WO2023121400A1 - 모낭유래 줄기세포의 배양방법 및 그의 용도 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method for culturing hair follicle-derived stem cells and a use thereof, comprising: a method for culturing hair follicle-derived stem cells; Hair follicle-derived stem cells prepared by the above method; A pharmaceutical composition for treating hair loss or promoting hair growth, comprising the prepared hair follicle-derived stem cells, their culture, or cells differentiated from the hair follicle-derived stem cells as an active ingredient; Quasi-drug composition; And it relates to a cosmetic composition.
- Stem cells are cells at a stage prior to differentiation into cells constituting tissues, and are capable of infinite proliferation in an undifferentiated state and have the potential to differentiate into cells of various tissues by specific differentiation stimuli. .
- ES cells embryonic stem cells
- adult stem cells tissue specific stem cells
- ICM inner cell mass
- tissue-specific stem cells are stem cells specific to each organ that appear during the embryonic development process to form each organ of the embryo, and their differentiation capacity is generally limited to cells constituting the tissue (multipotent).
- Representative tissue-specific stem cells include hematopoietic stem cells present in bone marrow and mesenchymal stem cells that differentiate into connective tissue cells other than blood cells.
- Hematopoietic stem cells differentiate into various blood cells such as red blood cells and leukocytes, and mesenchymal stem cells differentiate into osteoblasts, chondroblasts, adipocytes, and myoblasts.
- stem cells In recent years, since the isolation of embryonic stem cells from humans has been successful, interest in their clinical applications has increased. One of the most noteworthy applications of stem cells is their use as a cell source for cell replacement therapy.
- the existing hair follicle stem cell separation method is an enzymatic separation method using collagenase (Korean Patent Publication No. 10-2014-0075469 A), which has the disadvantage of affecting cell performance because protein damage on the cell surface is inevitable. Therefore, there is a need for research on methods for isolating and culturing skin stem cells.
- the present inventors have conducted various studies to develop new stem cells, and as a result, the hair follicle-derived stem cells prepared by the culture method of the present invention have excellent in vitro proliferation, cell performance, and differentiation ability, and are used for hair loss treatment and hair growth promotion It was confirmed that it can be used as, and the present invention was completed.
- One object of the present invention is to provide a method for culturing hair follicle-derived stem cells using hair follicle tissue and a hydrogel.
- Another object of the present invention is to provide hair follicle-derived stem cells prepared by the above method.
- Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating hair loss or promoting hair growth, comprising, as an active ingredient, the hair follicle-derived stem cells, their culture, or cells differentiated from the hair follicle-derived stem cells.
- Another object of the present invention is to provide a quasi-drug composition for improving hair loss or promoting hair growth, comprising, as an active ingredient, the hair follicle-derived stem cells, their culture, or cells differentiated from the hair follicle-derived stem cells.
- Another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for improving hair loss or promoting hair growth, comprising the hair follicle-derived stem cells, their culture, or cells differentiated from the hair follicle-derived stem cells as an active ingredient.
- Another object of the present invention is to provide a composition for culturing hair follicle-derived stem cells comprising hair follicle tissue and a hydrogel.
- Another object of the present invention is to provide a kit for culturing hair follicle-derived stem cells comprising the composition for culturing stem cells.
- stem cells can be effectively separated and obtained from hair follicle tissue, and the obtained hair follicle-derived stem cells have excellent multi-differentiation and self-renewal abilities, and are excellent in treating hair loss and promoting hair growth, so that hair loss It can be usefully used for improvement, prevention or treatment.
- Figure 1 shows the result of fragment formation of hair follicle tissue (a), a schematic diagram of hydrogel infiltration and culture of hair follicle tissue (b), and the result of cell migration and proliferation into the hydrogel for each culture period (c).
- Figure 2 is the result of confirming the immunophenotype of HB- hair follicle-derived stem cells.
- Figure 3 is the result of confirming the proliferative ability according to the subculture of HB- hair follicle-derived stem cells.
- 5a is a result of confirming the differentiation ability of HB-follicle-derived stem cells into adipocytes.
- Figure 5b is the result of confirming the differentiation ability of HB- hair follicle-derived stem cells into osteocytes.
- 6a is a result of DB-based hair growth function-related gene String Network analysis results and HB-hair follicle-derived stem cell-specific hair growth promoting functional genes confirmed.
- Figure 6b is the result of comparative analysis of the expression levels of major hair growth function-related genes in HB-hair follicle-derived stem cells.
- Figure 6c is the result of comparative analysis of the expression level of the hair growth promoting functional gene specifically expressed in HB-follicle-derived stem cells compared to adipose-derived stem cells.
- Figure 6d is a result of comparative analysis of the expression level of the hair growth promoting functional gene specifically expressed in HB-follicle-derived stem cells compared to adipose-derived stem cells.
- Figure 6e is the result of comparative analysis of the expression level of the hair growth promoting functional gene specifically expressed in HB-derived hair follicle-derived stem cells compared to conventional hair follicle-derived stem cells.
- Figure 7a is a result confirming the hair growth promoting effect of HB- hair follicle-derived stem cells in a mouse model.
- Figure 7b is a result confirming the hair growth promoting effect of HB- hair follicle-derived stem cells in a mouse model.
- Figure 8a is a result of confirming the hair follicle formation ability of HB- hair follicle-derived stem cells in a mouse model.
- Figure 8b is a result of confirming the hair follicle formation ability of HB-derived hair follicle stem cells in a mouse model.
- 8c is a result of confirming the follicle formation ability of HB-follicle-derived stem cells in a mouse model.
- 8d is a result of confirming the follicular formation ability of HB-follicle-derived stem cells in a mouse model.
- Figure 9a is a result confirming the mechanism of action of Wnt signaling of HB- hair follicle-derived stem cells in a mouse model.
- Figure 9b is a result confirming the mechanism of action of Wnt signaling of HB- hair follicle-derived stem cells in a mouse model.
- One aspect of the present invention for achieving the above object provides a method for culturing hair follicle-derived stem cells using hair follicle tissue and a hydrogel, and hair follicle-derived stem cells cultured by the method.
- the method of culturing hair follicle tissue-derived stem cells includes (a) incorporating hair follicle tissue into a hydrogel and culturing to obtain a culture product; and (b) decomposing the hydrogel in the obtained culture to recover stem cells that have migrated and proliferated from the hair follicle tissue into the hydrogel.
- the hydrogel refers to a three-dimensional network structure made by cross-linking of hydrophilic polymers by covalent or non-covalent bonds, and as the hair follicle tissue is three-dimensionally incorporated into the hydrogel, the hydrogel is At the same time as providing physical support, it is possible to simultaneously provide an extracellular matrix function capable of moving and proliferating hair follicle-derived stem cells present in the hair follicle tissue into the hydrogel.
- the hydrogel of the present invention is preferably a phase transitional hydrogel that exists in a solution state for three-dimensional culture supported by the hydrogel and can be converted into a sol and a gel.
- collagen gelatin ( gelatin), chondroitin, hyaluronic acid, alginic acid, MatrigelTM, chitosan, peptide, fibrin, PGA (polyglycolic acid) , PLA (polylactic acid), PEG (polyethylene glycol), and may be at least one selected from the group consisting of polyacrylamide, but is not limited thereto.
- the cultivation of the hydrogel incorporating the hair follicle tissue may be performed after immersing the hydrogel incorporating the hair follicle tissue in a conventional medium known in the art to be suitable for culturing stem cells.
- the step (a) may be cultured by incorporating the hair follicle tissue between the multilayers of the hydrogel. Specifically, it may be cultured by incorporating hair follicle tissue between hydrogel bilayers, but is not limited thereto.
- the hydrogel when the hair follicle tissue is embedded in the hydrogel, the hydrogel is added in two stages and cultured so that the hair follicle tissue can be embedded between the sandwich-type hydrogel double layers.
- the hydrophobicity of the outer layer of the cuticle of the hair remaining in the hair follicle tissue fragment can prevent the tissue fragment from being hydrated and floating.
- the hair follicle tissue can be sufficiently incorporated into the hydrogel between the two layers of the gel.
- the hair follicle tissue may be a section obtained by removing a portion corresponding to the follicular infundibulum from the epidermis.
- the slice may be 0.01 to 10 mm, 0.05 to 5 mm, or 0.1 to 3 mm, but the size of the slice is not limited.
- a 1 to 3 mm hair follicle tissue fragment removed from an area corresponding to the infundibulum of the epidermal region was used for culture.
- the culture period of the hair follicle tissue may be 3 to 20 days, 3 to 18 days, 3 to 16 days, 3 to 14 days, or 4 to 12 days. It is not limited.
- the hair follicle tissue was cultured for 4 to 12 days and used.
- the hair follicle tissue culture has an inter-tissue spacing of 1 mm or more, 2 mm or more, 3 mm or more, 4 mm or more, 5 mm or more, 50 mm or less, 40 mm or less, 30 mm or less, 20 mm or less, or It can be sown to 10 mm or less, but is not limited thereto.
- tissue seeding during the culture seeding is required in consideration of the distance between cells migrated/proliferated from one tissue in consideration of the outgrown distance.
- the spacing between the tissues is 5 mm or more, and the seeds are seeded and cultured.
- Step (b) may selectively degrade only the hydrogel in order to recover the hair follicle-derived stem cells that migrate/proliferate into the hydrogel after the hydrogel-supported three-dimensional culture step of step (a).
- the hydrogel may be degraded through one or more enzymes selected from the group consisting of collagenase, gelatinase, urokinase, streptokinase, tissue plasminogen activator (TPA), plasmin, and hyaluronidase there is.
- one or more enzymes selected from the group consisting of collagenase, gelatinase, urokinase, streptokinase, tissue plasminogen activator (TPA), plasmin, and hyaluronidase there is.
- the hair follicle stem cell isolation/cultivation technology of the present invention is a hydrogel-based niche-preserving self-replication-inducing separation technology that separates stem cells, and hair follicle tissue survives/cultures in vitro and isolates high-purity cells directly from tissue without enzyme treatment. applicable to new technologies.
- this separation method is differentiated from existing methods and has the advantage of being superior in terms of in vitro proliferation and cell performance.
- Cells isolated by the conventional method can be amplified in vitro only up to 2-3 passages (up to 5 passages), but the cells isolated by the method of the present invention have excellent performance such that cell senescence does not occur even when cultured for 8 or more passages. , long-term subculture is possible, so mass production is possible.
- hair follicle-derived stem cells prepared by the method for producing hair follicle-derived stem cells provided in the present invention express CD73, CD90, CD105, Nestin or Lgr5 on their cell surface, and express CD34, CD45 or HLA-DR. It exhibits immunological characteristics that do not become known and exhibits multi-differentiation characteristics capable of differentiating into adipocytes or osteocytes, but is not limited thereto.
- the hair follicle-derived stem cells are the hair follicle-derived stem cells prepared by the method for preparing hair follicle-derived stem cells provided in the present invention, the hair follicle-derived stem cells of the present invention, the hair follicle-derived stem cells, HB-hair follicle-derived stem cells, the present invention HB- It can be used in combination with hair follicle-derived stem cells, HB-HFSC.
- the proliferative ability, differentiation ability, and colony forming ability of the hair follicle-derived stem cells prepared by the method for producing hair follicle-derived stem cells of the present invention were confirmed.
- the hair growth promoting effect of the hair follicle-derived stem cells prepared by the method for producing hair follicle-derived stem cells of the present invention was confirmed.
- cell growth/cell senescence in vitro proliferation
- subculture and purity evaluation of primary cells were performed to confirm that the viability was excellent because of the long survival period in vitro.
- the hair follicle-derived stem cells prepared by the method for producing hair follicle-derived stem cells provided in the present invention may express a specific hair growth promoting functional gene.
- the hair growth promoting functional genes are specifically, SANP25 (Synaptosome Associated Protein 25), COL10A1 (Collagen Type X Alpha 1 Chain), TMEM119 (Transmembrane Protein 119), AQP1 (Aquaporin 1), PLCB4 (1-Phosphatidylinositol-4, It may be any one or more genes selected from 5-bisphosphate phosphodiesterase beta-4) and ITGA8 (Integrin Subunit Alpha 8), but is not limited thereto, and any gene known as a hair growth promoting functional gene may be included therein.
- the hair follicle-derived stem cells prepared by the hair follicle-derived stem cell manufacturing method showed a significant expression level of 10 times or more of the seven hair growth promoting functional genes compared to adipose-derived stem cells. It was confirmed that the hair follicle-derived stem cells prepared by exhibiting a specific hair growth promoting functional gene.
- Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for treating hair loss or promoting hair growth, comprising the hair follicle-derived stem cells, their culture, or cells differentiated from the hair follicle-derived stem cells as an active ingredient.
- culture or “culture” of the present invention may be a culture obtained during or after culturing hair follicle-derived stem cells in a medium, or a supernatant thereof, a concentrate thereof, or a lyophilized product thereof.
- hair growth or "hair growth promotion” of the present invention is a concept that may include hair growth promotion, increase in the number of hairs, and thickening of hair, as well as hair follicle regeneration or proliferation of hair follicle cells.
- Proliferation of hair follicle cells may include, but is not limited to, promoting conversion of hair follicle cells from a resting phase to a proliferative phase.
- the term "pharmaceutical composition” means prepared for the purpose of preventing or treating a disease, and may be administered in various oral and parenteral formulations at the time of actual clinical administration. , It may be prepared using diluents or excipients such as extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
- pharmaceutically acceptable additives may be further included according to each formulation.
- pharmaceutically acceptable additives include starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, and calcium hydrogen phosphate.
- Lactose, Mannitol, Taffy, Gum Arabic, Pregelatinized Starch, Corn Starch, Powdered Cellulose, Hydroxypropyl Cellulose, Opadry, Sodium Starch Glycolate, Carnauba Lead, Synthetic Aluminum Silicate, Stearic Acid, Magnesium Stearate, Aluminum Stearate, Calcium stearate, white sugar, dextrose, sorbitol and talc may be used.
- Pharmaceutically acceptable additives according to the present invention may be included in an amount of 0.1 to 90 parts by weight based on the composition.
- compositions in addition to the hair follicle-derived mesenchymal stem cells, one or more pharmaceutically acceptable conventional inert carriers, for example, in the case of injections, a preservative, pain reliever, solubilizer or stabilizer, etc., for topical administration
- a preservative for topical administration
- bases, excipients, lubricants or preservatives may be further included.
- the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And it can be single or multiple administrations. It is important to administer the amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without causing side effects in consideration of all of the above factors, and can be easily determined by those skilled in the art.
- the pharmaceutical composition provided in the present invention in addition to the hair follicle-derived stem cells, assists in the treatment of hair loss or promotes hair growth, maintains the activity of the hair follicle-derived stem cells, or promotes the differentiation of the hair follicle-derived stem cells.
- Components may be further included, for example, anti-inflammatory agents, stem cell mobilizing factors, growth inducers, and the like may be further included.
- the pharmaceutical composition of the present invention may be used for the purpose of improving, preventing or treating hair loss.
- Hair loss of the present invention includes both non-scarring alopecia, which is temporary hair loss, and scarring hair loss, which is caused by permanent destruction of hair follicles or hair roots. Hair loss, neoplastic hair loss, nutritional deficiency hair loss, drug-induced hair loss, and hair loss due to structural abnormality of hair are included, and male pattern hair loss, female pattern hair loss, and circular hair loss are also included.
- the term “improvement” may refer to any action that delays the progress of hair loss or alleviates the symptoms of hair loss by administering the composition according to the present invention to a subject.
- prevention may refer to any activity that suppresses or delays the occurrence of hair loss by administering the composition according to the present invention to a subject.
- treatment may refer to any action that improves or benefits hair loss symptoms by administering the composition of the present invention to a subject suspected of having hair loss.
- Another object of the present invention is to promote hair growth or hair loss, including the step of administering to a subject a composition containing the hair follicle-derived stem cells, their culture, or cells differentiated from the hair follicle-derived stem cells as an active ingredient. Preventive or therapeutic methods are provided.
- the hair follicle-derived stem cells, their cultures, or cells differentiated from the hair follicle-derived stem cells, hair growth promotion, hair loss, prevention, and treatment are as described above.
- the term “administration” means introducing the composition to a subject in an appropriate manner.
- the hair follicle-derived stem cell of the present invention, its culture, or a composition containing an active ingredient of cells differentiated from the skin-derived stem cell, or the pharmaceutical composition containing the same is applied to a local area, for example, hair loss It may be administered by coating or injection to the site, but is not limited thereto.
- composition may be used in combination with other pharmaceutical compositions that can be used for promoting hair growth or preventing or treating hair loss.
- the term "individual” refers to all animals, such as rats, mice, and livestock, including humans that have or may have hair loss.
- the animal may be not only humans but also mammals such as cows, horses, sheep, pigs, goats, camels, antelopes, dogs, and cats that require prevention or treatment of symptoms similar thereto, but are not limited thereto.
- composition of the present invention can be administered in a pharmaceutically effective amount.
- pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is dependent on the type and severity of the subject, age, sex, drug activity, It may be determined according to factors including sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
- composition may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. In addition, single or multiple administrations may be possible. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
- the composition may be administered orally or parenterally (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically applied) according to the desired method, and the dosage is the condition and weight of the patient, the severity of the disease, Depending on the drug form, administration route and time, it can be appropriately selected by those skilled in the art.
- the composition can be generally administered once or several times a day, but a preferred dosage is appropriately selected by those skilled in the art according to the condition and body weight of the subject, the severity of the disease, the type of drug, the route of administration and the period of administration. It can be.
- Another object of the present invention is to provide a quasi-drug composition for improving hair loss or promoting hair growth, comprising, as an active ingredient, the hair follicle-derived stem cells, their culture, or cells differentiated from the hair follicle-derived stem cells.
- quadsi-drug composition refers to fibers, rubber products or similar materials used for the purpose of treating, mitigating, treating or preventing diseases of humans or animals, having weak or non-direct action on the human body, Items that are not instruments or machines and similar items, items that fall under one of the categories of agents used for sterilization, insecticidal, and similar purposes to prevent infection, for the purpose of diagnosing, treating, mitigating, treating, or preventing human or animal diseases It refers to items that are not instruments, machines, or devices used, and items that are not instruments, machines, or devices that are used for the purpose of pharmacologically affecting the structure and function of humans or animals. Or it may be a personal hygiene product.
- Another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for improving hair loss or promoting hair growth, comprising the hair follicle-derived stem cells, their culture, or cells differentiated from the hair follicle-derived stem cells as an active ingredient.
- cosmetic composition can be prepared in any formulation that is conventionally prepared, for example, solution, emulsion, suspension, paste, cream, lotion, gel, powder, spray, surfactant-containing cleansing , Oil, soap, liquid cleanser, bath additive, foundation, makeup base, essence, toner, foam, pack, softening water, sunscreen cream or sun oil.
- Another object of the present invention is to provide a composition for culturing hair follicle-derived stem cells comprising hair follicle tissue and a hydrogel, and a kit for culturing hair follicle-derived stem cells comprising the composition.
- kit for culturing hair follicle-derived stem cells may include the composition for culturing stem cells and various components such as solutions and devices required for culturing the stem cells.
- Another object of the present invention is to provide a use for promoting hair growth or preventing or treating hair loss of a composition comprising the hair follicle-derived stem cells, their culture, or cells differentiated from the hair follicle-derived stem cells as an active ingredient.
- Example 1 3D culture of multi-layered hydrogel-supported hair follicle tissue
- Hair follicle tissue immersed in donated physiological saline and refrigerated was washed three times with PBS (Gibco) as a sample. After cutting the hair shaft portion of the washed hair follicle tissue, a portion of the infundibulum of 0.5 mm to 1 mm from the cut side was removed to form a hair follicle tissue section. After washing once with DMEM (low glucose, Gibco), the supernatant was removed, and 5 mL of fibrinogen solution (0.25% w/v fibrinogen (Green Cross), 200 ⁇ g/mL tranexamic acid (Shinpoong Pharmaceutical) in DMEM) was added.
- PBS Gibco
- Thrombin solution (0.5 IU/mL thrombin (Green Cross) in DMEM) was transferred to a 100 mm culture vessel with the same amount added to spread the hair follicle fragments and hydrogel evenly, and then left at room temperature for less than 10 minutes to fix the hair follicle tissue to the hydrogel. . Additionally, 5 mL each of fibrinogen solution (0.25% w/v fibrinogen, 200 ⁇ g/mL tranexamic acid in DMEM) and thrombin solution (0.5 IU/mL thrombin in DMEM) were added, and allowed to stand for 10 minutes to form the secondary hydrogel. After forming, it was incubated at 37 ° C. for 2 hours to sufficiently gelate (Fig. 1b).
- Hair follicle tissue was cultured for 10 or 14 days by the method described in Example 1. After washing the hydrogel three times for 3 minutes with warm PBS, 30% FBS/DMEM was added and stirred at a speed of 10 to 30 rpm in an orbital shaker. After removing the supernatant after 1 hour, 10 mL 30% FBS/DMEM with 1 ⁇ g/mL alteplase was added to dissolve the gel. When the gel is sufficiently degraded, the supernatant is removed after overnight culture in static conditions, and the growth medium is added and cultured in a conventional manner. The growth medium was replaced every 2 to 3 days, and subculture was performed every 4 to 6 days.
- FIG. 1 Results of tissue culture and cell separation and culture cultured according to the above method are shown in FIG. 1 .
- FITC-conjugated CD73 (Abcam, 1:25) antibody
- APC-conjugated CD90 (Invitrogen, 1:40)
- FITC-conjugated CD105 (Abcam) , 1:50
- FITC-conjugated CD34 (Abcam, 1:10) antibody
- FITC-conjugated HLA-DR (Novusbiologicals, 1:20) antibody
- Nestin (Novusbiologicals, 1:100) antibody
- FITC-conjugated Lgr5 Origene , 1:100) antibody
- FITC-conjugated mouse IgG Isotype control (Novusbiologicals, 1:5).
- the isolated and cultured HB-follicle-derived stem cells expressed CD73, CD90, CD105, Nestin, and Lgr5, but did not express CD34, CD45, and HLA-DR.
- human hair follicle-derived stem cells (4 passages) were seeded in a 6-well plate at 20 cells/well. The growth medium was replaced every 3 days and cultured for 14 days. After washing with PBS, it was fixed by leaving it at room temperature for 15 minutes with 4% paraformaldehyde/PBS (sigma). The fixed cells were washed 3 times with PBS and stained with 0.5% crystal violet/Methanol for 15 minutes at room temperature. After removing all the remaining solution, the cells were washed with distilled water three times, and the results of observing the stained colonies are shown in FIG. 4 .
- the PDT population doubling time
- HB-hair follicle-derived stem cells were seeded at a concentration of 1 ⁇ 10 4 cells/cm 2 and cultured in a growth medium until reaching 80% confluency, followed by StemProTM Adipogenesis differentiation kit (Gibco, cat. A1007001) The culture medium was changed every 3 days and cultured for 14 days. After fixing with 4% PFA for 15 minutes and reacting with 60% isopropanol for 15 minutes, all solutions were removed and sufficiently dried. Fat accumulation in the cytoplasm was confirmed by staining with 60% Oil Red O (sigma)/ethanol at room temperature for 15 minutes (FIG. 5a).
- the cells were seeded at a concentration of 1 ⁇ 10 4 cells/cm 2 and cultured in a growth medium until reaching 80% confluency, The medium was changed with the StemProTM Osteogenesis differentiation kit (Gibco, cat. A1007201) and cultured for 14 days while changing the medium every 3 days. After fixing with 4% PFA for 60 seconds, treatment with BCIP/NBT substrate solution (Sigma), and staining for 10 minutes under light-shielding conditions, the activity of alkaline phosphatase (ALP) was confirmed (FIG. 5b).
- StemProTM Osteogenesis differentiation kit Gibco, cat. A1007201
- the HB-follicle-derived stem cells obtained by the culture method of the present invention possess multipotency.
- Adipose-derived stem cells (ASC-1. ASC-2. ASC-3) and HB-follicle-derived stem cells (HB-HFSC-1, HB-HFSC-2, HB-HFSC-3) were TruSeq each of 3 lots of samples.
- a paired-end RNA library was constructed using the Stranded mRNA Library Prep Kit according to the manufacturer's protocol, and sequencing was performed by Macrogen (Seoul, Korea).
- mapping to the reference genome (version GRCh38) with the HISAT2 program (version 2.1.0, https://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml) and StringTie program (version 2.1.3b, https:// /ccb.jhu.edu/software/stringtie/) to obtain expression level profiles for each transcript (Fig. 6a).
- Gene expression levels were treated by taking the logarithm of TPM (Transcripts Per Kiobase Million) values (Fig. 6a). Differentially expressed genes between the control group and the comparison group were obtained using the edgeR package [1] of the R program (version 4.0) (1. SZKLARCZYK, Damian, et al.
- Biological networks involving marker genes were constructed using String Database (version 11.5) [3] (3. SMYTH, Gordon K., et al. LIMMA: linear models for microarray data. In Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. Statistics for Biology and Health. 2005.)
- a protein-protein interaction (PPI) network was constructed (Fig. 7a, b).
- the organism reference used to construct the PPI network was Homo sapiens.
- the edges connecting nodes representing proteins to each other were connected based on evidence such as experimental results, biological databases and literature, and gene fusion, and an edge score of 0.4 or higher was considered significant. did After building the network, orphan nodes with no connectivity between other nodes were removed.
- HB-hair follicle-derived stem cells were analyzed with a hair growth promotion-related gene network using String DB to confirm their association with known hair growth promotion pathways, and 7 hair growth promotion functional genes (SNAP25, ITGA8, PLCB4, COL10A1, GPNMB , TMEM119, AQP1) were derived. (Fig. 6a). In addition, it was confirmed that HB-follicle-derived stem cells expressed high levels of major hair growth function-related genes (TCF3, PRDM1, WNT5A, WNT5B, WNT9A, FGFR2, etc.) compared to adipose-derived stem cells (FIG. 6b).
- Fold change >10 in HB-hair follicle-derived stem cells confirmed 80 genes expressed compared to adipose-derived stem cells, among which 7 hair growth promoting functional genes (SNAP25, ITGA8, PLCB4, COL10A1, GPNMB, TMEM119, AQP1) showed differential expression compared to adipose-derived stem cells (FIGS. 6c and 6d).
- 7 hair growth promoting functional genes SNAP25, ITGA8, PLCB4, COL10A1, GPNMB, TMEM119, AQP1
- the expression of 7 hair growth promoting functional genes was more than 10 times higher. It was confirmed that it was significantly increased and differentially expressed (FIG. 6e).
- the 7 kinds of hair growth promoting functional genes are known as genes related to Wnt signaling and PI3K signaling, which are known signaling related to hair follicle formation and growth.
- the hair growth promoting effect of derived stem cells can be inferred.
- mice 7-12 weeks old BALB/c nude mice (central experimental animals) were inhaled anesthetized with 3% Isoflurane (Hana Pharmaceutical). After confirming that anesthesia is complete, HB-follicle-derived stem cells 1 ⁇ 10 6 cells are suspended in 100 ⁇ l of Normal saline (NS), and Insulin syringe (30 gauge) is placed in 4 places (2 ⁇ 2cm) on the corner of the dorsal part. was used for intradermal injection.
- NS Normal saline
- Insulin syringe (30 gauge) is placed in 4 places (2 ⁇ 2cm) on the corner of the dorsal part. was used for intradermal injection.
- NS Normal saline
- Insulin syringe (30 gauge) is placed in 4 places (2 ⁇ 2cm) on the corner of the dorsal part. was used for intradermal injection.
- NS Normal saline
- Insulin syringe (30 gauge) is placed in 4 places (2 ⁇ 2c
- the area of the hair growth area on the basis of percentage of the administration site (2 ⁇ 2cm, 4cm 2 ) was measured through Image J (NIH). (FIGS. 7A and 7B). As a result, the hair growth promoting effect of the present HB-follicle-derived stem cells could be confirmed.
- Beta-catenin antibody (Invitrogen, MA1-2001) was subjected to tissue immunofluorescence (IF) by attaching a secondary antibody (Fig. 9a), and prehybridization solution (50% formamide, 4X SSC, 50 mM DDT, 4X Denhart's soln, ⁇ X TED, 100ug/ml denatured salmon sperm DNA, 250ug/ml yeast RNA) at 42 degrees for 1 hour to bind to CD34 mRNA (FIG. 9b). After 31 days of administration of HB-follicle-derived stem cells, it was confirmed that ⁇ -catenin expression was increased and CD34 gene expression was increased.
- IF tissue immunofluorescence
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Abstract
본 발명은 모낭 유래 줄기세포의 배양방법 및 그의 용도에 관한 것으로, 모낭 유래 줄기세포의 배양방법; 상기 방법으로 제조된 모낭 유래 줄기세포; 상기 제조된 모낭 유래 줄기세포, 그의 배양물 또는 상기 모낭 유래 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는, 탈모 치료 또는 발모 촉진용 약학 조성물; 의약외품 조성물; 및 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 배양방법에 의하면 모낭조직으로부터 효과적으로 줄기세포를 분리 및 수득할 수 있으며, 상기 수득된 모낭 유래 줄기세포는 다분화 능력과 자기복제 능력이 뛰어나며, 탈모 치료 및 발모 촉진 효과가 뛰어나므로, 탈모 개선, 예방 또는 치료 용도로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 모낭 유래 줄기세포의 배양방법 및 그의 용도에 관한 것으로, 모낭 유래 줄기세포의 배양방법; 상기 방법으로 제조된 모낭 유래 줄기세포; 상기 제조된 모낭 유래 줄기세포, 그의 배양물 또는 상기 모낭 유래 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는, 탈모 치료 또는 발모 촉진용 약학 조성물; 의약외품 조성물; 및 화장료 조성물에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)란 조직을 구성하는 각 세포로 분화되기 전단계의 세포로서, 미분화 상태에서 무한 증식이 가능하고 특정 분화 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재적 가능성을 가진 세포를 말한다.
줄기세포는 분화 가능성에 따라 크게 배아 줄기세포(embryonic stem cell: ES cell)와 성체줄기세포(adult stem cell (조직 특이적 줄기세포(tissue specific stem cell))로 나뉜다. 배아 줄기세포는 수정란이 형성된 후 자궁내막에 착상하기 전의 초기 단계인 포배기(blastocyst) 배아 중 태아로 발생할 세포괴(inner cell mass: ICM)로부터 분리된 줄기세포로서, 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 가지고 있는 세포이다.
반면, 조직 특이적 줄기세포는 배아 발생 과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계에 나타나는 각 장기에 특이적인 줄기세포로서, 그 분화능이 일반적으로 그 조직을 구성하는 세포로만 한정(multipotent)된다. 대표적인 조직 특이적 줄기세포는 골수(bone-marrow)에 존재하는 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cell)와 혈구 세포 이외의 결합조직(connective tissue) 세포로 분화되는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)가 있다. 조혈 줄기세포는 적혈구, 백혈구등 각종 혈구 세포로 분화되고, 중간엽 줄기세포는 골아세포(osteoblast), 연골아세포(chondroblast), 지방세포(adipocyte) 및 근아세포(myoblast) 등으로 분화된다.
근래에 들어 인간으로부터 배아 줄기세포 분리가 성공한 이후, 그 임상적 적용에 관심이 고조되고 있다. 줄기세포의 적용분야로서 가장 주목받고 있는 것은 세포 대체요법을 위한 세포 공급원으로서의 이용이다.
기존의 모낭줄기세포 분리방법은 콜라게나아제(collagenase)등을 이용한 효소적 분리방법(한국공개특허공보 10-2014-0075469 A)으로 세포표면의 단백질 손상이 불가피하므로 세포성능에 영향을 미치는 단점이 있어, 피부줄기세포 분리 및 배양 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 새로운 줄기세포를 개발하고자 다양한 연구를 수행한 결과, 본 발명의 배양방법에 의해 제조된 모낭 유래 줄기세포가 체외증식력, 세포성능, 분화능이 뛰어나며, 탈모 치료 및 발모촉진 용도로 사용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 모낭 조직 및 하이드로젤을 이용하여 모낭 유래 줄기세포를 배양하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 방법으로 제조된 모낭 유래 줄기세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 모낭 유래 줄기세포, 그의 배양물 또는 상기 모낭 유래 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는, 탈모 치료 또는 발모 촉진용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 모낭 유래 줄기세포, 그의 배양물 또는 상기 모낭 유래 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는, 탈모 개선 또는 발모 촉진용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 모낭 유래 줄기세포, 그의 배양물 또는 상기 모낭 유래 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는, 탈모 개선 또는 발모 촉진용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 모낭 조직 및 하이드로젤을 포함하는 모낭 유래 줄기세포 배양용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 줄기세포 배양용 조성물을 포함하는 모낭 유래 줄기세포 배양용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 배양방법에 의하면 모낭조직으로부터 효과적으로 줄기세포를 분리 및 수득할 수 있으며, 상기 수득된 모낭 유래 줄기세포는 다분화 능력과 자기복제 능력이 뛰어나며, 탈모 치료 및 발모 촉진 효과가 뛰어나므로, 탈모 개선, 예방 또는 치료 용도로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 모낭 조직의 절편 형성 결과(a), 모낭조직의 하이드로젤 함입배양 모식도(b), 배양기간 별 하이드로젤 내로의 세포 이동 및 증식 결과(c)이다.
도 2는 HB-모낭 유래 줄기세포의 면역표현형을 확인한 결과이다.
도 3은 HB-모낭 유래 줄기세포의 계대배양에 따른 증식능을 확인한 결과이다.
도 4는 HB-모낭 유래 줄기세포의 콜로니 형성능을 확인한 결과이다.
도 5a는 HB-모낭 유래 줄기세포의 지방세포로의 분화능을 확인한 결과이다.
도 5b는 HB-모낭 유래 줄기세포의 골세포로의 분화능을 확인한 결과이다.
도 6a는 DB기반 발모기능 관련 유전자 String Network 분석 결과 및 HB-모낭 유래 줄기세포 특이 발모촉진 기능성유전자를 확인한 결과이다.
도 6b는 HB-모낭 유래 줄기세포의 주요 발모기능 관련 유전자의 발현량을 비교분석한 결과이다.
도 6c는 HB-모낭 유래 줄기세포의 특이적 발현 발모촉진 기능성유전자를 지방유래 줄기세포 대비 발현량 비교분석한 결과이다.
도 6d는 HB-모낭 유래 줄기세포의 특이적 발현 발모촉진 기능성유전자를 지방유래 줄기세포 대비 발현량 비교분석한 결과이다.
도 6e는 HB-모낭 유래 줄기세포의 특이적 발현 발모촉진 기능성유전자를 기존 모낭 유래 줄기세포 대비 발현량 비교분석한 결과이다.
도 7a은 마우스 모델에서 HB-모낭 유래 줄기세포의 발모촉진 효과를 확인한 결과이다.
도 7b은 마우스 모델에서 HB-모낭 유래 줄기세포의 발모촉진 효과를 확인한 결과이다.
도 8a은 마우스 모델에서 HB-모낭 유래 줄기세포의 모낭형성능을 확인한 결과이다.
도 8b은 마우스 모델에서 HB-모낭 유래 줄기세포의 모낭형성능을 확인한 결과이다.
도 8c은 마우스 모델에서 HB-모낭 유래 줄기세포의 모낭형성능을 확인한 결과이다.
도 8d은 마우스 모델에서 HB-모낭 유래 줄기세포의 모낭형성능을 확인한 결과이다.
도 9a는 마우스 모델에서 HB-모낭 유래 줄기세포의 Wnt signaling 작용기전을 확인한 결과이다.
도 9b는 마우스 모델에서 HB-모낭 유래 줄기세포의 Wnt signaling 작용기전을 확인한 결과이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 모낭조직 및 하이드로젤을 이용한 모낭 유래 줄기세포의 배양방법 및 상기 방법으로 배양된 모낭 유래 줄기세포를 제공한다.
구체적으로, 모낭조직 유래 줄기세포의 배양방법은 (a) 모낭 조직을 하이드로젤 내에 함입시키고 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 배양물에서 하이드로젤을 분해하여 상기 모낭 조직으로부터 하이드로젤 내로 이동 및 증식한 줄기세포를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 하이드로젤은 친수성 고분자가 공유 또는 비공유 결합으로 가교되어져 만들어진 3차원 망상구조물을 의미하는 것으로, 모낭 조직을 하이드로젤 내로 3차원적으로 함입시킴에 따라, 하이드로젤은 모낭 조직의 물리적 지지를 제공함과 동시에 모낭 조직 내 존재하는 모낭 유래 줄기세포를 하이드로젤 내로 이동하고 증식할 수 있는 세포외기질 기능을 동시에 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 하이드로젤은 하이드로젤 지지 3차원 배양을 위해 용액상태로 존재하다가 졸과 젤로 전환될 수 있는 상전이 (phase transitional)성 하이드로젤이 바람직하며, 구체적으로, 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 콘드로이틴(chondroitin), 하알루로닉산(hyaluronic acid), 알지닌(alginic acid), 메트리젤(MatrigelTM), 키토산(chitosan), 펩티드(peptide), 피브린(fibrin), PGA(polyglycolic acid), PLA(polylactic acid) 및 PEG(polyethylene glycol), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 제한 되는 것은 아니다.
상기 (a) 단계에 있어서, 모낭 조직이 함입된 하이드로젤의 배양은 당업계에서 줄기세포 배양에 적합하다고 알려져 있는 통상적인 배지에 모낭 조직이 함입된 하이드로젤을 침지한 후 수행될 수 있다.
또한, 상기 (a)단계는 모낭 조직을 하이드로겔 다중층 사이에 함입시켜 배양하는 것일 수 있다. 구체적으로, 하이드로겔 이중층 사이에 모낭조직을 함입시켜 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 모낭조직을 하이드로겔에 함입 시 2단계로 나누어 하이드로겔을 첨가하여, 샌드위치형 하이드로겔 이중층 사이에 모낭 조직이 함입될 수 있도록 배양한 바 있다.
상기와 같이 하이드로겔 다중층 사이에 모낭 조직을 함입시키는 경우 모낭조직 절편에 남아있는 hair의 큐티클 바깥층의 소수성으로 조직절편이 수화되지 않고 부유함을 방지할 수 있으며, 상기 2단계 하이드로겔 처리를 하여 하이드로겔 이충층 사이에서 모낭조직이 충분히 하이드로젤에 함입되도록 할 수 있다는 장점이 있다.
또한, 상기 (a)단계에 있어서, 상기 모낭조직 상기 모낭조직은 표피(epidermal)에서 모낭 누두부(follicular infundibulum)에 해당하는 부위를 제거한 절편을 이용하는 것일 수 있다. 상기 절편은 0.01 내지 10 mm, 0.05 내지 5mm, 0.1 내지 3 mm일 수 있으나, 상기 절편의 사이즈가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는, 모낭조직 절편 형성 시 표피(epidermal)영역의 누두부(infundibulum)에 해당하는 부위 제거한 1 ~ 3 mm의 모낭조직 절편을 이용하여 배양에 사용하였다.
또한, 상기 (a)단계에 있어서, 모낭 조직의 배양기간은 3일 내지 20일, 3일 내지 18일, 3일 내지 16일, 3일 내지 14일 또는 4일 내지 12일 일 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.
상기 배양기간간이 증가할수록 조직중량 당 분리된 세포 수가 증가하므로 세포의 분리효율 측면에서 유리하지만, 배양을 지속할수록 조직 주변 하이드로젤 내의 cell confluency가 증가하여 contact inhibition에 의한 세포증식 억제, 줄기세포 분화 유도의 가능성이 있으며, Cell/Hydrogel의 비율이 증가, cell aggregation이 발생함에 따라, 세포분리 시 hydrogel 선택적인 분해에 따른 cell release가 저해된다.
따라서, 조직주변에서 세포 과밀에 의한 응집(aggregation) 및 조직주변의 혼탁이 관찰되므로, 조직 배양 시 적절한 배양기간은 세포 outgrowth과 관찰되는 기간 내로 적절히 조절하는 것이 중요하다.
본 발명의 일 실시예에서는, 모낭 조직을 4일 내지 12일간 배양하여 사용한 바 있다.
또한, 상기 (a)단계에 있어서 모낭 조직의 배양은 조직간 간격이 1mm 이상, 2mm이상, 3mm이상, 4mm이상, 5mm 이상, 50 mm이하, 40 mm이하, 30 mm이하, 20 mm이하, 또는 10 mm이하로 파종할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.
상기 배양시 조직 파종에 있어 조직간 간격은 Outgrown distance를 고려하여 조직 하나로부터 이동/증식한 세포의 거리를 고려하여 파종이 필요하다.
본 발명의 일 실시예에서는 조직절편 파종 시 조직간의 간격은 5mm 이상으로 파종하여 배양한 바 있다.
상기 (b)단계는 (a)단계의 하이드로젤-지지 3차원 배양 단계 후 하이드로젤 내로 이동/증식한 모낭 유래 줄기세포들을 회수하기 위해, 하이드로젤만을 선택적으로 분해시킬 수 있다.
상기 하이드로젤의 분해는 콜라지나아제, 젤라티나아제, 유로키나아제, 스트렙토키나아제, TPA(tissue plasminogen activator), 플라즈민(plasmin) 및 히알루로니다아제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소를 통하여 분해될 수 있다.
본 발명의 모낭줄기세포의 분리/배양기술은 하이드로겔 기반 니치보존 자기복제 유도분리 기술로서 줄기세포 분리하는 기술이며, 모낭조직이 체외생존/배양되며 효소처리 없이 조직으로부터 직접 순도높은 세포를 분리할 수 있는 신기술에 해당된다.
기존의 방법과는 달리 본 분리방법은 현존하는 방식과 차별화된 방식으로 체외증식력 및 세포성능측면에서 월등하다는 장점이 있다.
기존의 방법으로 분리한 세포는 2-3계대(최대 5계대)까지만 체외증폭이 가능하나, 본 발명의 방법으로 분리한 세포는 8계대 이상 계대배양하여도 세포노화가 일어나지 않는 등 성능이 우수하며, 장기간 계대배양이 가능하므로 대량생산이 가능하다.
한편, 본 발명에서 제공하는 모낭 유래 줄기세포를 제조하는 방법에 의해 제조된 모낭 유래 줄기세포는 그의 세포표면에 CD73, CD90, CD105, Nestin 또는 Lgr5가 발현되고, CD34, CD45 또는 HLA-DR은 발현되지 않는 면역학적 특성을 나타내고, 지방세포 또는 골세포 등으로 분화될 수 있는 다분화 특성을 나타내나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 모낭 유래 줄기세포는 본 발명에서 제공하는 모낭 유래 줄기세포 제조하는 방법에 의해 제조된 모낭 유래 줄기세포, 본 발명 모낭 유래 줄기세포, 모낭 유래줄기세포, HB-모낭 유래 줄기세포, 본 발명 HB-모낭 유래 줄기세포, HB-HFSC와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명의 모낭 유래 줄기세포 제조방법에 의해 제조한 모낭 유래 줄기세포의 증식능, 분화능, 콜로니 형성능을 확인할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명의 모낭 유래 줄기세포 제조방법에 의해 제조한 모낭 유래 줄기세포의 발모촉진효과를 확인할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 추가적으로, 계대배양에 따른 세포성장능/세포노화 (체외증식력) 및 초대세포의 순도평가를 수행을 통해 체외에서 생존기간이 길어 생존능이 뛰어남을 확인할 수 있었다.
본 발명에서 제공하는 모낭 유래 줄기세포를 제조하는 방법에 의해 제조된 모낭 유래 줄기세포는 특이적 발모 촉진 기능성 유전자를 발현할 수 있다.
이때, 상기 발모 촉진 기능성 유전자는 구체적으로, SANP25(Synaptosome Associated Protein 25), COL10A1(Collagen Type X Alpha 1 Chain), TMEM119 (Transmembrane Protein 119), AQP1(Aquaporin 1), PLCB4(1-Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate phosphodiesterase beta-4) 및 ITGA8(Integrin Subunit Alpha 8)에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 발모촉진 기능성 유전자로 알려진 유전자라면 이에 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 모낭 유래 줄기세포 제조방법에 의해 제조된 모낭 유래 줄기세포에서 지방유래 줄기세포 대비 상기 7개의 발모촉진 기능성 유전자가 10배 이상의 현저한 발현량을 보임을 확인하여, 본원 방법에 의해 제조된 모낭 유래 줄기세포가 특이적 발모촉진 기능성 유전자를 발휘함을 확인할 수 있었다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 모낭 유래 줄기세포, 그의 배양물 또는 상기 모낭 유래 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는, 탈모 치료 또는 발모 촉진용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, “배양물” 또는 “배양액”은 모낭 유래 줄기세포를 배지에서 배양하는 과정 중 또는 배양 한 후 수득된 배양물 또는 이의 상층액, 이의 농축물 또는 이의 동결건조물 일 수 있다.
본 발명의 용어, “발모” 또는 “발모촉진”은 모발의 성장촉진, 모발개수의 증가, 모발의 굵기가 굵어지는 효과뿐만 아니라, 모낭재생 또는 모낭세포의 증식을 포함할 수 있는 개념이고, 상기 모낭세포의 증식은 모낭세포가 휴지기에서 증식기로의 변환이 촉진되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "약학 조성물"은 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
또한, 각각의 제형에 따라 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 내지 90 중량부 포함될 수 있다.
상기 약학 조성물에는 상기 모낭 유래 중간엽줄기세포 이외에도 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여할 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용을 유발하지 않으면서 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명에서 제공하는 약학 조성물은 상기 모낭 유래 줄기세포 이외에도 탈모의 치료 또는 발모의 촉진을 보조하거나, 상기 모낭 유래 줄기세포의 활성을 유지하거나, 상기 모낭 유래 줄기세포의 분화를 촉진하는 다양한 성분을 추가로 포함할 수 있는데, 일 예로서, 항염증제제, 줄기세포 동원인자, 성장 유도인자 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 탈모의 개선, 예방 또는 치료 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 탈모로는 일시적인 탈모인 비반흔성 탈모와 모낭이나 모근이 영구적으로 파괴되어 나타나는 반흔성 탈모를 모두 포함하며, 비반흔성 탈모에는 감염성 탈모, 외상성 탈모, 염증성 탈모, 선천성 탈모, 내분비성 탈모, 종양성 탈모, 영양결핍성 탈모, 약물에 의한 탈모, 그리고 모발의 구조이상에 의한 탈모를 포함하고, 남성형 탈모, 여성형 탈모, 원형 탈모도 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란, 본 발명에 따른 조성물을 개체에 투여하여 탈모의 진행을 지연시키거나 탈모의 증상을 경감시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란, 본 발명에 따른 조성물을 개체에 투여하여 탈모의 발생을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란, 본 발명의 상기 조성물을 탈모 발생 의심 개체에 투여하여 탈모 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 모낭 유래 줄기세포, 그의 배양물 또는 상기 모낭 유래 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 발모 촉진 또는 탈모의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
상기 모낭 유래 줄기세포, 그의 배양물 또는 상기 모낭 유래 줄기세포로부터 분화된 세포, 발모 촉진, 탈모, 예방, 치료는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 사용되는 용어, “투여”는 적절한 방법으로 개체에게 상기 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 구체적으로, 본 발명의 상기 모낭 유래 줄기세포, 그의 배양물 또는 상기 피부 유래 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분을 포함하는 조성물, 또는 이를 포함하는 상기 약학적 조성물을 국소부위, 예를 들어, 탈모 부위에 도포 또는 주사제로 투여할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 조성물은 발모 촉진 또는 탈모의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는 다른 약학적 조성물과 병용되어 사용될 수 있다.
본 발명의 용어, "개체"는 탈모가 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 예방 또는 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
상기 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여할 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여할 수 있다. 또한, 단일 또는 다중 투여할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 상기 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 구체적인 예로, 상기 조성물은 일반적으로 1일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있으나, 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 모낭 유래 줄기세포, 그의 배양물 또는 상기 모낭 유래 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는, 탈모 개선 또는 발모 촉진용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 용어, "의약외품 조성물"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 구체적으로 피부 외용제 또는 개인위생용품일 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 모낭 유래 줄기세포, 그의 배양물 또는 상기 모낭 유래 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는, 탈모 개선 또는 발모 촉진용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 용어, "화장료 조성물"은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 용액, 유탁액, 현탁액, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 파우더, 스프레이, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 파운데이션, 메이크업베이스, 에센스, 화장수, 폼, 팩, 유연수, 선 스크린 크림 또는 선오일 등으로 제형화 될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 모낭 조직 및 하이드로젤을 포함하는 모낭 유래 줄기세포 배양용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 모낭 유래 줄기세포 배양용 키트를 제공하는 것이다.
아울러, 모낭 유래 줄기세포 배양용 키트는 상기 줄기세포 배양용 조성물과 상기 줄기세포의 배양에 필요한 용액, 장치 등의 다양한 구성요소를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 모낭 유래 줄기세포, 그의 배양물 또는 상기 모낭 유래 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 발모 촉진 또는 탈모 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 다층 하이드로젤-지지 모낭조직의 3차원 배양
기증 받은 생리식염수에 담가 냉장 보관된 모낭조직을 시료로 PBS (Gibco)로 3회 세척하였다. 세척한 모낭조직의 hair shaft 부분을 절단한 후, 절단된 쪽으로부터 0.5 mm 내지 1 mm의 infundibulum 부분을 제거하여 모낭조직 절편을 형성하였다. DMEM (low glucose, Gibco) 으로 1회 세척 후 상층액을 제거하고, fibrinogen solution (0.25% w/v fibrinogen (녹십자), 200 μg/mL tranexamic acid (신풍제약) in DMEM) 5 mL을 넣었다. Thrombin solution (0.5 IU/mL thrombin (녹십자) in DMEM) 을 동량 첨가한 100 mm 배양용기에 옮겨 모낭절편 및 하이드로젤이 고루 퍼지게 한 후, 상온에 10분 이내로 방치하여 모낭조직을 하이드로젤에 고정시켰다. 추가로 fibrinogen solution (0.25% w/v fibrinogen, 200 μg/mL tranexamic acid in DMEM)과 Thrombin solution (0.5 IU/mL thrombin in DMEM)을 각 5 mL씩 첨가하고, 10분 이내 방치하여 2차 하이드로젤을 형성한 후, 37℃에 2시간 동안 배양하여 충분히 겔화시켰다(도 1b). Tranexamic acid 100 μg/mL 가 첨가된 성장배지 10mL (90% low DMEM:F12=1:1, 10% Fetal bovine serum, 20 ng/mL epidermal growth factor, 5 ng/mL basic fibroblast growth factor, 10 ng/mL insulin-like growth factor, and 10 mg/mL gentamicin) 를 넣고 10 ~ 30 rpm의 속도로 교반하며 1시간동안 배양하였다. 이후, 2~3일에 한번씩 성장배지를 교환하였다.
실시예 2. 다층 하이드로젤 내로 이동 성장한 HB-모낭 유래 줄기세포의 회수 및 증폭배양
실시예 1에서 기술한 방법으로 10일 또는 14일 간 모낭조직을 배양하였다. 하이드로젤을 warm PBS로 3분간 3회 세척 한 후, 30% FBS/DMEM을 넣고 orbital shaker에서 10 ~ 30 rpm의 속도로 교반했다. 1시간 뒤에 상층액 제거 후, 1 μg/mL alteplase가 첨가된 10 mL 30% FBS/DMEM 을 넣고 gel을 분해시켰다. Gel이 충분히 분해되면 static condition에서 overnight 배양 후 상등액 제거하고 성장배지를 첨가하여 통상적인 방법으로 배양하였다. 2~3일마다 성장배지를 교체해주며, 4~6일마다 계대배양 하였다.
상기 방법에 따라 배양한 조직배양 결과 및 세포분리 및 배양 결과는 도 1에 도시하였다.
실시예 3. 분리 및 배양된 HB-모낭 유래 줄기세포의 면역표현형 확인
실시예 2의 방법에 의해 분리 및 배양된 HB-모낭 유래 줄기세포의 면역표현형을 확인하기 위해 T75 플라스크에서 배양 중이던 세포를 수득하여 3% bovine serum albumin (sigma)/PBS에 현탁하였다. 세포현탁액은 9등분하여 다음의 항체와 4℃에서 1시간동안 반응시켰다: FITC-conjugated CD73 (Abcam, 1:25) antibody, APC-conjugated CD90 (Invitrogen, 1:40), FITC-conjugated CD105 (Abcam, 1:50), FITC-conjugated CD34 (Abcam, 1:10) antibody, FITC-conjugated HLA-DR (Novusbiologicals, 1:20) antibody, Nestin (Novusbiologicals, 1:100) antibody, FITC-conjugated Lgr5 (Origene, 1:100) antibody, FITC-conjugated mouse IgG Isotype control (Novusbiologicals, 1:5). 항체, 또는 AlexaFluor594-conjugated CD45 (Novus, 1:20) antibody. 반응 후 300 g, 5 min에서 원심분리하여 세척 후 3% BSA/PBS에 현탁한 뒤 유세포분석기 (BD)로 측정하였다(도 2).
그 결과 도 2에서 볼 수 있듯이 분리 및 배양된 HB-모낭 유래 줄기세포는 CD73, CD90, CD105, Nestin 및 Lgr5가 발현되고, CD34, CD45 및 HLA-DR은 발현되지 않음을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 분리 및 배양된 HB-모낭 유래 줄기세포의 증식능 및 콜로니 형성능 확인
실시예 2에서 수득된 분리 및 배양된 HB-모낭 유래 줄기세포의 증식능을 확인하기 위하여, 최초 배양 시 4000개/cm2 의 밀도로 세포를 파종 하고 4일마다 계대하여 얻은 세포 수를 통해 계대배양 횟수에 따른 군집배가시간을 측정하였다.
또한, 세포 수는 trypan blue 염색법으로 염색되지 않은 세포의 개수를 카운팅하였으며, 군집배가시간 (PDTs, population doubling time)은 다음 식으로부터 계산하여 도 3에 도시하였다: PDT = [days / (logN2 - logN1)] / log2, (N1 = 4,000 cells, N2 = 4일 후 세포 수).
또한, 실시예 2에서 수득된 분리 및 배양된 HB-모낭 유래 줄기세포의 콜로니 형성능을 확인하기 위하여, 사람 모낭 유래 줄기세포 (4 passages) 를 6-well plate에 20 개/well 로 파종하였다. 3일마다 성장배지로 교체하며 14일간 배양하였다. PBS로 세척 후 4% paraformaldehyde/PBS (sigma)로 15분간 상온에서 방치하여 고정했다. 고정된 세포는 PBS로 3회 세척 후, 0.5% crystal violet/Methanol로 15분간 상온에서 방치하여 염색시켰다. 잔여 용액을 모두 제거한 뒤 증류수로 3회 세척하고 염색된 콜로니를 관찰한 결과를 도 4에 도시하였다.
상기 도 3 및 4의 결과와 같이, 본 실시예 2의 방법에 의해 수득된 HB-모낭 유래 줄기세포는 계대배양에 따른 증식능이 유지되며, 콜로니 형성능 또한 일정 수준 이상임을 확인할 수 있었다.
즉, 모낭 유래 줄기세포를 계대배양 6회차까지 배양하여 population doubling time (PDT)을 구한 결과, PDT는 평균 32 시간 ± 7 시간으로 관찰되었으며, 계대배양에 따른 증식능이 유지됨을 확인할 수 있었다.
실시예 5. HB-모낭 유래 줄기세포의 분화능 확인
수득된 HB-모낭 유래 줄기세포의 지방세포로의 분화능력을 평가하기 위해, 세포를 1×104개/cm2 농도로 파종하여 80% confluency에 도달할 때까지 성장배지에서 배양한 다음, StemProTM Adipogenesis differentiation kit (Gibco, cat. A1007001) 로 배지를 교환하여 3일마다 배지를 갈아주며 14일동안 배양하였다. 4% PFA로 15분 고정하고, 60% isopropanol로 15분간 반응시킨 후 모든 용액을 제거하고 충분히 건조시켰다. 60% Oil Red O (sigma)/ethanol을 상온에서 15분간 염색하여 세포질 내 지방축적여부를 확인하였다(도 5a).
또한, 상기 HB-모낭 유래 줄기세포의 골세포로의 분화능력을 평가하기 위해, 세포를 1×104 개/cm2 농도로 파종하여 80% confluency에 도달할 때까지 성장배지에서 배양한 다음, StemProTM Osteogenesis differentiation kit (Gibco, cat. A1007201)로 배지를 교환하여 3일마다 배지를 갈아주며 14일동안 배양하였다. 4% PFA로 60초간 고정하고, BCIP/NBT substrate solution (Sigma) 처리 후, 차광조건에서 10분간 염색하여 염기성인산분해효소 (Alkaline phosphatase, ALP) 의 활성을 확인하였다(도 5b).
즉, 상기와 같은 결과로서 본원 배양방법에 의해 수득된 HB-모낭 유래 줄기세포는 다분화능을 보유하고 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 6. HB-모낭 유래 줄기세포의 지방유래 줄기세포 대비 차등발현 유전자 확인
지방유래 줄기세포 (ASC-1. ASC-2. ASC-3), HB-모낭 유래 줄기세포 (HB-HFSC-1, HB-HFSC-2, HB-HFSC-3)을 각3lot의 샘플을 TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit을 이용해 제조사의 프로토콜에 따라 페어드-엔드 RNA 라이브러리를 구축하였고, 마크로젠사 (서울, 대한민국)에서 시퀀싱을 수행하였다. 전처리 과정 후 HISAT2 프로그램 (버전 2.1.0, https://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml)으로 레퍼런스 지놈 (버전 GRCh38)에 매핑하고 StringTie 프로그램 (버전 2.1.3b, https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/)로 전사체별 발현량 프로파일을 얻었다 (도 6a). 유전자 발현량은 TPM (Transcripts Per Kiobase Million) 값에 로그를 취하여 다루었다 (도 6a). 대조군과 비교군간의 차등발현유전자는 R 프로그램 (버전 4.0)의 edgeR 패키지[1]를 이용하여 얻었다(1. SZKLARCZYK, Damian, et al. STRING v11: protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic acids research, 2019, 47.D1: D607-D613.). 줄기세포에서 차등발현하는 유전자의 발현 패턴을 관련 질환 전사체 데이터와 비교를 위해 공개된 전사체 데이터를 GEO (Gene Expression Omnibus) 데이터베이스에서 수집하였다. 각 공개 데이터의 차등 유전자 발현량 분석은 R 프로그램 (버전 4.0)의 limma 패키지 [2]를 이용하였다(2. ROBINSON, Mark D.; MCCARTHY, Davis J.; SMYTH, Gordon K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. bioinformatics, 2010, 26.1: 139-140.). 분석 프로그램에 따라 자체적으로 제공하는 통계적 검정 결과는 그대로 사용하였고, 유의 수준은 0.05 미만을 유의한 것으로 간주하였다. P value가 0.05를 초과한 결과를 표기하는 경우 P value를 별도로 표기하였다.
마커 유전자들이 참여하는 생물학적 네트워크 구축은 String Database (버전 11.5) [3]를 이용하여(3. SMYTH, Gordon K., et al. LIMMA: linear models for microarray data. In Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. Statistics for Biology and Health. 2005.) 단백질-단백질 상호작용 (PPI) 네트워크를 구축하였다 (도 7a, b). PPI 네트워크 구축에 사용한 유기체 레퍼런스는 Homo sapiens로 하였다. 네트워크 구축을 위한 설정으로 단백질을 나타내는 노드 (node)를 서로 연결하는 에지 (edge)는 실험 결과, 생물학적 데이터베이스 및 문헌, 유전자 퓨전 등의 근거 기반으로 연결하도록 하였고, 에지 점수는 0.4 이상인 것을 유의미 한 것으로 하였다. 네트워크 구축 후 다른 노드간 연결성이 없는 고아 노드들은 제거하였다. 노드 그룹들이 속하는 생물학적 기능은 KEGG 데이터베이스 [4]를 기준으로 통계적으로 유의한 것만 추출하였다 (False Discovery Rate < 0.05)( 4. KANEHISA, Minoru; GOTO, Susumu. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic acids research, 2000, 28.1: 27-30.). 두 그룹간 유의적인 차이 검정은 T-Test를 수행하여 얻었고 P value < 0.05 미만을 유의한 것으로 간주하였다. 분석 프로그램에 따라 자체적으로 제공하는 통계적 검정 결과는 그대로 사용하였고, 유의 수준은 0.05 미만을 유의한 것으로 간주하였다. P value가 0.05를 초과한 결과를 표기하는 경우 P value를 별도로 표기하였다.
String DB를 이용하여 HB-모낭 유래 줄기세포에서 발현된 유전자를 발모촉진 관련 유전자 network와 분석하여, 알려진 발모촉진 pathway와의 연관성을 확인하였으며 7개의 발모촉진 기능성 유전자 (SNAP25, ITGA8, PLCB4, COL10A1, GPNMB, TMEM119, AQP1)를 도출하였다. (도 6a). 또한 HB-모낭 유래 줄기세포가 지방유래 줄기세포 대비 주요 발모기능 관련 유전자(TCF3, PRDM1, WNT5A, WNT5B, WNT9A, FGFR2 등)를 높은 수준으로 발현함을 확인하였다(도 6b). HB-모낭 유래줄기세포에서 Fold change >10으로 지방유래 줄기세포 대비 발현된 유전자 80개를 확인하였고, 이 중 도 6a에서 도출한 발모촉진 기능성유전자 7개 (SNAP25, ITGA8, PLCB4, COL10A1, GPNMB, TMEM119, AQP1)가 지방유래 줄기세포 대비 차등발현이 나타났다 (도 6c 및 6d). 기존 모낭 또는 모낭 유래 줄기세포와 HB-모낭 유래 줄기세포의 유전자 발현량을 비교하였을 때, 발모촉진 기능성 유전자 7개 (SNAP25, ITGA8, PLCB4, COL10A1, GPNMB, TMEM119, AQP1)가 10배 이상 발현이 증가하여 유의하게 차등발현됨을 확인하였다 (도 6e).
상기 발모촉진 기능성 유전자 7종은 모낭 형성과 생장과 관련하여 알려진 시그널링인 Wnt signaling 및 PI3K signaling과 연관성이 있는 유전자로 알려져 있는 바, 이를 바탕으로 본 발명의 모낭 유래 줄기세포 제조방법에 의해 제조된 모낭 유래 줄기세포의 발모촉진 효과를 유추할 수 있다.
더불어, 모낭의 퇴행기를 유도하는 유전자로 알려진 CCN2, TGFB1유전자의 경우 발현 감소를 확인할 수 있었다(도 6b).
실시예 7.
누드마우스에서의 발모촉진효과 확인
실험동물인 7~12주령 BALB/c nude mouse (중앙실험동물)를 3% Isoflurane (하나제약)을 통해 흡입 마취시켰다. 마취가 완료된 것을 확인 후 HB-모낭 유래 줄기세포 1×106개 세포를 Normal saline (NS) 100㎕에 현탁하여 등쪽 (Dorsal part)에 4군데 (2×2cm) 모서리에 Insulin syringe (30 gauge)를 이용하여 피내주사 (Intradermal injection)하였다. HB-모낭 유래 줄기세포 투여 후 14일, 31일간 추적관찰 하였으며, 투여 직후 (0일), 투여 후 3일, 7일, 14일, 28일, 31일 디지털카메라로 투여부위를 촬영하였다. 투여부위 (2×2cm, 4cm2)를 백분율 기준으로 털이자란 부분의 넓이를 Image J (NIH)를 통해 측정하였다. (도 7a 및 도7b). 상기 결과로서 본 HB-모낭 유래 줄기세포의 발모촉진 효과를 확인할 수 있었다.
실시예 8.
누드마우스에서의 모낭형성능 및 피부두께 증가 확인
조직학적 분석을 위해 피부 조직을 고정액 (4% formaldehyde, sigma)에 24시간 고정한 후, 조직을 파라핀 포매 (Paraffin embedding)하여 박절한 뒤, H&E (Hematoxylin & Eosin) 염색을 실시하였다. 광학현미경을 통해 모낭 및 피부층 두께의 형태학적 변화를 확인하였다. 형성된 모낭 수 및 Epidermis, Dermis, Hypodermis 두께는 Image J를 통해 측정하였다 (도 8). HB-모낭 유래 줄기세포 투여 14일 및 31일 후, 모낭 형성 및 피부두께 증가를 확인하였다.
실시예 9.
누드마우스에서의 Wnt 신호전달 작용기전 확인
상기 H&E 염색과 마찬가지로 각 군의 조직을 고정하였으며, 파라핀 포매 후 박절하여 조직슬라이드를 제작하였다. Beta-catenin antibody (Invitrogen, MA1-2001)에 2차 항체를 붙여 조직면역화학염색 (Immunofluorescence, IF)을 진행하였고 (도 9a), 프리하이브리드화 용액 (50% 포름아미드, 4X SSC, 50mM DDT, 4X Denhart`s soln, `X TED, 100ug/ml denatured salmon sperm DNA, 250ug/ml yeast RNA) 42도에서 1시간동안 반응시켜 CD34 mRNA에 결합하도록 하였다 (도 9b). HB-모낭 유래 줄기세포 투여 31일 후 β-catenin 발현이 증가되었고, CD34 유전자 발현 증가됨을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (13)
- (a) 모낭 조직을 하이드로젤 내에 함입시키고 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및(b) 상기 수득한 배양물에서 하이드로젤을 분해하여 상기 모낭 조직으로부터 하이드로젤 내로 이동 및 증식한 줄기세포를 회수하는 단계를 포함하는, 모낭 유래 줄기세포의 배양방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a)단계는 모낭 조직을 하이드로겔 이중층 사이에 함입시켜 배양하는 것인, 모낭 유래 줄기세포의 배양방법.
- 제1항에 있어서, 상기 모낭조직은 표피(epidermal)에서 모낭 누두부(follicular infundibulum)에 해당하는 부위를 제거한 절편을 이용하는 것인, 모낭 유래 줄기세포의 배양방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a)단계에서 모낭 조직의 배양은 3일 내지 20일인 것인, 모낭 유래 줄기세포의 배양방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a)단계에서 모낭 조직의 배양은 조직간 간격이 1mm 이상 50mm이하로 파종된 것인, 모낭 유래 줄기세포의 배양방법.
- 제1항에 있어서, 상기 모낭 유래 줄기세포는 SANP25, COL10A1, TMEM119, AQP1, PLCB4 및 ITGA8에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 발현이 증가된 것인, 모낭 유래 줄기세포의 배양방법.
- 제1항에 있어서, 상기 모낭 유래 줄기세포는 CD73, CD90, CD105, Nestin 및 Lgr5가 발현되고,CD34, CD45 및 HLA-DR은 발현되지 않는 면역학적 특성을 가진 것인, 모낭 유래 줄기세포의 제조 방법.
- 제1항의 방법으로 제조된 모낭 유래 줄기세포.
- 제8항에 있어서, 상기 모낭 유래 줄기세포는 SANP25, COL10A1, TMEM119, AQP1, PLCB4 및 ITGA8에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 발현이 증가된 것인, 모낭 유래 줄기세포.
- 제8항에 있어서, 상기 모낭 유래 줄기세포는 CD73, CD90, CD105, Nestin 및 Lgr5가 발현되고,CD34, CD45 및 HLA-DR은 발현되지 않는 면역학적 특성을 가진 것인, 모낭 유래 줄기세포.
- 제1항의 방법으로 제조된 모낭 유래 줄기세포, 그의 배양물 또는 상기 모낭 유래 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는, 탈모 치료 또는 발모 촉진용 약학 조성물.
- 제1항의 방법으로 제조된 모낭 유래 줄기세포, 그의 배양물 또는 상기 모낭 유래 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는, 탈모 개선 또는 발모 촉진용 의약외품 조성물.
- 제1항의 방법으로 제조된 모낭 유래 줄기세포, 그의 배양물 또는 상기 모낭 유래 줄기세포로부터 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는, 탈모 개선 또는 발모 촉진용 화장료 조성물.
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