CN112430564A - 一种磁控三维细胞培养物调控方法 - Google Patents
一种磁控三维细胞培养物调控方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及组织工程与再生医学领域,特别是涉及一种三维细胞培养物调控方法。本发明提供一种三维细胞培养物调控方法,包括:A)提供磁性颗粒标记的三维细胞培养物;B)在受磁场作用的条件下,调控步骤A)所提供的三维细胞培养物。本发明所提供的三维细胞培养物调控方法,可以通过磁控手段将三维组织的构建过程与调控过程有序连接,实现了三维培养物的快速构建。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程与再生医学领域,特别是涉及一种三维细胞培养物调控方法。
背景技术
三维细胞培养体系的建立推动了类器官,微组织等技术的发展。也作为组织发育,疾病研究和药物筛选的模型,推动了生物医学领域研究的进步。然而,由于类器官、微组织等细胞聚合物等三维培养过程高度依赖细胞的自聚集特性,使得仅有胚胎干细胞、多能干细胞等特殊的干细胞能够形成三维多细胞结构,且产物具有极高的变异性;同时这一类三维培养要求高、过程复杂、费时长;构建三维结构由于缺乏血供系统,使得所形成的产物大小局限在直径500um左右,远远小于正常组织和器官的大小。以上均限制了其发展,特别是在器官移植和再生医学方面的发展。因此亟须要一种技术能够精确操控这一类三维组织的构建,并且改变传统的通过化学因子的调控手段。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种三维细胞培养物调控方法,用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明提供一种三维细胞培养物调控方法,包括:
A)提供磁性颗粒标记的三维细胞培养物;
B)在受磁场作用的条件下,调控步骤A)所提供的三维细胞培养物。
在本发明一些实施方式中,在受磁场作用的条件下,步骤A)所提供的三维细胞培养物在培养过程中被拉伸,优选在多个方向上被拉伸。
在本发明一些实施方式中,所述三维细胞培养物选自微组织、类器官、细胞聚集体、多层细胞膜片中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中,通过细胞内吞磁性颗粒的方法构建磁性颗粒标记的三维细胞培养物。
在本发明一些实施方式中,磁性颗粒标记的三维细胞培养物的构建方法包括:将细胞在包括磁性颗粒的培养液中共培养以提供磁性颗粒标记的细胞,通过磁性颗粒标记的细胞形成磁性颗粒标记的三维细胞培养物。
在本发明一些实施方式中,培养液中磁性颗粒的含量为10-100ug/ml,培养时间为2~4h。
在本发明一些实施方式中,所述细胞选自干细胞、成体细胞中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中,所述干细胞选自胚胎干细胞、多能干细胞、间充质干细胞中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中,所述成体细胞选自软骨细胞、骨细胞、上皮细胞、纤维细胞、内皮细胞、肝细胞中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中,所述磁性颗粒的材质包括四氧化三铁、三氧化二铁中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中,所述磁性颗粒的粒径为1~100nm。
在本发明一些实施方式中,所述磁性颗粒具有生物相容性。
在本发明一些实施方式中,所述磁场作用的条件中,磁场强度为50mT~500mT。
在本发明一些实施方式中,所述调控方法用于调控三维细胞培养物的形状。
在本发明一些实施方式中,所述调控方法用于调控细胞增殖和/或组织生长。
在本发明一些实施方式中,所述调控方法用于调控细胞的分化倾向,优选为血管化倾向或神经化倾向。
在本发明一些实施方式中,所述调控方法用于调控HIF-1α和/或VEGF表达量。
在本发明一些实施方式中,所述调控方法用于调控GAP43的表达量。
附图说明
图1显示为本发明实施例1实验结果示意图,其中,(A)磁控三维组织快速构建示意图;(B)垂直向磁控拉伸作用示意图;(C)磁性纳米颗粒标记细胞受磁控形成三维组织,并在不同磁场作用下形态变化,左侧为组织俯视及侧面照片,右侧为组织经microCT扫描后的三维重建图、剖面图以及剖面层面图。
图2显示为本发明实施例1实验结果示意图,其中,(A)EdU染色显示不同磁场作用下细胞增殖变化;(B)双侧磁铁作用组织中心区局部放大图;(C)不同磁场作用下组织内Hif-1α与VEGF表达情况;(D)不同磁场作用不同时间组织内HIF-1α及VEGF基因表达情况(n=3,★★p<0.01)。
图3显示为本发明实施例2实验结果示意图,其中,(A)磁控三维组织快速构建示意图;(B)水平向磁控拉伸作用示意图;(C)磁场水平拉伸构建组织显微镜镜下观察;(D)磁场水平拉伸作用下组织长度的变化(n=5,★★p<0.01)
图4显示为本发明实施例2实验结果示意图,其中,(A)磁场水平拉伸组织边缘处细胞增殖情况;(B)水平向拉伸磁场作用不同时间组织内HIF-1α及VEGF基因表达情况(n=3,★★p<0.01)。
图5显示为本发明实施例3实验结果示意图,其中,(A)磁控三维组织快速构建示意图;(B)多向磁控拉伸作用示意图;(C)磁控组织构建及磁场作用下组织多向拉伸microCT扫描三维重建图、剖面图及层面图;(D)磁场多向拉伸作用下组织高度与长度的变化(n=6,★★p<0.01)。
图6显示为本发明实施例3实验结果示意图,其中,(A)磁场多向拉伸组织及磁控构建组织植入裸鼠耳后皮下示意图;(B)激光多普勒血流扫描显示组织植入皮下后第1天、第7天时血流情况(n=6,★★p<0.01);(C)磁场拉伸组织植入皮下后第1天、第7天血流率;(D)免疫荧光染色显示植入组织内部CD31及α-SMA阳性血管情况;(E)免疫荧光染色显示植入组织内部CD31及GAP43表达情况。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰,以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。
本发明提供一种三维细胞培养物调控方法,包括:
A)将磁性颗粒标记的三维细胞培养物;
B)在受磁场作用的条件下,调控步骤A)所提供的磁性颗粒标记的三维细胞培养物。本发明发明人发现,将磁性颗粒标记的三维细胞培养物置于受磁场作用的条件下进行培养时,可以通过磁性颗粒在磁场引导下驱动细胞、影响细胞生物学行为,从而使磁场对细胞产生调控作用。所述三维细胞培养物调控方法可以是非诊断治疗目的的,也可以是体外的。
本发明所提供的细胞调控方法中,所述磁场作用的条件中,磁场强度可以为50mT~500mT、50mT~100mT、100mT~150mT、150mT~200mT、200mT~250mT、250mT~300mT、300mT~350mT、350mT~400mT、400mT~450mT、或450mT~500mT。通常来说,在受磁场作用的条件下,所提供的三维细胞培养物在培养过程中被拉伸,从而可以通过磁场拉伸作用调控三维细胞培养物的形状。三维细胞培养物所受的拉伸是细胞内的磁性颗粒在磁场作用下驱动细胞所产生的,所述拉伸的方向可以是单个方向上的拉伸,也可以为多个不同方向上的拉伸,优选可以在多个方向上被拉伸,拉伸的方向可以是任意的(例如,垂直方向、水平方向等),拉伸的作用力可以是间断的,也可以是持续的,磁场作用的条件下所形成的作用力可以是恒定的,也可以是变化的,从而可以更好地实现细胞调控。用于形成所述磁场作用的条件的方法对于本领域技术人员来说应该是公知的,例如,可以通过各种磁场生成装置形成所述磁场作用的条件,所述磁场生成装置具体可以是永磁铁、电磁铁等,磁场生成装置的大小、形状、强度、数量均可按所需的磁场作用的条件进行调整。
本发明所提供的三维细胞培养物调控方法中,所述三维细胞培养物(3-D cellcultures)通常具体指细胞的一种三维聚集体状态,所述三维细胞培养物通常是界于细胞和组织、器官之间的三维细胞聚合结构,所述三维细胞培养物具体可以是例如微组织、类器官、细胞聚集体(例如,细胞球)、多层细胞膜片等中的一种或多种的组合。
本发明所提供的三维细胞培养物调控方法中,提供磁性颗粒标记的三维细胞培养物的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的,只要使磁性颗粒进入细胞内即可,相关方法通常基本上不影响细胞的活性,例如,可以通过细胞内吞磁性颗粒的方法构建磁性颗粒标记的三维细胞培养物。更具体的,磁性颗粒标记的三维细胞培养物的构建方法可以包括:将细胞在包括磁性颗粒的培养液中共培养以提供磁性颗粒标记的细胞,通过磁性颗粒标记的细胞形成磁性颗粒标记的三维细胞培养物。在本发明一具体实施例中,培养液中磁性颗粒的含量可以为1-100ug/ml、1-3ug/ml、3-5ug/ml、5-10ug/ml、10-15ug/ml、15-20ug/ml、20-30ug/ml、30-40ug/ml、40-60ug/ml、60-80ug/ml、或80-100ug/ml,共培养的培养时间可以为2~4h、2~2.5h、2.5~3h、3~3.5h、或3.5~4h。在本发明一具体实施例中,通过磁性颗粒标记的细胞形成磁性颗粒标记的三维细胞培养物的方法具体可以是:将磁性颗粒标记的细胞聚集、培养。对细胞进行聚集的方法具体可以是超低吸附培养法、悬滴法、旋转培养法、微流控法等方法,也可以通过外加的磁力作用驱动细胞,快速形成细胞的聚集状态。施用上述方法时,具体可以使用超低吸附培养皿、悬滴板、生物反应器、微流控或磁力吸附的非依赖支架材料等器材对细胞进行聚集。
本发明所提供的三维细胞培养物调控方法中,所述细胞可以是各种能够被磁性颗粒标记的细胞、且具有增殖能力的细胞,例如,所述细胞可以是干细胞、成体细胞等中的一种或多种的组合;再例如,所述干细胞具体可以是胚胎干细胞、多能干细胞、间充质干细胞等中的一种或多种的组合;再例如,所述成体细胞具体可以是软骨细胞、骨细胞、上皮细胞、纤维细胞、内皮细胞、肝细胞等中的一种或多种的组合。在本发明一具体实施例中,所述细胞选自间充质干细胞,更具体选自牙髓干细胞,所述牙髓干细胞是牙髓来源的。
本发明所提供的细胞调控方法中,所述磁性颗粒可以是磁性纳米颗粒。所述磁性颗粒的粒径可以为1~100nm、1~3nm、3~5nm、5~10nm、10~15nm、15~20nm、20~30nm、30~40nm、40~50nm、50~60nm、60~800nm、或80~100nm。本发明中,所述磁性颗粒通常具有超顺磁性,即可以受外磁场吸引或排斥,且在外磁场消失后磁性会很快消失,以防止颗粒在磁性去除后继续聚集。所述磁性颗粒通常需要具有一定的细胞相容性以及磁导向性,从而可以被用于标记细胞,且不明显影响细胞的增殖。例如,所述磁性颗粒的材质可以选自四氧化三铁、三氧化二铁等中的一种或多种的组合,所述磁性颗粒也可以是表面经受功能化改性、修饰、包裹所获得的磁性颗粒。
本发明所提供的细胞调控方法中,调控步骤A)所提供的磁性颗粒标记的三维细胞培养物具体可以是培养所述三维细胞培养物。本领域技术人员可选择合适的方法培养所述三维细胞培养物。在本发明一具体实施例中,可以在37℃、5%CO2条件下,在DMEM高糖培养液中培养所述三维细胞培养物。
本发明所提供的三维细胞培养物调控方法中,所述三维细胞培养物调控方法可以用于:调控三维细胞培养物形状。所述三维细胞培养物可以通过磁场的调整,在合适方向上被拉伸,从而可以调控三维细胞培养物的形状,以形成目标形状的三维细胞培养物。本发明发明人发现,在受磁场拉伸作用的条件下,所形成的三维细胞培养物形状发生明显变化。
本发明所提供的三维细胞培养物调控方法中,所述三维细胞培养物调控方法可以用于:调控三维细胞培养物中细胞增殖和/或组织生长。本发明发明人发现,在受磁场拉伸作用的条件下,可以促进组成细胞增殖和/或组织生长,影响细胞的功能,从而验证了所述调控方法可以有效用于调控细胞增殖和/或组织生长,更具体为促进细胞增殖和/或组织生长。
本发明所提供的三维细胞培养物调控方法中,所述三维细胞培养物调控方法可以用于:调控培养物中细胞的分化倾向,具体可以是例如血管化和/或神经化倾向等。本发明发明人发现,在受磁场拉伸作用的条件下,培养步骤A)所提供的三维细胞培养物的过程中,其细胞中的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)及血管内皮生长因子VEGF的蛋白表达明显增高,不仅验证了所述调控方法可以用于调控或促进细胞中的HIF-1α和/或VEGF表达量,还验证了所述调控方法可以用于调控或促进三维细胞培养物的血管化倾向,有效促进了植入组织与宿主的整合。再例如,本发明发明人发现,在受磁场多个方向上拉伸作用的条件下,由牙髓干细胞构成的微组织在植入体内后也出现了神经标志物GAP43的表达,不仅验证了所述调控方法可以用于调控或促进细胞中的GAP43表达量,还验证了所述调控方法可以用于促进三维细胞培养物植入宿主体内后与宿主组织的整合。
本发明所提供的三维细胞培养物调控方法,可以通过磁控手段将三维组织的构建过程与调控过程有序连接,实现了三维培养物的快速构建。磁控拉伸调控作用可有效的改变产物的形状大小以及功能,促进产物的生长,与传统机械调控过程相比,磁控调控的装置更为简单经济,也可避免与产物的直接接触,通过磁场作用与胞内磁性颗粒产生内源性的机械作用力影响产物整体的状态。另外,磁控拉伸方式多,也可利用磁场的穿透特性,为磁控构建的三维细胞培养物在植入体内后,也能够进行调控,灵活性大,具有良好的产业化前景。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、免疫组织化学及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明,具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edition,2001;Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987and periodic updates;theseries METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998;METHODS INENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),AcademicPress,San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,ChromatinProtocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999等。
实施例1
垂直方向磁控拉伸调控三维细胞培养物:
步骤一、三维培养物的磁控快速构建:
纳米四氧化三铁分散液(10-30nm)(Macklin Biochemical,Shanghai,China),消毒后的四氧化三铁分散液经过无血清DMEM高糖培养液(HyClone,Logan,USA)稀释至100ug/mL。取牙髓干细胞在该培养基中孵育2h后,洗去未进入细胞的磁性纳米颗粒后,消化细胞,计数重悬成2×106个/mL。将一直径为2mm、高度为2mm的圆柱形N35级钕铁硼磁铁(NdFeB)定于培养皿底部(圆柱体长轴与培养皿底面垂直)(如图1A所示),向培养皿中加入约2×106个细胞。可观察到被磁性纳米颗粒标记的细胞快速沉淀至磁铁相对应的培养皿底部,即可形成具有三维结构的微组织。
步骤二、垂直方向磁控拉伸对三维细胞培养物形态的影响:
将另一枚直径为2cm、高度为2mm圆柱形N35级钕铁硼磁铁(NdFeB)固定在培养皿盖上其位置位于所构建三维细胞聚合物正上方,保持磁铁与培养液间2mm左右的距离(如图1B所示)。随着作用时间的延长,构建的组织会由扁平状态逐渐被拉高。作用24h后样本大体观察较未拉伸组的组织高度明显增加,组织经MicroCT扫描重建后可见与单侧组相比经双侧磁铁作用后的微组织被明显拉高(图1C)。
步骤三、垂直方向磁控拉伸对三维细胞培养物细胞增殖的影响:
通过EdU掺入法检测磁控拉伸作用对细胞增殖作用的影响,具体方法如下:需行EdU掺入法检测细胞增殖的样本需在收样前4h加入含有50μM EdU(Ribobio,C10310-1)的DMEM高糖完全培养基孵育。孵育结束后样本可经4%多聚甲醛固定或进行冰冻切片,按照试剂盒说明书进行Edu染色。
磁控拉伸作用组中EdU阳性增殖细胞层的厚度较单侧磁场作用组和无作用组要厚(图2A)。
步骤四、垂直方向磁控拉伸对三维细胞培养物血管化潜力的影响:
进一步我们研究了快速构建的三维组织在不同磁场作用下的血管化潜力,具体方法如下:构建的三维微组织,经过垂直方向拉伸作用24h后(具体方法参见本实施例中步骤二),可经4%多聚甲醛固定或进行冰冻切片,行免疫荧光染色。通过免疫荧光染色,我们发现磁控快速构建的三维组织的HIF-1α及VEGF即使在不缺氧的表层部位也有表达,在磁场拉伸持续作用24h后能够使HIF-1α及VEGF的蛋白表达明显增高(图2B)。
另外,我们通过检测垂直拉伸作用不同时间段的微组织中的HIF-1α及VEGF的基因表达情况也可发现:随着作用时间的增加,也增进了组织内HIF-1α及VEGF的表达,并且磁控拉伸作用可以进一步加强这一效应(图2C)。
实施例2
水平方向磁控拉伸调控三维细胞培养物:
步骤一、三维培养物的磁控快速构建:
纳米四氧化三铁分散液(10-30nm)(Macklin Biochemical,Shanghai,China),消毒后的四氧化三铁分散液经过无血清DMEM高糖培养液(HyClone,Logan,USA)稀释至100ug/mL。取牙髓干细胞在该培养基中孵育2h后,洗去未进入细胞的磁性纳米颗粒后,消化细胞,计数重悬成2×106个/mL。将一直径为1mm、高度为1mm的N35级钕铁硼磁铁(NdFeB)定于培养皿底部(圆柱体长轴与培养皿底面垂直)(图3A),向培养皿中加入约5×105个细胞。可观察到被磁性纳米颗粒标记的细胞快速沉淀至磁铁相对应的培养皿底部,逐渐形成三维细胞聚合物。
步骤二、水平方向磁控拉伸对三维细胞培养物形态的影响:
取下固定在培养皿底部的磁铁,迅速更换为长度为1mm的圆柱形N35级钕铁硼(NdFeB)磁铁(磁铁长轴与培养皿底面平行,长轴中心与构建组织中心重合)(图3B)。作用24h后,迅速更换为长度1.5mm的圆柱形N35级钕铁硼(NdFeB)磁铁。作用48小时后,迅速更换为长度2mm、直径为1mm的圆柱形N35级钕铁硼(NdFeB)磁铁。以此对构建组织产生水平方向上的拉伸作用。发现随着磁极的距离加长,组织的长度也逐渐增长,沿着磁铁长轴组织边缘处的细胞沿着磁场线向磁极处迁移(图3C)。我们测量了微组织的长度,发现微组织的长度随着磁铁的增长而延长,即磁场作用到第3天后,组织的长度较初始构建组织的长度显著提高,用2mm长度磁铁继续作用2天后组织的长度与第1天和第3天相比均有显著的统计学差异(图3D)。
步骤三、水平方向磁控拉伸对三维细胞培养物中细胞增殖的影响:
通过EdU染色我们观察到沿着拉伸方向组织边缘细胞的增殖情况,发现该区域大部分细胞为EdU阳性的增殖细胞(图4A),具体方法如下:需行Edu检测细胞增殖的样本需在收样前4h加入含有50μM EdU(Ribobio,C10310-1)的培养基孵育。孵育结束后样本可经4%多聚甲醛固定,按照试剂盒说明书进行Edu染色,取微组织边缘处进行共聚焦显微镜观察。发现边缘处可见大量EdU阳性增殖细胞。
步骤四、水平方向磁控拉伸对三维细胞培养物血管化潜力的影响:
进一步我们研究了快速构建的三维组织在水平磁场作用下的血管化潜力,具体方法如下构建的三维微组织,经过水平方向拉伸作用24h后(具体方法参见本实施例中步骤二),通过检测水平拉伸作用的微组织中的HIF-1α及VEGF的基因表达情况也可发现:发现在水平方向将微组织拉长的过中,HIF-1α和VEGF的表达时显著提高的(图4B)。
实施例3
多方向磁控拉伸调控三维细胞培养物:
步骤一、三维培养物的磁控快速构建:
纳米四氧化三铁分散液(10-30nm)(Macklin Biochemical,Shanghai,China),消毒后的四氧化三铁分散液经过无血清DMEM高糖培养液(HyClone,Logan,USA)稀释至100ug/mL。取牙髓干细胞在该培养基中孵育2h后,洗去未进入细胞的磁性纳米颗粒后,消化细胞,计数重悬成2×106个/mL。将一直径为3mm、高度为2mm的圆柱形N35级钕铁硼(NdFeB)磁铁固定于培养皿底部(圆柱体长轴与培养皿底面垂直)(图5A),向培养皿中加入约4.5×106个细胞。可观察到被磁性纳米颗粒标记的细胞快速沉淀至磁铁相对应的培养皿底部,逐渐形成三维微组织,其平均高度约0.67mm、底部平均宽度为3.36mm。
步骤二、多向磁控拉伸对三维细胞培养物形态的影响:
取下固定在培养皿底部的磁铁,迅速更换为长度为5mm,直径为2mm的圆柱形N35级钕铁硼(NdFeB)磁铁(磁铁长轴与培养皿底面平行,长轴中心与构建组织中心重合),同时,将另一枚直径为5mm、高度为2mm圆柱形N35级钕铁硼磁铁(NdFeB)培养皿盖上,其位置位于所构建三维细胞聚合物正上方,保持磁铁与培养液间2mm左右的距离(图5B)。作用24h后,MicroCT扫描重建样本,我们测量了微组织的长度,发现多向磁场拉伸作用下的微组织的长度与高度都明显增长,平均长度可达4.3mm,平均高度可达1.2mm,具体变化如图5C和5D所示。
步骤三、多向磁控拉伸对三维细胞培养物功能的影响:
我们在体外通过步骤一、步骤二磁控快速构建了大块的三维组织,经过多向磁控拉伸作用24小时后,植入4周龄裸鼠(BALB/c)耳后皮下(如图6A所示)。通过多普勒血流仪观察其血管化情况:分别在组织植入皮下1天和7天检测其血管话情况我们发现,植入的组织在7天时均有不同程度血管化,多向拉伸作用组的血管化情况较单侧磁场作用组显著提高(图6B)。使用激光多普勒血流仪自带定量分析软件检测其血流比率可知在7天时的多向拉伸组血流比相较单侧磁铁组明显提升(图6C)。植入第7天时,取材,组织固定、石蜡包埋、切片后行免疫荧光染色,可见CD31及α-SMA阳性血管在多向拉伸组较单侧作用组更加丰富(图6D)。同时我们通过组织内神经标志物GAP43的免疫荧光染色发现,经过多向拉伸处理的组织出现GAP43表达(图6E)。
综上所述,本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种三维细胞培养物调控方法,包括:
A)提供磁性颗粒标记的三维细胞培养物;
B)在受磁场作用的条件下,调控步骤A)所提供的三维细胞培养物。
2.如权利要求1所述的三维细胞培养物调控方法,其特征在于,在受磁场作用的条件下,步骤A)所提供的三维细胞培养物在培养过程中被拉伸,优选在多个方向上被拉伸。
3.如权利要求1所述的三维细胞培养物调控方法,其特征在于,所述三维细胞培养物选自微组织、类器官、细胞聚集体、多层细胞膜片中的一种或多种的组合。
4.如权利要求1所述的三维细胞培养物调控方法,其特征在于,通过细胞内吞磁性颗粒的方法构建磁性颗粒标记的三维细胞培养物。
5.如权利要求4所述的三维细胞培养物调控方法,其特征在于,磁性颗粒标记的三维细胞培养物的构建方法包括:将细胞在包括磁性颗粒的培养液中共培养以提供磁性颗粒标记的细胞,通过磁性颗粒标记的细胞形成磁性颗粒标记的三维细胞培养物。
6.如权利要求5所述的三维细胞培养物调控方法,其特征在于,培养液中磁性颗粒的含量为10-100ug/ml,培养时间为2~4h。
7.如权利要求1所述的三维细胞培养物调控方法,其特征在于,所述细胞选自干细胞、成体细胞中的一种或多种的组合。
8.如权利要求7所述的三维细胞培养物调控方法,其特征在于,所述干细胞选自胚胎干细胞、多能干细胞、间充质干细胞中的一种或多种的组合,所述成体细胞选自软骨细胞、骨细胞、上皮细胞、纤维细胞、内皮细胞、肝细胞中的一种或多种的组合。
9.如权利要求1所述的三维细胞培养物调控方法,其特征在于,所述磁性颗粒的材质包括四氧化三铁、三氧化二铁中的一种或多种的组合;
和/或,所述磁性颗粒的粒径为1~100nm;
和/或,所述磁性颗粒具有生物相容性;
和/或,所述磁场作用的条件中,磁场强度为50mT~500mT。
10.如权利要求1所述的三维细胞培养物调控方法,其特征在于,所述调控方法用于调控三维细胞培养物的形状;
和/或,所述调控方法用于调控细胞增殖和/或组织生长;
和/或,所述调控方法用于调控细胞的分化倾向,优选为血管化倾向或神经化倾向;
和/或,所述调控方法用于调控HIF-1α和/或VEGF表达量;
和/或,所述调控方法用于调控GAP43的表达量。
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