KR20220127375A - 기도 세포의 제조를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

기도 세포의 제조를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 기도 세포의 제조를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 하나의 태양에서, 기도 세포 표면 마커의 발현 및 증식하는 능력을 특징으로 하는 유도된 만능줄기(iPS) 세포로부터 유래된 상피 기도 세포를 개시한다. 또 다른 태양에서, iPS의 상피 기도 세포로의 분화 방법을 제공한다. 조작된 폐, 상기 상피 기도 세포를 포함하는 상기와 같은 조작된 폐의 제조 및 호흡기 질환의 치료 방법을 또한 개시한다.

Description

기도 세포의 제조를 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS OF PREPARING AIRWAY CELLS}
관련 출원의 상호참조
본 출원은 2014년 1월 14일자로 출원된 미국 가 특허출원 제 61/927,097 호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원의 내용은 전체가 본 발명에 진술된 바와 같이 본 발명에 참고로 인용된다.
미국에서 대략 30,000명의 사람이 낭성 섬유증(CF)이 있으며 매년 약 1,000건의 새로운 사례가 CF로 진단된다. CF는 가장 위태롭게는 폐, 및 또한 췌장, 간 및 장을 침범하는 상염색체 열성 유전 질환이다. CF는 상피를 가로질러 클로라이드 및 나트륨을 비정상적으로 수송하여, 끈적거리는 분비물을 발생시키는 것을 특징으로 한다. CF가 있는 사람들에서 가장 흔한 사망 원인은 호흡부전이다. 다수의 연구가 낭성 섬유증 트랜스막 전도도 조절인자(CFTR: cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein) 유전자의 돌연변이가 상피를 가로지르는 상기 CFTR 클로라이드 채널의 폴딩, 분비, 세포 표면 안정성, 및/또는 기능을 손상시킬 수 있음을 입증하였다. 상기 CFTR 구조 결함을 표적화하는 화합물을 확인하기 위한 예의노력이 진행되고 있지만, 지금까지 상기의 임상 효능은 불충분한 것으로 나타났으며, 보다 효율적인 치료법을 개발하기 위한 선행요건인 CFTR 조절의 분자 기전을 보다 잘 이해할 필요가 강조되고 있다.
기도에서, 상기 CFTR 돌연변이는 근위 기도 상피세포에 큰 영향을 미친다. CF 연구의 주요 장애 중 하나는 역학적 연구 및 약물 발견에 사용하기 위한, 살아있는 인간 근위 기도 상피세포의 결여이며, 상기 세포 유형은 CFTR 돌연변이에 의해 선택적으로 영향을 받는다. CF의 동물 모델은 일반적으로 인간 조건을 그다지 충분히 재현하지 못한다.
유도된 만능줄기(iPS: induced pluripotent stem) 세포는 폐포 상피세포로 발달할 가능성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 다수의 연구 그룹들이 다양한 프로토콜을 사용하여, 폐포 II형 세포를 향한 ESC 및 iPS의 분화를 보고하였다. 그러나, 이들 대단히 중요한 기도 질병의 많은 태양들은 여전히 불충분하게 이해된 채로 있다.
따라서, 당해 분야에서는 폐-관련된 치료법에 사용되는 기능성 기도 상피세포의 신뢰할만한 공급원을 확인할 필요가 있다.
본 발명은 조직 공학 및 호흡기 질환의 치료에 사용될 수 있는 기도 상피세포의 제조를 위한 조성물 및 방법을 포함한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 기도 세포 표면 마커의 발현(여기에서 상기 기도 세포 표면 마커는 클라라 세포 분비 단백질(CCSP), 사이토케라틴 5(KRT5), 및 FOXJ1을 포함한다), 및 배양물에서 상기 기도 세포 표면 마커의 상실 없이 증식하는 능력을 특징으로 하는 유도된 만능줄기(iPS) 세포로부터 유래된 기도 상피세포를 포함한다. 하나의 태양에서, 본 발명은 유도된 만능줄기(iPS) 세포를 기도 상피세포로 분화시키는 방법을 포함하며, 상기 방법은 상기 iPS 세포를 혈청의 부재하에서 배양하여 완성 내배엽(DE: definitive endoderm) 세포로의 분화를 유도하고, 상기 DE 세포를 혈청의 존재하에서 배양하여 전방 전장 내배엽(AFE: anterior foregut endoderm) 세포로의 분화를 유도하고, 상기 AFE 세포를 혈청, 사이토킨 칵테일, 및 고농도 레티노산의 존재하에서 배양하여 상기 AFE 세포의 기도 상피세포로의 분화를 유도함을 포함한다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 유도된 만능줄기(iPS)의 집단을 기도 상피세포로 분화시키고, 여기에서 상기 기도 상피세포는 클라라 세포 분비 단백질(CCSP), 사이토케라틴 5(KRT5) 및 FOXJ1을 포함하는 기도 세포 표면 마커를 발현하고; 배양물 중에서 상기 기도 세포 마커의 상실 없이 증식이 가능하며; 상기 기도 상피세포를 3차원 스캐폴드상에 시딩함을 포함하는 3차원 폐조직의 조작(engineering) 방법을 포함한다. 더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 기도 상피세포를 포함하는 조작된 3차원 폐 조직을 포함한다.
본 발명에 기술된 본 발명의 상기 태양 또는 임의의 다른 태양의 다양한 실시태양에서, 본 발명은 섬모가 있는 기도 상피세포를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 기도 상피세포는 낭성 섬유증 인간 iPS 세포로부터 유래한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 기도 상피세포는 배양물 중에서 적어도 약 30일 동안, 예를 들어 약 30일을 초과하여 증식할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 기도 세포 표면 마커의 발현은 낭성 섬유증 트랜스막 전도도 조절 단백질(CFTR), 및/또는 β-튜불린 IV, 뮤신-5AC 및 P63 중 적어도 하나를 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 기도 세포 표면 마커는 새로 단리된 인간 기도 세포상에서 발현되는 수준에 필적하는 수준으로 발현된다.
하나의 실시태양에서, 상기 iPS 세포의 배양은 상기 iPS 세포를 액티빈 A의 존재하에서 배양함을 포함한다. 상기와 같은 실시태양에서, 상기 액티빈 A는 상기 iPS 세포 배양물 중에 대략 포화 농도로 존재한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 iPS 세포의 배양은 상기 iPS 세포를 무혈청 보충제의 존재하에서 배양함을 포함한다.
하나의 실시태양에서, DE 세포는 c-kit, SOX17, FOXA2 및 CXCR4로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 완성 내배엽 세포 마커를 발현한다. 상기와 같은 실시태양에서, ECM 분자의 존재하에서의 배양은 상기 DE 세포를 ECM 분자와의 배양에 앞서 해리시킴을 포함한다. 또한, 상기 ECM 분자는 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 테나신, 엘라스틴, 프로테오글리칸 및 글리코스아미노글리칸 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 DE 세포의 배양은 상기 DE 세포를, 후방 내배엽 운명을 억제하고 근위 내배엽 운명을 유도하는 소분자 억제제, 예를 들어 BMP/TGF 신호전달을 억제하는 소분자 억제제, 예를 들어 도르소몰핀 (dorsomorphin), 노긴 (Noggin), A83-01, DMH-1, D4476, GW788388, LY364947, RepSox, SB431542, SB505124, SB525334, 및 SD208에 연속적으로 노출시킴을 포함한다. 또한 상기 소분자 억제제는 TGF/WNT 신호전달을 억제할 수 있다, 예를 들어 IWR-1, 노긴, CCT036477, IWP2, 데메톡시 커큐민, FH535 A83-01, D4476, GW788388, LY364947, RepSox, SB431542, SB505124, SB525334, 및 SD208이 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 AFE 세포는 NKX2.1을 발현한다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 레티노산의 고농도는 적어도 0.5 μM, 예를 들어 약 1 μM의 레티노산을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 사이토킨 칵테일은 WNT 경로를 억제한다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 iPS 세포는 병든 인간 세포, 예를 들어 낭성 섬유증 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 유래한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 유도된 만능줄기(iPS)를 기도 상피 세포로 분화시키고, 여기에서 상기 기도 상피세포는 클라라 세포 분비 단백질(CCSP), 사이토케라틴 5(KRT5) 및 FOXJ1을 포함하는 기도 세포 표면 마커를 발현하고, 배양물 중에서 상기 기도 세포 마커의 상실 없이 증식이 가능하며, 상기 기도 상피세포를 호흡기 질환의 증상의 개선, 치료 또는 경감이 필요한 피실험자에서 상기 호흡기 질환을 치료하기에 유효한 양으로 투여함을 포함하는, 상기 피실험자에서 상기 증상을 개선시키거나, 치료하거나 또는 경감시키는 방법을 포함한다.
본 발명에 기술된 본 발명의 상기 태양 또는 임의의 다른 태양의 다양한 실시태양에서, 본 발명은 오가노이드 구조를 형성하는 기도 상피세포를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 3차원 스캐폴드는 매트리젤 (matrigel)을 포함한다.
도 1은 인간 iPS 세포의 기도 상피세포로의 분화 단계를 그림으로 표시한다.
도 2A는 c-kit를 발현하는 5일째 iPS 세포로부터 유래된 세포 집단의 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 2B는 FOXA2를 발현하는 5일째 iPS 세포로부터 유래된 세포 집단의 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 2C는 SOX17을 발현하는 5일째 iPS 세포로부터 유래된 세포 집단의 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 2D는 클론 C1 중 CXCR4를 발현하는 5일째 iPS 세포로부터 유래된 세포 집단의 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 3A는 FOXA2/SOX2 발현에 대한 AFE 분화 중 작용물질 및 길항물질의 효과를 도시한다.
도 3B는 NKX2.1 발현에 대한 AFE 분화 중 작용물질 및 길항물질의 효과를 도시한다.
도 4는 인간 iPS 세포가 기도 상피세포로 분화하고 NKX2.1+FOXA2+ 세포의 증가를 생성시키도록 조작된 프로토콜의 단계를 그림으로 표시한다.
도 5는 전방화(anteriorization) 없이 1% 미만으로 NOGGIN/SB에 노출된 DE 세포에 비해, 15일째에 NKX2.1+FOXA2+ 세포의 증가를 도시한다.
도 6A는 DAPI로 염색된 생체외 분화된 NKX2.1+ 세포를 도시한다.
도 6B는 FOXA2로 염색된 생체외 분화된 NKX2.1+ 세포를 도시한다.
도 6C는 NKX2.1로 염색된 생체외 분화된 NKX2.1+ 세포를 도시한다.
도 6D는 NKX2.1/FOXA2/DAPI로 공-염색된 생체외 분화된 NKX2.1+ 세포를 도시하며, 이는 상기 NKX2.1+ 세포가 시험관내에서 분화되었음을 암시한다.
도 7A는 DAPI로 염색된 생체외 분화된 NKX2.1+/SOX2+를 도시한다.
도 7B는 SOX2로 염색된 생체외 분화된 NKX2.1+/SOX2+를 도시한다.
도 7C는 NKX2.1로 염색된 생체외 분화된 NKX2.1+/SOX2+를 도시한다.
도 7D는 SOX2/NKX2.1/DAPI로 염색된 생체외 분화된 NKX2.1+/SOX2+를 도시하며, 이는 상기 NKX2.1+/SOX2+ 세포가 시험관내에서 분화되었음을 암시한다.
도 8은 처리 전 약 1 내지 2%에 비해, 약 30%까지 만들어진 NKX2.1+/SOX2+ 기도 전구세포를 나타내는 막대 그래프이다.
도 9는 기도 분화 및 기본 배지에의 보충을 도시하는 다이어그램이다.
도 10A는 성숙한 폐 기도 상피세포에서 20일째 FOXJ1의 정량적인 RT-PCR 결과를 도시한다.
도 10B는 성숙한 폐 기도 상피세포에서 20일째 KRT5의 정량적인 RT-PCR 결과를 도시한다.
도 10C는 성숙한 폐 기도 상피세포에서 20일째 CFTR의 정량적인 RT-PCR 결과를 도시한다.
도 10D는 성숙한 폐 기도 상피세포에서 20일째 CCSP 또는 SCGB1A1의 정량적인 RT-PCR 결과를 도시한다.
도 10E는 성숙한 폐 기도 상피세포에서 20일째 P63의 정량적인 RT-PCR 결과를 도시한다.
도 10F는 성숙한 폐 기도 상피세포에서 20일째 SOX2의 정량적인 RT-PCR 결과를 도시한다.
도 10G는 성숙한 폐 기도 상피세포에서 20일째 뮤신5AC의 정량적인 RT-PCR 결과를 도시한다.
도 11은 27일째 기도 상피 분화를 유도하는 성장 인자 및 억제제 조합을 도시하는 다이어그램이다.
도 12A는 FOXJ1을 발현하는 27일째 iPS 세포로부터 유래된 세포 집단의 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 12B는 CFTR을 발현하는 27일째 iPS 세포로부터 유래된 세포 집단의 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 12C는 β-튜불린 IV를 발현하는 27일째 iPS 세포로부터 유래된 세포 집단의 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 12D는 SOX2를 발현하는 27일째 iPS 세포로부터 유래된 세포 집단의 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 12E는 CCSP를 발현하는 27일째 iPS 세포로부터 유래된 세포 집단의 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 12F는 KRT5를 발현하는 27일째 iPS 세포로부터 유래된 세포 집단의 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 12G는 뮤신5AC를 발현하는 27일째 iPS 세포로부터 유래된 세포 집단의 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 12H는 P63을 발현하는 27일째 iPS 세포로부터 유래된 세포 집단의 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 13A는 성숙한 폐 기도 상피세포에서 27일째 CFTR의 정량적인 RT-PCR 결과를 도시한다.
도 13B는 성숙한 폐 기도 상피세포에서 27일째 FOXJ1의 정량적인 RT-PCR 결과를 도시한다.
도 13C는 성숙한 폐 기도 상피세포에서 27일째 SCGB1A1(CCSP)의 정량적인 RT-PCR 결과를 도시한다.
도 13D는 성숙한 폐 기도 상피세포에서 27일째 뮤신5AC의 정량적인 RT-PCR 결과를 도시한다.
도 13E는 성숙한 폐 기도 상피세포에서 27일째 NKX2.1의 정량적인 RT-PCR 결과를 도시한다.
도 13F는 성숙한 폐 기도 상피세포에서 27일째 KRT5의 정량적인 RT-PCR 결과를 도시한다.
도 14는 35일째 기도 상피세포 분화의 성숙화를 도시하는 다이어그램이다.
도 15A는 근위 전구세포로서 염색된 기도 상피세포를 도시한다.
도 15B는 FOXJ1 항체로 염색된 기도 상피세포를 도시한다.
도 15C는 뮤신5AC 항체로 염색된 기도 상피세포를 도시한다.
도 15D는 CCSP 항체로 염색된 기도 상피세포를 도시한다.
도 15E는 CFTR 항체로 염색된 기도 상피세포를 도시한다.
도 15F는 PanKRT 항체로 염색된 기도 상피세포를 도시한다.
도 16A는 기도 세포 마커 뮤신5AC에 대한 35일째 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 16B는 기도 세포 마커 FOXJ1에 대한 35일째 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 16C는 기도 세포 마커 β-튜불린 IV에 대한 35일째 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 16D는 기도 세포 마커 P63에 대한 35일째 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 16E는 기도 세포 마커 CFTR에 대한 35일째 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 16F는 기도 세포 마커 CCSP에 대한 35일째 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 16G는 기도 세포 마커 CK5 또는 KRT5에 대한 35일째 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 16H는 기도 세포 마커 SOX2에 대한 35일째 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 17A는 iPS 유래된 기도 상피세포에서 35일째 KRT5 또는 CK5의 정량적인 RT-PCR 결과를 도시한다.
도 17B는 iPS 유래된 기도 상피세포에서 35일째 CFTR의 정량적인 RT-PCR 결과를 도시한다.
도 17C는 iPS 유래된 기도 상피세포에서 35일째 NKX2.1의 정량적인 RT-PCR 결과를 도시한다.
도 17D는 iPS 유래된 기도 상피세포에서 35일째 P63의 정량적인 RT-PCR 결과를 도시한다.
도 17E는 iPS 유래된 기도 상피세포에서 35일째 SCGB1A1 또는 CCSP의 정량적인 RT-PCR 결과를 도시한다.
도 17F는 iPS 유래된 기도 상피세포에서 35일째 FOXJ1의 정량적인 RT-PCR 결과를 도시한다.
도 17G는 iPS 유래된 기도 상피세포에서 35일째 뮤신5AC의 정량적인 RT-PCR 결과를 도시한다.
도 18은 CF 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 폐 기도 전구세포를 생성시키기 위한 단계적인 분화 접근법을 그림으로 표시한다.
도 19A는 CFTR 항체로 염색된 CF 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포를 도시한다.
도 19B는 뮤신5AC 항체로 염색된 CF 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포를 도시한다.
도 19C는 PanKRT 항체로 염색된 CF 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포를 도시한다.
도 19D는 CCSP 항체로 염색된 CF 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포를 도시한다.
도 20A는 CF 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포에서 뮤신5AC의 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 20B는 CF 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포에서 P63의 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 20C는 CF 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포에서 β-튜불린 IV의 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 20D는 CF 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포에서 FOXJ1의 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 20E는 CF 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포에서 CFTR의 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 20F는 CF 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포에서 SOX2의 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 20G는 CF 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포에서 CK5 또는 KRT5의 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 20H는 CF 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포에서 CCSP의 유식 세포측정 분석을 도시한다.
도 21A는 CF 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포에서 NKX2.1의 정량적인 RT-PCR을 도시한다.
도 21B는 CF 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포에서 뮤신5AC의 정량적인 RT-PCR을 도시한다.
도 21C는 CF 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포에서 SOX2의 정량적인 RT-PCR을 도시한다.
도 21D는 CF 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포에서 P63의 정량적인 RT-PCR을 도시한다.
도 21E는 CF 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포에서 SCGB1A1 또는 CCSP의 정량적인 RT-PCR을 도시한다.
도 21F는 CF 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포에서 FOXJ1의 정량적인 RT-PCR을 도시한다.
도 21G는 CF 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포에서 KRT5의 정량적인 RT-PCR을 도시한다.
도 21H는 CF 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포에서 CFTR의 정량적인 RT-PCR을 도시한다.
도 22A는 매트리젤에서 폐 오가노이드 구조로 발달된 iPSC로부터 유래된 기도 전구세포의 양성 P63 면역염색을 도시하는 영상 패널이다.
도 22B는 매트리젤에서 폐 오가노이드 구조로 발달된 iPSC로부터 유래된 기도 전구세포의 양성 NKX2.1 면역염색을 도시하는 영상 패널이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 과학기술 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에 개시된 바와 유사하거나 균등한 임의의 방법 및 물질을 본 발명의 시험의 실시에 사용할 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법은 본 발명에 개시된다. 본 발명을 개시하고 특허청구함에 있어서, 하기의 용어가 사용될 것이다.
또한, 본 발명에 사용된 용어는 단지 특정 실시태양들을 개시하기 위한 것이며 제한하고자 하는 것은 아님은 물론이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "하나의("a" 및 "an")"란 관사는 상기 관사의 문법적 목적어 중 하나 또는 그 이상(즉 적어도 하나)을 지칭하는데 사용된다. 예로서, "하나의 요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이 양, 시간적 기간 등과 같은 측정 가능한 값을 지칭할 때 "약"이란 용어는 명시된 값의 ±20% 또는 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 이내의 변화를 포함하는 것으로 여겨지는데, 상기와 같은 변화는 개시된 방법을 수행하기에 적합하기 때문이다. 문맥상 달리 명백하지 않은 한, 본 발명에 제공된 모든 수치들은 상기 약이란 용어에 의해 변형된다.
"전방 전장 내배엽"은 간을 생성시키는 내배엽 전방의 내배엽이다. 당해 분야의 통상적인 숙련가는 따라서 "전방 전장 내배엽"이 예를 들어 인두 내배엽 및 내배엽 세포의 다른 보다 고도로 분화된 집단을 포함하고, "전방 전장 내배엽"이란 용어에 의해 포함되는 다양한 세포 유형은 분자 마커의 상이한 발현 패턴을 나타낼 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 당해 분야의 통상적인 숙련가는 "전방 전장 내배엽"이 다양한 조직, 예를 들어 편도선, 고막, 갑상선, 부갑상선, 흉선, 기관, 식도, 위, 폐 및 후두/인두를 생성시킴을 이해할 것이다.
본 발명에 사용되는 바와 같이 "분화"란 용어는 덜 전문화된 세포, 예를 들어 줄기세포 또는 유도된 만능줄기세포가, 특이적인 계통에 전념하도록 보다 전문화된 세포유형, 예를 들어 비제한적으로 몇몇 전구세포뿐만 아니라 보다 전문화된 체세포로 되는 과정을 지칭한다. 줄기세포의 분화 조건은 당해 분야에 주지되어 있다.
본 원에 사용되는 바와 같은 "분화 배지"는 줄기세포, 유도만능세포 또는 완전히 분화되지는 않은 다른 상기와 같은 전구세포가 상기 배지에서 배양될 때 분화된 세포 또는 상기 줄기세포, 유도만능세포 또는 다른 상기와 같은 전구세포보다 더 분화된 세포의 특징 중 일부 또는 전부를 갖는 세포로 발달하도록 하는 첨가제를 포함하거나 또는 상기 첨가제가 없는 세포 생육 배지를 지칭한다.
"완성 내배엽 세포"는 완성 내배엽 계통의 하나 이상의 마커를 발현하는 세포를 의미한다. 이들 마커는 비제한적으로 CXCR4, SOX17, GATA-4, FOXA2, AFP, CER1, C-KIT, EPCAM, SNAI1, GSC, E-Cad, 또는 N-Cad를 포함할 수 있다. 완성 내배엽은 기능상, 내배엽층으로부터 유래되는 조직 중 하나 이상을 향해 더욱 분화될 수 있는 세포에 의해 한정된다. 상기는 폐, 갑상선, 간, 췌장 또는 장을 포함할 수 있다.
"기도 상피세포"는 대기도(기관지) 및 소기도(세기관지)에 늘어선 세포층을 구성하는 상피세포를 의미한다. 기도 상피세포는 섬모세포, 분비세포, 기저세포 및 원주세포 유형들을 포함한다.
"유도된 만능줄기 세포" 또는 "iPS 세포"는 특이적인 유전자의 발현을 유도함으로써 비-만능세포, 전형적으로 성인 체세포로부터 인공적으로 유도된(유전자 또는 화학적 방법을 사용하여) 만능줄기세포의 한 유형을 의미한다. 상기 유도된 만능줄기 세포는 천연 만능줄기세포와 실질적으로 유사하다. 상기 유도된 만능줄기 세포는 다수의 세포 유형, 예를 들어 비제한적으로 완성 내배엽 세포, 전방 전장 내배엽 세포, 및 기도 상피세포로 분화될 수 있다.
"오가노이드"란 용어는 조직 또는 기관의 표면적 외관 또는 실제 구조 또는 기능을 모방하는 하나 이상의 세포 유형의 3차원 집합체를 지칭한다.
"유도" 또는 "유도하다"란 용어는 세포의 표현형에 대해 특이적인 효과를 일으키는 원인 과정 또는 작용에 관한 것이다. 상기와 같은 효과는 상기 표현형의 변화를 유발하는 형태, 예를 들어 또 다른 세포 표현형으로의 분화이거나, 또는 상기 세포를 특정 세포에서 유지시키는, 예를 들어 세포의 탈분화를 방지하거나 또는 세포의 생존을 촉진하는 형태일 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "만능"이란 용어는 다양한 세포 유형으로의 분화를 허용하는 능력을 유지하는 미분화된 세포를 지칭한다.
"전구체 세포", "전구세포" 및 "줄기세포"란 용어들은 당해 분야에서 호환적으로 사용되며, 본 발명에 사용시 스스로 재생되거나 또는 목적하는 세포 유형으로 분화되는 자손세포를 생산하도록 잠재적으로 무제한 유사분열할 수 있는 만능 또는 계통-중립 전구세포를 지칭한다. 만능줄기세포와 대조적으로, 계통-전념 (lineage-committed) 전구세포는 일반적으로 서로 표현형적으로 상이한 다수의 세포 유형들을 생성시킬 수 없는 것으로 간주된다. 대신에, 전구세포는 하나 또는 가능하게는 2개의 계통-전념 세포 유형을 생성시킨다. 하나의 실시태양에서, 상기 줄기세포는 유도된 만능줄기(iPS) 세포이다.
"호흡기 질환"은 호흡기에 신체적으로 나타난 질병 또는 상태, 예를 들어 비제한적으로 낭성 섬유증, 호흡곤란 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 폐결핵, 기침, 기관지 천식, 증가된 기도 과민반응에 기반한 기침(기관지염, 독감 증후군, 천식, 폐쇄성 폐질환 등), 독감 증후군, 기침억제, 기도 과민반응, 결핵 질병, 천식(기도 염증성 세포 침윤, 증가된 기도 과민반응, 기관지수축, 점액 과분비 등), 만성 폐쇄성 폐 질환, 폐기종, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 기침, 가역적인 기도 폐쇄, 성인 호흡기 질병 증후군, 비둘기 사육자병, 농부의 폐, 기관지폐 이형성증, 기도 질환, 폐기종, 알러지성 기관지폐 아스퍼질러스증, 알러지성 기관지염 기관지확장증, 직업성 천식, 반응성 기도 질병 증후군, 간질성 폐 질병, 기생충성 폐 질병 등을 의미한다.
본 명세에서, "포함하다", "포함하는", "함유하는" 및 "갖는" 등은 미국 특허법에서 이들 용어에 근거한 의미를 가질 수 있으며, "포함하다", "포함하는" 등을 의미할 수 있고; "로 필수적으로 이루어지는" 또는 "필수적으로 이루어지는"은 마찬가지로 미국 특허법에 근거된 의미를 가지며 상기 용어는 개방형 용어로, 인용된 기본적인 또는 신규의 특성이 상기 인용된 것을 초과하는 존재에 의해 변하지 않고 선행 기술 실시태양을 제외하는 한, 상기 인용된 것을 초과하는 존재를 허용한다.
"유효량"은 호흡기 질환, 상태 또는 질병의 임상적 마커의 적어도 하나의 증상 또는 변화를 치료되지 않은 환자에 비해 감소시키거나 개선시키는데 필요한 양을 의미한다. 상기 호흡기 질환, 상태 또는 질병의 치료학적 치료에 사용되는 기도 상피 세포의 유효량은 상기 특이 질환, 상태 또는 질병의 특징, 상기 질환, 상태 또는 질병의 정도, 및 상기 세포의 투여뿐만 아니라 피실험자의 연령, 체중, 및 일반적인 건강에 따라 변한다.
"확장성"은 본 발명에서, 증식하는, 예를 들어 수가 확대되는, 또는 세포 집단의 경우에 집단 배가를 겪는 상기 세포의 능력을 지칭하는데 사용된다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "발현"이란 용어는 프로모터에 의해 구동되는 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로서 정의된다.
"단리된, "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한"이란 용어는 타고난 상태에서 발견될 때 통상적으로 수반하는 성분들이 다양한 정도로 없는 물질을 지칭한다. "단리"는 원래 출처 또는 환경으로부터의 분리 정도를 나타낸다. "정제"는 단리보다 더 높은 분리 정도를 나타낸다. "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한" 단백질은 임의의 불순물이 상기 단백질의 생물학적 성질에 실질적으로 영향을 미치거나 다른 불리한 결과를 야기하지 않기에 충분히 다른 물질이 없다. 즉, 세포는 세포 또는 물질이 실질적으로 없는 경우 정제된다. 순도 및 동종성은 전형적으로 분석 기법, 예를 들어 유식 세포측정 또는 유식 활성화된 세포 분류를 사용하여 측정된다. "정제된"이란 용어는 세포가 필수적으로 하나의 집단을 생성시킴을 나타낸다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "표현형"은 예를 들어 임의의 하나의 특징 또는 임의의 특징 그룹을 갖는 세포의 전체적인 물리적, 생화학적 및 생리학적 성질을 지칭한다.
"증식"은 본 발명에서 유사한 형태의, 특히 세포의 번식 또는 증가를 지칭하는데 사용된다. 즉, 증식은 보다 많은 수의 세포의 생산을 포함하며, 특히 세포의 수를 단순히 카운트하기, 3H-티미딘의 상기 세포에의 통합을 측정하기 등에 의해 측정될 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 선별 방법 또는 처리가 요구되는 관심 세포(예를 들어 암 또는 종양 세포)를 함유할 수 있는 어떤 것을 지칭한다. 상기 샘플은 생물학적 샘플, 예를 들어 생물학적 유체 또는 생물학적 조직일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 생물학적 샘플은 폐동맥 내피세포를 포함한 조직 샘플이다. 상기와 같은 샘플은 다양한 세포, 단백질 및 유전 물질을 포함할 수 있다. 생물학적 조직의 예는 또한 기관, 종양, 림프절, 동맥 및 개별적인 세포(들)를 포함한다. 생물학적 유체의 예는 뇨, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 가래, 뇌척수액, 눈물, 점액, 양막액 등을 포함한다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "피실험자" 또는 "환자"는 인간 또는 비-인간 포유동물일 수 있다. 비-인간 포유동물은 예를 들어 가축 및 애완동물, 예를 들어 양, 소, 돼지, 개, 고양이 및 뮤린 포유동물을 포함한다. 바람직하게, 상기 피실험자는 인간이다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "치료하다", "치료하는", "치료" 등의 용어는 호흡기 질환, 상태 또는 질병 및/또는 이와 관련된 하나 이상의 증상을 감소시키거나 개선시킴을 지칭한다. 제외하는 것은 아니지만, 호흡기 질환, 상태 또는 질병의 치료는 상기 질환, 태, 질병 또는 이들과 관련된 증상을 완전히 개선시키거나 제거할 것을 요하지는 않음을 알 것이다.
본 발명에 제공된 범위는 상기 범위내의 값들 전부에 대한 약칭인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 및 50으로 이루어지는 그룹으로부터의 임의의 수, 수들의 조합, 또는 하위-범위를 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명의 변수 또는 태양에 대한 실시태양의 인용은 임의의 단일 실시태양 또는 임의의 다른 실시태양 또는 그의 일부와의 조합으로서 상기 실시태양을 포함한다.
본 발명에 제공된 임의의 조성물 또는 방법을 본 발명에 제공된 다른 조성물 및 방법들 중 임의의 것들 중 하나 이상과 병용할 수 있다.
기도 상피세포
공여자 폐의 대체 공급원의 개발은 상기 폐의 질병 치료의 패러다임을 변화시킬 것이다. 말기 폐 질환 (end stage lung disease)의 치료에 대한 한 가지 선택권은 환자-특이적인 세포로부터 제조된 조작된 폐의 이식이다. iPS 세포-유래된 기도 상피세포의 발견은 기본적인 폐 병리의 연구를 촉진할 뿐만 아니라, CF를 포함한 폐 질환의 치료를 위한 신규 치료법의 개발을 촉진한다. 본 발명에 개시된 바와 같은 iPS로부터 유래된 기도 상피세포는 세포-기반 치료 용도 및 병든 폐 상피의 잠재적인 교체에 대한 특유의 기회를 제공한다.
하나의 태양에서, 유도된 만능줄기(iPS) 세포로부터 유래된 기도 상피세포는 본 발명에 포함된다. 상기 기도 상피세포는 기도 세포 표면 마커, 예를 들어 클라라 세포 분비 단백질(CCSP), 사이토케라틴 5(KRT5) 및 FOXJ1의 발현을 특징으로 한다. 상기 기도 상피세포는 또한 배양물에서 상기 기도 세포 표면 마커의 상실 없이 증식하는 능력을 갖는다. 기도 상피세포는 섬모세포, 분비세포, 기저세포 및 원주세포 유형들을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 기도 상피세포는 섬모가 있다.
iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포는 또한 기도 특이적인 세포 표면 마커의 배열을 발현한다. 기도 세포 표면 마커의 예는 비제한적으로 뮤신1 또는 MUC1, 뮤신5AC, FOXJ1, CCSP, KRT5, KRT14, TRP63, SOX17, SOX2, β-튜불린 IV 및 CFTR을 포함한다.
뮤신1 또는 MUC1은 뮤신과의 일원이며, 막 결합된, 글리코실화된 인단백질이다. 상기 단백질은 막관통 도메인에 의해 다수 상피의 정상 표면에 고정된다. 예시적인 뮤신1 서열은 진뱅크(GenBank) 수납 번호 NM_001018016 또는 NP_001018016에서 발견되는 인간 MUC1 서열 또는 그의 단편, 및 NM_013605 또는 NP_038633에서 발견되는 마우스 Muc1 서열 또는 그의 단편을 포함한다.
뮤신5AC는 위 및 호흡기 상피에서 발견되는 당단백질이다. 예시적인 뮤신5AC 서열은 진뱅크 수납번호 XM_003403450 또는 P98088에서 발견되는 인간 MUC5AC 서열, 또는 그의 단편을 포함한다.
포크헤드 박스J1(FOXJ1)은 섬모형성에 관련된 전사 인자이다. 예시적인 FOXJ1 서열은 진뱅크 수납번호 NM_001454 또는 NP_001445에서 발견되는 인간 FOXJ1 서열 또는 그의 단편, 및 NM_008240 또는 NP_032266에서 발견되는 마우스 FoxJ1 서열 또는 그의 단편을 포함한다.
클라라 세포 분비 단백질(CCSP)은 면역-조절 및 소염제이다. 예시적인 CCSP 서열은 진뱅크 수납번호 NM_003357 또는 NP_003348에서 발견되는 인간 CCSP 서열 또는 그의 단편, 및 NM_011681 또는 NP_035811에서 발견되는 마우스 CCSP 서열 또는 그의 단편을 포함한다.
케라틴5(KRT5)는 각질세포의 구조 프레임워크를 형성하는 강인한 섬유성 단백질의 그룹에 속한다. 예시적인 KRT5 서열은 진뱅크 수납번호 NM_000424 또는 NP_000415에서 발견되는 인간 KRT5 서열 또는 그의 단편, 및 NM_027011 또는 NP_081287에서 발견되는 마우스 KRT5 서열 또는 그의 단편을 포함한다.
케라틴 14(KRT14)는 중간 섬유 단백질의 I형 케라틴과의 일원이다. 예시적인 KRT14 서열은 진뱅크 수납번호 NM_000526 또는 NP_000517에서 발견되는 인간 KRT14 서열 또는 그의 단편, 및 NM_016958 또는 NP_058654에서 발견되는 마우스 KRT14 서열 또는 그의 단편을 포함한다.
형질전환 관련 단백질 63(TRP63 또는 P63)은 스트레스 및 발생에 대한 세포 반응에 관련된 전사 인자의 p53과의 일원이다. 예시적인 TRP63 서열은 진뱅크 수납번호 NM_001114978 또는 NP_001108450에서 발견되는 인간 TRP63 서열 또는 그의 단편, 및 NM_001127259 또는 NP_001120731에서 발견되는 마우스 TRP63 서열 또는 그의 단편을 포함한다.
성 결정 영역 Y-box 17(SOX17)은 표적 프로모터 DNA에 결합하고 배 발생의 조절에 핵심 역할을 하는 전사 조절인자이다. 예시적인 SOX17 서열은 진뱅크 수납번호 NM_022454 또는 NP_071899에서 발견되는 인간 SOX17 서열 또는 그의 단편을 포함한다.
성 결정 영역 Y-box 2(SOX2)는 미분화된 배아줄기세포의 자기-재생 또는 다능성의 유지에 필수적인 전사 인자이다. 예시적인 CFTR 서열은 진뱅크 수납번호 NM_003106 또는 NP_003097에서 발견되는 인간 CFTR 서열 또는 그의 단편, 및 NM_011443 또는 NP_035573에서 발견되는 마우스 CFTR 서열 또는 그의 단편을 포함한다.
β-튜불린 IV는 구상 단백질 소과의 다수 구성원들 중 하나이다. β-튜불린 IV는 섬모세포 유형으로 존재하며 포유동물에서 축사 구조에 필요할 수도 있다.
본 발명의 어딘가에 개시된 바와 같이, CFTR은 세포막을 가로질러 클로라이드 이온을 수송하는데 관련된 단백질이다. 예시적인 CFTR 서열은 진뱅크 수납번호 NM_000492 또는 NP_000483에서 발견되는 인간 CFTR 서열 또는 그의 단편, 및 NM_021050 또는 NP_066388에서 발견되는 마우스 CFTR 서열 또는 그의 단편을 포함한다.
하나의 실시태양에서, iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포는 기도 세포 표면 마커 CFTR의 발현을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 기도 세포 표면 마커는 β-튜불린 IV, 뮤신-5AC 및 P63을 포함한다. 상기 기도 상피세포에서 기도 세포 표면 마커의 발현은 새로 단리된 인간 기도 세포상에서 발현된 수준에 필적한다.
단리된 기도 세포와 달리, iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포는 기도 상피세포-관련된 마커, 예를 들어 CCSP, P63, FOXJ1, CFTR 및 NUC5AC의 상실 없이 다수의 계대 동안 증식할 수 있다. 상기 세포의 증식 능력을 사용하여 상이한 목적을 위한 수 백만개의 세포를 생성시킬 수 있다. 전구세포 집단을 "확대시키는" 능력은, 자가 iPS 세포 유래된 세포를 사용하여 조직 조작된 인간 폐 조직을 생산하는데 사용하기 위해 상기 기술을 번역하는 경우 특히 귀중하다. 하나의 실시태양에서, 상기 기도 상피세포는 적어도 약 30일 동안 배양물 중에서 증식할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 기도 상피세포는 약 30일 넘게 배양물 중에서 증식할 수 있다.
기도 상피세포로의 분화
본 발명은 하나의 태양에서 유도된 만능줄기(iPS) 세포를 기도 상피세포로 분화시키는 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 상기 iPS 세포를 혈청의 부재하에서 배양하여 완성 내배엽(DE) 세포로의 분화를 유도하고, 상기 DE 세포를 혈청의 존재하에서 배양하여 전방 전장 내배엽(AFE) 세포로의 분화를 유도하고, 상기 AFE 세포를 혈청의 존재하에서 사이토킨 칵테일 및 고농도 레티노산의 존재하에서 배양하여 상기 AFE 세포의 기도 상피세포로의 분화를 유도함을 포함한다.
iPS 세포
본 발명에 사용될 수 있는 iPS 세포를 2006년이래 최초로 개시된 접근법[참조: Yamanaka et al., Cell Stem Cell 1:39-49 (2007)]과 실질적으로 유사한 접근법, 또는 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 변형을 사용하여 유도할 수 있다. 예를 들어, iPC 세포를 숙주 세포 DNA에의 유전자 삽입 방법을 변형시켜 생성시킬 수 있다. 예를 들어 문헌[참조: Wernig et al., PNAS, 105:5856-5861 (2008)]; 문헌[Jaenisch et al., Cell 132:567-582 (2008)]; 문헌[Hanna et al., Cell 133:250-264 (2008)]; 및 문헌[Brambrink et al., Cell Stem Cell 2:151-159 (2008)]을 참조하시오. 이들 참고문헌은 iPS 세포 및 그의 생성 방법의 교시에 대해서 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
iPS 세포는 만능줄기세포로 재프로그램화된 체세포로부터 유래되기 때문에, 다수의 세포 유형들을 사용하여 상기 iPS 세포를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 호흡기 질환, 예를 들어 낭성 섬유증이 있는 피실험자로부터의 자가 세포에 의한 치료는 상기 세포의 면역거부를 경감시키거나 방지할 것이다. 따라서, iPS 세포를, iPS 세포로부터 유래된 분화세포에 의한 치료를 받을 피실험자로부터 생성시키는 것이 유용하다. 하나의 실시태양에서, 상기 기도 상피세포는 병든 세포, 예를 들어 낭성 섬유증 인간 iPS 세포로부터 유래한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 기도 상피세포는 호흡기 질환이 있는 피실험자의 자가 세포로부터 유래한다.
상기 iPS 세포를 기도 상피세포로 분화시키는 방법은 상기 iPS 세포를 DE 세포로의 분화를 유도하도록 배양함을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 iPS 세포를 혈청의 부재하에서 배양한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 iPS 세포를 무혈청 보충제의 존재하에서 배양한다. 무혈청 보충제의 예는, 비제한적으로, 혈청 보충제(Sigma), 미국 미주리주 세인트루이스 소재), B-27(Life Technologies, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재), BIOGRO-2(BI, 이스라엘 소재), KnockOut™(Life Technologies, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재), PluriQ(GlobalStem, 미국 메릴랜드주 록빌 소재), TCH®(MP, 미국 캘리포니아주 산타나 소재) 및 다른 유사한 보충제들이 있을 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 iPS 세포를, 완성 내배엽 세포로의 분화를 유도하는 작용제, 분자 또는 화합물, 예를 들어 비제한적으로 액티빈 A, 결절 단백질, 액티빈 A의 작용물질, 인히빈의 길항물질, 또는 이들의 임의의 조합의 존재하에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포를 액티빈 A 수용체를 활성화하는 작용제, 분자 또는 화합물, 예를 들어 액티빈 A 또는 액티빈 A 수용체 작용물질과 함께 배양할 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 세포를 액티빈 A와 유사한 방식으로 활성화 신호를 제공하거나 또는 상기 세포를 자극하는 작용제, 분자 또는 화합물, 예를 들어 결절 단백질과 배양하여 상기 iPS 세포를 완성 내배엽 세포로 분화시킬 수 있다. 더욱 또 다른 예에서, 상기 세포를 상기 액티빈 A 수용체를 간접적으로 활성화시키거나 또는 완성 내배엽 세포로의 분화를 유도할 수 있는 작용제, 분자 또는 화합물, 예를 들어 액티빈 A 억제제의 길항물질, 예를 들어 인히빈의 억제제 또는 다른 길항작용성 분자와 함께 배양할 수 있다.
완성 내배엽 세포로의 iPS 세포의 분화를 유도하는 하나 이상의 작용제, 분자 또는 화합물, 예를 들어 액티빈 A의 농도는 약 5 ng/㎖ 내지 약 500 ng/㎖의 범위일 수 있다. 하나 이상의 작용제, 분자 또는 화합물, 예를 들어 액티빈 A의 농도는 약 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 45 ng/㎖, 50 ng/㎖, 55 ng/㎖, 60 ng/㎖, 65 ng/㎖, 70 ng/㎖, 75 ng/㎖, 80 ng/㎖, 85 ng/㎖, 90 ng/㎖, 95 ng/㎖, 100 ng/㎖, 110 ng/㎖, 120 ng/㎖, 130 ng/㎖, 140 ng/㎖, 150 ng/㎖, 175 ng/㎖, 200 ng/㎖, 225 ng/㎖, 250 ng/㎖, 275 ng/㎖, 300 ng/㎖, 350 ng/㎖, 400 ng/㎖, 450 ng/㎖, 550 ng/㎖ 또는 이들 사이의 임의의 농도일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 iPS 세포를 100 ng/㎖의, 완성 내배엽 세포로의 iPS 세포의 분화를 유도하는 하나 이상의 작용제, 분자 또는 화합물, 예를 들어 액티빈 A의 존재하에서 배양한다. 상기 완성 내배엽 세포로의 분화를 유도하는 하나 이상의 작용제, 분자 또는 화합물, 예를 들어 액티빈 A의 농도는 또한 상기 iPS 세포 배양물 중의 대략 포화 농도일 수 있다. 액티빈 A의 포화 농도는 약 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 45 ng/㎖, 50 ng/㎖, 55 ng/㎖, 60 ng/㎖, 65 ng/㎖, 70 ng/㎖, 75 ng/㎖, 80 ng/㎖, 85 ng/㎖, 90 ng/㎖, 95 ng/㎖, 100 ng/㎖, 110 ng/㎖, 120 ng/㎖, 130 ng/㎖, 140 ng/㎖, 150 ng/㎖, 175 ng/㎖, 200 ng/㎖, 225 ng/㎖, 250 ng/㎖, 275 ng/㎖, 300 ng/㎖, 350 ng/㎖, 400 ng/㎖, 450 ng/㎖, 550 ng/㎖ 이상이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 완성 내배엽 세포로의 분화를 유도하는 하나 이상의 작용제, 분자 또는 화합물, 예를 들어 액티빈 A의 농도는 또한 상기 iPS 세포 배양물 중의 대략 포화 농도이다.
상기 iPS 세포를 적어도 약 12시간, 16 시간, 20 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 48 시간, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일 이상 동안 배양할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 iPS 세포를 약 5일 동안 배양한다. 하나의 실시태양에서, 상기 iPS 세포를 약 5일 동안 배양한다. 상기 iPS 세포를 적어도 약 6시간 동안 액티빈 A의 존재하에서 배양할 수 있다. 상기 iPS 세포를 적어도 약 12시간, 16 시간, 20 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 48 시간, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일 이상 동안 배양할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 iPS 세포를 적어도 약 5일 동안 액티빈 A의 존재하에서 배양한다.
iPS 세포의 분화는 엠브로이드체 방법을 사용하거나 또는 공급층 또는 매트리젤상에서 직접 완성 내배엽 단계로 발생할 수 있다.
완성 내배엽 세포
상기 iPS 세포로부터 분화된 DE 세포는 완성 내배엽 세포 마커의 배열을 발현한다. 완성 내배엽 세포 마커의 예는 비제한적으로 c-kit, SOX17, FOXA2 및 CXCR4이다.
CD117 또는 c-kit는 인간에서 KIT 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. 예시적인 c-kit 서열은 진뱅크 수납 번호 NM_000222 또는 NP_000213에서 발견되는 인간 c-kit 서열 또는 그의 단편, 및 NM_001122733 또는 NP_001116205에서 발견되는 마우스 c-kit 서열 또는 그의 단편을 포함한다.
CXCR4는 간질-유래된-인자-1에 특이적인 알파-케모킨 수용체이다. 예시적인 CXCR4 서열은 진뱅크 수납 번호 NM_001008540 또는 NM_001008540에서 발견되는 인간 CXCR4 서열 또는 그의 단편, 및 NM_009911 또는 NP_034041에서 발견되는 마우스 CXCR4 서열 또는 그의 단편을 포함한다.
하나의 실시태양에서, iPS 세포로부터 분화된 DE 세포는 내배엽 세포 표면 마커, c-kit, SOX17, FOXA2 및 CXCR4의 발현을 포함한다.
상기 iPS 세포의 기도 상피세포로의 분화 방법은 또한 상기 DE 세포를 혈청의 존재하에서 배양하여 전방 전장 내배엽(AFE) 세포로의 분화를 유도함을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 DE 세포를 혈청의 존재하에서 배양한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 DE 세포를 세포외 기질(ECM) 분자의 존재하에서 배양한다. ECM 분자의 예는 비제한적으로 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 테나신, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 글리코스아미노글리칸, 폴리사카라이드, 셀룰로스, ECM에서 발견되는 다른 분자, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
상기 DE 세포를 ECM 분자의 존재하에서 배양하기에 앞서 해리시킬 수 있다. 배지를 또한 DE 세포 유도배지에서 AFE 세포 유도배지로 바꿀 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 iPS 세포를 혈청의 존재하에서 배양한다.
상기 DE 세포를 연속적으로 소분자 억제제에 노출시켜 후방 내배엽 운명을 억제하고 근위 내배엽 운명을 유도한다. 상기 DE 세포를 또한 BMP/TGF 신호전달을 억제하는 소분자 억제제 및 TGF/WNT 신호전달을 억제하는 소분자 억제제에 연속적으로 노출시키면서 ECM 분자의 존재하에서 배양할 수 있다. 상기 BMP/TGF 신호전달을 억제하는 소분자 억제제는 비제한적으로 도르소몰핀, 노긴, A83-01, DMH-1, D4476, GW788388, LY364947, RepSox, SB431542, SB505124, SB525334, SD208, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 상기 TGF/WNT 신호전달을 억제하는 소분자 억제제는 비제한적으로 IWR-1, 노긴, CCT036477, IWP2, 데메톡시 커큐민, FH535 A83-01, D4476, GW788388, LY364947, RepSox, SB431542, SB505124, SB525334, SD208, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, DE 세포를 후방 내배엽 운명을 억제하고 근위 내배엽 운명을 유도하는 소분자 억제제들에 연속적으로 노출시킨다. 특정한 실시태양에서, 상기 BMP/TGF 신호전달을 억제하는 소분자 억제제는 예를 들어 도르소몰핀, 노긴, A83-01, DMH-1, D4476, GW788388, LY364947, RepSox, SB431542, SB505124, SB525334, SD208, 및 이들의 임의의 조합이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 상기 TGF/WNT 신호전달을 억제하는 소분자 억제제는 예를 들어 IWR-1, 노긴, CCT036477, IWP2, 데메톡시 커큐민, FH535 A83-01, D4476, GW788388, LY364947, RepSox, SB431542, SB505124, SB525334, SD208, 및 이들의 임의의 조합이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 DE 세포를 먼저 BMP/TGF 신호전달을 억제하는 소분자 억제제에 노출시키고, 이어서 TGF/WNT 신호전달을 억제하는 소분자 억제제에 노출시킨다.
상기 DE 세포를 적어도 약 6시간 동안 BMP/TGF 신호전달을 억제하는 소분자 억제제의 존재하에서 배양할 수 있다. 상기 DE 세포를 적어도 약 12시간, 16 시간, 20 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 48 시간, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일 이상 동안 BMP/TGF 신호전달을 억제하는 소분자 억제제와 함께 배양할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 DE 세포를 약 2일 내지 약 10일의 범위로 BMP/TGF 신호전달을 억제하는 소분자 억제제와 함께 배양한다. 하나의 실시태양에서, 상기 DE 세포를 약 2일 내지 약 7일의 범위로 BMP/TGF 신호전달을 억제하는 소분자 억제제와 함께 배양한다.
상기 DE 세포를 적어도 약 6시간 동안 TGF/WNT 신호전달을 억제하는 소분자 억제제의 존재하에서 배양할 수 있다. 상기 DE 세포를 적어도 약 12시간, 16 시간, 20 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 48 시간, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일 또는 그 이상 동안 TGF/WNT 신호전달을 억제하는 소분자 억제제와 함께 배양할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 DE 세포를 약 2일 내지 약 10일의 범위로 TGF/WNT 신호전달을 억제하는 소분자 억제제와 함께 배양한다. 하나의 실시태양에서, 상기 DE 세포를 약 2일 내지 약 7일의 범위로 TGF/WNT 신호전달을 억제하는 소분자 억제제와 함께 배양한다.
전방 전장 내배엽 세포
상기 DE 세포로부터 분화된 AFE 세포는 전방 전장 내배엽 세포 마커의 배열을 발현한다. 전방 전장 내배엽 세포 마커의 예는 비제한적으로 NKX2.1을 포함한다.
NKX2.1은 인간에서 NKX2-1 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. 예시적인 NKX2.1 서열은 진뱅크 수납 번호 NM_001079668 또는 NP_001073136에서 발견되는 인간 NKX2.1 서열 또는 그의 단편, 및 NM_001146198 또는 NP_001139670에서 발견되는 마우스 NKX2.1 서열 또는 그의 단편을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 AFE 세포는 NKX2.1을 발현한다.
상기 iPS 세포를 기도 상피세포로 분화시키는 방법은 또한 상기 AFE 세포를 상기 AFE 세포의 기도 상피세포로의 분화를 유도하도록 배양함을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 AFE 세포를 혈청의 존재하에서 배양한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 AFE 세포를 고농도 레티노산의 존재하에서 배양한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 AFE 세포를 사이토킨 칵테일의 존재하에서 배양한다. 특정한 실시태양에서, 사이토킨 칵테일은 WNT 경로를 억제한다. 상기 WNT 경로를 억제하는 사이토킨의 예는 비제한적으로 IWR-1, PD98059, BMP4, BMP7 및 다른 WNT 길항물질 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
상기 AFE 세포를 고농도 레티노산의 존재하에서 배양하여 분화를 유도한다. 상기 레티노산의 고농도는 약 0.1 μM 내지 약 2.0 μM의 범위일 수 있다. 상기 레티노산의 고농도는 약 0.1 μM, 0.2 μM, 0.3 μM, 0.4 μM, 0.5 μM, 0.6 μM, 0.7 μM, 0.8 μM, 0.9, 1.0 μM, 1.1 μM, 1.2 μM, 1.3 μM, 1.4 μM, 1.5 μM, 1.6 μM, 1.7 μM, 1.8 μM, 1.9 μM, 2.0 μM, 및 이들 사이의 임의의 농도일 수 있다.
상기 AFE 세포를 적어도 약 6시간 동안 고농도 레티노산의 존재하에서 배양할 수 있다. 상기 AFE 세포를 적어도 약 12시간, 16 시간, 20 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 48 시간, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일 또는 그 이상 동안 고농도의 레티노산 중에서 배양할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 AFE 세포를 적어도 약 3일 동안 상기 고농도의 레티노산 중에서 배양한다. 하나의 실시태양에서, 상기 AFE 세포를 상기 고농도의 레티노산과 함께 약 2일 내지 약 10일의 범위로 배양한다. 하나의 실시태양에서, 상기 AFE 세포를 약 2일 내지 약 7일의 범위로 상기 고농도의 레티노산과 함께 배양한다.
폐 조직 공학
본 발명은 또한 조작된 3차원 폐 조직 및 상기 3차원 폐 조직의 제조 방법을 제공한다. 하나의 태양에서, 조작된 3차원 폐 조직을 개시한다. 상기 조작된 폐는 기도 상피세포를 포함한다. 상기 기도 상피세포는 기도 세포 표면 마커, 예를 들어 클라라 세포 분비 단백질(CCSP), 사이토케라틴 5(KRT5) 및 FOXJ1을 발현하며; 상기 기도 세포 마커의 상실 없이 배양물 중에서 증식될 수 있다. 따라서, 본 발명은 말기 질병을 치료하기 위한 공여자 폐 조직의 대체 공급원에 조작된 폐를 제공한다.
또 다른 태양에서, 3차원 폐 조직의 조작 방법을 개시한다. 상기 방법은 유도된 만능줄기(iPS) 집단을 기도 상피세포로 분화시킴을 포함하며, 여기에서 상기 기도 상피세포는 기도 세포 표면 마커: 클라라 세포 분비 단백질(CCSP), 사이토케라틴 5(KRT5), 및 FOXJ1을 발현하고; 상기 기도 세포 마커의 상실 없이 배양물 중에서 증식될 수 있다. 상기 방법은 또한 상기 기도 상피세포를 3차원 스캐폴드, 예를 들어 매트리젤을 포함하는 스캐폴드상에 시딩함을 포함한다. 상기 기도 상피세포의 상기 3차원 스캐폴드상에의 시딩은 상기 기도 상피세포가 오가노이드 구조를 형성하게 한다. 당해 분야에 공지된 스캐폴드는 본 발명에 유용하다. 스캐폴드는 비제한적으로 세포물질 제거된 조직, 및 합성/천연 또는 합성과 천연 중합체성 스캐폴드의 조합을 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 3차원 스캐폴드는 메트리젤을 포함한다. 스캐폴드의 제조 방법은 미국특허 출원 제 2013/0013083 호 및 제 2012/0064050 호(이들은 내용 전체가 참고로 인용된다)에 개시된 방법들을 포함한다.
치료 방법
상기 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포 및 상기와 같은 세포를 포함하는 조작된 폐 조직은 생체내에서 피실험자의 치료에 사용된다. 본 발명은 피실험자의 호흡기 질환의 치료 방법을 포함한다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 하나의 태양에서 방법은 호흡기 질환의 증상의 개선, 치료 또는 경감이 필요한 피실험자에서 상기 증상의 개선, 치료 또는 경감을 포함한다. 상기 방법은 또한 유도된 만능줄기(iPS)를 기도 상피세포로 분화시키고(여기에서 상기 기도 상피세포는 기도 세포 표면 마커, 클라라 세포 분비 단백질(CCSP), 사이토케라틴 5(KRT5), 및 FOXJ1을 발현하고, 상기 기도 세포 마커의 상실 없이 배양물 중에서 증식될 수 있다), 상기 기도 상피세포를 상기 피실험자의 호흡기 질환의 치료에 유효한 양으로 투여함을 포함한다.
상기 피실험자의 치료 방법은 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포를 투여하거나 iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포를 포함하는 조작된 조직을 이식함을 추가로 포함할 수 있으며, 이때 투여 또는 이식 결과 상기 피실험자에서 호흡기 질환의 증상이 개선, 치료 또는 경감된다. 상기 개선, 치료 또는 경감은 자연적 감각 또는 인공 장치를 사용하여 탐지될 수 있는 상기 호흡기 질환 또는 상기 호흡기 질환의 증상의 임의의 변화일 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 호흡기 질환은 호흡기 중에 신체적으로 나타난 질병 또는 상태, 예를 들어 비제한적으로 낭성 섬유증, 호흡곤란 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 폐결핵, 기침, 기관지 천식, 증가된 기도 과민반응에 기반한 기침(기관지염, 독감 증후군, 천식, 폐쇄성 폐질환 등), 독감 증후군, 기침억제, 기도 과민반응, 결핵 질병, 천식(기도 염증성 세포 침윤, 증가된 기도 과민반응, 기관지수축, 점액 과분비 등), 만성 폐쇄성 폐 질환, 폐기종, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 기침, 가역적인 기도 폐쇄, 성인 호흡기 질병 증후군, 비둘기 사육자병, 농부의 폐, 기관지폐 이형성증, 기도 질환, 폐기종, 알러지성 기관지폐 아스퍼질러스증, 알러지성 기관지염 기관지확장증, 직업성 천식, 반응성 기도 질병 증후군, 간질성 폐 질병, 기생충성 폐 질병 등이다. 하나의 실시태양에서, 상기 호흡기 질환은 낭성 섬유증이다.
유리하게, 본 발명의 조성물 및 방법은 종래 기술 방법보다 개선을 나타낸다. 바람직하게 호흡기 질환의 치료에 사용하기 위한 조성물은 본 발명 어딘가에 개시된 바와 같은, iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법을 실시하기 위한 본 발명의 약학 제형의 용도를 포함한다. 상기와 같은 약학 제형을 피실험자에게 투여하기에 적합한 형태로 제공할 수 있으며, 상기 제형은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 하나 이상의 추가적인 성분, 또는 이들의 일부 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 유용한 약학 제형을 흡입, 경구, 비경구, 폐, 비내, 정맥내 또는 또 다른 투여 경로에 적합하게 개발할 수 있다. 다른 고려되는 제형으로는 예상된 나노입자, 리포솜 제제, 및 면역학-기반 제형이 있다. 상기 투여 경로(들)는 숙련가에게 쉽게 자명할 것이며 치료되는 질병의 유형 및 중증도, 치료되는 수의학 또는 인간 환자의 유형 및 연령 등을 포함한 임의의 수의 인자들에 따라 변할 것이다.
본 발명에 개시된 약학 제형을 약물학 분야에 공지되었거나 이후에 개발되는 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다. 일반적으로, 상기와 같은 제조 방법은 상기 세포를 담체 또는 하나 이상의 다른 보조 성분들과 회합하고, 이어서 필요하거나 바람직한 경우, 상기 생성물을 목적하는 단일- 또는 수회-용량 단위로 성형 또는 패키징하는 단계를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 세포를 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 사용하여 제형화한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명 세포의 약학 제형은 치료 유효량의 본 발명의 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 유용한 약학적으로 허용 가능한 담체는 비제한적으로 글리세롤, 물, 염수, 에탄올 및 다른 약학적으로 허용 가능한 염 용액, 예를 들어 포스페이트 및 유기산의 염을 포함한다. 이들 및 다른 약학적으로 허용 가능한 담체의 예는 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences (1991, Mack Publication Co., New Jersey]에 개시되어 있다.
투여/복용
임상 환경에서, 상기 세포에 대한 전달 시스템을 당해 분야에 친숙한 다수의 방법들 중 어느 하나에 의해 환자에게 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 세포의 약학 제형을 흡입에 의해 또는 전신적으로, 예를 들어 정맥내 주사에 의해 투여할 수 있다.
하나의 예시적인 실행에서, 상기 세포의 약학 제형을 폐 조직에의 주사에 의해 직접 투여할 수 있다. 미국특허 제 10/914,829 호는 직접 주사에 대한 프로토콜을 개시한다.
상기 투여 섭생은 유효량을 구성하는 것에 영향을 미칠 수도 있다. 치료학적 제형을 환자에게, 질병 또는 상태와 관련된 증상이 나타나기 전 또는 후에 투여할 수 있다. 더욱이, 다수의 분할된 투여량뿐만 아니라 시차를 둔 투여량을 매일 또는 연속적으로 투여하거나, 또는 상기 용량을 연속적으로 주입하거나 또는 일시 주사할 수 있다. 더욱이, 상기 치료학적 제형의 투여량을 치료 또는 예방 상황의 긴급성에 의해 지시되는 바와 같이 비례적으로 증가시키거나 감소시킬 수 있다.
피실험자, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에의 본 발명 세포의 투여를 공지된 과정을 사용하여, 상기 환자의 질병 또는 상태를 치료하기에 유효한 투여량 및 기간 동안 수행할 수 있다. 치료 효과를 성취하기에 필요한 상기 세포의 유효량은 투여되는 세포의 이식 정도; 투여 시간; 투여 지속기간; 상기 세포와 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 또는 물질; 상기 질병 또는 질환의 상태; 치료되는 피실험자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 기존 병력; 및 의학 분야에 주지된 인자들과 같은 인자들에 따라 다양할 수 있다. 투여량 섭생을 최적의 치료 반응을 제공하도록 조절할 수 있다. 예를 들어, 다수의 분할 용량을 매일 투여하거나 또는 상기 용량을 치료 상황의 긴급성에 의해 지시되는 바와 같이 비례적으로 감소시킬 수도 있다. 당해 분야의 통상적인 숙련가는 과도한 실험 없이 관련 인자들을 연구할 수 있을 것이며 상기 세포의 유효량에 관해 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 약학 제형 중 상기 세포의 실제 투여량 수준을 특정 피실험자에게 독성 없이, 상기 환자에 목적하는 치료 반응을 성취하기에 유효한 상기 세포의 양, 조성물 및 투여 방식을 획득하기 위해서 변화시킬 수 있다.
투여 경로
본 발명 세포의 투여 경로는 흡입, 경구, 코, 직장, 비경구, 설하, 경피, 점막흡수[예를 들어 설하, 혀, 구강(흡수), 요도(흡수), 질(예를 들어 질흡수 및 질 주위), 코(흡수) 및 직장(흡수)], 방광내, 폐내, 십이지장내, 위내, 척추강내, 피하, 근육내, 피내, 동맥내, 정맥내, 기관지내, 흡입, 및 국소 투여를 포함한다.
상기 세포 및 투여량의 적합한 제형은 예를 들어 분산액, 현탁액, 용액, 비드, 펠릿, 점착성 물질 (magmas), 크림, 페이스트, 고약, 로션, 디스크, 좌약, 코 또는 경구 투여용 액체 스프레이, 흡입용 분무 제형, 방광내 투여용 조성물 및 제형 등을 포함한다.
본 발명에 유용한 제형 및 조성물이 실시예에 제시된 특정 제형으로 제한되지 않음은 물론이다. 하기의 실시예는 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 상기 세포, 분화 방법, 조작된 조직, 및 본 발명의 치료 방법의 제조 및 사용 방법에 대한 완전한 개시 및 기재를 제공하기 위해 제안된 것이며 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
본 발명의 실시는 달리 가리키지 않는 한 통상적인 분자 생물학(재조합 기법 포함), 미생물, 세포 생물학, 생화학 및 면역학 기법을 사용하며, 이들 기법은 충분히 숙련가의 이해 범위내에 있다. 상기와 같은 기법은 예를 들어 하기의 문헌들에 충분히 설명되어 있다: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", fourth edition (Sambrook, 2012); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Culture of Animal Cells" (Freshney, 2010); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1997); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Short Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 2002); "Polymerase Chain Reaction: Principles, Applications and Troubleshooting", (Babar, 2011); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 2002). 이들 기법을 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 생성에 적용할 수 있으며, 그 자체가 본 발명을 구성하고 실시하는데 고려될 수 있다. 특정 실시태양들에 특히 유용한 기법들을 하기의 섹션에서 논의할 것이다.
실시예
본 발명을 하기의 실험 실시예를 참조하여 상세히 추가로 개시한다. 이들 실시예는 단지 예시를 목적으로 제공되며, 달리 명시되지 않는 한 제한하는 것을 의도하지 않는다. 따라서, 본 발명을 결코 하기의 실시예로 제한되는 것으로서 해석해서는 안 되며, 오히려 본 발명에 제공된 교시의 결과로서 자명해지는 모든 변화들을 포함하는 것으로서 해석해야 한다.
추가의 개시 없이, 당해 분야의 통상적인 숙련가는 선행 명세서 및 하기의 예시적인 실시예를 사용하여 본 발명의 화합물들을 제조 및 사용하고 청구된 방법을 실행할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서 하기의 실행 실시예는 본 발명의 실시태양들을 구체적으로 지적하며 어떠한 식으로도 제한으로서 해석하지 않는다.
이제 본 발명에 개시된 실험의 수행에 사용되는 물질 및 방법을 개시한다.
인간 iPS 세포의 배양
본 연구에 사용되는 렌티바이러스(클론 C2)를 사용하여 재프로그램화된 iPS 세포인 인간 iPS 세포주는 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 위스콘신-매디슨 대학 해부학부의 제임스 에이 톰슨 교수(Prof. James A Thomson)에 의해 제공되었다. 클론 C2는, OCT-4, SOX2, Nanog 및 lin28 유전자에 의한 단리된 인간 피부 섬유아세포의 렌티바이러스 형질도입에 의해 생성되었다. CF-iPS 세포는 다렐 엔 코튼 교수(Prof. Darrell N Kotton)에 의해 제공되었으며 낭성 섬유증 환자 피부 샘플로부터 단리된 피부 섬유아세포로부터 생성되었다. CF-iPS 세포는 단일 렌티바이러스 벡터에 의해 트랜스유전자 없이 생성되었다. 이들 유도만능인간 줄기세포는 이미 상기 톰슨과 코튼 실험실에서 특성화되었다. 이들은 통상적인 핵형을 가지며, 텔로머라제 활성을 발현하고, 세포 표면 마커, 및 인간 ES 세포를 특성화하는 유전자를 발현하고, 3개의 1차배엽층 전부의 진행된 유도체로 분화할 발생 가능성을 유지한다. 상기 2개의 iPS 세포주는 H9와 같은 hESC와 구별할 수 없는 형태를 나타내었으며 마우스 배아 섬유아세포 공급기 또는 매트리젤상에서 무기한 유지될 수 있다. 상기 2개의 인간 iPS 세포를 모두 앞서 톰슨 실험실에 의해 개시된 바와 같이 배양하고 유지시켰다. 간단히, iPS 세포를 DMEM-F12 배지 및 4 ng/㎖ bFGF, 1 mM 글루타민, 1% mM 불필수 아미노산 및 0.1 mM β-머캅토에탄올이 보충된 20%의 녹아웃 혈청 교체물 중의 조사된 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 공급층상에서 37 ℃, 5% CO2 및 90 내지 95% 습도하에, 배지를 매일 교환하면서 번식시켰다. 미분화된 iPS 세포는 줄기세포 커팅 도구(VWR)를 사용하는 기계적 해리에 의해 새로운 공급기상에서 4 내지 5일마다 계대배양하였다.
iPS 세포의 기도 상피세포로의 시험관내 분화
iPS 세포를 먼저 완성 내배엽(DE)을 향해 분화시켰다. DE 세포를 앞서 개시된 조건하에서 개시시켰다. 간단히, iPS 세포를 100 ng/㎖ 액티빈 A, 2 mM L-글루타민 및 1% 항생제-항진균제가 보충된 RPMI 1640 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 이어서, 1xB27 보충제 및 0.5 mM 나트륨 부티레이트를 동일한 배지에 가하고 iPS 세포를 상기 배지에서 3일 동안 배지를 매일 교환하면서 배양하였다.
후속으로, 상기 DE 세포를 트립신 처리하고 인간 ECM 단백질 코팅된 플레이트상에 재도말하고, 이를 d5 내지 d7 동안 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 1 mM 불필수 아미노산, 1% 항생제-항진균제가 있는 IMDM 중의 소분자 억제제들의 조합에 연속적으로 노출시킴으로써 전방 전장 내배엽(AFE)으로 분화시켰다. 도 1을 참조하시오.
이어서 AFE 세포를 20% FBS, 2 mM L-글루타민, 1 mM 불필수 아미노산, 1% 항생제-항진균제, 레티노산(0.5 μM), bFGF(10 ng/㎖), BMP4(10 ng/㎖), Wnt3a(100 ng/㎖), 및 KGF(10 ng/㎖ 각각)와 IMDM으로 이루어지는 폐 내배엽 분화 배지 중에서 5일 동안 유지시켰다. 이어서 상기 생육 인자 조합을 BMP7(10 ng/㎖), KGF(10 ng/㎖), 고농도의 레티노산(1 μM), RA-보충된 B27, IWR-1(100 nM), (WNT 길항물질) PD98059(1 μM)(MAPK 길항물질)로 3일 동안 전환시켰다.
16일째에 시작하여 세포를 IWR-1(50 nM), 고 RA(1 μM), BMP7(10 ng/㎖), KGF(10 ng/㎖), EGF(10 ng/㎖), 덱사메타손(50 nM), 부티릴cAMP(0.1 mM) 및 아이소부틸메틸크산틴(0.1 mM)이 보충된 동일한 기본 배지에서 12일 동안 추가로 기도 상피세포로 분화시켰다. 대안으로서, 상기 DE 세포를 상기 언급한 동일한 배지를 사용하여, 분할 없이 직접 분화시켰다. 28일째에, 세포를 트립신으로 분할하고, 사용시까지 BEGM™ 기관지 상피세포 생육 배지(Lonza) 중에서 콜라겐 I/III 코팅된 플레이트상에 재시딩하였다.
실시간 정량적인 RT-PCR
전체 RNA를 제조사의 설명에 따라 RNeasy 미니 키트(Qiagene)으로부터)를 사용하여 iPS 세포 및 iPS 세포-유래된 기도 상피세포로부터 추출하였다. 제1 가닥 상보성 DNA(cDNA)를 제조사의 프로토콜(Invitrogen)에 따라 슈퍼스크립트(SuperScript) 제1 가닥 합성 시스템을 사용하여 프라이머로서 무작위 헥사머로 합성하였다. 동등한 부피의 상기 생성물들의 혼합물을 PCR 증폭에 대한 주형으로서 사용하였다. iQ™ SYBR 그린 슈퍼믹스(Green Supermix)(Bio-Rad) 및 iCyler 및 iQ 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 나타낸 200 nM의 각각의 순방향 및 역방향 프라이머로 25 ㎕의 부피로 반응을 수행하였다. 각각의 샘플을 3회 중복 실행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 4분의 초기 변성 단계에 이어서 95 ℃에서 15s, 60 ℃에서 30s 및 72 ℃에서 30s로 이루어지는 40주기의 PCR을 포함하였다. 관심 유전자(GOI)에 대한 상기 3회 중복 PCR 반응으로부터의 평균 역치 주기(Ct)값을 동일한 cDNA 샘플로부터의 GAPDH에 대한 평균 Ct 값에 대해 표준화하였다. 샘플 A와 샘플 B간의 GIO 전사물 수준의 변화 배수는 2-ΔΔCt 이며, 이때 ΔCt = Ct(GOI) - Ct(GAPDH), 및 ΔΔCt = ΔCt(A) - ΔCt(B)이다.
유식 세포측정 및 면역화학 분석
분화 전 및 DE 및 AFE의 유도 및 기도 상피를 향한 분화 중에, 상기 세포를 상이한 시점들에서 면역화학 및/또는 유식 세포측정에 의해 분석하였다. iPS 세포 및 분화된 세포를 PBS 중의 4% 파라포름알데하이드에 20분 동안 고정시키고, 실온(RT)에서 15분 동안 PBS 중의 0.1% 트리톤 X-100으로 투과시키고, RT에서 60분 동안 PBS 중의 3% BSA 중에서 차단시키고, 이어서 4 ℃에서 밤새 1차 항체, RT에서 2시간 동안 2차 항체 중에서 배양하였다.
유식 세포측정을 위해서, 세포를 상기 고정화/침투 키트(BD 바이오사이언시즈)로부터의 고정화 용액으로 고정시키고, 제조사에 의해 개시된 바와 같은 1차 및 검출 항체로 염색하였다. 간단히 세포를 0.25% 트립신과 2분 동안 배양시켜 단세포 현탁액으로 해리시켰다. 상기 해리된 세포를 250 ㎕의 고정화/침투 용액 중에 재현탁시키고(0.5 x 106 세포), 얼음상에서 20분 동안 유지시키고, 침투/세척 완충제로 2회 세척하였다. 차단 용액으로 얼음상에서 30분 동안 차단시킨 후에, 상기 세포를 얼음상에서 30분 동안 상기 차단 용액 중에서 상응하는 1차 항체와 함께 배양하였다. 상기 세포를 얼음상에서 30분 동안 상응하는 접합된 2차와 배양 후에 350 ㎕의 침투/세척 완충제에 재현탁시키고, 2회 세척하고, 유식 세포측정에 의해 분석하였다.
통계학적 분석
모든 통계학적 분석을 소프트웨어 Origin(OriginLab), 미국 매사추세츠주 노샘프턴 소재)으로 수행하였다. 데이터를 평균±s.e.m.(측정의 표준 오차)으로서 나타내었다. T-검정을 수행하여 2개 그룹이 서로 현저하게 상이한 지를 평가하였다. 0.05 미만의 p 값(양측 검정)은 통계학적 유의수준으로 간주하였다. 모든 오차 막대는 ±SEM을 나타낸다.
오가노이드 형성
15일째의 기도 전구세포를 고 RA(1 μM), BMP7(10 ng/㎖), KGF(10 ng/㎖), EGF(10 ng/㎖), 덱사메타손(50 nM), 부티릴cAMP(0.1 mM) 및 이소부틸메틸크산틴(0.1 mM)이 보충된 IMDM 배지에서 분화된 기도 상피세포 중에서 공기-액체 상 상태로 매트리젤 중에서 15일 동안 배양하였다. 세포를 제조사에 의해 개시된 바와 같이 고정화/침투 키트(BD 바이오사이언시즈)로부터의 고정화 용액으로 고정시키고, 기도 상피세포에 대한 1차 항체, P63 및 NKX2.1 및 검출 항체로 염색하였다.
이제 본 발명에 개시된 실험의 결과를 개시한다.
폐는 그의 근위-원위 축을 따라 상피 조성의 큰 차이를 특징으로 하는 복잡한 3차원 구조를 갖는다. 루미날 상피(기관 및 주기관지)는 주로 섬모세포, 신경내분비(NE) 및 클라라-유사 세포로 구성된다. 후자는 세크레토글로빈, CCSP를 생산한다. 보다 원위의 기도(소기관지 및 세기관지)에서, 클라라 세포가 섬모세포보다 우세하며 기관에서보다 더 많은 NE 세포가 존재한다. 폐의 가장 원위 영역은 2개의 주요 상피세포 유형, 즉 I형(ATI) 및 II형(ATII) 상피세포로 구성되는 폐포의 복잡한 시스템으로 편재된다. ATI는 폐에서 폐포의 대부분에 늘어서 있고(폐포 표면적의 95%까지 덮고 있다) 주로 가스-교환을 맡고 있는 반면, ATII 세포는 폐포 계면활성제를 분비하며 주로 입방형이다. 인간 iPS 세포로부터 완성 내배엽(DE), 전방 전장 내배엽(AFE) 및 후속으로, 인간 폐포 II형 세포의 비교적 동종 집단을 생성시키는 단계적인 분화 방법은 앞서 개시되었다[참조: Ghaedi, et al., JCI 2012]. 본 발명에 개시된 연구에서, 기도 상피 발생을 안내하는 신호전달 경로의 타이밍 및 조화를 모방하는 단계적 분화 접근법을 사용한다. 특유의 전략을 사용하여, 높은 효능으로 인간 만능줄기세포로부터 기능성 기도 상피세포를 생성시켰다.
인간 iPS 세포의 전방 전장 내배엽 및 폐 내배엽 세포로의 유도
기관에서 먼 배아 호흡계는, 많은 종류의 전문화된 상피세포로 분화하는 마우스의 9.5일 또는 인간의 4주의 배아에서 완성 내배엽(DE)의 전방 복부상의 폐 돌기로부터 기원한다.
인간 iPS 세포를 무혈청 조건을 사용하여 DE 세포로 분화시켰다(도 1). iPS 세포를 액티빈 A의 포화 농도에 노출시킴으로써, 85% 초과의 내배엽 세포를 생성시켰다. 유식 세포측정 분석은 5일째에 iPS 세포로부터 유래된 세포 집단이 상기 배엽층과 관련된 마커들을 높은 비율로 발현함을 보였다. 세포의 89%는 c-kit에 양성이었고(도 2A), 91%는 SOX17에 양성이었으며(도 2C), 93%는 FOXA2에 양성이었고(도 2B), 상기 세포의 88%는 클론 C1에서 내배엽 표면 마커 CXCR4를 발현하였다(도 2D).
상기 방식으로 유래된 완성 내배엽 세포는 광범위하게 다능성인 것으로 추정되었지만, 다수의 연구들은 가장 전방의 전장 내배엽 계통, 예를 들어 흉선, 갑상선 및 폐 상피는 상기 전구세포로부터 유래되기 어려움을 입증하였다. 폐포 상피로의 직접 분화는 완성 내배엽(DE)의 생성에 이어서 전방 전장 내배엽(AFE)으로의 패턴화에 의해 진행되어야 한다.
따라서, 두 번째 단계에서, 상기 DE 세포를 AFE로 추가로 분화시켰다. 상기 DE 세포를 해리시키고, 인간 ECM-코팅된 플레이트상에 재도말하고, 2일 동안 AFE 분화 배지에서 배양하였다. ECM 단백질의 선택은 세포외 단백질 기질(콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 테나신, 엘라스틴, 및 다수의 프로테오글리칸 및 글리코스아미노글리칸)의 혼합물을 함유하는 인간 ECM 단백질 표면상에서 배양된 DE 세포가 다른 ECM 단백질상에서 배양된 DE 세포에 비해 더 빨리 부착되고 더 많은 수의 NKX2.1+를 생성시킴을 입증한 선행 연구로부터 성립되었다.
마우스 및 인간 ES 및 iPS에 대한 실험은 iPS 세포-유래된 완성 내배엽에서 액티빈 A/결절 및 TGF-β/BMP 신호전달의 이중 억제가 전방 전장 내배엽을 정량적으로 생성시키는데 요구됨을 입증하였다. 선행의 시도에서, 2일 동안 DE 세포에 대한 노긴(BMP 신호전달의 억제제) 및 SB141524(TGF-β 신호전달 억제제)의 적용이 전방 내배엽 운명(SOX2+)을 위해 후방 내배엽 운명(CDX2+)을 억제하였고 상기 AFE 표현형과 관련된 마커의 강한 발현을 갖는 세포의 농축된 집단을 제공하였다.
NKX2.1+FOXA2+ 전구세포의 수를 증가시키기 위해서, DE 세포로부터 AFE를 생성시키기 위한 선행의 접근법을 변형시켰다. 스네옥(Sneock)과 동료들은 BMP/TGF에 이은 TGF 및 Wnt 신호전달 경로 억제의 연속 억제가 DE 세포로부터 보다 양호한 AFE 분화를 제공함을 입증하였다[참조: Huang SX,et al., Nat Biotechnol., 2013 Dec 1. doi: 10.1038/nbt.2754]. AFE 동정을 촉진하기 위해서, DE 세포를 6 내지 8일간 표 1에 나열된 바와 같은 BMP4/TGFβ 및 Wnt 작용물질 및 길항물질의 상이한 조합들에 연속적으로 노출시켰다. 상기 NKX2.1+, FOXA2+ SOX2+ 및 NKX2.1+FOXA2+ 전구세포 수를 증가시키는 능력을 검사하였다. FOXA2/SOX2 및 NKX2.1 발현에 대한 AFE 분화 중 표 1에 나열된 작용물질 및 길항물질의 효과를 각각 도 3A 및 3B에 나타낸다.
6 내지 8일간 연속적으로 첨가된 BMP4/TGFβ 및 Wnt 작용물질 및 길항물질의 목록
조건 작용물질/길항물질 농도 작용물질/길항물질 농도
5-6 일 6-7 일
A 배지 N/A 배지 N/A
B 노긴/SB 200ng/10mM 노긴/SB 200ng/10mM
C 도르소몰핀, SB 10μM/10mM IWP2, SB 10μM/10mM
D A-83-01, 도르소몰핀 500nM/10μM IWP2, SB 10μM/10mM
E 도르소몰핀, SB 10μM/10mM 도르소몰핀, SB 10μM/10mM
F IWP2, SB 10μM/10mM IWP2, SB 10μM/10mM
G 액티빈 A 100ng 액티빈 A 100ng
H BMP4 10ng BMP4 10ng
선행 연구들은 FGF, BMP4과 구성원, KGF 및 WNT3a가 폐 내배엽으로의 패턴화를 위해 배발생 동안 신호를 제공함을 입증하였다. BMP4 신호전달은 폐 특정화에 필요하고 bFGF 및 WNT 농도의 증가는 NKX2.1+ 미숙한 폐 전구세포를 증가시킨다. 폐 세포 운명을 명시하기 위해서, 7일 후에 상기 배지를 bFGF(10 ng/㎖), BMP4(10 ng/㎖), Wnt3a(100 ng/㎖) 및 KGF(10 ng/㎖)를 함유하는 폐 내배엽 분화 배지로 5일 동안 전환시켰다. 7일째에 상이한 조건들 간의 FOXA2+SOX2+ 전방 내배엽 세포의 수를 비교하였다. FOXA2+SOX2+ 전방 내배엽 세포에 이중 양성인 세포의 수를 유식 세포측정에 의해 전체 FOXA2+ 내배엽 세포로부터 정량분석하였다. 결과는 DE 세포에서 BMP4/TGFB 및 Wnt 신호전달의 차단이 배지 단독에 비해 FOXA2+SOX2+ 전방 내배엽 세포의 수를 증가시킴을 암시하였다. 이러한 증가는 세포가 다른 억제제들의 조합에 비해 도르소몰핀/SB431542(BMP/TGFβ의 억제제) 및 IWP2/SB431542(WNT/TGF-β의 억제제)의 조합에 연속적으로 노출되었을 때 더 현저하였다(도 3A).
NKX2.1+은 상기 전장 내배엽의 다른 유도체로부터 미래의 폐를 구별하는 세포의 가장 초기 마커이다. BMP/TGFβ 및 WNT/TGF-β에의 연속 노출을 시험하여 상기가 iPS 세포-DE 세포를 NKX2.1+ 내배엽 세포로의 분화에 보다 반응성으로 만드는지를 측정하였다. NKX2.1+ 세포의 비율을 존재하는 전체 세포의 비율로서 정량분석하였다. 상기 NKX2.1+ 세포의 수는 DE 세포가 다른 억제제들의 조합에 비해 도르소몰핀/SB431542(BMP/TGFβ의 억제제) 및 IWP2/SB431542(Wnt/TGF-β의 억제제)의 조합에 연속적으로 노출되었을 때 더 높았다(도 3B).
상기 프로토콜을 추가로 조작하여(도 4 및 하기 표 2 참조), 전방화 없이 1% 미만으로 노긴/SB에 노출된 DE 세포에서의 50%에 비해, 15일째에 72.1%의 NKX2.1+FOXA2+ 세포의 증가를 생성시켰다. FOXA2로 공-염색된 생체외 분화된 모든 NKX2.1+ 세포(도 6A 내지 6D)는 시험관내에서 분화된 NKX2.1+ 세포가 폐 내배엽 세포를 나타냄을 암시하였다. 연속적인 액티빈 A 처리는 드문 FOXA2+SOX2+ 세포 및 소수의 NKX2.1+ 세포(도 3A 및 3B)를 생성시켰으며, 이는 액티빈 A 노출의 최적의 지속기간이 중요함을 암시한다. PAX8+(갑상선 마커) 및 TUJ1(신경 마커) 세포는 배양물 중에서 검출되지 않았다(데이터 도시 안 됨). 이들 결과는 모두 FGF, BMP4 및 WNT 신호전달의 조합이, DE 세포에서 BMP4/TGFB 및 WNT 신호전달의 연속적인 차단 후에, 전방 내배엽으로부터의 폐-특이적인 NKX2.1+ 전구세포의 계통 특정화를 촉진한다는 발견과 일치하였다.
5 내지 15일간 연속적으로 첨가된 BMP4/TGFβ 및 Wnt 작용물질 및 길항물질의 목록
조건 작용물질/길항물질 작용물질/길항물질 작용물질/길항물질
5-7 일 7-10 일 10-15 일
A SB/노긴 BMP4,bFGF, WNT3a, KGF IWR-I, PD98059, 고 RA, BMP7, KGF
B DSM,SB/ IWP2, SB BMP4,bFGF, WNT3a, KGF IWR-I, PD98059, 고 RA, BMP7, KGF
C SB/노긴 WNT3a, BMP4, FGF10, KGF, RA WNT3a, BMP4, FGF10, KGF, RA
D DSM,SB/ IWP2, SB WNT3a, BMP4, FGF10, KGF, RA WNT3a, BMP4, FGF10, KGF, RA
성숙한 폐 기도 상피세포의 임의의 유형에 대한 마커들, 예를 들어 뮤신1, 뮤신5AC(배상세포), FOXJ1(섬모세포) 및 CCSP(클라라 세포)는 면역형광 염색 또는 PCR에 의해 단백질 수준에서 검출되지 않았다(데이터 도시 안 됨).
폐 기도 전구세포를 향한 폐 내배엽 세포의 분화
초기 폐 내배엽(NKX2.1+/FOXA2+)은 다능성이며 그의 운명은 국소 미세환경(주로 중배엽) 또는 지역적(근위 대 원위) 세포 운명을 조절하는 신호에 의해 제공되는 신호에 따라 변한다. 상기 기도 상피의 분화는 배아 폐의 자루에서 발생하는 반면, 정점의 폐포 전구세포는 원위 세포, ATII 및 ATI 세포로 분화한다. 상기 자루 영역의 NKX2.1+SOX2+ 세포는 성숙한 기도 상피를 생성시키는 기도 전구세포이다. 대조적으로, 상기 원위 배아 폐 돌기 정점은 SOX9 및 FOXP2를 발현하며 모든 세포 유형의 기도 및 폐포를 생성시킬 수 있다.
BMP4는 원위에서 발현되는 반면, BMP7은 상기 기도에 가깝게 발현된다. 원위 bFGF 및 FGF10은 근위 KGF(FGF7)에 의해 교체되는 반면, WNT 신호전달은 근위 자루 전구세포에서 억제되고 원위 정점에 존재한다. SOX2는 기본적인 WNT 신호전달에 의해 음으로 조절되는, 기관지 계통 특정화의 핵심 조절인자이다. WNT 및 MAPKK/ERK 신호전달 경로의 억제는 AFE 세포로부터 NKX2.1+SOX2+ 세포 비율을 증가시킨다. 레티노산(RA)은 폐 돌기 발생에 중요한 인자이며, 이때 RA 농도는 원위 정점 영역에서보다 근위 자루 영역에서 비교적 더 높다. 고 RA 신호전달은 원위 폐 발생을 방지하며 근위 기도 발생을 촉진한다.
NKX2.1+ 폐 전구세포를 NKX2.1+SOX2+ 근위 전구세포로 전환시키기 위해서, 상기 BMP 및 WNT 경로를 상기 기도 나무의 근위 대 원위 패턴화를 조절하기 위해서 조절하였다. 12일째에 근위 기도 운명을 증대시키기 위해서, 생육 인자 조합을 BMP7(10 ng/㎖), KGF(10 ng/㎖), 고농도 레티노산(1 μM), IWR-1(100 nM)(WNT 길항물질), PD98059(1 μM)(MAPK 길항물질)을 함유하는 근위 유도 배지로 3일 동안 전환시켰다. 3일 후에, IWR-1, PD98059, BMP7 및 고 RA 농도에 의한 상기 WNT 경로의 억제가 관찰되었다. 상기 NKX2.1+/SOX2+ 기도 전구세포는 처리 전 약 1 내지 2%에 비해 약 30%까지 만들어졌다. (도 7A-7D 및 8)
기도 분화를 더욱 촉진하기 위해서, 15일째에 전구세포를 IWR-1(100 nM), RA(1 μM), BMP4(10 ng/㎖), BMP7(10 ng/㎖), KGF(10 ng/㎖), EGF(10 ng/㎖)가 보충된 동일한 기본 배지에서 12일 동안 배양하였다. 도 9를 참조하시오. 정량적인 RT-PCR은 성숙한 폐 기도 상피세포 마커, 예를 들어 FOXJ1(섬모세포)(도 10A), KRT5(기본 세포)(도 10B), CFTR(도 10C), CCSP 또는 SCGB1A1(클라라 세포)(도 10D), P63(도 10E), 뮤신5AC(배상세포)(도 10G)의 비교적 적당한 증가, 및 SOX2 발현(이는 20일의 분화시 iPS 세포로부터 유래된 세포에서 고도로 발현되었다)과 비교시(도 10F)를 밝혀내었다. 또한 표 3을 참조하시오.
기도 분화를 촉진하기 위해 기본 배지에 첨가되는 작용물질 및 길항물질의 목록
조건 처리
　 작용물질/길항물질 (7-10) 작용물질/길항물질 (10-20)
A 미분화된 인간 iPS 세포
B 완성 내배엽 세포
C 전방 전장 내배엽 세포
D BMP4,bFGF, WNT3a, KGF IWR-I, PD98059, 고 RA, BMP7, KGF
E WNT3a, BMP4, FGF10, KGF, RA WNT3a, BMP4, FGF10, KGF, RA
F 인간 기도 세포
27일째에 유식 세포측정은 세포의 76%가 기도 세포 마커 SOX2에 대해 양성일 때 상기 언급한 생육 인자 및 억제제 조합이 기도 상피 분화를 유도함을 밝혀내었다(도 11 및 12D). SOX2 양성 세포의 비율은 35일째에 72%에서 92%로 증가하였다. 기저 및 분비/섬모세포는 큰 및 작은 기도 구획의 2개의 주요 상피세포 계통이다. 기저 세포(BC)는 인간 폐의 안내 기도에 늘어서 있고 앞서 다른 근위 기도 계통을 생성시키는 것으로 나타난 다열 상피이다. BC의 한 가지 특징은 전사 인자 형질전환-관련 단백질 63(P63) 및 세포골격 단백질, 사이토케라틴 5 및 14(각각 KRT5 및 KRT14)의 높은 발현 수준이다. 이들 세포는 공기-액체 계면에서 배양시 또는 시험관내 기관구(tracheosphere) 분석에서 인간 기도에서 증식하고 섬모 및 분비 세포(클라라 세포)를 생성시킨다.
분화 27일째에, 세포의 64%는 KRT5에 대해 양성이고(도 12F) 상기 세포의 60% 이상은 P63+였으며(도 12H), 이는 상기 세포의 대다수가 잠재적인 기저 세포 전구세포임을 암시한다. 세포의 76%는 클라라 세포 분비 단백질(CCSP)을 발현한다(도 12E). 클라라-유사 세포는 근위에서부터 원위 축까지 전체를 통해서 상피 분비 세포이며 오랫동안 상기 기도의 전구세포로서 작용하는 것으로 생각되었다. 낭성 섬유증 트랜스막 전도도 조절인자(CFTR)는 상피 세포막을 가로질러 클로라이드 및 티오시아네이트 이온을 수송하는 ABC 수송자-부류 이온 채널이다. 대부분의 기도 상피세포뿐만 아니라 신경상피 세포는 CFTR 단백질을 발현한다. 유식 세포측정 분석은 27일째에 세포의 36%가 CFTR에 대해 양성임을 밝혀내었다(도 12B). 세포의 65% 이하 및 58%는 섬모세포 마커, FOXJ1(도 12A) 및 β-튜불린 IV(도 12C) 각각에 대해 양성이었으며, 이는 상기 배양물 중의 세포의 적어도 1/3이 섬모가 있는 CFTR-발현 기도 표현형(도 12B)을 가짐을 암시한다. 세포의 단지 8%만이 배상세포 마커인 뮤신-5AC를 발현하였다(도 12G).
27일째에 qPCR은 기도 분화 배지의 전환이 기도 유전자 KRT5(도 13F), P63, FOXJ1(도 13B), SOX17, MUC5AC(도 13D) 및 CFTR(도 13A)을 추가로 조절하는 반면, 더 낮은 수준의 뮤신5AC, SCGB1A1(CCSP)(도 13C)이 존재함을 가리켰다. 다른 내배엽 계통 마커, 예를 들어 AFP(간), PDX1, TG(갑상선) 및 PAX9(인두)는 이 단계에서 검출되지 않았다.
ECM 단백질은 폐에서 매우 특이적인 분포 및 조립 패턴을 갖는다. 기도 상피 분화의 복잡한 과정은 또한 세포-기질 및 세포-세포 상호작용을 수반한다. 인간 기관 및 기도는 다른 ECM 단백질에 비해 주로 콜라겐 I 및 III로 구성된다. 따라서 28일째에 시작하여 세포를 추가로 7일 동안 BEGM™ 기관지 상피세포 생육 배지(Lonza) 중의 콜라겐 I/III 코팅된 플레이트상으로 옮겼다. 인간 폐포 분화를 위한 변형된 조건을 사용하여, 35일째에 상기 AFE 세포는 높은 효율로 성공적으로 기도 상피 전구세포로 전환되었다.
35일째에 분화된 세포는 기도 상피 세포 마커, CFTR(도 15E), CCSP(도 15D), 뮤신5AC(도 15C), FOXJ1(도 15B) 및 PanKRT(도 15F)에 대해 양으로 염색되었다. 35일째에 유식 세포측정에 의해 측정시, 세포의 100%는 기도 세포 마커, SOX2(도 16H)에 대해 양성이었고, 세포의 97.5% 이하는 P63에 대해 양성이었다(도 16D). 세포의 100% 이하는 CCSP(클라라 세포)(도 16F), β-튜불린 IV(도 16C) 및 FOXJ1(섬모세포)(도 16B)을 발현하였다. 세포의 62% 및 24%는 각각 CFTR(도 16E) 및 뮤신5AC(도 16A)에 대해 양성이었다.
35일의 끝에서 세포의 대다수, 92.2%는 KRT5 또는 CK5에 대해 양성인 반면, 섬모 및 분비 표현형을 나타내는 FOXJ1 및 CCSP를 발현하였다. 이는 iPS 세포-유래된 기도 세포가 여전히 이 단계에서 잠재적으로 다능성을 가짐을 입증한다. 상기 기도 전구세포 또는 기저 세포는 다른 근위 세포, 예를 들어 클라라 세포 및 섬모 세포로 분화를 겪는 중에 있을 때 기저 세포 마커, KRT5 및 P63의 발현을 유지할 수 있다. 곰퍼츠(Gomperts) 등은 오가노이드 분석에서 클라라 세포가 FOXJ1을 발현하고, 섬모 표현형을 가질 뿐만 아니라 Muc5AC, CCSP 및 케라틴5를 발현하는 세포를 함유함을 입증하였다.
35일째 정량적인 RT-PCR은 CK5 또는 KRT5(도 17A), SCGB1A1(CCSP)(도 17E), CFTR(도 17B), P63(도 17D), FOXJ1(도 17F) 및 뮤신-5AC(도 17G)가 iPS 유래된 기도 상피세포에서 고도로 발현되었으며, 이때 발현 수준은 새로 단리된 인간 기도 세포에 필적함을 밝혀내었다. 이들 유전자는 미분화된 iPS, DE, AFE 세포에서는 검출될 수 없었다.
이어서, 유사한 단계적 분화 접근법을 CF 질병-특이적인 인간 iPS 세포로부터 폐 기도 전구세포를 생성시킴에 대해 검사하였다(도 18). 흥미롭게도, CF-iPS 세포 클론은 유사한 결과를 제공하였으며 DE, AFE, 기도 상피 세포를 향한 유사한 분화 효율을 가졌고, 이는 상기 프로토콜을 다른 공급원으로부터의 다른 iPS 세포주로 일반화시킬 수 있음을 암시한다(도 19A 내지 19D는 세포 염색을 도시하고, 도 20A 내지 20H는 유식 세포측정 분석을 도시하며 도 21A 내지 21H는 정량적인 RT-PCR 결과를 도시한다).
면역염색 분석은 또한 iPSC로부터 유래된 기도 전구세포 집단이 매트리젤에서 폐 오가노이드 구조로 발달할 수 있음을 보였다. 상기 구조는 기도 마커, P63(도 22A) 및 NKX2.1(도 22B)에 대해 양성이었다.
인체 내로의 이식을 위한 기능성 폐포 조직의 생체외 분석을 위한 진보된 기술의 개발은 조직 공학자가 직면하고 있는 도전적인 임무 중 하나이다. ESC 및 iPS 세포의 폐 상피세포 또는 전구체로의 분화에 있어서 최근의 진보는 폐 공학을 위해 줄기세포 유래된 상피세포를 사용하는 유망한 치료 전략을 제안하였다.
본 연구에서 고도로 효율적인 방법이 iPS 세포의 기능성 안내 기도 상피세포로의 직접적인 분화를 위해 개발되었으며, 이를 세포물질 제거된 폐 스캐폴드의 재세포화에 사용할 수 있고 이는 최종적으로 폐 이식용 자가 이식편을 제공할 수 있다. 현저하게, 상기 직접 분화 방법을 다수의 만능세포주(태아 폐 섬유아세포로부터 재프로그램화된 인간 iPS 세포 클론 C1, 및 피부 섬유아세포로부터 재프로그램화된 CF-iPS 세포)에 광범위하게 적용할 수 있다. 상기 두 iPS 세포 클론은 모두 유사한 결과를 제공하며 DE, AFE 및 상이한 유형의 기도 세포를 향한 유사한 분화 효율을 가졌고, 이는 상기 프로토콜을 다른 공급원으로부터의 다른 iPS 세포주에 일반화할 수 있음을 암시한다. iPS 세포의 폐포 상피로의 분화에 있어서 대부분의 노력은 II형 상피세포의 생성에 초점을 두고 있으며 소수의 연구는 기도 상피의 분화를 표적화하였다. 모든 공개된 보고서들에서, 상기 효능은 낮았으며 기도 마커의 발현은 확률론적인 것으로 보인다. ESC 및 iPS 세포를 낮은 효능으로 분화시키는 이종 배양물에서, 미분화된 만능줄기세포가 상기 집단내에 남아있을 위험이 있으며, 이는 이식 후 기형종을 형성시킬 중대한 위험을 가질 수 있다. 줄기세포 유형이 분화에 사용될지라도, 특히 다량의 충분히-분화된 세포의 생성에서 폐 공학에 도전은 여전히 남아있다. 선행의 보고서들에서 iPS 세포로부터 분화된 기도 세포는 확대시키기 어려웠다. 그러나, 단리된 기도 세포와 달리, 본 연구에서 iPS 세포-유래된 기도 세포는 기도 상피세포-관련된 마커, 예를 들어 CCSP, P63, FOXJ1, CFTR 및 뮤신-5AC의 상실 없이 수회의 계대동안 증식할 수 있으며 무세포 기질 스캐폴드에 시딩되는 수천만 개의 세포를 생성시키는데 사용될 수 있다. 전구세포 집단을 "확대"시키는 능력은 이들 기술을 자가 iPS 세포 유래된 세포를 사용하여 조직 조작된 인간 폐 조직을 생성시키는 용도로 번역될 때 특히 귀중할 것이다.
더욱이, 유전 및 퇴행성 질환에 걸린 환자의 치료를 허용하는 한정된 이식성 세포의 공급을 제공하는 것은 인간 세포 요법의 주목적이다. 몇몇 폐 질환, 예를 들어 낭성 섬유증에서, 인간 폐로부터 단리된 성인 폐 줄기 및 전구세포 또는 폐포 세포의 이식은 환자에서 정상적인 폐 기능을 복원시키기 위한 새로운 치료학적 접근법으로 대두되고 있다. 그러나, 상기 접근법은 인간 폐포 세포의 부족, 및 보다 중요하게는 손상된 폐에서 생체내에서의 상기와 같은 세포의 생착의 결여에 의해 제한된다.
iPS 세포로부터 유래된 기도 상피세포 또는 폐 상피 전구체는, 환자에서 타고난 폐 상피세포의 교체 및 건강한 폐 상피의 복원을 위해 줄기세포 기반 흡입 요법을 사용하는 유망한 치료학적 전략을 제공한다.
더욱이, 신규 약물의 개발은 비용이 많이 들며 자원 집약적이다. iPS 유래된 기도 상피세포는 초기 표적 연구 및 안전성 평가에서 도구로서뿐만 아니라 선별 모델로서의 용도에서부터 새로운 화학적 존재의 발견에 이르는, 약학적 개발에 잠재적으로 매우 귀중하다. 상기 iPS 유래된 기도 상피세포는 폐 조직의 병리에 대해 약물을 시험하는데 유용할 수 있다. 또한, 상기 iPS 유래된 기도 상피세포를, 폐 조직의 병리에 대한 치료제용의 특정한 전달 비히클의 효과를 검사하는데, 예를 들어 다양한 전달 시스템을 통해 투여된 동일 약제의 효과를 비교하거나, 또는 단순히 전달 비히클 자체(예를 들어 바이러스 벡터 대 비-바이러스 벡터)가 폐 병리학에 영향을 미칠 수 있는지의 여부를 평가하는데 사용할 수 있다.
공급층 또는 매트리젤상의 iPS 세포의 완성 내배엽 단계로의 직접적인 분화를 엠브로이드체 방법 대신 사용하였다. DE를 향한 직접적인 분화는 EB 방법에 비해 고순도의 집단을 제공하였다. 이는 주로 상기 엠브로이드체에서, 액티빈 A의 존재하에서조차 세포가 2개의 다른 배엽층, 중배엽 및 외배엽으로부터 남아있기 때문이었다.
완성 내배엽을 유도하기 위해서, iPS 세포를 48시간 동안 100 ng/㎖의 액티빈 A가 보충된 무혈청 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 이어서, 1xB27 보충제, 0.5 mM 나트륨 부티레이트를 동일한 배지에 가하고 iPS 세포를 상기 배지에서 추가로 3일 동안 배양하였다. 앞서 확립된 공개된 프로토콜에서는 세포를 액티빈 A를 함유하는 배지에서 5일 대신에 4일 동안 배양하였다. 1xB27 보충제는 저 혈청 조건을 제공하였다. 이들 세포는 또한 나트륨 부티레이트의 존재하에서 균일한 형태를 나타내었다.
다른 프로토콜에서, 조사자들은 대개 무혈청 배지 또는 제한 배지를 사용하였다. 대조적으로, 본 발명에 개시된 변형된 프로토콜은 5일째에 상기 배엽층과 관련된 마커를 높은 비율로 발현하는 iPS 유래된 세포 집단을 생성시켰다. 상기 세포 집단은 세포의 89%가 c-kit에 대해 양성이고, 91%는 SOX17에 대해 양성이며, 93%는 FOXA2에 대해 양성이고, 상기 세포의 88%는 클론 C1에서 내배엽 표면 마커 CXCR4를 발현하였다.
완성 내배엽을 전방 전장 내배엽으로 분화시키기 위해서, 상기 DE 세포를 5% FBS 및 도르소몰핀/SB141524를 함유하는 IMDM에서 배양하였다. 다른 프로토콜은 IMDM 대신에 다른 기본 배지를 사용하였으며, 다른 것들은 무혈청 배지 또는 제한 배지를 사용하였다.
전방 전장 내배엽으로부터 안내 기도 세포로의 분화를 조절하기 위해서, 생육 인자 및 세포외 단백질 기질에 집중하였다. 본 발명에 개시된 분화 방법에서, 10% FBS를 갖는 IMDM 중의 EGF, KGF 및 BMP7, BMP4, IWR-1(WNT3a 억제제) 및 고 레티노산을 선택하였다. 상기 분화 칵테일은 선행 보고서들에서 사용되지 않았다.
본 발명에 개시된 방법들은 폐 중에 존재하는 세포외 기질 단백질(상기는 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 테나신, 엘라스틴, 및 다수의 프로테오글리칸 및 글리코스아미노글리칸을 포함한다) 및 폐 발생 및 재생에 중심 역할을 하는 생육 인자들의 조합을 사용하여 배발생 중 폐 발생을 모방한다. iPS 세포를 먼저 완성 내배엽(DE)을 향해 분화시키고 이어서 ECM 코팅된 표면상에서 배양하였다. 본 발명에 개시된 분화 방법들은 기도 상피세포 분화를 위한 ECM 코팅된 표면을 조직-특이적인 분화를 위한 인간 iPS 세포 중의 생육 인자와 함께 사용하는 것을 최초로 발견하였다.
기도 상피 분화의 복잡한 과정은 또한 세포-기질 및 세포-세포 상호작용을 수반한다. 인간 기관 및 기도는 주로 콜라겐 I 및 III로 구성된다. 따라서 28일째에 시작하여 세포를 추가로 5일 동안 BEGM™ 기관지 상피세포 생육 배지(Lonza) 중의 콜라겐 I/III 코팅된 플레이트상으로 옮겼다. 본 연구는 최초로 iPS 세포로부터 기도 상피 분화에 콜라겐 I/III 혼합물 코팅된 표면을 사용한 연구이다.
뜻밖에도 인간 만능줄기세포가 시험관내에서 높은 효능으로 안내 기도 상피로의 분화를 지시할 수 있음을 발견하였다. 인간 기도 분화를 위한 본 발명에 개시된 방법을 사용하여, 35일째에 상기 AFE 세포는 높은 효율로 성공적으로 기도 상피 전구세포로 전환되었다. 35일째에 유식세포에 의해 측정된 바와 같이, 세포의 약 100%는 기도 세포 마커, SOX2에 대해 양성이었고, 세포의 약 97.5% 이하는 P63에 대해 양성이었다. 추가로, 세포의 약 100% 이하는 CCSP(클라라 세포) 및 β-튜불린 IV 및 FOXJ1(섬모세포)을 발현하였다. 세포의 약 62% 및 24%는 각각 CFTR 및 뮤신5AC에 대해 양성이었다.
35일의 끝에서 세포의 대다수, 약 92.2%는 KRT5에 대해 양성인 반면, 섬모 및 분비 표현형을 나타내는 FOXJ1 및 CCSP를 발현하였다. 정량적인 RT-PCR은 또한 CK5, SCGB1a1(CCSP), CFTR, P63, FOXJ1 및 뮤신-5AC가 iPS 유래된 기도 상피세포에서 고도로 발현되었고, 이때 상대적인 수준은 새로 단리된 인간 기도 세포에 필적함을 밝혀내었다.
단리된 기도 세포와 달리, 본 발명에 개시된 iPS 세포-유래된 기도 세포는 기도 상피 세포-관련된 마커, 예를 들어 CCSP, P63, FOXJ1, CFTR 및 뮤신-5AC의 상실 없이 다수의 계대 동안 증식할 수 있다. 이는 추가의 목적, 예를 들어 조작된 폐 조직의 제조를 위한 무세포 기질 스캐폴드의 시딩을 위해 수천만 개의 세포를 생성시킬 수 있게 한다.
다른 실시태양들
본 발명의 변수의 임의의 정의에서 요소들의 목록의 인용은 임의의 단일 요소 또는 나열된 요소들의 임의의 조합(또는 하위조합)으로서 상기 변수의 정의를 포함한다. 본 발명의 실시태양의 인용은 상기 실시태양을 임의의 단일 실시태양으로서 또는 임의의 다른 실시태양 또는 그의 일부와 함께 포함한다.
본 발명에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 공보의 명세는 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다. 본 발명을 특정한 실시태양들을 참조하여 개시하였지만, 본 발명의 다른 실시태양 및 변화들이 본 발명의 진정한 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 당해 분야의 다른 숙련가들에 의해 궁리될 수 있음은 자명하다. 첨부된 특허청구범위를 모든 상기와 같은 실시태양 및 균등한 변화를 포함하는 것으로서 해석하고자 한다.

Claims (14)

  1. 유도된 만능줄기(iPS) 세포로부터 유래된 기도 상피세포의 생체외(ex vivo) 집단으로서, 기도 상피세포의 생체외 집단이
    클라라 세포 분비 단백질(CCSP), 사이토케라틴 5(KRT5) 및 FOXJ1을 포함하는 기도 세포 표면 마커를 발현하되, 기도 세포 표면 마커가 새로 단리된 인간 기도 세포상에서 발현되는 수준에 필적하는 수준으로 발현되고;
    기도 세포 표면 마커의 상실 없이 배양물 중에서 적어도 30일 동안 증식하는 능력을 특징으로 하는, 기도 상피세포의 생체외 집단.
  2. 제1항에 있어서, 기도 상피세포가 섬모가 있는, 기도 상피세포의 생체외 집단.
  3. 제1항에 있어서, 낭성 섬유증 트랜스막 전도도 조절 단백질(CFTR)의 발현을 추가의 특징으로 하는, 기도 상피세포의 생체외 집단.
  4. 제1항에 있어서, β-튜불린 IV, 뮤신-5AC 및 P63 중 적어도 하나의 발현을 추가의 특징으로 하는, 기도 상피세포의 생체외 집단.
  5. 제1항에 있어서, 기도 상피세포가 낭성 섬유증 인간 iPS 세포로부터 유래되는, 기도 상피세포의 생체외 집단.
  6. 제1항의 기도 상피세포의 생체외 집단을 포함하는, 조작된(engineered) 3차원 폐 조직.
  7. 3차원 폐조직을 조작하는 방법으로서,
    (i) 유도된 만능줄기(iPS) 세포의 집단을, 바람직하게는 오가노이드 구조를 형성하는 기도 상피세포의 생체외 집단으로 분화시키는 단계로서, 기도 상피세포의 생체외 집단이
    클라라 세포 분비 단백질(CCSP), 사이토케라틴 5(KRT5) 및 FOXJ1을 포함하는 기도 세포 표면 마커를 발현하되, 기도 세포 표면 마커가 새로 단리된 인간 기도 세포상에서 발현되는 수준에 필적하는 수준으로 발현되고,
    기도 세포 표면 마커의 상실 없이 배양물 중에서 적어도 30일 동안 증식하는 능력을 특징으로 하는 단계; 및
    (ii) 기도 상피세포의 생체외 집단을 3차원 스캐폴드상에 시딩하는 단계를 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 3차원 스캐폴드가 매트리젤(matrigel)을 포함하는, 방법.
  9. 제7항의 방법에 의해 제조된, 조작된 3차원 폐 조직.
  10. 호흡기 질환 증상의 개선, 치료 또는 경감이 필요한 대상체에서 상기 증상을 개선, 치료 또는 경감하는데 사용하기 위한 위한 약학 제형으로서, 약학 제형이 유도된 만능줄기(iPS) 세포로부터 유래된 기도 상피세포의 생체외 집단 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하고,
    기도 상피세포의 생체외 집단이
    클라라 세포 분비 단백질(CCSP), 사이토케라틴 5(KRT5) 및 FOXJ1을 포함하는 기도 세포 표면 마커를 발현하되, 기도 세포 표면 마커가 새로 단리된 인간 기도 세포상에서 발현되는 수준에 필적하는 수준으로 발현되고;
    기도 세포 표면 마커의 상실 없이 배양물 중에서 적어도 30일 동안 증식하는 능력을 특징으로 하는, 약학 제형.
  11. 제10항에 있어서, 호흡기 질환이 낭성 섬유증, 호흡곤란 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 폐결핵, 기침, 기관지 천식, 증가된 기도 과민반응에 기반한 기침, 독감 증후군, 기침억제(anti-cough), 기도 과민반응, 결핵 질병, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 폐기종, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 가역적인 기도 폐쇄, 성인 호흡기 질병 증후군, 비둘기 사육자병, 농부의 폐, 기관지폐 이형성증, 기도 질환, 폐기종, 알러지성 기관지폐 아스퍼질러스증, 알러지성 기관지염 기관지확장증, 직업성 천식, 반응성 기도 질병 증후군, 간질성 폐 질병 및 기생충성 폐 질병으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    상기 증가된 기도 과민반응에 기반한 기침이 기관지염, 독감 증후군, 천식, 폐쇄성 폐질환 등 중의 하나 이상이고,
    상기 천식이 기도 염증성 세포 침윤, 증가된 기도 과민반응, 기관지수축, 점액 과분비 등 중의 하나 이상을 포함하는, 약학 제형.
  12. 제10항에 있어서, 약학 제형이 흡입, 경구, 비경구, 폐, 비내, 정맥내 또는 이들의 하나 이상의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 경로에 의해 투여되는, 약학 제형.
  13. 제10항에 있어서, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체가 글리세롤, 물, 염수, 에탄올, 다른 약학적으로 허용 가능한 염 용액, 포스페이트 및 유기산의 염으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는, 약학 제형.
  14. 제11항에 있어서, 호흡기 질환이 낭성 섬유증인, 약학 제형.
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