WO2016167372A1 - 大脳皮質ニューロンの誘導方法 - Google Patents

大脳皮質ニューロンの誘導方法 Download PDF

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WO2016167372A1
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高橋　淳
誠 元野
義彦 五百蔵
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing cerebral cortical neurons.
  • Cerebral infarction which causes necrosis of brain tissue due to ischemia, is a high-frequency disease that accounts for many of the causes of death, and often requires sedentary care and is a major welfare issue. It is a disease with In recent years, neural stem cells have been induced after cerebral infarction, and the self-healing system of tissues has been elucidated. However, since such self-healing does not occur in large infarct lesions, exogenous neurons are administered. Transplantation therapy is under consideration. In recent years, methods for inducing pluripotent stem cells into various tissue cells have been developed, and many reports have been made on nerve cells (Non-Patent Documents 1, 2, and 3). However, there is room for improvement in the induction method for efficiently producing such nerve cells suitable for tissue regeneration after cerebral infarction.
  • An object of the present invention is to efficiently produce cerebral cortical neurons from pluripotent stem cells. Therefore, the subject of this invention is providing the kit required for the manufacturing process or manufacture of a cerebral cortex neuron from a pluripotent stem cell.
  • the inventors of the present invention have examined the culture conditions as appropriate in the induction process of cerebral cortical neurons from pluripotent stem cells, and extended the axons by transplanting the obtained cerebral cortical neurons. As a result, it was found to be suitable for brain tissue, and the present invention was completed. That is, the present invention is as follows.
  • a method for producing cerebral cortical neurons from pluripotent stem cells including the following steps: (I) a step of suspending pluripotent stem cells in a culture solution containing a TGF ⁇ inhibitor, bFGF, Wnt inhibitor, and BMP inhibitor; (Ii) a step of subjecting the cells obtained in the step (i) to suspension culture in a culture solution containing a Wnt inhibitor and a BMP inhibitor; (Iii) A step of culturing the cells obtained in the step (ii). [2] The method according to [1], wherein the pluripotent stem cell is a human pluripotent stem cell.
  • the TGF ⁇ inhibitor is SB431542 or A-83-01.
  • the Wnt inhibitor is a POLCN inhibitor.
  • the Wnt inhibitor is C59 or LGK-974.
  • the BMP inhibitor is LDN193189.
  • the method further includes a step (iv) of extracting cells positive for at least one marker protein selected from the group consisting of CD231, PCDH17 and CDH8. 9] Any one of the methods.
  • the cerebral cortical neurons are neurons in the motor area of the cerebral cortex, wherein the neurons are Ctip2-positive CoupTF1 negative.
  • [12] The method according to any one of [1] to [11], wherein the step (i) is performed for at least 3 days.
  • step (13] The method according to any one of [1] to [12], wherein the step (ii) is performed for at least 6 days.
  • a cell culture containing cerebral cortical neurons obtained by the method according to any one of [1] to [13].
  • a kit for producing cerebral cortical neurons from pluripotent stem cells comprising a TGF ⁇ inhibitor, a bFGF, a Wnt inhibitor, and a BMP inhibitor.
  • FIG. 1 shows an example of a manufacturing protocol for cerebral cortical neurons.
  • FIG. 2 shows Sixx, Sox1 in cells on day 6 (day 6), day 12 (day 12) and day 18 (day 18) when DKK1, C59, XAV, or IWP4 is used as a Wnt inhibitor. It is a graph which shows the expression level of Foxg1, Lhx2, Emx2, CoupTF1, and Pax6. In the figure, no addition means the result when no Wnt inhibitor is used.
  • FIG. 3A shows stained images of Ctip2 (red) and CupTF1 (green) of cells on day 46 cultured with C59, DKK1, or XAV as Wnt inhibitors.
  • FIG. 1 shows an example of a manufacturing protocol for cerebral cortical neurons.
  • FIG. 2 shows Sixx, Sox1 in cells on day 6 (day 6), day 12 (day 12) and day 18 (day 18) when DKK1, C59, XAV, or IWP4 is used as a Wnt inhibitor.
  • FIG. 3B shows the content of CupTF1-negative cells in Ctip2-positive cells (left) and Ctip2-positive cells CupTF1 negative in all cells (DAPI) after 46 days of culturing with C59, DKK1, or XAV as Wnt inhibitors. It is a graph which shows the content rate (right figure) of a cell.
  • FIG. 4A shows a staining image for DAPI and Pax6 of 18-day cells cultured with C59 as a Wnt inhibitor at 0 nM, 2.5 nM, or 10 nM.
  • FIG. 4B shows cells on day 0 (d0), day 6 (d6), day 12 (d12) and day 18 (d18) cultured with C59 as a Wnt inhibitor at 0 nM, 2.5 nM or 10 nM. It is a graph which shows the expression level of CupTF1, Emx2, Lhx2, and Foxg1 in FIG.
  • FIG. 5A shows stained images of Ctip2 (red) and CupTF1 (green) of cells on day 46 cultured with LDN193189 using 0.1 ⁇ M, 0.5 ⁇ M or 2 ⁇ M.
  • FIG. 5B shows the content of CupTF1-negative cells in Ctip2-positive cells on the 46th day cultured with 0.1 ⁇ M, 0.5 ⁇ M or 2 ⁇ M of LDN193189 (left figure) and Ctip2-positive cells CupTF1-negative cells in all cells (DAPI). It is a graph which shows the content rate (right figure).
  • FIG. 5C is a graph showing the expression levels of CupTF1 and Sfrp1 in cells on day 46 cultured with LDN193189 using 0.1 ⁇ M, 0.5 ⁇ M or 2 ⁇ M.
  • FIG. 6A shows stained images for Ctip2 (red) and CupTF1 (green) of cells on day 46 cultured with 10%, 15%, or 20% KSR.
  • FIG. 6B shows the content of CupTF1-negative cells in Ctip2-positive cells on day 46 cultured with 10%, 15%, or 20% KSR (left figure) and the content of Ctip2-positive cells CupTF1-negative cells in all cells ( It is a graph which shows a right figure.
  • FIG. 6C is a graph showing the expression levels of CoupTF1 and Sfrp1 in cells on day 46 cultured with 10%, 15%, or 20% KSR.
  • FIG. 7A shows stained images for Ctip2 (red) and CupTF1 (green) of cells on day 46 cultured with 0.5-, 2-, or 5- ⁇ M A-83-01 instead of SB431542.
  • FIG. 7B shows the content of CupTF1-negative cells in Ctip2-positive cells on day 46 cultured with 0.5-, 2-, or 5- ⁇ M A-83-01 instead of SB431542 (left figure) and Ctip2-positive cells in all cells. It is a graph which shows the content rate (right figure) of CoupTF1 negative cell.
  • FIG. 8 is a schematic diagram of the mouse brain (upper figure) and immunostained images (lower figure) for human NCAM at each site 6 months after transplanting the induced cells obtained by the method of the present invention into the mouse motor cortex. Show. The site
  • FIG. 9 is a schematic diagram of the mouse brain (upper figure) and immunostained images (lower figure) for human NCAM at each site 6 months after transplantation of the induced cells obtained by the method of the present invention into the mouse motor cortex Show.
  • the immune tissue in the number 1 or 2 in the upper figure is shown in the lower figure.
  • the immunostained image shows staining of transplanted cell-derived human cells.
  • FIG. 10A shows a phase contrast image in the vicinity of the spinal cord 6 months after transplantation of the induced cells obtained by the method of the present invention into the mouse motor cortex (left diagram) and an immunohistological image (right diagram) against human NCAM.
  • FIG. 10A shows a phase contrast image in the vicinity of the spinal cord 6 months after transplantation of the induced cells obtained by the method of the present invention into the mouse motor cortex (left diagram) and an immunohistological image (right diagram) against human NCAM.
  • FIG. 10B shows phase contrast images (upper figure) and immunohistochemical images of human NCAM (lower figure) at each site near the medulla in 6 months after transplantation of the induced cells obtained by the method of the present invention into the mouse motor cortex. Indicates.
  • the immunostained image of the portion surrounded by the frame in the phase contrast image is shown in the following figure.
  • FIG. 11 shows the analysis result of the flow cytometer in the cells 48 days after differentiation induction.
  • the upper left figure shows the result of negative control
  • the upper right figure shows the result stained with CD231 antibody
  • the lower left figure shows the result stained with CDH8 antibody
  • the lower right figure shows the result stained with PCDH17 antibody.
  • the horizontal axis indicates the fluorescence intensity.
  • FIG. 12A shows stained images of Ctip2 (red) and CupTF1 (green) of cells after isolation of each marker-positive cell (CD231, PCDH17 or CDH8) from cells on differentiation-inducing day 48 and further culturing for 14 days.
  • Unsort represents the cells after the cells on the 48th day of differentiation induction were separated and further cultured for 14 days.
  • FIG. 12B shows the content of Ctip2 positive cells on the 14th day after re-culture of each marker positive cell (CD231, PCDH17 or CDH8) (indicated by + in the figure) or each marker negative cell (indicated by-in the figure) (top).
  • FIG. 4 is a graph showing the content of Ctip2 positive cells and Cup TF1 negative cells (lower panel). Unsort in the graph indicates the content of each cell after the cells on the 48th day of differentiation induction were dissociated and further cultured for 14 days.
  • FIG. 13A shows DAPI (blue) / Ctip2 (red) (left), DAPI (blue) / CupTF1 (green) of cells on day 46 differentiated in adhesion culture (upper) or suspension culture (lower) ( Stained images for the center diagram), Ctip2 (red), and CupTF1 (green) (right) are shown.
  • FIG. 13A shows DAPI (blue) / Ctip2 (red) (left), DAPI (blue) / CupTF1 (green) of cells on day 46 differentiated in adhesion culture (upper) or suspension culture (lower) ( Stained images for the center diagram), Ctip2 (red), and CupTF1 (green) (right) are shown.
  • FIG. 13B shows the content of Ctip2-positive cells (left diagram) and the content of Ctip2-positive cells CupTF1-negative cells (right diagram) on the 46th day after differentiation induction in adhesion culture (Attach) or floating culture (Floating). It is a graph.
  • FIG. 14A shows stained images of DAPI (blue), Ctip2 (red), and CupTF1 (green) of cells on day 46 cultured with C59, LGK-974, or ICG-001 as WNT inhibitors.
  • FIG. 14B shows the content of Ctip2-positive cells in the total cells (DAPI) after culturing for 46 days using C59, LGK-974, or ICG-001 as a WNT inhibitor (left panel) and the total cells (DAPI). It is a graph which shows the content rate (right figure) of Ctip2-positive cell CupTF1-negative cell in FIG.
  • the present invention provides a method for producing cerebral cortical neurons from pluripotent stem cells comprising the following steps: (I) a step of suspending pluripotent stem cells in a culture solution containing a TGF ⁇ inhibitor, bFGF, Wnt inhibitor, and BMP inhibitor; (Ii) a step of subjecting the cells obtained in the step (i) to suspension culture in a culture solution containing a Wnt inhibitor and a BMP inhibitor; (Iii) A step of further culturing the cells obtained in the step (ii).
  • the pluripotent stem cell that can be used in the present invention is a stem cell that has pluripotency that can be differentiated into all cells existing in a living body, and also has proliferative ability.
  • Specific examples of these pluripotent stem cells are not limited to the following, but include embryonic stem (ES) cells, embryonic stem (ntES) cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transfer, sperm stem cells ("GS cells”) "), Embryonic germ cells (“ EG cells "), induced pluripotent stem (iPS) cells, and the like.
  • ES embryonic stem
  • ntES embryonic stem
  • GS cells sperm stem cells
  • EG cells Embryonic germ cells
  • iPS induced pluripotent stem
  • More preferred pluripotent stem cells are human pluripotent stem cells, particularly preferably human ES cells and human iPS cells.
  • Embryonic stem cells ES cells are stem cells established from the inner cell mass of early embryos (eg, blastocysts) of mammals such as humans and mice, and having pluripotency and proliferation ability by self-replication. ES cells are embryonic stem cells derived from the inner cell mass of blastocysts, which are embryos in the 8-cell stage or morula stage of fertilized eggs, and have the ability to differentiate into any cell that constitutes an adult, so-called differentiation differentiation. And ability to proliferate by self-replication.
  • ES cells were discovered in 1981 in mice (MJ Evans and MH Kaufman (1981), Nature 292: 154-156), and then ES cell lines were also established in primates such as humans and monkeys.
  • JA Thomson et al. (1998), Science 282: 1145-1147, JA Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7844-7848, JA Thomson et al. (1996), Biol.Reprod., 55: 254-259 and JA Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr.Top.Dev.Biol., 38: 133. -165).
  • ES cells can be established by removing an inner cell mass from a blastocyst of a fertilized egg of a subject animal and culturing the inner cell mass on a fibroblast feeder.
  • the maintenance of ES cells by subculture is performed using a medium supplemented with substances such as leukemia inhibitory factor (LIF) and basic fibroblast growth factor (bFGF). It can be carried out.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • a medium for preparing ES cells for example, a DMEM / F-12 medium supplemented with 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 mM non-essential amino acid, 2 mM L-glutamic acid, 20% KSR and 4 ng / ml bFGF is used. 37 ° C, 5% CO 2 Human ES cells can be maintained under a humid atmosphere.
  • ES cells need to be passaged every 3 to 4 days. At this time, the passage is, for example, 1 mM CaCl. 2 And 0.25% trypsin and 0.1 mg / ml collagenase IV in PBS (phosphate buffered saline) containing 20% KSR.
  • ES cells can be selected using the expression of gene markers such as alkaline phosphatase, Oct-3 / 4, Nanog, etc. as an index.
  • sperm stem cells A sperm stem cell is a testis-derived pluripotent stem cell, which is a cell that is the origin for spermatogenesis.
  • these cells can be induced to differentiate into various types of cells, and have the property that, for example, chimeric mice can be produced when transplanted into mouse blastocysts (M. Kanatsu-Shinohara et al. 2003) Biol.Reprod., 69: 612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119: 1001-1012).
  • Sperm stem cells can be self-replicating in a medium containing glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), and by repeated passage under the same culture conditions as ES cells Sperm stem cells can be obtained (Takebayashi Masanori et al. (2008), Experimental Medicine, Vol. 26, No.
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • Embryonic germ cells are cells that are established from embryonic primordial germ cells and have the same pluripotency as ES cells, and are primitive in the presence of substances such as LIF, bFGF, and stem cell factor. It can be established by culturing germ cells (Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70: 841-847; JL Resnick et al. (1992), Nature, 359: 550-551).
  • (D) Artificial pluripotent stem cells Artificial pluripotent stem (iPS) cells are obtained by introducing one or more specific nuclear reprogramming substances into somatic cells in the form of DNA or protein, or one or more specific one or more Produced by increasing the expression level of endogenous mRNA and protein of the nuclear reprogramming substance through the use of a seed drug, characteristics almost equivalent to those of ES cells, for example, proliferation by differentiation pluripotency and self-replication Somatic cell-derived artificial stem cells (K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676, K. Takahashi et al. (2007) Cell, 131: 861-872, J. Am. Yu et al.
  • the nuclear reprogramming substance is not particularly limited as long as it is a gene specifically expressed in ES cells, a gene that plays an important role in maintaining undifferentiation of ES cells, or a gene product thereof.
  • reprogramming substances may be used in combination when iPS cells are established.
  • Such a combination can be a combination including at least one, two, or three kinds of the reprogramming substances, preferably a combination including three or four.
  • Nucleotide sequence information of mouse and human cDNA of each nuclear reprogramming substance and amino acid sequence information of the protein encoded by the cDNA are described in GenBank (US NCBI) or EMBL (Germany) described in WO2007 / 069666. It can be obtained by accessing accession numbers.
  • mouse and human cDNA sequence information and amino acid sequence information of L-Myc, Lin28, Lin28b, Esrrb, Esrrg, and Glis1 can be obtained by accessing NCBI accession numbers shown in Table 1.
  • a person skilled in the art can prepare a desired nuclear reprogramming substance by a conventional method based on the cDNA sequence or amino acid sequence information.
  • nuclear reprogramming substances may be introduced into somatic cells in the form of proteins, for example, by lipofection, binding to cell membrane permeable peptides, microinjection, or in the form of DNA, for example, It can be introduced into somatic cells by techniques such as vectors such as viruses, plasmids, artificial chromosomes, lipofection, use of liposomes, and microinjection.
  • vectors such as viruses, plasmids, artificial chromosomes, lipofection, use of liposomes, and microinjection.
  • viral vectors retrovirus vectors, lentiviral vectors (these vectors are Cell, 126, pp. 663-676, 2006; Cell, 131, pp. 861-872, 2007; Science, 318, pp.
  • adenovirus vector (Science, 322, 945-949, 2008), adeno-associated virus vector, Sendai virus vector (Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-62, 2009), etc.
  • the artificial chromosome vector include human artificial chromosome (HAC), yeast artificial chromosome (YAC), and bacterial artificial chromosome (BAC and PAC).
  • HAC human artificial chromosome
  • YAC yeast artificial chromosome
  • BAC and PAC bacterial artificial chromosome
  • plasmid a plasmid for mammalian cells can be used (Science, 322: 949-953, 2008).
  • the vector can contain a regulatory sequence such as a promoter, an enhancer, a ribosome binding sequence, a terminator, a polyadenylation site or a polyadenylation signal so that a nuclear reprogramming substance can be expressed.
  • a regulatory sequence such as a promoter, an enhancer, a ribosome binding sequence, a terminator, a polyadenylation site or a polyadenylation signal so that a nuclear reprogramming substance can be expressed.
  • the promoter used include EF1 ⁇ promoter, CAG promoter, SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (rous sarcoma virus) promoter, MoMuLV (Moloney murine leukemia virus) LTR, HSV- A TK (herpes simplex virus thymidine kinase) promoter or the like is used.
  • EF1 ⁇ promoter EF1 ⁇ promoter, CAG promoter, MoMuLV LTR, CMV promoter, SR ⁇ promoter and the like are preferable examples.
  • selectable marker sequences such as drug resistance genes (eg, kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene or puromycin resistance gene), thymidine kinase gene, and diphtheria toxin gene or fragments thereof, and green fluorescent protein (GFP) ),
  • GFP green fluorescent protein
  • a reporter gene sequence such as ⁇ -glucuronidase (GUS) or FLAG.
  • the above vector contains a LoxP sequence before and after the gene or promoter encoding the nuclear reprogramming substance and the gene encoding the nuclear reprogramming substance that binds to it. You may have.
  • a method is used in which a transposon is used to incorporate a transgene into a chromosome, and then a plasmid vector or an adenoviral vector is used to act on a cell with a transferase to completely remove the transgene from the chromosome.
  • Preferred transposons include, for example, piggyBac, which is a transposon derived from lepidopterous insects (Kaji, K.
  • the vectors are replicated without chromosomal integration and are present episomally, with the origins of lymphotropic herpesvirus, BK virus and bovine papillomavirus and their origins. It may contain sequences involved in replication. For example, including EBNA-1 and oriP or Large T and SV40ori sequences (WO 2009/115295, WO 2009/157201 and WO 2009/149233).
  • an expression vector that can be expressed polycistronically may be used.
  • the gene coding sequence may be linked by an IRES or foot-and-mouth disease virus (FMDV) 2A coding region (Science, 322: 949-953, 2008). , WO 2009/092042 and WO 2009/152529).
  • FMDV foot-and-mouth disease virus
  • HDAC histone deacetylase
  • VPA valproic acid
  • small molecule inhibitors such as trichostatin A, sodium butyrate, MC1293, M344, siRNA and shRNA against HDAC (eg, HDAC1 siRNA Smartpool® (Millipore), HuSH 29mer shRNA Constructs) nucleic acid expression inhibitors such as against HDAC1 (OriGene) and the like], DNA methyltransferase inhibitors (for example, 5′-azacytidine) (Nat.
  • G9a histone methyltransferase inhibitors for example, BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)), G9a, SiRNA and shRNA (eg, nucleic acid expression inhibitors such as G9a siRNA (human) (Santa Cruz Biotechnology), etc.)], L-channel calcium agonist (L-channel calcium agonist) (eg, Bayk 8644) (Cell Stem Cell 3,568-574 (2008)), p53 inhibitors (eg, siRNA and shRNA against p53) (Cell Stem Cell, 3,475-479 (2008)), Wnt Shi Gnal signaling activator (eg soluble Wnt3a) (Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)), growth factor such as LIF or bFGF, ALK5 inhibitor (eg SB431542) (Nat.
  • Such a drug used in the method of increasing the expression level of the endogenous protein of the nuclear reprogramming substance by a drug includes 6-bromoindirubin-3′-oxime, indirubin-5-nitro-3′- Oxime, valproic acid, 2- (3- (6-methylpyridin-2-yl) -1H-pyrazol-4-yl) -1,5-naphthyridine, 1- (4-methylphenyl) -2- (4 Examples include 5,6,7-tetrahydro-2-imino-3 (2H) -benzothiazolyl) ethanone HBr (pifthrin-alpha), prostaglandin J2, prostaglandin E2, and the like (WO 2010/068955).
  • DMEM, DMEM / F12 or DME medium containing 10 to 15% FBS in addition to LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L- Glutamine, non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol and the like can be appropriately included.
  • ES cell culture medium containing bFGF or SCF for example, mouse ES cell culture medium (for example, TX-WES medium, Thrombo X) or primate ES cell culture medium (for example, primate (human or monkey) ES cell culture medium (distributor: Reprocell, Kyoto, Japan), mTeSR-1).
  • culture methods include, for example, 37 ° C., 5% CO 2
  • somatic cells are contacted with a nuclear reprogramming substance (DNA, RNA, or protein) and cultured for about 4 to 7 days.
  • a nuclear reprogramming substance DNA, RNA, or protein
  • Mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc. and cultured in a culture medium for primate ES cell culture containing bFGF about 10 days after contact between the somatic cells and the nuclear reprogramming substance, and about 30 to about ES cell-like colonies can be generated after 45 days or more.
  • the cells may be cultured under conditions of an oxygen concentration as low as 5 to 10%.
  • the cells are treated with 10% FBS-containing DMEM medium (including LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L-glutamine, non-essential amino acids on feeder cells (eg, mitomycin C-treated STO cells or SNL cells).
  • FBS-containing DMEM medium including LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L-glutamine, non-essential amino acids on feeder cells (eg, mitomycin C-treated STO cells or SNL cells).
  • b-mercaptoethanol and the like can be suitably included
  • ES-like colonies can be formed after about 25 to about 30 days or more.
  • the medium is replaced with a fresh medium once a day from the second day after the start of the culture.
  • the number of somatic cells used for nuclear reprogramming is not limited, but culture dishes (100 cm 2 ) About 5 ⁇ 10 3 ⁇ About 5 ⁇ 10 6 A range of cells.
  • cells expressing the marker gene can be selected by culturing the cells in a medium containing the corresponding drug (that is, a selective medium).
  • a medium containing the corresponding drug that is, a selective medium.
  • the marker gene is a fluorescent protein gene
  • the marker gene-expressing cell is obtained by observing with a fluorescence microscope, in the case of a luminescent enzyme gene, by adding a luminescent substrate, or in the case of a chromogenic enzyme gene, by adding a chromogenic substrate. Can be detected.
  • a “somatic cell” may be any cell other than germ cells from mammals (eg, humans, mice, monkeys, pigs and rats), for example, keratinized epithelial cells ( Eg, keratinized epidermal cells), mucosal epithelial cells (eg, epithelial cells of the tongue surface), exocrine glandular epithelial cells (eg, mammary cells), hormone-secreting cells (eg, adrenal medullary cells), cells for metabolism and storage (eg E.g., hepatocytes), luminal epithelial cells that make up the interface (e.g., type I alveolar cells), luminal epithelial cells of the inner chain (e.g., vascular endothelial cells), and cilia cells that have the ability to carry ( Eg, airway epithelial cells), extracellular matrix secreting cells (eg, fibroblasts), contractile cells (eg, smooth muscle cells), blood and immune system cells (eg, T
  • the degree of cell differentiation and the age of the animal from which the cells are collected there is no particular limitation on the degree of cell differentiation and the age of the animal from which the cells are collected. This can be applied to both undifferentiated progenitor cells (including somatic stem cells) and finally differentiated mature cells. It can be used as the source of somatic cells in the invention.
  • undifferentiated progenitor cells include tissue stem cells (somatic stem cells) such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells.
  • the mammal from which somatic cells are collected is not particularly limited, but is preferably a human.
  • ES cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transfer The nt ES cell is a cloned embryo-derived ES cell produced by a nuclear transfer technique and has almost the same characteristics as a fertilized egg-derived ES cell (T. Wakayama et al. (2001), Science, 292). S. Wakayama et al. (2005), Biol.Reprod., 72: 932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450: 497-502).
  • nt ES nuclear transfer ES cells
  • nt ES cells are established from the inner cell mass of a blastocyst derived from a cloned embryo obtained by replacing the nucleus of an unfertilized egg with the nucleus of a somatic cell.
  • a combination of nuclear transfer technology JB Cibelli et al. (1998), Nat. Biotechnol., 16: 642-646) and ES cell production technology (above) is used.
  • JB Cibelli et al. (1998), Nat. Biotechnol., 16: 642-646)
  • ES cell production technology above
  • reprogramming can be performed by injecting a somatic cell nucleus into an enucleated unfertilized egg of a mammal and culturing it for several hours.
  • F Fusion stem cells
  • a fused stem cell is a stem cell that is produced by fusing a somatic cell and an egg or ES cell, has the same pluripotency as the fused ES cell, and also has a gene unique to the somatic cell (Tada M et al. Curr Biol. 11: 1553-8, 2001; Cowan CA et al. Science. 2005 Aug 26; 309 (5739): 1369-73).
  • cerebral cortical neurons include one or more cells selected from the group consisting of cerebral cortical neurons, cerebral cortical neural stem cells, and cerebral cortical neural progenitors unless otherwise specified.
  • Cerebral cortical neurons produced by the method of the present invention are preferably cells positive for Foxg1.
  • Foxg1 includes a polynucleotide represented by NCBI accession number NM_005249 and proteins encoded by these.
  • the cerebral cortex neurons produced by the method of the present invention are more preferably cerebral cortex motor cells or upper motor neurons, i.e., neurons in front of the cerebral cortex, more preferably motor cells of the cerebral cortex. It is a nerve cell of the V layer.
  • Such nerve cells are a cell population characterized by being positive for Ctip2, which can be paraphrased as cells characterized by being negative for CupTF1.
  • Ctip2 includes a polynucleotide represented by NCBI accession number NM_001282237, NM_001282238, NM_022898 or NM_138576 and a protein encoded by these.
  • the cerebral cortical neurons produced in the present invention may be produced as a cell population containing other cell types, for example, 15% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more in the produced cell population. Alternatively, 50% or more may be cerebral cortical neurons. After producing cerebral cortical neurons by the method of the present invention, the cells may be concentrated.
  • the step (iv) may further include a step of extracting cells positive for at least one marker protein selected from the group consisting of CD231, PCDH17 and CDH8 from the cells obtained in step (iii). .
  • the culture may be further continued after the extraction. Examples of the culture after extraction include a method of culturing under the same conditions as in step (iii), but are not particularly limited.
  • a TGF ⁇ inhibitor is a substance that inhibits signal transduction from binding of TGF ⁇ to a receptor to SMAD, and a substance that inhibits binding to the receptor ALK family, or SMAD by the ALK family. And a substance that inhibits phosphorylation of the enzyme.
  • TGF ⁇ inhibitor include Lefty-1 (NCBI Accession No. includes mouse: NM — 010094, human: NM — 020997), SB431542, SB202190 (above, RK Lindemann et al., Mol.
  • the TGF ⁇ inhibitor used in the present invention may preferably be SB431542 represented by the following formula I or A-83-01 represented by the following formula II.
  • the concentration of SB431542 in the culture solution is not particularly limited as long as it inhibits ALK5.
  • the concentration of A-83-01 in the culture solution is not particularly limited as long as it is a concentration that inhibits ALK5.
  • it is 500 nM to 5 ⁇ M, more preferably 500 nM to 2 ⁇ M.
  • bFGF is also referred to as FGF2, and is commercially available from, for example, Wako and Invitrogen, and can be easily used.
  • bFGF may be obtained by forced expression into cells by methods known to those skilled in the art.
  • the concentration of bFGF in the culture solution is, for example, 0.1 ng / mL, 0.5 ng / mL, 1 ng / mL, 2 ng / mL, 3 ng / mL, 4 ng / mL, 5 ng / mL, 6 ng / mL, 7 ng / mL.
  • it is 1 ng / mL to 100 ng / mL, and more preferably 10 ng / mL.
  • the Wnt inhibitor is a substance that suppresses the production of Wnt, or a substance that inhibits signal transduction from binding of Wnt to the receptor to ⁇ -catenin accumulation, and to the Frizzled family of receptors.
  • Wnt inhibitors examples include DKK1 protein (for example, NCBI accession number: NM_012422 for humans), sclerostin (for example, NCBI accession number: NM_025237 for humans), IWR-1 ( Merck Millipore), IWP-2 (Sigma-Aldrich), IWP-3 (Sigma-Aldrich), IWP-4 (Sigma-Aldrich), IWP-L6 (EMD Millipore), C59 (or Nnt-C59tech) ), ICG-001 (Cellagen Technology), LGK-974 (or NVP-LGK-974) (Cellagen Technology), FH535.
  • DKK1 protein for example, NCBI accession number: NM_012422 for humans
  • sclerostin for example, NCBI accession number: NM_025237 for humans
  • IWR-1 Merck Millipore
  • IWP-2 Sigma-Aldrich
  • IWP-3 Sigma-Aldrich
  • IWP-4 Sigma
  • a preferred Wnt inhibitor is a substance that suppresses the production of Wnt.
  • PORCN involved in the processing of Wnt protein in the case of human, NCBI accessor
  • NP_001269096, NP_077376, NP_982299, NP_982300, or NP_982301 for example, C59, IWP-3, IWP-4, IWP-L6 or LGK-974. It is.
  • a more preferred Wnt inhibitor is C59 represented by the following formula III.
  • the concentration of C59 in the culture solution is not particularly limited as long as it is a concentration that inhibits Wnt.
  • LGK-974 represented by the following formula VI can also be preferably used as a Wnt inhibitor.
  • the concentration of LGK-974 in the culture solution is not particularly limited as long as it is a concentration that inhibits Wnt.
  • 1 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 500 nM, 750 nM, and 1 ⁇ M are included. It is not limited.
  • the concentration is preferably 1 nM to 1 ⁇ M, for example, 1 nM to 500 nM, more preferably 10 nM to 200 nM, or 10 nM to 150 nM, for example, 10 nM to 100 nM.
  • the BMP inhibitor refers to proteinaceous inhibitors such as Chordin, Noggin, Follistatin, Dorsorphine (ie, 6- [4- (2-piperidin-1-yl-ethoxy) phenyl] -3-pyridin- 4-yl-pyrazolo [1,5-a] pyrimidine), its derivatives (P.B.Yu et al.
  • LDN193189 (ie 4- (6- (4- (piperazin-1-yl)). ) Phenyl) pyra zolo [1,5-a] pyrimidin-3-yl) quinoline) is exemplified.
  • Dorsomorphin and LDN193189 are commercially available and are available from Sigma-Aldrich and Stemgent, respectively.
  • the BMP inhibitor used in the present invention may preferably be LDN193189 represented by the following formula IV.
  • the concentration of LDN193189 in the culture solution is not particularly limited as long as it is a concentration that inhibits BMP.
  • the concentration is preferably 2 ⁇ M or less, for example, 100 nM to 2 ⁇ M, more preferably 500 nM to 2 ⁇ M, or less than 2 ⁇ M, for example, 100 nM or more and less than 2 ⁇ M, and more preferably Is 500 nM or more and less than 2 ⁇ M.
  • the culture solution used in step (i) of the present invention can be prepared by adding the above-described TGF ⁇ inhibitor, bFGF, Wnt inhibitor, and BMP inhibitor using a medium used for culturing animal cells as a basal medium. .
  • the basal medium examples include Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's medium EM medium, Dulbecco's medium Medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, Neurobasal Medium (Invitrogen), and mixed media thereof are included.
  • GMEM Glasgow's Minimal Essential Medium
  • IMDM Medium IMDM medium
  • Medium 199 medium Eagle's Minimum Essential Medium
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • ⁇ MEM medium Dulbecco's medium EM medium
  • Dulbecco's medium Dulbecco's medium
  • Ham's F12 medium RPMI 1640 medium
  • Fischer's medium Neurobasal Medium (Invitrogen)
  • mixed media thereof are included.
  • it is a medium in which DMEM and Ham's F12 medium are mixed at a ratio of 1: 1.
  • Serum substitutes include, for example, albumin, transferrin, Knockout Serum Replacement (KSR) (serum substitute for FBS during ES cell culture), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acid, insulin, collagen precursor, Examples include trace elements and a plurality of combinations selected from these.
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • the serum replacement is KSR.
  • the concentration in the basal medium is, for example, 5%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18 %, 19%, and 20% are preferable, but the concentration is preferably less than 20%, for example, 10% or more and 15% or less.
  • the basal medium includes 2-mercaptoethanol, 3′-thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, Glutamax (Invitrogen), non-essential amino acids, vitamins, growth factors, low molecular compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvin
  • a preferred basal medium is a medium in which DMEM and Ham's F12 medium containing KSR, 2-mercaptoethanol, a non-essential amino acid and L-glutamine are mixed at a ratio of 1: 1.
  • pluripotent stem cells may be dissociated and used.
  • Examples of a method for dissociating cells include a method of dissociating dynamically, a dissociation solution having protease activity and collagenase activity (for example, , Accutase (TM) and Accumax (TM), etc.) or dissociation methods using a dissociation solution having only collagenase activity.
  • a method of dissociating pluripotent stem cells using Accumax is exemplified.
  • the ROCK inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the function of Rho kinase (ROCK).
  • ROCK Rho kinase
  • Y-27632 for example, Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-). 983 (2000); Narumiya et al., Methods Enzymol. 325, 273-284 (2000)), Fasudil / HA1077 (see, for example, Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)), H-1152.
  • ROCK inhibitors may be used.
  • the ROCK inhibitor used in the present invention may be preferably Y-27632 represented by the following formula (V).
  • the concentration of Y-27632 in the medium is, for example, 100 nM, 500 nM, 750 nM, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, 5 ⁇ M, 6 ⁇ M, 7 ⁇ M, 8 ⁇ M, 9 ⁇ M, 10 ⁇ M, 15 ⁇ M, 20 ⁇ M, 25 ⁇ M, 30 ⁇ M, 40 ⁇ M, 50 ⁇ M, Although not limited to 60 ⁇ M, 70 ⁇ M, 80 ⁇ M, 90 ⁇ M, and 100 ⁇ M. Preferably, it is 10 ⁇ M or more and 50 ⁇ M or less.
  • the culture in step (i) of the present invention is preferably carried out by suspension culture.
  • the suspension culture means culturing cells by forming aggregates (also referred to as spheres) in a non-adherent state in a culture vessel, and is not particularly limited, but improves adhesion to cells.
  • Culture vessels that have not been artificially treated (for example, coating treatment with extracellular matrix) for the purpose, or treatment for artificially suppressing adhesion (for example, polyhydroxyethyl methacrylic acid (poly-HEMA), nonionic)
  • a culture vessel coated with a surface-active polyol such as Pluronic F-127) or a phospholipid-like structure (for example, a water-soluble polymer (Lipidure) containing 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine).
  • the culture temperature is not particularly limited, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C. 2 Cultivation is performed in an atmosphere containing air, and CO 2
  • the concentration is preferably about 2-5%.
  • O 2 The concentration is O in normal air. 2 It may be a concentration, or it may be a normal high oxygen condition or a normal low oxygen condition.
  • the high oxygen condition means 25% or more of O. 2 Concentration, O over 30% 2 Concentration, over 35% O 2 Concentration or 40% or more O 2 The concentration is illustrated.
  • Step (i) of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 6 days or more, 7 days or more, or more days, and the upper limit is not particularly limited. However, 36 days or less, 30 days or less, 24 days or less, 18 days or less, or 12 days or less. More preferably, it is 3 days or more and 12 days or less, and more preferably 6 days.
  • the culture solution used in step (ii) of the present invention can be prepared by adding the above-described Wnt inhibitor and BMP inhibitor using a medium used for animal cell culture as a basal medium.
  • a basal medium include Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's medium EM medium, Dulbecco's medium Medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, Neurobasal Medium (Invitrogen), and mixed media thereof are included.
  • the basal medium may contain serum, or a serum substitute may be added instead of serum.
  • Serum substitutes include, for example, albumin, transferrin, Knockout Serum Replacement (KSR) (serum substitute for FBS during ES cell culture), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acid, insulin, collagen precursor, Examples include trace elements and a plurality of combinations selected from these.
  • the serum replacement is KSR.
  • the concentration in the basal medium is, for example, 5%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18 %, 19%, and 20% are preferable, but the concentration is preferably less than 20%, for example, 10% or more and 15% or less.
  • the basal medium includes 2-mercaptoethanol, 3′-thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, Glutamax (Invitrogen), non-essential amino acids, vitamins, growth factors, low molecular compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvin
  • One or more substances such as acids, buffers, inorganic salts, and the like may also be included.
  • a preferred basal medium is a medium in which DMEM and Ham's F12 medium containing KSR, 2-mercaptoethanol, a non-essential amino acid and L-glutamine are mixed at a ratio of 1: 1.
  • the cells obtained in the step (i) may be dissociated and used as they are. More preferably, in the cells obtained in the step (i), the culture is continued and the culture is continued. Therefore, the culture in the step (ii) of the present invention is preferably performed by suspension culture.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the concentration is preferably about 2-5%.
  • O 2 The concentration is O in normal air. 2 It may be a concentration, or it may be a normal high oxygen condition or a normal low oxygen condition.
  • the step (ii) of the present invention is not particularly limited.
  • the number of days is 6 days or more, 7 days or more, 8 days or more, 9 days or more, 10 days or more, 11 days or more, 12 days or more, or more.
  • an upper limit is not specifically limited, 48 days or less, 42 days or less, 36 days or less, 30 days or less, 24 days or less, 18 days or less are mentioned. More preferably, it is 6 days or more and 18 days or less, and more preferably 12 days.
  • the culture medium used in step (iii) of the present invention can be a basal medium used for culturing animal cells.
  • the basal medium include Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's medium EM medium, Dulbecco's medium Medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, Neurobasal Medium (Invitrogen), and mixed media thereof are included.
  • GMEM Glasgow's Minimal Essential Medium
  • IMDM Medium IMDM
  • Medium 199 medium Eagle's Minimum Essential Medium
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • ⁇ MEM medium Dulbecco's medium EM medium
  • Dulbecco's medium Dulbecco's medium
  • Ham's F12 medium RPMI 1640 medium
  • Fischer's medium Neurobasal Medium (Invitrogen)
  • mixed media thereof are included
  • Serum substitutes include, for example, albumin, transferrin, Knockout Serum Replacement (KSR) (serum substitute for FBS during ES cell culture), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acid, insulin, collagen precursor, Examples include trace elements and a plurality of combinations selected from these.
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • the serum replacement is a B27 supplement.
  • the basal medium includes 2-mercaptoethanol, 3′-thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, Glutamax (Invitrogen), non-essential amino acids, vitamins, growth factors, low molecular compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvin
  • a preferred basal medium is Neurobasal Medium containing B27 supplement and L-glutamine.
  • FGF8 fibroblast growth factor 8
  • neurotrophic factor or the like can be appropriately added to the basal medium.
  • FGF8 is not particularly limited, but in the case of human FGF8, four splicing forms of FGF8a, FGF8b, FGF8e or FGF8f are exemplified, and FGF8b is more preferable in the present invention.
  • FGF8 is commercially available from, for example, Wako and R & D systems, and can be easily used, but may be obtained by forced expression into cells by methods known to those skilled in the art.
  • the concentration of FGF8 in the culture solution is, for example, 1 ng / mL, 5 ng / mL, 10 ng / mL, 50 ng / mL, 100 ng / mL, 150 ng / mL, 200 ng / mL, 250 ng / mL, 500 ng / mL, 1000 ng / mL. , 2000 ng / mL, 5000 ng / mL, but not limited thereto.
  • it is 100 ng / mL.
  • a neurotrophic factor is a ligand to a membrane receptor that plays an important role in the survival and function maintenance of nerve cells.
  • nerve growth factor For example, nerve growth factor (NGF), brain-derived nerve Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF), Neurotrophin 3 (NT-3), Neurotrophin 4/5 (NT-4 / 5), Neurotrophin 6 (NT-6), bFGF, acidic FGF, FGF-5, epidermal growth factor (EGF), hepatocyte growth factor (HGF), insulin, insulin-like growth factor 1 (IGF1), insulin-like growth factor 2 (IGF2) ) Cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), TGF-b2, TGF-b3, interleukin 6 (IL-6), ciliary neurotrophic factor (CNTF) And LIF.
  • NGF nerve growth factor
  • BDNF brain-derived nerve Brain-derived Neurotrophic Factor
  • NT-3 Neurotrophin 3
  • Neurotrophin 4/5 NT-4 / 5
  • Neurotrophin 6 bFGF
  • acidic FGF FGF-5
  • EGF epidermal growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • insulin insulin-like growth factor 1
  • the neurotrophic factor is commercially available from, for example, Wako and R & D systems, and can be easily used, but may be obtained by forced expression into cells by a method known to those skilled in the art.
  • the step (iii) of the present invention is a step of culturing the cells obtained in the step (ii), and the culture may be adhesion culture or suspension culture.
  • Adhesion culture can be performed by culturing using a culture container coated with an extracellular matrix.
  • the coating treatment can be performed by placing a solution containing an extracellular matrix in a culture container and then removing the solution as appropriate.
  • the extracellular matrix is a supramolecular structure existing outside the cell and may be naturally derived or an artificial product (recombinant).
  • Examples include substances such as polylysine, polyornithine, collagen, proteoglycan, fibronectin, hyaluronic acid, tenascin, entactin, elastin, fibrillin, laminin and fragments thereof.
  • extracellular matrices may be used in combination, for example, preparations from cells such as BD Matrigel TM. Preferably, it is a mixture of polyornithine, laminin and fibronectin.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C. 2 Cultivation is performed in an atmosphere containing air, and CO 2 The concentration is preferably about 2-5%. O 2 The concentration is O in normal air. 2 It may be a concentration, or it may be a normal high oxygen condition or a normal low oxygen condition. From the viewpoint that cerebral cortical neurons can be obtained, the step (iii) of the present invention is not particularly harmful even if the culture is continued for a long period of time.
  • cerebral cortical neurons obtained in the present invention can be administered as a preparation to cerebral disorder patients.
  • cerebral disorder refers to a state in which nerve cells are lost due to ischemia or the like, and examples include disorders after cerebral infarction.
  • Cerebral cortical neurons produced by the above method are suspended in physiological saline or the like and transplanted to a nerve cell missing site of a patient.
  • the present invention provides a therapeutic agent for cerebral disorder containing cerebral cortical neurons obtained from pluripotent stem cells by the above method, preferably a therapeutic agent for cerebral infarction.
  • the number of cerebral cortical neurons contained in the therapeutic agent for cerebral disorder is not particularly limited as long as the graft can be engrafted after administration. 4 More than one can be included. Further, it may be prepared by appropriately increasing or decreasing according to the size of the symptom or body.
  • kits for producing cerebral cortical neurons from pluripotent stem cells includes a culture solution, an additive, a culture container, or the like used in each step of producing the cerebral cortical neuron described above.
  • a reagent selected from the group consisting of a TGF ⁇ inhibitor, bFGF, Wnt inhibitor, and BMP inhibitor can be mentioned.
  • the kit may further include a document or instructions describing the procedure of the manufacturing process.
  • Human ES cells (KhES-1) were received from the Institute of Regenerative Medicine, Kyoto University (Suemori H, et al. Biochem Biophys Res Commun. 345: 926-32, 2006).
  • Human iPS cells 404C2 were received from Professor Yamanaka of Kyoto University as cells obtained by introducing Oct3 / 4, Sox2, Klf4, L-MYC, LIN28 and p53shRNA into human fibroblasts by episomal vectors. (Okita, et al, Nat Methods. 8: 409-412, 2011).
  • a human iPS cell was obtained from Professor Yamanaka of Kyoto University as a cell obtained by introducing Oct3 / 4, Sox2, Klf4, L-MYC, LIN28, GRIS1 and p53shRNA into human fibroblasts by episomal vectors. Received. ES cells and iPS cells were cultured on SNL cells (Takahashi K, et al, Cell. 131: 861-872, 2007).
  • the medium was replaced with the same medium containing no Y-27632 (day 3).
  • various Wnt inhibitors DKK1, C59, XAV) or IWP4 (Stemgent)
  • LDN193189 Stemgent
  • KSR Invitrogen
  • 0.1 mM MEM non-essential amino acid Invitrogen
  • 0.1 mM 2-mercaptoethanol The medium was changed to DMEM / F12 (WAKO) containing (WAKO) and 2 mM L-Gln (Invitrogen) (day 6). Thereafter, the same medium was replaced every 3 days, and culturing was performed for 18 days from the start of differentiation induction (day 18).
  • the resulting cell mass was transferred onto a dish (24 well plate (BD)) coated with 50 ⁇ g / ml ornithine (Sigma), 5 ⁇ g / ml laminin (Sigma), 5 ⁇ g / ml fibronectin (BD Bioscience Pharmingen) and B27 (Invitrogen). ) Culturing was continued in Neurobasal (Invitrogen) supplemented with 2 mM L-Gln and 10 units / ml penicillin and streptomycin (Invitrogen). The longest was 46 days from the start of differentiation induction. The medium was changed every 2 or 3 days. The protocol of the induction process is shown in FIG.
  • Wnt inhibitors 500 ng / ml DKK1, 2 nM C59, 500 nM XAV or 500 nM IWP4 was added, and after culturing for 18 days, Six3 (forebrain marker), Sox1 (Neuroectoderm marker), Foxg1 (cerebral cortex formation factor), Lhx2 (cerebral cortex formation factor), Emx2 (forebrain posterior marker), CupTF1 (forebrain posterior marker) and Pax6 (anterior forebrain marker) The gene expression level was measured by the qPCR method (FIG. 2).
  • C59 can be suitably used as a Wnt inhibitor.
  • Examination of C59 Concentration The concentration in the case of using C59 as a Wnt inhibitor in the previous induction method was examined. Specifically, the cells were cultured for 18 days with no addition, 2.5 nM, 10 nM and 1 ⁇ M C59. At this time, when 1 ⁇ M C59 was used, no spheres were formed in the suspension culture, and hence no subsequent analysis was performed. When the obtained spheres were immunostained using an antibody against Pax6, positive cells were confirmed under any conditions (FIG. 4A). Furthermore, the expression level of Foxg1, Lhx2, Emx2, and CoupTF1 genes was measured by qPCR method for the obtained spheres (FIG.
  • the cells were cultured for 46 days using 0.1 ⁇ M, 0.5 ⁇ M and 2 ⁇ M LDN193189.
  • the obtained cells were immunostained using antibodies against CoupTF1 and Ctip2, it was confirmed that CoupTF1-negative Ctip2-positive cells were obtained in a concentration-dependent manner (FIGS. 5A and 5B).
  • the expression levels of the CoupTF1 and Sfrp1 genes were measured by the qPCR method (FIG. 5C). As a result, it was confirmed that cells having a low expression level of CoupTF1 and a high expression level of Sfrp1 were obtained in a concentration-dependent manner.
  • the cells were cultured for 46 days with 0.5 ⁇ M, 2 ⁇ M or 5 ⁇ M A-83-01 (WAKO).
  • A-83-01 A-83-01
  • the obtained cells were immunostained using antibodies against CoupTF1 and Ctip2
  • CoupTF1-negative Ctip2-positive cells were obtained as in SB431542 (FIG. 7).
  • concentration range of A-83-01 examined there was no significant difference in the induction efficiency of cerebral cortical neurons. Effects of transplantation Cerebral cortical neurons induced by the above method for 48 days were suspended in PBS, transplanted to the motor cortex of the mouse cerebral cortex, and the excised brain sections were immunized with human NCAM antibody (Santa Cruz) in June.
  • iPS Cell Culture iPS cells (836B1) were obtained from Miyazaki T et al. Nat Commun. 3: Cultured according to the method described in 1236, 2012. Briefly, the cells were cultured in 6-well plates coated with Laminin 511E8.
  • Improvement of cerebral cortex differentiation induction method Dissociate iPS cells (836B1) using Accumax, transfer 9 ⁇ 10 3 cells per well to a 96-well plate (Lipidure-coat 96-well plate), 50 ⁇ M Y-27632, 10 ⁇ M SB43152, 10 ng Suspension culture was performed in DMEM / F12 containing / ml bFGF, 50 nM C59, 0.1 ⁇ M LDN193189, 10% KSR, 0.1 mM MEM non-essential amino acids, 0.1 mM 2-mercaptoethanol and 2 mM L-Gln (Initiation of differentiation induction, day 0).
  • the medium was replaced with the same medium containing no Y-27632 (day 3).
  • the medium was changed to DMEM / F12 containing 50 nM C59, 0.1 ⁇ M LDN193189, 10% KSR, 0.1 mM MEM non-essential amino acid, 0.1 mM 2-mercaptoethanol and 2 mM L-Gln (day 6). Thereafter, the same medium was replaced every 3 days, and culturing was performed for 18 days from the start of differentiation induction (day 18).
  • the obtained cell mass was transferred onto a dish (24 well plate) coated with 50 ⁇ g / ml ornithine, 5 ⁇ g / ml laminin, 5 ⁇ g / ml fibronectin, and B27, 2 mM L-Gln, and 10 units / ml penicillin and streptomycin were added.
  • culture was performed from the start of differentiation induction to the 48th day. The medium was changed every 3 or 4 days.
  • the cells on the 48th day of differentiation induction were dissociated using Accumax, labeled with anti-CD231 antibody (Thermo), anti-CDH8 antibody (Antibodies) or anti-PCDH17 antibody (Thermo), and analyzed using FACS ( FIG.
  • Dissociated iPS cells (836B1) cultured under feeder-free conditions using Laminin 511E8 using Accumax and transferred 9 ⁇ 10 3 cells per well to a 96-well plate (Lipidure-coat 96-well plate) Contains 50 ⁇ M Y-27632, 10 ⁇ M SB43152, 10 ng / ml bFGF, 10 nM-50 nM C59, 0.1 ⁇ M LDN193189, 10% KSR, 0.1 mM MEM non-essential amino acids, 0.1 mM 2-mercaptoethanol and 2 mM L-Gln In DMEM / F12, suspension culture was performed (differentiation induction start, day 0).
  • the medium was replaced with the same medium containing no Y-27632 (day 3).
  • the medium was changed to DMEM / F12 containing 10 nM-50 nM C59, 0.1 ⁇ M LDN193189, 10% KSR, 0.1 mM MEM non-essential amino acids, 0.1 mM 2-mercaptoethanol and 2 mM L-Gln (day 6) ). Thereafter, the same medium was replaced every 3 days, and culturing was performed for 18 days from the start of differentiation induction (day 18).
  • the medium was replaced with the same medium containing no Y-27632 (day 3).
  • DMEM containing various WNT inhibitors (C59, LGK-974, ICG-001), 100 nM LDN193189, 10% KSR, 0.1 mM MEM non-essential amino acids, 0.1 mM 2-mercaptoethanol and 2 mM L-Gln.
  • the medium was changed to / F12 (day 6). Thereafter, the same medium was replaced every 3 days, and culturing was performed for 18 days from the start of differentiation induction (day 18).
  • the present invention is useful for regenerative medicine, particularly for treatment of injured brains such as cerebral ischemia. All publications, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

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Abstract

多能性幹細胞から大脳皮質ニューロンを製造する方法を提供する。　（ｉ）多能性幹細胞をＴＧＦβ阻害剤、ｂＦＧＦ、Ｗｎｔ阻害剤、およびＢＭＰ阻害剤を含む培養液中で浮遊培養する工程、（ｉｉ）前記工程（ｉ）で得られた細胞をＷｎｔ阻害剤、およびＢＭＰ阻害剤を含む培養液中で浮遊培養する工程、および（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で得られた細胞をさらに培養する工程を含む、多能性幹細胞から大脳皮質ニューロンを製造する方法を提供する。

Description

大脳皮質ニューロンの誘導方法
　本発明は、大脳皮質ニューロンの製造方法に関する。
　虚血により脳組織の壊死等が引き起こされる脳梗塞は、死亡原因の中でも多くを占めている高頻度な疾患である上、後遺症を残して介護が必要となることが多く福祉の面でも大きな課題を伴う疾患である。近年、脳梗塞後には、神経幹細胞が誘導され、組織の自己治癒のシステムが解明されているが、大きな梗塞巣になれば、このような自己治癒は起きないため、外来性の神経細胞を投与する移植治療が検討されている。
　近年では、多能性幹細胞から様々な組織細胞へと誘導する方法が開発されており、神経細胞についても多くの報告がなされている（非特許文献１、２、３）。
　しかし、このような脳梗塞後の組織再生に適した神経細胞を効率よく作製するための誘導方法については、改良の余地がある。
Ｋｉｍ　ＪＥ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　１０８：３００５−３０１０，２０１１ Ｈｕ　ＢＹ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　１０７：４３３５−４３４０，２０１０ Ｍａｒｉａｎｉ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．１０９：１２７７０−１２７７５，２０１２
　本発明の目的は、多能性幹細胞から効率よく大脳皮質ニューロンを製造することである。したがって、本発明の課題は、多能性幹細胞から大脳皮質ニューロンの製造工程または製造に必要なキットを提供することである。
　本発明者らは、上記の課題を解決すべく、多能性幹細胞から大脳皮質ニューロンの誘導工程において、培養条件を適宜検討し、得られた大脳皮質ニューロンを移植することで軸索を伸長させ、脳組織に適合することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］以下の工程を含む多能性幹細胞から大脳皮質ニューロンを製造する方法：
（ｉ）多能性幹細胞をＴＧＦβ阻害剤、ｂＦＧＦ、Ｗｎｔ阻害剤、およびＢＭＰ阻害剤を含む培養液中で浮遊培養する工程、
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で得られた細胞をＷｎｔ阻害剤、およびＢＭＰ阻害剤を含む培養液中で浮遊培養する工程、
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で得られた細胞を培養する工程。
［２］前記多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞である、［１］の方法。
［３］前記ヒト多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞である、［２］の方法。
［４］前記ＴＧＦβ阻害剤が、ＳＢ４３１５４２またはＡ−８３−０１である、［１］から［３］のいずれかの方法。
［５］前記Ｗｎｔ阻害剤が、ＰＯＲＣＮ阻害剤である、［１］から［４］のいずれかの方法。
［６］前記Ｗｎｔ阻害剤が、Ｃ５９またはＬＧＫ−９７４である［１］から［５］のいずれかの方法。
［７］前記ＢＭＰ阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９である、［１］から［６］のいずれかの方法。
［８］前記培養液が血清又は血清代替物をさらに含む、［１］から［７］のいずれかの方法。
［９］前記工程（ｉ）の培養液がＲＯＣＫ阻害剤をさらに含む、［１］から［８］のいずれかの方法。
［１０］前記工程（ｉｉｉ）に続いてさらに、工程（ｉｖ）ＣＤ２３１、ＰＣＤＨ１７およびＣＤＨ８から成る群より選択される少なくとも一つのマーカータンパク質が陽性である細胞を抽出する工程を含む［１］から［９］のいずれかの方法。
［１１］前記大脳皮質ニューロンが、Ｃｔｉｐ２陽性ＣｏｕｐＴＦ１陰性であることを特徴とする大脳皮質の運動野の神経細胞である、［１］から［１０］のいずれかの方法。
［１２］前記工程（ｉ）が、少なくとも３日間行われる、［１］から［１１］のいずれかの方法。
［１３］前記工程（ｉｉ）が、少なくとも６日間行われる、［１］から［１２］のいずれかの方法。
［１４］［１］~［１３］のいずれかの方法で得られる、大脳皮質ニューロンを含む細胞培養物。
［１５］ＴＧＦβ阻害剤、ｂＦＧＦ、Ｗｎｔ阻害剤、及びＢＭＰ阻害剤を含む、多能性幹細胞から大脳皮質ニューロンを作製するためのキット。
［１６］前記ＴＧＦβ阻害剤が、ＳＢ４３１５４２またはＡ−８３−０１であり、前記Ｗｎｔ阻害剤が、Ｃ５９またはＬＧＫ−９７４であり、前記ＢＭＰ阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９である、［１５］のキット。
　本発明によれば、脳梗塞の治療などに有用な、移植に適した大脳皮質ニューロンを効率よく得ることができる。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１５−０８２４９７号の開示内容を包含する。
図１には、大脳皮質ニューロンの製造プロトコールの一例を示す。 図２は、Ｗｎｔ阻害剤として、ＤＫＫ１、Ｃ５９、ＸＡＶ、またはＩＷＰ４を用いた場合の培養６日目（ｄａｙ６）、１２日目（ｄａｙ１２）および１８日目（ｄａｙ１８）の細胞におけるＳｉｘ３、Ｓｏｘ１、Ｆｏｘｇ１、Ｌｈｘ２、Ｅｍｘ２、ＣｏｕｐＴＦ１およびＰａｘ６の発現量を示すグラフである。図中、無添加は、Ｗｎｔ阻害剤を用いなかった場合の結果を意味する。 図３Ａは、Ｗｎｔ阻害剤として、Ｃ５９、ＤＫＫ１、またはＸＡＶを用いて培養した４６日目の細胞のＣｔｉｐ２（赤色）およびＣｏｕｐＴＦ１（緑色）に対する染色像を示す。図３Ｂは、Ｗｎｔ阻害剤として、Ｃ５９、ＤＫＫ１、またはＸＡＶを用いて４６日間培養した後のＣｔｉｐ２陽性細胞におけるＣｏｕｐＴＦ１陰性細胞の含有率（左図）および全細胞（ＤＡＰＩ）におけるＣｔｉｐ２陽性細胞ＣｏｕｐＴＦ１陰性細胞の含有率（右図）を示すグラフである。 図４Ａは、Ｗｎｔ阻害剤としてＣ５９を０ｎＭ、２．５ｎＭまたは１０ｎＭ用いて培養した１８日目の細胞のＤＡＰＩおよびＰａｘ６に対する染色像を示す。図４Ｂは、Ｗｎｔ阻害剤としてＣ５９を０ｎＭ、２．５ｎＭまたは１０ｎＭ用いて培養した０日目（ｄ０）、６日目（ｄ６）、１２日目（ｄ１２）および１８日目（ｄ１８）の細胞におけるＣｏｕｐＴＦ１、Ｅｍｘ２、Ｌｈｘ２およびＦｏｘｇ１の発現量を示すグラフである。 図５Ａは、ＬＤＮ１９３１８９を０．１μＭ、０．５μＭまたは２μＭ用いて培養した４６日目の細胞のＣｔｉｐ２（赤色）およびＣｏｕｐＴＦ１（緑色）に対する染色像を示す。図５Ｂは、ＬＤＮ１９３１８９を０．１μＭ、０．５μＭまたは２μＭ用いて培養した４６日目のＣｔｉｐ２陽性細胞におけるＣｏｕｐＴＦ１陰性細胞の含有率（左図）および全細胞（ＤＡＰＩ）におけるＣｔｉｐ２陽性細胞ＣｏｕｐＴＦ１陰性細胞の含有率（右図）を示すグラフである。図５Ｃは、ＬＤＮ１９３１８９を０．１μＭ、０．５μＭまたは２μＭ用いて培養した４６日目の細胞におけるＣｏｕｐＴＦ１およびＳｆｒｐ１の発現量を示すグラフである。 図６Ａは、ＫＳＲを１０％、１５％または２０％用いて培養した４６日目の細胞のＣｔｉｐ２（赤色）およびＣｏｕｐＴＦ１（緑色）に対する染色像を示す。図６Ｂは、ＫＳＲを１０％、１５％または２０％用いて培養した４６日目のＣｔｉｐ２陽性細胞におけるＣｏｕｐＴＦ１陰性細胞の含有率（左図）および全細胞におけるＣｔｉｐ２陽性細胞ＣｏｕｐＴＦ１陰性細胞の含有率（右図）を示すグラフである。図６Ｃは、ＫＳＲを１０％、１５％または２０％用いて培養した４６日目の細胞におけるＣｏｕｐＴＦ１およびＳｆｒｐ１の発現量を示すグラフである。 図７Ａは、ＳＢ４３１５４２の代わりにＡ−８３−０１を０．５μＭ、２μＭまたは５μＭ用いて培養した４６日目の細胞のＣｔｉｐ２（赤色）およびＣｏｕｐＴＦ１（緑色）に対する染色像を示す。図７Ｂは、ＳＢ４３１５４２の代わりにＡ−８３−０１を０．５μＭ、２μＭまたは５μＭ用いて培養した４６日目のＣｔｉｐ２陽性細胞におけるＣｏｕｐＴＦ１陰性細胞の含有率（左図）および全細胞におけるＣｔｉｐ２陽性細胞ＣｏｕｐＴＦ１陰性細胞の含有率（右図）を示すグラフである。 図８は、マウスの脳の模式図（上図）およびマウスの運動野へ本発明の方法で得られた誘導細胞を移植後６月目の各部位におけるヒトＮＣＡＭに対する免疫染色像（下図）を示す。上図において丸く囲まれた領域に細胞を移植した部位を示し、また図中の番号１または２における、免疫組織を下図に示す。免疫染色像において、移植細胞由来のヒト細胞の染色が示されている。 図９は、マウスの脳の模式図（上図）およびマウスの運動野へ本発明の方法で得られた誘導細胞を移植後６月目の各部位におけるヒトＮＣＡＭに対する免疫染色像（下図）を示す。上図中の番号１または２における、免疫組織を下図に示す。免疫染色像において、移植細胞由来のヒト細胞の染色が示されている。 図１０Ａは、マウスの運動野へ本発明の方法で得られた誘導細胞を移植後６月目の脊髄付近の位相差像（左図）およびヒトＮＣＡＭに対する免疫組織像（右図）を示す。図１０Ｂは、マウスの運動野へ本発明の方法で得られた誘導細胞を移植後６月目の延髄付近の各部位での位相差像（上図）およびヒトＮＣＡＭに対する免疫組織像（下図）を示す。位相差像における枠で囲まれた部分の免疫染色像を下図にて示す。 図１１は、分化誘導４８日目の細胞におけるフローサイトメーターの解析結果を示す。左上図は、陰性対照の結果を示し、右上図は、ＣＤ２３１抗体により染色した結果を示し、左下図は、ＣＤＨ８抗体により染色した結果を示し、右下図は、ＰＣＤＨ１７抗体により染色した結果を示す。横軸は、蛍光強度を示す。図中、各マーカーの陽性細胞の含有率を数字で示す。 図１２Ａは、分化誘導４８日目の細胞から各マーカー陽性細胞（ＣＤ２３１、ＰＣＤＨ１７またはＣＤＨ８）を単離し、さらに１４日間培養した後の細胞のＣｔｉｐ２（赤色）およびＣｏｕｐＴＦ１（緑色）に対する染色像を示す。図中Ｕｎｓｏｒｔは、分化誘導４８日目の細胞を分離し、さらに１４日間培養した後の細胞を示す。図１２Ｂは、各マーカー陽性細胞（ＣＤ２３１、ＰＣＤＨ１７またはＣＤＨ８）（図中＋で示す）または各マーカー陰性細胞（図中−で示す）の再培養後１４日目におけるＣｔｉｐ２陽性細胞の含有率（上図）およびＣｔｉｐ２陽性細胞ＣｏｕｐＴＦ１陰性細胞の含有率（下図）を示すグラフである。グラフ中Ｕｎｓｏｒｔは、分化誘導４８日目の細胞を解離し、さらに１４日間培養した後の細胞におけるそれぞれの含有率を示す。 図１３Ａは、接着培養（上段）または浮遊培養（下段）にて分化誘導した４６日目の細胞のＤＡＰＩ（青）／Ｃｔｉｐ２（赤）（左図）、ＤＡＰＩ（青）／ＣｏｕｐＴＦ１（緑）（中央図）およびＣｔｉｐ２（赤色）およびＣｏｕｐＴＦ１（緑色）（右図）に対する染色像を示す。図１３Ｂは、接着培養（Ａｔｔａｃｈ）または浮遊培養（Ｆｌｏａｔｉｎｇ）にて分化誘導した４６日目におけるＣｔｉｐ２陽性細胞の含有率（左図）およびＣｔｉｐ２陽性細胞ＣｏｕｐＴＦ１陰性細胞の含有率（右図）を示すグラフである。 図１４Ａは、ＷＮＴ阻害剤として、Ｃ５９、ＬＧＫ−９７４、またはＩＣＧ−００１を用いて培養した４６日目の細胞のＤＡＰＩ（青色）、Ｃｔｉｐ２（赤色）およびＣｏｕｐＴＦ１（緑色）に対する染色像を示す。図１４Ｂは、ＷＮＴ阻害剤として、Ｃ５９、ＬＧＫ−９７４、またはＩＣＧ−００１を用いて４６日間培養した後の全細胞（ＤＡＰＩ）におけるＣｔｉｐ２陽性細胞の含有率（左図）および全細胞（ＤＡＰＩ）におけるＣｔｉｐ２陽性細胞ＣｏｕｐＴＦ１陰性細胞の含有率（右図）を示すグラフである。
　本発明は、次の工程を含む多能性幹細胞から大脳皮質ニューロンを製造する方法：
（ｉ）多能性幹細胞をＴＧＦβ阻害剤、ｂＦＧＦ、Ｗｎｔ阻害剤、およびＢＭＰ阻害剤を含む培養液中で浮遊培養する工程、
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で得られた細胞をＷｎｔ阻害剤、およびＢＭＰ阻害剤を含む培養液中で浮遊培養する工程、
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で得られた細胞をさらに培養する工程。
＜多能性幹細胞＞
　本発明で使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞である。それらの多能性幹細胞の具体例は、以下のものに限定されないが、胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、精子幹細胞（「ＧＳ細胞」）、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、およびｉＰＳ細胞である。より好ましい多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞であり、特に好ましくはヒトＥＳ細胞、およびヒトｉＰＳ細胞である。
（Ａ）胚性幹細胞
　ＥＳ細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能とを有する幹細胞である。
　ＥＳ細胞は、受精卵の８細胞期または桑実胚段階の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ＥＳ細胞は、マウスで１９８１年に発見され（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ　ａｎｄ　Ｍ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１５４−１５６）、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもＥＳ細胞株が樹立された（Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９８），Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２：１１４５−１１４７、Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：７８４４−７８４８、Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９６），Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５５：２５４−２５９およびＪ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ　ａｎｄ　Ｖ．Ｓ．Ｍａｒｓｈａｌｌ（１９９８），Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３８：１３３−１６５）。
　ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養によるＥＳ細胞の維持は、白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ））、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ））などの物質を添加した培地を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのＥＳ細胞の樹立と維持の方法については、例えばＨ．Ｓｕｅｍｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ．（２００６），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３４５：９２６−９３２、Ｍ．Ｕｅｎｏ　ｅｔ　ａｌ．（２００６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：９５５４−９５５９、Ｈ．Ｓｕｅｍｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ．（２００１），Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２２２：２７３−２７９およびＨ．Ｋａｗａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．（２００２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１５８０−１５８５などに記載されている。
　ＥＳ細胞作製のための培地として、例えば０．１ｍＭ　２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン酸、２０％ＫＳＲ及び４ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を使用し、３７℃、５％ＣＯ２湿潤雰囲気下でヒトＥＳ細胞を維持することができる。また、ＥＳ細胞は、３~４日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば１ｍＭ　ＣａＣｌ２及び２０％ＫＳＲを含有するＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中の０．２５％トリプシン及び０．１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶを用いて行うことができる。
　ＥＳ細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ−３／４、Ｎａｎｏｇなどの遺伝子マーカーの発現を指標にして行うことができる。特に、ヒトＥＳ細胞の選択では、ＯＣＴ−３／４、ＮＡＮＯＧ、などの遺伝子マーカーの発現をＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ法で検出したり、および／または、細胞表面抗原であるＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１を免疫染色法にて検出することで行うことができる（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ　Ｉ，ｅｔ　ａｌ．（２００６），Ｎａｔｕｒｅ．４４４：４８１−４８５）。
　ヒトＥＳ細胞株である例えばＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。
（Ｂ）精子幹細胞
　精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ＥＳ細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ（Ｍ．Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，６９：６１２−６１６；Ｋ．Ｓｈｉｎｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．（２００４），Ｃｅｌｌ，１１９：１００１−１０１２）。精子幹細胞は、神経膠細胞系由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ））を含む培地で自己複製可能であるし、ＥＳ細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって精子幹細胞を得ることができる（竹林正則ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４１~４６頁，羊土社（東京、日本））。
（Ｃ）胚性生殖細胞
　胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ＥＳ細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、幹細胞因子（ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ）などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる（Ｙ．Ｍａｔｓｕｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２），Ｃｅｌｌ，７０：８４１−８４７；Ｊ．Ｌ．Ｒｅｓｎｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２），Ｎａｔｕｒｅ，３５９：５５０−５５１）。
（Ｄ）人工多能性幹細胞
　人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、ある特定の１種もしくは複数種の核初期化物質を、ＤＮＡまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することによるか、または、ある特定の１種もしくは複数種の薬剤の使用により該核初期化物質の内在性のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現量を上昇させることによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ａｎｄ　Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）Ｃｅｌｌ，１２６：６６３−６７６、Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ，１３１：８６１−８７２、Ｊ．Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７−１９２０、Ｍ．Ｎａｋａｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：１０１−１０６、国際公開ＷＯ　２００７／０６９６６６および国際公開ＷＯ　２０１０／０６８９５５）。核初期化物質は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子もしくはＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、またはそれらの遺伝子産物であればよく、特に限定されないが、例えば、Ｏｃｔ３／４，Ｋｌｆ４，Ｋｌｆ１，Ｋｌｆ２，Ｋｌｆ５，Ｓｏｘ２，Ｓｏｘ１，Ｓｏｘ３，Ｓｏｘ１５，Ｓｏｘ１７，Ｓｏｘ１８，ｃ−Ｍｙｃ，Ｌ−Ｍｙｃ，Ｎ−Ｍｙｃ，ＴＥＲＴ，ＳＶ４０　Ｌａｒｇｅ　Ｔ　ａｎｔｉｇｅｎ，ＨＰＶ１６　Ｅ６，ＨＰＶ１６Ｅ７，Ｂｍｉｌ，Ｌｉｎ２８，Ｌｉｎ２８ｂ，Ｎａｎｏｇ，Ｅｓｒｒｂ，ＥｓｒｒｇおよびＧｌｉｓ１が例示される。これらの初期化物質は、ｉＰＳ細胞樹立の際には、組み合わされて使用されてもよい。そのような組合せは、上記初期化物質を、少なくとも１種、２種もしくは３種含む組み合わせ、好ましくは３種もしくは４種を含む組み合わせとすることができる。
　上記の各核初期化物質のマウスおよびヒトｃＤＮＡのヌクレオチド配列情報、並びに、該ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列情報は、ＷＯ２００７／０６９６６６に記載のＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）またはＥＭＢＬ（ドイツ国）のａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒｓにアクセスすることによって入手可能である。また、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｅｓｒｒｂ、ＥｓｒｒｇおよびＧｌｉｓ１のマウスおよびヒトのｃＤＮＡ配列情報およびアミノ酸配列情報については、表１に示したＮＣＢＩ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒｓにアクセスすることにより取得できる。当業者は、該ｃＤＮＡ配列またはアミノ酸配列情報に基づいて、常法により所望の核初期化物質を調製することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　これらの核初期化物質は、タンパク質の形態で、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよいし、あるいは、ＤＮＡの形態で、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソームの使用、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（これらのベクターは、Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６；Ｃｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７；Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８，ｐｐ．１９１７−１９２０，２００７に準ずる。）、アデノウイルスベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２，９４５−９４９，２００８）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（Ｐｒｏｃ　Ｊｐｎ　Ａｃａｄ　Ｓｅｒ　Ｂ　Ｐｈｙｓ　Ｂｉｏｌ　Ｓｃｉ．８５，３４８−６２，２００９）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣおよびＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２：９４９−９５３，２００８）。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトもしくはポリアデニル化シグナルなどの制御配列を含むことができる。使用されるプロモーターとしては、例えばＥＦ１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、ＥＦ１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＭｏＭｕＬＶ　ＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい例として挙げられる。さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子またはピューロマイシン耐性遺伝子）、チミジンキナーゼ遺伝子、およびジフテリアトキシン遺伝子もしくはその断片などの選択マーカー配列、並びに、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）またはＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、核初期化物質をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する核初期化物質をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にＬｏｘＰ配列を有してもよい。別の好ましい実施態様においては、トランスポゾンを用いて染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、プラスミドベクターもしくはアデノウイルスベクターを用いて細胞に転移酵素を作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるｐｉｇｇｙＢａｃ等が挙げられる（Ｋａｊｉ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，（２００９），Ｎａｔｕｒｅ，４５８：７７１−７７５、Ｗｏｌｔｊｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，（２００９），Ｎａｔｕｒｅ，４５８：７６６−７７０、ＷＯ　２０１０／０１２０７７）。さらに、ベクターには、染色体への組み込みがなくとも複製されて、エピソーマルに存在するように、リンパ指向性ヘルペスウイルス（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｈｅｒｐｅｓ　ｖｉｒｕｓ）、ＢＫウイルスおよび牛乳頭腫ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）の起点とその複製に関わる配列を含んでいてもよい。例えば、ＥＢＮＡ−１およびｏｒｉＰ、または、Ｌａｒｇｅ　ＴおよびＳＶ４０ｏｒｉ配列を含むことが挙げられる（ＷＯ　２００９／１１５２９５、ＷＯ　２００９／１５７２０１およびＷＯ　２００９／１４９２３３）。また、２種またはそれ以上の核初期化物質を同時に導入するために、ポリシストロニックに発現させることができる発現ベクターを用いてもよい。ポリシストロニックに発現させるためには、遺伝子をコードする配列と配列の間は、ＩＲＥＳまたは口蹄病ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａコード領域により結合されていてもよい（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２：９４９−９５３，２００８、ＷＯ　２００９／０９２０４２およびＷＯ　２００９／１５２５２９）。
　核初期化に際して、ｉＰＳ細胞の誘導効率を高めるために、上記の因子の他に、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤［例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６（７）：７９５−７９７（２００８））、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例、ＨＤＡＣ１　ｓｉＲＮＡ　Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨｕＳＨ　２９ｍｅｒ　ｓｈＲＮＡ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ＨＤＡＣ１（ＯｒｉＧｅｎｅ）等）等の核酸性発現阻害剤など］、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば５’−アザシチジン（５’−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ））（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６（７）：７９５−７９７（２００８））、Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、ＢＩＸ−０１２９４（Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，２：５２５−５２８（２００８））等の低分子阻害剤、Ｇ９ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例、Ｇ９ａ　ｓｉＲＮＡ（ｈｕｍａｎ）（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等）等の核酸性発現阻害剤など］、Ｌ−チャネルカルシウムアゴニスト（Ｌ−ｃｈａｎｎｅｌ　ｃａｌｃｉｕｍ　ａｇｏｎｉｓｔ）（例えばＢａｙｋ８６４４）（Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，３，５６８−５７４（２００８））、ｐ５３阻害剤（例えばｐ５３に対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）（Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，３，４７５−４７９（２００８））、Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子（例えば可溶性Ｗｎｔ３ａ）（Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，３，１３２−１３５（２００８））、ＬＩＦまたはｂＦＧＦなどの増殖因子、ＡＬＫ５阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２）（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６：８０５−８（２００９））、有糸分裂活性化プロテインキナーゼシグナル伝達（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ｇｌｙｃｏｇｅｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｋｉｎａｓｅ）−３阻害剤（ＰｌｏＳ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，６（１０），２２３７−２２４７（２００８））、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５などのｍｉＲＮＡ（Ｒ．Ｌ．Ｊｕｄｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２７：４５９−４６１（２００９））、等を使用することができる。
　薬剤によって核初期化物質の内在性のタンパク質の発現量を上昇させる方法に使用される、そのような薬剤としては、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム、インジルビン−５−ニトロ−３’−オキシム、バルプロ酸、２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン、１−（４−メチルフェニル）−２−（４，５，６，７−テトラヒドロ−２−イミノ−３（２Ｈ）−ベンゾチアゾリル）エタノンＨＢｒ（ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−ａｌｐｈａ）、プロスタグランジンＪ２およびプロスタグランジンＥ２等が例示される（ＷＯ　２０１０／０６８９５５）。
　ｉＰＳ細胞誘導のための培養培地としては、例えば（１）１０~１５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥ培地（これらの培地にはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）、（２）ｂＦＧＦまたはＳＣＦを含有するＥＳ細胞培養用培地、例えばマウスＥＳ細胞培養用培地（例えばＴＸ−ＷＥＳ培地、トロンボＸ社）または霊長類ＥＳ細胞培養用培地（例えば霊長類（ヒトまたはサル）ＥＳ細胞用培地（販売先：リプロセル、京都、日本）、ｍＴｅＳＲ−１）、などが含まれる。
　培養法の例としては、例えば、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で体細胞と核初期化物質（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質）を接触させ約４~７日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上にまきなおし、体細胞と核初期化物質の接触から約１０日後からｂＦＧＦ含有霊長類ＥＳ細胞培養用培地で培養し、該接触から約３０~約４５日またはそれ以上ののちにＥＳ細胞様コロニーを生じさせることができる。また、ｉＰＳ細胞の誘導効率を高めるために、５~１０％と低い酸素濃度の条件下で培養してもよい。
　あるいは、前記細胞を、フィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞またはＳＮＬ細胞）上で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（これにはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、ｂ−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約２５~約３０日またはそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを形成させることができる。
　上記培養の間には、培養開始２日目以降から毎日１回新鮮な培地と培地交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ（１００ｃｍ２）あたり約５×１０３~約５×１０６細胞の範囲である。
　マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡを用いた場合は、対応する薬剤を含む培地（すなわち、選択培地）で細胞の培養を行うことによりマーカー遺伝子発現細胞を選択することができる。またマーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、または、発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、マーカー遺伝子発現細胞を検出することができる。
　本明細書中で使用する「体細胞」は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタおよびラット）由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、Ｉ型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Ｔリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞（組織前駆細胞）等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞（体性幹細胞も含む）であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
　本発明において、体細胞を採取する由来となる哺乳動物は特に制限されないが、好ましくはヒトである。
（Ｅ）核移植により得られたクローン胚由来のＥＳ細胞
　ｎｔ　ＥＳ細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のＥＳ細胞であり、受精卵由来のＥＳ細胞とほぼ同じ特性を有している（Ｔ．Ｗａｋａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：７４０−７４３；Ｓ．Ｗａｋａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．（２００５），Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，７２：９３２−９３６；Ｊ．Ｂｙｒｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（２００７），Ｎａｔｕｒｅ，４５０：４９７−５０２）。具体的には、ｎｔ　ＥＳ（ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ＥＳ）細胞は、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立される。ｎｔ　ＥＳ細胞の作製のためには、核移植技術（Ｊ．Ｂ．Ｃｉｂｅｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９９８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：６４２−６４６）とＥＳ細胞作製技術（上記）との組み合わせが利用される（若山清香ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４７~５２頁）。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで再プログラム化することができる。
（Ｆ）融合幹細胞
　融合幹細胞は、体細胞と卵子もしくはＥＳ細胞とを融合させることにより作製され、融合させたＥＳ細胞と同様な多能性を有し、さらに体細胞に特有の遺伝子も有する幹細胞である（Ｔａｄａ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．Ｃｕｒｒ　Ｂｉｏｌ．１１：１５５３−８，２００１；Ｃｏｗａｎ　ＣＡ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００５　Ａｕｇ　２６；３０９（５７３９）：１３６９−７３）。
＜大脳皮質ニューロン＞
　本発明において、大脳皮質ニューロンとは、特に断りがなければ、大脳皮質神経細胞、大脳皮質神経幹細胞及び大脳皮質神経前駆細胞から成る群から選択される一又は複数の細胞を含むものとする。本発明の方法によって製造される大脳皮質ニューロンは、好ましくは、Ｆｏｘｇ１が陽性である細胞である。本発明において、Ｆｏｘｇ１としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００５２４９で示されるポリヌクレオチドおよびこれらがコードするタンパク質が挙げられる。本発明の方法によって製造される大脳皮質ニューロンは、より好ましくは、大脳皮質の運動野の神経細胞または上位運動ニューロン、すなわち、大脳皮質の前方の神経細胞であり、さらに好ましくは大脳皮質の運動野の第Ｖ層の神経細胞である。このような神経細胞は、Ｃｔｉｐ２が陽性であることを特徴とする細胞集団であり、これはＣｏｕｐＴＦ１が陰性であることを特徴とする細胞と言い換えることができる。本発明において、Ｃｔｉｐ２としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１２８２２３７、ＮＭ＿００１２８２２３８、ＮＭ＿０２２８９８またはＮＭ＿１３８５７６で示されるポリヌクレオチドおよびこれらがコードするタンパク質が挙げられる。
　本発明において製造される大脳皮質ニューロンは、他の細胞種が含まれる細胞集団として製造されてもよく、例えば、製造された細胞集団において１５％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上または５０％以上が大脳皮質ニューロンであってもよい。本発明の方法により大脳皮質ニューロンを製造後、当該細胞を濃縮しても良い。大脳皮質ニューロンを濃縮する方法として、ＣＤ２３１、ＰＣＤＨ１７およびＣＤＨ８から成る群より選択される少なくとも一つのマーカータンパク質が陽性である細胞を抗体により標識し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）や磁気細胞分離装置（ＭＡＣＳ）を用いて濃縮する方法が例示される。これらの抗体は、市販の抗体を適宜利用することができる。従って、工程（ｉｖ）として、工程（ｉｉｉ）で得られた細胞から、ＣＤ２３１、ＰＣＤＨ１７およびＣＤＨ８から成る群より選択される少なくとも一つのマーカータンパク質が陽性である細胞を抽出する工程をさらに含んでも良い。抽出後にさらに培養を継続しても良い。抽出後の培養は、例えば、工程（ｉｉｉ）と同様の条件で培養する方法が例示されるが、特に限定されない。
＜ＴＧＦβ阻害剤＞
　本発明において、ＴＧＦβ阻害剤とは、ＴＧＦβの受容体への結合からＳＭＡＤへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるＡＬＫファミリーへの結合を阻害する物質、またはＡＬＫファミリーによるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する物質が挙げられる。このようなＴＧＦβ阻害剤としては、例えば、Ｌｅｆｔｙ−１（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．として、マウス：ＮＭ＿０１００９４、ヒト：ＮＭ＿０２０９９７が例示される）、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ２０２１９０（以上、Ｒ．Ｋ．Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ，２００３，２：２０）、ＳＢ５０５１２４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＮＰＣ３０３４５、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＳＤ２０８（Ｓｃｉｏｓ）、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６（Ｌｉｌｌｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａ−８３−０１（ＷＯ　２００９１４６４０８）およびこれらの誘導体などが例示される。本発明で使用されるＴＧＦβ阻害剤は、好ましくは、下記の式Ｉで表されるＳＢ４３１５４２または下記の式ＩＩで表されるＡ−８３−０１であり得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 　培養液中におけるＳＢ４３１５４２の濃度は、ＡＬＫ５を阻害する濃度であれば特に限定されないが、例えば、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、５００μＭ、１ｍＭ、であるがこれらに限定されない。好ましくは、、１μＭから１００μＭであり、より好ましくは、１０μＭである。
　培養液中におけるＡ−８３−０１の濃度は、ＡＬＫ５を阻害する濃度であれば特に限定されないが、例えば、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、５００ｎＭから５μＭであり、より好ましくは、５００ｎＭから２μＭである。
＜ｂＦＧＦ＞
　本発明において、ｂＦＧＦは、ＦＧＦ２とも称し、例えばＷａｋｏ社やＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、当業者に公知の方法によって細胞へ強制発現によって得てもよい。
　培養液中におけるｂＦＧＦの濃度は、例えば、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬであるがこれらに限定されない。好ましくは、１ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは、１０ｎｇ／ｍＬである。
＜Ｗｎｔ阻害剤＞
　本発明において、Ｗｎｔ阻害剤とは、Ｗｎｔの産生を抑制する物質、またはＷｎｔの受容体への結合からβカテニンの蓄積へと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーへの結合を阻害する物質、またはβカテニンの分解を促進する物質などが挙げられる。このようなＷｎｔ阻害剤としては、例えば、ＤＫＫ１タンパク質（例えば、ヒトの場合、ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０１２２４２）、スクレロスチン（例えば、ヒトの場合、ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０２５２３７）、ＩＷＲ−１（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＩＷＰ−２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＷＰ−３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＷＰ−４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＷＰ−Ｌ６（ＥＭＤ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｃ５９（または、Ｗｎｔ−Ｃ５９）（Ｃｅｌｌａｇｅｎ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＩＣＧ−００１（Ｃｅｌｌａｇｅｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＬＧＫ−９７４（または、ＮＶＰ−ＬＧＫ−９７４）（Ｃｅｌｌａｇｅｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＦＨ５３５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＷＩＫＩ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＫＹＯ２１１１（Ｍｉｎａｍｉ　Ｉ，ｅｔ　ａｌ，Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．２：１４４８−１４６０，２０１２）、ＰＮＵ−７４６５４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＸＡＶ９３９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）およびこれらの誘導体などが例示される。本発明の多能性幹細胞から大脳皮質ニューロンを製造するにあたり、好ましいＷｎｔ阻害剤は、Ｗｎｔの産生を抑制する物質であり、例えば、Ｗｎｔタンパク質のプロセシングに関与するＰＯＲＣＮ（ヒトの場合、ＮＣＢＩのアクセション番号：ＮＰ＿００１２６９０９６、ＮＰ＿０７３７３６、ＮＰ＿９８２２９９、ＮＰ＿９８２３００、またはＮＰ＿９８２３０１で表されるタンパク質が例示される）を阻害する物質が挙げられ、例えば、Ｃ５９、ＩＷＰ−３、ＩＷＰ−４、ＩＷＰ−Ｌ６またはＬＧＫ−９７４である。本発明において、より好ましいＷｎｔ阻害剤は、下記の式ＩＩＩで表されるＣ５９である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　培養液中におけるＣ５９の濃度は、Ｗｎｔを阻害する濃度であれば特に限定されないが、例えば、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、２．５ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、７．５ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、１ｎＭから５０ｎＭであり、例えば、２ｎＭから５０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭから５０ｎＭであるか、あるいは、１０ｎＭ未満の濃度であり、例えば、２ｎＭ以上、１０ｎＭ未満である。
　また、本発明において、下記の式ＶＩで表されるＬＧＫ−９７４もＷｎｔ阻害剤として好ましく利用することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　培養液中におけるＬＧＫ−９７４の濃度は、Ｗｎｔを阻害する濃度であれば特に限定されないが、例えば、１ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、１ｎＭから１μＭであり、例えば、１ｎＭから５００ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭから２００ｎＭであるか、あるいは、１０ｎＭから１５０ｎＭの濃度であり、例えば、１０ｎＭ以上、１００ｎＭ以下である。
＜ＢＭＰ阻害剤＞
　本発明において、ＢＭＰ阻害剤とは、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ、などのタンパク質性阻害剤、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（すなわち、６−［４−（２−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ−１−ｙｌ−ｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］−３−ｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌ−ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）、その誘導体（Ｐ．Ｂ．Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．（２００７），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１６：ＩＩ＿６０；Ｐ．Ｂ．Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：３３−４１；Ｊ．Ｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．（２００８），ＰＬｏＳ　ＯＮＥ，３（８）：ｅ２９０４）およびＬＤＮ１９３１８９（すなわち、４−（６−（４−（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ−１−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−３−ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）が例示される。ＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎおよびＬＤＮ１９３１８９は市販されており、それぞれＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社およびＳｔｅｍｇｅｎｔ社から入手可能である。本発明で使用されるＢＭＰ阻害剤は、好ましくは、下記の式ＩＶで表されるＬＤＮ１９３１８９であり得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　培養液中におけるＬＤＮ１９３１８９の濃度は、ＢＭＰを阻害する濃度であれば特に限定されないが、例えば、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、２μＭ以下の濃度であり、例えば、１００ｎＭから２μＭであり、より好ましくは、５００ｎＭから２μＭであるか、あるいは、２μＭ未満の濃度であり、例えば、１００ｎＭ以上、２μＭ未満であり、より好ましくは、５００ｎＭ以上、２μＭ未満である。
＜工程（ｉ）＞
　本発明の工程（ｉ）で用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として、上述したＴＧＦβ阻害剤、ｂＦＧＦ、Ｗｎｔ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤を添加して調製することができる。基礎培地としては、例えば、Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ　Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、ＤＭＥＭとＨａｍ’ｓ　Ｆ１２培地を１：１で混合した培地である。基礎培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは血清に代えて血清代替物を添加してもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素およびこれらから選択される複数の組み合わせなどが挙げられる。好ましくは、血清代替物はＫＳＲである。本発明の工程（ｉ）において、ＫＳＲを用いる場合、基礎培地における濃度は、例えば、５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％が挙げられるが、好ましくは、２０％未満、例えば１０％以上１５％以下の濃度である。基礎培地には、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。好ましい基礎培地は、ＫＳＲ、２−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸およびＬ−グルタミンを含有するＤＭＥＭとＨａｍ’ｓ　Ｆ１２培地を１：１で混合した培地である。
　本発明の工程（ｉ）において、多能性幹細胞を解離させて用いてもよく、細胞を解離させる方法としては、例えば、力学的に解離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）およびＡｃｃｕｍａｘ（商標）など）またはコラゲナーゼ活性のみを有する解離溶液を用いた解離方法が挙げられる。好ましくは、Ａｃｃｕｍａｘが例示される）を用いて多能性幹細胞を解離する方法が用いられる。細胞を解離させた場合、ＲＯＣＫ阻害剤を適宜、解離後に添加して培養することが望ましい。ＲＯＣＫ阻害剤を添加する場合、少なくとも１日間添加して培養すればよい。多能性幹細胞を解離させる１日以上前、好ましくは１日前より、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地で培養してもよい。
　本発明において、ＲＯＣＫ阻害剤とは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Ｙ−２７６３２（例えば、Ｉｓｈｉｚａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７，９７６−９８３（２０００）；Ｎａｒｕｍｉｙａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２５，２７３−２８４（２０００）参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（例えば、Ｕｅｎａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３８９：９９０−９９４（１９９７）参照）、Ｈ−１１５２（例えば、Ｓａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．９３：２２５−２３２（２００２）参照）、Ｗｆ−５３６（例えば、Ｎａｋａｊｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２（４）：３１９−３２４（２００３）参照）およびそれらの誘導体、ならびにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の低分子化合物も知られているので、本発明においてはこのような化合物またはそれらの誘導体も使用できる（例えば、米国特許出願公開第２００５０２０９２６１号、同第２００５０１９２３０４号、同第２００４００１４７５５号、同第２００４０００２５０８号、同第２００４０００２５０７号、同第２００３０１２５３４４号、同第２００３００８７９１９号、及び国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、同第２００４／０３９７９６号参照）。本発明では、１種または２種以上のＲＯＣＫ阻害剤が使用され得る。本発明で使用されるＲＯＣＫ阻害剤は、好ましくは、下記式（Ｖ）で表されるＹ−２７６３２であり得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 　培地中のＹ−２７６３２の濃度は、例えば、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、１０μＭ以上、５０μＭ以下である。
　本発明の工程（ｉ）の培養では、浮遊培養によって行われることが好ましい。本発明において、浮遊培養とは、細胞を培養容器へ非接着の状態で凝集体（スフェアとも言う）を形成させて培養することであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていない培養容器、若しくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ）、非イオン性の界面活性ポリオール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ−１２７等）またはリン脂質類似構造物（例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを構成単位とする水溶性ポリマー（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ））によるコーティング処理した培養容器を使用することによって行う培養である。
　本発明の工程（ｉ）の培養条件について、培養温度は、特に限定されないが、約３０~４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２~５％である。Ｏ２濃度は、通常の空気中におけるＯ２濃度であってもよく、あるいは、通常以上の高酸素条件であっても通常以下の低酸素条件であってもよい。本発明において、高酸素条件とは、２５％以上のＯ２濃度、３０％以上のＯ２濃度、３５％以上のＯ２濃度、または４０％以上のＯ２濃度が例示される。低酸素条件とは、１０％以下のＯ２濃度、５％以下のＯ２濃度、４％以下のＯ２濃度、３％以下のＯ２濃度、２％以下のＯ２濃度、または１％以下のＯ２濃度が例示される。
　本発明の工程（ｉ）は、特に限定されないが、例えば、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、またはそれ以上の日数が挙げられ、上限は特に限定されないが、３６日以下、３０日以下、２４日以下、１８日以下、１２日以下が挙げられる。より好ましくは、３日以上、１２日以下であり、さらに好ましくは、６日である。
＜工程（ｉｉ）＞
　本発明の工程（ｉｉ）で用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として、上述したＷｎｔ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤を添加して調製することができる。基礎培地としては、例えば、Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ　Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、ＤＭＥＭとＨａｍ’ｓ　Ｆ１２培地を１：１で混合した培地である。基礎培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは血清に代えて血清代替物を添加してもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素およびこれらから選択される複数の組み合わせなどが挙げられる。好ましくは、血清代替物はＫＳＲである。本発明の工程（ｉｉ）において、ＫＳＲを用いる場合、基礎培地における濃度は、例えば、５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％が挙げられるが、好ましくは、２０％未満、例えば１０％以上１５％以下の濃度である。基礎培地には、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。好ましい基礎培地は、ＫＳＲ、２−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸およびＬ−グルタミンを含有するＤＭＥＭとＨａｍ’ｓ　Ｆ１２培地を１：１で混合した培地である。
　本発明の工程（ｉｉ）において、前記工程（ｉ）で得られた細胞を解離させて用いてもよく、そのまま用いても良い。より好ましくは、前記工程（ｉ）で得られたを細胞において、培養液を交換して培養を継続する方法である。従って、本発明の工程（ｉｉ）の培養では、浮遊培養によって行われることが好ましい。
　本発明の工程（ｉ）の培養条件について、培養温度は、特に限定されないが、約３０~４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２~５％である。Ｏ２濃度は、通常の空気中におけるＯ２濃度であってもよく、あるいは、通常以上の高酸素条件であっても通常以下の低酸素条件であってもよい。
　本発明の工程（ｉｉ）は、特に限定されないが、例えば、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、またはそれ以上の日数が挙げられ、上限は特に限定されないが、４８日以下、４２日以下、３６日以下、３０日以下、２４日以下、１８日以下が挙げられる。より好ましくは、６日以上１８日以下であり、さらに好ましくは、１２日である。
＜工程（ｉｉｉ）＞
　本発明の工程（ｉｉｉ）で用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地を用いることができる。基礎培地としては、例えば、Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ　Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍである。基礎培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは血清に代えて血清代替物を添加してもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素およびこれらから選択される複数の組み合わせなどが挙げられる。好ましくは、血清代替物はＢ２７サプリメントである。基礎培地には、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。好ましい基礎培地は、Ｂ２７サプリメントおよびＬ−グルタミンを含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍである。本発明の工程（ｉｉｉ）で用いる培養液は、上記基礎培地に例えば、ＦＧＦ８（線維芽細胞成長因子８（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ８））、神経栄養因子などを適宜添加したものを用いることができる。
　本発明において、ＦＧＦ８とは、特に限定されないが、ヒトＦＧＦ８の場合、ＦＧＦ８ａ、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ８ｅまたはＦＧＦ８ｆの４つのスプライシングフォームが例示され、本発明ではより好ましくは、ＦＧＦ８ｂである。ＦＧＦ８は、例えばＷａｋｏ社やＲ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、当業者に公知の方法によって細胞へ強制発現によって得てもよい。
　培養液中におけるＦＧＦ８の濃度は、例えば、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、５０００ｎｇ／ｍＬであるがこれらに限定されない。好ましくは、１００ｎｇ／ｍＬである。
　本発明において、神経栄養因子とは、神経細胞の生存と機能維持に重要な役割を果たしている膜受容体へのリガンドであり、例えば、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＮＧＦ））、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ））、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）、ニューロトロフィン６（ＮＴ−６）、ｂＦＧＦ、酸性ＦＧＦ、ＦＧＦ−５、上皮細胞増殖因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ））、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ））、インスリン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ２）、グリア細胞株由来神経栄養因子（Ｇｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ））、ＴＧＦ−ｂ２、ＴＧＦ−ｂ３、インターロイキン６（ＩＬ−６）、毛様体神経栄養因子（Ｃｉｌｉａｒｙ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ（ＣＮＴＦ））およびＬＩＦなどが挙げられる。神経栄養因子は、、例えばＷａｋｏ社やＲ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、当業者に公知の方法によって細胞へ強制発現によって得てもよい。
　本発明の工程（ｉｉｉ）では、前記工程（ｉｉ）で得られた細胞を培養する工程であり、当該培養は、接着培養であっても浮遊培養であっても良い。接着培養を行う場合、細胞外基質をコーティング処理された培養容器を用いて培養することによって行い得る。コーティング処理は、細胞外基質を含有する溶液を培養容器に入れた後、当該溶液を適宜除くことによって行い得る。
　本発明において、細胞外基質とは、細胞の外に存在する超分子構造体であり、天然由来であっても、人工物（組換え体）であってもよい。例えば、ポリリジン、ポリオルニチン、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリリン、ラミニンといった物質およびこれらの断片が挙げられる。これらの細胞外基質は、組み合わせて用いられてもよく、例えば、ＢＤ　Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）などの細胞からの調製物であってもよい。好ましくは、ポリオルニチン、ラミニンおよびフィブロネクチンの混合物である。
　本発明の工程（ｉｉｉ）において、浮遊培養を行う場合、前記工程（ｉｉ）で得られた細胞の培養液を適宜、上述の本発明の工程（ｉｉｉ）で用いる培養液に置換することによって行い得る。本発明において、培養液を置換するにあたり、全ての培養液を置換してもよく、例えば、半量の置換を数回に分けて行っても良い。
　本発明の工程（ｉｉｉ）の培養条件について、培養温度は、特に限定されないが、約３０~４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２~５％である。Ｏ２濃度は、通常の空気中におけるＯ２濃度であってもよく、あるいは、通常以上の高酸素条件であっても通常以下の低酸素条件であってもよい。
　本発明の工程（ｉｉｉ）は、大脳皮質ニューロンが得られるという観点から、長期にわたって培養を継続しても特に弊害がないことから、特に上限を設定する必要はないが、例えば、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１４日以上、２１日以上、２８日以上、３０日以上、３５日以上、またはそれ以上の日数が挙げられる。より好ましくは、２８日以上であり、さらに好ましくは、２８日または３０日である。
＜大脳障害治療剤＞
　本発明で得られた大脳皮質ニューロンは、製剤として大脳障害患者に投与することができる。本発明において、大脳障害とは、虚血等により神経細胞が欠落した状態を言い、例えば、脳梗塞後の障害が挙げられる。上記の方法により製造された大脳皮質ニューロンを生理食塩水等に懸濁させ、患者の神経細胞欠落部位に移植することによって行われる。従って、本発明では、上記の方法で多能性幹細胞より得られた大脳皮質ニューロンを含む大脳障害治療剤、好ましくは、脳梗塞治療剤を提供する。
　本発明において、大脳障害治療剤に含まれる大脳皮質ニューロンの細胞数は、移植片が投与後に生着できれば特に限定されないが、例えば、１５×１０４個以上含まれ得る。また、症状や体躯の大きさに合わせて適宜増減して調製されてもよい。
　大脳皮質ニューロンの疾患部位への移植は、例えば、Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２，１１３７（１９９９）もしくはＮ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ．；３４４：７１０−９（２００１）に記載されるような手法によって行うことができる。
＜キット＞
　本発明での他の実施態様において、多能性幹細胞から大脳皮質ニューロンを作製するキットが含まれる。当該キットには、上述した大脳皮質ニューロンを作製する各工程に使用する培養液、添加剤または培養容器等が含まれる。例えば、ＴＧＦβ阻害剤、ｂＦＧＦ、Ｗｎｔ阻害剤およびＢＭＰ阻害剤から成る群より選択される試薬が挙げられる。本キットには、さらに製造工程の手順を記載した書面や説明書を含んでもよい。
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
細胞
　ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−１）は、京都大学再生医科学研究所より受領した（Ｓｕｅｍｏｒｉ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．３４５：９２６−３２，２００６）。ヒトｉＰＳ細胞である４０４Ｃ２は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８およびｐ５３ｓｈＲＮＡをヒト線維芽細胞にエピソーマルベクターにより導入して得られた細胞として京都大学の山中教授らより受領した（Ｏｋｉｔａ，ｅｔ　ａｌ，Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ．８：４０９−４１２，２０１１）。ヒトｉＰＳ細胞である８３６Ｂ１は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８、ＧＬＩＳ１およびｐ５３ｓｈＲＮＡをヒト線維芽細胞にエピソーマルベクターにより導入して得られた細胞として京都大学の山中教授らより受領した。ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞は、ＳＮＬ細胞上で培養した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ，Ｃｅｌｌ．１３１：８６１−８７２，２００７）。
大脳皮質の分化誘導方法
　分化誘導前日に１０μＭ　Ｙ−２７６３２（ＷＡＫＯ）を培養液へ添加して培養したＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞をＳＮＬ　ｆｅｅｄｅｒ上から分離させるためにＣＴＫでＳＮＬ細胞を除去した後、Ａｃｃｕｍａｘ（ＩＣＴ）を用いて解離させ、９６ｗｅｌｌプレート（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ−ｃｏａｔ　９６ｗｅｌｌプレート（ＮＯＦ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））に１ｗｅｌｌあたり９×１０３個を移し、５０μＭ　Ｙ−２７６３２（ＷＡＫＯ）、１０μＭ　ＳＢ４３１５２（Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、各種Ｗｎｔ阻害剤（ＤＫＫ１（Ｒ＆Ｄ，５００ｎｇ／ｍｌ）、Ｃ５９（Ｃｅｌｌａｇｅｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２−１０ｎＭ）、ＸＡＶ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，５００ｎＭ−２μＭ）またはＩＷＰ４（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，５００ｎＭ−２．５μＭ））、ＬＤＮ１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ　ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ　２−メルカプトエタノール（ＷＡＫＯ）および２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＷＡＫＯ）中で、浮遊培養を行った（分化誘導開始、ｄａｙ０）。３日後、培地交換に際して、Ｙ−２７６３２を含有しない同培地へ交換した（ｄａｙ３）。３日後、各種Ｗｎｔ阻害剤（ＤＫＫ１、Ｃ５９、ＸＡＶ）またはＩＷＰ４（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ））、ＬＤＮ１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ　ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ　２−メルカプトエタノール（ＷＡＫＯ）および２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＷＡＫＯ）へ培地を交換した（ｄａｙ６）。以後、３日毎に同じ培地に交換し、分化誘導開始から１８日間培養を行った（ｄａｙ１８）。
　得られた細胞塊を、５０μｇ／ｍｌオルニチン（Ｓｉｇｍａ）、５μｇ／ｍｌラミニン（Ｓｉｇｍａ）、５μｇ／ｍｌフィブロネクチン（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でコートしたディッシュ（２４ｗｅｌｌプレート（ＢＤ））上に移し、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎおよび１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン及びストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、培養を継続した。最長は、分化誘導開始から４６日間培養を行った。なお、培地交換は、２または３日毎にて行った。誘導工程のプロトコールを図１に示す。
Ｗｎｔ阻害剤の検討
　前期の誘導方法において、Ｗｎｔ阻害剤として、５００ｎｇ／ｍｌ　ＤＫＫ１、２ｎＭ　Ｃ５９、５００ｎＭ　ＸＡＶまたは５００ｎＭ　ＩＷＰ４を添加し、１８日間培養した後の細胞において、Ｓｉｘ３（前脳マーカー）、Ｓｏｘ１（神経外胚葉マーカー）、Ｆｏｘｇ１（大脳皮質形成因子）、Ｌｈｘ２（大脳皮質形成因子）、Ｅｍｘ２（前脳の後方マーカー）、ＣｏｕｐＴＦ１（前脳の後方マーカー）およびＰａｘ６（前脳の前方マーカー）の遺伝子の発現量をｑＰＣＲ法により測定した（図２）。その結果、Ｗｎｔ阻害剤としてＤＫＫ１を用いた場合は、Ｅｍｘ２やＣｏｕｐＴＦ１の発現量が多く、前脳の後方の細胞が多く誘導されることが見出された。
　さらに、Ｗｎｔ阻害剤として、５００ｎｇ／ｍｌ　ＤＫＫ１、２ｎＭ　Ｃ５９または５００ｎＭ　ＸＡＶを添加し、上記誘導方法にて、４６日間培養した後の細胞に対して、ＣｏｕｐＴＦ１および大脳皮質ニューロンの第Ｖ層のマーカーであるＣｔｉｐ２に対する抗体を用いて免疫染色を行ったところ、Ｃ５９を用いた場合、ＣｏｕｐＴＦ１陰性Ｃｔｉｐ２陽性の大脳皮質ニューロンが多く誘導されることが確認された（図３）。
　以上の結果より、Ｃ５９がＷｎｔ阻害剤として好適に用いることができることが示唆された。
Ｃ５９の濃度の検討
　前期の誘導方法において、Ｗｎｔ阻害剤としてＣ５９を用いる場合の濃度について検討を行った。詳細には、無添加、２．５ｎＭ、１０ｎＭおよび１μＭのＣ５９を用いて１８日間培養した。このとき、１μＭのＣ５９を用いた場合、浮遊培養において、スフェア（ｓｐｈｅｒｅ）を形成しなかったため、以後の分析を行わなかった。得られたスフェアについて、Ｐａｘ６に対する抗体を用いて免疫染色を行ったところ、いずれの条件においても陽性細胞が確認された（図４Ａ）。さらに、得られたスフェアについて、Ｆｏｘｇ１、Ｌｈｘ２、Ｅｍｘ２およびＣｏｕｐＴＦ１の遺伝子の発現量をｑＰＣＲ法により測定した（図４Ｂ）。その結果、１０ｎＭのＣ５９を用いた場合に得られた細胞においてＣｏｕｐＴＦ１の発現量が低く、Ｌｈｘ２およびＦｏｘｇ１の発現量が高いことから、至適な条件であったことが確認できた。しかし、ＥＳ細胞（Ｋｈ−１）を用いた場合、１０ｎＭのＣ５９を用いた場合に得られたスフェアは、ＯＦＬコートディッシュへの接着が少ないことから、１０ｎＭより低い濃度の方が適している場合もあることが示唆された。従って、以下の検討では、２ｎＭのＣ５９をＷｎｔ阻害剤として用いることとした。
ＬＤＮ１９３１８９の濃度の検討
　前期の誘導方法において、ＬＤＮ１９３１８９の濃度について検討を行った。詳細には、０．１μＭ、０．５μＭおよび２μＭのＬＤＮ１９３１８９を用いて４６日間培養した。得られた細胞について、ＣｏｕｐＴＦ１およびＣｔｉｐ２に対する抗体を用いて免疫染色を行ったところ、濃度依存的に、ＣｏｕｐＴＦ１陰性Ｃｔｉｐ２陽性細胞が得られることが確認された（図５Ａ，Ｂ）。さらに、ＣｏｕｐＴＦ１およびＳｆｒｐ１の遺伝子の発現量をｑＰＣＲ法により測定した（図５Ｃ）。その結果、濃度依存的に、ＣｏｕｐＴＦ１の発現量が低く、Ｓｆｒｐ１の発現量が高い細胞が得られることが確認された。しかし、２μＭのＬＤＮ１９３１８９を用いた場合、培養１８日目に得られたスフェアにおいて細胞死が多く確認されたことから、細胞毒性も強く現れることが確認された。ＬＤＮ１９３１８９は、２μＭより低い濃度の方が以後の操作を考慮すると適していることが示唆された。従って、以下の検討では、０．１μＭまたは０．５μＭのＬＤＮ１９３１８９を用いることとした。
ＫＳＲの濃度の検討
　前期の誘導方法において、ＫＳＲの濃度について検討を行った。詳細には、１０％、１５％および２０％のＫＳＲを用いて４６日間培養した。得られた細胞について、ＣｏｕｐＴＦ１およびＣｔｉｐ２に対する抗体を用いて免疫染色を行ったところ、濃度依存的に、ＣｏｕｐＴＦ１陰性Ｃｔｉｐ２陽性細胞が減少することが確認された（図６Ａ，Ｂ）。さらに、ＣｏｕｐＴＦ１およびＳｆｒｐ１の遺伝子の発現量をｑＰＣＲ法により測定した（図６Ｃ）。その結果、濃度依存的に、ＣｏｕｐＴＦ１の発現量が高く、Ｓｆｒｐ１の発現量が低い細胞が得られることが確認された。従って、ＫＳＲは、２０％より低い濃度の方が大脳皮質の前方の大脳皮質ニューロンを誘導することに適していることが示唆された。以下の検討では、１０％または１５％のＫＳＲを用いることとした。
ＳＢ４３１５４２の代替物の検討
　前期の誘導方法において、ＳＢ４３１５４２の代替物として、Ａ−８３−０１の濃度について検討を行った。詳細には、０．５μＭ、２μＭまたは５μＭのＡ−８３−０１（ＷＡＫＯ）を用いて４６日間培養した。得られた細胞について、ＣｏｕｐＴＦ１およびＣｔｉｐ２に対する抗体を用いて免疫染色を行ったところ、ＳＢ４３１５４２と同様に、ＣｏｕｐＴＦ１陰性Ｃｔｉｐ２陽性細胞が得られることが確認された（図７）。また、検討したＡ−８３−０１の濃度範囲では、大脳皮質ニューロンの誘導効率に大きな違いは見られなかった。
移植の効果
　上記の方法で４８日間誘導した大脳皮質ニューロンをＰＢＳに懸濁させ、マウスの大脳皮質の運動野に移植し６月目に、摘出した脳切片をｈｕｍａｎ　ＮＣＡＭ抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ）で免疫染色し、解析したところ、移植細胞に由来する軸索が、中脳、橋、延髄と伸長し皮質脊髄路により、脊髄まで到達していることが確認された（図８~１０）。
ｉＰＳ細胞の培養
　ｉＰＳ細胞（８３６Ｂ１）は、Ｍｉｙａｚａｋｉ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｃｏｍｍｕｎ．３：１２３６，２０１２に記載に準拠した方法で培養した。簡潔には、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１Ｅ８でコーティングした６ｗｅｌｌプレートにて培養した。
大脳皮質の分化誘導方法の改良
　ｉＰＳ細胞（８３６Ｂ１）をＡｃｃｕｍａｘを用いて解離させ、９６ｗｅｌｌプレート（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ−ｃｏａｔ　９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ）に１ｗｅｌｌあたり９×１０３個を移し、５０μＭ　Ｙ−２７６３２、１０μＭ　ＳＢ４３１５２、１０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ、５０ｎＭ　Ｃ５９、０．１μＭ　ＬＤＮ１９３１８９、１０％　ＫＳＲ、０．１ｍＭ　ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．１ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、浮遊培養を行った（分化誘導開始、ｄａｙ０）。３日後、培地交換に際して、Ｙ−２７６３２を含有しない同培地へ交換した（ｄａｙ３）。３日後、５０ｎＭ　Ｃ５９、０．１μＭ　ＬＤＮ１９３１８９、１０％　ＫＳＲ、０．１ｍＭ　ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．１ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２へ培地を交換した（ｄａｙ６）。以後、３日毎に同じ培地に交換し、分化誘導開始から１８日間培養を行った（ｄａｙ１８）。
　得られた細胞塊を、５０μｇ／ｍｌオルニチン、５μｇ／ｍｌラミニン、５μｇ／ｍｌフィブロネクチンをコートしたディッシュ（２４ｗｅｌｌプレート）上に移し、Ｂ２７、２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎ、および、１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン及びストレプトマイシンを添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ中で、分化誘導開始から４８日目まで培養を行った。なお、培地交換は、３または４日毎にて行った。
　上述の分化誘導４８日目の細胞をＡｃｃｕｍａｘを用いて解離し、抗ＣＤ２３１抗体（Ｔｈｅｒｍｏ）、抗ＣＤＨ８抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）または抗ＰＣＤＨ１７抗体（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて標識し、ＦＡＣＳを用いて解析した（図１１）。誘導後の細胞において、ＣＤ２３１、ＣＤＨ８またはＰＣＤＨ１７が陽性である細胞が、それぞれ、６．９％、１．４％または８．４％を含有することが確認された。
　続いて、このＣＤ２３１、ＣＤＨ８またはＰＣＤＨ１７の陽性細胞を回収し、９６ｗｅｌｌプレート（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ−ｃｏａｔ　９６ｗｅｌｌプレート）に１ｗｅｌｌあたり１ｘ１０４個を移し、Ｂ２７、２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎ、１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン及びストレプトマイシン、および１０μＭ　Ｙ−２７６３２を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ中で３日間培養し、その後、Ｙ−２７６３２を除いた同培地で、さらに１１日間培養を行った。培養後、ＣｏｕｐＴＦ１およびＣｔｉｐ２に対する抗体を用いて免疫染色を行ったところ、Ｃｔｉｐ２陽性細胞が、ＣＤ２３１、ＣＤＨ８またはＰＣＤＨ１７の陽性細胞に多く確認された（図１２Ａ）。また、ＣｏｕｐＴＦ１が陰性でＣｔｉｐ２が陽性である細胞も、ＣＤ２３１、ＣＤＨ８またはＰＣＤＨ１７の陽性細胞に多く含まれることが確認された。以上より、上記方法により誘導した細胞からＣＤ２３１、ＣＤＨ８またはＰＣＤＨ１７が陽性である細胞を抽出することで、大脳皮質運動野に存在する神経細胞を濃縮することができる可能性が示唆された。
大脳皮質の分化誘導方法の改良
　Ｌａｍｉｎｉｎ５１１Ｅ８を用いてフィーダーフリー条件で培養したｉＰＳ細胞（８３６Ｂ１）をＡｃｃｕｍａｘを用いて解離させ、９６ｗｅｌｌプレート（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ−ｃｏａｔ　９６ｗｅｌｌプレート）に１ｗｅｌｌあたり９×１０３個を移し、５０μＭ　Ｙ−２７６３２、１０μＭ　ＳＢ４３１５２、１０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ、１０ｎＭ−５０ｎＭ　Ｃ５９、０．１μＭ　ＬＤＮ１９３１８９、１０％　ＫＳＲ、０．１ｍＭ　ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．１ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、浮遊培養を行った（分化誘導開始、ｄａｙ０）。３日後、培地交換に際して、Ｙ−２７６３２を含有しない同培地へ交換した（ｄａｙ３）。３日後、１０ｎＭ−５０ｎＭ　Ｃ５９、０．１μＭ　ＬＤＮ１９３１８９、１０％　ＫＳＲ、０．１ｍＭ　ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．１ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２へ培地を交換した（ｄａｙ６）。以後、３日毎に同じ培地に交換し、分化誘導開始から１８日間培養を行った（ｄａｙ１８）。
　Ｄａｙ１８の培地を半量吸引除去し、Ｂ２７、２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎ、および、１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌを除去した量だけ添加した。同様に、Ｄａｙ２１においても半量の培地を交換した。Ｄａｙ２４において、ペトリディッシュへ細胞を移し、以後、３または４日毎に半量の培地を交換した。Ｄａｙ４６にて、得られた細胞において、ＣｏｕｐＴＦ１およびＣｔｉｐ２に対する抗体を用いて免疫染色を行ったところ、実施例１または２で得られた細胞とＣｏｕｐＴＦ１およびＣｔｉｐ２の発現において大きな違いは見られなかった（図１３ＡおよびＢ）。以上より、Ｄａｙ１８以降においても浮遊培養によって、所望の大脳皮質運動野に存在する神経細胞が誘導できることが確認された。
大脳皮質の分化誘導方法の改良
　分化誘導前日に１０μＭ　Ｙ２７６３２を培養液へ添加して培養したｉＰＳ細胞（８３６Ｂ１）をＳＮＬ　ｆｅｅｄｅｒ上から分離させるためにＣＴＫでＳＮＬ細胞を除去した後、Ａｃｃｕｍａｘを用いて解離させ、９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ−ｃｏａｔ　９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ）に１ｗｅｌｌあたり９×１０３個を移し、５０μＭ　Ｙ−２７６３２、１０μＭ　ＳＢ４３１５２、１０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ、各種Ｗｎｔ阻害剤（Ｃ５９　５０ｎＭ，ＬＧＫ−９７４　１００ｎＭ，ＩＣＧ−００１　１μＭ（Ｃｅｌｌａｇｅｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））、１００ｎＭ　ＬＤＮ１９３１８９、１０％　ＫＳＲ、０．１ｍＭ　ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．１ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、浮遊培養を行った（分化誘導開始、ｄａｙ０）。３日後、培地交換に際して、Ｙ−２７６３２を含有しない同培地へ交換した（ｄａｙ３）。３日後、各種ＷＮＴ阻害剤（Ｃ５９，ＬＧＫ−９７４，ＩＣＧ−００１）、１００ｎＭ　ＬＤＮ１９３１８９、１０％　ＫＳＲ、０．１ｍＭ　ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．１ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２へ培地を交換した（ｄａｙ６）。以後、３日毎に同じ培地に交換し、分化誘導開始から１８日間培養を行った（ｄａｙ１８）。
　Ｄａｙ１８の培地を半量吸引除去し、Ｂ２７、２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎ、および、１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン及びストレプトマイシンを添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌを除去した量だけ添加した。同様に、Ｄａｙ２１においても半量の培地を交換した。Ｄａｙ２４において、ペトリディッシュへ細胞を移し、以後、３または４日毎に半量の培地を交換した。Ｄａｙ４６にて、得られた細胞において、ＣｏｕｐＴＦ１およびＣｔｉｐ２に対する抗体を用いて免疫染色を行ったところ、Ｃｔｉｐ２の発現において、実施例１または２で得られた細胞と大きな違いは見られなかった（図１４ＡおよびＢ）。また、ＣｏｕｐＴＦ１陰性でＣｔｉｐ２陽性細胞の誘導効率はＣ５９と類似の作用をもつＬＧＫ−９７４において、大きな違いはなかったが、Ｃ５９と異なる作用をもつＩＣＧ−００１においては、著しく低かった（図１４Ｃ）。以上より、Ｃ５９と類似の作用をもつＷＮＴ阻害剤ＬＧＫ−９７４を利用しても、所望の大脳皮質運動野に存在する神経細胞が誘導できることが確認された。
　本発明は、再生医療、特に脳虚血等の傷害脳の治療に有用である。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (16)

  1. 　以下の工程を含む多能性幹細胞から大脳皮質ニューロンを製造する方法：
    （ｉ）多能性幹細胞をＴＧＦβ阻害剤、ｂＦＧＦ、Ｗｎｔ阻害剤、およびＢＭＰ阻害剤を含む培養液中で浮遊培養する工程、
    （ｉｉ）前記工程（ｉ）で得られた細胞をＷｎｔ阻害剤、およびＢＭＰ阻害剤を含む培養液中で浮遊培養する工程、
    （ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で得られた細胞を培養する工程。
  2. 　前記多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ヒト多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞である、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記ＴＧＦβ阻害剤が、ＳＢ４３１５４２またはＡ−８３−０１である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記Ｗｎｔ阻害剤が、ＰＯＲＣＮ阻害剤である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記Ｗｎｔ阻害剤が、Ｃ５９またはＬＧＫ−９７４である請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記ＢＭＰ阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９である、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記培養液が血清又は血清代替物をさらに含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記工程（ｉ）の培養液がＲＯＣＫ阻害剤をさらに含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記工程（ｉｉｉ）に続いてさらに、工程（ｉｖ）ＣＤ２３１、ＰＣＤＨ１７およびＣＤＨ８から成る群より選択される少なくとも一つのマーカータンパク質が陽性である細胞を抽出する工程を含む請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　前記大脳皮質ニューロンが、Ｃｔｉｐ２陽性ＣｏｕｐＴＦ１陰性であることを特徴とする大脳皮質の運動野の神経細胞である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　前記工程（ｉ）が、少なくとも３日間行われる、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　前記工程（ｉｉ）が、少なくとも６日間行われる、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　請求項１~１３のいずれか１項に記載の方法で得られる、大脳皮質ニューロンを含む細胞培養物。
  15. 　ＴＧＦβ阻害剤、ｂＦＧＦ、Ｗｎｔ阻害剤、及びＢＭＰ阻害剤を含む、多能性幹細胞から大脳皮質ニューロンを作製するためのキット。
  16. 　前記ＴＧＦβ阻害剤が、ＳＢ４３１５４２またはＡ−８３−０１であり、前記Ｗｎｔ阻害剤が、Ｃ５９またはＬＧＫ−９７４であり、前記ＢＭＰ阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９である、請求項１５に記載のキット。
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