CN111514141A - 化合物在制备治疗肝纤维药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提出了化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗肝纤维化，所述化合物为式(I)所示的化合物或式(I)所示化合物的立体异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药。本发明的化合物能够高效地治疗肝纤维化疾病，具有良好的吸收性、较高的生物活性和利用度，溶解性高，低毒，尤其是在体内具有较强的稳定性，不易分解，药效时间长，从而起到治疗肝纤维化的效果，应用前景好。

Description

化合物在制备治疗肝纤维药物中的用途

技术领域

本发明涉及医药领域。具体地，本发明涉及化合物在制备治疗肝纤维药物中的用途。

背景技术

肝纤维化是肝脏应对各种持续性损伤因素所产生的愈伤反应的结果，其主要特征包括：肝星形细胞的激活、肝窦内皮细胞血管化、胶原蛋白沉积等。近年来，肝纤维化以及肝纤维化相关疾病比如肝硬化和肝癌危害逐渐加重，并已成为严重威胁人类生命安全的疾病类型。据报道全世界范围内约有8亿人患有肝脏疾病，而我国患有肝病的人群则高达3亿。在发达国家内，有近45％的人口死亡与纤维化疾病相关。如果肝纤维化得不到治疗，至少会有33％的患者在20年内转化为肝硬化，而且一旦肝硬化出现腹水症状，其中50％的患者在2年内死亡。

现代生物学、医学的发展，肝脏纤维化发病机制和分子信号变化越来越清晰，但是目前针对肝纤维化的治疗除了去除根本的致病因素(如乙型肝炎、丙型肝炎病毒等)尚无有效的治疗措施，目前FDA尚未批准针对肝纤维化的药物及疗法，所以研发针对肝纤维化的药物是目前基础研究领域和制药领域的热点之一。

因此，目前用于治疗肝纤维化的药物仍有待研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了化合物在制备药物中的用途、用于治疗肝纤维化的药物组合物或药物联合，采用该药物、药物组合物或药物联合能够高效地治疗肝纤维化疾病，具有良好的吸收性、较高的生物活性和利用度，溶解性高，低毒，尤其是在体内具有较强的稳定性，不易分解，药效时间长，从而起到治疗肝纤维化的效果，应用前景好。

在本发明的一个方面，本发明提出了化合物在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗肝纤维化，所述化合物为式(I)所示的化合物或式(I)所示化合物的立体异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药；

发明人经过对上千种化合物进行高通量筛选及体内验证，发现同一化合物针对不同类型的纤维化疾病(例如肺纤维化、皮肤纤维化或肝纤维化)的作用效果不尽相同，一些化合物对于肺纤维化的疗效好，但是，对于肝纤维化的疗效反倒不佳，例如Pomalidomide被报道能用于皮肤纤维化的治疗(Ann Rheum Dis 2012；71:1895–1899)，但是由于肝损伤作用并不能用于肝纤维化的治疗(Lancet.2014；383:2125–2126)。最终，发现上述化合物能够高效地治疗肝纤维化疾病，具有良好的吸收性、较高的生物活性和利用度，溶解性高，低毒，尤其是在体内具有较强的稳定性，不易分解，药效时间长，从而起到治疗肝纤维化的效果，应用前景好。

根据本发明的实施例，上述化合物在制备药物中的用途还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述化合物适于抑制肝脏组织中的胶原纤维沉淀。

根据本发明的实施例，所述化合物适于使纤维化标志基因col 1a1和Acta2表达量降低。

根据本发明的实施例，所述化合物适于抑制肝星形细胞(Hepatic stellatecells)的激活。

根据本发明的实施例，所述药物的给药剂量为100～150mg/kg人体重。在此给药剂量下，可以有效地起到治疗肝纤维化的目的。

根据本发明的实施例，所述药物用于治疗门静脉周纤维化、桥接肝纤维化或肝硬化。对于肝纤维化患者来说，根据病情的发展会分为不同的阶段，不同的阶段展现不同特征。从解剖病理学角度，肝纤维化可以分为四个阶段，F0阶段中没有肝纤维化，F2阶段出现门静脉周纤维化，F3阶段为桥接肝纤维化，F4阶段为肝硬化。发明人发现，使用上述化合物可以有效地治疗F2～F4期的肝纤维化。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种用于治疗肝纤维化的药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：化合物，所述化合物为式(I)所示的化合物或式(I)所示化合物的立体异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药；以及药学上可接受的辅料、载体、赋形剂、溶媒或它们的组合。由此，根据本发明实施例的药物组合物能够高效地治疗肝纤维化疾病，具有良好的吸收性、较高的生物活性和利用度，溶解性高，低毒，尤其是在体内具有较强的稳定性，不易分解，药效时间长，从而起到治疗肝纤维化的效果，应用前景好。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种用于治疗肝纤维化的药物联合。根据本发明的实施例，所述药物联合包括：化合物，所述化合物为式(I)所示的化合物或式(I)所示化合物的立体异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药；至少一种用于治疗肝纤维的药物。由此，采用根据本发明实施例的药物联合可以高效地治疗肝纤维化疾病，具有良好的吸收性、较高的生物活性和利用度，溶解性高，低毒，尤其是在体内具有较强的稳定性，不易分解，药效时间长，从而起到治疗肝纤维化的效果，应用前景好。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的早期小鼠肝纤维化动物模型诱导及治疗方案流程示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的晚期小鼠肝纤维化动物模型诱导及治疗方案流程示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例的早期肝纤维化小鼠的组织学染色鉴定示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例的肝纤维化标志基因表达检测REPSOX对早期肝纤维化治疗作用示意图；

图5显示了根据本发明一个实施例的免疫荧光实验检测早期肝纤维化小鼠星形细胞激活、胶原沉积效果示意图；

图6显示了根据本发明一个实施例的晚期肝纤维化小鼠的组织学染色鉴定示意图；

图7显示了根据本发明一个实施例的肝纤维化标志基因表达检测REPSOX对晚期肝纤维化治疗作用示意图；

图8显示了根据本发明一个实施例的免疫荧光实验检测晚期肝纤维化小鼠星形细胞激活、胶原沉积效果示意图。

具体实施方式

现在详细描述本发明的某些实施方案，其实例由随附的结构式和化学式说明。本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本文所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本文所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本申请不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等)，以本申请为准。

应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。

除非另外说明，本发明所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。

定义或一般术语

术语“包含”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

“立体异构体”是指具有相同化学构造，但原子或基团在空间上排列方式不同的化合物。立体异构体包括对映异构体、非对映异构体、构象异构体(旋转异构体)、几何异构体(顺/反)异构体、阻转异构体，等等。

“手性”是具有与其镜像不能重叠性质的分子；而“非手性”是指与其镜像可以重叠的分子。

“对映异构体”是指一个化合物的两个不能重叠但互成镜像关系的异构体。

“非对映异构体”是指有两个或多个手性中心并且其分子不互为镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质，如熔点、沸点、光谱性质和反应性。非对映异构体混合物可通过高分辨分析操作如电泳和色谱，例如HPLC来分离。

本发明所使用的立体化学定义和规则一般遵循S.P.Parker，Ed.，McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company，New York；andEliel，E.and Wilen，S.，“Stereochemistry of Organic Compounds”，John Wiley&Sons，Inc.，New York，1994。

许多有机化合物以光学活性形式存在，即它们具有使平面偏振光的平面发生旋转的能力。在描述光学活性化合物时，使用前缀D和L或R和S来表示分子关于其一个或多个手性中心的绝对构型。前缀d和l或(+)和(-)是用于指定化合物所致平面偏振光旋转的符号，其中(-)或l表示化合物是左旋的。前缀为(+)或d的化合物是右旋的。一种具体的立体异构体是对映异构体，这种异构体的混合物称作对映异构体混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，当在化学反应或过程中没有立体选择性或立体特异性时，可出现这种情况。

本发明公开化合物的任何不对称原子(例如，碳等)都可以以外消旋或对映体富集的形式存在，例如(R)-、(S)-或(R,S)-构型形式存在。在某些实施方案中，各不对称原子在(R)-或(S)-构型方面具有至少50％对映体过量，至少60％对映体过量，至少70％对映体过量，至少80％对映体过量，至少90％对映体过量，至少95％对映体过量，或至少99％对映体过量。

依据起始物料和方法的选择，本发明化合物可以以可能的异构体中的一个或它们的混合物，例如外消旋体和非对应异构体混合物(这取决于不对称碳原子的数量)的形式存在。光学活性的(R)-或(S)-异构体可使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术拆分。如果化合物含有一个双键，取代基可能为E或Z构型；如果化合物中含有二取代的环烷基，环烷基的取代基可能有顺式或反式构型。

所得的任何立体异构体的混合物可以依据组分物理化学性质上的差异被分离成纯的或基本纯的几何异构体，对映异构体，非对映异构体，例如，通过色谱法和/或分步结晶法。

可以用已知的方法将任何所得终产物或中间体的外消旋体通过本领域技术人员熟悉的方法拆分成光学对映体，如，通过对获得的其非对映异构的盐进行分离。外消旋的产物也可以通过手性色谱来分离，如，使用手性吸附剂的高效液相色谱(HPLC)。特别地，对映异构体可以通过不对称合成制备，例如，可参考Jacques,et al.,Enantiomers,Racematesand Resolutions(Wiley Interscience,New York,1981)；Principles of AsymmetricSynthesis(2nd Ed.Robert E.Gawley,Jeffrey Aubé,Elsevier,Oxford,UK,2012)；Eliel,E.L.Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw-Hill,NY,1962)；Wilen,S.H.Tablesof Resolving Agents and Optical Resolutions p.268(E.L.Eliel,Ed.,Univ.of NotreDame Press,Notre Dame,IN 1972)；Chiral Separation Techniques:A PracticalApproach(Subramanian,G.Ed.,Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA,Weinheim,Germany,2007)。

术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指具有不同能量的可通过低能垒(lowenergy barrier)互相转化的结构异构体。若互变异构是可能的(如在溶液中)，则可以达到互变异构体的化学平衡。例如，质子互变异构体(protontautomer)(也称为质子转移互变异构体(prototropic tautomer))包括通过质子迁移来进行的互相转化。价键互变异构体(valence tautomer)包括通过一些成键电子的重组来进行的互相转化。互变异构的另一个实例是酚-酮互变异构。除非另外指出，本发明化合物的所有互变异构体形式都在本发明的范围之内。

术语“药学上可接受的”是指当给人施用时生理上可耐受的并且一般不产生过敏或相似不适当的反应，例如肠胃不适、眩晕等的分子实体和组合物。优选地，本文所用的术语“药学上可接受的”是指联邦监管机构或国家政府批准的或美国药典或其他一般认可的药典上列举的在动物中、更特别在人体中使用的。

术语“载体”指与所述化合物一同施用的稀释剂、辅剂、赋形剂或基质。这些药物载体可以是无菌液体，例如水和油类，包括石油、动物、植物或合成来源的，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水和水性溶液盐水溶液和水性葡萄糖与甘油溶液优选用作载体、特别是可注射溶液。适宜的药物载体描述于E.W.Martin的“Remington′s PharmaceuticalSciences”中。

本发明中立体化学的定义和惯例的使用通常参考以下文献：S.P.Parker,Ed.,McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,NewYork；and Eliel,E.and Wilen,S.,"Stereochemistry of Organic Compounds",JohnWiley&Sons,Inc.,New York,1994.本发明的化合物可以包含不对称中心或手性中心，因此存在不同的立体异构体。本发明的化合物所有的立体异构形式，包括但绝不限于，非对映体，对映异构体，阻转异构体，和它们的混合物，如外消旋混合物，组成了本发明的一部分。很多有机化合物都以光学活性形式存在，即它们有能力旋转平面偏振光的平面。在描述光学活性化合物时，前缀D、L或R、S用来表示分子手性中心的绝对构型。前缀d、l或(+)、(-)用来命名化合物平面偏振光旋转的符号，(-)或l是指化合物是左旋的，前缀(+)或d是指化合物是右旋的。这些立体异构体的化学结构是相同的，但是它们的立体结构不一样。特定的立体异构体可以是对映体，异构体的混合物通常称为对映异构体混合物。50:50的对映体混合物被称为外消旋混合物或外消旋体，这可能导致化学反应过程中没有立体选择性或立体定向性。术语“外消旋混合物”和“外消旋体”是指等摩尔的两个对映异构体的混合物，缺乏光学活性。

“异构体”为具有相同分子式的不同化合物。“立体异构体”为仅仅原子的空间排列方式不同的异构体。如本文使用的术语“异构体”包括任何和所有的几何异构体和立体异构体。

本发明的“水合物”是指本发明所提供的化合物或其盐，其还包括化学量或非化学当量通过非共价分子间力结合的水，也可说是溶剂分子是水所形成的缔合物。

本发明的“溶剂化物”是指一个或多个溶剂分子与本发明的化合物所形成的缔合物。形成溶剂化物的溶剂包括，但并不限于，水、异丙醇、乙醇、甲醇、二甲亚砜、乙酸乙酯、乙酸、氨基乙醇。

本发明的“氮氧化物”是指当化合物含几个胺官能团时，可将1个或大于1个的氮原子氧化形成N-氧化物。N-氧化物的特殊实例是叔胺的N-氧化物或含氮杂环氮原子的N-氧化物。可用氧化剂例如过氧化氢或过酸(例如过氧羧酸)处理相应的胺形成N-氧化物(参见Advanced Organic Chemistry,Wiley Interscience,第4版,Jerry March,pages)。尤其是，N-氧化物可用L.W.Deady的方法制备(Syn.Comm.1977,7,509-514)，其中例如在惰性溶剂例如二氯甲烷中，使胺化合物与间-氯过氧苯甲酸(MCPBA)反应。

本发明所使用的术语“前药”，代表一个化合物在体内转化为本发明所示的化合物。这样的转化受前体药物在血液中水解或在血液或组织中经酶转化为母体结构的影响。关于前体药物完整的讨论可以参考以下文献：T.Higuchi and V.Stella,Pro-drugs asNovel Delivery Systems,Vol.14of the A.C.S.Symposium Series,Edward B.Roche,ed.,Bioreversible Carriers in Drug Design,American Pharmaceutical Associationand Pergamon Press,1987,J.Rautio et al,Prodrugs:Design and ClinicalApplications,Nature Review Drug Discovery,2008,7,255-270,and S.J.Hecker etal,Prodrugs of Phosphates and Phosphonates,Journal of Medicinal Chemistry,2008,51，2328-2345。

除非其他方面表明，本发明的化合物的所有互变异构形式都包含在本发明的范围之内。

“代谢产物”是指具体的化合物或其盐在体内通过代谢作用所得到的产物。一个化合物的代谢产物可以通过所属领域公知的技术来进行鉴定，其活性可以通过如本发明所描述的那样采用试验的方法进行表征。这样的产物可以是通过给药化合物经过氧化、还原、水解、酰氨化、脱酰氨作用、酯化、脱脂作用、酶裂解等等方法得到。相应地，本发明包括化合物的代谢产物，包括将本发明的化合物与哺乳动物充分接触一段时间所产生的代谢产物。

本发明化合物的各种药学上可接受的盐形式都是有用的。术语“药学上可接受的盐”是指那些盐形式对于制药化学家而言是显而易见的，即它们基本上无毒并能提供所需的药代动力学性质、适口性、吸收、分布、代谢或排泄。其他因素，在性质上更加实用，对于选择也很重要，这些是：原材料的成本、结晶的容易、产率、稳定性、吸湿性和结果原料药的流动性。简单地讲，药物组合物可以通过有效成分与药学上可接受的载体制备得到。

本发明所使用的“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的有机盐和无机盐。药学上可接受的盐在所属领域是为我们所熟知的，如文献：S.M.Berge et al.,describepharmaceutically acceptable salts in detail in J.Pharmaceutical Sciences,66:1-19,1977.所记载的。药学上可接受的无毒的酸形成的盐包括，但并不限于，与氨基基团反应形成的无机酸盐有盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、高氯酸盐、硝酸盐等，和有机酸盐如乙酸盐、丙酸盐、乙醇酸盐、草酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、枸橼酸盐、苯甲酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、甲苯磺酸盐、磺基水杨酸盐等，或通过书籍文献上所记载的其他方法如离子交换法来得到这些盐。

其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、苹果酸盐、2-羟基丙酸、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、重硫酸盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊基丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、反丁烯二酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐、等等。通过适当的碱得到的盐包括碱金属、碱土金属、铵等。

本发明提供药物组合物，包含治疗有效量的式(I)所示化合物或其药学上可接受的立体异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药和药学上可接受的辅料、载体、赋形剂、溶媒或它们的组合。当本发明的化合物以药物的形式施用于哺乳动物例如人时，其可以以化合物本身的形式被给予或者可以以含有例如0.1至99.5％(更优选0.5至90％)活性成分以及药学可接受的载体的药物组合物的形式被给予。

措辞“药学可接受的载体”在本领域中是公认的，包括适于将本发明的化合物施用于哺乳动物的药学可接受的材料、组合物或载体。所述载体包括参与携带主体物质或将其从一个器官或机体的一部分转移到另一个器官或机体的另一部分的液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。各载体在与制剂中的其它成分相容和对患者无害的意义上必须是“可接受的”。可用作药学可接受的载体的材料的一些实例包括：糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素、粉状西黄蓍胶、麦芽、明胶、滑石粉，赋形剂如可可脂和栓剂蜡类；油类，如花生油、棉子油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二醇类，如丙二醇；多元醇类，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲液；和药物制剂中所用的其它无毒的可相容的物质。

在组合物中也可以存在润湿剂、乳化剂和润滑剂如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。

本发明的药物组合物包括适于口服、鼻、局部、口含、舌下、直肠和/或胃肠外施用的那些。制剂可以方便地以单位剂型形式存在并且可以通过药学领域公知的任何方法来制备。可以与载体物质组合来制备单剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗作用的化合物的量。一般而言，以百分之一为单位，该量为约1％至约99％活性成分，优选约5％至约70％，最优选约10至约30％。

“联合”表示在单个剂量单位形式中的固定组合或用于组合施用的部分的药盒，其中本发明公开化合物和组合伴侣(治疗肝纤维的药物)可以在同一时间独立施用或者可以在一定的时间间隔内分别施用，特别是使联合伴侣表现出合作、例如协同作用。如本文所用的术语“药物组合物”表示将一种以上活性成分混合或组合所得到的产品，并且既包括活性成分的固定组合也包括非固定组合。术语“固定联合”表示活性成分如本发明公开化合物和组合伙伴以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定联合”表示活性成分如本发明公开化合物和组合伙伴均作为单独实体同时、共同或无特定时间限制地先后施用于患者。

术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

1、实验方法

8周龄的雄性C57BL/6通过清华大学实验动物中心购置于北京维通利华实验动物技术有限公司。所有小鼠均饲养于清华大学实验动物中心的无特定病原体屏障内，自由饮水和进食。所有动物实验技术均经过清华大学动物伦理委员会生物医学分析中心的批准。

首先，构建不同严重程度的小鼠肝纤维化动物模型，分别被称为早期小鼠肝纤维化动物模型(图1)和晚期小鼠肝纤维化动物模型(图2)，小鼠腹腔注射5mL/kg 10％的CCL4(CCL4：橄榄油＝1:9，v/v)诱导慢性肝损伤，每周两次，共4周(早期)或者10周(晚期)。诱导慢性肝损伤结束后，根据小鼠体重数据将小鼠分为早期肝纤维化REPSOX治疗组、早期药物载体-PBS对照组、晚期肝纤维化REPSOX治疗组、晚期药物载体-PBS对照组，每组小鼠各5只。REPSOX治疗组小鼠腹腔注射20mg/kg的式(I)所示化合物(简称REPSOX)，每2天1次，治疗持续共两周。PBS对照组按照相同的要求注射同等剂量的PBS。两周后，三溴乙醇麻醉小鼠取其肝脏组织。

取部分肝脏组织提取RNA，反转录至cDNA，之后qPCR检测纤维化标志基因col 1a1、Acta2表达情况。部分肝脏组织固于10％的福尔马林溶液内，进行石蜡包埋，切8μl切片之后进行常规苏木素&伊红染色，观察肝脏组织病理学变化。利用天狼猩红染色观察胶原纤维沉积，并利用Image J软件对天狼猩红染色的阳性区域进行定量统计。部分肝脏组织包埋于OCT内，冰冻切片至5微米，进行a-SMA和collagen的免疫荧光染色。

2、实验结果

(1)对早期小鼠肝纤维化动物模型进行治疗，治疗两周后对治疗组和对照组(Vehicle)组的小鼠肝脏进行组织染色，天狼星红染色能够对组织中胶原蛋白的沉积情况进行表征，沉积的胶原蛋白被染成红色。参见图3，通过天狼星红染色，发明人发现REPSOX治疗组的胶原蛋白沉积明显少于对照组，利用Image J软件对天狼星红染色图片的阳性区域进行统计，统计结果发现，与PBS对照组相比，REPSOX治疗组内胶原纤维极显著地减少。H&E染色结果显示，与PBS对照组相比，REPSOX治疗组内胶原纤维沉积明显减少，并且肝脏的整体结构更加有序完整。

(2)在早期小鼠肝纤维化动物模型上使用REPSOX治疗两周之后，参见图4，qPCR结果表明，与PBS对照组相比，REPSOX治疗组的纤维化标志基因col 1a1和Acta2的表达均显著性地下降。由此，证明经过治疗之后，早期肝纤维化得到恢复。

(3)参见图5，其中COL 1指I型胶原蛋白，发生肝纤维化时该细胞外基质在肝内沉积，含量增加，作为肝纤维化严重程度的指标之一；CD31是肝血管化的marker。免疫荧光染色结果表明，REPSOX治疗组具有更少的a-SMA(α-平滑肌肌动蛋白，是肝星形细胞激活的marker)阳性区域，表明被激活的星形细胞减少；与PBS对照组相比，胶原蛋白沉积在REPSOX治疗组内明显减少；另外，肝脏病理性血管新生数量在REPSOX治疗组内也明显减少。综合实验结果表明，REPSOX对于早期肝纤维化的治疗具有明显的效果。

(4)对晚期小鼠肝纤维化动物模型进行治疗，治疗两周后对治疗组和对照组(Vehicle)组的小鼠肝脏进行组织染色。参见图6，染色结果表明，肝纤维化程度更加严重，可达到F3-F4期，被认为是肝纤维化晚期或者肝硬化阶段。使用REPSOX治疗两周后，REPSOX治疗组的肝脏组织表现出更少的胶原蛋白沉积，同时H&E染色结果表明，治疗组表现出更少的胶原沉积，肝脏结构完整性更高。

(5)在晚期小鼠肝纤维化动物模型上使用REPSOX治疗两周之后，参见图7，COL1A1是I型胶原蛋白的基因名；在基因水平表征胶原蛋白的表达量；ACTA为aSMA的基因名，在基因水平表征肝星形细胞的激活程度。qPCR结果表明，与PBS对照组相比，REPSOX治疗组的纤维化标志基因Acta2的表达显著性地下降。

(6)参见图8，免疫荧光染色结果表明，在晚期小鼠肝纤维化动物模型中，REPSOX治疗组具有更少的a-SMA阳性区域，胶原蛋白表达减少，表明被激活的星形细胞减少，胶原沉积减少，证明该化合物对早期和晚期的肝纤维化均有较好的治疗效果。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (8)

1.化合物在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物用于治疗肝纤维化，

所述化合物为式(I)所示的化合物或式(I)所示化合物的立体异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药；

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述化合物适于抑制肝脏组织中的胶原纤维沉淀。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述化合物适于使纤维化标志基因col1a1和Acta2表达量降低。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述化合物适于抑制肝星形细胞的激活。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物的给药剂量为100～150mg/kg人体重。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗门静脉周纤维化、桥接肝纤维化或肝硬化。

7.一种用于治疗肝纤维化的药物组合物，其特征在于，包括：

化合物，所述化合物为式(I)所示的化合物或式(I)所示化合物的立体异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药；以及

药学上可接受的辅料、载体、赋形剂、溶媒或它们的组合；

8.一种用于治疗肝纤维化的药物联合，其特征在于，包括：

化合物，所述化合物为式(I)所示的化合物或式(I)所示化合物的立体异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药；

至少一种用于治疗肝纤维的药物；

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