KR102566549B1

KR102566549B1 - 3성분 프로드럭, 이의 약학적 조성물 및 의약 용도

Info

Publication number: KR102566549B1
Application number: KR1020210074452A
Authority: KR
Inventors: 유형철; 김재선; 임지웅; 이주영; 최광현; 장덕호; 이승용
Original assignee: 제이투에이치바이오텍 (주)
Priority date: 2021-06-08
Filing date: 2021-06-08
Publication date: 2023-08-14
Also published as: KR20220165891A

Abstract

본 개시는 투여 후 모노메틸 푸마레이트 (monomethyl fumarate)를 생성할 수 있는 신규 화합물, 이들을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물, 이들의 의약 용도에 관한 것이다.

Description

3성분 프로드럭, 이의 약학적 조성물 및 의약 용도{Three-component prodrug, pharmaceutical composition and medical use thereof}

본 개시는 건선 (psoriasis), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 아토피 (atopy), 천식 (asthma), 관절염 (arthritis), 염증성 장질환 (inflammatory bowel disease), 루프스 (lupus), 근위축성 측색경화증 (amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅턴병 (Huntington disease), 알츠하이머병 (Alzheimer’s disease), 파킨슨병 (Parkinson’s disease), 황반변성, 수면무호흡증 (Sleep Apnea), 영상적 단독 증후군 (Radiologically Isolated Syndrome), 피부경화증 (Scleroderma), 신경병증 통증, 만성통증, 통풍, 당뇨병성 족부궤양을 포함한 당뇨합병증, 뇌혈관질환, 심혈관질환, 암, 종양 등 다양한 질환의 치료 또는 개선에 유용하다고 알려진 모노메틸 푸마레이트 (monomethyl fumarate)의 신규한 전구체 약물에 관한 것이다. 본 개시는 또한 이러한 새로운 전구체 약물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 개시는 또한 이러한 전구체 약물을 이용하는 의약 용도에 관한 것이다.

디메틸 푸마레이트 (dimethyl fumarate; DMF)는 푸마르산의 메틸 에스테르 화합물로서 시판중인 푸마덤 (Fumaderm, 건선 치료제) 및 텍피데라 (Tecfidera, 다발성 경화증 치료제)의 유효성분이다. 이들 제품은 경구용 의약품이다. 디메틸 푸마레이트는 경구투여 후 모노메틸 푸마레이트 (monomethyl fumarate; MMF)로 빠르게 대사되며, 실제로 약효를 나타내는 물질은 모노메틸 푸마레이트로 알려져 있다. 즉, 디메틸 푸마레이트는 활성대사체인 모노메틸 푸마레이트의 전구체 약물이라고 할 수 있다.

모노메틸 푸마레이트의 생리학적 작용 기전은 현재까지 다양한 측면에서 연구되었으며, 면역조절 기능, 항산화 효과, 신경세포의 보호, 항염증 효과 등을 규명한 여러 연구결과가 보고된 바 있다. (Journal of Neuroinflammation, 2012, 9, 163.; Redox Biology, 2015, 169.; Critical Reviews in Immunology, 2013, 33(4), 307.; Journal of Immunology, 2011, 187(10), 5015.; Perspectives in Medicinal Chemistry, 2015, 7, 1.; Psoriasis:Targets and Therapy, 2015, 5, 9) 이미 상품화된 푸마덤 (Fumaderm) 제품의 경우, 디메틸 푸마레이트, 에틸 수소 푸마레이트 칼슘염, 에틸 수소 푸마레이트 마그네슘염, 및 에틸 수소 아연염 4가지의 푸마르산 에스테르 복합제 (Fumaric acid ester; FAEs)로 개발되었다. 이 약은 중증도의 건선 환자에게 효능이 있는 것으로 확인되었으며, 그 기전은 선택적 면역조절 (Th2 선택적 사이토카인 분비 유도)과 관련된 것으로 보고되었다. (British Journal of Dermatology, 1999, 141, 424.)

디메틸 푸마레이트를 주성분으로 하는 텍피데라 (Tecfidera) 제품은 다발성 경화증 치료제이다. 활성 대사체인 모노메틸 푸마레이트는 일차적으로 Nrf2 (Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2) 경로의 활성화를 통해 다발성 경화증에 대한 치료 효과를 나타내는 것으로 보고되었다. (Brain, 2011, 678.; Human Molecular Genetics, 2017, 26(15), 2864.) 또한 모노메틸 푸마레이트와 같은 항산화성 Nrf2 활성제는 다발성 경화증을 포함하여 알츠하이머병, 헌팅턴병, 파킨슨병, 근위축성 측색경화증 등의 다양한 퇴행성 신경질환에 대한 치료 효과를 나타낸다. (British Journal of Pharmacology, 2017, 174(12), 1750.)

모노메틸 푸마레이트 또는 디메틸 푸마레이트는 상기 질환들 이외에 아토피, 황반변성, 수면 무호흡증 (Sleep Apnea), 다발성 경화증과 관련된 영상적 단독 증후군(Radiologically Isolated Syndrome), 피부경화증(Scleroderma), Systemic Sclerosis-Associated Pulmonary Arterial Hypertension, 암, 종양 등의 치료, 개선 또는 예방에 유용한 것으로 알려져 있다 (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02438137, https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02739542, https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02981082, J Neuroinflammation. 2015; 12: 239., Aging (Albany NY). 2016 Jul; 8(7): 1289-1290., J Invest Dermatol. 2018 Jan;138(1):78-88. doi: 10.1016/j.jid.2017.08.024. Epub 2017 Sep 1., Nature Scientific Reports | 7:41605 | DOI: 10.1038/srep41605, Front Immunol. 2018; 9: 1896. J Investig Allergol Clin Immunol 2018; Vol. 28(3): 182-215).

이상 언급된 건선, 다발성 경화증, 염증성 질환 또는 신경퇴행 질환은 모두 치료가 매우 어렵거나 불가능한 난치성 질환임에도 불구하고, 디메틸 푸마레이트 (DMF) 제품은 건선, 다발성 경화증 등 일부 질환의 치료에 있어서 임상적 효용성이 매우 뛰어난 것으로 인정받고 있다.

상기 질환의 특성상 디메틸 푸마레이트 제제는 최소 1개월 이상의 장기 복용이 불가피하나, 디메일 푸마레이트 제제는 부작용이 심한 것으로 알려져 있다.

예를 들어, 다발성 경화증 치료제로 사용되는 텍피데라는 캡슐 제형 (120mg 및 240mg)으로 상품화되었으며, 초기 용량으로 1일 2회, 1회 120mg을 7일간 투여하고, 이후 권장용량인 1일 2회, 1회 240mg으로 증량하는 용법으로 사용된다. 그러나 장기복용에 따른 부작용, 예를 들면 위장관 장애 (설사, 구역질, 복통, 상복부 통증), 홍조 (flushing), 림프구 감소증 (lymphopenia), 다병소성 백질뇌증 (progressive multifocal leukoencephalopathy) 등이 흔하게 나타난다. 특히 위장관 장애는 20% 이상의 환자군에서, 홍조 현상은 40%의 환자군에서 나타나는 매우 흔한 부작용이다. 또한 상기 부작용 위험 때문에 텍피데라는 음식물과 함께 복용하여 내약성을 향상시키도록 권고되고 있으며, 홍조 또는 위장관 장애가 심각할 경우 1일 2회, 1회 120mg으로 용량을 일시 감소시킬 수 있다. 그러나 이러한 경우에도 1개월 이내 권장용량인 1일 2회, 1회 240mg으로 반드시 증량하여야 한다.

디메틸 푸마레이트의 이와 같은 단점을 보완하기 위해 신규한 화학구조를 갖는 모노메틸 푸마레이드(MMF)의 전구체 약물들이 개발되었다. 이중에서 ALKS8700 (Alkemes사, 미국)은 디록시멜 푸마레이트를 개발하였으며, 2019년 FDA로부터 신약 승인을 받았다 (제품명: VUMERITY, 미국특허 8,669,281). 또한 XP23829 (Xenoport사, 미국)은 현재 임상 2상 시험이 종료된 상태이다 (미국특허 제8,148,414호). 이들 후보물질들은 모두 다발성 경화증 치료제로 개발하기 위한 모노메틸 푸마레이트의 전구체 약물이며, 기존 디메틸 푸마레이트의 심각한 부작용, 특히 위장관 장애를 개선하는 것에 초점을 맞추었다. 이 중에서 XP23829 후보물질은 다발성 경화증 치료를 위한 효능 측면에서 기존 의약품인 디메틸 푸마레이트 제제를 대조약으로 사용할 때 독성 대비 생물학적 동등성(bioequivalent therapy)의 특장점이 충분히 입증되지 않았다. XP23829의 임상 2상에서 실시한 투여 용량은 1일 1회 또는 2회 각각 400mg, 800mg으로서 기존의 디메틸 푸마레이트 제제 대비 고용량의 용법으로 설계되었다.

한편, 2019년에 FDA로부터 신약승인을 받은 디록시멜 푸마레이트(DRF)는 임상 3상에서 위장관 부작용의 발생빈도와 부작용의 발현 정도가 디메틸 푸마레이트 (DMF)와 비교하여 개선되었음을 보고하였으나, 그럼에도 불구하고 전체 투여 환자 중 30% 이상에서 위장관 부작용 {gastrointestinal (GI) treatment-emergent adverse events (TEAEs)}이 관찰되었다. 이 결과는 역시 임상 3상에서 디메틸 푸마레이트 (DMF)를 투여한 환자군에서 발생한 위장관 부작용의 발현비율 40% 대비 10% 감소한 수치이지만, EVOLVE-MS-1 임상 3상 프로그램에서 DRF 투여를 중단한 피험자가 14.9%에 달하며, 약물로 인한 부작용으로 인해 중단한 비율이 6.3%에 달하는 것으로 보고되었다. [Reference: Improving the Gastrointestinal Tolerability of Fumaric Acid Esters: Early Findings on Gastrointestinal Events with Diroximel Fumarate in Patients with Relapsing-Remitting Multiple Sclerosis from the Phase 3, Open-Label EVOLVE-MS-1 Study; Adv Ther, July 17, 2019 (https://doi.org/10.1007/s12325-019-01085-3)]

특히, 디록시멜 푸마레이트는 디메틸 푸마레이트의 가장 흔한 부작용 중 하나인 홍조 (flushing)는 크게 개선되지 않았다. EVOLVE-MS-2는 임상 3상이며, 506명의 재발-완화형 다발성 경화증 (Relapsing-remitting multiple sclerosis, RRMS) 환자를 대상으로 DRF (462 mg twice daily)와 DMF (240 mg twice daily)를 각각 5주 동안 투여하고 부작용의 빈도와 정도를 비교하였다. 두 치료군 모두에 대해 가장 흔하게 보고된 부작용은 홍조 (flushing), 설사 (diarrhea), 오심 (nausea)의 순으로서 DRF군에서 각각 32.8%, 15.4%, 14.6% 보고되었으며, DMF군에서 40.6%, 22.3%, 20.7% 보고되었다. 위장관 부작용과 홍조부작용은 DMF의 치료를 중단하는 가장 중요한 두 가지 원인으로 보고되고 있다. 특히, 상기 임상 3상에서 홍조 (flushing)는 플라시보 투여군에서는 매우 낮은 비율로 나타나는 부작용이므로, DMF든, DRF든 상관없이 30% 이상의 투여환자에게 모두 발현되는 특징을 갖는다. [Reference: https://www.medscape.com/viewarticle/916496]

미국 특허 등록번호 8,669,281 미국 특허 등록번호 8,148,414

따라서 본 개시가 해결하고자 하는 과제는 위장관 부작용, 홍조 등의 부작용이 경감되고 우수한 생리활성 및 약물 동태를 나타내는 모노메틸 푸마레이트의 전구체 약물, 이러한 약물을 포함하는 약학 조성물, 및 이러한 약물의 면역체계 이상, 신경퇴행 질환, 염증성 질환 등 다양한 질환의 치료 또는 개선 의약 용도를 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 개시는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명자들은 다양한 전구체 약물들을 제조 및 평가하였다. 평가한 여러 화합물들 중에서 상기 화합물이 부작용 개선 및 약물 동태 측면에서 매우 우수한 효과를 나타내었고, 이러한 측면 이외에도 전구체 약물로서의 뛰어난 물성 또는 특성을 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

즉, 모노메틸 푸마레이트 (monomethyl fumarate)와 2-아세톡시벤조산이 4-히드록시벤질 알콜 (4-hydroxybenzyl alcohol; HBA)로 연결되어, 특정 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 3성분으로 구성된 전구체 약물이 여러 측면에서 본 발명의 목적에 부합하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 명세서에서 사용된 용어인 "본 발명의 화합물"은 화학식 1의 화합물뿐만 아니라, 이의 클라드레이트 (clathrates), 수화물, 용매화물, 또는 (결정)다형체를 포함하는 의미이다.

본 명세서에서 사용될 경우, 용어 "결정다형 (polymorph)"은 본 발명의 화합물의 고체 결정 형태 또는 그것의 복합체를 의미한다. 화학구조가 같은 화합물의 각각의 결정다형은 서로 다른 물리적, 화학적 그리고/또는 스펙트럼적 특성을 보인다. 물리적 특성 측면의 차이점으로는 안정성 (예를 들어, 열 또는 빛 안정성), 압축성과 밀도 (제제화 및 생산물 제조에 중요함), 그리고 용해율 (생물학적 이용률에 영향을 줄 수 있음)을 포함하나, 이에 한정되지 아니한다. 안정성의 차이는 화학반응성 변화들 (예를 들어, 또 다른 다형으로 구성되었을 때보다 하나의 다형으로 구성되었을 때 더 빠르게 변색이 되는 것 같은 차별적 산화) 또는 기계적인 특징들 (예를 들어, 동역학적으로 선호된 다형체로서 저장된 정제 파편들이 열역학 적으로 더 안정된 다형으로 변환) 또는 둘 다 (하나의 다형의 정제는 높은 습도에서 더 분해에 예민)를 야기한다. 결정다형의 다른 물리적 성질들은 그들의 가공에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 한 결정다형은 또 다른 결정다형에 비하여, 예를 들어, 그것의 형태 또는 입자의 크기 분포에 기인하여 용매화합물을 형성할 가능성이 많을 수 있거나, 여과 또는 세척이 더 어려울 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "용매 화합물"은 비공유 분자간의 힘에 의해 결합된 화학량론적 또는 비-화학량론적인 양의 용매를 포함하는 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 의미한다. 바람직한 용매들은 휘발성이고, 비독성이며, 인간에게 극소량 투여될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "수화물 (hydrate)"은 비공유 분자간의 힘에 의해 결합된 화학량론적 또는 비-화학량론적인 양의 물을 포함하는 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "클라드레이트 (clathrate)"은 게스트 분자(예를 들어, 용매 또는 물)를 가두어 놓은 공간(예를 들어, 채널 (channel))을 포함한 결정 격자의 형태의 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은, 경구 투여 후 생체 내에서 하기 반응식 1과 같이 대사가 된다.

[반응식 1]

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 생체 내에서 에스터라제에 의해 대사가 되어 MMF (monomethyl fumarate), HBA (4-(hydroxymethyl)phenol), 및 2-아세톡시벤조산이 각각 생성된다. 또한 2-아세톡시벤조산 (아스피린)은 역시 에스터라제에 의해 살리실산과 아세트산으로 생체 내 대사된다.

상기 화학식 1의 화합물(3성분 프로드럭)은 MMF의 작용기전인 NRF2/HO-1의 upregulation 효과; HBA의 생리활성인 성상세포 (astrocytes)에서의 항산화효능 효능; 및 2-아세톡시벤조산 및 그 대사체인 살리실산의 소염진통 효능을 나타낼 뿐만 아니라, 후술하는 바와 같이 홍조 완화 효능이 동시에 발현될 수 있다.

본 발명자들은 다양한 3성분의 프로드럭을 설계, 합성 및 평가하였다. 일례로 하기 화학식 2로 표시되는 화합물은 화학식 1과 동일하게 HBA를 링커로 하지만 MMF와 2-아세톡시벤조산의 위치가 화학식 1의 화합물과 다르다.

[화학식 2]

상기 화학식 2의 화합물은 마우스 (mouse), 랫트 (rat), 및 도그 (dog)를 이용한 in vivo 약동학 시험에서 MMF, 2-아세톡시벤조산, 및 그 대사체인 살리실산이 충분한 양이 검출되지 않음이 확인되었다. 즉, 화학식 1과 매우 유사한 구조를 가지지만, 그 대사산물에는 큰 차이가 있었다.

화학식 1 및 2의 화합물 공히 4개의 에스테르 결합을 갖고 있기 때문에 생체내에서 에스터라제에 의해 경쟁적으로 가수분해가 일어날 수 있는데, 본 발명자들이 확인한 결과 화학 구조의 미세한 차이에 따라 대사산물이 달라진다. 예를 들어, 화학식 2의 화합물은 생체 내 벤질 에스테르가 화학식 1의 화합물 대비 상대적으로 안정한 것으로 확인되었으며, MMF 작용기의 메틸 에스테르의 가수분해가 경쟁적으로 더 빠르게 나타난다. 이를 상기 반응식 2에 나타내었다.

[반응식 2]

상기 반응식 2에서 두번째 경로는 MMF의 메틸 에스테르가 담체인 HBA의 에스테르 결합보다 먼저 혹은 더 경쟁적으로 가수분해되며, 결과적으로 체내 대사를 통해 생리활성에 필요한 만큼 충분한 MMF의 혈중 농도를 기대할 수 없는 것으로 예상된다.

또한, 본 발명자들은 상기 화학식 1 및 2의 다양한 유도체를 설계하여 합성 및 평가를 진행하였다.

[화학식 3]

[화학식 4]

상기 화학식 3 및 4에서 링커는 각각 탄소수 1 내지 4의 알킬; 할로겐, 메틸, 디메틸, 히드록시, 아미노기 등의 치환기가 치환된 알킬; 아릴; 할로겐, 알킬, 히드록시, 아미노기 등의 치환기가 치환된 아릴; 헤테로아릴; 할로겐, 알킬, 히드록시, 아미노기 등의 치환기가 치환된 헤테로아릴; 탄소수 2 내지 4의 알케닐; 탄소수 2 내지 4의 알키닐; 할로겐, 메틸, 디메틸, 히드록시, 아미노기 등의 치환기가 치환된 알케닐 또는 알키닐 등의 다양한 조합을 생각해 볼 수 있다.

본 발명자들은 상기 화학식 3 및 4의 화합물들 중에서 물리화학적 특성과 보관 안정성이 우수한 것들에 대해 랫트 (rat)에서의 경구흡수율 및 혈중 대사체를 평가하였다. 상기 화학식 3 및 4의 화합물들의 경우 분자량과 지용성이 증가하면서 경구흡수율이 낮은 것이 많았다. 또, 위장의 pH 조건하에서 에스테르 작용기의 가수분해가 선행되는 경우도 많았고, 경구 흡수가 되더라도 6개나 되는 에스테르의 경쟁적 가수분해 반응에 의해 바람직하지 않은 다양한 대사산물이 형성되었다. 결과적으로 상기 화학식 1과 같이 완전한 형태로 생체 내 가수분해되는 전구체 약물을 확인할 수 없었다.

이에 본 발명자들은 상기 화학식 1의 3성분 프로드럭을 가장 완전한 형태의 화합물로서 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은, 예를 들어, 다음과 같은 경로로 합성될 수 있다.

[반응식 3]

이 제조 방법은 하나의 일례이며, 상기 화학식 1로 표시되는 상기 반응식 3의 최종생성물은 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 다양한 방법에 의해 제조 가능하다.

본 발명자들은 모노메틸 푸마레이트 화합물의 화학 구조를 변형하여, 경구 투여시의 약효 발현에 충분한 경구흡수도 (oral bioavailability)을 가지며, 바람직한 혈중 약물동태(pharmacokinetic profile), 물리화학적 성질 등을 가지는 새로운 구조의 신규 화합물을 창안, 제조하였다. 이렇게 제조된 신규 화합물을 경구 투여한 후, 혈중 노출되는 모노메틸 푸마레이트의 농도는 궁극적으로 다양한 질환의 치료 또는 개선을 위한 약물의 효능과 비례한다. 따라서, 모노메틸 푸마레이트를 정맥 투여한 후 혈중 노출된 모노메틸 푸마레이트의 농도를 기준으로 하여, 본 발명에 따른 신규 화합물을 경구 투여한 후 대사 과정을 거쳐 혈중 노출된 모노메틸 푸마레이트 물질의 농도를 비교함으로써 정맥 투여 및 경구 투여의 용량을 비례적으로 적용할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 3성분 프로드럭의 다른 구성요소는 2-아세톡시벤조산으로서 제품명 아스피린 (Aspirin)으로 시판되는 성분과 동일하다. 2-아세톡시벤조산은 항염증 효능 및 항산화 효능을 갖는 소염진통제이다. 다발성 경화증 환자가 아스피린을 복용 시 운동능력이 향상되고, 운동으로 인한 체온 상승을 경감할 수 있다는 임상결과가 보고되어 있다. [Reference: Aspirin is an effective pretreatment for exercise in multiple sclerosis: A double-blind randomized controlled pilot trial, Multiple Sclerosis Journal, Volume: 24 issue: 11, page(s): 1511-1513] 한편, 실험용 자가면역질환 마우스 모델(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE mice model)에서 아스피린이 Regulatory T cells의 보호작용을 통해 다발성 경화증을 개선할 수 있음이 보고되었다. [Reference: Aspirin ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis through interleukin-11-mediated protection of regulatory T cells, Science Signaling 27 Nov 2018: Vol. 11, Issue 558,] 또한 아스피린은 DMF로 인한 홍조 부작용을 경감하는 것으로도 알려져 있으며, DMF 및 DRF 공히 홍조 부작용의 경감을 위해 아스피린과의 병용을 권장하고 있다.

본 발명의 3성분 프로드럭의 또 다른 구성요소는 링커(linker)로 사용한 4-하이드록시벤질 알코올 (4-Hydroxybenzyl alcohol; HBA)이다. HBA는 약초 식물 등에 존재하는 천연물질로서 Gastrodigenin으로 불리기도 하며, 예를 들어, 천마 (Gastrodia elata)의 지표성분으로도 알려져 있다. HBA는 혈관-뇌장벽 (Blood-Brain Barrier)을 투과하며, 항산화 작용에 의해 랫트 (rat)의 뇌 손상을 개선하는 등의 생리활성이 보고되어 있다. [Reference: 4-hydroxybenzyl alcohol ameliorates cerebral injury in rats by antioxidant action. Neurochem Res. 2011 Feb;36(2):339-46.] 또한 HBA는 뇌 허혈의 실험쥐 모델에서 Nrf2와 PDI (protein disulphide isomerase)를 활성화시켜 뇌 손상과 행동장애를 막는 효능이 보고되어 있다. [Reference: p-hydroxybenzyl alcohol prevents brain injury and behavioral impairment by activating Nrf2, PDI, and neurotrophic factor genes in a rat model of brain ischemia, Molecules and Cells, March 2011, Volume 31, Issue 3, pp 209-215]

본 개시의 다른 양태는 상기 화학식 1의 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

상기 약학적으로 허용 가능한 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체가 사용될 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스, 글리콜 등을 포함할 수 있다. 약학 조성물은 또한 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려진 문헌을 참고할 수 있다.

본 개시의 일 양태는 또한 활성 성분으로 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 포함하는, 건선 (psoriasis), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 아토피 (Atopy), 천식 (asthma), 관절염 (arthritis), 염증성 장질환 (inflammatory bowel disease), 루프스 (lupus), 근위축성 측색경화증 (amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅턴병 (Huntington disease), 알츠하이머병 (Alzheimer’s disease), 파킨슨병 (Parkinson’s disease), 황반변성, 수면 무호흡증 (Sleep Apnea), 영상적 단독 증후군 (Radiologically Isolated Syndrome), 피부경화증 (Scleroderma), 신경병증 통증, 만성통증, 통풍, 당뇨병성 족부궤양을 포함한 당뇨합병증, 뇌혈관질환, 심혈관질환, 암 또는 종양의 치료 또는 개선용 약학 조성물을 제공한다. 즉, 본 발명은 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의, 상기 질환의 치료 또는 개선용 의약 용도를 제공한다. 본 발명의 화합물은 MMF의 효능을 극대화하며, 그 부작용을 최소화할 수 있다. 상기 뇌혈관질환 또는 심혈관질환으로는 예를 들어, 동맥경화증, 폐고혈압, 당뇨병성 심근증, 뇌졸중 등이 있다.

본 개시의 다른 양태는 또한 상기 화학식 1의 화합물의 치료적으로 유효한 양을 앞서 언급된 질환의 치료 또는 개선이 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 건선, 아토피, 황반 변성, 다발성 경화증, 천식, 관절염, 염증성 장질환, 루프스, 근위축성 측색경화증, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 수면 무호흡증 (Sleep Apnea), 영상적 단독 증후군 (Radiologically Isolated Syndrome), 피부경화증 (Scleroderma), 신경병증 통증, 만성통증, 통풍, 당뇨병성 족부궤양을 포함한 당뇨합병증, 뇌혈관질환, 심혈관질환, 암 또는 종양을 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 상기 개체는 인간이다. 일 양태에서, 상기 치료는 예방 치료 (preventative treatment)이다. 또 다른 양태에서, 상기 치료는 완화 치료 (palliative treatment)이다. 또 다른 양태에서, 상기 치료는 회복 치료 (restorative treatment)이다.

본 명세서에서 사용된 "유효한 양 또는 유효량"은 앞서 언급한 질환 또는 이러한 질환으로 나타나는 증상을 늦추거나 또는 최소화하거나; 또는 이러한 질환의 치료 또는 관리에서 치료상 이점을 제공하기에 충분한 본 발명의 화합물의 양을 말한다.

본 발명의 약학 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 투여 경로로도 투여할 수 있으며, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 다만, 본 발명의 화합물들이 뛰어난 경구 흡수율을 보여준다는 측면에서 경구 투여 경로가 더 바람직하다.

비경구적인 투여방법으로는 예를 들어, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 본 발명의 약학 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자 (prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수도 있다.

본 발명의 약학 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨 등을 포함하는 당류; 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분 등을 포함하는 전분류; 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈, 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 본 개시의 약학 제형에는 또한 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 결합제가 이용될 수 있으며, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제들도 첨가될 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 위장관 자극을 완화하기 위하여 약물이 위내에서 방출하지 않고 장관을 통과할 때 방출되도록 의도된 장용 코팅 (enteric coating) 또는 마이크로캡슐화 할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 총 투여량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 질환의 증상에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 활성 성분의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01 ㎍ 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 1 mg 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 본 발명의 활성 성분의 용량은 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이, 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여, 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자가 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 다른 치료제와 병용하여 투여되는 경우, 본 발명의 조성물과 다른 치료제는 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 이때 다른 치료제라 함은 면역체계 이상, 신경퇴행 질환, 염증성 질환 등 다양한 질환의 치료 또는 개선 효과를 갖는 것으로 이미 알려져 있는 물질일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물이 다른 치료제와 병용하여 투여될 경우, 본 발명의 조성물과 다른 치료제는 각각 별도의 용기로 분리시켜 제형화 되거나, 같은 제형에서 함께 복합 제형화 될 수 있다.

본 발명에서 제시된 화합물을 인체에 투여하기 위한 예시적 제제로는 장용 코팅 정제가 있다. 이러한 정제는 본 발명이 속한 분야에 있어 잘 알려진 방법을 이용하여 제조될 수 있으며, 구체적으로 하기 표 1와 같은 성분으로 제조될 수 있다.

(단위: 중량 %)		조성물 1	조성물 2
코팅 전 정제(나정)	약효성분(화학식 1 화합물)	10	12
	만니톨	55	48
	히드록시프로필 셀룰로오스	20	25
	나트륨 스테아릴 푸마레이트	1	1
분리막	폴리비닐피롤리돈	2	2
장용코팅	히프로멜로스 프탈레이트	10.3	10.3
	디부틸세바케이트	1.2	1.2
	티타늄 디옥사이드	0.5	0.5

본 발명은 면역체계 이상, 신경퇴행 질환, 염증성 질환 등 다양한 질환의 치료 또는 개선에 효과적인 전구체 화합물, 이들을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물, 이들의 의약 용도, 및 이들을 치료 또는 예방이 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 화합물은 의약품의 활성 성분으로, 물리화학적 특성 등 여러 측면에서 다양한 장점을 가질 뿐만 아니라, 특히 경구 투여 후 생분해되어 체내에 노출되는 3성분의 생체이용률, 약물동태 등이 우수하다. 또한, 본 발명에 따른 화합물은 부작용 측면에서 더욱 더 우수한 효과를 발휘한다.

도 1은 자가면역 뇌척수염 유도 마우스 (EAE mouse, experimental autoimmune encephalomyelitis)를 사용한 다발성 경화증 질환모델에서 각 시험군별 림프절의 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포 침투율 평가 결과이다.
도 2는 자가면역 뇌척수염 유도 마우스 (EAE mouse, experimental autoimmune encephalomyelitis)를 사용한 다발성 경화증 질환모델에서 각 시험군별 중추신경계의 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포 침투율 평가 결과이다.
도 3은 자가면역 뇌척수염 유도 마우스 (EAE mouse, experimental autoimmune encephalomyelitis)를 사용한 다발성 경화증 질환모델에서 각 시험군별 림프절의 Th1 세포 및 Th17 세포 침투율 평가 결과이다.
도 4는 약물투여에 의한 피부 홍조 부작용을 측정한 결과이며, 표준시험법인 마우스 모델에서의 혈중 프로스타글란딘 D2 (PGD2)의 농도분석 결과이다.

본 발명에 대해서는 하기의 실시예에 기초하여 보다 상세하게 설명될 것이나, 이는 본 발명의 권리범위를 제한하려는 것이 아니다. 또한, 당업계에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 취지를 해하지 않는 범위 내에서 본 발명에 대해 다양한 변형 및 수정을 가할 수 있을 것이다.

실시예 1: 화학식 1의 화합물 합성

단계 1: 4-((tert-부틸다이메틸실릴옥시)메틸)페놀의 합성 (1)

4-하이드록시 벤질 알코올 1.0g을 디메틸포름아마이드 5ml에 용해시고 tert-부틸메틸실릴 클로라이드 1.15g (0.95 당량)을 추가로 용해시켰다. 그 후 얼음수조를 이용하여 온도를 낮춰 교반하였다. 약 30분 후, 디메틸포름아마이드 2.5ml와 트리에틸아민 1.12ml (1 당량)의 혼합 용액을 낮은 온도 하에서 서서히 적가하였다. 상온에서 16시간 교반 후 30ml의 물과 20ml의 메틸 삼차뷰틸에테르를 이용하여 유기층을 추출하였다. 추출된 유기층을 10ml의 소금물, 염화암모늄 수용액 10ml 각각으로 세척하였다. 그 뒤 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 여과한 후, 여액을 감압 농축하여 갈색 유액 화합물을 얻었다.

¹H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 9.271 (s, 1H), 7.80 (d, 2H), 6.70 (d, 2H), 4.558 (s, 2H), 0.868 (s, 9H), 0.038 (s, 6H)

Properties: Brown Oil / Yield ≥90%

단계 2: 4-((tert-부틸다이메틸실릴옥시)메틸)페닐 메틸 푸마레이트 (2)의 합성

4-((tert-부틸다이메틸실릴옥시)메틸)페놀 (1) 1g을 10ml의 디클로로메탄 용액에 넣고 추가로 모노메틸 푸마레이트 0.54g (1 당량) 및 4-디메틸아미노피리딘 0.025g (0.05 당량)을 넣어 현탁액 상태로 상온 교반하였다. 약 30분 후, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 염산염 1.6g (2 당량)을 추가한 뒤 교반하였다. 현탁액이던 반응액이 맑은 용액으로 변화된 후 감압증류를 통해 디클로로메탄을 제거하였다. 이후 에틸 아세테이트 20 ml와 물 20 ml를 사용하여 추출하고 얻어진 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 여과한 뒤, 감압농축하여 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물을 실리카겔 컬럼을 통하여 (에틸아세테이트:헵탄 = 1:4) 분리 정제 후 감압농축하여 갈색 유액 화합물을 얻었다.

¹H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.328 (d, 2H), 7.144 (d, 2H), 6.936 (s, 2H), 4.677 (s, 2H), 3.742 (s, 3H), 0.863 (s, 9H), 0.043 (s, 6H)

Properties: Brown Oil / Yield 65%

단계 3: 4-(하이트록시메틸)페닐 메틸 푸마레이트 (3)의 합성

4-((tert-부틸다이메틸실릴옥시)메틸)페닐 메틸 푸마레이트 (2) 1g을 5ml의 디메틸설폭사이드와 1ml의 물 혼합용액에 넣고 150℃로 환류 교반하였다. 박막 크로마토그래피를 활용하여 (2)번 화합물이 모두 소진되는지 확인하였다. (2)번 화합물이 모두 소진되었을 때 물 30ml, 에틸 아세테이트 6ml, 및 메틸 삼차뷰틸에테르 12ml를 이용하여 추출하여 유기층을 분리하였다. 이후 10ml의 소금물, 염화암모늄 수용액 10ml로 각각 세척한 뒤 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 여과한 후, 여액을 감압 농축하여 하얀 고체를 얻었다. 수득된 고체를 2ml의 메틸 삼차뷰틸에테르에 녹인 뒤 20ml의 헵탄을 가하여 재결정된 고체를 필터 여과하여 수득하였다.

¹H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.420 (d, 2H), 7.21 (d, 2H), 7.023 (s, 2H), 5.296 (t, 1H), 4.546 (d, 2H), 3.83 (s, 3H)

Properties: White powder / Yield 85%

단계 4: 4-((아세톡시벤조일록시)메틸)페닐 메틸 푸마레이트 (화학식 1)의 합성

4-(하이드록시메틸)페닐 메틸 푸마레이트 (3) 1g을 10ml의 디클로로메탄 용액에 녹인 뒤 0.65ml (1.1 당량)의 트리에틸아민을 추가하고 얼음수조를 이용하여 온도를 낮춰 교반하였다. 약 30분 후, 디클로로메탄 10ml에 2-(클로로카보닐)페닐 아세테이트 0.84g (1 당량)을 용해시킨 뒤 (3) 화합물 수용액에 서서히 적가하였다. 약 1시간 뒤, 얼음수조를 제거하고 상온에서 16시간 교반하였다. 디클로로메탄을 감압증류하여 제거한 뒤 에틸 아세테이트 10ml 및 물 10ml를 이용하여 추출하였다. 추출된 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 여과한 후, 여액을 감압 농축하여 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물을 실리카겔 컬럼을 통하여 (에틸 아세테이트:메틸삼차뷰틸에터:헵탄 = 1:2:7) 분리 정제 후 감압농축하여 하얀색 고체 화합물을 얻었다.

¹H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.992 (d, 1H), 7.691 (t, 1H), 7.54 (d, 2H), 7.423 (t, 2H), 7.227-7.288 (m, 3H), 6.993 (s, 2H), 5.316 (s, 2H), 3.79 (s, 3H), 2.092 (s, 3H)

Properties: White powder / Yield 70%

실험예 1: Beagle Dog 이용 약동학적 평가

상기 실시예 1의 화합물에 대한 약물동태 시험을 다음과 같이 실시하였다. 시험물질은 실시예 1에서 제조한 화학식 1의 화합물, 그리고 대조물질은 텍피데라 제품의 주성분인 디메틸 푸마레이트 (시그마알드리치, 카달로그 번호 50744)를 사용하였다. 상기 시험물질 및 대조물질을 비글 (Beagle)에 단회 경구투여한 후 대사과정에 의해 혈중 방출되는 모노메틸 푸마레이트 약물의 시간별 농도를 추적 분석, 본 발명의 화합물의 효능을 입증하였다.

한편, 또 하나의 대조군으로서 디메틸 푸마레이트와 아스피린을 병용 투여하여 화학식 1의 투여군 대비 혈중 MMF, 아스피린 및 살리실산의 혈중 농도를 비교하였다.

본 실험의 투여군은 하기 표 2와 같았다.

투여군 (마리수)	물질	투여량	비히클
G1 (n =3)	화학식 1의 화합물	16.6 mg/kg	10% NMP in corn oil
G2 (n =3)	디메틸 푸마레이트	6.0 mg/kg	10% NMP in corn oil
G3 (n =3)	디메틸 푸마레이트, 아스피린 (병용투여)	6.0 mg/kg, 7.5 mg/kg	10% NMP in corn oil

시험물질 및 대조물질은 각각 동일한 방법으로 조제한 후 비글견에 0.0417 mmol/kg 용량으로 투여하였으며, 정해진 시간에 채혈한 후 혈장을 분리하였다. 약물의 분석은 HPLC (XBridge column C₁₈, Waters, mobile phase 0.1% formic acid:acetonitrile (30:70, %/%)) 및 MS/MS (ESI positive, MRM)를 이용하여 실시하였다. 비글견 공혈장과 각각의 상용 표준용액을 9:1 비율로 혼합하여 5, 50, 100, 500, 1000 및 5,000 ng/ml의 농도로 조제, 검량을 하였다. 또한 QC 시료의 조제는 비글견 공혈장과 QC용 표준용액을 9:1 비율로 혼합하여, 100, 750 및 2,500 ng/ml 농도로 조제하였다. 전처리 방법은 혈장시료 100 μl를 원심분리용 튜브로 옮기고, 내부표준용액 10 μl와 메탄올 300 μl를 첨가한 후 약 30초간 혼합하였다. 튜브를 3,000 x g (4℃)에서 약 5분간 원심분리하고, 상층액을 취하여 LC 바이알로 옮긴 후 기기에 주입하였다. 그리고 미리 검증된 분석법을 적용하여 비글견 혈장 중 유효성분, 즉 모노메틸 푸마레이트의 농도를 정량하였다. 약물 동태 파라미터는 WinNonlin 5.2 (Pharsight, USA) 프로그램을 사용하였고, Noncompartment modeling (best fit)으로 AUC_0-t, AUC_0-∞, C_max, T_max, t_1/2를 계산하였다. 약물동태 파라미터 결과는 평균 (Mean)과 표준편차 (SD)로 표기하였고, SPSS 프로그램 (Statistical Package for the Social Sciences, 10.0K, USA)을 사용하여 통계 처리하였다.

시험 결과, 대조물질 및 시험물질의 경구 투여 후 생체이용률을 정리하면 다음의 표 3 및 4와 같았다.

G1과 G2군에서 혈중 MMF의 농도 비교

구분		AUC_0-24 (hr*ng/ml)	Cmax (ng/ml)	상대흡수도 (디메틸 푸마레이트 대비, %)	투여경로
대조물질 (G2)	디메틸 푸마레이트	7,929±1,297	1,605±586	-	경구
시험물질 (G1)	실시예 1	9,568±1,519	2,274±274	120.7%	경구

G1과 G3(병용투여)군에서 혈중 MMF의 농도 비교

구분		AUC_0-24 (hr*ng/ml)	Cmax (ng/ml)	상대흡수도 (병용투여 대비, %)	투여경로
병용투여 (G3)	디메틸 푸마레이트 + 아스피린	7,367±2,109	2,018±334	-	경구
시험물질 (G1)	실시예 1	9,568±1,519	2,274±274	129.9%	경구

대표적으로 실시예 1 화합물 (G1)의 경우, 혈중 MMF를 기준으로 평균 AUC_t는 9,568 hr*ng/ml, 평균 AUC_i는 11,009 hr*ng/ml, 평균 C_max는 2,274 ng/ml, 평균 T_max는 1.17시간, 평균 t_1/2은 7.62시간, 디메틸 푸마레이트 (G2) 대비 상대흡수도는 120.7%이었다. 한편, 실시예 1 화합물 (G1)의 경우, 디메틸 푸마레이트+아스피린 병용투여 (G3) 대비하여 아스피린의 상대흡수도는 111.4%, 살리실산의 상대흡수도는 108.8%로 나타났다 (AUC_0-24 기준). 실시예 1 화합물 경구투여군의 시간별 모노메틸 푸마레이트 혈중 농도 (ng/mL)를 대조물질인 디메틸 푸마레이트 투여군와 비교하여 나타내면 표 5와 같으며, 실시예 1 화합물 경구투여군의 모노메틸 푸마레이트, 아스피린 및 살리실산의 혈중 농도 경향을 나타내면 표 6과 같다.

(ng/mL)	실시예 1 화합물		(ng/mL)	디메틸 푸마레이트
time (h)	mean	SD	time (h)	mean	SD
0	0	0	0	0	0
0.25	1171	1103	0.25	1399	937
0.5	1868	743	0.5	1127	445
1	1305	1183	1	1124	729
2	1246	698	2	987	175
4	782	121	4	862	182
6	452	345	6	382	199
8	389	87	8	194	103
12	248	94	12	197	32
24	103	86	24	83	53

AUC_0-12	9568	1519	AUC_0-12	7929	1297
AUC_inf	11009	3111	AUC_inf	9434	2555
Cmax	2274	274	Cmax	1605	586
Tmax	1.17	0.76	Tmax	1.50	2.17
T1/2	7.62	3.79	T1/2	8.15	5.32

(ng/mL)	모노메틸푸마레이트		아스피린		살리실산
time (h)	mean	SD	mean	SD	mean	SD
0	0	0	0	0	0	0
0.25	1171	1103	302	160	1390	586
0.5	1868	743	460	124	2396	214
1	1305	1183	380	234	2551	927
2	1246	698	534	88	3693	507
4	782	121	577	26	4263	231
6	452	345	360	39	2958	187
8	389	87	241	11	2038	301
12	248	94	123	32	1212	397
24	103	86	31	34	195	296

AUC_0-24	9568	1519	4869	936	36674	9386
AUC_inf	11009	3111	5234	1427	38771	12349
Cmax	2274	274	586	42	4263	231
Tmax	1.17	0.76	3.33	1.15	4.00	0.00
T1/2	7.62	3.79	5.47	3.57	2.25	1.16

병용대비 상대흡수	129.9%		111.4%		108.8%

실험예 2: 다발성 경화증 동물모델 (EAE) 유효성 평가

본 발명에 따른 실시예 1의 화합물을 실험적 자가면역 뇌척수염의 실험용 마우스 (EAE mice, experimental autoimmune encephalomyelitis)를 사용하여 증상 및 약효를 평가하였다.

(1) EAE 질환 유발 및 약물 투여

구체적으로 EAE 실험은 6-8주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하였다. EAE 유발은 다음과 같이 수행하였다. 미엘린 희소돌기 아교세포 당단백 35-55 (MOG, myelin oligodendrocyte glycoprotein)를 준비하여 결핵균 (Mycobacterium Tuberculosis 10 mg/ml H37RA; Difco, 미국)이 포함된 complete Freund's adjuvant (CFA; Difco, 미국)와 혼합하고, 이 에멀전을 마우스에 피하로 주사하였다. 동시에 백일해독소 (PTX, pertussis toxin, List Biological Lab, 미국) 250 ng을 복강으로 day 0 및 day 2에 각각 주사하였다. 시험물질은 2.5% DMSO가 포함된 옥수수 기름에 현탁하여 day 2부터 종료일 (21일차)까지 하루에 두 번 경구투여하였다. (n = 10) 각 군에 대한 투여물질에 대한 정리는 아래 표 7에 정리하였다.

투여군	군 종류	시험물질	투여량	비히클
G1	정상군	-	-	-
G2	음성대조군	vehicle	-	DMSO 2.5%, corn oil 97.5%
G3	양성대조군 1	디메틸 푸마레이트	30 mg/kg	DMSO 2.5%, corn oil 97.5%
G4	양성대조군 2	디메틸 푸마레이트	60 mg/kg,	DMSO 2.5%, corn oil 97.5%
G5	시험군(저용량)	화학식 1의 화합물	82.8 mg/kg	DMSO 2.5%, corn oil 97.5%
G6	시험군(고용량)	화학식 1의 화합물	165.6 mg/kg	DMSO 2.5%, corn oil 97.5%
G7	양성대조군 3	디메틸 푸마레이트 + 아스피린	60 mg/kg+ 75 mg/kg	DMSO 2.5%, corn oil 97.5%

(2) 임상증상의 개선 효능

MOG 펩타이드에 의해 유도된 EAE 동물모델의 임상증상의 척도 (EAE score)를 매일 몸무게와 함께 하기 표 8에 따라 10단계로 평가하여 임상점수 0점~5점으로 표현하였다.

임상점수	임상증상
0.0	운동 기능의 명백한 변화 없음
0.5	꼬리 끝이 처지거나 힘이 없음
1.0	꼬리 전체 쳐져있음
1.5	꼬리 전체 쳐져있고 뒷다리 일부 이상
2.0	꼬리 전체 쳐져있고 뒷다리 약함
2.5	꼬리 전체 쳐져있고 뒷다리를 질질끔
3.0	꼬리 전체 쳐져있고 뒷다리가 마비됨
3.5	꼬리 전체 쳐져있고 뒷다리가 완전히 마비됨
4.0	꼬리 전체 쳐져있고 뒷다리가 완전히 마비되며 앞다리 일부 마비
4.5	뒷다리가 완전히 마비되며 앞다리 일부 마비, 케이지에서 움직임 없음.
5.0	마비로 인해 폐사

실험결과를 하기 표 9에 나타내었다.

	임상점수 (21일차)	CD4 T 세포 (%)	CD8 T 세포 (%)	Th1 세포 (%)	Th17 세포 (%)
정상군	0.0	0.8	0.9	3.5	4.6
vehicle 군	3.2	23.2	16.0	15.4	12.4
DMF 30 mpk	2.3	13.1	8.8	10.2	10.1
DMF 60 mpk	1.3	13.8	8.5	7.9	6.3
화학식 1 화합물 82.8 mpk	2.0	11.2	7.8	8.8	8.8
화학식 1 화합물 165.6 mpk	1.5	6.5	4.7	6.4	7.5
DMF 60 mpk + 아스피린 75 mpk	1.1	5.8	4.1	5.4	4.8

실험 결과, MOG를 이용한 EAE 유도는 10일차부터 증상이 나타났으며, 약물이 투여되지 않은 음성대조군 (G2)의 임상점수는 3 정도로 나타난 바 질환유도는 적절하였다. 양성대조군에 사용된 대조물질인 디메틸 푸마레이트는 저농도 (G3), 고농도 (G4)에서 각각 유의적으로 질환의 심각성을 낮추었다.

화학식 1의 화합물을 투여한 시험군에서 역시 저용량 (G5) 및 고용량 (G6) 모두 유의적인 임상점수 개선 효과가 나타났고, 특히 저용량보다 고용량에서 임상점수 개선이 뛰어난 바 용량상관성을 나타내었다. 그리고 화학식 1 화합물의 저용량군 (G5)은 동일 몰비 투여군인 디메틸 푸마레이트 저용량군 (G3)과 유사한 수준의 약효를 보였고, 화학식 1 화합물의 고용량군 (G6) 역시 동일 몰비 투여군인 디메틸 푸마레이트 고용량군 (G4)와 유사한 수준의 약효를 보였다. 이것은 아스피린 병용투여군 (G7)에 있어서도 유사한 수준의 결과로 확인되었다.

(3) 면역세포의 침투 억제 효능

다발성 경화증은 특정 면역세포의 신경조직 공격이 질환 발병의 근본적인 원인으로 알려져 있다. 예를 들면, 림프절 (lymph node, LN) 또는 중추신경계 (central nervous system, CNS)에서 CD4 또는 CD8 발현 T 세포와, Th1 또는 Th17 세포의 침투율 증가는 매우 중요한 질환 악화요인으로 알려져 있다. 이에 본 연구자들은 EAE 동물모델의 각 시험군별로 항원 주입 3주 뒤 마우스에서 림프절 (lymph node), 뇌와 척수 (CNS)를 적출하여 유세포분석기 (flow cytometry analyzer)를 이용, 상기 면역세포수의 비율 (%)를 계산하였다.

그 결과를 도 1 (림프절, CD4 T 세포 및 CD8 T 세포 침투율), 도 2 (중추신경계, CD4 T 세포 및 CD8 T 세포 침투율) 및 도 3 (림프절, Th1 세포 및 Th17 세포 침투율)에 나타내었다.

도 1에서와 같이, 화학식 1의 화합물의 저용량 투여군 (G5) 및 고용량 투여군 (G6) 모두 림프절에서의 CD4 및 CD8 T 세포의 침투율이 질환유발군 (G2) 대비 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.

또한 도 2에서와 같이, 화학식 1의 화합물의 저용량 투여군 (G5) 및 고용량 투여군 (G6) 모두 중추신경계에서의 CD4 및 CD8 T 세포의 침투율이 질환유발군 (G2) 대비 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.

또, 도 3에서와 같이, 화학식 1의 화합물의 저용량 투여군 (G5) 및 고용량 투여군 (G6) 모두 림프절에서의 Th1 및 Th17 세포의 침투율이 질환유발군 (G2) 대비 감소하는 것을 확인하였다.

실험예 3: 독성 평가

디메틸 푸마레이트 처방시 나타나는 일반적인 부작용인 피부 홍조 현상 (flushing)이 화학식 1 화합물을 투여할 경우 완화되는지 여부를 평가하였다. 홍조 현상은 혈중 프로스타글란딘 D2 (prostaglandin D2, PGD2) 농도 분석을 통해 확인하였다. PGD2는 홍조 현상과 밀접한 관련을 갖는 생체유래 물질로, 혈중 PGD2의 농도분석은 약물의 부작용을 예측할 수 있는 표준 시험법으로 알려져 있다. (The journal of pharmacology and experimental therapeutics, 2008, 327(3), 665.)

시험방법은 C57BL6 수컷 마우스를 시험동물로 사용하여 3개 군으로 나누어 실험을 진행하였다. (G1: vehicle, G2: 디메틸 푸마레이트 60 mg/kg, G3: 화학식 1의 화합물 165.6 mg/kg, 이상 n=3) 각 시험군에서 시험물질은 10% NMP, 90% corn oil의 부형제를 사용하였고, 단회 경구투여하고 5분 후에 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액에 존재하는 PGD2는 Elisa kit (#CSB-E14022m, CUSABIO)를 이용하여 측정하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 약물 투여 5분 후 디메틸 푸마레이트 투여군 (140.74±29.5 pg/ml)에 비해 화학식 1의 화합물 투여군 (32.95±13.1 pg/ml)은 76.6% 차이로 유의적으로 감소하였다.

결론적으로, 디메틸 푸마레이트에 의해 유발되는 홍조 부작용의 생체표지자인 혈중 PGD2 증가현상이 화학식 1의 화합물 투여군에서는 상당한 수준으로 감소되어, 임상적으로 독성 완화 가능성이 크다고 판단되었다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물.
[화학식 1]
삭제
활성 성분으로 제1항의 화합물을 포함하는, 건선, 아토피, 황반 변성, 다발성 경화증, 천식, 관절염, 염증성 장질환, 루프스, 근위축성 측색경화증, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 수면 무호흡증 (Sleep Apnea), 영상적 단독 증후군 (Radiologically Isolated Syndrome), 피부경화증 (Scleroderma), 신경병증 통증, 만성통증, 통풍, 당뇨병성 족부궤양을 포함한 당뇨합병증, 뇌혈관질환, 심혈관질환, 암 또는 종양의 치료 또는 개선용 약학 조성물.