WO2022239909A1 - 시프로플록사신에 의한 줄기세포의 연골전구세포로의 유도 및 연골세포로의 분화 - Google Patents
시프로플록사신에 의한 줄기세포의 연골전구세포로의 유도 및 연골세포로의 분화 Download PDFInfo
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- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
Definitions
- the present invention relates to the inducing effect of ciprofloxacin to induce chondrogenic progenitor cells from stem cells and differentiate into chondrocytes.
- cartilage disease is the most frequently caused degenerative disease due to the aging of the population.
- cartilage tissue ages, in addition to the decrease in cartilage thickness and the number of chondrocytes, changes in the composition of the matrix are caused, and changes in cell functions are also induced.
- cartilage is known as a tissue that cannot regenerate itself after damage because it does not have blood vessels, nerves, and lymph tissues.
- drugs such as pain relievers, steroids or non-steroidal anti-inflammatory drugs, hyaluronic acid, collagen, or the like, or to perform artificial joint surgery.
- drugs or surgeries have limitations in helping to maintain, or have limitations in the environment such as age and allergy.
- Ciprofloxacin is a type of antibiotic that is safe enough to be listed on the WHO list of essential drugs, and is registered and distributed in Korea as well as the FDA. .
- the inventors of the present invention completed the present invention by confirming that ciprofloxacin can induce differentiation of stem cells into chondrocytes and simultaneously induce stem cells into chondrogenic progenitor cells before maturation into chondrocytes.
- An object of the present invention is to provide a composition for inducing chondrogenic progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors.
- Another object of the present invention is to provide a composition for inducing differentiation from stem cells into chondrocytes containing ciprofloxacin.
- Another object of the present invention is to provide chondrogenic progenitor cells derived from a composition for inducing chondrogenic progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors.
- Another object of the present invention is to provide differentiated chondrocytes from a composition for inducing differentiation from stem cells to chondrocytes containing ciprofloxacin.
- Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for use in the prevention or treatment of cartilage-related diseases, including a composition for inducing cartilage progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors.
- Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for use in the prevention or treatment of cartilage-related diseases, including a composition for inducing differentiation from stem cells to chondrocytes containing ciprofloxacin.
- Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for use in the prevention or treatment of cartilage-related diseases comprising the chondrogenic progenitor cells according to the present invention.
- Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for use in the prevention or treatment of cartilage-related diseases comprising chondrocytes according to the present invention.
- Another object of the present invention is to provide a method for inducing chondrogenic progenitor cells from stem cells, comprising culturing the stem cells in a medium containing a composition for inducing chondrogenic progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors. is to do
- Another object of the present invention is to provide a method for treating cartilage-related diseases comprising administering a composition for inducing cartilage progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors to a subject in need thereof.
- Another object of the present invention is to provide a method for treating cartilage-related diseases comprising administering chondrogenic progenitor cells derived from a composition for inducing cartilage progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors to a subject in need thereof. is to provide
- Another object of the present invention is to provide a method for producing prochondral cells comprising culturing stem cells in a medium containing a composition for inducing prochondral cells from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors.
- Another object of the present invention is to provide uses of ciprofloxacin and growth factors for the preparation of a composition for inducing cartilage progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors.
- Another object of the present invention is to provide the use of a composition for inducing chondrogenic progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors for the preparation of chondrogenic progenitor cells.
- Another object of the present invention is to provide the use of a composition for inducing cartilage progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors for the manufacture of a pharmaceutical composition for preventing or treating cartilage-related diseases.
- Another object of the present invention is the use of chondrogenic progenitor cells induced by a composition for inducing cartilage progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors for the manufacture of a pharmaceutical composition for preventing or treating cartilage-related diseases. is to provide
- Another object of the present invention is to provide a method for inducing differentiation from stem cells into chondrocytes, which includes culturing the stem cells in a medium containing a composition for inducing differentiation from stem cells into chondrocytes containing ciprofloxacin.
- Another object of the present invention is to provide a method for treating cartilage-related diseases comprising administering a composition for inducing differentiation from stem cells to chondrocytes containing ciprofloxacin to a subject in need thereof.
- Another object of the present invention is to provide a method for treating cartilage-related diseases comprising administering chondrocytes differentiated from a composition for inducing differentiation from stem cells to chondrocytes containing ciprofloxacin to a subject in need thereof.
- Another object of the present invention is to provide a method for producing chondrocytes comprising culturing stem cells in a medium containing a composition for inducing differentiation from stem cells into chondrocytes containing ciprofloxacin.
- Another object of the present invention is to provide a use of ciprofloxacin for preparing a composition for inducing differentiation from stem cells into chondrocytes.
- Another object of the present invention is to provide the use of a composition for inducing differentiation from stem cells into chondrocytes containing ciprofloxacin for the production of chondrocytes.
- Another object of the present invention is to provide a use of a composition for inducing differentiation from stem cells to chondrocytes, including ciprofloxacin, for the manufacture of a pharmaceutical composition for preventing or treating cartilage-related diseases.
- Another object of the present invention is the use of chondrocytes differentiated by a composition for inducing differentiation from stem cells to chondrocytes containing ciprofloxacin for the manufacture of a pharmaceutical composition for preventing or treating cartilage-related diseases. is to provide
- the present invention provides a composition for inducing cartilage progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and a growth factor.
- the present invention provides a composition for inducing differentiation from stem cells into chondrocytes containing ciprofloxacin.
- mesenchymal stem cell refers to a cell having infinite proliferative ability in an undifferentiated state and the ability to differentiate into cells of various tissues by a specific differentiation inducing stimulus.
- the mesenchymal stem cell of the present invention may be any cell having differentiation and proliferative potential, and can be derived from humans, monkeys, pigs, horses, cows, sheep, It can be derived from any animal such as dogs, cats, mice, rabbits, etc., preferably human-derived, more preferably human adipose tissue, bone marrow, peripheral blood, Or it may be isolated from umbilical cord blood, etc., and most preferably, it may be derived from fat.
- CPFX Ciprofloxacin
- CPFX is an antibiotic used to treat numerous pathogenic infections in the past, and is an antibiotic listed on the WHO list of essential drugs, which is the most effective and safe drug list essential in the medical system.
- stem cells are cultured in a medium containing such ciprofloxacin, the stem cells are induced into cartilage progenitor cells or the stem cells are differentiated into chondrocytes.
- the term “paracrine effect” means that the cartilage progenitor cells or chondrocytes do not replace or regenerate cartilage cells or cartilage tissue, but various useful substances secreted from the cartilage progenitor cells or chondrocytes in vivo It means that cartilage-related diseases can be prevented or treated by activating chondrocytes or chondrocytes.
- the useful material may be SOX9 (SRY-Box Transcription Factor 9) or COMP (Cartilage Oligomeric Matrix Protein), but is not limited thereto.
- ciprofloxacin after culturing stem cells in a medium, ciprofloxacin was administered to a medium containing stem cells to confirm cytotoxicity of ciprofloxacin. As a result, there was no significant difference compared to the control group (CONT) in cell viability. It was confirmed that ciprofloxacin showed biocompatibility without cytotoxicity.
- the composition of the medium containing ciprofloxacin for the induction of chondrogenic progenitor cells from the stem cells of the present invention is not limited in composition ratio, but the basal medium is DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) or a-MEM medium containing 1 to 10% FBS, and may contain growth factors such as ciprofloxacin, EGF, FGF, VEGF, and SGF, preferably EGF and FGF. However, it is not limited thereto.
- the content of the EGF may be included in an amount of 0.1 to 100 ng based on the total weight of the medium composition, and the FGF is removed from the stem cells.
- the content of FGF may be included as 0.1 to 100 ng.
- the content of ciprofloxacin for the induction of chondrocytes from stem cells may be 0.01 to 1 uM, preferably 0.1 to 1 uM, based on the total weight of the medium composition, but is not limited thereto.
- the composition of the medium containing ciprofloxacin for inducing differentiation from stem cells to chondrocytes according to the present invention is not limited in its composition ratio, but the basal medium is DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) or a-MEM medium containing 1 to 10% FBS, and may contain ciprofloxacin.
- DMEM Denbecco's Modified Eagle's Medium
- FBS FBS
- the medium containing ciprofloxacin for inducing differentiation from stem cells to chondrocytes may not contain other factors such as growth factors other than ciprofloxacin.
- the content of ciprofloxacin for inducing differentiation from stem cells to chondrocytes may be included in the range of 0.05 to 10uM or 0.08 to 8uM, preferably 0.1 to 6uM, based on the total weight of the medium composition. However, it is not limited thereto.
- differentiation means a phenomenon in which structures and functions are specialized from each other during growth by dividing and proliferating, that is, cells, tissues, etc. of organisms form or function to perform their assigned tasks. that this is changing Differentiation in the present invention means differentiation from stem cells to chondrocytes.
- the present invention when the stem cell function marker expression rate, self-renewal ability and multipotency of the cartilage progenitor cells derived from the composition for inducing cartilage progenitor cells from stem cells according to the present invention are compared with stem cells, the present invention
- the chondrogenic progenitor cells induced using the composition for inducing chondrogenic progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors according to the method can self-replicate similarly to stem cells, and furthermore, induce fat differentiation, osteogenic differentiation, and cartilage differentiation. It was confirmed that induction was possible and that the surface antigen of mesenchymal stem cells was expressed.
- cartilage differentiation ability of the chondrogenic progenitor cells derived from the composition for inducing chondrogenic progenitor cells from stem cells according to the present invention is compared with the stem cells, stem cells containing ciprofloxacin and growth factors according to the present invention
- cartilage progenitor cells derived from the composition for inducing cartilage progenitor cells are applied to cartilage cell treatment, cartilage hypertrophy and COMP induced by the exponential increase in SOX9 that occurs when cartilage cells are treated using stem cells It was confirmed that problems such as the absence of hyaline cartilage, such as the absence of Col2 that hardens cartilage, can be solved.
- cartilage differentiation ability of the chondrogenic progenitor cells derived from the composition for inducing chondrogenic progenitor cells from stem cells according to the present invention is compared with the stem cells, the stem cells containing ciprofloxacin and growth factors according to the present invention
- cartilage progenitor cells derived from the composition for inducing cartilage progenitor cells from cells were treated with chondrocytes in which an inflammatory reaction was induced, it was confirmed that the cartilage progenitor cells had better chondrocyte regeneration ability than stem cells.
- a hypertensive response is induced in chondrocytes using a plate containing an insert.
- the expression level of ADAMTS4 was reduced by about 35%, and when the plate was directly treated, it was confirmed that the expression level of ADAMTS4 was reduced by about 76%.
- composition for inducing chondrogenic progenitor cells from stem cells according to the present invention had excellent ability to inhibit chondrolytic enzyme in chondrogenic progenitor cells.
- the cartilage degrading enzyme is an enzyme that decomposes cartilage, and may be known as conventional cartilage degrading enzymes such as ADAMTS4, ADAMTS5, MMP-13, and the like.
- the present invention provides chondrogenic progenitor cells derived from a composition for inducing chondrogenic progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors.
- stem cells were induced to differentiate into chondrocytes when ciprofloxacin was treated.
- the stem cells differentiated into chondrocytes the cells were densely populated to confirm tissue-like properties, and it was confirmed that Alcian blue staining, which appears dependent on SOX9, was applied to the chondrocytes as a whole.
- the present invention provides chondrocytes differentiated from a composition for inducing differentiation from stem cells to chondrocytes containing ciprofloxacin.
- SOX9 is a marker gene for cartilage differentiation or chondrocytes or a cartilage differentiation marker, such as Aggrecan (ACAN), COMP or Col2a.
- SOX9 is a transcription factor that plays a key role in cartilage formation and development. When SOX9 is excessively suppressed, it is known that the expression of ACAN and Col2a, which are major components of cartilage, are not well expressed (Cha BH et al. Cartilage tissue formation from dedifferentiated chondrocytes by codelivery of BMP-2 and SOX-9 genes encoding bicistronic vector. Cell Transplant 2012).
- the composition for inducing differentiation from stem cells to chondrocytes from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors or the composition for inducing differentiation from stem cells to chondrocytes containing ciprofloxacin according to the present invention contains SOX9, ACAN, Expression of one or more genes selected from the group consisting of COMP and Col2a may be increased.
- chondrogenic progenitor cells derived from the composition for inducing chondrogenic progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors or a composition for inducing differentiation from stem cells to chondrocytes containing ciprofloxacin Chondrocytes differentiated from can be used for the prevention or treatment of diseases requiring cartilage regeneration, such as cartilage-related diseases.
- the cartilage-related disease may be one or more selected from the group consisting of, but not limited to, osteoarthritis, osteoarthritis, osteochondrosis, degenerative arthritis, rheumatoid arthritis, osteomalacia, fibrotic osteitis, and aplastic bone disease.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for use in preventing or treating cartilage-related diseases, including a composition for inducing cartilage progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for use in preventing or treating cartilage-related diseases, including a composition for inducing differentiation from stem cells into chondrocytes containing ciprofloxacin.
- the present invention provides a pharmaceutical composition
- a pharmaceutical composition comprising chondrogenic progenitor cells derived from the composition for inducing chondrogenic progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors for use in preventing or treating cartilage-related diseases.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for use in the prevention or treatment of cartilage-related diseases containing differentiated chondrocytes from the composition for inducing differentiation from stem cells to chondrocytes containing ciprofloxacin.
- the pharmaceutical composition of the present invention includes a composition for inducing chondrogenic progenitor cells containing ciprofloxacin and a growth factor, a composition for inducing differentiation from stem cells to chondrocytes containing ciprofloxacin, and a prochondral cartilage according to the present invention.
- a composition for inducing chondrogenic progenitor cells containing ciprofloxacin and a growth factor a composition for inducing differentiation from stem cells to chondrocytes containing ciprofloxacin
- a prochondral cartilage according to the present invention.
- pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents may be included.
- the carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methyl hydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
- the pharmaceutical composition of the present invention can be applied in any dosage form, and more specifically, it may be a parenteral dosage form.
- the parenteral formulation may be in the form of a spray such as injection, application, or aerosol. More specifically, it may be in the form of an injection.
- Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried formulations, and suppositories.
- Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.
- composition of the present invention may be mixed in water with a stabilizer or buffer to prepare a solution or suspension, which may be formulated for unit administration in an ampoule or vial.
- the present invention also provides a method for preventing or treating cartilage-related diseases, comprising administering the pharmaceutical composition according to the present invention to a subject in need thereof.
- the cartilage disease may be at least one selected from the group consisting of osteoarthritis, osteoarthritis, dyschondrosis, degenerative arthritis, rheumatoid arthritis, osteomalacia, fibrous osteitis, and aplastic bone disease, but is not limited thereto.
- pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is based on the patient's sexually transmitted disease, age, type of disease, severity, It may be determined according to the activity of the drug, the sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of excretion, the duration of treatment, factors including drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
- the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, or may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents.
- the pharmaceutical composition of the present invention may be administered single or multiple times. It is important to administer the amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects in consideration of all the above factors, and can be easily determined by those skilled in the art.
- subject of the present invention includes animals such as horses, sheep, pigs, goats, camels, antelopes, dogs, or humans having cartilage-related diseases whose symptoms can be improved by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention. do. Cartilage-related diseases can be effectively prevented or treated by administering the pharmaceutical composition for prevention or treatment according to the present invention to a subject.
- administration means introducing a predetermined substance into a human or animal by any appropriate method, and the administration route of the composition for prevention or treatment according to the present invention is any general route as long as it can reach the target tissue. It can be administered orally or parenterally through.
- the composition for preventing or treating cartilage-related diseases according to the present invention may be administered by any device capable of moving active ingredients to target cells.
- the preferred dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention varies depending on the condition and body weight of the patient, the severity of the disease, the drug type, the route and duration of administration, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
- the stem cells are progenitor cartilage cells.
- chondrogenic progenitor cells can be induced by using the composition for inducing cartilage progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors, and from stem cells containing ciprofloxacin.
- Differentiation into chondrocytes can be induced by using the composition for inducing differentiation into chondrocytes.
- Another aspect of the present invention relates to a method for inducing chondrogenic progenitor cells from stem cells, comprising culturing the stem cells in a medium containing a composition for inducing chondrogenic progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors.
- Another aspect of the present invention relates to a method for treating a cartilage-related disease comprising administering a composition for inducing cartilage progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and a growth factor to a subject in need thereof.
- Another aspect of the present invention is a method for treating cartilage-related diseases comprising administering chondrogenic progenitor cells derived from a composition for inducing chondrogenic progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors to a subject in need thereof. It is about.
- Another aspect of the present invention relates to a method for producing chondrogenic progenitor cells comprising culturing stem cells in a medium containing a composition for inducing chondrogenic progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors.
- Another aspect of the present invention relates to the use of ciprofloxacin and growth factors for the preparation of a composition for inducing cartilage progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors.
- Another aspect of the present invention relates to the use of a composition for inducing chondrogenic progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and a growth factor for producing chondrogenic progenitor cells.
- Another aspect of the present invention relates to the use of a composition for inducing cartilage progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and a growth factor for the manufacture of a pharmaceutical composition for preventing or treating cartilage-related diseases.
- Another aspect of the present invention is the use of chondrogenic progenitor cells induced by the composition for inducing cartilage progenitor cells from stem cells containing ciprofloxacin and growth factors for the manufacture of a pharmaceutical composition for preventing or treating cartilage-related diseases. It is about.
- the composition of the medium containing ciprofloxacin for the induction of chondrogenic progenitor cells from stem cells is not limited in its composition ratio, but the basal medium is DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) containing 1 to 10% FBS or It is an a-MEM medium containing 1 to 10% FBS, and may contain ciprofloxacin and growth factors such as EGF, FGF, VEGF, and SGF.
- the growth factors include EGF and FGF. It may be, but is not limited thereto.
- another aspect of the present invention relates to a method for inducing differentiation from stem cells to chondrocytes, comprising culturing the stem cells in a medium containing a composition for inducing differentiation from stem cells to chondrocytes containing ciprofloxacin. .
- Another aspect of the present invention relates to a method for treating a cartilage-related disease comprising administering a composition for inducing differentiation from stem cells to chondrocytes containing ciprofloxacin to a subject in need thereof.
- Another aspect of the present invention relates to a method for treating a cartilage-related disease comprising administering chondrocytes differentiated from a composition for inducing differentiation from stem cells to chondrocytes containing ciprofloxacin to a subject in need thereof.
- Another aspect of the present invention relates to a method for producing chondrocytes comprising culturing stem cells in a medium containing a composition for inducing differentiation from stem cells to chondrocytes containing ciprofloxacin.
- Another aspect of the present invention relates to the use of ciprofloxacin for preparing a composition for inducing differentiation from stem cells into chondrocytes.
- Another aspect of the present invention relates to the use of a composition for inducing differentiation from stem cells into chondrocytes, including ciprofloxacin for the production of chondrocytes.
- Another aspect of the present invention relates to the use of a composition for inducing differentiation from stem cells into chondrocytes containing ciprofloxacin for the manufacture of a pharmaceutical composition for preventing or treating cartilage-related diseases.
- Another aspect of the present invention is the use of chondrocytes differentiated by a composition for inducing differentiation from stem cells to chondrocytes containing ciprofloxacin for the manufacture of a pharmaceutical composition for preventing or treating cartilage-related diseases. It is about.
- stem cell refers to a cell having self-renewal capacity in an undifferentiated state and the ability to differentiate into cells of various tissues by a specific differentiation inducing stimulus (Multi-differentiation Potency). , Preferably it may be mesenchymal stem cells.
- the medium containing ciprofloxacin and growth factors used when inducing chondrogenic progenitor cells from stem cells may contain 0.01 to 1uM, preferably 0.1 to 1uM of ciprofloxacin based on the total weight of the medium composition, , Each of the growth factors may be included in an amount of 0.1 to 100 ng based on the total weight of the medium composition, but is not limited thereto.
- the medium containing ciprofloxacin used when inducing differentiation of chondrocytes from stem cells may be included in the range of 0.01 to 10uM or 0.08 to 8uM, preferably 1 to 6uM, based on the total weight of the medium composition. It may be, but is not limited thereto.
- the medium for culturing stem cells may be, but is not limited to, DMEM or a-MEM medium containing fetal bovine serum (FBS).
- FBS fetal bovine serum
- the FBS may be contained in 1 to 15% or 1 to 13% based on the total weight of the medium composition, preferably 1 to 10%.
- prevention refers to any action that prevents the occurrence of a desired symptom or disease by administering the composition of the present invention, or delays its occurrence or expression.
- treatment means any action that improves or disappears a desired symptom or disease by administering the composition of the present invention.
- the content of ciprofloxacin and growth factors contained in the composition of the present invention can induce chondrogenic progenitor cells from stem cells or induce differentiation from stem cells into chondrocytes, It can be included in various amounts.
- the active ingredient is included below the lower limit, induction from stem cells to chondrogenic progenitor cells may not be exerted, or differentiation from stem cells to chondrocytes may not be induced, and when the active ingredient is included above the upper limit, toxicity to cells may not be exhibited. this can happen
- the composition according to the present invention can induce induction of stem cells into chondrogenic progenitor cells or differentiation into chondrocytes.
- cartilage progenitor cells according to the present invention exhibit an excellent cartilage regeneration effect compared to stem cells.
- composition, chondroprogenitor cells or chondrocytes according to the present invention can be used for preventing or treating cartilage-related diseases.
- Figure 1a shows the characteristics of stem cells as a basic feature that stem cells have.
- Figure 1b shows the basic characteristics of stem cells, showing positive reactions for CD29, 73, 90, and 105, and negative reactions for CD31, 34, and 45 in the immunophenotype expressed by stem cells.
- Figure 1c is a characteristic that stem cells have by default, and in order to confirm the multipotential in the differentiation capacity of mesenchymal stem cells, the differentiation capacity into fat, bone, and cartilage was confirmed.
- Figure 1d shows the results showing the self-renewal ability as a basic feature of stem cells through a colony forming assay.
- Figure 1e confirms that there is no change that causes genetic defects even after culturing up to 6 passages, showing that the stem cells of the present invention are stable.
- Figure 2 shows the results confirming the cytotoxicity of ciprofloxacin.
- Figure 3a shows changes in cell properties and proteins during the induction of differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes using ciprofloxacin in a 2D method.
- Figure 3b shows the results of confirming the cell properties and protein changes during the induction of differentiation of stem cells into chondrocytes using ciprofloxacin using a 3D method.
- Figure 4a shows the characteristics of chondrogenic progenitor cells induced by ciprofloxacin.
- Figure 4b shows that genetic mutations of the cells induced by karyotype analysis of chondrogenic progenitor cells induced by ciprofloxacin did not occur.
- Figure 5a shows the result of confirming the expression rate of the stem cell potential marker of the progenitor cells and stem cells according to the present invention.
- Figure 5b shows the result of confirming the self-renewal ability of the chondrogenic progenitor cells and stem cells according to the present invention.
- Figure 5c shows the result of confirming the multipotential (adipogenic differentiation inducing ability, osteogenic differentiation inducing ability, and cartilage differentiation inducing ability) of the chondrogenic progenitor cells and stem cells according to the present invention.
- Figure 6a shows the result of confirming the mRNA expression level of SOX9 according to the induction of the differentiation of chondrogenic progenitor cells and stem cells according to the present invention.
- Figure 6b shows that COMP increases as SOX9 decreases in the case of chondrogenic progenitor cells according to the present invention, but increases in the early stage of differentiation induction and then decreases in the case of stem cells.
- Figure 7a shows the result of confirming the chondrocyte regeneration effect of the chondrogenic progenitor cells and stem cells according to the present invention.
- FIG. 7B shows the result of analyzing the regenerated chondrocyte area in the chondrocyte progenitor cell treatment group and the stem cell treatment group, normal chondrocytes and inflammatory chondrocytes according to the present invention.
- Figure 8 shows the results of confirming the inhibitory effect of cartilage degrading enzyme (ADAMTS4) of chondrogenic progenitor cells according to the present invention.
- Stem cells are cultured by attaching more than 80% of DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) or a-MEM containing 1 to 10% FBS.
- DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
- FBS FBS
- the cells were recovered using Trypsin-EDTA, counted, seeded in a 96-well plate at 1x10 3 cells/well, adhered for 24 hr, and then ciprofloxacin (Samsung Pharmaceutical, ciprofloxacin strain) was administered according to the concentration, and cells were then administered for a specific time (up to 166 hr). After confirming the toxicity, apply Cell Counting Kit-8 (hereafter CCK, DOJINDO, Cat.No. CK04-13) at 10ul/well, and then incubate in a 37°C, 5% CO 2 incubator for 1 hour.
- CCK Cell Counting Kit-8
- Absorbance is measured using an absorbance meter (Bio-Tek, Epoch2) and quantitatively calculated.
- Stem cells are cultured by attaching more than 80% of DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) or a-MEM containing 1 to 10% FBS.
- DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
- FBS FBS
- the cells were recovered using Trypsin-EDTA, counted, seeded in a 96-well plate at 1x10 3 cells/well, adhered for 24 hr, and then ciprofloxacin (Samsung Pharmaceutical, ciprofloxacin strain) was administered according to the concentration, and cells were then administered for a specific time (up to 166 hr). After confirming the toxicity, apply Cell Counting Kit-8 (hereafter CCK, DOJINDO, Cat.No. CK04-13) at 10ul/well, and then incubate in a 37°C, 5% CO 2 incubator for 1 hour.
- CCK Cell Counting Kit-8
- stem cells induced to differentiate for 16 days were washed with water using DPBS and fixed with 4% Paraformaldehyde for 1 hour.
- Stem cells are cultured by attaching more than 80% of DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) or a-MEM containing 1 to 10% FBS.
- DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
- FBS FBS
- the cells are recovered using Trypsin-EDTA, counted, and then inoculated with 5x10 5 cells in a 15mL conical tube, and then using a centrifuge (Hanil Science, Combi415) with a medium containing 0.1 to 6uM of ciprofloxacin to settle the cells to 150g. Incubate for 16 days while changing the medium every 2 to 3 days in a 37°C, 5% CO 2 incubator.
- Stem cells are cultured in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) containing 1 to 10% FBS or a-MEM with at least 80% adherence. Then, the cells are recovered using Trypsin-EDTA, counted, and then suspended in FLASK with a medium containing growth factors such as 0.1 to 1uM of ciprofloxacin, 0.1 to 100ng of EGF, and 0.1 to 100ng of FGF. The culture medium is changed every 2 to 3 days. This is repeated for 1 to 3 passages.
- the cultured stem cells (collected from tissues donated from hospitals for non-profit patient treatment) and chondrogenic progenitor cells induced in Example 4 are collected and washed.
- the stem cell markers CD73, CD90, CD105, CD31, CD34, and CD45 are stained for 1 hour at 4° C., followed by centrifugation at 1500 RPM and 3 min. Thereafter, after washing twice with FACs buffer (buffer), expression was confirmed using FACS (BD, Accuri6) equipment.
- the stem cell positive marker it was confirmed to be positive in the cartilage progenitor cells
- the negative marker it was confirmed to be negative in the cartilage progenitor cells as well.
- colony forming assay and bone cell differentiation ability, chondrocyte differentiation ability, and adipocyte differentiation ability were performed using commonly used media or kits, and the same or similar values as those of stem cells were confirmed.
- the chondrogenic differentiation capacity of the cultured stem cells (collected from tissues donated from hospitals for non-profit patient treatment) and the cartilage progenitor cells prepared in Example 4 were compared.
- COMP a component constituting the matrix according to the organization of chondrocytes, increased as SOX9 decreased in chondrocytes, but in the case of stem cells, it increased and then decreased in the early stage of induction of differentiation (Fig. 6b) .
- cartilage progenitor cells when cartilage progenitor cells are applied to cartilage cell therapy, cartilage hypertrophy (induced by the exponential increase of SOX9) and absence of hyaline cartilage (COMP Absence of Col2 that hardens back cartilage), etc. can be solved.
- the chondrocyte regeneration effect of the cultured stem cells (collected from tissues donated from hospitals for non-profit patient treatment) and the chondroprogenitor cells prepared in Example 4 were compared.
- LPS is used in chondrocytes to induce an inflammatory response. Thereafter, a scratch of 2 mm or more was applied to cause physical stress, and then stem cells or cartilage progenitor cells were treated.
- chondrocytes As a result, after inducing an inflammatory response in chondrocytes, some areas were damaged and treated with stem cells and cartilage precursor cells. When comparing the areas where chondrocytes were regenerated, about 61% of normal chondrocytes were regenerated. Inflammation-induced chondrocytes were regenerated by 24%.
- the stem cell and chondrogenic progenitor cell treatment group showed regenerative ability of about 47% or more, and in particular, the stem cell treatment group showed about 47% and the cartilage progenitor cell treatment group showed about 89% of regeneration ability (Figs. 7a and 7b ).
- the chondrocyte regeneration ability of the chondrogenic progenitor cells is superior to that of the stem cells.
- chondrogenic progenitor cells In order to confirm the paracrine effect of chondrogenic progenitor cells, an inflammatory response was induced in chondrocytes using a plate (VWR, 734-2719) with an insert, and then the chondrogenic progenitor cells were treated (indirectly) on the insert or applied to the plate. When directly treated, the inhibitory effect of cartilage degrading enzyme was confirmed.
- Chondrolytic enzymes such as ADAMTS4, ADAMTS5, and MMP-13, induce cartilage degradation.
Abstract
본 발명은 시프로플록사신의 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도 또는 연골세포로의 분화 유도 효과에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물, 연골전구세포 및 연골세포는 연골 관련 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 시프로플록사신의 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도 및 연골세포로의 분화 유도 효과에 관한 것이다.
전 세계적으로 인구의 고령화로 인해 가장 빈번하게 유발되는 퇴행성 질환인 연골질환의 치료를 위한 다양한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 연골 조직은 노화에 따라 연골 두께와 연골세포 수의 감소 이외에 기질의 구성변화가 초래되며, 세포의 기능에도 변화가 유발된다. 또한, 특이하게 연골은 혈관, 신경 및 임파 조직이 없으므로 손상 후 스스로 재생이 불가능한 조직으로 알려져 있다.
이러한 연골질환의 치료를 위해서는 진통제, 스테로이드 또는 비스테로이드계 항염제 등과 같은 약물이나 히알루론산, 콜라겐 등과 같은 연골을 보할 수 있는 보조적인 물질을 이용하거나 인공관절 수술을 하는 것이 일반적이다. 그러나 위와 같은 약물이나 수술은 유지를 위해 도움을 주는데 한계가 있거나 나이, 알러지와 같은 환경에 대한 한계점이 있다.
따라서 최근에는 줄기세포를 이용하여 퇴행성 질환을 극복하고자 시도되고 있으나 그 효율이 높지 않다.
또한 줄기세포를 연골세포로의 분화를 유도하는데 있어 많은 물질이 소요되고, 실제로 체내에 존재하는 줄기세포가 연골세포로의 분화에 있어 그 도움을 받는지 확인이 어렵다.
한편, 시프로플록사신(Ciprofloxacin)은 항생제의 일종으로 WHO 필수 의약품 목록에 등재되어 있을 정도로 안전한 약물이며, FDA는 물론이고 국내에서도 등록되어 유통되고 있으나 이러한 시프로플록사신의 줄기세포의 연골분화 유도 효과에 대해서는 알려진 바 없다.
따라서, 본 발명자들은 시프로플록사신이 줄기세포를 연골세포로 분화 유도함과 동시에 줄기세포를 연골세포로 성숙하기 전의 연골전구세포로 유도할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 시프로플록사신을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물로부터 유도된 연골전구세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시프로플록사신을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물로부터 분화된 연골세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물을 포함하는 연골 관련 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시프로플록사신을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물을 포함하는 연골 관련 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 연골전구세포를 포함하는 연골 관련 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 연골세포를 포함하는 연골 관련 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물이 함유된 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 연골 관련 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물로부터 유도된 연골전구세포를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 연골 관련 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물이 함유된 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 연골전구세포 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물의 제조를 위한 시프로플록사신(ciprofloxacin) 및 성장인자의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 연골전구세포의 제조를 위한 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 연골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 연골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물에 의해 유도된 연골전구세포의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시프로플록사신을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물이 함유된 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시프로플록사신을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 연골 관련 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시프로플록사신을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물로부터 분화된 연골세포를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 연골 관련 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시프로플록사신을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물이 함유된 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 연골세포 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물의 제조를 위한 시프로플록사신(ciprofloxacin)의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 연골세포의 제조를 위한 시프로플록사신(ciprofloxacin)을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 연골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 시프로플록사신(ciprofloxacin)을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 연골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 시프로플록사신(ciprofloxacin)을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물에 의해 분화 유도된 연골세포의 용도를 제공하는 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 시프로플록사신을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어, “줄기세포”는 미분화 상태에서 무한 증식능력(Self-Renewal Capacity)과 더불어 특정한 분화 유도 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 능력(Multi-differentiation Potency)을 가진 세포를 말하며, 바람직하게는 중간엽 줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, “중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell)”는 미분화 상태에서 무한 증식능력과 더불어 특정 한 분화 유도 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 능력을 가진 세포를 말한다. 본 발명의 중간엽 줄기세포는 분화능 및 증식능을 갖는 모든 세포일 수 있으며, 인간(Human), 원숭 이(Monkeys), 돼지(Pigs), 말(Horses), 소(Cows), 양(Sheep), 개(Dogs), 고양이(Cats), 생쥐(Mice), 토끼 (Rabbits) 등의 모든 동물로부터 유래할 수 있으며, 바람직하게는 인간 유래이며, 더욱 바람직하게는 인간의 지방조직, 골수, 말초혈액, 또는 제대혈 등에서 분리된 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 지방 유래일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, “시프로플록사신(Ciprofloxacin, CPFX)”은 종래 수많은 병균 감염을 치료하기 위해 사용되는 항생제로서, 의료제도에서 필수적인 가장 효과적이고 안전한 약물 목록인 WHO 필수 의약품 목록에 등재되어 있는 항생제이다. 본 발명에서는 이러한 시프로플록사신이 포함된 배지에서 줄기세포를 배양하면 줄기세포가 연골전구세포로 유도되거나, 줄기세포가 연골세포로 분화됨을 확인하였다.
본 발명에서 사용된 용어, “파라크린 효과(Paracrine)”란 연골전구세포 또는 연골세포가 연골 세포나 연골 조직을 대체 또는 재생하는 것이 아니라 연골전구세포 또는 연골세포에서 분비되는 여러 유용성 물질이 생체 내의 연골전구세포 또는 연골세포를 활성화하여 연골 관련 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 유용성 물질은 SOX9(SRY-Box Transcription Factor 9) 또는 COMP(Cartilage Oligomeric Matrix Protein) 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시예에 있어서, 줄기세포를 배지에서 배양한 후 시프로플록사신을 줄기세포가 함유된 배지에 투여하여 시프로플록사신의 세포독성을 확인한 결과, 세포 생존능에 있어서 대조군(CONT) 대비 유의한 차이가 나타나지 않았는 바, 시프로플록사신이 세포독성 없이 생체 적합성을 나타냄을 확인하였다.
일 실시예에서, 본 발명의 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도를 위한 시프로플록사신이 포함된 배지 조성은 그 조성비가 제한되지 않으나, 기본 배지는 1 내지 10%의 FBS가 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 1 내지 10%의 FBS가 함유된 a-MEM 배지로 하며, 시프로플록사신, EGF, FGF, VEGF, SGF 등의 성장인자를 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 EGF 및 FGF 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 EGF가 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도를 위한 시프로플록사신이 포함된 배지 조성물에 포함될 경우, 상기 EGF의 함량은 배지 조성물 전체 중량을 기준으로 0.1 내지 100ng으로 포함될 수 있고, 상기 FGF가 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도를 위한 시프로플록사신이 포함된 배지 조성물에 포함될 경우, 상기 FGF의 함량은 0.1 내지 100ng으로 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도를 위한 상기 시프로플록사신의 함량은 배지 조성물 전체 중량 기준으로 0.01 내지 1uM, 바람직하게는 0.1 내지 1 uM으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 실시예에서, 본 발명의 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도를 위한 시프로플록사신이 포함된 배지 조성은 그 조성비가 제한되지 않으나, 기본 배지는 1 내지 10%의 FBS가 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 1 내지 10%의 FBS가 함유된 a-MEM 배지로 하며, 시프로플록사신을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도를 위한 시프로플록사신이 포함된 배지에는 시프로플록사신 외에 성장인자와 같은 다른 인자는 포함하지 않을 수 있다.
본 발명에 있어서, 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도를 위한 상기 시프로플록사신의 함량은 배지 조성물 전체 중량 기준으로 0.05 내지 10uM 혹은 0.08 내지 8uM의 범위로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 6uM으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용어, “분화(Differentiation)”란 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 본 발명의 분화는 줄기세포에서 연골세포로의 분화를 의미하는 것이다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물로부터 유도된 연골전구세포의 줄기세포능 마커 발현율, 자가복제능 및 다분화능을 줄기세포와 비교했을 때, 본 발명에 따른 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물을 사용하여 유도된 연골전구세포가 줄기세포와 유사하게 자가복제가 가능하고, 나아가 지방분화 유도, 골분화 유도 및 연골분화 유도가 가능하며, 중간엽줄기세포의 표면항원을 발현함을 확인하였다.
다른 실시예에서, 본 발명에 따른 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물로부터 유도된 연골전구세포의 연골분화능을 줄기세포와 비교했을 때, 본 발명에 따른 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물로부터 유도된 연골전구세포를 연골세포 치료에 적용할 경우, 줄기세포를 이용하여 연골세포를 치료할 경우 나타나는 SOX9의 기하급수적인 증가로 인해 유도되는 연골비대화와 COMP 등 연골을 단단하게 하는 Col2의 부재와 같은 유리연골의 부재 등의 문제점을 해결할 수 있음을 확인하였다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물로부터 유도된 연골전구세포의 연골분화능을 줄기세포와 비교했을 때, 본 발명에 따른 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물로부터 유도된 연골전구세포를 염증반응이 유도된 연골세포에 처리한 경우, 줄기세포 보다 연골전구세포의 연골세포 재생능이 우수함을 확인하였다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물로부터 유도된 연골전구세포의 파라크린 효과를 확인하기 위하여 인서트가 포함된 플레이트를 이용하여 연골세포에 연증반응을 유도한 후 인서트 위에 연골전구세포를 처리 (간접적 처리)한 경우, ADAMTS4의 발현 수준이 약 35% 감소하였고, 해당 플레이트에 직접적으로 처리할 경우, ADAMTS4의 발현 수준이 약 76% 감소한 것을 확인하였다.
즉, 본 발명에 따른 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물로부터 유도된 연골전구세포의 연골분해효소의 저해능이 우수함을 확인하였다.
상기 연골분해효소는 연골을 분해하는 효소로서, ADAMTS4, ADAMTS5, MMP-13 등과 같이 종래 연골분해효소로 알려진 것일 수 있다.
따라서, 본 발명은 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물로부터 유도된 연골전구세포를 제공한다.
본 발명의 다른 일 실시예에서, 시프로플록사신을 줄기세포에 처리하였을 때 줄기세포가 연골세포로 분화 유도됨을 2D 배양 (또는 2차원 배양)을 통해 확인하였다. 그 결과 줄기세포가 연골세포로 분화됨에 따라 세포가 밀집되는 성상을 확인하였으며 SOX9에 의해 의존적으로 나타나는 알시안블루(Alcian blue) 염색이 연골세포에 전체적으로 된 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 실시예에서, 시프로플록사신을 줄기세포에 처리하였을 때 줄기세포가 연골세포로 분화 유도됨을 3D 배양 (또는 3차원 배양)을 통해 확인하였다. 그 결과 줄기세포가 연골세포로 분화됨에 따라 세포가 밀집되어 조직과 같은 성상을 확인하였으며 SOX9에 의존적으로 나타나는 알시안블루(Alcian blue) 염색이 연골세포에 전체적으로 된 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 시프로플록사신을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물로부터 분화된 연골세포를 제공한다.
본 명세서에서, SOX9는 아그레칸(Aggrecan, ACAN), COMP 또는 Col2a와 같이 연골분화 또는 연골세포의 표지유전자 또는 연골 분화 마커이다. SOX9는 연골 형성 및 발달에 핵심적인 역할을 하는 전사인자로 SOX9가 지나치게 억제되었을 경우에는 연골의 주요 성분인 ACAN 및 Col2a의 발현이 잘 나타나지 않는 것으로 알려져 있다(Cha BH et al. Cartilage tissue formation from dedifferentiated chondrocytes by codelivery of BMP-2 and SOX-9 genes encoding bicistronic vector. Cell Transplant 2012).
따라서, 본 발명에 따른 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물 또는 시프로플록사신을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물은 상기 유도된 세포 내 SOX9, ACAN, COMP 및 Col2a로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자 발현이 증가되는 것일 수 있다.
상기 기술한 바와 같이, 본 발명에 따라 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물로부터 유도된 연골전구세포 또는 시프로플록사신을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물로부터 분화된 연골세포는 연골 재생이 필요한 질환, 예컨대, 연골 관련 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.
상기 연골 관련 질환은, 이에 제한되는 것은 아니나, 골관절염, 변형성 관절증, 연골형성이상증, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골연화증, 섬유성 골염 및 무형성 골질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
따라서, 본 발명은 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물을 포함하는 연골 관련 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 시프로플록사신을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물을 포함하는 연골 관련 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물을 제공한다.
아울러 본 발명은 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물로부터 유도된 연골전구세포를 포함하는 연골 관련 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 시프로플록사신을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물로부터 분화된 연골세포를 포함하는 연골 관련 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위하여, 상기 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 연골전구세포로의 유도용 조성물, 시프로플록사신을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물, 본 발명에 따른 연골전구세포 또는 연골세포 외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 어떠한 제형으로도 적용 가능하며, 보다 구체적으로 비경구용 제형일 수 있다. 비경구용 제형으로는 주사용, 도포용, 에어로졸 등의 스프레이 형태일 수 있다. 더욱 구체적으로는 주사제 형태일 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
주사형 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 연골 관련 질환 예방 또는 치료방법을 제공한다. 구체적으로 상기 연골 질환은 골관절염, 변형성 관절증, 연골형성이상증, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골연화증, 섬유성 골염 및 무형성 골질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물을 의약품으로 제형화할 경우 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있고, 상기 문헌들은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
본 명세서에서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 성병, 연령, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 용어 "개체"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 연골 관련 질환을 가진 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 또는 인간을 포함한다. 본 발명에 따른 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써, 연골 관련 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
본 명세서에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 인간 또는 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 예방 또는 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 연골 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물 또는 시프로플록사신을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물 각각에서 줄기세포가 연골전구세포로 유도되고, 연골세포로 분화됨을 확인한 바, 상기 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물을 이용하여 연골전구세포로 유도할 수 있고, 시프로플록사신을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물을 이용하여 연골세포로 분화를 유도할 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면은 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물이 함유된 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 연골 관련 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물로부터 유도된 연골전구세포를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 연골 관련 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물이 함유된 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 연골전구세포 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물의 제조를 위한 시프로플록사신(ciprofloxacin) 및 성장인자의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 연골전구세포의 제조를 위한 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 연골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 연골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물에 의해 유도된 연골전구세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도를 위한 시프로플록사신이 포함된 배지 조성은 그 조성비가 제한되지 않으나, 기본 배지는 1 내지 10%의 FBS가 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 1 내지 10%의 FBS가 함유된 a-MEM 배지로 하며, 시프로플록사신 및 EGF, FGF, VEGF, SGF 등의 성장인자를 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 성장인자에는 EGF 및 FGF 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 일 측면은 시프로플록사신을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물이 함유된 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 시프로플록사신을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 연골 관련 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 시프로플록사신을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물로부터 분화된 연골세포를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 연골 관련 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 시프로플록사신을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물이 함유된 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 연골세포 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물의 제조를 위한 시프로플록사신(ciprofloxacin)의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 연골세포의 제조를 위한 시프로플록사신(ciprofloxacin)을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 연골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 시프로플록사신(ciprofloxacin)을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 연골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 시프로플록사신(ciprofloxacin)을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물에 의해 분화 유도된 연골세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 “줄기세포”는 미분화 상태에서 무한 증식능력(Self-Renewal Capacity)과 더불어 특정한 분화 유도 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 능력(Multi-differentiation Potency)을 가진 세포를 말하며, 바람직하게는 중간엽 줄기세포일 수 있다.
본 발명에서, 줄기세포로부터 연골전구세포를 유도할 때 사용되는 시프로플록사신 및 성장인자가 포함된 배지는, 배지 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 1uM, 바람직하게는 0.1 내지 1uM의 시프로플록사신을 포함할 수 있고, 성장인자 각각은 배지 조성물 전체 중량을 기준으로 0.1 내지 100ng으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 줄기세포로부터 연골세포를 분화 유도할 때 사용되는 시프로플록사신이 포함된 배지는, 배지 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 10uM 혹은 0.08 내지 8uM의 범위로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 6uM으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 줄기세포를 배양하는 배지는 이에 제한되는 것은 아니나, 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM 또는 a-MEM 배지일 수 있다.
상기 FBS는 배지 조성물 전체 중량를 기준으로 1 내지 15% 혹은 1 내지 13%로 함유될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 10%로 함유될 수 있다.
본 명세서에서 "예방"이란 본 발명의 조성물을 투여하여 목적하는 증상 또는 질병이 발생하지 않도록 하거나, 이의 발생 또는 발현을 늦추는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 "치료"란 본 발명의 조성물을 투여하여 목적하는 증상 또는 질병을 호전시키거나 사라지게 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 조성물에 포함되는 시프로플록사신 및 성장인자의 함량은 줄기세포로부터 연골전구세포로 유도할 수 있고 또는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화를 유도할 수 있다면, 다양한 함량으로 포함될 수 있다. 유효성분이 하한 미만으로 포함되는 경우에는 줄기세포로부터 연골전구세포로 유도가 발휘되지 않을 수 있고 또는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도가 발휘되지 않을 수 있으며, 상한 초과로 포함되는 경우에는 세포에서 독성이 일어날 수 있다.
이상 본 명세서에 기재된 수치 값은 달리 명시되어 있지 않은 한 균등범위까지 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명에 따른 조성물은 시프로플록사신을 포함함으로써 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도 또는 연골세포로의 분화를 유도할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 연골전구세포는 줄기세포 대비 우수한 연골재생 효과를 나타낸다.
따라서, 본 발명에 따른 조성물, 연골전구세포 또는 연골세포는 연골 관련 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.
도 1a는 줄기세포가 기본적으로 가지고 있는 특징으로서, 줄기세포의 성상을 보여준다.
도 1b는 줄기세포가 기본적으로 가지고 있는 특징으로서, 줄기세포가 발현하는 면역표현형에 있어서 CD29, 73, 90, 105에 대하여는 양성반응, CD31, 34, 45에 대하여는 음성반응을 보여준다.
도 1c는 줄기세포가 기본적으로 가지고 있는 특징으로서, 중간엽줄기세포의 분화능에 있어서 다분화능을 확인하기 위해 지방, 골, 연골로의 분화능을 확인하였다.
도 1d는 줄기세포가 기본적으로 가지고 있는 특징으로서, 자가복제능을 Colony forming assay를 통해 보여준 결과를 보여준다.
도 1e는 6계대까지 배양하여도 유전적인 결함이 발생하는 변화가 없음을 확인하여, 본 발명의 줄기세포가 안정함을 보여준다.
도 2는 시프로플록사신의 세포독성을 확인한 결과를 보여준다.
도 3a는 2D방법으로 시프로플록사신을 이용한 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화유도 용도 중 세포의 성상 및 단백질의 변화를 보여준다.
도 3b는 3D방법으로 시프로플록사신을 이용한 줄기세포의 연골세포로의 분화유도 용도 중 세포의 성상과 단백질 변화를 확인한 결과를 보여준다.
도 4a는 시프로플록사신에 의해 유도된 연골전구세포의 성상을 보여준다.
도 4b는 시프로플록사신에 의해 유도된 연골전구세포의 핵형분석으로 유도된 세포의 유전적 변이가 일어나지 않음을 보여준다.
도 5a는 본 발명에 따른 연골전구세포와 줄기세포의 줄기세포능 마커 발현율을 확인한 결과를 보여준다.
도 5b는 본 발명에 따른 연골전구세포와 줄기세포의 자가복제능을 확인한 결과를 보여준다.
도 5c는 본 발명에 따른 연골전구세포와 줄기세포의 다분화능 (지방분화 유도능, 골분화 유도능 및 연골분화 유도능)을 확인한 결과를 보여준다.
도 6a는 본 발명에 따른 연골전구세포와 줄기세포를 분화 유도함에 따른 SOX9의 mRNA 발현 수준을 확인한 결과를 보여준다.
도 6b는 본 발명에 따른 연골전구세포의 경우 SOX9이 감소함에 따라 COMP가 증가하지만, 줄기세포의 경우 분화유도 초기에 증가했다가 감소하는 것을 보여준다.
도 7a는 본 발명에 따른 연골전구세포와 줄기세포의 연골세포 재생 효과를 확인한 결과를 보여준다.
도 7b는 본 발명에 따른 연골전구세포 처리군과 줄기세포 처리군, 정상연골세포 및 염증성 연골세포에서 재생된 연골세포 영역을 분석한 결과를 보여준다.
도 8은 본 발명에 따른 연골전구세포의 연골분해효소 (ADAMTS4) 저해 효과를 확인한 결과를 보여준다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실험예 및 제조예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실험예 및 제조예에 한정되는 것이 아니라, 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
[실시예]
실시예
1.
시프로플록사신의
세포독성 확인
줄기세포(병원으로부터 비영리 목적의 환자 치료를 위해 기증받은 조직으로부터 채취)를 1 내지 10% FBS가 함유된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 또는 a-MEM에 80% 이상 부착시켜 배양한다.
이후 세포를 Trypsin-EDTA를 이용하여 회수 후 계수하여 96well plate에 1x103cells/well로 seeding하여 24hr 부착 후 시프로플록사신(삼성제약, 시프로플록사신주)을 농도에 따라 투여한 다음 특정 시간(최대 166hr)동안 세포독성을 확인하고 Cell Counting Kit-8 (이하 CCK, DOJINDO, Cat.No. CK04-13)을 10ul/well씩 처리한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 1시간 배양한다.
흡광계(Bio-Tek, Epoch2)를 이용하여 흡광도를 측정하여 정량적으로 계산한다.
그 결과, 줄기세포에서의 시프로플록사신은 6uM까지 처리되어도 세포독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 2).
실시예
2.
시프로플록사신을
이용한 줄기세포의 연골세포분화 유도(2D)
줄기세포(병원으로부터 비영리 목적의 환자 치료를 위해 기증받은 조직으로부터 채취)를 1 내지 10% FBS가 함유된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 또는 a-MEM에 80% 이상 부착시켜 배양한다.
이후 세포를 Trypsin-EDTA를 이용하여 회수 후 계수하여 96well plate에 1x103cells/well로 seeding하여 24hr 부착 후 시프로플록사신(삼성제약, 시프로플록사신주)을 농도에 따라 투여한 다음 특정 시간(최대 166hr)동안 세포독성을 확인하고 Cell Counting Kit-8 (이하 CCK, DOJINDO, Cat.No. CK04-13)을 10ul/well씩 처리한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 1시간 배양한다.
이후, 16일동안 분화 유도한 줄기세포를 DPBS를 이용하여 수세하여 4% Paraformaldehyde로 1시간 고정한다.
고정이 완료된 세포를 알시안블루(Alcian blue) 용액(Merck, B8438)을 이용하여 1시간 내지 1일간 염색한다. 이후 1N HCl을 이용하여 1회 수세한 후 멸균증류수를 이용하여 3회 더 수세한다.
최종적으로 수세된 샘플을 현미경으로 관찰한다.
그 결과, 연골세포로의 유도에 따라 세포가 밀집되는 성상을 확인하였으며 Sox9에 의존적으로 나타나는 알시안블루(Alcian blue) 염색이 전체적으로 된 것을 확인할 수 있었다(도 3a).
실시예
3.
시프로플록사신을
이용한 줄기세포의 연골세포분화 유도(3D)
줄기세포(병원으로부터 비영리 목적의 환자 치료를 위해 기증받은 조직으로부터 채취)를 1 내지 10% FBS가 함유된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 또는 a-MEM에 80% 이상 부착시켜 배양한다.
이후 세포를 Trypsin-EDTA를 이용하여 회수 후 계수하여 15mL conical tube에 5x105cell을 접종 후 시프로플록사신이 0.1내지 6uM이 함유된 배지로 Centrifuge(한일과학, Combi415)를 이용하여 150g로 세포를 가라앉힌다. 37℃, 5% CO2인큐베이터에서 2 내지 3일 간격으로 배지를 갈아주며 16일 동안 배양한다.
16일동안 분화 유도한 줄기세포를 DPBS를 이용하여 수세하여 4% Paraformaldehyde로 1시간 고정한다.
고정이 완료된 세포를 알시안블루(Alcian blue) 용액(Merck, B8438)을 이용하여 1시간 내지 24시간 염색한다. 이후 1N HCl을 이용하여 1회 수세한 후 멸균증류수를 이용하여 3회 더 수세한다.
최종적으로 수세된 샘플을 관찰한다.
그 결과, 연골세포로의 유도에 따라 세포가 밀집되어 조직과 같은 성상을 확인하였으며 Sox9에 의존적으로 나타나는 알시안블루(Alcian blue) 염색이 전체적으로 된 것을 확인할 수 있었다(도 3b).
실시예
4.
시프로플록사신을
이용한
연골전구세포
유도
줄기세포 (병원으로부터 비영리 목적의 환자 치료를 위해 기증받은 조직으로부터 채취)를 1 내지 10% FBS가 함유된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 또는 a-MEM에 80% 이상 부착시켜 배양한다. 이후 세포를 Trypsin-EDTA를 이용하여 회수 후 계수하여 시프로플록사신 0.1내지 1uM과 EGF 0.1 내지 100ng, FGF 0.1 내지 100ng 등 성장인자가 함유된 배지로 세포를 FLASK에 부유하여 37℃, 5% CO2인큐베이터에서 2 내지 3일 간격으로 배지를 갈아주며 배양한다. 이를 1 내지 3계대 반복한다.
그 결과, 시프로플록사신을 포함하는 조성물로부터 줄기세포가 연골전구세포로 유도됨을 확인하였으며, 유도된 연골전구세포의 세포 성상(도 4a)을 확인하고, 핵형분석(도 4b)을 진행하여 세포의 유전적 변이가 일어나지 않음을 확인하였다.
실시예
5.
연골전구세포와
줄기세포의 비교
배양이 완료된 줄기세포(병원으로부터 비영리 목적의 환자 치료를 위해 기증받은 조직으로부터 채취)와 실시예 4에서 유도된 연골전구세포를 회수하여 수세한다.
수세가 완료된 세포를 FACs buffer를 이용하여 부유시킨 후 줄기세포마커 CD73, CD90, CD105, CD31, CD34, CD45를 4℃에서 1시간 염색 후 1500RPM, 3min 동안 원심분리(centrifugation)한다. 이후 FACs 버퍼(buffer)를 이용하여 2회 수세한다음 FACS (BD, Accuri6)장비를 이용하여 발현을 확인하였다.
그 결과, 줄기세포 양성마커의 경우 연골전구세포에서도 양성으로 나타났으며, 음성마커의 경우 연골전구세포에서도 음성으로 확인되었다.
이 외에도 콜로니 형성 분석(Colony forming assay)과 골세포분화능, 연골세포분화능, 지방세포분화능을 일반으로 사용하는 배지나 키트(Kit)를 이용하여 진행한 경우 줄기세포와 동일하거나 비슷한 값을 확인하였다.
실시예
6.
연골전구세포와
줄기세포의
연골분화능
비교
배양이 완료된 줄기세포(병원으로부터 비영리 목적의 환자 치료를 위해 기증받은 조직으로부터 채취)와 상기 실시예 4에서 제작된 연골전구세포의 연골분화능을 비교하였다.
그 결과, 대조군에서 초기 마커인 SOX9의 경우 연골전구세포는 기본적으로 줄기세포 대비 약 20배 이상을 발현함을 확인하였다. 그러나, 분화를 유도함에 따라 그 값이 감소하는 패턴 역시 줄기세포는 지속적으로 초기 마커만이 증가하고 있음을 확인하였다(도 6a).
이후 연골세포의 조직화에 따라 기질(matrix)을 구성하는 요소인 COMP는 연골전구세포에서 SOX9이 감소함에 따라 증가하지만 줄기세포의 경우 오히려 분화유도 초기에 증가했다가 감소함을 확인하였다(도 6b).
이로 인하여 연골전구세포를 연골세포 치료에 적용할 경우, 줄기세포를 이용하여 연골세포 치료를 진행할 경우 나타나고 있는 문제점인 연골비대화(SOX9의 기하급수적인 증가로 인해 유도됨)와 유리연골의 부재(COMP 등 연골을 단단하게 하는 Col2의 부재) 등을 해결할 수 있다.
실시예
7.
연골전구세포와
줄기세포의 연골세포
재생능
비교
배양이 완료된 줄기세포(병원으로부터 비영리 목적의 환자 치료를 위해 기증받은 조직으로부터 채취)와 상기 실시예 4에서 제작된 연골전구세포의 연골세포 재생 효과를 비교하였다.
연골세포에 LPS를 사용하여 염증반응을 유도한다. 이후 2mm 이상의 스크래치를 주어 물리적인 스트레스를 일으킨 다음 줄기세포 또는 연골전구세포를 처리해주었다.
그 결과, 연골세포에 염증반응을 유도한 후 일부 구역을 훼손하여 줄기세포와 연골전구세포를 처리하여 연골세포가 재생되는 영역을 비교했을 때 정상적인 연골세포의 경우 약 61%의 재생을 보였으나, 염증이 유발된 연골세포는 24% 재생되었다. 또한, 줄기세포와 연골전구세포 처리군은 약 47% 이상의 재생능을 보였으며, 특히 줄기세포 처리군은 약 47%, 연골전구세포 처리군은 약 89%의 재생능을 보였다(도 7a 및 7b).
즉, 줄기세포 대비 연골전구세포의 연골세포 재생능이 우수함을 알 수 있다.
실시예
8.
연골전구세포의
연골분해효소 저해 효과 비교
연골전구세포의 파라크린 효과를 확인하기 위하여 인서트가 포함된 플레이트(VWR, 734-2719)를 이용하여 연골세포에 염증반응을 유도한 후 인서트 위에 연골전구세포를 처리 (간접적 처리)하거나 해당 플레이트에 직접적으로 처리 시 연골분해효소의 저해 효과를 확인하였다.
연골분해효소는 ADAMTS4, ADAMTS5, MMP-13과 같은 효소로서 연골분해를 유도한다.
그 결과, 연골전구세포의 간접적으로 처리한 경우 ADAMTS4의 발현 수준이 약 35% 감소하였으며, 직접적으로 처리한 경우 약 76% 감소한 것을 확인하였다(도 8).
Claims (44)
- 시프로플록사신(ciprofloxacin) 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)인, 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 성장인자는 EGF, FGF, VEGF 및 SGF로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물.
- 시프로플록사신(ciprofloxacin)을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물.
- 제4항에 있어서,상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)인, 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물.
- 시프로플록사신(ciprofloxacin) 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물로부터 유도된 연골전구세포.
- 시프로플록사신(ciprofloxacin)을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물로부터 분화된 연골세포.
- 제1항에 따른 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물을 포함하는 연골 관련 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물.
- 제4항에 따른 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물을 포함하는 연골 관련 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물.
- 제6항의 연골전구세포를 포함하는 연골 관련 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물.
- 제7항의 연골세포를 포함하는 연골 관련 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 연골 관련 질환은 골관절염, 변형성 관절증, 연골형성이상증, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골연화증, 섬유성 골염 및 무형성 골질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 연골 관련 질환의 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 약학적 조성물.
- 시프로플록사신 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물이 함유된 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도 방법.
- 제13항에 있어서,상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)인, 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도 방법.
- 제13항에 있어서,상기 성장인자는 EGF, FGF, VEGF 및 SGF로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도 방법.
- 제1항에 따른 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 연골 관련 질환의 치료 방법.
- 제6항의 연골전구세포를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 연골 관련 질환의 치료 방법.
- 제1항의 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물이 함유된 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는, 연골전구세포 제조방법.
- 제18에 있어서,상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)인, 연골전구세포 제조방법.
- 제18항에 있어서,상기 성장인자는 EGF, FGF, VEGF 및 SGF로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 연골전구세포 제조방법.
- 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물의 제조를 위한 시프로플록사신(ciprofloxacin) 및 성장인자의 용도.
- 제21항에 있어서,상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)인, 시프로플록사신 및 성장인자의 용도.
- 제21항에 있어서,상기 성장인자는 EGF, FGF, VEGF 및 SGF로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 시프로플록사신 및 성장인자의 용도.
- 연골전구세포의 제조를 위한 시프로플록사신(ciprofloxacin) 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물의 용도.
- 제24항에 있어서,상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)인, 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물의 용도.
- 제24항에 있어서,상기 성장인자는 EGF, FGF, VEGF 및 SGF로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물의 용도.
- 연골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 시프로플록사신(ciprofloxacin) 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물의 용도.
- 제27항에 있어서,상기 연골 관련 질환은 골관절염, 변형성 관절증, 연골형성이상증, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골연화증, 섬유성 골염 및 무형성 골질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물의 용도.
- 연골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 시프로플록사신(ciprofloxacin) 및 성장인자를 포함하는 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물에 의해 유도된 연골전구세포의 용도.
- 제29항에 있어서,상기 연골 관련 질환은 골관절염, 변형성 관절증, 연골형성이상증, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골연화증, 섬유성 골염 및 무형성 골질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 줄기세포로부터 연골전구세포로의 유도용 조성물에 의해 유도된 연골전구세포의 용도.
- 시프로플록사신을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물이 함유된 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도 방법.
- 제31항에 있어서,상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)인, 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도 방법.
- 제4항에 따른 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 연골 관련 질환의 치료 방법.
- 제7항의 연골세포를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 연골 관련 질환의 치료 방법.
- 제4항의 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물이 함유된 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는, 연골세포 제조방법.
- 제35에 있어서,상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)인, 연골세포 제조방법.
- 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물의 제조를 위한 시프로플록사신(ciprofloxacin)의 용도.
- 제37항에 있어서,상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)인, 시프로플록사신(ciprofloxacin)의 용도.
- 연골세포의 제조를 위한 시프로플록사신(ciprofloxacin)을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물의 용도.
- 제39항에 있어서,상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)인, 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물의 용도.
- 연골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 시프로플록사신(ciprofloxacin)을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물의 용도.
- 제41항에 있어서,상기 연골 관련 질환은 골관절염, 변형성 관절증, 연골형성이상증, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골연화증, 섬유성 골염 및 무형성 골질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물의 용도.
- 연골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 시프로플록사신(ciprofloxacin)을 포함하는 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물에 의해 분화 유도된 연골세포의 용도.
- 제43항에 있어서,상기 연골 관련 질환은 골관절염, 변형성 관절증, 연골형성이상증, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골연화증, 섬유성 골염 및 무형성 골질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도용 조성물에 의해 분화 유도된 연골세포의 용도.
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