 그룹은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이다. 본원에 개시된 아미노산 서열의 치환 변이체는 개시된 서열 중의 적어도 하나의 잔기가 제거되고 그 위치에 상이한 잔기가 삽입된 것들이다. 바람직하게는, 아미노산 변화는 보존적이다. 천연 존재 아미노산 각각에 대한 바람직한 보존적 치환은 다음과 같다: Ala에서 ser로; Arg에서 lys로; Asn에서 gln 또는 his로; Asp에서 glu로; Cys에서 ser 또는 ala로; Gln에서 asn로; Glu에서 asp로; Gly에서 pro로; His에서 asn 또는 gln로; Ile에서 leu 또는 val로; Leu에서 ile 또는 val로; Lys에서 arg로; gln 또는 glu; Met에서 leu 또는 ile로; Phe에서 met, leu 또는 tyr로; Ser에서 thr로; Thr에서 ser로; Trp에서 tyr로; Tyr에서 trp 또는 phe로; 및 Val에서 ile 또는 leu로.
한 가지 실시형태에서, 서열 동일성은 주어진 2개 서열번호의 전체 길이 또는 이의 일부에 기초하여 계산된다. 이의 일부는 바람직하게는 양 서열번호의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%를 의미한다.
활성제
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "특정 경로 또는 분자의 활성제", 예컨대, "Wnt 신호전달 경로의 활성제"(달리 지시하지 않는 경우)는 상기 경로 또는 분자와 관련 또는 연관된 활성을 증강 또는 촉진 또는 활성화 또는 상향조절 또는 증가시키는 물질을 나타낸다. 예를 들면, 표준 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로의 경우, 이 활성은, LEF/TCF 결합 부위 리포터의 확립된 다량체를 사용하는 Wnt 리포터 활성, 및/또는 GSK-3β의 억제, 및/또는 표준 Wnt 표적 유전자, 예컨대, T, Tbx6, Msgn1, 또는 Axin2의 활성화에 의해 측정할 수 있다. 따라서, Wnt 신호전달 활성의 활성화는 상기 특정된 바와 같이 Msgn1 리포터 활성의 Wnt의 증가인 것으로 평가될 수 있다[참조: Chal J et al 2015]. 경로 또는 분자에 따라, 당업자는 상기 경로 또는 분자의 활성에 특이적인 검정을 알고 있고, 이를 사용하여 활성제를 평가할 수 있다. 상기 증가는, 활성제 부재하의 대조군 상황과 비교하여, 적어도 1%, 5% 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 이상일 수 있다.
억제제
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "특정 경로 또는 분자의 억제제"는 상기 경로 또는 분자와 관련 또는 연관된 활성을 억제, 하향조절 또는 감소시키는 물질을 나타낸다. 경로 또는 분자에 따라, 당업자는 상기 경로 또는 분자의 활성에 특이적인 경로를 알고 있고, 이를 사용하여 억제제를 평가할 수 있다. 상기 감소는, 억제제 부재하의 대조군 상황과 비교하여, 적어도 1%, 5% 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 이상일 수 있다
[표 1]
본 발명의 서열
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
실시예:
실시예 1
방법
본원에서 사용된 모든 화합물의 정식 명칭 및 제조원은 부록에 상세되어 있다.
hiPS 세포로부터 인간 갈색 지방세포 전구세포(hBAP)의 일차 분화 및 유도:
미분화 hiPS 세포는 트립신을 사용하여 단일 세포로 분리하고, Rock-1 억제제(10μM)이 보충된 mTESR-1 배지에서 마트리겔-코팅된 접시에 5.5.104 세포/cm2의 밀도로 씨딩한다. 1일 후, 배지를 Rock-1 억제제 부재하의 신선한 mTESR-1로 교환한다. 세포가 분화 0일에서 측정한 작은 응집체를 형성하는 경우, 이들을 일련의 분화 배지로 교환한다.
0일에서, 배지를 ITS(1%), CHIR99021(3μM) 및 LDN-193189(500nM)가 보충된 DMEM으로 구성된 배지로 교환한다. 배지는 6일까지 매일 갱신한다.
6일에서, 배지를 KSR(15%), LDN-193189(500nM), HGF(10ng/ml) 및 IGF-1(2ng/ml)가 보충된 DMEM으로 구성된 배지로 교환한다. 배지는 8일까지 매일 교환한다.
8일에서, 배지를 KSR(15%) 및 IGF-1(2ng/ml)이 보충된 DMEM으로 구성된 배지로 교환한다. 배지는 12일까지 매일 교환한다.
12일 내지 22일까지, 배지를 KSR(15%), HGF(10ng/ml) 및 IGF-1(2ng/ml)이 보충된 DMEM으로 구성된 배지로 교환한다. 배지는 2일마다 교환한다(도 1 및 2).
hBAP를 유도하기 위해 선택된 일(12일 내지 22일)에서, 배지를 FBS(10%)가 보충된 DMEM으로 구성된 배지로 교환한다. 배지를 2일마다 갱신한다. 1주 후에, 세포는 트립신을 사용하여 계대배양하고, 이들을 조직 배양 등급 플레이트에 씨딩한다. 이는 고정 계대 수 0이고, 세포를 FGF-2(5ng/ml)가 보충된 이전 배지에서 유지시킨다.
세포가 컨플루언스에 도달한 경우, 이들을 계대배양하고, 5.104 세포/cm2의 밀도로 씨딩한다.
계대는 균일한 형태의 세포 모집단이 수득될 때까지 반복한다(통상 4 내지 9회)(도 2).
인간 갈색 지방세포 전구세포(hBAP)의 분화:
hBAP를 고밀도(즉, 5.105 세포/cm2)로 플레이팅하고, 유도 배지에 유지시킨다. 세포가 분화 0일에서 측정하여 컨플루언스에 도달한 경우, 배지를 FBS(10%), 로시글리타존(1μM), 인슐린(10㎍/ml), T3(0.2nM), SB431542(5μM), 아스코르브산(25.5㎍/ml), EGF(10ng/ml), 하이드로코르티손(4㎍/ml), 덱사메타손(1μM) 및 IBMX(500μM)가 보충된 낮은 글루코즈의 DMEM으로 구성된 분화 배지로 교환한다. 덱사메타손 및 IBMX는 3일 후에 폐기한다(도 3). 이어서, 분화 배지를 주 2회 교환한다.
결과
실험 결과
BA를 수득하기 위한 워크플로우(workflow)
이 프로토콜은 hiPS 세포의 초기 배치로부터 BA를 수득하기 위한 순차 분화 세션으로 구성되어 있다(도 1). iPAM 세포의 유도 후, BAP의 추정 아집단은 계대 5로부터 계대 9까지 순차 재플레이팅함으로써 농후화시킨다. 프로토콜의 제2 부분을 개시하기 전에, 12일 내지 22일 범위의 몇몇 종점에서 BAP를 선택했다. 이어서, 농후화된 BAP 모집단은 주요 지방생성 인자를 함유하는 배양 배지에서 2주 동안 분화시킨다(도 1 및 2).
BAP는 계대를 통해 농후화될 수 있다
분화 12 내지 22일 후(16일이 제시됨), 본 발명자들은 세포를 계대배양하고, BAP 모집단을 농후화시키기 위해 이들을 혈청 + FGF2 함유 배양 배지에 플레이팅했다. 세포를 P0로부터 P4로 계대하면, 응집체 및 오염 세포를 제거할 수 있다(도 3). 세포는 위상차 현미경으로 설명된 바와 같이 섬유아세포-유사 BAP의 균질한 및 100% 컨플루언트 모집단에 도달했다. 계대 4 후에, BAP의 세포 형상은 P9까지 더이상 변화되지 않았고(데이터는 제시되지 않음), P5에서 P9까지 분화 프로세스를 무차별적으로 가능하게 한다.
BAP-유도된 BA는 분화된 갈색 지방세포의 관련 마커를 발현한다
BAP 또는 BAP-유래 BA(P5에서 P9까지)는, 10% 소태아 혈청 + 로시글리타존(1μM) + 인슐린(10㎍/ml) + T3 호르몬(200pM) + SB431542(5㎛) + 아스코르브산(25.5㎍/ml) + EGF(10ng/ml) + 하이드로코르티손(4㎍/ml) + 덱사메타손(1μM) + IBMX(500μM)를 함유하는 DMEM에서 분화시켰다. 3일 후, 배지를 최후 2개 화합물을 포함하지 않는 신선한 배지로 교환했다. RT-qPCR에 의한 전사물의 발현 수준을 BA 및 BAP 세포에서 평가했다(도 4). pan-지방세포 마커 FABP4(지방산 결합 단백질 4), PLIN1(페리리핀 1), PPARγ(퍼옥시좀 증식인자-활성화 수용체 감마)는 BAP와 비교하여 BA 세포로 증가했고, 이는 지방세포 경로에 대한 관여를 반영한다. 한편, 갈색 지방세포 마커: UCP1(비커플링 단백질 1), CIDE-A(세포사-유도 DFFA-유사 이펙터 A) 및 PGC1-α(퍼옥시좀 증식인자-활성화 수용체 감마 공활성제 알파)는 BAP보다 BA에서 더욱 발현되었다. 이러한 효과는 계대 5에서 9까지 관찰되었다(도 4).
성숙 17일 후, BA 배양물은 이어서 UCP1에 대한 항체 및 세포내 지질 액적을 동정하는 중성 지질 프로브를 사용한 면역형광에 의해 특성화했다. 제시된 바와 같이, BA는 UCP1에 대한 강력한 및 균질한 염색을 보유했다(도 6). UCP1 + 지질 액적을 발현하는 세포 수의 정량화는 39.5%(P9 세포의 경우) 내지 79%(P6 세포의 경우) 범위의 양성 세포를 나타냈다.
실시예 1.a
방법
본원에서 사용된 모든 화합물의 정식 명칭 및 제조원은 부록에 상세되어 있다.
hiPS 세포로부터 인간 갈색 지방세포 전구세포(hBAP)의 일차 분화 및 유도(도 6 및 7):
단계 a) 미분화 hiPS 세포는 트립신을 사용하여 단일 세포로 분리하고, 3.104 내지 9.104 세포/cm2 범위의 밀도로 씨딩했다. 이 실시예는 Rock-1 억제제(10μM)이 보충된 mTESR-1 배지에서 마트리겔-코팅된 접시에 5.5.104 세포/cm2로 수행했다. 1일 후, 배지를 Rock-1 억제제 부재하의 신선한 mTESR-1로 교환한다. 세포가 분화 0일에서 측정한 작은 응집체를 형성하는 경우, 이들은 일련의 일차 분화 배지로 교환한다.
0일에서, 배지를 ITS(1%), CHIR99021(3μM) 및 LDN-193189(500nM)이 보충되고 3일부터 FGF-2(20ng/ml)이 보충되거나 보충되지 않은 DMEM으로 구성된 배지로 교환한다. 배지는 6일까지 매일 갱신한다. 이는 근축 중배엽 계통의 유도에 상응한다.
단계 b) 6일에서, 배지를 KSR(15%), LDN-193189(500nM), HGF(10ng/ml) 및 IGF-1(2 ng/ml)이 보충되고 FGF-2(20ng/ml)이 보충되거나 보충되지 않은 DMEM으로 구성된 배지로 교환한다. 배지는 8일까지 매일 교환한다.
8일에서, 배지를 KSR(15%) 및 IGF-1(2ng/ml)이 보충된 DMEM으로 구성된 배지로 교환한다. 배지는 12일까지 매일 교환한다.
12일에서 개시하고 선택된 시점에 도달할 때까지(늦어도 22일), 배지는 KSR(15%), HGF(10ng/ml) 및 IGF-1(2ng/ml)이 보충된 DMEM으로 구성된 배지로 교환한다. 배지는 2일마다 교환한다. 이 단계는 세포의 hBAP로의 유도 개시에 상응한다.
단계 c) hBAP를 유도하기 위해 선택된 일(일차 분화의 12 내지 22일 및 단계 c)의 개시로부터 6 내지 15일 후)에, 배지를 FBS(10%)가 보충되거나 보충되지 않고 FGF-2(5ng/ml)가 보충되거나 보충되지 않은 DMEM으로 구성된 배지로 교환한다. 이 실시예는 FGF-2의 부재하에 10% FBS가 보충된 DMEM으로 수행했다. 배지는 2일마다 갱신한다.
단계 d) 7일 후에, 세포는 트립신을 사용하여 계대배양하고, 조직 배양 등급 플레이트에 씨딩한다. 이는 계대 수 0(P0)이다. 세포는 FGF-2(5ng/ml)가 보충된 DMEM 및 FBS(10%)로 구성된 배지에서 유지시킨다.
세포가 컨플루언스에 도달하는 경우, 이들을 계대배양하고 조직 배양 등급 플레이트에서 3.104 내지 9.104 세포/cm2 범위의 밀도로 씨딩한다. 이 실험은 5.104 세포/cm2를 사용하여 수행했다.
계대는, 당업자에 의해 측정된 바와 같이 균일한 형태의 세포 모집단이 수득될 때까지 반복하고(통상 4 내지 9회)(도 8), 따라서 hBAP의 모집단을 생성한다.
인간 갈색 지방세포 전구세포(hBAP)의 인간 갈색 지방세포(hBA)로의 이차 분화:
단계 e) hBAP를 3.104 내지 9.104 세포/cm2 범위의 밀도로 플레이팅하고, 유도 배지, 즉 FBS(10%) 및 FGF-2(5ng/ml)이 보충된 DMEM으로 구성된 배지에서 유지시킨다. 이 실험은 5.104 세포/cm2를 사용하여 수행했다. 세포가 이차 분화 0일에 측정한 컨플루언스에 도달하는 경우, 배지를 FBS(10%), 로시글리타존(1μM), 인슐린(10㎍/ml), T3(0.2nM), SB431542(5μM), 아스코르브산(25.5㎍/ml), EGF(10 ng/ml), 하이드로코르티손(4㎍/ml), 덱사메타손(1μM) 및 IBMX(500μM)가 보충된 낮은 글루코즈(1g/l)의 DMEM으로 구성된 분화 배지로 교환한다. 덱사메타손 및 IBMX는 3일 후에 폐기한다. 이어서, 분화 배지를 8 내지 30일(통상 약 2주) 동안 주 2회 교환한다.
정량적 RT-PCR:
핵 스핀 RNA 플러스 키트(Macherey-Nagel)를 사용하여 세포 배양으로부터 전체 RNA를 추출했다. RT-PCR은 500ng 전체 RNA에 대해 iScript gDNA 클리어 cDNA 합성 Kit(Biorad), 적절한 프라이머를 사용하여 수행하고, LightCycler 480II(Roche)에서 실행한다. TBP는 내부 대조군으로서 사용했다.
면역세포화학:
세포 배양물을 PFA 4%로 고정시켰다. 세포를 인산염 완충된 식염수(PBS) 중의 5% NGS, 1% 소태아 혈청 및 0.2% 트리톤으로 구성된 차단 용액으로 30분 동안 인큐베이션했다. 일차 항체 인큐베이션은 실온에서 1시간 30분 동안 수행하고, 항체 작업 희석은 다음과 같다: 항-UCP1(R&D)은 1:250이었고, 항-데스민(Santa Cruz)은 1:800이었다. PBS 세척 후, 세포를 AlexaFluor488-접합된 이차 항체(Invitrogen)과 함께 1:1000으로 30분 동안 인큐베이션하고, Dapi로 대비염색했다. HCS Lipidtox 중성 지질 염색은 표준 프로토콜에 따라 수행했다.
지방분해:
BAP는 17일 동안 분화시켰다. 이어서, 세포를 BSA 0.2%가 보충된 DMEM 1g/l 글루코즈에서 24시간 동안 유지했다. 지방분해는 24시간 동안 포르스콜린(10μM)로 자극했다.
실험 결과
본 발명에 기재된 바와 같이 BA를 수득하기 위한 워크플로우.
이 프로토콜은 hiPS 세포의 초기 배치로부터 BA를 수득하기 위한 순차 분화 세션으로 구성되어 있다(도 6). iPAM 세포의 유도(단계 a)) 및 근원성 배지에 대한 후속 노출(단계 b)) 후에, BAP의 추정 아집단을 12일 내지 22일 범위의 상이한 시점에서 유도하여, 순차 재플레이팅에 의해 농후화시킨다(통상 4 내지 9 계대)(단계 c) 및 d)). 이어서, 이 농후화된 BAP 모집단을 주요 지방생성 인자를 함유하는 배양 배지에서 약 2주 동안 분화시킨다(단계 e))(도 6 및 7).
BAP의 표현형 특성화
본 실시예에 기재된 방법에 따라 12 내지 22일 분화시킨 후(16일이 제시됨), 세포는 FBS + FGF2를 함유하는 배양 배지에서 플레이팅하여 BAP 모집단을 농후화시킨다. 세포를 수회 계대하면(통상 4), 응집체 및 오염 세포를 제거할 수 있다(도 8). 세포 모집단은, 위상차 현미경에 의해 설명된 바와 같이, 당업자에게 균일한, 섬유아세포-유사 BAP의 100% 컨플루언트 상태에 도달했다. 균질화가 수득된 후의 추가 계대는 BAP의 세포 형상을 변화시키지 않았다(데이터는 제시되지 않음).
계대에서 BAP-유래 BA의 특성화
BAP(P1 내지 P9)는 FBS(10%) + 로시글리타존(1μM) + 인슐린(10㎍/ml) + T3 호르몬(200pM) + SB431542(5μM) + 아스코르브산(25.5㎍/ml) + EGF(10ng/ml) + 하이드로코르티손(4㎍/ml) + 덱사메타손(1μM) + IBMX(500μM)을 함유하는 DMEM에서 BA로 분화했다. 덱사메타손 및 IBMX는 3일 후에 폐기했다. 지방세포 계통에 전형적인 특정 전사물의 발현 수준은 BAP 및 BA 둘 다에서 RT-qPCR에 의해 평가했다(도 9 및 11). pan-지방세포 마커 FABP4(지방산 결합 단백질 4), PLIN1(페리리핀 1), PPARγ(퍼옥시좀 증식인자-활성화 수용체 감마)는 BAP와 비교하여 BA 세포에서 크게 증가했고(각각 최대 1.105; 3,5.104 및 8배 높게 발현됨), 이는 지방세포 경로에 대한 관여를 반영한다. 또한, 갈색 지방세포 마커: UCP1(비커플링 단백질 1), CIDE-A(세포사-유도 DFFA-유사 이펙터 A) 및 PGC1-α(퍼옥시좀 증식인자-활성화 수용체 감마 공활성제 알파)는 BAP보다 BA에서 유의적으로 더 많이 발현되었다(각각 최대 1,2.105; 300 및 150배 높게 발현됨).
이어서, 분화 17일에서 BA 배양물은 UCP1에 대한 항체 및 세포내 지질 액적을 동정하는 중성 지질 프로브를 사용한 면역형광에 의해 특성화했다. BA는 UCP1의 강력한 및 균일한 염색을 보유했다(도 10 및 12). UCP1 + 지질 액적을 발현하는 세포 수의 정량화는 이 실험에서 40%(P2 세포의 경우) 내지 79%(P6 세포의 경우) 범위의 양성 세포를 나타냈다. 본 발명을 사용하여 수득한 분화 수율은 UCP1을 발현하고 지질 액적을 제시하는 세포의 85%에 도달했다(도 19).
중요하게는, 특성화를 완성하기 위해, 12일 또는 16일에서 및 5 계대 후에 유도된 BAP를 17일 동안 분화시킨 다음, 포르스콜린(10μM)로 처리했다. 24시간 후, 본 발명자들은 무처리 세포와 비교하여 처리된 세포에서 방출된(약 60%) 유리 글리세롤의 증가를 관찰했다(도 13D). BA는 포르스콜린에 반응하여 지방분해를 증가시킬 수 있고, 따라서 이들 세포의 기능성을 나타낸다.
이들 결과는, 본 발명의 방법이 지방세포 뿐만 아니라 특히 기능성인 갈색 지방세포 전구세포 및 지방세포를, 전례 없는 매우 높은 수율(최대 85% 순도)로 생성하고(실시예 2 참조), 이는 공업적 용도에 적합한 고순도로 BA의 모집단을 수득하게 한다.
BAP를 유도하기 위한 시간 간격
상기 기재된 바와 같이, 연속 계대에 의한 BAP의 농후화 전에, 세포는 근원성 배지에서 6일 내지 22일까지 배양하고, 이어서 혈청을 함유하는 배지에서 유지시킨다.
상이한 시점에서 유도된 BAP는 17일 동안 분화시켰다(실시예 1에 기재된 바와 같이)(데이터는 계대 5에 대해 제시됨). BA 배양은 모두 다수의 지질 액적을 수반하는 UCP1 단백질을 강력하게 발현했다(도 13, A). UCP1을 발현하고 지질 액적을 제시하는 세포 수의 정량화는 43%(14일에서 유도한 BAP의 경우) 내지 69%(12일에서 유도된 BAP의 경우) 범위를 나타냈다. UCP1의 발현은 qPCR 분석에 의해 확인한다(도 13, B). FABP4 및 UCP1 둘 다는, 예상한 바와 같이, BAP보다 BA에서 더욱 많이 발현되었다. 이들 데이터는 BAP가 12일 내지 22일의 임의의 시점에서 유도될 수 있고, 만족스러운 효율로 BA의 생성을 유도할 수 있음을 나타낸다. 추가로, 포르스콜린으로 자극시킨 후, 본 발명자들은 12일 및 16일에서 유도된 BAP의 분화 후에 수득한 BA의 지방분해의 증가를 관찰했고, 이는 이전 결과를 확인시켰다(도 13, D).
도 14에서, 본 발명의 방법은, 이 단계의 중요성을 평가하기 위해 단계 c) 없이 수행했다. BAP는 혈청을 함유하는 배지에서 배양 단계의 존재(1) 또는 부재(2)하에 20일에서 유도했다. 분화 후, UCP1-양성 세포의 비율은 이러한 추가 단계와 함께 유도된 BAP에서는 60%였고, 이것 없이 유도된 것에서는 23%였다. 이들 결과는 단계 c)가 BA 생성의 수율을 유의적으로 증가시키고, 이의 부재는 BA 모집단의 수득을 방해하지 않고, 따라서 임의적인 것을 나타낸다.
이들 결과는, iPAM 세포의 유도 후, BAP 유도용으로 선택된 시점이 일차 분화의 12 내지 22일 동안, 이어서 2 내지 9의 연속 계대로 구성되는 한, BAP 및 BA가 높은 수율로 생성될 수 있음을 나타낸다. 이들 가능성 중에서, 바람직한 조건은 16일에서 BAP를 유도하고 이들을 분화 전에 5회 계대하는 것이다.
실시예 2
본 실시예에서, 본원에 기재된 방법의 우수성을 확인하기 위해, 본 발명의 방법을 BAP 및/또는 BA를 생성하는 것으로 주장하는 종래 기술에서 동정된 다른 방법과 비교했다. 각 방법(2 내지 5)에 대해, BAP 및 BA는 또한 하기 기재된 본 발명의 방법(방법 1)을 사용하고 동시에 미분화 hiPS 세포의 동일한 배치를 사용하여 동시에 생성했다.
방법
본원에 사용되는 모든 화합물의 정식 명칭 및 제조원은 부록에 상세되어 있다.
방법 1: hiPS 세포로부터 hBAP의 일차 분화 및 유도, 및 hBAP의 hBA로의 분화:
단계 a) 미분화 hiPS 세포는 트립신을 사용하여 단일 세포로 분리하고, Rock-1 억제제(10μM)가 보충된 mTESR-1 배지에서 마트리겔-코팅된 접시로 5.5.104 세포/cm2의 밀도로 씨딩한다. 1일 후, 배지를 Rock-1 억제제 부재하의 신선한 mTESR-1로 교환한다. 세포가 일차 분화의 0일에서 측정한 작은 응집체를 형성하는 경우, 이들을 일련의 분화 배지로 교환한다.
0일에서, 배지를 ITS(1%), CHIR99021(3μM) 및 LDN-193189(500nM)이 보충된 DMEM으로 구성된 배지로 교환한다. 배지는 6일까지 매일 갱신한다.
단계 b) 6일에서, 배지를 KSR(15%), LDN-193189(500nM), HGF(10ng/ml) 및 IGF-1(2ng/ml)가 보충된 DMEM으로 구성된 배지로 교환한다. 배지는 8일까지 매일 교환한다.
8일에서, 배지를 KSR(15%) 및 IGF-1(2ng/ml)가 보충된 DMEM으로 구성된 배지로 교환한다. 배지는 12일까지 매일 교환한다.
12일 내지 16일에서, 배지를 KSR(15%), HGF(10ng/ml) 및 IGF-1(2ng/ml)가 보충된 DMEM으로 구성된 배지로 교환한다. 배지는 2일마다 교환한다(도 6 및 7).
단계 c) 16일에서, 배지를 FBS(10%)가 보충된 DMEM으로 구성된 배지로 교환한다. 배지는 2일마다 갱신한다.
단계 d) 7일 후, 세포는 트립신을 사용하여 계대배양하고, 조직 배양 등급 플레이트에 씨딩한다. (계대 수 0). 세포는 FBS(10%) 및 FGF-2(5ng/ml)가 보충된 DMEM으로 구성된 이전 배지에서 유지시킨다.
세포가 컨플루언스에 도달하는 경우, 이들을 계대배양하고 5.104 세포/cm2의 밀도로 씨딩한다.
계대는 균일한 형태의 세포 모집단이 수득될 때까지 5회 반복한다.
단계 e) hBAP를 5.104 세포/cm2의 밀도로 플레이팅하고, 유도 배지, 즉 FBS(10%) 및 FGF-2(5nh/ml)가 보충된 DMEM에서 유지한다. 세포가 2차 분화의 0일에서 측정한 컨플루언스에 도달하는 경우, 배지를 FBS(10%), 로시글리타존(1μM), 인슐린(10㎍/ml), T3(0.2nM), SB431542(5μM), 아스코르브산(25.5㎍/ml), EGF(10ng/ml), 하이드로코르티손(4㎍/ml), 덱사메타손(1μM) 및 IBMX(500μM)이 보충된 낮은 글루코즈(1g/ml)의 DMEM으로 구성된 분화 배지로 교환한다. 덱사메타손 및 IBMX는 3일 후에 폐기한다. 이어서, 분화 배지는 이차 분화의 17일까지 주 2회 교환한다.
방법 2: WO2013/030243에 기재된 프로토콜
WO2013/030243는, 지방세포로의 이들의 분화에 적절한 조건하에서, 즉 지방세포 분화를 유도하는 것으로 공지되어 있는 적어도 하나 이상의 화합물의 유효량의 존재하에서 iPAM 세포의 모집단을 배양하여 지방세포를 포함하는 모집단을 제조하는 방법을 주장한다. 방법 1에 필적하는 BAP 및 BA가 WO2013/030243의 방법을 사용하여 수득될 수 있는지를 결정하기 위해, iPAM 세포를 생성하고, 후속적으로 근원성 배양 배지(2.a) 또는 지방생성 배지(2.b 및 2.c)에 노출시키고, 지방생성 배지는 지방세포의 생성을 위한 잠재적 "적절한 조건"인 것으로 간주된다.
iPAM 세포의 생성
미분화 hiPS 세포는 트립신을 사용하여 단일 세포로 분리하고, Rock-1 억제제(10μM)이 보충된 mTESR-1 배지의 마트리겔-코팅된 접시에 씨딩한다. 1일 후, 배지를 Rock-1 억제제 부재하의 신선한 mTESR-1로 교환한다. 세포가 일차 분화 0일에 측정한 작은 응집체를 형성하는 경우, 이들은 일련의 분화 배지로 교환한다.
0일에서, 배지를 ITS(1%), CHIR99021(3μM) 및 LDN-193189(500nM)이 보충된 DMEM으로 구성된 배지로 교환한다.
3일 후, 이전 배지에 FGF-2(20ng/ml)을 보충한다. 배지는 6일까지 매일 갱신한다.
방법 2.a: iPAM 세포의 생성 및 근원성 배지에서의 배양 단계:
6일에서, 배지를 KSR(15%), LDN-193189(500nM), HGF(10ng/ml), FGF-2(20ng/ml) 및 IGF-1(2ng/ml)이 보충된 DMEM으로 구성된 배지로 교환한다. 배지는 8일까지 매일 교환한다.
8일에서, 배지를 KSR(15%) 및 IGF-1(2ng/ml)가 보충된 DMEM으로 구성된 배지로 교환한다.
12일에서, 배지를 KSR(15%), HGF(10ng/ml) 및 IGF-1(2ng/ml)이 보충된 DMEM으로 구성된 배지로 교환한다. 배지는 2 내지 3일마다 갱신한다.
방법 2.b 및 c: iPAM 세포의 생성 및 지방생성 배지에서의 배양 단계
iPAM 세포는 상기 기재된 바와 같이 생성한다.
6일에서, 배지를 KSR(15%), LDN-193189(500nM), HGF(10ng/ml), FGF-2(20ng/ml) 및 IGF-1(2ng/ml)이 보충된 DMEM으로 구성된 배지로 교환한다. 배지는 8일까지 매일 교환한다. 이어서, 8일에서, 배지를 2개 지방세포 분화 배지 중의 하나로 교환한다.
b. 지방세포 분화 배지는 15% KSR을 함유하는 DMEM-기초 배지로 구성하고, 덱사메타손(1μM), IBMX(500μM), 인슐린(10㎍/ml), T3 (0,2nM) 및 로시글리타존(1μM)을 보충했다. 이 배지는 당업자에게 표준 지방생성 배지로 간주되고 있다.
c. 지방세포 분화 배지는 본원의 단계 e)에 기재되었다. 배지는 15% KSR, 덱사메타손(1μM), IBMX(500μM), 인슐린(10㎍/ml), T3(0,2nM), SB431542(5μM), 아스코르브산(25,5㎍/ml), EGF(10ng/ml) 및 하이드로코르티손(4㎍/ml)을 함유하는 DMEM-기초 배지로 구성된다.
11일에서, 덱사메타손 및 IBMX는 양쪽 지방생성 배지로부터 제거된다. 배지는 2 내지 3일마다 갱신한다.
방법 3: WO17223457에 기재된 프로토콜
WO17223457은, iPAM 세포의 모집단을 제공한 후, 이 모집단을 2개의 상이한 조건 세트: "HIFL" 또는 "PRA-Adipomix"하에 배양함으로써 UCP1을 발현하는 유도 갈색 지방 조직(iBAT) 세포를 생성하는 시험관내 방법을 주장한다. 방법 1에 필적하는 BAP 및 BA가 방법 3을 사용하여 수득될 수 있는지를 결정하기 위해, iPAM 세포를 생성하고, 후속적으로 WO17223457에 기재된 각각의 방법에 노출시킨다.
방법 3.1. 방법 《HIFL》:
0 내지 6일: 이전에 방법 2에 기재된 《iPAM 세포의 생성》을 참조한다.
6일에서, 배지를 KSR(15%), LDN-193189(100nM), HGF(10ng/ml), FGF-2(20ng/ml) 및 IGF-1(2ng/ml)이 보충된 DMEM으로 구성된 배지로 교환한다. 배지는 8일까지 매일 교환한다.
8일에서, 배지에는 HGF(10ng/ml) 및 IGF-I(2ng/ml)만이 보충된다. 배지는 2 내지 3일마다 교환한다.
방법 3.2. 방법 《PRA-Adipomix:
0 내지 6일: 이전에 방법 2에 기재된 《iPAM 세포의 생성》을 참조한다.
6일에서, 배지를 PD173074(250nM) 및 레티노산(100nM)을 함유하는 DMEM-기초 배지로 교환한다.
8일에서, 배양물을 2개의 지방세포 분화 배지로 교환한다.
a. WO17223457에 기재된 Adipomix 배지. 배지는 15% KSR, 1× 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS), 500μM IBMX, 125nM 인도메타신, 1nM T3, 5μM 덱사메타손 및 1μM 로시글리타존을 함유하는 DMEM-기초 배지로 구성된다. 배지는 2 내지 3일마다 갱신한다.
b. 본원에 기재된 지방세포 분화 배지. 배지는 15% KSR, 덱사메타손(1μM), IBMX(500μM), 인슐린(10㎍/ml), T3(0,2nM), 로시글리타존(1μM), SB431542(5μM), 아스코르브산(25,5㎍/ml), EGF(10ng/ml) 및 하이드로코르티손(4㎍/ml)을 함유하는 DMEM 기초 배지로 구성된다. 11일에서, 덱사메타손 및 IBMX를 제거한다. 배지는 2 내지 3일마다 갱신한다.
방법 4: 《Hafner et al., 2016》에 기재된 프로토콜
하프너 등(Hafner et al.)은, 배양체(EB)를 형성하고, 이들을 DMEM, 혈청 및 FGF-2를 함유하는 배지에서 배양한 다음, 연속 계대 및 단계 e)의 지방생성 배지에서의 배양에 의해 hiPS 세포로부터 BAP 및 BA 세포를 생성하는 방법을 개시한다. 방법 1 및 4는, BAP를 유도하고 이들을 BA로 분화하기 위한 공통 단계를 공유하지만, 방법 4의 배양체 형성에 의한 다능성 세포의 분화의 제1 단계 또는 iPAM 세포의 생성 및 이어서 방법 1의 근원성 배지에 대한 노출이 상이하다.
방법 1의 수율에 필적하는 수율로 방법 4를 사용하여 BAP 및 BA를 수득할 수 있는지를 결정하기 위해, 양쪽 방법을 병행하여 수행했다.
EB는, 20% 녹-아웃 혈청 대체물이 보충된 DMEM/F12 배지에서 부유 배양에 의해 형성했다. EB 형성한지 10일 후, EB를 젤라틴-코팅된 배양 플레이트에 플레이팅하고, 20% KSR이 보충된 DMEM/F12 배지에서 8일 동안 유지했다. 18일 후, 배지를 10% FBS가 보충된 DMEM으로 구성된 배지로 교환한다. 1주일 후, 세포를 계대배양하고, 조직 배양 등급 플레이트에 씨딩한다. 계대는, 4 또는 5 계대 후, 균일한 형태의 세포 모집단이 수득될 때까지 반복한다.
세포를 5.104 세포/cm2의 밀도로 플레이팅하고, 유도 배지, 즉 FBS(10%) 및 FGF-2(5nh/ml)가 보충된 DMEM에서 유지한다. 세포가 분화 0일에서 측정하여 컨플루언스에 도달하는 경우, 배지를 FBS(10%), 로시글리타존(1μM), 인슐린(10㎍/ml), T3(0.2nM), SB431542(5μM), 아스코르브산(25.5㎍/ml), EGF(10ng/ml), 하이드로코르티손(4㎍/ml), 덱사메타손(1μM) 및 IBMX(500μM)이 보충된 낮은 글루코즈(1g/l)의 DMEM으로 구성된 분화 배지로 교환한다. 덱사메타손 및 IBMX는 3일 후에 폐기한다. 이어서, 분화 배지를 분화 17일까지 주 2회 교환한다.
방법 5: WO2012/147853에 기재된 프로토콜
WO2012/147853는, 2단계 프로세스로 hiPS 세포로부터 갈색 지방세포를 고효율(>90%)로 생성하는 방법을 청구한다: 우선, 혈청-비함유 환경에서 조혈 사이토킨의 존재하에 다능성 줄기 세포로부터 부유 배양에 의해 세포 응집체를 생성한다. 이어서, BA는, 조혈 사이토킨의 존재하에 세포 응집체의 세포 부착에 의해 생성한다. 방법 1 및 5는, 각 방법에 의해 수득가능한 BA의 분화의 수율을 비교하기 위해 병행하여 수행했다.
WO2012/147853에 따라, hiPS 세포의 분화는, IMDM/F12 배지(1mg/mL BSA, 1용적%의 합성 지질 용액, 1용적%의 100× ITS, 450mM MTG, 2mM L-글루타민, 5용적%의 PFHII, 50mg/mL의 아스코르브산, 20ng/mL의 BMP4, 5ng/mL의 VEGF, 20ng/mL의 SCF, 2.5ng/mL의 Flt3L, 2.5ng/mL의 IL6, 및 5ng/mL의 IGF2을 함유)에서 부유 배양에 의한 배양체(EB)의 형성에 의해 개시한다. 배지는 3일마다 교환한다.
8일 후, EB는 IMDM/F12 배지(5mg/mL BSA, 1용적%의 합성 지질 용액, 1용적%의 100× ITS, 450mM MTG, 2mM L-글루타민, 5용적%의 PFHII, 50mg/mL의 아스코르브산, 10ng/mL의 BMP7, 5ng/mL의 VEGF, 20ng/mL의 SCF, 2.5ng/mL의 Flt3L, 2.5ng/mL의 IL6, 및 5ng/mL의 IGF2를 함유)에서 젤라틴-코팅된 배양 플레이트에 1주 동안 플레이팅한다. 배지는 3일마다 교환한다.
정량적 RT-PCR:
전체 RNA는, 핵 스핀 RNA 플러스 키트(Macherey-Nagel)을 사용하여 세포 배양으로부터 추출했다. RT-PCR은, iScript gDNA 클리어 cDNA 합성 키트(Biorad), 적절한 프라이머를 사용하여 500ng 전체 RNA에 대해 수행하고, LightCycler 480II(Roche)로 실행한다. TBP는 내부 대조군으로 사용했다.
면역세포화학:
세포 배양물을 PFA 4%로 고정시켰다. 세포를 인산염 완충된 식염수(PBS) 중의 5% NGS, 1% 소태아 혈청 및 0.2% 트리톤으로 구성된 차단 용액과 함께 30분 동안 인큐베이션했다. 일차 항체 인큐베이션을 실온에서 1시간 30분 동안 수행하고, 항체 작동 희석은 다음과 같다: 항-UCP1(R&D)은 1:250이었고, 항-데스민(Santa Cruz)은 1:800이었다. PBS 세척 후, 세포를 AlexaFluor488-접합된 이차 항체(Invitrogen)와 함께 1:1000으로 30분 동안 인큐베이션하고, Dapi와 대비염색했다. HCS Lipidtox 중성 지질 염색은 표준 프로토콜에 따라 수행했다.
실험 결과
방법 1과 방법 2의 비교:
본 발명의 방법에 기재된 배양 단계를 적용하거나 적용하지 않고서, iPAM 세포가 갈색 지방세포를 생성하는 능력(도 15)를 평가했다. hiPS 세포의 단일 배치로부터 동시에 개시하여, iPAM 세포가 생성되었다. 이어서, 세포를 근원성 배지에서 유지하거나(방법 2.a), 지방생성 배지에서 배양하거나(방법 2.b 및 c), 방법 1에 따라 분화했다.
qPCR에 의해 분석된 지방세포 마커의 발현: 이 비교를 위해, 20일, 30일 및 방법 1)의 BAP 및 BA의 유전자 발현은 8일(즉, 지방세포 계통에 대한 임의의 관여 전)에 채취한 샘플에 대해 정규화했다. 분화 20일 또는 30일 후, 방법 2.a의 세포는 BABP4(pan-지방세포 마커)를 약하게 발현하지만, UCP1(갈색 지방세포 특이적 마커)를 발현하지 않았다. 그러나, UCP1의 발현은 20일 또는 30일에서 방법 2.b 및 2.c의 세포에서 낮은 수준으로 검출되었다. UCP1의 발현은 방법 1로부터 생성된 대조군 세포에서 900배 더 높았다.
이들 데이터는, 지방생성 배지를 사용한 적절한 유도에 의해, iPAM 세포가 갈색 지방세포로 분화할 수 있음을 나타낸다. 그러나, UCP1의 발현은, 방법 1로 생성된 세포보다 방법 2.b 또는 2.c로 생성된 세포에서 유의적으로 더 낮았고, 이는 본 발명에 기재된 추가 단계의 중요성을 입증한다. 본 발명을 구성하는 배양 단계의 조합은, 선행 기술에서 시사되어 있는 바와 같이, 이들 단계의 임의의 기타 조합과 비교하여, 놀랍게도 높은 수율의 BA 생성을 생성한다.
방법 1과 방법 3의 비교:
WO17223457에 따라 BA 세포를 생성하는 능력을 평가했다. hiPS 세포의 단일 배치로부터 동시에 개시하여, iPAM 세포가 생성되었다. 이어서, 세포를 방법 1, 3.1, 3.2.a 및 3.2.b(섹션 방법에 상세됨)의 배양 단계에 노출시켰다.
qPCR에 의해 분석된 지방세포 마커의 발현:
이 비교를 위해, 20일, 30일, 및 방법 1)의 BAP 및 BA에 대한 유전자의 발현은 8일(즉, 지방세포 계통에 대한 임의의 관여 전)에 채취한 샘플에 대해 정규화했다.
분화 20일 또는 30일 후, "HIFL"이란 명칭의 방법 3.1의 세포는 임의의 지방세포 마커를 발현하지 않았고(도 16), 이는 세포가 갈색 지방세포로 분화하지 않았음을 시사한다. 20일 또는 30일 후, 방법 3.2의 세포는 낮은 수준의 FABP4 및 UCP1 마커를 발현했다(도 17). UCP1의 발현은 방법 1로부터 생성된 대조군 세포에서 적어도 1000배 더 높았다.
이들 데이터는 또한, 적절한 유도에 의해, iPAM 세포가 갈색 지방세포로 분화할 수 있음을 나타낸다. 그러나, UCP1의 발현은 방법 1과 비교하여 방법 3으로 생성된 세포에서 유의적으로 낮았다. WO17223457에 기재된 방법은 낮은 수율로 BA 세포를 생성할 수 있지만, 이들 결과는 본 발명의 방법의 우수성을 명백히 입증한다.
방법 1과 방법 4의 비교:
하프너 등(Hafner et al.)에 따라 BA 세포를 생성하는 능력을 평가했다. 방법 1 또는 방법 4에 따라 hiPS 세포를 분화시켜 갈색 지방세포를 생성했다. 이차 분화 전의 BAP 배양 및 지방생성 배지에서의 17일간의 성숙 후의 BA 배양을 계대 4(데이터는 제시하지 않음) 및 5(도 18)에서 qPCR 및 면역형광에 의해 분석했다.
qPCR에 의해 분석한 지방세포 마커의 발현: 이 비교를 위해, 분화 세포에서 유전자의 발현은 미분화 세포에서 발현에 의해 정규화했다. 양쪽 방법으로 수득된 BA 세포는 FABP4 및 UCP1의 발현을 나타냈지만(도 18.B), 방법 1로부터의 세포는 UCP1 수준을 100배 더 높게 발현했다.
IF에 의해 분석된 지방세포 마커의 발현: UCP1을 발현하고 지질 액적을 제시하는 세포의 모집단은 방법 4보다 방법 1에서 유의적으로 더 높았다(방법 1의 경우 약 47% 및 방법 4의 경우 25%)(도 18.A).
따라서, 이들 데이터는, 놀랍게도, 근축 중배엽 계통의 유도 및 방법 1에 기재된 바와 같은 계대에 의한 BAP의 농후화의 조합이 분화 수율을 유의적으로 개선시키는 것을 교시한다.
방법 1과 방법 5의 비교:
본 발명자들은 방법 5의 결과를 재현할 수 없었다. 몇몇 시도에도 불구하고, 세포 응집체의 최초 형성 단계 후, 높은 세포 사멸이 2 또는 3일 후에 관찰되었다(도 19). 세포 배양물은 8일 후에 완전히 소실되었다.
그러나, 동일한 배치의 미분화 hiPS 세포를 사용하여 방법 1에 따라 분화한 대조군 세포는, qPCR(FABP4 및 UCP1 마커는 BAP보다 BA에서 더욱 많이 발현되었다) 또는 면역형광(분화 17일 후, UCP1을 발현하고 지질 액적을 제시하는 세포 모집단은 85%에 도달했다)에 의해 예상된 결과를 나타냈고, 이는 방법 5의 재현 중에 관찰된 세포 사멸이 사용된 미분화 hiPS 세포에 기인하지 않았음을 시사한다.
이들 결과는 WO2012/147853의 방법은 재현성이 아니거나 외부 인자에 대해 크게 의존하지 않음을 시사하고, 이는 이 방법을 산업 용도에 적합하지 않게 하고, 방법 1의 우수성을 확인하고, 방법 5로부터 이론적으로 수득될 수 있는 세포가 본 발명의 방법에 의해 수득된 세포에 필적하지 않음을 시사한다.
비교의 요약:
기존의 프로토콜에 대한 본 발명의 기술적 이점을 입증하기 위해, 본 발명자들은 하기의 생성을 주장하는 선행 기술에 개시된 다른 프로토콜과 비교했다:
- iPAM 세포로부터 지방세포 또는 갈색 지방세포 또는
- hiPS 세포로부터 갈색 지방세포.
qPCR에 의한 분석(도 20)은 방법 1로 생성된 BA가 임의의 다른 프로토콜보다 높은 수준으로 갈색 지방세포 특이적 마커 UCP1을 발현했고(예를 들면, 방법 4보다 100배 및 방법 3보다 최대 1000배), 이는 유의적으로 높은 분화 수율을 증명한다. 이들 결과는 본 발명의 방법이, 기존의 프로토콜과 비교하여, 수율 및/또는 기간의 측면 뿐만 아니라 EB의 부재하에서 견고성의 측면에서 BAP 및 BA를 생성하는데 우수하다는 것을 명백히 입증한다. 따라서, 본 출원은 BAP 및 BA를 생성하는 놀라운 신규 방법을 개시한다.
참고문헌
본 출원을 통해, 다양한 참고문헌은 본 발명이 관계되는 최신 기술을 기재한다. 이들 참고문헌의 개시는 참조에 의해 본 출원에 도입된다.
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약어/분자 목록
아스코르브산(또한 비타민 C로 공지됨)은 인간의 식사에서 필수 영양소이다. 아스코르브산은 강력한 환원제 및 항산화제이다. 항산화 활성 이외에, 아스코르브산(ASC)는, 프로콜라겐의 프롤린 및 리신 잔기의 하이드록실화 효소의 보조인자로서 작용한다. 제조업자: Sigma Aldrich
CHIR99021은 GSK3의 매우 강력한 억제제이고 WNT 활성제로서 기능하는 아미노피리미딘 유도체이다. 제조업자: axon medchem
덱사메타손은 합성 글루코코르티코이드 호르몬이다. 제조업자: Sigma Aldrich
DMEM: 둘베코 변형된 이글 배지(기초 배양 배지). 제조업자: Gibco
EGF: 상피 성장 인자(EGF)은 이 수용체, EGFR에 결합함으로써 세포 성장 및 분화를 자극한다. 제조업자: Miltenyi biotech
FBS: 소태아 혈청. 제조업자:　PanSera; Dutscher
FGF-2(또한 bFGF로 불리움): 섬유아 성장 인자-2. 제조업자: Miltenyi biotech
HGF: 간세포 성장 인자. 제조업자: R&D systems
하이드로코르티손은 부신 피질로부터 분비된 글루코코르티코이드이다. 제조업자: Sigma aldrich
IBMX: (3-이소부틸-1-베틸크산틴)은 사이클릭 AMP 및 사이클릭 GMP 포스포디에스테라제(PDE)의 비-특이적 억제제이다. PDE를 억제함으로써, IBMX는 세포의 cAMP 및 cGMP 수준을 증가시켜, 사이클릭-뉴클레오타이드-조절된 단백질 키나제를 활성화시킨다. 제조업자: Stemcell technologies
IGF-1: 인슐린 성장 인자 유형 1. 제조업자: Miltenyi biotech
ITS: 인슐린-트랜스페린-셀레늄. 이는 세포 보충제이다. 인슐린은 글루코즈 및 아미노산 흡수, 지질생성, 세포내 수송, 단백질 및 핵산 합성을 촉진한다. 트랜스페린은 유리-철의 수준을 조절하는 철-결합 글리코단백질이다(또한 산소 및 퍼옥사이드 유리 라디칼의 수준을 감조시키는 역할을 한다). 셀레늄은 글루타티온 퍼옥시다제 및 다른 단백질의 보조인자이고, 배양 배지에서 항산화제로서 사용된다. 제조업자: Gibco
KSR: 녹아웃 혈청 보충. 이는 다능성 줄기 세포(PSC)의 성장을 지원하는 보다 정의된 FBS-비함유 배지 보충제이다. 제조업자: Gibco
LDN-193489: LDN-193189는 골 형태형성 단백질(BMP) 유형 I 수용체 ALK2 및 ALK3의 세포 투과성 소분자 억제제이다. LDN-193189는 도르소모르핀의 구조-활성 상관 연구로부터 유도되고, 주로 Smad1, Smad5 및 Smad8 포스포릴화의 방지를 통해 기능한다. 제조업자: Miltenyi biotech
mTESR-1: hESC & hiPSC의 공급자-독립적 유지를 위한 표준화 배지. 제조업자: Stemcell technologies
Y-27632 (통칭 Rock-1 억제제로 불리움) : Rho-연관된, 코일드-코일 함유 단백질 키나제(ROCK)의 억제제. 제조업자: Tocris bioscience.
로시글리타존: 로시글리타존은 티아졸리딘디온 부류의 항-당뇨병 약물이다. 다른 티아졸리딘디온과 동일하게, 이의 작용 메카니즘은 퍼옥시좀 증식인자-활성화 수용체(PPAR), 특히 PPAR-감마의 세포내 수용체 부류의 활성화에 의한 것이다. 제조업자: Prestwick
SB431542는, ALK5, ALK4 및 ALK7을 억제하지만 BMP 유형 I 수용체 ALK2, ALK3 및 ALK6을 억제하지 않는 TGF-β/액티빈/NODAL 경로의 소분자 억제제이다. 제조업자: Stemcell technologies.
T3: 트리요오도티로닌. T3은 티록신의 탈요오드화에 의해 생성되는 갑상선 호르몬이다. 제조업자: Sigma aldrich.
SEQUENCE LISTING <110> Anagenesis Biotechnologies S.A.S. <120> METHOD FOR PREPARING BAP or BA cells <130> P6071446PCT <150> EP17211081.9 <151> 2017-12-29 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 272 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met His Leu Arg Leu Ile Ser Trp Leu Phe Ile Ile Leu Asn Phe Met 1 5 10 15 Glu Tyr Ile Gly Ser Gln Asn Ala Ser Arg Gly Arg Arg Gln Arg Arg 20 25 30 Met His Pro Asn Val Ser Gln Gly Cys Gln Gly Gly Cys Ala Thr Cys 35 40 45 Ser Asp Tyr Asn Gly Cys Leu Ser Cys Lys Pro Arg Leu Phe Phe Ala 50 55 60 Leu Glu Arg Ile Gly Met Lys Gln Ile Gly Val Cys Leu Ser Ser Cys 65 70 75 80 Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly Thr Arg Tyr Pro Asp Ile Asn Lys Cys Thr 85 90 95 Lys Cys Lys Ala Asp Cys Asp Thr Cys Phe Asn Lys Asn Phe Cys Thr 100 105 110 Lys Cys Lys Ser Gly Phe Tyr Leu His Leu Gly Lys Cys Leu Asp Asn 115 120 125 Cys Pro Glu Gly Leu Glu Ala Asn Asn His Thr Met Glu Cys Val Ser 130 135 140 Ile Val His Cys Glu Val Ser Glu Trp Asn Pro Trp Ser Pro Cys Thr 145 150 155 160 Lys 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Arg Glu Leu Ser Lys Ser Arg Gln Thr Met Asp 290 295 300 Cys Ala Thr 305

Claims (14)

  1. BAP 세포를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계:
    a) 다능성 세포를, Wnt 신호전달 경로(signaling pathway)의 활성제를 포함하는 배양 배지에서 배양하여 유도 근축 중배엽 전구세포(iPAM) 세포를 수득하는 단계,
    b) iPAM 세포를 근원성 배양 배지에서 배양하는 단계,
    c) 임의로, 단계 b)의 종료시에 수득된 세포를, 혈청 또는 이의 등가물(equivalent)을 포함하고 임의로 FGF2 또는 이의 등가물을 추가로 포함하는 배양 배지에서 추가로 배양하는 단계,
    d) 단계 b) 또는 c)의 종료시에 수득된 세포를 계대배양(passaging)하고 이들을 배양 접시에 씨딩(seeding)하여 BAP를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법이 하기 단계:
    바람직하게는, 제1항에 정의된 바와 같은 단계 a), 단계 b), 임의의 단계 c) 및, 단계 d)를 포함하고, 하기 단계:
    e) 선택된 BAP 세포, 바람직하게는 단계 d)의 종료시에 수득가능한 것들을, 혈청 또는 이의 등가물을 포함하는 지방생성 배양 배지에서 배양하여 BA 세포를 수득하는 단계를 추가로 포함하는, BA 세포를 제조하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 a)가, 골 형태형성 경로(BPM) 신호전달 경로의 억제제 및 임의로 DMSO를 추가로 포함하는 배양 배지에서 수행되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서,
    a) Wnt 신호전달 경로가 표준 Wnt/베타 카테닌 신호전달 경로 및/또는 Wnt/PCP 신호전달 경로이고,
    b) 억제제 또는 BMP 신호전달 경로가 노긴(Noggin), 코르딘(Chordin), 코르딘-유사 1-3, 폴리스타틴(Follistatin), 폴리스타틴-유사 1-5, Dan 계열의 멤버 및 이의 변이체 및 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 b)가, 배양 배지, 혈청 또는 이의 등가물, BMP 수용체의 억제제, c-MET 수용체의 활성제 및 IGF 또는 인슐린 수용체의 활성제를 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이들로 이루어지는 근원성 배양 배지를 사용하여 수행되는, 방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 e)가 배양 배지, TGF베타/액티빈/NODAL 경로(바람직하게는 SB431542), EGF(상피 성장 인자) 수용체(바람직하게는 EGF)의 활성제, 아스코르브산, 및 코르티코이드 수용체(바람직하게는 하이드로코르티손)의 활성제를 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어지는 지방생성 배양 배지를 사용하여 수행되는, 방법.
  7. 제2항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, BA 세포가 UCP1의 발현을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, BAP 세포가 UCP1을 발현하는 BA 세포로 전환되는 이들의 능력을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제2항 내지 제7항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 수득할 수 있는 BA 세포의 모집단(population)으로서, UCP1을 발현하는 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%를 포함하는, BA 세포의 모집단.
  10. 제1항, 제3항 내지 제5항 및 제8항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 수득할 수 있는 BAP 세포의 모집단으로서, 제9항에 정의된 BA 세포의 모집단으로 전환되는 상기 모집단의 능력을 특징으로 하는, BA 세포의 모집단.
  11. 의약으로서 사용하기 위한, 제9항 또는 제10항에 따르는 BAP 또는 BA 세포의 모집단.
  12. 제9항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 따르는 BAP 또는 BA 세포의 모집단을 포함하는 조성물로서, 바람직하게는 상기 조성물이 약제학적 조성물인, 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 의약이 BA 또는 BAP 세포 활성과 관련된 질환 또는 병태(condition) 및 바람직하게는 대사성 질환 또는 병태, 예컨대, 비만 관련 병상(obesity-related pathology), 대사 증후군, 진성 당뇨병, 고지방증, NASH(비-알콜성 지방성 간염), 에너지 균형(섭취량 대 소비량)을 치료하기 위한 것인, BAP 또는 BA 세포의 모집단.
  14. 스크리닝(screenig) 목적을 위한, 제9항 또는 제10항에 정의된 BAP 또는 BA 세포의 모집단의 용도.
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