ES2891134T3 - Composiciones y métodos de preparación de células de vías respiratorias - Google Patents

Abstract

Un método de diferenciación in vitro de una célula madre pluripotente inducida (iPS) en una célula epitelial de las vías respiratorias que comprende: cultivar la célula iPS que se obtiene preferiblemente a partir de una célula humana enferma; más preferiblemente una célula iPS humana específica de la enfermedad de fibrosis quística, en ausencia de suero para inducir la diferenciación en una célula de endodermo definitivo (DE); cultivar la célula DE en presencia de suero para inducir la diferenciación en una célula de endodermo anterior de la parte anterior del tubo digestivo (AFE), en donde la célula AFE preferiblemente expresa NKX2.1; y cultivar la célula AFE en presencia de suero, un cóctel de citocinas que comprende EGF, KGF, BMP7, BMP4 e IWR-1, y una alta concentración de ácido retinoico, en donde la alta concentración comprende de 0,8 μM a 1,2 μM para inducir la diferenciación de la célula AFE en la célula epitelial de las vías respiratorias, en donde la célula epitelial de las vías respiratorias expresa la proteína secretora de células de Clara (CCSP), la citoqueratina 5 (KRT5) y los marcadores de superficie de las células de las vías respiratorias FOXJ1, y en donde la célula epitelial de las vías respiratorias es capaz de proliferar en cultivo durante al menos 30 días, preferiblemente más de 30 días, sin pérdida de los marcadores de superficie de las células de las vías respiratorias.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos de preparación de células de vías respiratorias

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos Núm. 61/927.097, presentada el 14 de enero de 2014.

Antecedentes de la invención

Aproximadamente 30.000 personas en Estados Unidos tienen fibrosis quística (FQ) y cada año se diagnostican alrededor de 1.000 nuevos casos de FQ. La FQ es un trastorno genético autosómico recesivo que afecta más críticamente a los pulmones y también al páncreas, el hígado y el intestino. Se caracteriza por un transporte anormal de cloruro y sodio a través del epitelio, lo que da lugar a secreciones espesas y viscosas. La causa más común de muerte en personas con FQ es la insuficiencia respiratoria. Varios estudios han demostrado que las mutaciones en el gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) pueden alterar el plegamiento, la secreción, la estabilidad de la superficie celular y/o la función del canal de cloruro de CFTR a través de un epitelio. Aunque se está realizando un intenso esfuerzo para identificar compuestos que se dirigen al defecto estructural de CFTR, hasta ahora su eficacia clínica ha demostrado ser deficiente, lo que destaca la necesidad de comprender mejor el mecanismo molecular de la regulación de CFTR, que es un requisito previo para desarrollar terapias más eficaces.

En las vías respiratorias, las mutaciones de CFTR tienen un gran impacto sobre las células epiteliales de las vías respiratorias proximales. Uno de los principales obstáculos en la investigación de la FQ es la falta de células epiteliales humanas vivas de las vías respiratorias proximales, el tipo de célula afectado selectivamente por las mutaciones de CFTR, para su uso en estudios mecanicistas y en el descubrimiento de fármacos. Los modelos animales de FQ generalmente no recapitulan muy bien la afección humana. Se ha demostrado que las células madre pluripotentes inducidas (iPS) muestran el potencial de convertirse en células epiteliales alveolares. Varios grupos de investigación han informado de la diferenciación de células ESC e iPS hacia células alveolares de tipo II, utilizando una variedad de protocolos. Sin embargo, muchos aspectos de estas enfermedades de las vías respiratorias profundamente importantes siguen siendo poco conocidos. Wong et al., Nature Biotechnology (26 de agosto de 2012) se refieren a células iPS inducidas que se utilizan para generar células epiteliales de las vías respiratorias y describen que se ha investigado la expresión de marcadores de superficie - entre otros SCGB1A1 (CCSP), KRT5 y FOXJ1. Ghaedi et al., en Journal of Clinical Investigation (1 de noviembre de 2013) describen un método para generar células epiteliales alveolares (AETII) a partir de iPSC que se convierten en endodermo definitivo (DE) cultivado inicialmente sin suero. Las células AETII son negativas para los marcadores de superficie CCSP, p63 y SOX2. El documento WO 2006/128025 y Park et al., Developmental Biology (1 de junio de 2006) se refieren al tratamiento de lesiones pulmonares. Más específicamente, se refieren a la capacidad de la proteína de unión al ADN Sox17 para influir en la diferenciación de las células epiteliales respiratorias e inducir la activación del sistema de reparación pulmonar.

Por tanto, existe una necesidad en la técnica de identificar una fuente fiable de células epiteliales funcionales de las vías respiratorias para su uso en terapias relacionadas con el pulmón.

Compendio de la invención

La presente invención se define mediante los siguientes apartados 1-10, a continuación

1. Un método in vitro para diferenciar una célula madre pluripotente inducida (iPS) en una célula epitelial de las vías respiratorias que comprende:

cultivar la célula iPS que se obtiene preferiblemente de una célula humana enferma; más preferiblemente una célula iPS humana específica de la enfermedad de fibrosis quística, en ausencia de suero para inducir la diferenciación en una célula de endodermo (DE) definitiva;

cultivar la célula DE en presencia de suero para inducir la diferenciación en una célula de endodermo anterior de la parte anterior del tubo digestivo (AFE), en donde la célula AFE preferiblemente expresa NKX2.1; y

cultivar la célula AFE en presencia de suero, un cóctel de citocinas que comprende EGF, KGF, BMP7, BMP4 e IWR-1, y una alta concentración de ácido retinoico, en donde la alta concentración comprende de 0,8 |^jM a 1,2 ^j M para inducir la diferenciación de la AFE en la célula epitelial de las vías respiratorias, en donde la célula epitelial de las vías respiratorias expresa la proteína secretora de células de Clara (CCSP), la citoqueratina 5 (KRT5) y los marcadores de superficie celular de las vías respiratorias FOXJ1, y en donde la célula epitelial de las vías respiratorias es capaz de proliferar en cultivo durante al menos 30 días, preferiblemente más de 30 días, sin pérdida del marcador de superficie celular de las vías respiratorias.

2. El método del apartado 1, en donde la etapa de cultivar la célula iPS comprende cultivar la célula iPS en presencia de activina A, preferiblemente a aproximadamente concentraciones de saturación, para inducir la diferenciación a la célula DE.

3. El método del apartado 1, en donde la célula DE expresa uno o más marcadores celulares de endodermo definitivos seleccionados del grupo que consiste en c-kit, SOX17, FOXA2 y CXCR4.

4. El método del apartado 1, en donde la etapa de cultivar la célula DE comprende cultivar las células DE en presencia de moléculas de la matriz extracelular (ECM); preferiblemente que comprende disociar la célula DE antes del cultivo con moléculas ECM.

5. El método del apartado 4, en donde las moléculas de ECM comprenden uno o más de colágeno, laminina, fibronectina, tenascina, elastina, un proteoglicano y un glicosaminoglicano.

6. El método del apartado 1, en donde la etapa de cultivar la célula DE comprende exponer secuencialmente la célula DE a inhibidores moleculares pequeños para suprimir el destino del endodermo posterior e inducir el destino del endodermo proximal.

7. El método del apartado 6, en donde los inhibidores de molécula pequeña inhiben la señalización de BMP/TGF y se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en dorsomorfina, Noggin, A83-01, DMH-1, D4476, GW788388, LY364947, RepSox, SB431542, SB505124, SB525334, y SD208.

8. El método del apartado 1, en donde la etapa de cultivar la célula iPS comprende cultivar la célula iPS en presencia de activina A a aproximadamente concentraciones de saturación, para inducir la diferenciación en la célula DE.

9. El método del apartado 6, en donde los inhibidores de molécula pequeña inhiben la señalización de TGF/WNT.

10. El método del apartado 5, en donde la etapa de cultivar la célula iPS comprende cultivar la célula iPS en presencia de un suplemento sin suero, para inducir la diferenciación en la célula DE.

La divulgación incluye composiciones y métodos para preparar células epiteliales de las vías respiratorias que se pueden utilizar en ingeniería de tejidos y para el tratamiento de trastornos respiratorios.

En un aspecto, la divulgación incluye una célula epitelial de las vías respiratorias obtenida a partir de una célula madre pluripotente inducida (iPS) caracterizada por la expresión de marcadores de superficie de las células de las vías respiratorias, en donde los marcadores de superficie de las células de las vías respiratorias comprenden la proteína secretora de células de Clara (CCSP), citoqueratina 5 (KRT5) y FOXJ1, y la capacidad de proliferar en cultivo sin pérdida de los marcadores de superficie de las células de las vías respiratorias. En un aspecto, la divulgación incluye un método para diferenciar una célula madre pluripotente inducida (iPS) en una célula epitelial de las vías respiratorias que comprende cultivar la célula iPS en ausencia de suero para inducir la diferenciación en una célula de endodermo (DE) definitiva, cultivar la célula DE en presencia de suero para inducir la diferenciación en una célula de endodermo anterior de la parte anterior del tubo digestivo (AFE) y cultivar la célula AFE en presencia de suero, un cóctel de citocinas y una alta concentración de ácido retinoico para inducir la diferenciación de la célula AFE en la célula epitelial de las vías respiratorias. En otro aspecto, la divulgación incluye un método de diseñar mediante ingeniería un tejido pulmonar tridimensional que comprende diferenciar una población de células madre pluripotentes inducidas (iPS) en células epiteliales de las vías respiratorias, en donde las células epiteliales de las vías respiratorias expresan marcadores de la superficie de las células de las vías respiratorias que comprenden la proteína secretora de células de Clara (CCSP), citoqueratina 5 (KRT5) y FOXJ1; y son capaces de proliferar en cultivo sin pérdida de los marcadores de las células de las vías respiratorias, y sembrar las células epiteliales de las vías respiratorias sobre un armazón tridimensional. En otro aspecto más, la divulgación incluye un tejido pulmonar tridimensional diseñado mediante ingeniería que comprende la célula epitelial de las vías respiratorias descrita en el presente documento.

En varias realizaciones de los aspectos anteriores descritos en el presente documento, la divulgación incluye la célula epitelial de las vías respiratorias que está ciliada. En otra realización, la célula epitelial de las vías respiratorias se obtiene a partir de una célula iPS humana de fibrosis quística. En otra realización más, la célula epitelial de las vías respiratorias es capaz de proliferar en cultivo durante al menos aproximadamente 30 días, tal como más de aproximadamente 30 días.

En otra realización, la expresión de marcadores de la superficie de las células de las vías respiratorias comprende adicionalmente la proteína reguladora de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) y/o al menos una entre p-tubulina IV, mucina-5AC y P63. En otra realización más, los marcadores de la superficie de las células de las vías respiratorias se expresan a niveles comparables a los expresados en las células de las vías respiratorias humanas recién aisladas.

En una realización, el cultivo de la célula iPS comprende cultivar la célula iPS en presencia de activina A. En tal realización, la activina A se encuentra aproximadamente a concentraciones de saturación en el cultivo de células iPS. En otra realización, el cultivo de células iPS comprende cultivar las células iPS en presencia de un suplemento sin suero.

En una realización, la célula DE expresa uno o más marcadores celulares de endodermo definitivos seleccionados del grupo que consiste en c-kit, SOX17, FOXA2 y CXCR4. En tales realizaciones, el cultivo en presencia de moléculas ECM comprende disociar la célula DE antes del cultivo con moléculas ECM. Asimismo, las moléculas de ECM pueden comprender uno o más de un colágeno, laminina, fibronectina, tenascina, elastina, un proteoglicano y un glicosaminoglicano. En otra realización, el cultivo de la célula DE comprende exponer secuencialmente la célula DE a inhibidores de molécula pequeña para suprimir el destino de endodermo posterior e inducir el destino de endodermo proximal, tales como los inhibidores de molécula pequeña que inhiben la señalización de BMP/TGF como dorsomorfina, Noggin, A83-01, DMH-1, D4476, GW788388, LY364947, RepSox, SB431542, SB505124, SB525334 y SD208. Asimismo, los inhibidores de molécula pequeña pueden inhibir la señalización de TGF/WNT, tales como IWR-1, Noggin, CCT036477, IWP2, desmetoxi curcumina, FH535 A83-01, D4476, GW788388, LY364947, RepSox, SB431542, SB505124, SB5258334, y SD208.

En otra realización, la célula AFE expresa NKX2.1.

En otra realización más, la alta concentración de ácido retinoico comprende al menos aproximadamente 0,5 pM de ácido retinoico, tal como aproximadamente 1 pM.

En otra realización, el cóctel de citocinas inhibe la vía de WNT.

En otra realización más, la célula iPS se obtiene a partir de una célula humana enferma, tal como una célula iPS humana específica de la enfermedad de fibrosis quística.

En otro aspecto, la divulgación incluye un método para mejorar, tratar o aliviar un síntoma de un trastorno respiratorio en un sujeto que lo necesita, que comprende diferenciar una célula madre pluripotente inducida (iPS) en una célula epitelial de las vías respiratorias, en donde las células epiteliales de las vías respiratorias expresan marcadores de superficie de las células de las vías respiratorias que comprenden la proteína secretora de células de Clara (CCSP), citoqueratina 5 (KRT5) y FOXJ1, y son capaces de proliferar en cultivo sin pérdida de los marcadores de células de las vías respiratorias, y administrar las células epiteliales de las vías respiratorias en una cantidad eficaz para tratar el trastorno respiratorio en el sujeto.

En varias realizaciones de los aspectos anteriores descritos en el presente documento, la divulgación incluye células epiteliales de las vías respiratorias que forman una estructura de organoide.

En otra realización, el armazón tridimensional comprende matrigel.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un diagrama de las etapas para diferenciar las células iPS humanas en células epiteliales de las vías respiratorias.

La Figura 2A muestra el análisis de citometría de flujo de la población celular obtenida a partir de células iPS el día 5 en el que se expresa c-kit.

La Figura 2B muestra el análisis de citometría de flujo de la población celular obtenida a partir de células iPS el día 5 en el que se expresa FOXA2.

La Figura 2C muestra el análisis de citometría de flujo de la población celular obtenida a partir de células iPS el día 5 en el que se expresa SOX17.

La Figura 2D muestra el análisis de citometría de flujo de la población de células obtenida a partir de células iPS el día 5 en el que se expresa CXCR4 en el clon Cl.

La Figura 3A muestra el efecto de los agonistas y antagonistas durante la diferenciación de AFE sobre la expresión de FOXA2/SOX2.

La Figura 3B muestra el efecto de los agonistas y antagonistas durante la diferenciación de AFE sobre la expresión de NKX2.1.

La Figura 4 muestra un diagrama de las etapas del protocolo que se manipularon para diferenciar las células iPS humanas en células epiteliales de las vías respiratorias y dar como resultado un aumento de células NKX2.1+FOXA2+.

La Figura 5 muestra ese aumento de células NKX2.1+FOXA2+ el día 15 en comparación con las células DE expuestas a NOGGIN/SB con menos de 1% sin anteriorización.

La Figura 6A muestra células NKX2.1+ diferenciadas ex vivo teñidas con DAPI.

La Figura 6B muestra células NKX2.1+ diferenciadas ex vivo teñidas con FOXA2.

La Figura 6C muestra células NKX2.1+ diferenciadas ex vivo teñidas con NKX2.1.

La Figura 6D muestra células NKX2.1+ diferenciadas ex vivo teñidas simultáneamente con NKX2.1/FOXA2/DAPI, lo que sugiere que las células NKX2.1+ se diferenciaron in vitro.

La Figura 7A muestra NKX2.1+/SOX2+ diferenciadas ex vivo teñidas con DAPI.

La Figura 7B muestra NKX2.1+/SOX2+ diferenciadas ex vivo teñidas con SOX2.

La Figura 7C muestra NKX2.1+/SOX2+ diferenciadas ex vivo teñidas con NKX2.1.

La Figura 7D muestra NKX2.1+/SOX2+ diferenciadas ex vivo teñidas con SOX2/NKX2.1/DAPI, lo que sugiere que las células NKX2.1+/SOX2+ se diferenciaron in vitro.

La Figura 8 es un gráfico de barras que muestra las células progenitoras de las vías respiratorias NKX2.1+/ SOX2+ preparadas a aproximadamente 30% en comparación con aproximadamente 1-2% antes del tratamiento.

La Figura 9 es un diagrama que muestra la diferenciación de las vías respiratorias y los suplementos de los medios basales.

La Figura 10A muestra los resultados de una RT-PCR cuantitativa de FOXJ1 el día 20 en células epiteliales pulmonares maduras de las vías respiratorias.

La Figura 10B muestra los resultados de una RT-PCR cuantitativa de KRT5 el día 20 en células epiteliales pulmonares maduras de las vías respiratorias.

La Figura 10C muestra los resultados de una RT-PCR cuantitativa de CFTR el día 20 en células epiteliales pulmonares maduras de las vías respiratorias.

La Figura 10D muestra los resultados de una RT-PCR cuantitativa de CCSP o SCGB1A1 el día 20 en células epiteliales pulmonares maduras de las vías respiratorias.

La Figura 10E muestra los resultados de una RT-PCR cuantitativa de P63 el día 20 en células epiteliales pulmonares maduras de las vías respiratorias.

La Figura 10F muestra los resultados de una RT-PCR cuantitativa de SOX2 el día 20 en células epiteliales pulmonares maduras de las vías respiratorias.

La Figura 10G muestra los resultados de una RT-PCR cuantitativa de Mucin5AC el día 20 en células epiteliales pulmonares maduras de las vías respiratorias.

La Figura 11 es un diagrama que muestra la combinación de factores de crecimiento e inhibidor el día 27 para inducir la diferenciación epitelial de las vías respiratorias.

La Figura 12A muestra el análisis de citometría de flujo de la población celular obtenida a partir de células iPS el día 27 que expresan FOXJ1.

La Figura 12B muestra el análisis de citometría de flujo de la población celular obtenida a partir de células iPS el día 27 que expresan CFTR.

La Figura 12C muestra el análisis de citometría de flujo de la población celular obtenida a partir de células iPS el día 27 que expresan p-tubulina IV.

La Figura 12D muestra el análisis de citometría de flujo de la población celular obtenida a partir de células iPS el día 27 que expresan SOX2.

La Figura 12E muestra el análisis de citometría de flujo de la población celular obtenida a partir de células iPS el día 27 que expresan CCSP.

La Figura 12F muestra el análisis de citometría de flujo de la población celular obtenida a partir de células iPS el día 27 que expresan KRT5.

La Figura 12G muestra el análisis de citometría de flujo de la población celular obtenida a partir de células iPS el día 27 que expresan Mucin5AC.

La Figura 12H muestra el análisis de citometría de flujo de la población celular obtenida a partir de células iPS el día 27 que expresan P63.

La Figura 13A muestra los resultados de una RT-PCR cuantitativa de CFTR el día 27 en células epiteliales pulmonares maduras de las vías respiratorias.

La Figura 13B muestra los resultados de una RT-PCR cuantitativa de FOXJ1 el día 27 en células epiteliales pulmonares maduras de las vías respiratorias.

La Figura 13C muestra los resultados de una RT-PCR cuantitativa de SCGB1A1 (CCSP) el día 27 en células epiteliales pulmonares maduras de las vías respiratorias.

La Figura 13D muestra los resultados de una RT-PCR cuantitativa de Mucin5AC el día 27 en células epiteliales pulmonares maduras de las vías respiratorias.

La Figura 13E muestra los resultados de una RT-PCR cuantitativa de NKX2.1 el día 27 en células epiteliales pulmonares maduras de las vías respiratorias.

La Figura 13F muestra los resultados de una RT-PCR cuantitativa de KRT5 el día 27 en células epiteliales pulmonares maduras de las vías respiratorias.

La Figura 14 es un diagrama que muestra la maduración de la diferenciación de las células epiteliales de las vías respiratorias el día 35.

La Figura 15A muestra células epiteliales de las vías respiratorias teñidas como progenitores proximales.

La Figura 15B muestra células epiteliales de las vías respiratorias teñidas con anticuerpo para FOXJ1. La Figura 15C muestra células epiteliales de las vías respiratorias teñidas con anticuerpo para Mucin5AC. La Figura 15D muestra células epiteliales de las vías respiratorias teñidas con anticuerpo para CCSP. La Figura 15E muestra células epiteliales de las vías respiratorias teñidas con anticuerpo para CFTR. La Figura 15F muestra células epiteliales de las vías respiratorias teñidas con anticuerpo para PanKRT. La Figura 16A muestra el análisis de citometría de flujo para el marcador de células de las vías respiratorias Mucin5AC el día 35.

La Figura 16B muestra el análisis de citometría de flujo para el marcador de células de las vías respiratorias FOXJ1 el día 35.

La Figura 16C muestra el análisis de citometría de flujo para el marcador de células de las vías respiratorias p-tubulina IV el día 35.

La Figura 16D muestra el análisis de citometría de flujo para el marcador de células de las vías respiratorias P63 el día 35.

La Figura 16E muestra el análisis de citometría de flujo para el marcador de células de las vías respiratorias CFTR el día 35.

La Figura 16F muestra el análisis de citometría de flujo para el marcador de células de las vías respiratorias CCSP el día 35.

La Figura 16G muestra el análisis de citometría de flujo para el marcador de células de las vías respiratorias CK5 o KRT5 el día 35.

La Figura 16H muestra el análisis de citometría de flujo para el marcador de células de las vías respiratorias SOX2 el día 35.

La Figura 17A muestra los resultados de una RT-PCR cuantitativa de KRT5 o CK5 el día 35 en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de iPS.

La Figura 17B muestra los resultados de una RT-PCR cuantitativa de CFTR el día 35 en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de iPS.

La Figura 17C muestra los resultados de una RT-PCR cuantitativa de NKX2.1 el día 35 en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de iPS.

La Figura 17D muestra los resultados de una RT-PCR cuantitativa de P63 el día 35 en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de iPS.

La Figura 17E muestra los resultados de una RT-PCR cuantitativa de SCGB1A1 o CCSP el día 35 en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de iPS.

La Figura 17F muestra los resultados de una RT-PCR cuantitativa de FOXJ1 el día 35 en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de iPS.

La Figura 17G muestra los resultados de una RT-PCR cuantitativa de Mucin5AC el día 35 en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de iPS.

La Figura 18 muestra un diagrama de un enfoque de diferenciación etapa por etapa para generar progenitores de las vías respiratorias pulmonares a partir de células iPS humanas específicas de la enfermedad de FQ.

La Figura 19A muestra células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de células iPS humanas específicas de la enfermedad de FQ teñidas con anticuerpo para CFTR.

La Figura 19B muestra células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de células iPS humanas específicas de la enfermedad de FQ teñidas con anticuerpo para Mucin5AC.

La Figura 19C muestra células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de células iPS humanas específicas de la enfermedad de FQ teñidas con anticuerpo para PanKRT.

La Figura 19D muestra células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de células iPS humanas específicas de la enfermedad de FQ teñidas con anticuerpo para CCSP.

La Figura 20A muestra el análisis de citometría de flujo de Mucin5AC en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de células iPS humanas específicas de la enfermedad de FQ.

La Figura 20B muestra el análisis de citometría de flujo de P63 en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de células iPS humanas específicas de la enfermedad de Fq .

La Figura 20C muestra el análisis de citometría de flujo de p-tubulina IV en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de células iPS humanas específicas de la enfermedad de FQ.

La Figura 20D muestra el análisis de citometría de flujo de FOXJ1 en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de células iPS humanas específicas de la enfermedad de FQ.

La Figura 20E muestra el análisis de citometría de flujo de CFTR en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de células iPS humanas específicas de la enfermedad de FQ.

La Figura 20F muestra el análisis de citometría de flujo de SOX2 en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de células iPS humanas específicas de la enfermedad de FQ.

La Figura 20G muestra el análisis de citometría de flujo de CK5 o KRT5 en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de células iPS humanas específicas de la enfermedad de FQ.

La Figura 20H muestra el análisis de citometría de flujo de CCSP en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de células iPS humanas específicas de la enfermedad de FQ.

La Figura 21A muestra una RT-PCR cuantitativa de NKX2.1 en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de células iPS humanas específicas de la enfermedad de FQ.

La Figura 21B muestra una RT-PCR cuantitativa de Mucin5AC en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de células iPS humanas específicas de la enfermedad de FQ.

La Figura 21C muestra una RT-PCR cuantitativa de SOX2 en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de células iPS humanas específicas de la enfermedad de FQ.

La Figura 21D muestra una RT-PCR cuantitativa de P63 en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de células iPS humanas específicas de la enfermedad de FQ.

La Figura 21E muestra una RT-PCR cuantitativa de SCGB1A1 o CCSP en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de células iPS humanas específicas de la enfermedad de FQ.

La Figura 21F muestra una RT-PCR cuantitativa de FOXJ1 en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de células iPS humanas específicas de la enfermedad de FQ.

La Figura 21G muestra una RT-PCR cuantitativa de KRT5 en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de células iPS humanas específicas de la enfermedad de FQ.

La Figura 21H muestra una RT-PCR cuantitativa de CFTR en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de células iPS humanas específicas de la enfermedad de FQ.

La Figura 22A es un panel de imágenes que muestra la inmunotinción positiva de P63 de células progenitoras de las vías respiratorias obtenidas a partir de iPSC que se desarrollaron a estructuras organoides pulmonares en Matrigel.

La Figura 22B es un panel de imágenes que muestra la inmunotinción positiva de NKX2.1 de células progenitoras de las vías respiratorias obtenidas a partir de iPSC que se desarrollaron en estructuras organoides pulmonares en Matrigel.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos empleados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque se puede emplear cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica para someter a prueba la presente invención, los materiales y métodos preferidos se describen en el presente documento. Al describir y reivindicar la presente invención, se utilizará la siguiente terminología.

También se debe entender que la terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante.

Como se emplea en el presente documento, los artículos "un" y "una" se utilizan para referirse a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

Como se emplea en el presente documento cuando se hace referencia a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal y similares, se pretende que el término "aproximadamente" abarque variaciones de ± 20% o en el margen de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% o 0,01% del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar los métodos descritos. A menos que quede claro lo contrario a partir del contexto, todos los valores numéricos proporcionados en el presente documento se modifican por el término aproximadamente.

Por "endodermo anterior de la parte anterior del tubo digestivo" se entiende el endodermo que es anterior al endodermo que da lugar al hígado. Un experto en la técnica apreciará fácilmente que el "endodermo anterior de la parte anterior del tubo digestivo " incluye, por ejemplo, el endodermo faríngeo y otras poblaciones más altamente diferenciadas de las células endodérmicas y que los diversos tipos de células abarcados por el término "endodermo anterior de la parte anterior del tubo digestivo" pueden mostrar diferentes patrones de expresión de marcadores moleculares. Un experto en la técnica apreciará que el "endodermo anterior de la parte anterior del tubo digestivo" da lugar a diversos tejidos, por ejemplo, amígdalas, membrana timpánica, tiroides, glándulas paratiroides, timo, tráquea, esófago, estómago, pulmón y laringe/faringe.

El término "diferenciación", como se emplea en el presente documento, se refiere al proceso mediante el cual una célula menos especializada, tal como una célula madre o una célula madre pluripotente inducida, se convierte en un tipo de célula más especializada, de modo que está comprometida con un linaje específico que incluye, sin limitación, ciertas células progenitoras, así como células somáticas más especializadas. Las condiciones para la diferenciación de células madre son bien conocidas en la técnica.

"Medio de diferenciación", como se emplea en el presente documento, se refiere a un medio de crecimiento celular que comprende un aditivo o una carencia de un aditivo de manera que una célula madre, una célula pluripotente inducida u otra célula progenitora que no está completamente diferenciada, se convierten en una célula con algunas o todas las características de una célula diferenciada o una célula más diferenciada que la célula madre, la célula pluripotente inducida u otra célula progenitora de este tipo cuando se incuban en el medio.

Por "célula de endodermo definitivo" se entiende una célula que expresa uno o más marcadores del linaje de endodermo definitivo. Estos marcadores pueden incluir, entre otros, CXCR4, SOX17, GATA-4, FOXA2, AFP, CER1, C-KIT, EPCAM, SNAI1, GSC, E-Cad o N-Cad. El endodermo definitivo se define funcionalmente por células que son capaces de diferenciarse adicionalmente hacia uno o más de los tejidos que se obtienen de la capa germinal del endodermo. Esto puede incluir los pulmones, la tiroides, el hígado, el páncreas o los intestinos.

Por "célula epitelial de las vías respiratorias" se entiende una célula epitelial que forma una capa de células que recubren las vías respiratorias grandes (bronquios) y las vías respiratorias pequeñas (bronquiolos). Las células epiteliales de las vías respiratorias incluyen tipos de células ciliadas, secretoras, basales y columnares.

Por "célula madre pluripotente inducida" o "célula iPS" se entiende un tipo de célula madre pluripotente obtenida artificialmente (utilizando métodos genéticos o químicos) de una célula no pluripotente - típicamente una célula somática adulta - induciendo la expresión de genes específicos. La célula madre pluripotente inducida es sustancialmente similar a las células madre pluripotentes naturales. La célula madre pluripotente inducida es capaz de diferenciarse en múltiples tipos de células que incluyen, pero no se limitan a, células del endodermo definitivo, células del endodermo anterior de la parte anterior del tubo digestivo y células epiteliales de las vías respiratorias. El término "organoide" se refiere a una agregación tridimensional de uno o más tipos de células que imita la apariencia superficial o la estructura o función reales de un tejido u órgano.

Los términos "inducción" o "inducir", están relacionados con el proceso o acto de hacer que se produzca un efecto específico sobre el fenotipo de la célula. Tal efecto puede estar en una forma que provoque un cambio en el fenotipo, p. ej., diferenciación hacia otro fenotipo celular, o puede estar en una forma que mantenga la célula en una célula particular, p. ej., evitando la des-diferenciación o promoviendo la supervivencia de una célula.

El término "pluripotente", como se emplea en el presente documento, se refiere a una célula indiferenciada que mantiene la capacidad de permitir la diferenciación en varios tipos de células.

Los términos "célula precursora", "célula progenitora" y "célula madre" se utilizan indistintamente en la técnica y, como se emplean en el presente documento, se refieren a una célula progenitora pluripotente o de linaje no comprometido, que es potencialmente susceptible de un número ilimitado de divisiones mitóticas para renovarse a sí misma o para producir células progenitoras que se diferenciarán en el tipo de célula deseado. A diferencia de las células madre pluripotentes, las células progenitoras de linaje comprometido generalmente se consideran incapaces de dar lugar a numerosos tipos de células que difieren fenotípicamente entre sí. En cambio, las células progenitoras dan lugar a uno o posiblemente dos tipos de células de linaje comprometido. En una realización, la célula madre es una célula madre pluripotente inducida (iPS).

Por "trastorno respiratorio" se entiende una enfermedad o afección que se manifiestan físicamente en el tracto respiratorio incluyendo, pero sin limitarse a, fibrosis quística, síndrome de dificultad respiratoria, síndrome de dificultad respiratoria aguda, tuberculosis pulmonar, tos, asma bronquial, tos basada en un aumento de hiperreactividad de las vías respiratorias (bronquitis, síndrome gripal, asma, enfermedad pulmonar obstructiva y similares), síndrome gripal, antitusivo, hiperreactividad de las vías respiratorias, enfermedad tuberculosa, asma (infiltración de células inflamatorias de las vías respiratorias, aumento de la hiperreactividad de las vías respiratorias, broncoconstricción, hipersecreción de moco y similares), enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfisema, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, tos, obstrucción reversible de las vías respiratorias, síndrome de enfermedad respiratoria del adulto, enfermedad del colombófilo, pulmón de granjero, displasia broncopulmonar, trastorno de las vías respiratorias, enfisema, aspergilosis broncopulmonar alérgica, bronquitis alérgica, bronquiectasia, asma ocupacional, síndrome de enfermedad reactiva de las vías respiratorias, enfermedad pulmonar intersticial, enfermedad pulmonar parasitaria y similares.

En esta divulgación, "comprende", "que comprende", "que contiene" y "que tiene" y similares pueden tener el significado que se les atribuye en la ley de Patentes de Estados Unidos y pueden significar "incluye", "que incluye" y similares; "que consiste esencialmente en" o "consiste esencialmente" también tienen el significado atribuido en la ley de Patentes de Estados Unidos y el término es abierto, lo que permite la presencia de más de lo que se menciona siempre que las características básicas o novedosas de lo que se menciona no cambien por la presencia de más de lo que se menciona, pero excluye las realizaciones de la técnica anterior.

Por "cantidad eficaz" se entiende la cantidad necesaria para reducir o mejorar al menos un síntoma o cambio en un marcador clínico de un trastorno, afección o enfermedad respiratoria con relación a un paciente no tratado. La cantidad eficaz de células epiteliales de las vías respiratorias utilizadas para el tratamiento terapéutico del trastorno, afección o enfermedad respiratoria varía dependiendo de la forma del trastorno, afección o enfermedad específica, extensión del trastorno, afección o enfermedad y la administración de las células, así como la edad, el peso corporal y la salud general del sujeto.

"Capacidad de expansión" se emplea en el presente documento para referirse a la capacidad de una célula para proliferar, por ejemplo, para aumentar su número o, en el caso de una población de células, para experimentar duplicaciones de población.

El término "expresión" como se emplea en el presente documento se define como la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótidos particular dirigida por su promotor.

Los términos "aislado", "purificado" o "biológicamente puro" se refieren a material que está libre en diversos grados de los componentes que normalmente lo acompañan cuando se encuentra en su estado nativo. "Aislar" denota un grado de separación de la fuente o los alrededores originales. "Purificar" denota un grado de separación que es mayor que el aislamiento. Una proteína "purificada" o "biológicamente pura" está suficientemente libre de otros materiales de manera que las impurezas no afecten materialmente a las propiedades biológicas de la proteína ni provoquen otras consecuencias adversas. Es decir, una célula se purifica si está sustancialmente libre de células o materiales. La pureza y la homogeneidad se determinan típicamente utilizando técnicas analíticas, por ejemplo, citometría de flujo o clasificación de células activada por flujo. El término "purificado" puede indicar que una célula da lugar esencialmente a una población.

Como se emplea en el presente documento, "fenotipo" se refiere a la composición física, bioquímica y fisiológica completa de una célula, p. ej., que tiene cualquier rasgo o grupo de rasgos.

"Proliferación" se emplea en el presente documento para referirse a la reproducción o multiplicación de formas similares, especialmente de células. Es decir, la proliferación abarca la producción de un mayor número de células y se puede medir, entre otras cosas, simplemente contando el número de células, midiendo la incorporación de 3H-timidina a la célula y similares.

Como se emplea en el presente documento, "muestra" o "muestra biológica" se refieren a todo lo que pueda contener las células de interés (p. ej., cánceres o células tumorales de los mismos) para las cuales se desea el método de escrutinio o tratamiento. La muestra puede ser una muestra biológica, tal como un fluido biológico o un tejido biológico. En una realización, una muestra biológica es una muestra de tejido que incluye células endoteliales arteriales pulmonares. Tal muestra puede incluir diversas células, proteínas y material genético. Los ejemplos de tejidos biológicos también incluyen órganos, tumores, ganglios linfáticos, arterias y células individuales. Los ejemplos de fluidos biológicos incluyen orina, sangre, plasma, suero, saliva, semen, heces, esputo, líquido cefalorraquídeo, lágrimas, moco, líquido amniótico o similares.

Un "sujeto" o "paciente", como se emplea en el presente documento, puede ser un mamífero humano o no humano. Los mamíferos no humanos incluyen, por ejemplo, ganado y animales domésticos, tales como mamíferos ovinos, bovinos, porcinos, caninos, felinos y murinos. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano.

Como se emplean en el presente documento, los términos "tratar", "tratando", "tratamiento", y similares se refieren a la reducción o mejora de un trastorno, afección o enfermedad respiratoria y/o uno o más síntomas asociados con los mismos. Se apreciará que, aunque no se excluye, el tratamiento de un trastorno, afección o enfermedad respiratoria no requiere que el trastorno, afección, enfermedad o síntomas asociados con los mismos mejoren o se eliminen por completo.

Se entiende que los intervalos proporcionados en el presente documento son una forma abreviada de todos los valores dentro del intervalo. Por ejemplo, se entiende que un intervalo de 1 a 50 incluye cualquier número, combinación de números o subintervalo del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50.

La enumeración de una realización para una variable o aspecto en el presente documento incluye esa realización como una realización única o combinada con cualquier otra realización o porciones de la misma.

Cualquier composición o método proporcionado en el presente documento se puede combinar con una o más de cualquiera de las otras composiciones y métodos proporcionados en el presente documento.

Células epiteliales de las vías respiratorias

El desarrollo de fuentes alternativas de pulmón donante cambiaría el paradigma de tratamiento de las enfermedades pulmonares. Una opción para tratar la enfermedad pulmonar en fase terminal es el trasplante con pulmones diseñados mediante ingeniería de tejidos a partir de células específicas del paciente. El descubrimiento de las células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de las células iPS no solo facilita el estudio de la patología pulmonar básica, sino que también facilita el desarrollo de nuevas terapias para el tratamiento de la enfermedad pulmonar, incluida la FQ. Las células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de una célula iPS como se describe en el presente documento ofrecen una oportunidad única para una aplicación terapéutica basada en células y un reemplazo potencial de epitelios pulmonares enfermos.

En un aspecto, en la presente divulgación se incluye una célula epitelial de las vías respiratorias obtenida a partir de una célula madre pluripotente inducida (iPS). La célula epitelial de las vías respiratorias se caracteriza por la expresión de marcadores de superficie de las células de las vías respiratorias, tales como la proteína secretora de células de Clara (CCSP), citoqueratina 5 (KRT5) y FOXJ1. La célula epitelial de las vías respiratorias también tiene la capacidad de proliferar en cultivo sin pérdida de los marcadores de la superficie de las células de las vías respiratorias. Las células epiteliales de las vías respiratorias incluyen tipos de células ciliadas, secretoras, basales y columnares. En una realización, la célula epitelial de las vías respiratorias es ciliada.

Las células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de una célula iPS también expresan una serie de marcadores de superficie celular específicos de las vías respiratorias. Los ejemplos de marcadores de la superficie de las células de las vías respiratorias incluyen, pero no se limitan a, Mucina1 o MUC1, Mucina5AC, FOXJ1, CCSP, KRT5, KRT14, TRP63, SOX17, SOX2, p-Tubulina IV y CFTR.

La Mucina1 o MUC1 es un miembro de la familia de las mucinas y es una fosfoproteína glicosilada unida a la membrana. La proteína está anclada a la superficie apical de muchos epitelios mediante un dominio transmembrana. Las secuencias de Mucina1 ilustrativas incluyen la secuencia de MUC1 humana encontrada en GenBank Núm. de Acceso NM_001018016 o NP_001018016, o un fragmento de la misma, y la secuencia de Muc1 de ratón encontrada en NM_013605 o NP_038633, o un fragmento de la misma.

La Mucina5AC es una glicoproteína que se encuentra en el epitelio del tracto respiratorio y gástrico. Una secuencia de Mucina5AC ilustrativa incluye la secuencia de MUC5AC humana que se encuentra en GenBank Núm. de Acceso de XM_003403450 o P98088, o un fragmento de la misma.

La caja 1 de la cabeza de tenedor "Forkhead box J1" (FOXJ1) es un factor de transcripción involucrado en la ciliogénesis. Las secuencias de FOXJ1 ilustrativas incluyen la secuencia de FOXJ1 humana encontrada en GenBank Núm. de Acceso NM_001454 o NP_001445, o un fragmento de la misma, y la secuencia de FoxJ1 de ratón encontrada en NM_008240 o NP_032266, o un fragmento de la misma.

La proteína secretora de células de Clara (CCSP) es un agente inmunomodulador y anti-inflamatorio. Las secuencias de CCSP ilustrativas incluyen la secuencia de CCSP humana encontrada en GenBank Núm. de Acceso NM_003357 o NP_003348, o un fragmento de la misma, y la secuencia de CCSP de ratón encontrada en NM_011681 o NP_035811, o un fragmento de la misma.

La queratina 5 (KRT5) pertenece a un grupo de proteínas fibrosas resistentes que forman el marco estructural de los queratinocitos. Las secuencias de KRT5 ilustrativas incluyen la secuencia de KRT5 humana encontrada en GenBank Núm. de Acceso NM_000424 o NP_000415, o un fragmento de la misma, y la secuencia de KRT5 de ratón encontrada en NM_027011 o NP_081287, o un fragmento de la misma.

La queratina 14 (KRT14) es un miembro de la familia.de proteínas de filamentos intermedios de la queratina tipo I. Las secuencias de KRT14 ilustrativas incluyen la secuencia de KRT14 humana encontrada en GenBank Núm. de Acceso NM_000526 o NP_000517, o un fragmento de la misma, y la secuencia de KRT14 de ratón encontrada en NM_016958 o NP_058654, o un fragmento de la misma.

La proteína 63 relacionada con la transformación (TRP63 o P63) es un miembro de la familia p53 de factores de transcripción involucrados en las respuestas celulares al estrés y el desarrollo. Las secuencias de TRP63 ilustrativas incluyen la secuencia de TRP63 humana encontrada en GenBank Núm. de Acceso NM_001114978 o NP_001108450, o un fragmento de la misma, y la secuencia de TRP63 de ratón encontrada en NM_001127259 o NP_001120731, o un fragmento de la misma.

La región determinante del sexo del cromosoma Y - caja 17 (SOX17) es un regulador de la transcripción que se une al ADN del promotor diana y desempeña un papel clave en la regulación del desarrollo embrionario. Una secuencia de SOX17 ilustrativa incluye la secuencia de SOX17 humana que se encuentra en GenBank Núm. de Acceso NM_022454 o NP_071899, o un fragmento de la misma.

La región determinante del sexo del cromosoma Y - caja 2 (SOX2) es un factor de transcripción que es esencial para mantener la autorrenovación, o pluripotencia, de las células madre embrionarias indiferenciadas. Las secuencias de CFTR ilustrativas incluyen la secuencia de CFTR humano que se encuentra en GenBank Núm. de Acceso NM_003106 o NP_003097, o un fragmento de la misma, y la secuencia de CFTR de ratón que se encuentra en NM_011443 o NP_035573, o un fragmento de la misma.

La p-tubulina IV es uno de varios miembros de una pequeña familia de proteínas globulares. La p-tubulina IV está presente en tipos de células ciliadas y puede ser necesaria para estructuras del axonema en mamíferos.

Como se describe en otra parte del presente documento, CFTR es una proteína involucrada en el transporte de iones cloruro a través de las membranas celulares. Las secuencias de CFTR ilustrativas incluyen la secuencia de CFTR humano que se encuentra en GenBank Núm. de Acceso NM_000492 o NP_000483, o un fragmento de la misma, y la secuencia de CFTR de ratón que se encuentra en NM_021050 o NP_066388, o un fragmento de la misma.

En una realización, la célula epitelial de las vías respiratorias obtenida a partir de una célula iPS incluye la expresión del marcador CFTR de la superficie de las células de las vías respiratorias. En otra realización, los marcadores de la superficie de las células de las vías respiratorias incluyen p-tubulina IV, mucina-5AC y P63. Las expresiones de los marcadores de la superficie de las células de las vías respiratorias en la célula epitelial de las vías respiratorias son comparables a los niveles expresados en las células de las vías respiratorias humanas recién aisladas.

A diferencia de las células aisladas de las vías respiratorias, las células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de una célula iPS son capaces de proliferar durante varios pases sin perder marcadores asociados a las células epiteliales de las vías respiratorias, tales como CCSP, P63, FOXJ1, CFTR y MUC5AC. La capacidad de proliferación de las células se puede utilizar para generar millones de células para diferentes propósitos. La capacidad de "aumentar a escala" una población progenitora es particularmente valiosa cuando se traducen estas tecnologías para su uso en la producción de tejidos pulmonares humanos modificados mediante ingeniería de tejidos, utilizando células obtenidas a partir de células iPS autólogas. En una realización, la célula epitelial de las vías respiratorias es capaz de proliferar en cultivo durante al menos aproximadamente 30 días. En otra realización, la célula epitelial de las vías respiratorias es capaz de proliferar en cultivo durante más de aproximadamente 30 días.

Diferenciación en células epiteliales de las vías respiratorias

La divulgación proporciona adicionalmente, en un aspecto, métodos para diferenciar una célula madre pluripotente inducida (iPS) en una célula epitelial de las vías respiratorias. Los métodos incluyen cultivar la célula iPS en ausencia de suero para inducir la diferenciación en una célula de endodermo definitivo (DE), cultivar la célula DE en presencia de suero para inducir la diferenciación en una célula del endodermo anterior de la parte anterior del tubo digestivo (AFE) y cultivar la célula AFE en presencia de suero en un cóctel de citocinas y una alta concentración de ácido retinoico para inducir la diferenciación de la célula AFE en la célula epitelial de las vías respiratorias.

Células iPS

Las células iPS que se pueden utilizar con la invención se pueden obtener utilizando enfoques sustancialmente similares al enfoque descrito originalmente en 2006 (Yamanaka et al., Cell Stem Cell 1:39-49 (2007)) o modificaciones que son conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden crear células iPS modificando el método de inserción de genes en el ADN celular del anfitrión. Véanse, por ejemplo, Wernig et al., PNAS, 105:5856-5861 (2008); Jaenisch et al., Cell 132:567-582 (2008); Hanna et al., Cell 133:250-264 (2008); y Brambrink et al., Cell Stem Cell 2:151-159 (2008).

Dado que las células iPS se obtienen a partir de células somáticas que se han reprogramado a células madre pluripotentes, se pueden utilizar múltiples tipos de células para generar las células iPS. Por ejemplo, los tratamientos con células autólogas de un sujeto con un trastorno respiratorio, tal como la fibrosis quística, moderarán o evitarán el rechazo inmunológico de las células. Por lo tanto, es útil generar células iPS a partir de un sujeto que recibirá tratamiento con células diferenciadas obtenidas a partir de sus células iPS. En una realización, la célula epitelial de las vías respiratorias se obtiene de una célula enferma, tal como una célula iPS humana de fibrosis quística. En otra realización, la célula epitelial de las vías respiratorias se obtiene de una célula que es autóloga para un sujeto con un trastorno respiratorio.

El método de diferenciación de la célula iPS en la célula epitelial de las vías respiratorias incluye cultivar las células iPS para inducir la diferenciación en células DE. En una realización, las células iPS se cultivan en ausencia de suero. En otra realización, las células iPS se cultivan en presencia de un suplemento sin suero. Los ejemplos de suplementos sin suero pueden incluir, pero no se limitan a, reemplazo de suero (Sigma, St. Louis, MO), B-27 (Life Technologies, Carlsbad, CA), BIOGRO-2 (BI, Israel), KnockOut™ (Life Technologies, Carlsbad, C^a ), PluriQ (GlobalStem, Rockville, MD), Tc H® (MP, Santa Ana, cA) y otros suplementos similares.

En una realización, las células iPS se pueden cultivar en presencia de un agente, molécula o compuesto que induce la diferenciación a células del endodermo definitivo, que incluyen, pero no se limitan a, activina A, proteína nodal, un agonista de activina A, un antagonista de inhibina, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, las células se pueden cultivar con un agente, molécula o compuesto que active un receptor de activina A, tal como activina A o un agonista del receptor de activina A. En otro ejemplo, las células se pueden cultivar con un agente, molécula o compuesto que proporcione una señal de activación o estimule las células de una manera similar a la activina A, tal como la proteína nodal, dando como resultado la diferenciación de las células iPS en células de endodermo definitivo. En otro ejemplo más, las células se pueden cultivar con un agente, molécula o compuesto, tal como un antagonista de un inhibidor de activina A, p. ej., un inhibidor de inhibina, u otra molécula antagonista que puede activar indirectamente el receptor de activina A o inducir la diferenciación en una célula de endodermo definitivo. La concentración de uno o más agentes, moléculas o compuestos, tales como activina A, que inducen la diferenciación de las células iPS en células de endodermo definitivo puede estar en el intervalo de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 500 ng/ml. La concentración de uno o más agentes, moléculas o compuestos, tales como la activina A, puede ser de aproximadamente 5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 35 ng/ml, 40 ng/ml, 45 ng/ml, 50 ng/ml, 55 ng/ml, 60 ng/ml, 65 ng/ml, 70 ng/ml, 75 ng/ml, 80 ng/ml, 85 ng/ml, 90 ng/ml, 95 ng/ml, 100 ng/ml, 110 ng/ml, 120 ng/ml, 130 ng/ml, 140 ng/ml, 150 ng/ml, 175 ng/ml, 200 ng/ml, 225 ng/ml, 250 ng/ml, 275 ng/ml, 300 ng/ml, 350 ng/ml, 400 ng/ml, 450 ng/ml, 550 ng/ml o cualquier concentración intermedia . En una realización, la célula iPS se cultiva en presencia de 100 ng/ml de uno o más agentes, moléculas o compuestos, tales como activina A, para inducir la diferenciación de las células iPS a células de endodermo definitivo. La concentración del agente, molécula o compuesto, tal como activina A, para inducir la diferenciación en células de endodermo definitivo también puede ser de aproximadamente concentraciones de saturación en el cultivo de células iPS. Las concentraciones de saturación de activina A son de aproximadamente 5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 35 ng/ml, 40 ng/ml, 45 ng/ml, 50 ng/ml, 55 ng/ml, 60 ng/ml, 65 ng/ml, 70 ng/ml, 75 ng/ml, 80 ng/ml, 85 ng/ml, 90 ng/ml, 95 ng/ml, 100 ng/ml, 110 ng/ml, 120 ng/ml, 130 ng/ml, 140 ng/ml, 150 ng/ml, 175 ng/ml, 200 ng/ml, 225 ng/ml, 250 ng/ml, 275 ng/ml, 300 ng/ml, 350 ng/ml, 400 ng/ml, 450 ng/ml, 550 ng/ml o más. En otra realización, la concentración del agente, molécula o compuesto, tal como activina A, para inducir la diferenciación en células de endodermo definitivo es de aproximadamente concentraciones de saturación en el cultivo de células iPS. Las células iPS se pueden cultivar durante al menos aproximadamente 12 horas, 16 horas, 20 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 48 horas, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, o más. En una realización, las células iPS se cultivan durante aproximadamente 5 días. En una realización, las células iPS se cultivan durante aproximadamente 5 días. Las células iPS se pueden cultivar en presencia de activina A durante al menos aproximadamente 6 horas. Las células iPS se pueden cultivar durante al menos aproximadamente 12 horas, 16 horas, 20 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 48 horas, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, o más. En otra realización, las células iPS se cultivan en presencia de activina A durante al menos aproximadamente 5 días. La diferenciación de las células iPS puede ocurrir utilizando el método del cuerpo embrioide o directamente en las capas alimentadoras o Matrigel hasta la fase de endodermo definitivo.

Células de endodermo definitivo

Las células DE diferenciadas a partir de las células iPS expresan una serie de marcadores de células de endodermo definitivo. Los ejemplos de marcadores de células de endodermo definitivo incluyen, pero no se limitan a, c-kit, SOX17, FOXA2 y CXCR4.

CD117 o c-kit es una proteína que en seres humanos está codificada por el gen KIT. Las secuencias de c-kit ilustrativas incluyen la secuencia de c-kit humana encontrada en GenBank Núm. de Acceso NM_000222 o NP_000213, o un fragmento de la misma, y la secuencia de c-kit de ratón encontrada en NM_001122733 o NP_001116205, o un fragmento de la misma.

CXCR4 es un receptor de alfa-quimiocinas específico para el factor 1 derivado del estroma. Las secuencias de CXCR4 ilustrativas incluyen la secuencia de CXCR4 humana encontrada en GenBank Núm. de Acceso NM_001008540 o NM_001008540, o un fragmento de la misma, y la secuencia de CXCR4 de ratón encontrada en NM_009911 o NP_034041, o un fragmento de la misma.

En una realización, la célula DE diferenciada a partir de una célula iPS incluye la expresión de marcadores de la superficie de las células de endodermo, c-kit, SOX17, FOXA2 y CXCR4.

El método de diferenciación de la célula iPS en la célula epitelial de las vías respiratorias también incluye el cultivo de la célula DE en presencia de suero para inducir la diferenciación en una célula de endodermo anterior de la parte anterior del tubo digestivo (AFE). En una realización, las células DE se cultivan en presencia de suero. En otra realización, las células DE se cultivan en presencia de moléculas de matriz extracelular (ECM). Los ejemplos de moléculas de ECM pueden incluir, pero no se limitan a, colágenos, lamininas, fibronectinas, tenascinas, elastinas, proteoglicanos, glicosaminoglicanos, polisacáridos, celulosas, otras moléculas que se encuentran en la ECM y cualquier combinación de los mismos.

Las células DE se pueden disociar antes del cultivo en presencia de moléculas de ECM. Los medios también se pueden cambiar de medios de inducción de células DE a medios de inducción de células AFE. En una realización, las células iPS se cultivan en presencia de suero.

Las células DE se exponen secuencialmente a inhibidores de molécula pequeña para suprimir el destino del endodermo posterior e inducir el destino del endodermo proximal. Las células DE también se pueden cultivar en presencia de moléculas de ECM mientras se exponen secuencialmente las células DE a inhibidores de molécula pequeña que inhiben la señalización de BMP/TGF e inhibidores de molécula pequeña que inhiben la señalización de TGF/WNT. Los inhibidores de molécula pequeña que inhiben la señalización de BMP/TGF pueden incluir, pero no se limitan a, dorsomorfina, Noggin, A83-01, DMH-1, D4476, GW788388, LY364947, RepSox, SB431542, SB505124, SB525334, SD208 y cualquier combinación de los mismos. Los inhibidores de molécula pequeña que inhiben la señalización de TGF/WNT pueden incluir, pero no se limitan a, IWR-1, Noggin, CCT036477, IWP2, desmetoxi curcumina, FH535 A83-01, D4476, GW788388, LY364947, RepSox, SB431542, SB505124, SB5025334, SD208 y cualquier combinación de los mismos. En otra realización, la célula DE se expone secuencialmente a inhibidores de molécula pequeña para suprimir el destino del endodermo posterior e inducir el destino del endodermo proximal. En una realización particular, los inhibidores de molécula pequeña inhiben la señalización de BMP/TGF, tales como dorsomorfina, Noggin, A83-01, DMH-1, D4476, GW788388, LY364947, RepSox, SB431542, SB505124, SB525334, SD208 y cualquier combinación de los mismos. En otra realización particular, los inhibidores de molécula pequeña inhiben la señalización de TGF/WNT, tales como IWR-1, Noggin, c Ct 036477, IWP2, desmetoxi curcumina, FH535 A83-01, D4476, GW788388, LY364947, RepSox, SB431542, SB505124, SB525334, SD208, y cualquier combinación de los mismos. En otra realización, las células DE se exponen primero a inhibidores de molécula pequeña que inhiben la señalización de BMP/TGF y a continuación se exponen a inhibidores de molécula pequeña que inhiben la señalización de TGF/WNT.

Las células DE se pueden cultivar en presencia de inhibidores de molécula pequeña que inhiben la señalización de BMP/TGF durante al menos aproximadamente 6 horas. Las células DE se pueden cultivar durante al menos aproximadamente 12 horas, 16 horas, 20 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 48 horas, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días o más con los inhibidores de molécula pequeña que inhiben la señalización de BMP/TGF. En una realización, las células DE se cultivan con inhibidores de molécula pequeña que inhiben la señalización de BMP/TGF en el intervalo de aproximadamente 2 días a aproximadamente 10 días. En una realización, las células DE se cultivan con inhibidores de molécula pequeña que inhiben la señalización de BMP/TGF en el intervalo de aproximadamente 2 días a aproximadamente 7 días.

Las células DE se pueden cultivar en presencia de inhibidores de molécula pequeña que inhiben la señalización de TGF/WNT durante al menos aproximadamente 6 horas. Las células DE se pueden cultivar durante al menos aproximadamente 12 horas, 16 horas, 20 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 48 horas, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días o más con los inhibidores de molécula pequeña que inhiben la señalización de TGF/WNT. En una realización, las células DE se cultivan con inhibidores de molécula pequeña que inhiben la señalización de TGF/WNT en el intervalo de aproximadamente 2 días a aproximadamente 10 días. En una realización, las células DE se cultivan con inhibidores de molécula pequeña que inhiben la señalización de TGF/WNT en el intervalo de aproximadamente 2 días a aproximadamente 7 días.

Células del endodermo anterior de la parte anterior del tubo digestivo

Las células AFE diferenciadas a partir de las células DE expresan una serie de marcadores de células del endodermo anterior de la parte anterior del tubo digestivo. Un ejemplo de marcador de células del endodermo anterior de la parte anterior del tubo digestivo incluye, pero no se limita a, NKX2.1.

NKX2.1 es una proteína que en seres humanos está codificada por el gen NKX2-1. Las secuencias de NKX2.1 ilustrativas incluyen la secuencia de NKX2.1 humana que se encuentra en GenBank Núm. de Acceso NM_001079668 o NP_001073136, o un fragmento de la misma, y la secuencia de NKX2.1 de ratón que se encuentra en NM_001146198 o NP_001139670, o un fragmento de la misma. En una realización, la célula AFE expresa NKX2.1.

El método para diferenciar la célula iPS en la célula epitelial de las vías respiratorias también incluye cultivar la célula AFE para inducir la diferenciación de la célula AFE en la célula epitelial de las vías respiratorias. En una realización, las células AFE se cultivan en presencia de suero. En otra realización, las células AFE se cultivan en presencia de una alta concentración de ácido retinoico. En otra realización más, las células AFE se cultivan en presencia de un cóctel de citocinas. En una realización particular, el cóctel de citocinas inhibe la vía de WNT. Los ejemplos de citocinas que inhiben la ruta de WNT incluyen, pero no se limitan a, IWR-1, PD98059, BMP4, BMP7 y otros antagonistas de WNT, y cualquier combinación de los mismos.

Las células AFE se cultivan en presencia de una alta concentración de ácido retinoico para inducir la diferenciación. La alta concentración de ácido retinoico puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,1 pM a aproximadamente 2.0 pM. La alta concentración de ácido retinoico puede ser de aproximadamente 0,1 pM, 0,2 pM, 0,3 pM, 0,4 pM, 0,5 pM, 0,6 pM, 0,7 pM, 0,8 pM, 0,9, 1,0 pM, 1,1 pM, 1,2 pM, 1,3 pM, 1,4 pM, 1,5 pM, 1,6 pM, 1,7 pM, 1,8 pM, 1,9 pM, 2.0 pM y cualquier concentración intermedia.

Las células AFE se pueden cultivar en presencia de una alta concentración de ácido retinoico durante al menos aproximadamente 6 horas. Las células AFE se pueden cultivar durante al menos aproximadamente 12 horas, 16 horas, 20 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 48 horas, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días o más en una alta concentración de ácido retinoico. En otra realización, las células AFE se cultivan en una alta concentración de ácido retinoico durante al menos aproximadamente 3 días. En una realización, las células AFE se cultivan con una alta concentración de ácido retinoico en el intervalo de aproximadamente 2 días a aproximadamente 10 días. En una realización, las células AFE se cultivan con una alta concentración de ácido retinoico en el intervalo de aproximadamente 2 días a aproximadamente 7 días.

Ingeniería de tejido pulmonar

La presente divulgación también proporciona un tejido pulmonar tridimensional diseñado mediante ingeniería de tejidos y métodos para fabricar el tejido pulmonar tridimensional. En un aspecto, se describe un tejido pulmonar tridimensional diseñado mediante ingeniería de tejidos. El pulmón diseñado mediante ingeniería de tejidos incluye células epiteliales de las vías respiratorias. Las células epiteliales de las vías respiratorias expresan marcadores de superficie de las células de las vías respiratorias, tales como proteína secretora de células de Clara (CCSP), citoqueratina 5 (KRT5) y FOXJ1; y son capaces de proliferar en cultivo sin pérdida de los marcadores de células de las vías respiratorias. Por tanto, la divulgación proporciona una fuente alternativa de tejido pulmonar donante para tratar la enfermedad en fase terminal con pulmones diseñados mediante ingeniería de tejidos.

En otro aspecto, se describe un método de ingeniería de un tejido pulmonar tridimensional. El método incluye diferenciar una población de células madre pluripotentes inducidas (iPS) en células epiteliales de las vías respiratorias, en donde las células epiteliales de las vías respiratorias expresan marcadores de superficie de las células de las vías respiratorias: proteína secretora de células de Clara (CCSP), citoqueratina 5 (KRT5) y FOXJ1; y son capaces de proliferar en cultivo sin pérdida de los marcadores de células de las vías respiratorias. El método también incluye sembrar las células epiteliales de las vías respiratorias en un armazón tridimensional, tal como un armazón que comprende matrigel. La siembra de las células epiteliales de las vías respiratorias en el armazón tridimensional permite que las células epiteliales de las vías respiratorias formen una estructura organoide. Los armazones conocidos en la técnica son útiles en la invención. Los armazones pueden incluir, pero no se limitan a, tejido descelularizado y armazones sintéticos/naturales o combinaciones de armazones poliméricos sintéticos y naturales. En una realización, el armazón tridimensional comprende matrigel. El método de producción de armazones puede incluir los descritos en las Solicitudes de Estados Unidos Núm.: 2013/0013083 y 2012/0064050.

Métodos de tratamiento

Las células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de las células iPS y los tejidos pulmonares diseñados mediante ingeniería de tejidos que incluyen dichas células se utilizan in vivo para el tratamiento de sujetos. La presente divulgación incluye métodos para tratar un trastorno respiratorio en un sujeto. Como se describe en el presente documento, en un aspecto, un método incluye mejorar, tratar o aliviar un síntoma de un trastorno respiratorio en un sujeto que lo necesite. El método también incluye diferenciar una célula madre pluripotente inducida (iPS) en una célula epitelial de las vías respiratorias, en donde las células epiteliales de las vías respiratorias expresan marcadores de superficie de las células de las vías respiratorias, proteína secretora de células de Clara (CCSP), citoqueratina 5 (KRT5) y FOXJ1, y son capaces de proliferar en cultivo sin pérdida de los marcadores de células de las vías respiratorias y administrar las células epiteliales de las vías respiratorias en una cantidad eficaz para tratar el trastorno respiratorio en el sujeto.

Los métodos para tratar sujetos pueden incluir adicionalmente la administración de las células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de las células iPS o la implantación de un tejido modificado que incluye células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de las células iPS, en donde la administración o implantación da como resultado una mejora, tratamiento o alivio de un síntoma de un trastorno respiratorio en el sujeto. La mejora, el tratamiento o el alivio pueden ser cualquier cambio en el trastorno respiratorio o un síntoma del trastorno respiratorio que se puede detectar utilizando los sentidos naturales o dispositivos artificiales.

Los trastornos respiratorios que se pueden tratar utilizando los métodos de la presente invención son enfermedades o afecciones que se manifiestan físicamente en el tracto respiratorio, que incluyen, entre otras, fibrosis quística, síndrome de dificultad respiratoria, síndrome de dificultad respiratoria aguda, tuberculosis pulmonar, tos, asma bronquial, tos basada en un aumento de la hiperreactividad de las vías respiratorias (bronquitis, síndrome gripal, asma, enfermedad pulmonar obstructiva y similares), síndrome gripal, antitusivo, hiperreactividad de las vías respiratorias, enfermedad tuberculosa, asma (infiltración de células inflamatorias de las vías respiratorias, aumento de la hiperreactividad de las vías respiratorias, broncoconstricción, hipersecreción de moco y similares), enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfisema, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, tos, obstrucción reversible de las vías respiratorias, síndrome de enfermedad respiratoria del adulto, enfermedad del colombófilo, pulmón de granjero, displasia broncopulmonar, trastorno de las vías respiratorias, enfisema, aspergilosis broncopulmonar alérgica, bronquitis alérgica, bronquiectasia, asma ocupacional, síndrome de enfermedad reactiva de las vías respiratorias, enfermedad pulmonar intersticial, enfermedad pulmonar parasitaria y similares. En una realización, el trastorno respiratorio es fibrosis quística.

Ventajosamente, las composiciones y métodos descritos en el presente documento representan una mejora con respecto a los métodos de la técnica anterior. Preferiblemente, las composiciones para su uso en el tratamiento de un trastorno respiratorio incluyen células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de células iPS, como se describe en otra parte del presente documento.

La divulgación también abarca el uso de una formulación farmacéutica para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento. Tal formulación farmacéutica se puede proporcionar en una forma adecuada para la administración a un sujeto y puede comprender uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, uno o más ingredientes adicionales o alguna combinación de estos.

Las formulaciones farmacéuticas que son útiles en los métodos divulgados en el presente documento se pueden desarrollar adecuadamente para una vía de administración por inhalación, oral, parenteral, pulmonar, intranasal, intravenosa u otra. Otras formulaciones contempladas incluyen nanopartículas proyectadas, preparaciones liposomales y formulaciones de base inmunológica. Las) vías de administración serán fácilmente evidentes para el experto en la técnica y dependerán de cualquiera de una serie de factores, incluyendo el tipo y la gravedad de la enfermedad que se está tratando, el tipo y la edad del paciente veterinario o humano que se está tratando, y similares.

Las formulaciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden preparar mediante cualquier método conocido o desarrollado en el futuro en la técnica de la farmacología. En general, tales métodos preparatorios incluyen la etapa de asociar las células con un portador o uno o más de otros ingredientes accesorios, y después, si es necesario o deseable, dar forma o envasar el producto en una unidad de dosis única o múltiple deseada.

En una realización, las células divulgadas en el presente documento se formulan utilizando uno o más excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables. En una realización, las formulaciones farmacéuticas de las células divulgadas en el presente documento incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz de las células divulgadas en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables, que son útiles, incluyen, pero no se limitan a, glicerol, agua, solución salina, etanol y otras soluciones salinas farmacéuticamente aceptables tales como fosfatos y sales de ácidos orgánicos. Los ejemplos de estos y otros portadores farmacéuticamente aceptables se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (1991, Mack Publication Co., Nueva Jersey).

Administración/dosificación

En el ámbito clínico, los sistemas de suministro de células se pueden introducir en un paciente mediante cualquiera de varios métodos, cada uno de los cuales es familiar en la técnica. Por ejemplo, una formulación farmacéutica de las células se puede administrar por inhalación o sistémicamente, p. ej. por inyección intravenosa.

En una implementación ilustrativa, la formulación farmacéutica de las células se puede administrar directamente mediante inyección en un tejido pulmonar. En el documento U.S. Núm. de Serie 10/914.829 se describe un protocolo de inyección directa.

El régimen de administración puede afectar a lo que constituye una cantidad eficaz. Las formulaciones terapéuticas se pueden administrar al paciente antes o después de la manifestación de los síntomas asociados con la enfermedad o afección. Adicionalmente, se pueden administrar varias dosificaciones divididas, así como dosificaciones escalonadas, diaria o secuencialmente, o la dosis se puede infundir continuamente o puede ser una inyección en embolada. Adicionalmente, las dosificaciones de las formulaciones terapéuticas se pueden aumentar o disminuir proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica o profiláctica.

La administración de las células descritas en el presente documento a un sujeto, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano, puede llevarse a cabo utilizando procedimientos conocidos, a dosificaciones y durante períodos de tiempo eficaces para tratar una enfermedad o afección en el paciente. La cantidad eficaz de células necesaria para lograr un efecto terapéutico puede variar según factores tales como el grado de implantación de las células administradas; el momento de la administración; la duración de la administración; otros fármacos, compuestos o materiales utilizados combinados con las células; el estado de la enfermedad o trastorno; la edad, sexo, peso, condición, salud general e historial médico previo del sujeto que está siendo tratado; y factores similares bien conocidos en la técnica médica. Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, se pueden administrar varias dosis divididas diariamente o se puede reducir proporcionalmente la dosis según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Un experto en la técnica sería capaz de estudiar los factores relevantes y realizar la determinación con respecto a la cantidad eficaz de células sin experimentación indebida.

Los niveles de dosificación reales de las células en las formulaciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento se pueden variar para obtener una cantidad de células que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un sujeto, composición y modo de administración en particular, sin que sea tóxica para el paciente.

Vías de administración

Las vías de administración de las células divulgadas en el presente documento incluyen administración inhalación, oral, nasal, rectal, parenteral, sublingual, transdérmica, transmucosa (p. ej., sublingual, lingual, (trans)bucal, (trans)uretral, vaginal (p. ej., trans- y perivaginal), (intra)nasal y (trans)rectal), intravesical, intrapulmonar, intraduodenal, intragástrica, intratecal, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraarterial, intravenosa, intrabronquial, por inhalación y tópica.

La formulación adecuada de las células y las dosificaciones incluyen, por ejemplo, dispersiones, suspensiones, soluciones, cuentas, gránulos, magmas, cremas, pastas, emplastos, lociones, discos, supositorios, pulverizaciones líquidas para administración nasal u oral, formulaciones en aerosol para inhalación, composiciones y formulaciones para administración intravesical y similares.

Se debe entender que las formulaciones y composiciones que serían útiles en la presente divulgación no se limitan a las formulaciones particulares expuestas en los ejemplos. Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo fabricar y utilizar las células, los métodos de diferenciación, los tejidos diseñados por ingeniería de tejidos y los métodos terapéuticos de la divulgación.

La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, mecanismos convencionales de biología molecular (incluidos mecanismos recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro del alcance del experto en la técnica. Tales mecanismos se explican completamente en la bibliografía, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", cuarta edición (Sambrook, 2012); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Culture of Animal Cells" (Freshney, 2010); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1997); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller y Calos, 1987); "Short Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 2002); "Polymerase Chain Reaction: Principles, Applications and Troubleshooting", (Babar, 2011); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 2002). Estos mecanismos son aplicables a la producción de los polinucleótidos y polipéptidos divulgados en el presente documento y, como tales, se pueden considerar al realizar y poner en práctica la invención. Los mecanismos particularmente útiles para realizaciones particulares se discutirán en las secciones que siguen.

Ejemplos

La invención se describe adicionalmente en detalle con referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no se pretende que sean limitantes a menos que se especifique lo contrario. Por tanto, la invención no se debe interpretar de ninguna manera como limitada a los siguientes ejemplos, sino que se debe interpretar que abarca todas y cada una de las variaciones que se hacen evidentes como resultado de la enseñanza proporcionada en el presente documento.

Sin descripción adicional, se cree que un experto en la técnica puede, utilizando la descripción anterior y los siguientes ejemplos ilustrativos, elaborar y utilizar los compuestos de la presente invención y poner en práctica los métodos reivindicados. Por lo tanto, los siguientes ejemplos de trabajo señalan específicamente realizaciones de la presente invención y no se deben interpretar como limitantes de ninguna manera.

Los materiales y Métodos utilizados en la realización de los experimentos divulgados en el presente documento se describen a continuación.

Cultivo de células iPS humanas

Las líneas de células iPS humanas, células iPS reprogramadas utilizando lentivirales (clon C2) utilizadas en el estudio actual fueron proporcionadas por el Prof. James A. Thomson, Departamento de Anatomía, Universidad de Wisconsin-Madison, Madison, WI. El clon C2 se generó mediante transducción lentiviral de fibroblastos de piel humana aislados con el gen OCT-4, SOX2, Nanog y lin28. Las células CF-iPS fueron proporcionadas por el profesor Darrell N Kotton y generadas a partir de fibroblastos dérmicos aislados de una muestra de piel de un paciente con fibrosis quística. Las células CF-iPS se generaron sin transgenes mediante un único vector lentiviral. Estas células madre humanas pluripotentes inducidas ya se caracterizaron en el laboratorio de Thomson y Kotton. Tienen cariotipos normales, expresan actividad de telomerasa, expresan marcadores de la superficie de las células y genes que caracterizan a las células madre embrionarias humanas y mantienen el potencial de desarrollo para diferenciarse en derivados avanzados de las tres capas germinales primarias. Estas dos líneas de células iPS mostraron una morfología indistinguible de las hESC tales como H9 y se pueden mantener indefinidamente en alimentadores de fibroblastos embrionarios de ratón o Matrigel. Ambas células iPS humanas se cultivaron y mantuvieron como se describió previamente por el laboratorio Thomson. Brevemente, las células iPS se propagaron en capas alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) irradiadas en medio DMEM-F12 y 20% de reemplazo de suero KnockOut con un suplemento de 4 ng/ml de bFGF, glutamina 1 mM, aminoácidos no esenciales 1% mM y B-mercaptoetanol 0,1 mM a 37°C, 5% de CO2 y 90-95% de humedad, con cambio de medio todos los días. Se hicieron pasar células iPS indiferenciadas cada 4-5 días a alimentadores de nueva aportación mediante disociación mecánica utilizando Stem Cell Cutting Tool (VWR).

Diferenciación in vitro de células iPS en células epiteliales de las vías respiratorias

Las células iPS se diferenciaron primero hacia el endodermo definitivo (DE). Las células DE se iniciaron en las condiciones descritas anteriormente. Brevemente, se cultivaron células iPS en medio RPMI 1640 con un suplemento de 100 ng/ml de activina A, L-glutamina 2 mM y antibiótico-antimicótico al 1% durante 48 horas. A continuación, se añadieron suplemento 1xB27 y butirato de sodio 0,5 mM al mismo medio y se cultivaron las células iPS en este medio durante 3 días con cambios diarios de medio.

Posteriormente, las células DE se trataron con tripsina y se sembraron en placas recubiertas con proteína ECM humana y se diferenciaron a endodermo anterior de la parte anterior del tubo digestivo (AFE) exponiéndolas secuencialmente entre los días d5 a d7 a combinaciones de inhibidores de molécula pequeña en IMDM con FBS al 10%, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales1 mM, antibiótico-antimicótico al 1%. Véase la Figura 1.

A continuación, las células AFE se mantuvieron en medio de diferenciación de endodermo pulmonar que consistía en IMDM con FBS al 20%, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 1 mM, antibiótico-antimicótico al 1%, ácido retinoico (0,5 j M), bFGF (10 ng/ml), BMP4 (10 ng/ml), Wnt3a (100 ng/ml) y KGF (10 ng/ml cada uno) durante 5 días. La combinación de factores de crecimiento se cambió a BMP7 (10 ng/ml), KGF (10 ng/ml), alta concentración de ácido retinoico (1 j M), B27 con un suplemento de AR, IWR-1 (100 nM), (antagonista de WNT) PD98059 (1 j M) (antagonista de mAp K) durante 3 días.

A partir del día 16, las células se diferenciaron adicionalmente a las células epiteliales de las vías respiratorias en el mismo medio basal con un suplemento de IWR-1 (50 nM), alta concentración de AR (1 j M), BMP7 (10 ng/ml), KGF (10 ng/ml), EGF (10 ng/ml), dexametasona (50 nM), butirilAMPc (0,1 mM) e isobutilmetilxantina (0,1 mM) durante 12 días. Como alternativa, las células DE se diferenciaron directamente, sin dividir, utilizando el mismo medio mencionado anteriormente. El día 28, las células se dividieron con tripsina y se volvieron a sembrar sobre placas recubiertas de colágeno I/III en Medio de Crecimiento de Células Epiteliales Bronquiales BEGM™, de Lonza hasta su uso.

RT-PCR cuantitativa en tiempo real

El ARN total se extrajo de las células iPS y las células del epitelio de las vías respiratorias obtenidas a partir de las células iPS utilizando el RNeasy Mini Kit de Qiagene siguiendo las instrucciones del fabricante. Se sintetizó ADN complementario de primera hebra (ADNc) con hexámeros aleatorios como cebadores, utilizando el Sistema de Síntesis de Primera Hebra SuperScript de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen). Se utilizó una mezcla de volumen igual de los productos como moldes para la amplificación por PCR. Las reacciones se realizaron en un volumen de 25 j l con iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) y cada uno de los cebadores directos e inversos 200 nM que se muestran utilizando el soporte lógico iCyler e iQ (Bio-Rad). Cada muestra se analizó por triplicado. Las condiciones de la PCR incluyeron una etapa de desnaturalización inicial de 4 min a 95°C, seguido de 40 ciclos de PCR que consistían en 15 s a 95°C, 30 s a 60°C y 30 s a 72°C. Los valores de ciclo de umbral (Ct) promedio de las reacciones de PCR por triplicado para un gen de interés (GOI) se normalizaron frente a los valores de Ct promedio para GAPDH de la misma muestra de ADNc. La multiplicidad de cambio de los niveles de transcrito del GOI entre la muestra A y la muestra B son iguales a 2-ññCt, donde ACt = Ct(Goi) - Ct(GAPDH) y AACt = ACt(A) - ACt(B).

Análisis de citometría de flujo e inmunoquímica

Antes de la diferenciación y durante la inducción de DE y AFE y la diferenciación hacia el epitelio de las vías respiratorias, las células se analizaron mediante inmunoquímica y/o citometría de flujo en diferentes momentos. Las células iPS y las células diferenciadas se fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS durante 20 min, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% en PBS durante 15 min a temperatura ambiente (TA), se bloquearon en BSA al 3% en PBS durante 60 min a TA, y después se incubaron en anticuerpo primario durante la noche a 4°C, anticuerpo secundario durante 2 h a TA.

Para la citometría de flujo, las células se fijaron con la solución de fijación del kit de Fijación/Permeabilización (BD Biosciences) y se tiñeron con anticuerpos primarios y de detección como describe el fabricante. Brevemente, las células se disociaron en suspensiones unicelulares mediante incubación con tripsina al 0,25% durante 2 min. Las células disociadas se resuspendieron (0,5 x 106 células) en 250 pl de solución de fijación/permeabilización, se mantuvo sobre hielo durante 20 min y se lavaron dos veces con tampón Perm/Wash. Después de bloquear con solución de bloqueo durante 30 min sobre hielo, las células se incubaron con el anticuerpo primario correspondiente en la solución de bloqueo durante 30 min sobre hielo. Las células se resuspendieron en 350 pl de tampón Perm/Wash después de la incubación con el secundario conjugado correspondiente durante 30 min sobre hielo, se lavaron dos veces y se analizaron por citometría de flujo.

Análisis estadísticos

Todos los análisis estadísticos se realizaron con el soporte lógico Origin (OriginLab, Northampton, MA). Los datos se expresaron como media ± e.t.m. (error típico de medición). Se realizaron pruebas T para evaluar si dos grupos eran significativamente diferentes entre sí. Los valores de p inferiores a 0,05 (de dos colas) se consideraron estadísticamente significativos. Todas las barras de error representan ± ETM.

Formación de organoide

Las células progenitoras de las vías respiratorias del día 15 se cultivaron en Matrigel en condición de fase airelíquido en células epiteliales de las vías respiratorias diferenciadas en medio IMDM con un suplemento de AR a alta concentración (1 pM), BMP7 (10 ng/ml), kGf (10 ng/ml), EGF (10 ng/ml), dexametasona (50 nM), butirilAMPc (0,1 mM) e isobutilmetilxantina (0,1 mM) durante 30 días. Las células se fijaron con la solución de fijación del kit de Fijación/Permeabilización (BD Biosciences) y se tiñeron con anticuerpos primarios para células epiteliales de las vías respiratorias, P63 y NKX2.1 y anticuerpos de detección como describe el fabricante.

Los resultados de los experimentos divulgados en el presente documento se describen a continuación.

El pulmón tiene una estructura tridimensional compleja que presenta grandes diferencias en la composición del epitelio a lo largo de su eje proximo-distal. El epitelio luminal (tráquea y bronquios primarios) está compuesto en gran parte por células ciliadas, neuroendocrinas (N^e ) y células de tipo Clara. Estas últimos producen secretoglobinas, CCSP. En las vías respiratorias más distales (pequeños bronquios y bronquiolos), las células de Clara predominan sobre las ciliadas y hay más células NE que en la tráquea. La región más distal del pulmón está organizada en un complejo sistema de alvéolos que se compone de dos tipos de células epiteliales primarias: células epiteliales de tipo I (ATI) y de tipo II (ATII). Las ATI cubren la mayor parte de los alvéolos del pulmón (que abarcan hasta 95% de la superficie alveolar) y son las principales responsables del intercambio de gases, mientras que las células ATII secretan tensioactivos alveolares y tienen una forma fundamentalmente cuboidea. Se ha descrito previamente un método de diferenciación por etapas para generar endodermo definitivo (DE), endodermo anterior de la parte anterior del tubo digestivo (AFE) y, posteriormente, una población relativamente homogénea de células alveolares humanas tipo II a partir de células iPS humanas (Ghaedi, et al., JCI 2012). En el trabajo descrito en el presente documento, se emplea un enfoque de diferenciación escalonada que imita el tiempo y la coordinación de las vías de señalización que guían el desarrollo epitelial de las vías respiratorias. Utilizando una estrategia única, se generaron células epiteliales funcionales de las vías respiratorias a partir de células madre pluripotentes humanas con alta eficacia.

Inducción de células iPS humanas a células de endodermo anterior de la parte anterior del tubo digestivo y de endodermo pulmonar. El sistema respiratorio embrionario, distal a la tráquea, se origina a partir de yemas pulmonares en la cara ventral anterior del endodermo definitivo (DE) el día embrionario 9.5 en el ratón o en la semana 4 en seres humanos, y se diferencia en muchos tipos de células epiteliales especializadas.

Las células iPS humanas se diferenciaron en células DE utilizando condiciones sin suero (Figura 1). Al exponer las células iPS a concentraciones de saturación de activina A, se generaron más de 85% de células endodérmicas. El análisis de citometría de flujo mostró que la población celular obtenida a partir de células iPS el día 5 expresaba un alto porcentaje de marcadores asociados con esta capa germinal. Ochenta y nueve por ciento de las células fueron positivas para c-kit (Figura 2A), 91% positivas para SOX17 (Figura 2C), 93% positivas para FOXA2 (Figura 2B) y 88% de las células expresaron el marcador de superficie de endodermo CXCR4 (Figura 2D) en el clon C1.

Aunque se ha supuesto que las células de endodermo definitivo obtenidas de esta manera son ampliamente multipotentes, varios estudios han demostrado que los linajes endodérmicos más anteriores de la parte anterior del tubo digestivo, tales como el timo, la tiroides y el epitelio pulmonar, han sido difíciles de obtener a partir de estos progenitores. La diferenciación dirigida al epitelio alveolar se debe realizar mediante la generación del endodermo definitivo (DE), seguida de la creación de patrones en el endodermo anterior de la parte anterior del tubo digestivo (AFE).

Por lo tanto, en la segunda etapa, las células DE se diferenciaron adicionalmente a AFE. Las células DE se disociaron, se volvieron a sembrar en placas recubiertas con ECM humana y se cultivaron en medio de diferenciación de AFE durante 2 días. La elección de las proteínas de la ECM se basó en un estudio anterior que mostró que las células DE cultivadas en superficies de proteínas de la ECM humana que contienen una mezcla de matriz proteica extracelular (colágenos, laminina, fibronectina, tenascina, elastina y una serie de proteoglicanos y glicosaminoglicanos), se anclaron más rápido y dieron como resultado un mayor número de NKX2.1 en comparación con las células DE cultivadas en otras proteínas de la ECM.

Los experimentos con ES e iPS de ratón y humanas han demostrado claramente que se requiere la inhibición dual de la señalización de activina A/nodal y TGF-p/BMP en el endodermo definitivo obtenido a partir de células iPS para generar cuantitativamente el endodermo anterior de la parte anterior del tubo digestivo. En un intento anterior, la aplicación de Noggin (inhibidor de la señalización de BMP) y SB 141524 (inhibidor de la señalización de TGF-p) durante 2 días a las células DE suprimió un destino de endodermo posterior (CDX2+) a favor de un destino de endodermo anterior (SOX2+) y produjo una población enriquecida de células con una fuerte expresión de marcadores asociados con el fenotipo AFE.

Para aumentar el número de células progenitoras NKX2.1+FOXA2+, se realizaron modificaciones de los enfoques anteriores para producir AFE a partir de células DE. Sneock y sus colaboradores han demostrado que la inhibición secuencial de BMP/TGF seguida de la inhibición de la vía de señalización de TGF y Wnt proporciona una mejor diferenciación de AFE a partir de las células DE (Huang SX, et al., Nat Biotechnol., 1 de diciembre de 2013 doi: 10.1038/nbt.2754). Para promover la identidad de AFE, las células DE se expusieron a continuación secuencialmente entre los días 6 y 8 a diferentes combinaciones de agonistas y antagonistas de BMP4/TGFp y Wnt como se enumera en la Tabla 1. Se examinó la capacidad para aumentar el número de células progenitoras NKX2.1+, FOXA2+ SOX2+ y NKX2. 1+FOXA2+. El efecto de los agonistas y antagonistas enumerados en la Tabla 1 durante la diferenciación de AFE sobre la expresión de FOXA2/SOX2 y NKX2.1 se muestran en las Figuras 3A y 3B, respectivamente.

Tabla 1: Lista de agonistas y antagonistas de BMP41TGFP y Wnt añadidos secuencialmente entre los días 6 y 8.

Estudios previos demostraron que los miembros de la familia de FGF, BMP4, KGF y WNT3a proporcionan señales durante la embriogénesis para la generación de patrones en el endodermo pulmonar. La señalización de BMP4 es necesaria para la especificación pulmonar y un aumento en la concentración de bFGF y WNT aumenta los progenitores pulmonares inmaduros NKX2.1+. Para especificar el destino de las células pulmonares, después del día 7, el medio se cambió a un medio de diferenciación de endodermo pulmonar que contenía bFGF (10 ng/ml), BMP4 (10 ng/ml), Wnt3a (100 ng/ml) y KGF (10 ng/ml) durante 5 días. El número de células de endodermo anterior FOXA2+ SOX2+ se comparó entre las diferentes condiciones el día 7. El número de células doble positivas para las células del endodermo anterior FOXA2+ SOX2+se cuantificó con respecto al total de células de endodermo FOXA2+ por citometría de flujo. Los resultados indicaron que el bloqueo de la señalización de BMP4/TGFB y Wnt en las células DE aumentó el número de células de endodermo anterior FOXA2+ SOX2+ en comparación con el medio solo. Este aumento fue más pronunciado cuando las células se expusieron secuencialmente a combinaciones de dorsomorfina/SB431542 (inhibidor de BMP/TGFp) e IWP2/SB431542 (inhibidor de WNT/TGF-p) en comparación con la combinación de otros inhibidores (Figura 3A).

NKX2.1+ es el marcador más temprano de células que distingue al futuro pulmón de otros derivados del endodermo de la parte anterior del tubo digestivo. Se sometió a prueba la exposición secuencial a BMP/TGFp y WNT/TGF-p para determinar si hacía que las células iPS-células DE fueran más competentes para diferenciarse en células endodérmicas NKX2.1+. Los porcentajes de células NKX2.1+ se cuantificaron como porcentajes del total de células presentes. El número de células NKX2.1+ fue mayor cuando las células DE se expusieron a las combinaciones de dorsomorfina/SB431542 (inhibidor de BMP/TGFp) e IWP2/SB431542 (inhibidor de Wnt/TGF-p) en comparación con la combinación de otros inhibidores (Figura 3B).

El protocolo se manipuló adicionalmente, véanse la Figura 4 y la Tabla 2 a continuación, para dar como resultado un aumento de células NKX2.1+FOXA2+ el día 15, 72,1% en comparación con 50% en células DE expuestas a NOGGIN/SB con menos del 1% sin anteriorización (Figura 5). Todas las células NKX2.1+ diferenciadas ex vivo teñidas conjuntamente con FOXA2 (Figuras 6A-6D) sugirieron que las células NKX2.1+ que se diferenciaron in vitro representaban las células del endodermo pulmonar. El tratamiento continuo con activina A dio como resultado células FOXA2+SOX2+ raras y pocas células NKX2.1+ (Figuras 3A y 3B), lo que sugiere que la duración óptima de la exposición a activina A era importante. No se detectaron células PAX8+ (marcador de tiroides) ni TUJ1 (marcador neuronal) en el cultivo (datos no mostrados). Todos estos resultados fueron compatibles con el hallazgo de que una combinación de señalización de FGF, BMP4 y WNT, después del bloqueo secuencial de la señalización de BMP4/TGFB y WNT en las células DE, promovió la especificación del linaje de células progenitoras NKX2.1 específicas de pulmón a partir del endodermo anterior.

Tabla 2: Lista de agonistas y antagonistas de BMP4/TGFP y Wnt añadidos secuencialmente entre los días 5­ 15.

No se detectaron marcadores para ningún tipo de células epiteliales pulmonares maduras de las vías respiratorias tales como Mucina1, Mucina5AC (células caliciformes), FOXJ1 (células ciliadas) y CCSP (células de Clara) a nivel de proteína mediante tinción de inmunofluorescencia o PCR (datos no mostrados).

Diferenciación de las células del endodermo pulmonar hacia las células progenitoras de las vías respiratorias pulmonares. El endodermo pulmonar temprano (NKX2.1+/FOXA2+) es multipotente y su destino depende de las señales proporcionadas por el microambiente local (principalmente el mesodermo) o por las señales que controlan el destino celular regional (proximal frente a distal). La especialización del epitelio de las vías respiratorias ocurre en los tronco del pulmón embrionario, mientras que los progenitores alveolares en las puntas se diferencian en células distales, células ATII y ATI. Las células NKX2.1+SOX2+ de la región del tallo son células progenitoras de las vías respiratorias que dan lugar al epitelio maduro de las vías respiratorias. Por el contrario, la yema del pulmón embrionario distal expresa SOX9 y FOXP2 y es capaz de producir todos los tipos de células de las vías respiratorias y los alvéolos.

BMP4 se expresa distalmente, mientras que BMP7 se expresa más cerca de las vías respiratorias. El bFGF y el FGF10 distales se reemplazan por KGF proximal (FGF7), mientras que la señalización de WNT se inhibe en los progenitores del tronco proximal y está presente en la punta distal. SOX2 es un regulador clave de la especificación del linaje bronquiolar, que está regulado negativamente por la señalización canónica de WNT. La inhibición de las vías de señalización WNT y MAPKK/ERK aumenta la proporción de células NKX2.1 SOX2+ de las células AFE. El ácido retinoico (AR) es un factor importante para el desarrollo de la yema pulmonar, con una concentración de AR relativamente más alta en la región del tronco proximal que en la región de la punta distal. La señalización con una alta concentración de AR previene el desarrollo del pulmón distal y favorece el desarrollo de la vías respiratorias proximales.

Para convertir los progenitores pulmonares NKX2.1+ en células progenitoras proximales NKX2. 1+SOX2+, las vías de BMP y WNT se regularon para controlar la creación de patrones proximales a distales del árbol de las vías respiratorias. El día 12 para mejorar el destino de las vías respiratorias proximales, la combinación de factores de crecimiento se cambió a un medio de inducción proximal que contenía BMP7 (10 ng/ml), KGF (10 ng/ml), alta concentración de ácido retinoico (1 ^j M), IWR-1 (100 nM) (antagonista de WNT), PD98059 (1 ^j M) (antagonista de MAPK) durante 3 días. Después de 3 días, se observó inhibición de la vía WNT con IWR-1, PD98059, BMP7 y altas concentraciones de AR. Las células progenitoras de las vías respiratorias NKX2. 1+/ SOX2+ constituyeron hasta aproximadamente 30% en comparación con aproximadamente 1-2% antes del tratamiento (Figuras 7A-7D y 8) Para promover adicionalmente la diferenciación de las vías respiratorias, las células progenitoras el día 15 se cultivaron en el mismo medio basal con un suplemento de IWR-1 (100 nM), AR (1 j M), BMP4 (10 ng/ml), BMP7 (10 ng/ml), KGF (10 ng/ml), EGF (10 ng/ml) durante 12 días. Véase la Figura 9. La RT-PCR cuantitativa reveló un aumento relativamente modesto en los marcadores de células epiteliales de las vías respiratorias pulmonares maduras, tales como FOXJ1 (células ciliadas) (Figura 10A), KRT5 (células basales) (Figura 10B), CFTR (Figura 10C), CCSP o SCGB1A1 (células de Clara) (Figura 10D), P63 (Figura 10E), Mucina5AC (células caliciformes) (Figura 10G), y en comparación con la expresión de SOX2 (Figura 10F), que se expresó en gran medida en células obtenidas a partir de células iPS el día 20 de diferenciación. Véase también la Tabla 3.

Tabla 3: Una lista de agonistas y antagonistas añadidos a los medios basales para promover la diferenciación de las vías respiratorias

El día 27, la citometría de flujo reveló la diferenciación epitelial de las vías respiratorias inducida por la combinación de inhibidores y factores de crecimiento antes mencionados cuando 76% de las células eran positivas para el marcador de células de las vías respiratorias SOX2 (Figuras 11 y 12D). Los porcentajes de células positivas para SOX2 aumentaron de 72% a 92% el día 35. Las células basales y secretoras/ciliadas son dos linajes de células epiteliales principales en el compartimento grande y pequeño de las vías respiratorias. Las células basales (BC) son epitelios pseudoestratificados que recubren las vías respiratorias conductoras del pulmón humano y que se ha demostrado previamente que dan lugar a otros linajes proximales de las vías respiratorias. Una característica de las BC son los altos niveles de expresión de la proteína relacionada con la transformación del factor de transcripción 63 (P63) y las proteínas citoesqueléticas, citoqueratinas 5 y 14 (KRT5 y KRT14, respectivamente). Estas células proliferan y generan células secretoras y ciliadas (células de Clara) en las vías respiratorias humanas cuando se cultivan en la interfaz aire-líquido o en un ensayo de traqueosfera in vitro.

El día 27 de diferenciación, 64% de las células fueron positivas para KRT5 (Figura 12F) y más de 60% de las células fueron P63+ (Figura 12H), lo que sugiere que la gran mayoría de las células eran potencialmente progenitoras de células basales. Setenta y seis por ciento de las células expresan la proteína secretora de células de Clara (CCSP) (Figura 12E). Las células de tipo Clara son células secretoras epiteliales en todo el eje proximal a distal y se ha pensado durante mucho tiempo que actúan como células progenitoras de las vías respiratorias. El regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) es un canal iónico de clase transportadora ABC que transporta iones cloruro y tiocianato a través de las membranas de las células epiteliales. La mayoría de las células epiteliales de las vías respiratorias, así como las células neuroepiteliales, expresan la proteína CFTR. El análisis de citometría de flujo reveló que 36% de las células el día 27 eran positivas para CFTR (Figura 12B). Hasta 65% y 58% de las células fueron positivas para los marcadores de células ciliadas, FOXJ1 (Figura 12A) y p-Tubulina IV (Figura 12C), respectivamente, lo que sugiere que al menos un tercio de las células en el cultivo tienen el fenotipo de las vías respiratorias que expresa CFTR de células ciliadas (Figura 12B). Sólo 8% de las células expresaron Mucina-5AC, el marcador de células caliciformes (Figura 12G).

La qPCR el día 27 indicó que el cambio a los medios de diferenciación de las vías respiratorias dio como resultado una mayor regulación por incremento de los genes de las vías respiratorias KRT5 (Figura 13F), P63, FOXJ1 (Figura 13B), SOX17, MUC5AC (Figura 13D) y CFTR (Figura 13A), mientras que hubo menores niveles de Mucina5AC, SCGB1A1 (CCSP) (Figura 13C). En esta fase no se detectaron otros marcadores de linaje de endodermo tales como AFP (hígado), PDX1, TG (tiroides) y PAX9 (faríngeo).

Las proteínas de la ECM tienen un patrón de distribución y ensamblaje muy específico en el pulmón. El complejo proceso de diferenciación epitelial de las vías respiratorias también implica la interacción célula-matriz y célulacélula. La tráquea y las vías respiratorias humanas se componen principalmente de colágeno I y III en comparación con otras proteínas de la ECM. Por lo tanto, al comienzo del día 28, las células se transfirieron a placas recubiertas con colágeno I/III en Medio de Crecimiento de Células Epiteliales Bronquiales BEGM™ de Lonza durante otros 7 días. Utilizando las condiciones modificadas para la diferenciación alveolar humana, el día 35 las células AFE se convirtieron con éxito en células progenitoras epiteliales de las vías respiratorias con alta eficacia.

El día 35, las células diferenciadas se tiñeron positivamente para determinar los marcadores de células epiteliales de las vías respiratorias, CFTR (Figura 15E), CCSP (Figura 15D), Mucina5AC (Figura 15C), FOXJ1 (Figura 15B) y PanKRT (Figura 15F). Según lo determinado por citometría de flujo el día 35, 100% de las células fueron positivas para el marcador de células de las vías respiratorias, SOX2 (Figura 16H), y hasta 97,5% de las células fueron positivas para P63 (Figura 16D). Hasta 100% de las células expresaron CCSP (células de Clara) (Figura 16F), p-Tubulina IV (Figura 16C) y FOXJ1 (células ciliadas) (Figura 16B). Sesenta y dos por ciento y 24% de las células fueron positivas para CFTR (Figura 16E) y Mucina5AC (Figura 16A), respectivamente.

Al final del día 35, la gran mayoría, 92,2% de las células, fueron positivas para KRT5 o CK5 mientras expresaban FOXJ y CCSP mostrando un fenotipo ciliado y secretor. Esto demuestra que las células de las vías respiratorias obtenidas a partir de las células iPS todavía tienen potencial multipotente en esta fase. Es posible que los progenitores de las vías respiratorias o las células basales mantuvieran la expresión de los marcadores de células basales, KRT5 y P63 cuando se estaban diferenciando a otras células proximales tales como las células de Clara y las células ciliadas. Gomperts et al. demostraron en ensayos con organoides que las células de Clara expresan FOXJ1, tenían un fenotipo ciliado y también contenían células que expresaban Muc5AC, CCSP y queratina 5.

La RT-PCR cuantitativa el día 35 reveló que CK5 o KRT5 (Figura 17A), SCGB1A1 (CCSP) (Figura 17E), CFTR (Figura 17B), P63 (Figura 17D), FOXJ1 (Figura 17F) y Mucina-5AC (Figura 17G) se expresaron en gran medida en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de iPS, con niveles de expresión comparables a los de las células de las vías respiratorias humanas recién aisladas. Estos genes no fueron detectables en células iPS, DE, AFE indiferenciadas.

A continuación, se examinó un enfoque de diferenciación por etapas similar para generar progenitores de las vías respiratorias pulmonares a partir de células iPS humanas específicas de la enfermedad de FQ (Figura 18). Curiosamente, los clones de células CF-iPS arrojaron resultados similares y tuvieron una eficacia similar para diferenciarse hacia DE, AFE, células epiteliales de las vías respiratorias, lo que sugiere que este protocolo se puede generalizar a otras líneas de células iPS de otras fuentes (Figuras 19A-19D que muestran tinción celular, Figuras 20A-20H que muestran el análisis de citometría de flujo y las Figuras 21A-21H que muestran los resultados cuantitativos de RT-PCR).

El análisis de inmunotinción también mostró que la población de células progenitoras de las vías respiratorias obtenida a partir de las iPSC se podía convertir en estructuras organoides pulmonares en Matrigel. Las estructuras fueron positivas para los marcadores de las vías respiratorias, P63 (Figura 22A) y NKX2.1 (Figura 22B).

El desarrollo de tecnologías avanzadas para el ensamblaje ex vivo de tejido alveolar funcional para su implantación en el organismo humano es una de las difíciles tareas a las que se enfrentan los ingenieros de tejidos. Los avances recientes en la diferenciación de células ESC e iPS en células epiteliales pulmonares o precursores han sugerido una estrategia terapéutica prometedora que utiliza células epiteliales obtenidas a partir de células madre para la ingeniería pulmonar.

En el presente estudio se desarrolló un método altamente eficaz para la diferenciación dirigida de células iPS a células epiteliales conductoras funcionales de las vías respiratorias, que se pueden utilizar para la recelularización de armazones pulmonares descelularizados y que, en última instancia, pueden proporcionar un injerto autólogo para trasplante de pulmón. En particular, este método de diferenciación dirigida fue ampliamente aplicable a varias líneas celulares pluripotentes (clon C1 de células iPS humanas, reprogramadas a partir de fibroblastos pulmonares fetales y células CF-iPS, reprogramadas a partir de fibroblastos dérmicos). Ambos clones de células iPS producen resultados similares y tienen una eficacia similar para diferenciarse hacia DE, AFE y diferentes tipos de células de las vías respiratorias, lo que sugiere que este protocolo se puede generalizar a otras líneas de células iPS de otras fuentes. La mayoría de los esfuerzos en la diferenciación de células iPS a epitelio alveolar se centran en la generación de células epiteliales de tipo II y pocos estudios se han dirigido a la diferenciación del epitelio de las vías respiratorias. En todos los informes publicados, la eficacia fue baja y la expresión del marcador de las vías respiratorias parece ser estocástica. En cultivos heterogéneos de células ESC e iPS diferenciadoras con baja eficacia existe el riesgo de que queden células madre pluripotentes indiferenciadas dentro de las poblaciones, lo que puede conllevar un riesgo significativo de formación de teratomas después del trasplante. Independientemente del tipo de célula madre que se utilice para la diferenciación, siguen existiendo desafíos en la ingeniería pulmonar, especialmente en la generación de grandes cantidades de células bien diferenciadas. En informes anteriores, las células de las vías respiratorias diferenciadas a partir de las células iPS han sido difíciles de expandir. Sin embargo, a diferencia de las células de las vías respiratorias aisladas, las células de las vías respiratorias obtenidas a partir de las células iPS de este estudio son capaces de proliferar durante varios pases sin perder marcadores asociados a las células epiteliales de las vías respiratorias, tales como CCSP, P63, FOXJ1, CFTR y mucina-5AC, y se pueden utilizar para generar decenas de millones de células con las que sembrar el armazón de la matriz acelular. La capacidad de "aumentar a escala" una población progenitora será particularmente valiosa cuando se traduzcan estas tecnologías para su uso en la ingeniería de tejidos pulmonares humanos modificados mediante ingeniería de tejidos, utilizando células obtenidas a partir de células iPS autólogas.

Por otra parte, proporcionar un suministro de células trasplantables definidas que permitan el tratamiento de pacientes afectados por trastornos genéticos y degenerativos es un objetivo principal de la terapia con células humanas. En determinadas enfermedades pulmonares, tales como la fibrosis quística, el trasplante de células madre y progenitoras pulmonares adultas o células alveolares aisladas del pulmón humano está surgiendo como un nuevo enfoque terapéutico para restaurar las funciones pulmonares normales en los pacientes. Sin embargo, este enfoque está limitado por la escasez de células alveolares humanas y, lo que es más importante, por la falta de injerto de tales células en vivo en pulmones lesionados.

Las células epiteliales de las vías respiratorias o los precursores del epitelio pulmonar derivados de las células iPS proporcionan una estrategia terapéutica prometedora que utiliza terapias inhaladas basadas en células madre para reemplazar las células epiteliales pulmonares nativas y reconstituir el epitelio pulmonar sano en los pacientes.

Por otra parte, el desarrollo de nuevos fármacos es costoso y requiere muchos recursos. Las células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de iPS son potencialmente muy valiosas para el desarrollo farmacéutico, abarcando desde su uso como herramientas en estudios de dianas tempranas hasta evaluaciones de seguridad, así como modelos de escrutinio para encontrar nuevas entidades químicas. Las células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de iPS pueden ser útiles para someter a prueba fármacos en la patología de un tejido pulmonar. Además, las células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de iPS se pueden utilizar para examinar los efectos de vehículos de suministro particulares para agentes terapéuticos en la patología del tejido pulmonar, por ejemplo, para comparar los efectos del mismo agente administrado a través de diferentes sistemas de suministro, o simplemente para evaluar si un vehículo de suministro en sí mismo (p. ej., un vector viral frente a uno no viral) es capaz de afectar a la patología pulmonar.

Se utilizó la diferenciación directa de las células iPS en capas alimentadoras o Matrigel hasta la fase de endodermo definitivo en lugar del método del cuerpo embrioide. La diferenciación directa hacia DE produjo poblaciones de alta pureza en comparación con el método EB. Esto se debió principalmente a que, en el cuerpo embrionario, incluso en presencia de activina A, quedaban células de otras dos capas germinales embrionarias, el mesodermo y el ectodermo.

Para inducir el endodermo definitivo, se cultivaron células iPS en medio RPMI 1640 sin suero con un suplemento de 100 ng/ml de activina A durante 48 horas. A continuación, se añadió 1 x suplemento de B27, se añadió butirato de sodio 0,5 mM al mismo medio y se cultivaron células iPS en este medio durante otros 3 días. En protocolos publicados previamente establecidos, las células se cultivaron en medio que contenía activina A durante 4 días en lugar de 5 días. Uno x suplemento B27 proporcionó una condición sérica baja. Estas células también mostraron una morfología uniforme en presencia de butirato de sodio.

En otros protocolos, los investigadores no han utilizado en su mayoría medios séricos o medios definidos. Por el contrario, el protocolo modificado descrito en el presente documento dio como resultado poblaciones de células obtenidas a partir de IPS el día 5 que expresaron un alto porcentaje de marcadores asociados con esta capa germinal. La población de células fue 89% células positivas para c-kit, 91% positivas para SOX17, 93% positivas para FOXA2 y 88% de las células expresaron el marcador de superficie de endodermo CXCR4 en el clon C1.

Para diferenciar el endodermo definitivo a endodermo anterior de la parte anterior del tubo digestivo, las células DE se cultivaron en IMDM que contenía FBS al 5% y dorsomorfina/SB141524. Otros protocolos utilizaron otros medios basales en lugar de IMDM y los otros no utilizaron medios séricos ni medios definidos.

Para controlar la diferenciación del endodermo anterior de la parte anterior del tubo digestivo a las células conductoras de las vías respiratorias, los factores de crecimiento y la matriz proteica extracelular fueron el centro de atención. En los métodos de diferenciación descritos en el presente documento, se eligieron EGF, KGF y BMP7, BMP4, IWR-1 (inhibidor de WNT3a) y alta concentración de ácido retinoico en IMDM con FBS al 10%. Este cóctel de diferenciación no se ha utilizado en informes anteriores.

Los métodos descritos en el presente documento imitan el desarrollo pulmonar durante la embriogénesis utilizando proteínas de la matriz extracelular que existen en el pulmón (que incluyen colágenos, laminina, fibronectina, tenascina, elastina y varios proteoglicanos y glicosaminoglicanos) y una combinación de factores de crecimiento que desempeñan un papel central en el desarrollo y la regeneración pulmonar. Las células iPS se diferenciaron primero hacia el endodermo definitivo (DE) y después se cultivaron sobre superficies recubiertas con ^eC^m . El descubrimiento de los métodos de diferenciación descritos en el presente documento es el primero en utilizar superficies recubiertas con ECM para la diferenciación de células epiteliales de las vías respiratorias junto con factores de crecimiento en células iPS humanas para la diferenciación específica de tejido.

El complejo proceso de diferenciación epitelial de las vías respiratorias también implica la interacción célula-matriz y célula-célula. La tráquea y las vías respiratorias humanas están compuestas principalmente de colágeno I y III. Por lo tanto, a partir del día 28, las células se transfirieron a placas recubiertas con colágeno I/III en Medio de Crecimiento de Células Epiteliales Bronquiales BEGM™ de Lonza durante otros 5 días. Este estudio es uno de los primeros en utilizar una superficie recubierta con una mezcla de colágeno I/III para la diferenciación epitelial de las vías respiratorias a partir de células iPS.

Fue inesperado descubrir que las células madre pluripotentes humanas se pueden dirigir para que se diferencien in vitro en el epitelio de las vías respiratorias conductor con alta eficacia. Utilizando los métodos descritos en el presente documento para la diferenciación de las vías respiratorias humanas, el día 35, las células AFE se convirtieron con éxito en células progenitoras epiteliales de las vías respiratorias con alta eficacia. Según se determinó mediante citometría de flujo el día 35, aproximadamente 100% de las células fueron positivas para el marcador de células de las vías respiratorias, SOX2, y hasta aproximadamente 97,5% de las células fueron positivas para P63. Además, hasta aproximadamente 100% de las células expresaron CCSP (células de Clara) y p-tubulina IV y FOXJ1 (células ciliadas). Aproximadamente 62% y 24% de las células fueron positivas para CFTR y Mucin5AC, respectivamente.

Al final del día 35, la gran mayoría, aproximadamente 92,2%, de las células eran positivas para KRT5, mientras que expresaban FOXJ1 y CCSP mostrando un fenotipo secretor y ciliado. La RT-PCR cuantitativa también reveló que ^c K5, SCGBIal (CCSP), CFTR, P63, FOXJ1 y Mucina-5AC fueron altamente expresados en células epiteliales de las vías respiratorias obtenidas a partir de iPS, con niveles relativos en comparación con las células de las vías respiratorias humanas recién aisladas.

A diferencia de las células de las vías respiratorias aisladas, las células de las vías respiratorias obtenidas a partir de las células iPS descritas en el presente documento son capaces de proliferar durante varios pases sin perder marcadores asociados a las células epiteliales de las vías respiratorias, tales como CCSP, P63, FOXJ1, CFTR y mucina-5AC. Esto hace posible generar decenas de millones de células para otros fines, tales como sembrar los armazones de matriz acelular para fabricar tejidos pulmonares modificados por ingeniería de tejidos.

Otras realizaciones

La mención de una lista de elementos en cualquier definición de una variable en el presente documento incluye definiciones de esa variable como cualquier elemento individual o combinación (o subcombinación) de elementos enumerados. La mención de una realización en el presente documento incluye esa realización como una realización única o combinada con cualquier otra realización o partes de la misma.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un método de diferenciación in vitro de una célula madre pluripotente inducida (iPS) en una célula epitelial de las vías respiratorias que comprende:

cultivar la célula iPS que se obtiene preferiblemente a partir de una célula humana enferma; más preferiblemente una célula iPS humana específica de la enfermedad de fibrosis quística, en ausencia de suero para inducir la diferenciación en una célula de endodermo definitivo (DE);

cultivar la célula DE en presencia de suero para inducir la diferenciación en una célula de endodermo anterior de la parte anterior del tubo digestivo (AFE), en donde la célula AFE preferiblemente expresa NKX2.1; y

cultivar la célula AFE en presencia de suero, un cóctel de citocinas que comprende EGF, KGF, BMP7, BMP4 e IWR-1, y una alta concentración de ácido retinoico, en donde la alta concentración comprende de 0,8 pM a 1,2 pM para inducir la diferenciación de la célula AFE en la célula epitelial de las vías respiratorias, en donde la célula epitelial de las vías respiratorias expresa la proteína secretora de células de Clara (CCSP), la citoqueratina 5 (KRT5) y los marcadores de superficie de las células de las vías respiratorias FOXJ1, y en donde la célula epitelial de las vías respiratorias es capaz de proliferar en cultivo durante al menos 30 días, preferiblemente más de 30 días, sin pérdida de los marcadores de superficie de las células de las vías respiratorias.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa de cultivo de la célula iPS comprende cultivar la célula iPS en presencia de activina A, preferiblemente a aproximadamente concentraciones de saturación, para inducir la diferenciación a la célula DE.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la célula DE expresa uno o más marcadores celulares de endodermo definitivo seleccionados del grupo que consiste en c-kit, SOX17, FOXA2 y CXCR4.

4. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa de cultivo de la célula DE comprende cultivar las células DE en presencia de moléculas de la matriz extracelular (ECM); preferiblemente que comprende disociar la célula DE antes del cultivo con moléculas de la ECM.

5. El método de la reivindicación 4, en donde las moléculas de ECM comprenden uno o más de colágeno, laminina, fibronectina, tenascina, elastina, un proteoglicano y un glicosaminoglicano.

6. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa de cultivo de la célula DE comprende exponer secuencialmente la célula DE a inhibidores de molécula pequeña para suprimir el destino de endodermo posterior e inducir el destino de endodermo proximal.

7. El método de la reivindicación 6, en donde los inhibidores de molécula pequeña inhiben la señalización de BMP/TGF y se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en dorsomorfina, Noggin, A83-01, DMH-1, D4476, GW788388, LY364947, RepSox, SB431542, SB505124, SB525334 y SD208.

8. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa de cultivo de la célula iPS comprende cultivar la célula iPS en presencia de activina A a aproximadamente concentraciones de saturación, para inducir la diferenciación a la célula DE.

9. El método de la reivindicación 6, en donde los inhibidores de molécula pequeña inhiben la señalización de TGF/WNT.

10. El método de la reivindicación 5, en donde la etapa de cultivo de la célula iPS comprende cultivar la célula iPS en presencia de un suplemento sin suero, para inducir la diferenciación a la célula DE.