WO2020045578A1 - 前脳型興奮性神経細胞の製造方法 - Google Patents

前脳型興奮性神経細胞の製造方法 Download PDF

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WO2020045578A1
WO2020045578A1 PCT/JP2019/033954 JP2019033954W WO2020045578A1 WO 2020045578 A1 WO2020045578 A1 WO 2020045578A1 JP 2019033954 W JP2019033954 W JP 2019033954W WO 2020045578 A1 WO2020045578 A1 WO 2020045578A1
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WO
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forebrain
inhibitor
type
cells
neurons
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Application number
PCT/JP2019/033954
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English (en)
French (fr)
Inventor
智 周
岡野　栄之
Original Assignee
学校法人慶應義塾
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing forebrain-type excitatory neurons. More specifically, the present invention relates to a method for producing forebrain-type excitable neurons, a co-culture of forebrain-type excitatory neurons, forebrain-type excitatory neurons and astrocytes, and a screening for a therapeutic agent for a neurological disease.
  • the present invention relates to a method and a medium for inducing differentiation of forebrain-type excitatory neurons from forebrain-type neural progenitor cells. This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2018-160426 for which it applied to Japan on August 29, 2018, and uses the content here.
  • Patent Document 1 describes a method for inducing the differentiation of pluripotent stem cells into nerve cells.
  • Non-Patent Document 1 discloses that a human cerebral cortex-like three-dimensional culture in which neural cells and astrocytes are stacked is prepared by three-dimensionally culturing human pluripotent stem cells.
  • an object of the present invention is to provide a technique for producing mature and functional nerve cells.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a method for producing forebrain-type excitatory neurons wherein the pluripotent stem cells are treated with a Bone morphogenetic protein (BMP) inhibitor, a Transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ) inhibitor and a Wnt inhibitor.
  • BMP Bone morphogenetic protein
  • TGF- ⁇ Transforming growth factor- ⁇
  • Wnt inhibitor a Wnt inhibitor
  • the forebrain-type neural progenitor cell is obtained by using Glial-Cell Derived Neurotrophic Factor (GDNF), Brain derived neurotropic factor (BDNF), Ascorbic acid, MP Obtaining a forebrain-type excitatory neuron by adhesion culture in the presence of a cell cycle inhibitor and a ⁇ -secretase inhibitor.
  • GDNF Glial-Cell Derived Neurotrophic Factor
  • BDNF Brain derived neurotropic factor
  • MP Obtaining a forebrain-type excitatory neuron by adhesion culture in the presence of a cell cycle inhibitor and a ⁇ -secretase inhibitor.
  • the cell cycle inhibitor is a G1-phase specific cell cycle inhibitor.
  • the G1 phase-specific cell cycle inhibitor is an inhibitor of Cyclin dependent kinase (CDK) 4 or CDK6.
  • the step of obtaining forebrain-type neural progenitor cells comprises: a first step of adhesively culturing pluripotent stem cells in the presence of a BMP inhibitor, a TGF- ⁇ inhibitor and a Wnt inhibitor; The method according to any one of [1] to [3], further comprising: a second step of subjecting the cells to adherent culture in the presence of a BMP inhibitor and a TGF- ⁇ inhibitor.
  • [6] The production method according to any one of [1] to [5], wherein the forebrain-type excitatory neurons have a purity of 90% or more.
  • AMPA ⁇ -amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid
  • N-methyl-D-aspartic acid Forebrain-type excitatory neurons that are positive for NMDA
  • CAMK2 ⁇ Calcium / calmodulin-dependent protein kinase II ⁇
  • a method for screening a therapeutic agent for a neurological disease comprising: [10] A step of co-culturing the forebrain-type excitatory neurons and astrocytes according to [7] in the presence of a test substance, and the morphology, synaptic vesicles, and electricity of the forebrain-type excitatory neurons Evaluating the expression of a physiological parameter or marker and obtaining an evaluation result, and that the evaluation result has changed significantly as compared to the evaluation result in the absence of the test substance, indicating that the test substance has a neurological disorder.
  • a method for screening a therapeutic agent for a neurological disease the method being a candidate for a therapeutic agent.
  • a medium for inducing differentiation from forebrain-type neural progenitor cells to forebrain-type excitatory nerve cells comprising GDNF, BDNF, ascorbic acid, dibutyryl cAMP, a cell cycle inhibitor and a ⁇ -secretase inhibitor.
  • (A) to (f) are graphs showing the results of analyzing the expression of Sox1 and Oct4 in cells induced to differentiate using 8% KSR-containing GMEM medium by flow cytometry in Experimental Example 1.
  • (A) to (f) are graphs showing the results of analyzing the expression of Sox1 and Oct4 in cells induced to differentiate using N2B27 medium by flow cytometry in Experimental Example 1.
  • (A) to (d) are graphs showing the results of quantitative RT-PCR measurement of the expression of POU5F1 gene, NANOG gene, SOX1 gene, and FOXG1 gene at the mRNA level in the cells induced to differentiate in Experimental Example 2, respectively. It is.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a schedule for inducing differentiation of pluripotent stem cells into forebrain-type excitatory neurons.
  • 9 is a fluorescence micrograph showing the results of immunostaining in Experimental Example 3.
  • (A) to (c) are photomicrographs of cells after 6 days of adherent culture from Replating in Experimental Example 4.
  • (A) to (d) are graphs showing the results of quantitative RT-PCR measurement of the expression of the GRIA1, GRIA2, GRIA3 and GRIA4 genes at the mRNA level in the cells induced to differentiate in Experimental Example 4, respectively. It is.
  • (A) to (c) are graphs showing the results of measuring the expression of GRIN1, GRIN2A, and GRIN2B genes at the mRNA level in cells induced to differentiate in Experimental Example 4, respectively, by quantitative RT-PCR.
  • (A) to (c) are graphs showing the results of quantitative RT-PCR measuring the expression of the SYN1, DLG4, and CAMK2A genes at the mRNA level in the cells induced to differentiate in Experimental Example 4, respectively.
  • (A) to (d) are graphs showing the results of quantitative RT-PCR measuring the expression of the CACG2 gene, CACNG3 gene, CACNG4 gene and CACNG8 gene at the mRNA level in the cells induced to differentiate in Experimental Example 4, respectively. It is.
  • FIG. 1 A) and (b) are graphs showing the results of measuring the expression of Tau gene and 4R @ Tau gene at the mRNA level in cells induced to differentiate in Experimental Example 4, respectively, by quantitative RT-PCR.
  • FIG. 1 A) to (c) are fluorescence micrographs showing the results of immunostaining of cells in Experimental Example 6.
  • FIG. 1 A) is a photograph obtained by immunostaining MAP2
  • FIG. 1 A) is a photograph obtained by immunostaining Foxg1
  • FIG. 1 A) is a photograph obtained by superimposing the photographs of (a) and (b).
  • FIG. 1 A) to (c) are fluorescence micrographs showing the results of immunostaining of cells in Experimental Example 6.
  • (A) is a photograph immunostained for MAP2
  • (b) is a photograph immunostained for NeuN
  • (c) is a photograph obtained by superimposing the photographs (a) and (b).
  • (A) and (b) are fluorescence micrographs showing the results of immunostaining in Experimental Example 6.
  • (A) is an image obtained by superimposing an immunostaining image of MAP2 and an immunostaining image of Tbr1
  • (b) is an image obtained by superimposing an immunostaining image of MAP2 and an immunostaining image of Ctip2.
  • (A) and (b) are fluorescence micrographs showing the results of immunostaining in Experimental Example 6.
  • (A) is an image obtained by superimposing an immunostaining image of Syn1, an immunostaining image of vGluT1, and an immunostaining image of MAP2, and (b) is an immunostaining image of vGluT2, an immunostaining image of Homer1, and an immunostaining image of MAP2.
  • (A) and (b) are fluorescence micrographs showing the results of immunostaining in Experimental Example 6.
  • (A) is a photograph immunostained for 4R @ Tau, and (b) is a photograph immunostained for MAP2 in the same visual field as (a).
  • (A) and (b) are raster plots showing the results of measuring calcium ion influx into nerve cells in Experimental Example 7.
  • (A) is a result measured in the absence of tetrodotoxin, and (b) is a result measured in the presence of tetrodotoxin.
  • 15 is a raster plot showing a result of detecting spontaneous firing of nerve cells by MEA analysis in Experimental Example 7.
  • (A) to (c) are graphs showing the results of patch clamp analysis in Experimental Example 7.
  • (A) to (c) are graphs showing the results of evaluation of glutamate-induced excitotoxicity (reducing ability) of forebrain neurons in Experimental Example 8.
  • (A) shows the results using forebrain-type neurons differentiated from human iPS cell line 201B7, and (b) uses forebrain-type neurons differentiated from human iPS cell line 1210B2.
  • (C) shows the results obtained using forebrain-type neurons differentiated from KhES1, a human ES cell line.
  • (A) to (c) are graphs showing the results of measuring the neurite length of forebrain-type neurons and evaluating glutamate-induced excitotoxicity (neurite length) in Experimental Example 9.
  • (A) shows the results using forebrain-type neurons differentiated from human iPS cell line 201B7, and (b) uses forebrain-type neurons differentiated from human iPS cell line 1210B2.
  • (C) shows the results obtained using forebrain-type neurons differentiated from KhES1, a human ES cell line.
  • (A) to (c) are graphs showing the results of evaluation of the reducing ability of forebrain-type nerve cells in Experimental Example 10.
  • (A) shows the results using forebrain-type neurons differentiated from human iPS cell line 201B7, and (b) uses forebrain-type neurons differentiated from human iPS cell line 1210B2.
  • (C) shows the results obtained using forebrain-type neurons differentiated from KhES1, a human ES cell line.
  • (A) to (c) are graphs showing the results of measuring the neurite length of forebrain-type neurons in Experimental Example 11.
  • (A) shows the results using forebrain-type neurons differentiated from human iPS cell line 201B7, and (b) uses forebrain-type neurons differentiated from human iPS cell line 1210B2.
  • (C) shows the results obtained using forebrain-type neurons differentiated from KhES1, a human ES cell line.
  • A is a graph showing the measurement results of the production of A [beta] 40 peptide in Experiment 12.
  • (B) is a graph showing the measurement results of the production of A [beta] 42 peptide in Experiment 12.
  • (A) is a graph showing the measurement results of the production of A [beta] 40 peptides in Experimental Example 13.
  • (B) is a graph showing the measurement results of the production of A [beta] 42 peptides in Experimental Example 13.
  • (C) is a graph showing the result of calculating the ratio of the production amounts of A ⁇ 40 peptide and A ⁇ 42 peptide (production amount of A ⁇ 42 peptide / production amount of A ⁇ 40 peptide) based on (a) and (b). It is.
  • human genes and human proteins are represented by uppercase alphabets.
  • the first character is represented by an uppercase alphabet, and the subsequent characters are represented by a lowercase alphabet.
  • Mouse proteins are represented by uppercase alphabets.
  • human, mouse, and other species genes may be represented without strict discrimination.
  • human proteins, mouse proteins, and other species proteins may be represented without strict discrimination.
  • the present invention provides a method for producing forebrain-type excitatory neurons, wherein the pluripotent stem cells are adherently cultured in the presence of a BMP inhibitor, a TGF- ⁇ inhibitor and a Wnt inhibitor, Obtaining a forebrain-type neural progenitor cell, and adhesively culturing the forebrain-type neural progenitor cell in the presence of GDNF, BDNF, ascorbic acid, dibutyryl cAMP, a cell cycle inhibitor and a ⁇ -secretase inhibitor; Obtaining excitable neurons.
  • the present inventors induced differentiation of a plurality of types of pluripotent stem cells such as human iPS cells and human ES cells by the production method of the present embodiment, and produced forebrain-type excitatory neurons. It was revealed that it can be manufactured.
  • the obtained forebrain-type excitatory neurons could be subjected to all the steps of differentiation induction by monolayer culture by adhesion culture, and the purity was 90% or more.
  • the purity is 90% or more means that 90% or more of the differentiated cells become forebrain-type excitable neurons.
  • the purity of forebrain-type excitatory neurons obtained by the production method of the present embodiment is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and even more preferably 99% or more. , And 100%.
  • high purity of forebrain-type excitable neurons means that the ratio of forebrain-type excitable neurons to the cells present in the culture vessel is high, and It can be said that the differentiation efficiency of sexual nerve cells is high.
  • the purity of forebrain-type neural progenitor cells obtained in the step of obtaining forebrain-type neural progenitor cells is 90% or more.
  • “purity of 90% or more” means that when differentiation of neural progenitor cells is induced, 90% or more of the cells become forebrain-type nerve cells.
  • the cell adhesion culture can be performed by culturing the cells using a culture vessel coated with a surface for cell adhesion.
  • the production method of the present embodiment may be carried out in the presence of feeder cells or under conditions without using feeder cells, but is preferably carried out under conditions without using feeder cells. By not using feeder cells, forebrain-type excitatory neurons with reduced contamination of impurities can be produced.
  • the pluripotent stem cells may be, for example, induced pluripotent stem cells (iPSCs), for example, ES cells.
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • the above-mentioned pluripotent stem cells may be human-derived cells, or may be cells derived from non-human animals such as mice, rats, pigs, goats, sheep, and monkeys.
  • the above-mentioned pluripotent stem cells may be induced pluripotent stem cells derived from healthy individuals, or may be induced pluripotent stem cells derived from neurological patients.
  • the obtained forebrain-type excitable neurons can be used as a model of a neurological disease.
  • Such forebrain-type excitable neurons are useful for elucidating the mechanism of a neurological disease, screening for a drug for treating a disease, and the like.
  • DMH1, Dorsomorphin, LDN-193189, etc. can be used as the BMP inhibitor.
  • SB431542, A83-01, RepSox and the like can be used as the TGF- ⁇ inhibitor.
  • IWP2, IWP3, IWP4, XAV939, Dkk1, and the like can be used as a Wnt inhibitor.
  • the cell cycle inhibitor is preferably a G1 phase-specific cell cycle inhibitor.
  • a cell cycle inhibitor By adding a cell cycle inhibitor to the medium, differentiation induction into forebrain-type excitable neurons can be promoted.
  • the G1-phase specific cell cycle inhibitor is preferably a CDK4 or CDK6 inhibitor. More specific G1 phase-specific cell cycle inhibitors include PD0332991, CINK4, LY2835219, LEE011, and the like.
  • ⁇ -secretase inhibitors examples include DAPT ( ⁇ -secretase inhibitor IX), Compound E, ⁇ -secretase inhibitor XI, ⁇ -secretase inhibitor III, and the like.
  • ROCK inhibitor examples include Y27632.
  • the step of obtaining forebrain-type neural progenitor cells comprises: a first step of adhesively culturing pluripotent stem cells in the presence of a BMP inhibitor, a TGF- ⁇ inhibitor and a Wnt inhibitor; And a second step of subjecting the cells after the first step to adherent culture in the presence of a BMP inhibitor and a TGF- ⁇ inhibitor. That is, it is preferable to add the Wnt inhibitor to the medium of the first step and not to add the Wnt inhibitor to the medium of the second step.
  • the step of obtaining forebrain-type neural progenitor cells comprises a first step of adding a Wnt inhibitor to a medium, and a second step of not adding a Wnt inhibitor to a medium.
  • the first step is preferably performed for about one week
  • the second step is also preferably performed for about one week.
  • the forebrain-type neural progenitor cells are subjected to GDNF, BDNF, ascorbic acid, dibutyryl cAMP, a cell cycle inhibitor and a ⁇ -secretase inhibitor.
  • the cells may be dissociated into single cells and replated before the step of performing the adherent culture.
  • dissociating into single cells means dissociating the cells adhered to the culture vessel one by one.
  • the dissociation into single cells can be carried out by subjecting the cells to an enzymatic treatment such as accutase, trypsin, collagenase or the like, which is usually used for cell dissociation, and pipetting.
  • the present invention provides forebrain-type excitatory neurons housed in a culture vessel, having a purity of 90% or more, being positive for AMPA receptor, NMDA receptor and CAMK2 ⁇ , and igniting spontaneously. I do.
  • the forebrain-type excitatory neurons of the present embodiment are vGlut1 positive or vGlut2 positive, and can also be said to be cells that perform excitatory synaptic transmission.
  • the forebrain-type excitatory neurons of the present embodiment may be vGlut1 positive and vGlut2 positive.
  • the forebrain-type excitatory neurons of the present embodiment can be produced by the above-described production method. Conventionally, it has been difficult to produce forebrain-type excitatory neurons of such purity. On the other hand, such a forebrain-type excitatory nerve cell can be manufactured by the above-described manufacturing method.
  • a positive AMPA receptor a positive AMPA receptor
  • a positive NMDA receptor a positive NMDA receptor
  • spontaneous firing indicate excitable neurons.
  • the forebrain-type excitatory neurons of the present embodiment are CAMK2 ⁇ -positive and functional neurons.
  • the forebrain-type excitatory neurons of the present embodiment are 4R @ Tau-positive and functional neurons.
  • the present invention provides a co-culture of forebrain-type excitatory neurons and astrocytes as described above.
  • examples of astrocytes include astrocytes induced to differentiate from pluripotent stem cells.
  • the pluripotent stem cells used for inducing differentiation of astrocytes may be the same as the pluripotent stem cells used for inducing differentiation of forebrain-type excitatory neurons.
  • a co-culture of forebrain-type excitatory neurons and astrocytes can be called a co-culture system in which forebrain-type excitatory neurons and astrocytes are co-cultured.
  • a co-culture is, for example, forebrain-type excitatory neurons and astrocytes co-cultured in a culture vessel, which may include a medium and a culture vessel.
  • the present invention provides a method for culturing the forebrain-type excitatory neuron in the presence of a test substance, the method comprising: The step of evaluating the expression of a parameter or marker and obtaining an evaluation result, wherein the evaluation result has changed significantly as compared to the evaluation result in the absence of the test substance, and the test substance is a therapeutic agent for a neurological disease.
  • the present invention provides a method for co-culturing the forebrain-type excitable neurons and astrocytes described above in the presence of a test substance, comprising the steps of: Evaluating the vesicles or electrophysiological parameters to obtain an evaluation result, and that the evaluation result has changed significantly as compared with the evaluation result in the absence of the test substance.
  • a method for screening a therapeutic agent for a neurological disease which is a candidate for a drug.
  • the screening method of the present embodiment is mainly different from the above-described screening method in that forebrain-type excitatory neurons are co-cultured with astrocytes. By co-culturing with astrocytes, screening can be performed in an environment closer to the living body than screening using only forebrain-type excitatory neurons.
  • the test substance is not particularly limited, and examples include a natural compound library, a synthetic compound library, an existing drug library, a metabolite library, and the like.
  • Existing drug libraries also include, for example, nucleic acid drugs.
  • Evaluation of the morphology of forebrain-type excitable neurons includes, for example, paraformaldehyde fixation of co-cultured forebrain-type excitatory neurons and astrocytes, staining of neuronal markers by immunostaining, and neurological observation by microscopic observation. Measuring the length of the protrusion may be mentioned.
  • neuronal markers include MAP2, Tau1, ⁇ 3Tubulin and the like.
  • synaptic vesicles of forebrain-type excitatory neurons includes, for example, after fixing paraformaldehyde, staining a synapse-related protein by immunostaining, and counting the number by microscopic observation.
  • synapse-related protein include Synapsin1, Bassoon, vGluT1, vGluT2, Synapsophysin, and the like.
  • the evaluation of electrophysiological parameters of forebrain-type excitable neurons includes, for example, synchronous firing and spontaneous action potential of neurons by Ca 2+ imaging, microelectrode array (MEA) analysis, patch clamp analysis, and the like. (SAP), spontaneous excitatory post-synaptic current (sEPSC) and the like.
  • markers of forebrain-type excitatory neurons may be performed at the gene level or at the protein level.
  • marker genes for example, FOXG1, SIX3, TBR1, BCL11B, SATB2, POU3F2, TLE4, CUX1, CAMK2A, DLG4, HOMER1, GRIA1, GRIA2, GRIA3, GRIA4, GRIN1, APIN2AP, EN2AAP , PEN2, NCSTN, BACE1, APP and the like.
  • the expression of the marker gene can be evaluated by, for example, microarray analysis, real-time PCR analysis, or the like.
  • marker proteins include amyloid ⁇ 40 peptide, amyloid ⁇ 42 peptide, Foxg1, Six3, Tbr1, Ctip2, Satb2, Brn2, Tle4, Cux1, Camk2A, PSD95, Homer1, GluR1, GluR2, GluR3, GluR3NR , NR2B, PSEN1, PSEN2, APH1A, APH1B, PEN2, Nicastrin, BACE1, APP and the like.
  • the expression of the marker protein can be evaluated by, for example, immunostaining, western blotting, ELISA, or the like.
  • the evaluation result of the expression of the morphology, synaptic vesicles, electrophysiological parameters or markers of the forebrain-type excitatory neurons is significantly compared to the evaluation result in the absence of the test substance.
  • the test substance can be determined to be a candidate for a therapeutic drug for a neurological disease.
  • the present invention relates to the induction of differentiation from forebrain-type neural progenitor cells to forebrain-type excitatory neurons, which comprises GDNF, BDNF, ascorbic acid, dibutyryl cAMP, a cell cycle inhibitor and a gamma secretase inhibitor.
  • forebrain-type neural progenitor cells which comprises GDNF, BDNF, ascorbic acid, dibutyryl cAMP, a cell cycle inhibitor and a gamma secretase inhibitor.
  • forebrain-type neural progenitor cells which comprises GDNF, BDNF, ascorbic acid, dibutyryl cAMP, a cell cycle inhibitor and a gamma secretase inhibitor.
  • forebrain-type neural progenitor cells which comprises GDNF, BDNF, ascorbic acid, dibutyryl cAMP, a cell cycle inhibitor and a gamma secretase inhibitor.
  • GDNF forebrain-type neural
  • the medium of the present embodiment can efficiently induce forebrain-type neural progenitor cells to forebrain-type excitatory neurons.
  • the cell cycle inhibitor is the same as described above, and is preferably a G1-phase specific cell cycle inhibitor.
  • the G1-phase specific cell cycle inhibitor is preferably a CDK4 or CDK6 inhibitor. More specific G1 phase-specific cell cycle inhibitors include PD0332991, CINK4, LY2835219, LEE011, and the like.
  • ⁇ -secretase inhibitors examples include DAPT ( ⁇ -secretase inhibitor IX), Compound E, ⁇ -secretase inhibitor XI, ⁇ -secretase inhibitor III, and the like.
  • the differentiation-inducing medium of the present embodiment preferably further contains a ROCK inhibitor.
  • the ROCK inhibitor include Y27632.
  • Example 1 (Examination of conditions for inducing differentiation of human iPS cells into ectoderm) 201B7, a human iPS cell line, was cultured for 12 days in a medium supplemented with a BMP inhibitor and a TGF- ⁇ inhibitor, and the conditions for inducing differentiation into ectoderm were examined.
  • DM In addition, DMH1 (model “041-33881”, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) having a final concentration of 2 ⁇ M or 5 ⁇ M was used as a BMP inhibitor.
  • SB431542 (model “S4317”, Sigma-Aldrich) having a final concentration of 2 ⁇ M or a final concentration of 10 ⁇ M was used as a TGF- ⁇ inhibitor.
  • RO276 inhibitor Y27632 (model “253-00513”, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the medium at a final concentration of 10 ⁇ M in order to suppress the death of iPS cells.
  • FIGS. 1 (a) to 1 (f) are graphs showing the results of analyzing the expression of Sox1 and Oct4 by flow cytometry when using a GMEM medium containing 8% KSR.
  • FIGS. 1A to 1C show the results of a control in which each cell was stained using an isotype control antibody.
  • FIGS. 1D to 1F show the results of staining each cell with an anti-Oct4 antibody and an anti-Sox1 antibody. 1D to 1F, the vertical axis indicates the expression level of Oct4, and the horizontal axis indicates the expression intensity of Sox1.
  • 1 (a) and 1 (d) show the results when the BMP inhibitor and the TGF- ⁇ inhibitor were not added to the medium.
  • FIGS. 1B and 1E show the results obtained by adding DMH1 having a final concentration of 2 ⁇ M and SB431542 having a final concentration of 2 ⁇ M to the medium.
  • FIGS. 1C and 1F show the results obtained by adding DMH1 having a final concentration of 5 ⁇ M and SB431542 having a final concentration of 10 ⁇ M to the medium.
  • FIGS. 2A to 2F are graphs showing the results of analyzing the expression of Sox1 and Oct4 by flow cytometry when the N2B27 medium was used.
  • 2 (a) to 2 (c) show the results of a control in which each cell was stained using an isotype control antibody.
  • 2 (d) to 2 (f) show the results of staining each cell using an anti-Oct4 antibody and an anti-Sox1 antibody.
  • 2D to 2F the vertical axis indicates the expression level of Oct4, and the horizontal axis indicates the expression intensity of Sox1.
  • 2 (a) and 2 (d) show the results when the BMP inhibitor and the TGF- ⁇ inhibitor were not added to the medium.
  • FIGS. 2B and 2E show the results obtained by adding DMH1 having a final concentration of 2 ⁇ M and SB431542 having a final concentration of 2 ⁇ M to the medium.
  • FIGS. 2C and 2F show the results obtained by adding DMH1 having a final concentration of 5 ⁇ M and SB431542 having a final concentration of 10 ⁇ M to the medium.
  • Example 2 (Examination of conditions for inducing differentiation of pluripotent stem cells into forebrain-type neural progenitor cells) In addition to the differentiation-inducing conditions examined in Experimental Example 1, conditions for inducing differentiation of pluripotent stem cells into forebrain-type neural progenitor cells by adding a Wnt inhibitor to the medium were examined.
  • 201B7 a human iPS cell line, was cultured in a medium supplemented with a BMP inhibitor and a TGF- ⁇ inhibitor for 12 days.
  • DMH1 model “041-33881”, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • SB431542 model “S4317”, Sigma-Aldrich
  • IWP2 model “I0536”, Sigma-Aldrich
  • RO276 inhibitor Y27632 was added to the medium at a final concentration of 10 ⁇ M in order to suppress the death of iPS cells.
  • the conditions for adding the Wnt inhibitor were examined for 1 to 12 days after the start of the culture, 1 to 7 days after the start of the culture, and 5 to 12 days after the start of the culture.
  • the expression of the undifferentiated marker gene, the ectoderm marker gene and the marker gene of the forebrain-type neuron in each cell was measured by quantitative RT-PCR to determine whether or not the cells had differentiated into forebrain-type neural progenitor cells. did.
  • 3 (a) to 3 (d) show the quantitative RT-level expression of POU5F1 gene and NANOG gene which are undifferentiated markers, SOX1 gene which is an ectodermal marker, and FOXG1 gene which is a marker of forebrain-type nerve cells.
  • -It is a graph which shows the result measured by PCR.
  • the POU5F1 gene is a gene encoding the Oct4 protein
  • the SOX1 gene is a gene encoding the Sox1 protein.
  • FIG. 3 (a) shows the measurement results of the POU5F1 gene
  • FIG. 3 (b) shows the measurement results of the NANOG gene
  • FIG. 3 (c) shows the measurement results of the SOX1 gene
  • FIG. 3 (d) shows the FOXG1 gene 2 shows the measurement results.
  • the expression level of each gene was normalized by the ACTB gene expression level.
  • “Undiff” indicates the results obtained using undifferentiated iPS cells
  • “d1-12” indicates the results obtained by adding a Wnt inhibitor to the medium for 1 to 12 days after the start of culture
  • “d1-7” indicates the results obtained by adding Wnt inhibitors to the medium. The results show that the inhibitor was added to the medium for 1 to 7 days after the start of the culture
  • “d5-12” shows the results of adding the Wnt inhibitor to the medium for 5 to 12 days after the start of the culture.
  • FIGS. 3A and 3B it was revealed that the expression level of the undifferentiated marker decreased under any of the conditions. Further, as shown in FIG. 3 (c), it was found that the expression level of the ectoderm marker increased under any of the conditions. As shown in FIG. 3 (d), when the Wnt inhibitor was added to the medium for 1 to 12 days after the start of the culture, or when the Wnt inhibitor was added to the medium for 1 to 7 days after the start of the culture, It was revealed that the expression level of the neuronal marker was significantly increased.
  • FORSE-1 which is a marker for forebrain neurons
  • FIGS. 4A to 4C are graphs showing analysis results. 4 (a) to 4 (c), "d1-12” shows the result of adding the Wnt inhibitor to the medium for 1 to 12 days after the start of the culture, and “d1-7” shows the result of adding the Wnt inhibitor to the medium after the start of the culture. “D5-12” indicates the result of adding the Wnt inhibitor to the medium for 5 to 12 days after the start of the culture.
  • the vertical axis indicates the number of cells, and the horizontal axis indicates the expression intensity of FORSE-1.
  • the conditions for inducing differentiation from pluripotent stem cells into forebrain-type neural progenitor cells are those in which a Wnt inhibitor is added to the medium for 1 to 7 days after the start of culture.
  • DG indicates the number of days after the culture
  • Repplating indicates that the cells were detached from the culture vessel to dissociate into single cells, and then seeded in a new culture vessel.
  • GMEM, KSR, DMH1, SB431542, Y27632, and IWP2 are the same as those described above.
  • ⁇ “ BrainPhys @ medium ” indicates a medium.
  • “DAPT” (model “D5942-5MG”, Sigma-Aldrich) indicates a ⁇ -secretase inhibitor
  • “AA” (model “A4403-100MG”, Sigma-Aldrich) indicates ascorbic acid
  • “dbcAMP” (Model “D0627-1G”, Sigma-Aldrich) indicates dibutyryl cAMP
  • “PD0332991” Model “PZ0199”, Sigma-Aldrich) indicates a CDK4 / 6 inhibitor.
  • GDNF model “450-10”, Peprotech
  • BDNF model “248-BD-025”, R & D
  • FIG. 6 is a fluorescence micrograph showing the results of immunostaining for examining the time-dependent changes in the expression of Sox1, Oct3 / 4, and Pax6 in pluripotent stem cells induced to differentiate pluripotent stem cells according to the schedule shown in FIG. It is.
  • the surface coating of the culture vessel was examined. Specifically, on the schedule shown in FIG. 5, the surface coating of the culture vessel after re-seeding (Replating) was examined.
  • the surface coat include poly-L-lysine (model “P4832”, Sigma-Aldrich) and laminin (model “23017015”, Thermo Fisher Scientific), Matrigel (Corning) coat, and laminin ( Model "23017015", Thermo Fisher Scientific Co.) coat was examined.
  • FIGS. 7A to 7C are micrographs of each cell after adherent culture for 6 days from replating.
  • the scale bar is 100 ⁇ m.
  • FIG. 7A shows the result of coating with poly-L-lysine and laminin
  • FIG. 7B shows the result of matrigel coating
  • FIG. 7C shows the result of laminin coating.
  • AMPA receptor gene and NMDA receptor gene which are indicators of excitatory neurons, was measured by quantitative RT-PCR.
  • the expression of synapse-related genes, TARP ⁇ family genes, and Tau genes were also measured by quantitative RT-PCR.
  • FIGS. 8A to 8D are graphs showing the results of measuring the expression of the AMPA receptor gene, GRIA1, GRIA2, GRIA3, and GRIA4 genes at the mRNA level by quantitative RT-PCR.
  • 8 (a) shows the measurement results of the GRIA1 gene
  • FIG. 8 (b) shows the measurement results of the GRIA2 gene
  • FIG. 8 (c) shows the measurement results of the GRIA3 gene
  • FIG. 8 (d) shows the GRIA4 gene 2 shows the measurement results.
  • IPS indicates the measurement results of undifferentiated iPS cells
  • 1-2wk (NPC) indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells
  • FIGS. 9A to 9C are graphs showing the results of quantitative RT-PCR measuring the expression of the NMDA receptor genes GRIN1, GRIN2A, and GRIN2B at the mRNA level.
  • FIG. 9A shows the measurement results of the GRIN1 gene
  • FIG. 9B shows the measurement results of the GRIN2A gene
  • FIG. 9C shows the measurement results of the GRIN2B gene.
  • IPS indicates the measurement results of undifferentiated iPS cells
  • 1-2wk (NPC) indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells
  • FIGS. 10 (a) to (c) are graphs showing the results of measuring the expression of SYN1, DLG4, and CAMK2A genes, which are synapse-related genes, at the mRNA level by quantitative RT-PCR.
  • FIG. 10 (a) shows the measurement results of the SYN1 gene
  • FIG. 10 (b) shows the measurement results of the DLG4 gene
  • FIG. 10 (c) shows the measurement results of the CAMK2A gene.
  • the CAMK2A gene is a gene encoding a CAMK2 ⁇ protein.
  • IPS indicates the measurement results of undifferentiated iPS cells
  • 1-2wk (NPC) indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells
  • FIGS. 11 (a) to 11 (d) are graphs showing the results obtained by measuring the expression of a TARP ⁇ family gene, which is a control protein of the AMPA receptor, by quantitative RT-PCR.
  • a TARP ⁇ family gene which is a control protein of the AMPA receptor
  • the CACNG2 gene, CACNG3 gene, CACNG4 gene, and CACNG8 gene were examined.
  • FIG. 11 (a) shows the measurement results of the CACNG2 gene
  • FIG. 11 (b) shows the measurement results of the CACNG3 gene
  • FIG. 11 (c) shows the measurement results of the CACNG4 gene
  • FIG. 11 (d) shows the CACNG8 gene 2 shows the measurement results.
  • IPS indicates the measurement results of undifferentiated iPS cells
  • 1-2wk (NPC) indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells
  • FIG. 12A is a graph showing the result of measuring the expression of the Tau gene by quantitative RT-PCR.
  • FIG. 12 (b) is a graph showing the results of measuring the expression of the 4R Tau gene by quantitative RT-PCR.
  • 4R Tau is a kind of isoform of Tau protein.
  • FIG. 12 (a) indicates the Tau gene.
  • FIG. 12 (b) indicates the 4R @ Tau gene.
  • IPS indicates the measurement results of undifferentiated iPS cells
  • 1-2wk (NPC) indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • 3-4wk indicates the measurement results of neural progenitor cells 1-2 weeks after the start of differentiation induction
  • “3-4wk”, “5-6wk”, “7-8wk”, “9-10wk” are 3-4 weeks, 5-6 weeks, 7-8 weeks, and 9-10 weeks from the start of differentiation induction, respectively.
  • 15-16 weeks, and "Cerebral @ cortex” shows the results of measurement using commercially available human cerebral cortex RNA (model “636561", Clontech).
  • FIGS. 13A to 13C are fluorescence micrographs showing the results of immunostaining.
  • the scale bar is 50 ⁇ m.
  • FIG. 13 (a) is a photograph immunostained for MAP2
  • FIG. 13 (b) is a photograph immunostained for Foxg1
  • FIG. 13 (c) is a superposition of the photographs of FIGS. 13 (a) and (b). It is a thing.
  • ⁇ Immunostaining of mature neuronal markers Subsequently, the cells were induced to differentiate from iPS cells, and after 5 weeks, the cells were fixed with paraformaldehyde, and the expression of MAP2, a marker for neurons, and NeuN, a marker for mature neurons, was examined by immunostaining.
  • MAP2 a marker for neurons
  • NeuN a marker for mature neurons
  • FIGS. 14A to 14C are fluorescence micrographs showing the results of immunostaining.
  • the scale bar is 100 ⁇ m.
  • FIG. 14 (a) is a photograph of MAP2 immunostained
  • FIG. 14 (b) is a photograph of NeuN immunostained
  • FIG. 14 (c) is a superposition of the photographs of FIGS. 14 (a) and (b). It is a thing.
  • FIGS. 15A and 15B are fluorescence micrographs showing the results of immunostaining.
  • the scale bar is 50 ⁇ m.
  • FIG. 15 (a) shows the MAP2 immunostaining image and the Tbr1 immunostaining image superimposed
  • FIG. 15 (b) shows the MAP2 immunostaining image and Ctip2 immunostaining image superimposed.
  • the nerve cells obtained by inducing differentiation according to the schedule shown in FIG. 5 express cerebral cortical markers.
  • FIGS. 16A and 16B are fluorescence micrographs showing the results of immunostaining.
  • the scale bar is 50 ⁇ m.
  • FIG. 16 (a) is an image obtained by superimposing an immunostaining image of Syn1, an immunostaining image of vGluT1 and an immunostaining image of MAP2, and
  • FIG. 16 (b) is an immunostaining image of vGluT2, an immunostaining image of Homer1, and MAP2.
  • the nerve cells obtained by inducing differentiation according to the schedule shown in FIG. 5 form excitatory synapses.
  • FIGS. 17A and 17B are fluorescence micrographs showing the results of immunostaining.
  • FIG. 17 (a) is a photograph immunostained for 4R @ Tau
  • FIG. 17 (b) is a photograph immunostained for MAP2 in the same field as FIG. 17 (a).
  • arrows indicate 4R ⁇ Tau positive cells.
  • Example 7 (Functional analysis of forebrain-type excitatory neurons differentiated from pluripotent stem cells 3) Pluripotent stem cells were induced to differentiate according to the schedule shown in FIG. 5 to produce forebrain-type neurons.
  • a pluripotent stem cell As a pluripotent stem cell, a human iPS cell line 201B7 was used. Subsequently, spontaneous firing of the prepared forebrain neurons was examined.
  • FIGS. 18 (a) and 18 (b) are raster plots showing the results of measuring the inflow of calcium ions into each nerve cell.
  • FIG. 18 (a) shows the result of measurement in the absence of tetrodotoxin
  • FIG. 18 (b) shows the result of measurement in the presence of tetrodotoxin.
  • the vertical axis indicates the identified individual neuron (neuron ID)
  • the horizontal axis indicates time (second)
  • the plot indicates that calcium ion influx was detected. .
  • microelectrode array Microelectrode array, MEA
  • MEA microelectrode array
  • FIG. 19 is a raster plot showing the result of detecting spontaneous firing of each nerve cell.
  • the vertical axis indicates the identified nerve cells (neuron IDs)
  • the horizontal axis indicates time (seconds)
  • the plot indicates that spontaneous firing was detected.
  • FIGS. 20A to 20C are graphs showing the results of patch clamp analysis.
  • FIGS. 20A and 20B show the results of measuring the spontaneous action potential (sAP) of the nerve cell.
  • FIG. 20 (b) shows the results of measurement performed in the same manner as in FIG. 20 (a) except that tetrodotoxin, a voltage-gated sodium channel inhibitor, was added to the medium.
  • FIG. 20 (c) shows the results of measuring spontaneous excitatory post-synaptic currents (sEPSC) of nerve cells.
  • sEPSC spontaneous excitatory post-synaptic currents
  • Example 8 (Functional analysis of forebrain-type excitatory neurons differentiated from pluripotent stem cells 4)
  • Pluripotent stem cells were induced to differentiate according to the schedule shown in FIG. 5 to produce forebrain-type neurons.
  • human iPS cell lines 201B7 and 1210B2 and human ES cell line KhES1 were used as the pluripotent stem cells. Subsequently, L-glutamic acid was added to the prepared medium of each forebrain-type nerve cell, and glutamate-induced excitotoxicity was examined.
  • ⁇ ⁇ Glutamate which was serially diluted to a final concentration of 0 to 100 ⁇ M, was added to the medium of each forebrain neuron 5 weeks after the differentiation was induced from the pluripotent stem cells, and the mixture was incubated for 24 hours.
  • MK801 which is an NMDA receptor antagonist was added to the medium at a final concentration of 1 ⁇ M.
  • the reducing ability of the cells was measured by a WST-8 assay using CellCCounting Kit-8 (Dojindo Laboratories), and glutamate-induced excitotoxicity was evaluated.
  • the reducing ability of the cells was calculated assuming that the measured value when glutamic acid was not added was 100%, and the measured value when 0.1% Triton @ X-100 was added to the cells was 0%.
  • FIGS. 21 (a) to 21 (c) are graphs showing the results of evaluating glutamate-induced excitotoxicity (reducing ability).
  • FIG. 21 (a) shows the results using forebrain-type nerve cells induced to differentiate from human iPS cell line 201B7
  • FIG. 21 (b) shows the results from forebrain-type nerve cells induced to differentiate from human iPS cell line 1210B2.
  • FIG. 21 (c) shows the results using forebrain-type nerve cells induced to differentiate from human ES cell line KhES1.
  • Example 9 (Functional analysis of forebrain-type excitatory neurons differentiated from pluripotent stem cells 5) A plurality of pluripotent stem cells were induced to differentiate according to the schedule shown in FIG. 5 to produce forebrain-type nerve cells.
  • the pluripotent stem cells human iPS cell lines 201B7 and 1210B2 and human ES cell line KhES1 were used. Subsequently, L-glutamic acid was added to the prepared medium of each forebrain-type nerve cell, and glutamate-induced excitotoxicity was examined.
  • ⁇ ⁇ Glutamate which was serially diluted to a final concentration of 0 to 100 ⁇ M, was added to the medium of each forebrain neuron 5 weeks after the differentiation was induced from the pluripotent stem cells, and the mixture was incubated for 24 hours.
  • MK801 which is an NMDA receptor antagonist was added to the medium at a final concentration of 1 ⁇ M.
  • neurite length ( ⁇ m) per MAP2-positive cell was measured using IN Cell Analyzer 6000 (GE Healthcare Bioscience) to evaluate glutamate-induced excitotoxicity.
  • FIGS. 22 (a) to 22 (c) are graphs showing the results of measuring the neurite length of forebrain-type neurons and evaluating glutamate-induced excitotoxicity (neurite length).
  • FIG. 22 (a) shows the results using forebrain-type neurons differentiated from human iPS cell line 201B7
  • FIG. 22 (b) shows forebrain-type nerve cells differentiated from human iPS cell line 1210B2.
  • FIG. 22 (c) shows the results using forebrain-type nerve cells induced to differentiate from human ES cell line KhES1.
  • Example 10 (Functional analysis of forebrain-type excitatory neurons differentiated from pluripotent stem cells 6) A plurality of pluripotent stem cells were induced to differentiate according to the schedule shown in FIG. 5 to produce forebrain-type nerve cells.
  • pluripotent stem cells human iPS cell lines 201B7 and 1210B2 and human ES cell line KhES1 were used.
  • human A ⁇ 42 peptide (Peptide Research Institute) serially diluted to a final concentration of 0 to 10 ⁇ M was added to the medium of each forebrain-type neuron, and incubated for 48 hours. Subsequently, the cell reducing ability was measured by a WST-8 assay using Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories), and neurotoxicity was evaluated.
  • FIGS. 23 (a) to 23 (c) are graphs showing the results of measuring the reducing ability of each forebrain neuron.
  • FIG. 23 (a) shows the results obtained using forebrain-type neurons differentiated from human iPS cell line 201B7
  • FIG. 23 (b) shows the results of using forebrain-type neurons differentiated from human iPS cell line 1210B2.
  • FIG. 23 (c) shows the results using forebrain-type nerve cells induced to differentiate from human ES cell line KhES1.
  • Example 11 (Functional analysis of forebrain-type excitatory neurons differentiated from pluripotent stem cells 7) A plurality of pluripotent stem cells were induced to differentiate according to the schedule shown in FIG. 5 to produce forebrain-type nerve cells.
  • the pluripotent stem cells human iPS cell lines 201B7 and 1210B2 and human ES cell line KhES1 were used.
  • a [beta] 42 peptides medium amyloid ⁇ 42 peptide of each forebrain neural cell prepared was added (hereinafter referred to as "A [beta] 42 peptides.”), By measuring neurite length was evaluated neurotoxicity.
  • human A ⁇ 42 peptide (Peptide Research Institute) serially diluted to a final concentration of 0 to 10 ⁇ M was added to the medium of each forebrain-type neuron, and incubated for 48 hours. Subsequently, the neurite length of MAP2-positive cells was measured using IN @ Cell @ Analyzer6000 (GE Healthcare Bioscience) to evaluate neurotoxicity.
  • FIGS. 24A to 24C are graphs showing the results of measuring the neurite length of each forebrain-type neuron.
  • FIG. 24 (a) shows the results using forebrain-type neurons differentiated from human iPS cell line 201B7
  • FIG. 24 (b) shows forebrain-type nerve cells differentiated from human iPS cell line 1210B2.
  • FIG. 24 (c) shows the results using forebrain-type nerve cells induced to differentiate from human ES cell line KhES1.
  • Example 12 (Functional analysis of forebrain-type excitatory neurons differentiated from pluripotent stem cells 8) A plurality of pluripotent stem cells were induced to differentiate according to the schedule shown in FIG. 5 to produce forebrain-type nerve cells.
  • a pluripotent stem cell a human iPS cell line 201B7 was used.
  • DAPT gamma secretase inhibitor
  • Figure 25 (a) is a graph showing the measurement results of the production of A [beta] 40 peptide. Further, FIG. 25 (b) is a graph showing the measurement results of the production of A [beta] 42 peptide.
  • “Ctl” indicates the result of the control without the addition of the ⁇ -secretase inhibitor
  • “+ DAPT” indicates the result of the addition of DAPT.
  • “**” indicates that a significant difference exists at p ⁇ 0.01
  • “***” indicates that a significant difference exists at p ⁇ 0.001.
  • Example 13 (Functional analysis of forebrain-type excitatory neurons differentiated from pluripotent stem cells 9) A plurality of pluripotent stem cells were induced to differentiate according to the schedule shown in FIG. 5 to produce forebrain-type nerve cells.
  • As the pluripotent stem cells 201B7, a human iPS cell line derived from a healthy human, and PS1 (A246E), an iPS cell line derived from a familial Alzheimer's disease patient expressing mutant presenilin 1 were used.
  • DAPT gamma secretase inhibitor
  • Figure 26 (a) is a graph showing the measurement results of the production of A [beta] 40 peptide. Further, FIG. 26 (b) is a graph showing the measurement results of the production of A [beta] 42 peptide. FIG. 26 (c) shows the ratio of the production amounts of A ⁇ 40 peptide and A ⁇ 42 peptide (the production amount of A ⁇ 42 peptide / the production amount of A ⁇ 40 peptide) based on FIGS. 26 (a) and 26 (b). 4 is a graph showing the result of calculating ().
  • forebrain-type neurons produced from iPS cells derived from Alzheimer's disease patients were compared with forebrain-type neurons produced from iPS cells derived from healthy individuals, in the production amount of A ⁇ 40 peptide and A ⁇ 42 peptide. It was revealed that the production was significantly higher.
  • brain neural cells before prepared from Alzheimer's disease from patients iPS cells as compared to the brain neural cells before produced from iPS cells derived from healthy individuals, the ratio of production of A [beta] 40 peptide and A [beta] 42 peptide (A ⁇ 42 peptide production / A ⁇ 40 peptide production) was found to be significantly higher.

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Abstract

前脳型興奮性神経細胞の製造方法であって、多能性幹細胞を、Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）阻害剤、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－β（ＴＧＦ－β）阻害剤及びＷｎｔ阻害剤の存在下で接着培養し、前脳型神経前駆細胞を得る工程と、前記前脳型神経前駆細胞を、Ｇｌｉａｌ－Ｃｅｌｌ　Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ）、Ｂｒａｉｎ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ）、アスコルビン酸、ジブチリルｃＡＭＰ、細胞周期阻害剤及びγセクレターゼ阻害剤の存在下で接着培養し、前脳型興奮性神経細胞を得る工程と、を含む、製造方法。

Description

前脳型興奮性神経細胞の製造方法
　本発明は、前脳型興奮性神経細胞の製造方法に関する。より詳細には、本発明は、前脳型興奮性神経細胞の製造方法、前脳型興奮性神経細胞、前脳型興奮性神経細胞及びアストロサイトの共培養物、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法、及び前脳型神経前駆細胞から前脳型興奮性神経細胞への分化誘導用培地に関する。本願は、２０１８年８月２９日に日本に出願された特願２０１８－１６０４２６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　多能性幹細胞を神経細胞に分化誘導する方法が盛んに検討されている。例えば、特許文献１には、多能性幹細胞を神経細胞に分化誘導する方法が記載されている。また、非特許文献１には、ヒト多能性幹細胞を３次元培養することにより、神経細胞及びアストロサイトが積層された大脳皮質様３次元培養物を作製したことが記載されている。
特開２０１３－１２３４３６号公報
Pasca A. M., et al., Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture., Nat. Methods, 12 (7), 671-678, 2015.
　しかしながら、特許文献１に記載された方法は、多能性幹細胞から神経上皮細胞（神経前駆細胞）を分化誘導するものである。このため、特許文献１に記載の方法により、成熟した神経細胞を作製することは困難である。また、非特許文献１に記載された方法により、特定の神経細胞を大量に作製することは困難である。そこで、本発明は、成熟した機能的な神経細胞を製造する技術を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］前脳型興奮性神経細胞の製造方法であって、多能性幹細胞を、Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）阻害剤、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－β（ＴＧＦ－β）阻害剤及びＷｎｔ阻害剤の存在下で接着培養し、前脳型神経前駆細胞を得る工程と、前記前脳型神経前駆細胞を、Ｇｌｉａｌ－Ｃｅｌｌ　Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ）、Ｂｒａｉｎ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ）、アスコルビン酸、ジブチリルｃＡＭＰ、細胞周期阻害剤及びγセクレターゼ阻害剤の存在下で接着培養し、前脳型興奮性神経細胞を得る工程と、を含む、製造方法。
［２］前記細胞周期阻害剤が、Ｇ１期特異的細胞周期阻害剤である、［１］に記載の製造方法。
［３］前記Ｇ１期特異的細胞周期阻害剤がＣｙｃｌｉｎ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｋｉｎａｓｅ（ＣＤＫ）４又はＣＤＫ６の阻害剤である、［２］に記載の製造方法。
［４］前記前脳型神経前駆細胞を得る工程は、多能性幹細胞を、ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤及びＷｎｔ阻害剤の存在下で接着培養する第１工程と、前記第１工程の後の前記細胞を、ＢＭＰ阻害剤及びＴＧＦ－β阻害剤の存在下で接着培養する第２工程と、を含む、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］前記前脳型神経前駆細胞の純度が９０％以上である、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］前記前脳型興奮性神経細胞の純度が９０％以上である、［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］培養容器に収容され、純度が９０％以上であり、α－アミノ－３－ヒドロキシ－５－メチル－４－イソオキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体及びＣａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ＩＩ　α（ＣＡＭＫ２α）が陽性であり、自発発火する、前脳型興奮性神経細胞。
［８］［７］に記載の前脳型興奮性神経細胞及びアストロサイトの共培養物。
［９］被験物質の存在下で、請求項７に記載の前脳型興奮性神経細胞を培養する工程と、前記前脳型興奮性神経細胞の、形態、シナプス小胞、電気生理学的パラメータ又はマーカーの発現を評価し、評価結果を得る工程と、前記評価結果が、被験物質の非存在下における評価結果と比較して有意に変化したことが、前記被験物質が神経疾患の治療薬の候補であることを示す、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。
［１０］被験物質の存在下で、［７］に記載の前脳型興奮性神経細胞及びアストロサイトを共培養する工程と、前記前脳型興奮性神経細胞の、形態、シナプス小胞、電気生理学的パラメータ又はマーカーの発現を評価し、評価結果を得る工程と、前記評価結果が、被験物質の非存在下における評価結果と比較して有意に変化したことが、前記被験物質が神経疾患の治療薬の候補であることを示す、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。
［１１］ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、アスコルビン酸、ジブチリルｃＡＭＰ、細胞周期阻害剤及びγセクレターゼ阻害剤を含有する、前脳型神経前駆細胞から前脳型興奮性神経細胞への分化誘導用培地。
　本発明によれば、成熟した機能的な神経細胞を製造する技術を提供することができる。
（ａ）～（ｆ）は、実験例１において、８％ＫＳＲ含有ＧＭＥＭ培地を用いて分化誘導した細胞におけるＳｏｘ１及びＯｃｔ４の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｆ）は、実験例１において、Ｎ２Ｂ２７培地を用いて分化誘導した細胞におけるＳｏｘ１及びＯｃｔ４の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｄ）は、それぞれ、実験例２において分化誘導した細胞における、ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＳＯＸ１遺伝子、ＦＯＸＧ１遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現を定量ＲＴ－ＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｃ）は、実験例２において分化誘導した細胞におけるＦＯＲＳＥ－１の発現量をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すグラフである。 多能性幹細胞を前脳型興奮性神経細胞に分化誘導するスケジュールを示す模式図である。 実験例３における免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 （ａ）～（ｃ）は実験例４において、再播種（Ｒｅｐｌａｔｉｎｇ）から６日間接着培養後の細胞の顕微鏡写真である。 （ａ）～（ｄ）は、それぞれ、実験例４において分化誘導した細胞における、ＧＲＩＡ１遺伝子、ＧＲＩＡ２遺伝子、ＧＲＩＡ３遺伝子及びＧＲＩＡ４遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現を定量ＲＴ－ＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｃ）は、それぞれ、実験例４において分化誘導した細胞における、ＧＲＩＮ１遺伝子、ＧＲＩＮ２Ａ遺伝子及びＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現を定量ＲＴ－ＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｃ）は、それぞれ、実験例４において分化誘導した細胞における、ＳＹＮ１遺伝子、ＤＬＧ４遺伝子及びＣＡＭＫ２Ａ遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現を定量ＲＴ－ＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｄ）は、それぞれ、実験例４において分化誘導した細胞における、ＣＡＣＮＧ２遺伝子、ＣＡＣＮＧ３遺伝子、ＣＡＣＮＧ４遺伝子及びＣＡＣＮＧ８遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現を定量ＲＴ－ＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、それぞれ、実験例４において分化誘導した細胞における、Ｔａｕ遺伝子及び４Ｒ　Ｔａｕ遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現を定量ＲＴ－ＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｃ）は、実験例６における細胞の免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ａ）はＭＡＰ２を免疫染色した写真であり、（ｂ）はＦｏｘｇ１を免疫染色した写真であり、（ｃ）は（ａ）及び（ｂ）の写真を重ね合わせたものである。 （ａ）～（ｃ）は、実験例６における細胞の免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ａ）はＭＡＰ２を免疫染色した写真であり、（ｂ）はＮｅｕＮを免疫染色した写真であり、（ｃ）は（ａ）及び（ｂ）の写真を重ね合わせたものである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例６における免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ａ）はＭＡＰ２の免疫染色画像及びＴｂｒ１の免疫染色画像を重ね合わせたものであり、（ｂ）はＭＡＰ２の免疫染色画像及びＣｔｉｐ２の免疫染色画像を重ね合わせたものである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例６における免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ａ）はＳｙｎ１の免疫染色画像、ｖＧｌｕＴ１の免疫染色画像及びＭＡＰ２の免疫染色画像を重ね合わせたものであり、（ｂ）はｖＧｌｕＴ２の免疫染色画像、Ｈｏｍｅｒ１の免疫染色画像及びＭＡＰ２の免疫染色画像を重ね合わせたものである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例６における免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ａ）は４Ｒ　Ｔａｕを免疫染色した写真であり、（ｂ）は（ａ）と同じ視野においてＭＡＰ２を免疫染色した写真である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例７において、神経細胞へのカルシウムイオンの流入を測定した結果を示すラスタープロットである。（ａ）は、テトロドトキシンの非存在下で測定した結果であり、（ｂ）は、テトロドトキシンの存在下で測定した結果である。 実験例７において、ＭＥＡ解析により神経細胞の自発発火を検出した結果を示すラスタープロットである。 （ａ）～（ｃ）は、実験例７におけるパッチクランプ解析の結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｃ）は、実験例８において、前脳型神経細胞のグルタミン酸誘発興奮毒性（還元能）を評価した結果を示すグラフである。（ａ）はヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果であり、（ｂ）はヒトｉＰＳ細胞株である１２１０Ｂ２から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果であり、（ｃ）はヒトＥＳ細胞株であるＫｈＥＳ１から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果である。 （ａ）～（ｃ）は、実験例９において、前脳型神経細胞の神経突起長を測定し、グルタミン酸誘発興奮毒性（神経突起長）を評価した結果を示すグラフである。（ａ）はヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果であり、（ｂ）はヒトｉＰＳ細胞株である１２１０Ｂ２から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果であり、（ｃ）はヒトＥＳ細胞株であるＫｈＥＳ１から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果である。 （ａ）～（ｃ）は、実験例１０において、前脳型神経細胞の還元能を評価した結果を示すグラフである。（ａ）はヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果であり、（ｂ）はヒトｉＰＳ細胞株である１２１０Ｂ２から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果であり、（ｃ）はヒトＥＳ細胞株であるＫｈＥＳ１から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果である。 （ａ）～（ｃ）は、実験例１１において、前脳型神経細胞の神経突起長を測定した結果を示すグラフである。（ａ）はヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果であり、（ｂ）はヒトｉＰＳ細胞株である１２１０Ｂ２から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果であり、（ｃ）はヒトＥＳ細胞株であるＫｈＥＳ１から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果である。 （ａ）は、実験例１２におけるＡβ４０ペプチドの産生量の測定結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例１２におけるＡβ４２ペプチドの産生量の測定結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例１３におけるＡβ４０ペプチドの産生量の測定結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例１３におけるＡβ４２ペプチドの産生量の測定結果を示すグラフである。（ｃ）は、（ａ）及び（ｂ）に基づいて、Ａβ４０ペプチド及びＡβ４２ペプチドの産生量の比（Ａβ４２ペプチドの産生量／Ａβ４０ペプチドの産生量）を算出した結果を示すグラフである。
［遺伝子名及びタンパク質名の表記］
　本明細書では、ヒト遺伝子及びヒトタンパク質は、大文字のアルファベットで表すものとする。また、マウス遺伝子は、先頭文字を大文字のアルファベットで、それ以降を小文字のアルファベットで表すものとする。また、マウスタンパク質は大文字のアルファベットで表すものとする。しかしながら、場合により、ヒト遺伝子、マウス遺伝子、その他の種の遺伝子を厳密に区別せずに表す場合がある。また、ヒトタンパク質、マウスタンパク質、その他の種のタンパク質を厳密に区別せずに表す場合がある。
［前脳型興奮性神経細胞の製造方法］
　１実施形態において、本発明は、前脳型興奮性神経細胞の製造方法であって、多能性幹細胞を、ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤及びＷｎｔ阻害剤の存在下で接着培養し、前脳型神経前駆細胞を得る工程と、前記前脳型神経前駆細胞を、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、アスコルビン酸、ジブチリルｃＡＭＰ、細胞周期阻害剤及びγセクレターゼ阻害剤の存在下で接着培養し、前脳型興奮性神経細胞を得る工程と、を含む、製造方法を提供する。
　実施例において後述するように、発明者らは、本実施形態の製造方法により、ヒトｉＰＳ細胞、ヒトＥＳ細胞等の複数種類の多能性幹細胞を分化誘導し、前脳型興奮性神経細胞を製造することができることを明らかにした。
　得られた前脳型興奮性神経細胞は、分化誘導の全工程を接着培養による単層培養で行うことができ、純度が９０％以上であった。ここで、純度が９０％以上であるとは、分化誘導した細胞の９０％以上が前脳型興奮性神経細胞になることを意味する。
　すなわち、本実施形態の製造方法により得られる前脳型興奮性神経細胞の純度は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９９％以上であることが更に好ましく、１００％であることが特に好ましい。
　本明細書において、前脳型興奮性神経細胞の純度が高いとは、培養容器中に存在する細胞のうち、前脳型興奮性神経細胞が占める割合が高いことを意味し、前脳型興奮性神経細胞の分化効率が高いといいかえることもできる。
　また、本実施形態の製造方法において、前脳型神経前駆細胞を得る工程で得られる前脳型神経前駆細胞の純度も９０％以上である。ここで、純度が９０％以上であるとは、神経前駆細胞を分化誘導した場合に、細胞の９０％以上が前脳型神経細胞になることを意味する。
　分化誘導を接着培養による単層培養で行うことにより、必要な培地が比較的少量であり、培養に必要なスペースも少ないため、より低コストに前脳型興奮性神経細胞を製造することができる。なお、細胞の接着培養は、細胞接着用の表面コートがなされた培養容器を用いて細胞を培養することにより行うことができる。
　本実施形態の製造方法は、フィーダー細胞の存在下で実施してもよく、フィーダー細胞を使用しない条件で実施してもよいが、フィーダー細胞を使用しない条件で実施することが好ましい。フィーダー細胞を使用しないことにより、不純物の混入が低減された前脳型興奮性神経細胞を製造することができる。
　本実施形態の製造方法において、多能性幹細胞は、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってもよく、例えばＥＳ細胞であってもよい。また、上記の多能性幹細胞はヒト由来の細胞であってもよく、マウス、ラット、ブタ、ヤギ、ヒツジ、サル等の非ヒト動物由来の細胞であってもよい。
　また、上記の多能性幹細胞は、健常人由来の人工多能性幹細胞であってもよく、神経疾患患者由来の人工多能性幹細胞であってもよい。神経疾患患者由来の人工多能性幹細胞から前脳型興奮性神経細胞を製造した場合、得られた前脳型興奮性神経細胞を神経疾患のモデルとして用いることができる。このような前脳型興奮性神経細胞は、神経疾患のメカニズムの解明や疾患治療薬のスクリーニング等に有用である。
　本実施形態の製造方法において、ＢＭＰ阻害剤としては、ＤＭＨ１、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、ＬＤＮ－１９３１８９等を使用することができる。また、ＴＧＦ－β阻害剤としては、ＳＢ４３１５４２、Ａ８３－０１、ＲｅｐＳｏｘ等を使用することができる。また、Ｗｎｔ阻害剤としては、ＩＷＰ２、ＩＷＰ３、ＩＷＰ４、ＸＡＶ９３９、Ｄｋｋ１等を使用することができる。
　また、細胞周期阻害剤は、Ｇ１期特異的細胞周期阻害剤であることが好ましい。細胞周期阻害剤を培地に添加することにより、前脳型興奮性神経細胞への分化誘導を促進することができる。また、Ｇ１期特異的細胞周期阻害剤は、ＣＤＫ４又はＣＤＫ６の阻害剤であることが好ましい。より具体的なＧ１期特異的細胞周期阻害剤としては、ＰＤ０３３２９９１、ＣＩＮＫ４、ＬＹ２８３５２１９、ＬＥＥ０１１等が挙げられる。
　また、γセクレターゼ阻害剤としては、ＤＡＰＴ（γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＩＸ）、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｅ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＸＩ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＩＩＩ等が挙げられる。
　前脳型神経前駆細胞を接着培養し、前脳型興奮性神経細胞を得る工程においては、培地に更にＲＯＣＫ阻害剤を添加することが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ２７６３２等が挙げられる。
　本実施形態の製造方法において、前脳型神経前駆細胞を得る工程は、多能性幹細胞を、ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤及びＷｎｔ阻害剤の存在下で接着培養する第１工程と、前記第１工程の後の前記細胞を、ＢＭＰ阻害剤及びＴＧＦ－β阻害剤の存在下で接着培養する第２工程とを含むことが好ましい。すなわち、第１工程の培地にＷｎｔ阻害剤を添加し、第２工程の培地にはＷｎｔ阻害剤を添加しないことが好ましい。
　実施例において後述するように、前脳型神経前駆細胞を得る工程が、培地にＷｎｔ阻害剤を添加する第１工程と、培地にＷｎｔ阻害剤を添加しない第２工程とを含むことにより、前脳型マーカーを発現する細胞がより多く得られる傾向にある。ここで、第１工程は約１週間行うことが好ましく、第２工程も約１週間行うことが好ましい。
　本実施形態の製造方法において、前脳型神経前駆細胞を得る工程の後、前脳型神経前駆細胞を、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、アスコルビン酸、ジブチリルｃＡＭＰ、細胞周期阻害剤及びγセクレターゼ阻害剤の存在下で接着培養する工程の前に、細胞を単一細胞に解離させて播種しなおしてもよい。ここで、単一細胞に解離させるとは、培養容器に接着している細胞を１個ずつばらばらに解離させることを意味する。単一細胞への解離は、通常、細胞の解離に用いられる、アキュターゼ、トリプシン、コラゲナーゼ等の酵素処理を行い、ピペッティングすること等により行うことができる。
［前脳型興奮性神経細胞］
　１実施形態において、本発明は、培養容器に収容され、純度が９０％以上であり、ＡＭＰＡ受容体、ＮＭＤＡ受容体及びＣＡＭＫ２αが陽性であり、自発発火する、前脳型興奮性神経細胞を提供する。本実施形態の前脳型興奮性神経細胞は、ｖＧｌｕｔ１陽性又はｖＧｌｕｔ２陽性であり、興奮性シナプス伝達を行う細胞であるということもできる。本実施形態の前脳型興奮性神経細胞は、ｖＧｌｕｔ１陽性かつｖＧｌｕｔ２陽性であってもよい。
　本実施形態の前脳型興奮性神経細胞は、上述した製造方法により製造することができるものである。従来、このような純度の前脳型興奮性神経細胞を製造することは困難であった。これに対し、上述した製造方法により、このような前脳型興奮性神経細胞を製造することができる。
　ここで、ＡＭＰＡ受容体が陽性であること、ＮＭＤＡ受容体が陽性であること、自発発火することは、興奮性の神経細胞であることを示す。
　また、従来の方法では、多能性幹細胞からＣＡＭＫ２αが陽性の神経細胞を製造することは困難であった。これに対し、実施例において後述するように、本実施形態の前脳型興奮性神経細胞はＣＡＭＫ２αが陽性であり、機能的な神経細胞である。また、従来の方法では、多能性幹細胞から４Ｒ　Ｔａｕが陽性の神経細胞を製造することは困難であった。これに対し、実施例において後述するように、本実施形態の前脳型興奮性神経細胞は４Ｒ　Ｔａｕが陽性であり、機能的な神経細胞である。
［前脳型興奮性神経細胞及びアストロサイトの共培養物］
　１実施形態において、本発明は上述した前脳型興奮性神経細胞及びアストロサイトの共培養物を提供する。
　ここで、アストロサイトとしては、多能性幹細胞から分化誘導したアストロサイト等が挙げられる。この場合、アストロサイトの分化誘導に用いる多能性幹細胞は、前脳型興奮性神経細胞の分化誘導に用いる多能性幹細胞と同様であってよい。
　前脳型興奮性神経細胞及びアストロサイトの共培養物は、前脳型興奮性神経細胞及びアストロサイトが共培養された共培養系といいかえることができる。共培養物とは、すなわち、培養容器内で共培養された前脳型興奮性神経細胞及びアストロサイトであり、これに培地、培養容器を含めてもよい。
　本実施形態の共培養物を用いることにより、神経疾患の治療薬のスクリーニング、神経疾患のメカニズムの解明等を行うことができる。
［神経疾患の治療薬のスクリーニング方法］
　１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、上述した前脳型興奮性神経細胞を培養する工程と、前記前脳型興奮性神経細胞の、形態、シナプス小胞、電気生理学的パラメータ又はマーカーの発現を評価し、評価結果を得る工程と、前記評価結果が、被験物質の非存在下における評価結果と比較して有意に変化したことが、前記被験物質が神経疾患の治療薬の候補であることを示す、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供する。
　別の実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、上述した前脳型興奮性神経細胞及びアストロサイトを共培養する工程と、前記前脳型興奮性神経細胞の、形態、シナプス小胞又は電気生理学的パラメータを評価し、評価結果を得る工程と、前記評価結果が、被験物質の非存在下における評価結果と比較して有意に変化したことが、前記被験物質が神経疾患の治療薬の候補であることを示す、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供する。本実施形態のスクリーニング方法は、上述したスクリーニング方法と比較して、前脳型興奮性神経細胞をアストロサイトと共培養する点において主に異なっている。アストロサイトと共培養することにより、前脳型興奮性神経細胞のみを用いたスクリーニングよりも、より生体内に近い環境でスクリーニングを行うことができる。
　本実施形態のスクリーニング方法において、被験物質としては特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。既存薬ライブラリには、例えば核酸医薬品も含まれる。
　前脳型興奮性神経細胞の形態の評価としては、例えば、共培養した前脳型興奮性神経細胞及びアストロサイトをパラホルムアルデヒド固定後、免疫染色により神経細胞のマーカーを染色し、顕微鏡観察により神経突起の長さを測定することが挙げられる。神経細胞のマーカーとしては、例えば、ＭＡＰ２、Ｔａｕ１、β３Ｔｕｂｕｌｉｎ等が挙げられる。
　前脳型興奮性神経細胞のシナプス小胞の評価とは、例えば、パラホルムアルデヒド固定後、免疫染色によりシナプス関連タンパク質を染色し、顕微鏡観察によりその数を計測することが挙げられる。シナプス関連タンパク質として、例えば、Ｓｙｎａｐｓｉｎ１、Ｂａｓｓｏｏｎ、ｖＧｌｕＴ１、ｖＧｌｕＴ２、Ｓｙｎａｐｓｏｐｈｙｓｉｎ等が挙げられる。
　前脳型興奮性神経細胞の電気生理学的パラメータの評価とは、例えば、Ｃａ２＋イメージング、微小電極アレイ（Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ　ａｒｒａｙ、ＭＥＡ）解析、パッチクランプ解析等により、神経細胞の同期発火、自発性活動電位（ｓＡＰ）、自発的な興奮性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣ）等を評価すること等が挙げられる。
　前脳型興奮性神経細胞のマーカーの発現の評価は、遺伝子レベルで行ってもよいし、タンパク質レベルで行ってもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ＦＯＸＧ１、ＳＩＸ３、ＴＢＲ１、ＢＣＬ１１Ｂ、ＳＡＴＢ２、ＰＯＵ３Ｆ２、ＴＬＥ４、ＣＵＸ１、ＣＡＭＫ２Ａ、ＤＬＧ４、ＨＯＭＥＲ１、ＧＲＩＡ１、ＧＲＩＡ２、ＧＲＩＡ３、ＧＲＩＡ４、ＧＲＩＮ１、ＧＲＩＮ２Ａ、ＧＲＩＮ２Ｂ、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２、ＡＰＨ１Ａ、ＡＰＨ１Ｂ、ＰＥＮ２、ＮＣＳＴＮ、ＢＡＣＥ１、ＡＰＰ等が挙げられる。マーカー遺伝子の発現は、例えば、マイクロアレイ解析、リアルタイムＰＣＲ解析等により評価することができる。
　また、マーカータンパク質としては、例えば、アミロイドβ４０ペプチド、アミロイドβ４２ペプチド、Ｆｏｘｇ１、Ｓｉｘ３、Ｔｂｒ１、Ｃｔｉｐ２、Ｓａｔｂ２、Ｂｒｎ２、Ｔｌｅ４、Ｃｕｘ１、Ｃａｍｋ２Ａ、ＰＳＤ９５、Ｈｏｍｅｒ１、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４、ＮＲ１、ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２、ＡＰＨ１Ａ、ＡＰＨ１Ｂ、ＰＥＮ２、Ｎｉｃａｓｔｒｉｎ、ＢＡＣＥ１、ＡＰＰ等が挙げられる。マーカータンパク質の発現は、例えば、免疫染色、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等により評価することができる。
　被験物質の存在下における、前脳型興奮性神経細胞の、形態、シナプス小胞、電気生理学的パラメータ又はマーカーの発現の評価結果が、被験物質の非存在下における評価結果と比較して有意に変化した場合、上記の被験物質は神経疾患の治療薬の候補であると判断することができる。
［前脳型興奮性神経細胞への分化誘導用培地］
　１実施形態において、本発明は、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、アスコルビン酸、ジブチリルｃＡＭＰ、細胞周期阻害剤及びγセクレターゼ阻害剤を含有する、前脳型神経前駆細胞から前脳型興奮性神経細胞への分化誘導用培地を提供する。
　実施例において後述するように、本実施形態の培地により、前脳型神経前駆細胞を前脳型興奮性神経細胞に効率よく分化誘導することができる。本実施形態の培地において、細胞周期阻害剤は、上述したものと同様であり、Ｇ１期特異的細胞周期阻害剤であることが好ましい。また、Ｇ１期特異的細胞周期阻害剤は、ＣＤＫ４又はＣＤＫ６の阻害剤であることが好ましい。より具体的なＧ１期特異的細胞周期阻害剤としては、ＰＤ０３３２９９１、ＣＩＮＫ４、ＬＹ２８３５２１９、ＬＥＥ０１１等が挙げられる。
　また、γセクレターゼ阻害剤としては、ＤＡＰＴ（γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＩＸ）、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｅ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＸＩ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＩＩＩ等が挙げられる。
　本実施形態の分化誘導用培地は、更にＲＯＣＫ阻害剤を含有することが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ２７６３２等が挙げられる。
　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
（ヒトｉＰＳ細胞の外胚葉への分化誘導条件の検討）
　ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７を、ＢＭＰ阻害剤及びＴＧＦ－β阻害剤を添加した培地で１２日間培養し、外胚葉への分化誘導条件を検討した。
　培地として、８％ＫＳＲ（型式「１０８２８－０２８」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）含有ＧＭＥＭ培地（型式「０７８－０５５２５」、和光純薬工業株式会社）、及びＮ２Ｂ２７培地（タカラバイオ株式会社）を検討した。
　また、ＢＭＰ阻害剤として、終濃度２μＭ又は終濃度５μＭのＤＭＨ１（型式「０４１－３３８８１」、和光純薬工業株式会社）を使用した。また、ＴＧＦ－β阻害剤として、終濃度２μＭ又は終濃度１０μＭのＳＢ４３１５４２（型式「Ｓ４３１７」、シグマアルドリッチ社）を使用した。
　また、培養開始から１日間は、ｉＰＳ細胞の死滅を抑制するため、ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ２７６３２（型式「２５３－００５１３」、和光純薬工業株式会社）を終濃度１０μＭで培地に添加した。
　外胚葉への分化は、Ｓｏｘ１の発現を検出することにより検討した。また、未分化マーカーとしてＯｃｔ４の発現を検討した。
　図１（ａ）～（ｆ）は、８％ＫＳＲ含有ＧＭＥＭ培地を用いた場合におけるＳｏｘ１及びＯｃｔ４の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すグラフである。図１（ａ）～（ｃ）はアイソタイプコントロール抗体を用いて各細胞を染色した対照の結果である。また、図１（ｄ）～（ｆ）は抗Ｏｃｔ４抗体及び抗Ｓｏｘ１抗体を用いて各細胞を染色した結果である。図１（ｄ）～（ｆ）中、縦軸はＯｃｔ４の発現量を示し、横軸はＳｏｘ１の発現強度を示す。また、図１（ａ）及び（ｄ）はＢＭＰ阻害剤及びＴＧＦ－β阻害剤を培地に添加しなかった結果である。また、図１（ｂ）及び（ｅ）は終濃度２μＭのＤＭＨ１及び終濃度２μＭのＳＢ４３１５４２を培地に添加した結果である。また、図１（ｃ）及び（ｆ）は終濃度５μＭのＤＭＨ１及び終濃度１０μＭのＳＢ４３１５４２を培地に添加した結果である。
　また、図２（ａ）～（ｆ）は、Ｎ２Ｂ２７培地を用いた場合におけるＳｏｘ１及びＯｃｔ４の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すグラフである。図２（ａ）～（ｃ）はアイソタイプコントロール抗体を用いて各細胞を染色した対照の結果である。また、図２（ｄ）～（ｆ）は抗Ｏｃｔ４抗体及び抗Ｓｏｘ１抗体を用いて各細胞を染色した結果である。図２（ｄ）～（ｆ）中、縦軸はＯｃｔ４の発現量を示し、横軸はＳｏｘ１の発現強度を示す。また、図２（ａ）及び（ｄ）はＢＭＰ阻害剤及びＴＧＦ－β阻害剤を培地に添加しなかった結果である。また、図２（ｂ）及び（ｅ）は終濃度２μＭのＤＭＨ１及び終濃度２μＭのＳＢ４３１５４２を培地に添加した結果である。また、図２（ｃ）及び（ｆ）は終濃度５μＭのＤＭＨ１及び終濃度１０μＭのＳＢ４３１５４２を培地に添加した結果である。
　その結果、８％ＫＳＲ含有ＧＭＥＭ培地を用いて、２μＭのＤＭＨ１及び終濃度２μＭのＳＢ４３１５４２を培地に添加した場合、及び、５μＭのＤＭＨ１及び終濃度１０μＭのＳＢ４３１５４２を培地に添加した場合において、未分化マーカーであるＯｃｔ４の発現が減少し、Ｓｏｘ１の発現が増加したことが明らかとなった。
　一方、培地にＮ２Ｂ２７培地を用いた場合には、未分化マーカーであるＯｃｔ４の発現が十分に減少せず、Ｓｏｘ１の発現の増加も明確でない傾向が認められた。
　以上の結果から、多能性幹細胞を外胚葉に分化させる条件としては、８％ＫＳＲ含有ＧＭＥＭ培地を用いて、２μＭのＤＭＨ１及び終濃度２μＭのＳＢ４３１５４２を培地に添加する条件がよいと考えられた。
［実験例２］
（多能性幹細胞から前脳型神経前駆細胞への分化誘導条件の検討）
　実験例１で検討した分化誘導条件に加えて、培地にＷｎｔ阻害剤を添加することにより、多能性幹細胞を前脳型神経前駆細胞に分化誘導する条件を検討した。
　具体的には、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７を、ＢＭＰ阻害剤及びＴＧＦ－β阻害剤を添加した培地で１２日間培養した。ＢＭＰ阻害剤として、終濃度２μＭのＤＭＨ１（型式「０４１－３３８８１」、和光純薬工業株式会社）を使用した。また、ＴＧＦ－β阻害剤として、終濃度２μＭのＳＢ４３１５４２（型式「Ｓ４３１７」、シグマアルドリッチ社）を使用した。また、Ｗｎｔ阻害剤として、終濃度２μＭのＩＷＰ２（型式「Ｉ０５３６」、シグマアルドリッチ社）を使用した。また、培養開始から１日間は、ｉＰＳ細胞の死滅を抑制するため、ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ２７６３２（型式「２５３－００５１３」、和光純薬工業株式会社）を終濃度１０μＭで培地に添加した。
　Ｗｎｔ阻害剤の添加条件として、培養開始後１～１２日間、培養開始後１～７日間、培養開始後５～１２日間を検討した。
　続いて、各細胞における、未分化マーカー遺伝子、外胚葉マーカー遺伝子及び前脳型神経細胞のマーカー遺伝子の発現を定量ＲＴ－ＰＣＲにより測定し、前脳型神経前駆細胞に分化したか否かを検討した。
　図３（ａ）～（ｄ）は、未分化マーカーであるＰＯＵ５Ｆ１遺伝子及びＮＡＮＯＧ遺伝子、外胚葉マーカーであるＳＯＸ１遺伝子、前脳型神経細胞のマーカーであるＦＯＸＧ１遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現を定量ＲＴ－ＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。なお、ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子はＯｃｔ４タンパク質をコードする遺伝子であり、ＳＯＸ１遺伝子は、Ｓｏｘ１タンパク質をコードする遺伝子である。
　図３（ａ）はＰＯＵ５Ｆ１遺伝子の測定結果を示し、図３（ｂ）はＮＡＮＯＧ遺伝子の測定結果を示し、図３（ｃ）はＳＯＸ１遺伝子の測定結果を示し、図３（ｄ）はＦＯＸＧ１遺伝子の測定結果を示す。
　図３（ａ）～（ｄ）中、各遺伝子の発現量はＡＣＴＢ遺伝子の発現量により標準化した。また、「Ｕｎｄｉｆｆ」は未分化のｉＰＳ細胞を用いた結果を示し、「ｄ１－１２」はＷｎｔ阻害剤を培養開始後１～１２日間培地に添加した結果を示し、「ｄ１－７」はＷｎｔ阻害剤を培養開始後１～７日間培地に添加した結果を示し、「ｄ５－１２」はＷｎｔ阻害剤を培養開始後５～１２日間培地に添加した結果を示す。
　その結果、図３（ａ）、（ｂ）に示すように、いずれの条件においても、未分化マーカーの発現量が減少することが明らかとなった。また、図３（ｃ）に示すように、いずれの条件においても、外胚葉マーカーの発現量が上昇することが明らかとなった。また、図３（ｄ）に示すように、Ｗｎｔ阻害剤を培養開始後１～１２日間培地に添加した場合、又はＷｎｔ阻害剤を培養開始後１～７日間培地に添加した場合に前脳型神経細胞のマーカーの発現量が顕著に増加することが明らかとなった。
　続いて、前脳型神経細胞のマーカーであるＦＯＲＳＥ－１の発現量をフローサイトメトリーにより解析した。
　図４（ａ）～（ｃ）は、解析結果を示すグラフである。図４（ａ）～（ｃ）中、「ｄ１－１２」はＷｎｔ阻害剤を培養開始後１～１２日間培地に添加した結果を示し、「ｄ１－７」はＷｎｔ阻害剤を培養開始後１～７日間培地に添加した結果を示し、「ｄ５－１２」はＷｎｔ阻害剤を培養開始後５～１２日間培地に添加した結果を示す。また、縦軸は細胞数を示し、横軸はＦＯＲＳＥ－１の発現強度を示す。
　その結果、図４（ｂ）に示すように、Ｗｎｔ阻害剤を培養開始後１～７日間培地に添加した場合において、ＦＯＲＳＥ－１陽性細胞が最も多く得られることが明らかとなった。また、免疫染色による解析によってもフローサイトメトリーと同様の結果が得られた。
　以上の結果から、多能性幹細胞から前脳型神経前駆細胞への分化誘導条件としては、Ｗｎｔ阻害剤を培養開始後１～７日間培地に添加する条件がよいと考えられた。
［実験例３］
（多能性幹細胞から前脳型興奮性神経細胞への分化誘導）
　図５に示すスケジュールで多能性幹細胞を分化誘導し前脳型神経細胞を得た。多能性幹細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７を使用した。なお、後述するように、この神経細胞は前脳型興奮性神経細胞であることが明らかとなった。
　図５中、「ｄｉｖ」は培養後の日数を示し、「Ｒｅｐｌａｔｉｎｇ」（再播種）は、細胞を培養容器から剥離させて単一細胞に解離させた後、新しい培養容器に播種したことを示す。また、ＧＭＥＭ、ＫＳＲ、ＤＭＨ１、ＳＢ４３１５４２、Ｙ２７６３２、ＩＷＰ２は上述したものと同様である。
　また、「ＢｒａｉｎＰｈｙｓ　ｍｅｄｉｕｍ」（型式「＃０５７９３」、ステムセルテクノロジーズ社）は培地を示す。また、「ＤＡＰＴ」（型式「Ｄ５９４２－５ＭＧ」、シグマアルドリッチ社）はγ－セクレターゼ阻害剤を示し、「ＡＡ」（型式「Ａ４４０３－１００ＭＧ」、シグマアルドリッチ社）はアスコルビン酸を示し、「ｄｂｃＡＭＰ」（型式「Ｄ０６２７－１Ｇ」、シグマアルドリッチ社）はジブチリルｃＡＭＰを示し、「ＰＤ０３３２９９１」（型式「ＰＺ０１９９」、シグマアルドリッチ社）は、ＣＤＫ４／６阻害剤を示す。また、ＧＤＮＦ（型式「４５０－１０」、ペプロテック社）、ＢＤＮＦ（型式「２４８－ＢＤ－０２５」、Ｒ＆Ｄ社）も使用した。
　図６は、図５に示すスケジュールで多能性幹細胞を分化誘導した多能性幹細胞における、Ｓｏｘ１、Ｏｃｔ３／４、Ｐａｘ６の発現の継時的変化を検討した免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
　再播種（Ｒｅｐｌａｔｉｎｇ）から３週間後の神経細胞を観察した結果、自発発火することが明らかとなった。詳細については後述する。この結果は、得られた神経細胞が興奮性神経細胞であることを示す。
　また、培地として「ＢｒａｉｎＰｈｙｓ　ｍｅｄｉｕｍ」の代わりに「Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ」（型式「２１１０３０４９」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用した点以外は上記と同様にして分化誘導した神経細胞についても自発発火するか否かを検討した。その結果、培地として「ＢｒａｉｎＰｈｙｓ　ｍｅｄｉｕｍ」を使用して分化誘導した神経細胞のほうが、より良好に自発発火することが明らかとなった。
［実験例４］
（コート剤の検討）
　神経細胞の凝集が発生すると、画像処理による測定対象分子の定量等の精度が低下する場合がある。このため、神経細胞を凝集させずに単一の層を形成させることができると好ましい。
　そこで、培養容器の表面コートを検討した。具体的には、図５に示すスケジュールにおいて、再播種（Ｒｅｐｌａｔｉｎｇ）後の培養容器の表面コートを検討した。表面コートとしては、ポリ－Ｌ－リジン（型式「Ｐ４８３２」、シグマアルドリッチ社）及びラミニン（型式「２３０１７０１５」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）の両者によるコート、マトリゲル（コーニング社）コート、及びラミニン（型式「２３０１７０１５」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）コートを検討した。
　図７（ａ）～（ｃ）は再播種（Ｒｅｐｌａｔｉｎｇ）から６日間接着培養後の各細胞の顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍである。図７（ａ）はポリ－Ｌ－リジン及びラミニンによるコートの結果であり、図７（ｂ）はマトリゲルコートの結果であり、図７（ｃ）はラミニンコートの結果である。
　その結果、マトリゲルコート、ラミニンコートでは、神経細胞の凝集が観察された。これに対し、ポリ－Ｌ－リジン及びラミニンによるコートでは、神経細胞の凝集が観察されず、神経細胞の単一の層が形成されることが明らかとなった。
［実験例５］
（多能性幹細胞から分化誘導した前脳型興奮性神経細胞の機能解析１）
　図５に示すスケジュールで多能性幹細胞を分化誘導し、前脳型神経細胞を作製した。多能性幹細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７を使用した。
　続いて、興奮性神経細胞の指標である、ＡＭＰＡ受容体遺伝子及びＮＭＤＡ受容体遺伝子の発現を定量ＲＴ－ＰＣＲにより測定した。また、シナプス関連遺伝子、ＴＡＲＰγファミリー遺伝子、Ｔａｕ遺伝子の発現についても定量ＲＴ－ＰＣＲにより測定した。
《ＡＭＰＡ受容体》
　図８（ａ）～（ｄ）は、ＡＭＰＡ受容体遺伝子である、ＧＲＩＡ１遺伝子、ＧＲＩＡ２遺伝子、ＧＲＩＡ３遺伝子及びＧＲＩＡ４遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現を定量ＲＴ－ＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。図８（ａ）はＧＲＩＡ１遺伝子の測定結果を示し、図８（ｂ）はＧＲＩＡ２遺伝子の測定結果を示し、図８（ｃ）はＧＲＩＡ３遺伝子の測定結果を示し、図８（ｄ）はＧＲＩＡ４遺伝子の測定結果を示す。
　図８（ａ）～（ｄ）中、各遺伝子の発現量はＡＣＴＢ遺伝子の発現量により標準化した。また、「ｉＰＳ」は未分化のｉＰＳ細胞の測定結果を示し、「１－２ｗｋ（ＮＰＣ）」は分化誘導開始から１～２週間の神経前駆細胞の測定結果を示し、「３－４ｗｋ」、「５－６ｗｋ」、「７－８ｗｋ」、「９－１０ｗｋ」、「１５－１６ｗｋ」は、それぞれ、分化誘導開始から３～４週間、５～６週間、７～８週間、９～１０週間、１５～１６週間の神経細胞の測定結果を示し、「Ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｃｏｒｔｅｘ」は市販のヒト大脳皮質ＲＮＡ（型式「６３６５６１」、クロンテック社）を用いた測定結果を示す。
　その結果、図５に示すスケジュールで分化誘導した前脳型神経細胞では、ＡＭＰＡ受容体遺伝子の発現の増加が認められた。この結果は、図５に示すスケジュールで分化誘導することにより、前脳型興奮性神経細胞が得られることを示す。
《ＮＭＤＡ受容体》
　図９（ａ）～（ｃ）は、ＮＭＤＡ受容体遺伝子である、ＧＲＩＮ１遺伝子、ＧＲＩＮ２Ａ遺伝子及びＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現を定量ＲＴ－ＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。図９（ａ）はＧＲＩＮ１遺伝子の測定結果を示し、図９（ｂ）はＧＲＩＮ２Ａ遺伝子の測定結果を示し、図９（ｃ）はＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子の測定結果を示す。
　図９（ａ）～（ｃ）中、各遺伝子の発現量はＡＣＴＢ遺伝子の発現量により標準化した。また、「ｉＰＳ」は未分化のｉＰＳ細胞の測定結果を示し、「１－２ｗｋ（ＮＰＣ）」は分化誘導開始から１～２週間の神経前駆細胞の測定結果を示し、「３－４ｗｋ」、「５－６ｗｋ」、「７－８ｗｋ」、「９－１０ｗｋ」、「１５－１６ｗｋ」は、それぞれ、分化誘導開始から３～４週間、５～６週間、７～８週間、９～１０週間、１５～１６週間の神経細胞の測定結果を示し、「Ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｃｏｒｔｅｘ」は市販のヒト大脳皮質ＲＮＡ（型式「６３６５６１」、クロンテック社）を用いた測定結果を示す。
　その結果、図５に示すスケジュールで分化誘導した前脳型神経細胞では、ＮＭＤＡ受容体遺伝子の発現の増加が認められた。この結果は、図５に示すスケジュールで分化誘導することにより、前脳型興奮性神経細胞が得られることを更に支持するものである。
《シナプス関連遺伝子》
　図１０（ａ）～（ｃ）は、シナプス関連遺伝子である、ＳＹＮ１遺伝子、ＤＬＧ４遺伝子及びＣＡＭＫ２Ａ遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現を定量ＲＴ－ＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。
　図１０（ａ）はＳＹＮ１遺伝子の測定結果を示し、図１０（ｂ）はＤＬＧ４遺伝子の測定結果を示し、図１０（ｃ）はＣＡＭＫ２Ａ遺伝子の測定結果を示す。なお、ＣＡＭＫ２Ａ遺伝子はＣＡＭＫ２αタンパク質をコードする遺伝子である。
　図１０（ａ）～（ｃ）中、各遺伝子の発現量はＡＣＴＢ遺伝子の発現量により標準化した。また、「ｉＰＳ」は未分化のｉＰＳ細胞の測定結果を示し、「１－２ｗｋ（ＮＰＣ）」は分化誘導開始から１～２週間の神経前駆細胞の測定結果を示し、「３－４ｗｋ」、「５－６ｗｋ」、「７－８ｗｋ」、「９－１０ｗｋ」、「１５－１６ｗｋ」は、それぞれ、分化誘導開始から３～４週間、５～６週間、７～８週間、９～１０週間、１５～１６週間の神経細胞の測定結果を示し、「Ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｃｏｒｔｅｘ」は市販のヒト大脳皮質ＲＮＡ（型式「６３６５６１」、クロンテック社）を用いた測定結果を示す。
　その結果、図５に示すスケジュールで分化誘導した前脳型神経細胞では、シナプス関連遺伝子の発現の増加が認められた。また、従来発現させることが困難であったＣＡＭ２ＫＡ遺伝子の発現も認められた。この結果は、図５に示すスケジュールで分化誘導することにより、前脳型興奮性神経細胞が得られることを更に支持するものである。
《ＴＡＲＰγファミリー遺伝子》
　図１１（ａ）～（ｄ）は、ＡＭＰＡ受容体の制御タンパク質である、ＴＡＲＰγファミリー遺伝子の発現を定量ＲＴ－ＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。ＴＡＲＰγファミリー遺伝子として、ＣＡＣＮＧ２遺伝子、ＣＡＣＮＧ３遺伝子、ＣＡＣＮＧ４遺伝子、ＣＡＣＮＧ８遺伝子を検討した。
　図１１（ａ）はＣＡＣＮＧ２遺伝子の測定結果を示し、図１１（ｂ）はＣＡＣＮＧ３遺伝子の測定結果を示し、図１１（ｃ）はＣＡＣＮＧ４遺伝子の測定結果を示し、図１１（ｄ）はＣＡＣＮＧ８遺伝子の測定結果を示す。
　図１１（ａ）～（ｄ）中、各遺伝子の発現量はＡＣＴＢ遺伝子の発現量により標準化した。また、「ｉＰＳ」は未分化のｉＰＳ細胞の測定結果を示し、「１－２ｗｋ（ＮＰＣ）」は分化誘導開始から１～２週間の神経前駆細胞の測定結果を示し、「３－４ｗｋ」、「５－６ｗｋ」、「７－８ｗｋ」、「９－１０ｗｋ」、「１５－１６ｗｋ」は、それぞれ、分化誘導開始から３～４週間、５～６週間、７～８週間、９～１０週間、１５～１６週間の神経細胞の測定結果を示し、「Ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｃｏｒｔｅｘ」は市販のヒト大脳皮質ＲＮＡ（型式「６３６５６１」、クロンテック社）を用いた測定結果を示す。
　その結果、図５に示すスケジュールで分化誘導した前脳型神経細胞では、ＴＡＲＰγファミリー遺伝子の発現の増加が認められた。この結果は、図５に示すスケジュールで分化誘導することにより、前脳型興奮性神経細胞が得られることを更に支持するものである。
《Ｔａｕ遺伝子》
　図１２（ａ）は、Ｔａｕ遺伝子の発現を定量ＲＴ－ＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。図１２（ｂ）は、４Ｒ　Ｔａｕ遺伝子の発現を定量ＲＴ－ＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。４Ｒ　Ｔａｕは、Ｔａｕタンパク質のアイソフォームの一種である。
　図１２（ａ）中、「ＭＡＰＴ」はＴａｕ遺伝子を示す。また、図１２（ｂ）中、「ＭＡＰＴ＿４Ｒ」は４Ｒ　Ｔａｕ遺伝子を示す。また、図１２（ａ）及び（ｂ）中、各遺伝子の発現量はＡＣＴＢ遺伝子の発現量により標準化した。また、「ｉＰＳ」は未分化のｉＰＳ細胞の測定結果を示し、「１－２ｗｋ（ＮＰＣ）」は分化誘導開始から１～２週間の神経前駆細胞の測定結果を示し、「３－４ｗｋ」、「５－６ｗｋ」、「７－８ｗｋ」、「９－１０ｗｋ」、「１５－１６ｗｋ」は、それぞれ、分化誘導開始から３～４週間、５～６週間、７～８週間、９～１０週間、１５～１６週間の神経細胞の測定結果を示し、「Ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｃｏｒｔｅｘ」は市販のヒト大脳皮質ＲＮＡ（型式「６３６５６１」、クロンテック社）を用いた測定結果を示す。
　その結果、図５に示すスケジュールで分化誘導した前脳型神経細胞では、４Ｒ　Ｔａｕ遺伝子の発現の増加が認められた。この結果は、図５に示すスケジュールで分化誘導することにより、４Ｒ　Ｔａｕ陽性の神経細胞が得られることを示す。従来、多能性幹細胞から分化誘導することにより４Ｒ　Ｔａｕ陽性の神経細胞を作製することは困難であった。
［実験例６］
（多能性幹細胞から分化誘導した前脳型興奮性神経細胞の機能解析２）
　図５に示すスケジュールで多能性幹細胞を分化誘導し、前脳型神経細胞を作製した。多能性幹細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７を使用した。
《前脳型神経細胞のマーカーの免疫染色》
　ｉＰＳ細胞から分化誘導し３週間後の細胞をパラホルムアルデヒド固定し、免疫染色により、神経細胞のマーカーであるＭＡＰ２及び前脳型神経細胞のマーカーであるＦｏｘｇ１の発現を検討した。
　図１３（ａ）～（ｃ）は、免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍである。図１３（ａ）はＭＡＰ２を免疫染色した写真であり、図１３（ｂ）はＦｏｘｇ１を免疫染色した写真であり、図１３（ｃ）は図１３（ａ）及び（ｂ）の写真を重ね合わせたものである。
　その結果、ほぼ全ての細胞が、ＭＡＰ２及びＦｏｘｇ１を発現していることが明らかとなった。この結果は、図５に示すスケジュールで分化誘導することにより、ほぼ全ての細胞がＦｏｘｇ１陽性神経細胞、すなわち前脳型神経細胞に分化したことを示す。
《成熟型神経細胞のマーカーの免疫染色》
　続いてｉＰＳ細胞から分化誘導し５週間後の細胞をパラホルムアルデヒド固定し、免疫染色により、神経細胞のマーカーであるＭＡＰ２及び成熟型神経細胞のマーカーであるＮｅｕＮの発現を検討した。
　図１４（ａ）～（ｃ）は、免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍである。図１４（ａ）はＭＡＰ２を免疫染色した写真であり、図１４（ｂ）はＮｅｕＮを免疫染色した写真であり、図１４（ｃ）は図１４（ａ）及び（ｂ）の写真を重ね合わせたものである。
　その結果、ほぼ全ての細胞が、ＭＡＰ２及びＮｅｕＮを発現していることが明らかとなった。この結果は、図５に示すスケジュールで分化誘導することにより、ほぼ全ての細胞が成熟型神経細胞に分化したことを示す。
《大脳皮質マーカーの免疫染色》
　続いてｉＰＳ細胞から分化誘導し３週間後の細胞をパラホルムアルデヒド固定し、免疫染色により、神経細胞のマーカーであるＭＡＰ２及び大脳皮質マーカーであるＴｂｒ１及びＣｔｉｐ２Ｎの発現を検討した。
　図１５（ａ）及び（ｂ）は、免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍである。図１５（ａ）はＭＡＰ２の免疫染色画像及びＴｂｒ１の免疫染色画像を重ね合わせたものであり、図１５（ｂ）はＭＡＰ２の免疫染色画像及びＣｔｉｐ２の免疫染色画像を重ね合わせたものである。
　その結果、図５に示すスケジュールで分化誘導して得られた神経細胞は、大脳皮質マーカーを発現することが明らかとなった。
《興奮性シナプスマーカーの免疫染色》
　続いてｉＰＳ細胞から分化誘導し１０週間後の細胞をパラホルムアルデヒド固定し、免疫染色により、興奮性シナプスマーカーであるｖＧｌｕＴ１及びＨｏｍｅｒ１の発現を検討した。また、神経細胞のマーカーであるＭＡＰ２、シナプス小胞のマーカーであるＳｙｎ１、興奮性シナプスのマーカーであるｖＧｌｕＴ２の発現も検討した。
　図１６（ａ）及び（ｂ）は、免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍである。図１６（ａ）はＳｙｎ１の免疫染色画像、ｖＧｌｕＴ１の免疫染色画像及びＭＡＰ２の免疫染色画像を重ね合わせたものであり、図１６（ｂ）はｖＧｌｕＴ２の免疫染色画像、Ｈｏｍｅｒ１の免疫染色画像及びＭＡＰ２の免疫染色画像を重ね合わせたものである。
　その結果、図５に示すスケジュールで分化誘導して得られた神経細胞は、興奮性シナプスを形成することが明らかとなった。
《４Ｒ　Ｔａｕの免疫染色》
　続いてｉＰＳ細胞から分化誘導し７週間後の細胞をパラホルムアルデヒド固定し、免疫染色により、Ｔａｕタンパク質のアイソフォームの一種である４Ｒ　Ｔａｕの発現を検討した。また、神経細胞のマーカーであるＭＡＰ２の発現も検討した。
　図１７（ａ）及び（ｂ）は、免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１７（ａ）は４Ｒ　Ｔａｕを免疫染色した写真であり、図１７（ｂ）は図１７（ａ）と同じ視野においてＭＡＰ２を免疫染色した写真である。図１７（ａ）中、矢印は４Ｒ　Ｔａｕ陽性細胞を示す。
　その結果、図５に示すスケジュールで分化誘導して得られた神経細胞の中には、４Ｒ　Ｔａｕ陽性細胞が存在することが明らかとなった。なお、従来、多能性幹細胞から分化誘導することにより４Ｒ　Ｔａｕ陽性の神経細胞を作製することは困難であった。
［実験例７］
（多能性幹細胞から分化誘導した前脳型興奮性神経細胞の機能解析３）
　図５に示すスケジュールで多能性幹細胞を分化誘導し、前脳型神経細胞を作製した。多能性幹細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７を使用した。続いて、作製した前脳型神経細胞の自発発火を検討した。
《カルシウムイオンプローブを用いた検討》
　まず、カルシウムイオンプローブを用いた検討を行った。ｉＰＳ細胞から分化誘導し５週間後の前脳型神経細胞の培地にカルシウムイオンプローブであるＦｌｕｏ－８　ＡＭ（５μＭ、ＡＡＴ　Ｂｉｏｑｕｅｓｔ社）、Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ（１ｍＭ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）及びＰｌｕｏｎｉｃ　Ｆ－１２７（０．０２％、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を添加し３７℃で３０分インキュベートした。
　その後、Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ含有培地に置換し、蛍光顕微鏡を用いて１．３３Ｈｚでタイムラプス画像を取得した。得られたデータはＩｍａｇｅ　Ｊ（ＮＩＨ）及びＦｌｕｏｒｏＳＮＮＡＰソフトウェアを用いて解析した。また、電位依存性ナトリウムチャネル阻害薬であるテトロドトキシンを培地に添加した場合においても、同様にしてタイムラプス画像を取得した。
　図１８（ａ）及び（ｂ）は、各神経細胞へのカルシウムイオンの流入を測定した結果を示すラスタープロットである。図１８（ａ）は、テトロドトキシンの非存在下で測定した結果であり、図１８（ｂ）は、テトロドトキシンの存在下で測定した結果である。図１８（ａ）及び（ｂ）中、縦軸は識別した個々の神経細胞（ニューロンＩＤ）を示し、横軸は時間（秒）を示し、プロットはカルシウムイオンの流入が検出されたことを示す。
　その結果、図５に示すスケジュールで分化誘導した前脳型神経細胞は同期発火を示すことが明らかとなった。また、前脳型神経細胞の自発発火はテトロドトキシンの培地への添加により消失することが明らかとなった。
　この結果は、図５に示すスケジュールで分化誘導した前脳型神経細胞が興奮性の神経伝達を行うことを示す。
《ＭＥＡ解析》
　続いて、ｉＰＳ細胞から分化誘導し４０日後の前脳型神経細胞を用いて微小電極アレイ（Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ　ａｒｒａｙ、ＭＥＡ）解析を行い、作製した前脳型神経細胞の自発発火を検討した。自発発火はＭａｅｓｔｒｏ　ｓｙｓｔｅｍ（Ａｘｉｏｎ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて計測した。ポリ－Ｌ－リジン及びラミニンでコートした１２ウェルＭＥＡプレートに細胞を播種し、３日毎に培地交換を行なった。データは１２．５ｋＨｚで取得し、２００～３０００ＨｚのＢｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈバンドパスフィルターを用いてフィルタリングした。検出の閾値はベースラインに対して＋６．０×標準偏差とした。
　図１９は、各神経細胞の自発発火を検出した結果を示すラスタープロットである。図１９中、縦軸は識別した個々の神経細胞（ニューロンＩＤ）を示し、横軸は時間（秒）を示し、プロットは自発発火が検出されたことを示す。
　その結果、図５に示すスケジュールで分化誘導した前脳型神経細胞は同期発火を示すことが明らかとなった。この結果は、図５に示すスケジュールで分化誘導した前脳型神経細胞が興奮性の神経伝達を行うことを更に支持するものである。
《パッチクランプ》
　続いて、ｉＰＳ細胞から分化誘導し７週間後の前脳型神経細胞を用いてパッチクランプ解析を行い、作製した前脳型神経細胞の自発発火を検討した。
　図２０（ａ）～（ｃ）は、パッチクランプ解析の結果を示すグラフである。図２０（ａ）及び（ｂ）は神経細胞の自発性活動電位（ｓＡＰ）を測定した結果である。図２０（ｂ）は電位依存性ナトリウムチャネル阻害薬であるテトロドトキシンを培地に添加した以外は図２０（ａ）と同様にして測定した結果である。図２０（ｃ）は神経細胞の自発的な興奮性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣ）を測定した結果である。図２０（ａ）及び（ｂ）中、縦軸は電圧を示し、横軸は時間を示す。また、図２０（ｃ）中、縦軸は電流を示し、横軸は時間を示す。
　その結果、図５に示すスケジュールで分化誘導した前脳型神経細胞は自発発火を示すことが明らかとなった。また、前脳型神経細胞の自発発火はテトロドトキシンの培地への添加により消失することが明らかとなった。更に、前脳型神経細胞が興奮性のシナプス伝達を行うことが明らかとなった。この結果は、図５に示すスケジュールで分化誘導した前脳型神経細胞が自発的な興奮性の神経伝達を行うことを更に支持するものである。
［実験例８］
（多能性幹細胞から分化誘導した前脳型興奮性神経細胞の機能解析４）
　図５に示すスケジュールで多能性幹細胞を分化誘導し、前脳型神経細胞を作製した。多能性幹細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７及び１２１０Ｂ２、並びにヒトＥＳ細胞株であるＫｈＥＳ１を使用した。続いて、作製した各前脳型神経細胞の培地にＬ－グルタミン酸を添加し、グルタミン酸誘発興奮毒性を検討した。
　多能性幹細胞から分化誘導し５週間後の各前脳型神経細胞の培地に終濃度０～１００μＭとなるように段階希釈したグルタミン酸を添加し、２４時間インキュベートした。また、比較のために、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬であるＭＫ８０１を終濃度１μＭでそれぞれ培地に添加した群も用意した。
　続いて、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（同仁化学研究所）を用いたＷＳＴ－８アッセイにより細胞の還元能を測定し、グルタミン酸誘発興奮毒性を評価した。また、細胞の還元能は、グルタミン酸を添加しなかった場合の測定値を１００％とし、細胞に０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を添加した場合の測定値を０％として算出した。
　図２１（ａ）～（ｃ）は、グルタミン酸誘発興奮毒性（還元能）を評価した結果を示すグラフである。図２１（ａ）はヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果であり、図２１（ｂ）はヒトｉＰＳ細胞株である１２１０Ｂ２から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果であり、図２１（ｃ）はヒトＥＳ細胞株であるＫｈＥＳ１から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果である。
　その結果、いずれの多能性幹細胞から分化誘導した場合においても、作製した前脳型神経細胞は、グルタミン酸誘発興奮毒性を示すことが明らかとなった。また、グルタミン酸誘発興奮毒性はＮＭＤＡ受容体拮抗薬の培地への添加により抑制されることが明らかとなった。この結果は、図５に示すスケジュールで分化誘導した前脳型神経細胞が機能的な神経細胞であることを更に支持するものであり、本誘導系により分化誘導した前脳型興奮性神経細胞を用いて興奮毒性を評価可能であることを示すものである。したがって、本誘導系により分化誘導した前脳型興奮性神経細胞は、毒性試験や、毒性を抑制する化合物の評価等に有用である。
［実験例９］
（多能性幹細胞から分化誘導した前脳型興奮性神経細胞の機能解析５）
　図５に示すスケジュールで複数の多能性幹細胞を分化誘導し、前脳型神経細胞を作製した。多能性幹細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７及び１２１０Ｂ２、並びにヒトＥＳ細胞株であるＫｈＥＳ１を使用した。続いて、作製した各前脳型神経細胞の培地にＬ－グルタミン酸を添加し、グルタミン酸誘発興奮毒性を検討した。
　多能性幹細胞から分化誘導し５週間後の各前脳型神経細胞の培地に終濃度０～１００μＭとなるように段階希釈したグルタミン酸を添加し、２４時間インキュベートした。また、比較のために、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬であるＭＫ８０１を終濃度１μＭでそれぞれ培地に添加した群も用意した。
　続いて、ＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ６０００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いてＭＡＰ２陽性細胞１細胞あたりの神経突起長（μｍ）を計測し、グルタミン酸誘発興奮毒性を評価した。
　図２２（ａ）～（ｃ）は、前脳型神経細胞の神経突起長を測定し、グルタミン酸誘発興奮毒性（神経突起長）を評価した結果を示すグラフである。図２２（ａ）はヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果であり、図２２（ｂ）はヒトｉＰＳ細胞株である１２１０Ｂ２から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果であり、図２２（ｃ）はヒトＥＳ細胞株であるＫｈＥＳ１から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果である。
　その結果、いずれの多能性幹細胞から分化誘導した場合においても、作製した前脳型神経細胞は、グルタミン酸誘発興奮毒性を示すことが明らかとなった。また、グルタミン酸誘発興奮毒性はＮＭＤＡ受容体拮抗薬の培地への添加により抑制されることが明らかとなった。この結果は、図５に示すスケジュールで分化誘導した前脳型神経細胞が機能的な神経細胞であることを更に支持するものであり、本誘導系により分化誘導した前脳型興奮性神経細胞を用いて興奮毒性を評価可能であり、治療薬スクリーニングにも使用可能であることを示すものである。
［実験例１０］
（多能性幹細胞から分化誘導した前脳型興奮性神経細胞の機能解析６）
　図５に示すスケジュールで複数の多能性幹細胞を分化誘導し、前脳型神経細胞を作製した。多能性幹細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７及び１２１０Ｂ２、並びにヒトＥＳ細胞株であるＫｈＥＳ１を使用した。
　続いて、作製した各前脳型神経細胞の培地にアミロイドβ４２ペプチド（以下、「Ａβ４２ペプチド」という場合がある。）を添加し、神経毒性を評価した。
　具体的には、各前脳型神経細胞の培地に、終濃度０～１０μＭとなるように段階希釈したヒトＡβ４２ペプチド（ペプチド研究所）を添加して４８時間インキュベートした。続いて、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（同仁化学研究所）を用いたＷＳＴ－８アッセイにより細胞の還元能を測定し、神経毒性を評価した。
　図２３（ａ）～（ｃ）は、各前脳型神経細胞の還元能を測定した結果を示すグラフである。図２３（ａ）はヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果であり、図２３（ｂ）はヒトｉＰＳ細胞株である１２１０Ｂ２から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果であり、図２３（ｃ）はヒトＥＳ細胞株であるＫｈＥＳ１から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果である。
　その結果、いずれの多能性幹細胞から分化誘導した場合においても、作製した前脳型神経細胞は、Ａβ４２ペプチドにより還元能の低下を示すことが明らかとなった。この結果は、図５に示すスケジュールで分化誘導した前脳型神経細胞が機能的な神経細胞であることを更に支持するものであり、本誘導系により分化誘導した前脳型興奮性神経細胞を用いて神経毒性を評価可能であることを示すものである。
［実験例１１］
（多能性幹細胞から分化誘導した前脳型興奮性神経細胞の機能解析７）
　図５に示すスケジュールで複数の多能性幹細胞を分化誘導し、前脳型神経細胞を作製した。多能性幹細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７及び１２１０Ｂ２、並びにヒトＥＳ細胞株であるＫｈＥＳ１を使用した。
　続いて、作製した各前脳型神経細胞の培地にアミロイドβ４２ペプチド（以下、「Ａβ４２ペプチド」という場合がある。）を添加し、神経突起長を測定することにより、神経毒性を評価した。
　具体的には、各前脳型神経細胞の培地に、終濃度０～１０μＭとなるように段階希釈したヒトＡβ４２ペプチド（ペプチド研究所）を添加して４８時間インキュベートした。続いて、ＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ６０００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いてＭＡＰ２陽性細胞の神経突起長を計測し、神経毒性を評価した。
　図２４（ａ）～（ｃ）は、各前脳型神経細胞の神経突起長を測定した結果を示すグラフである。図２４（ａ）はヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果であり、図２４（ｂ）はヒトｉＰＳ細胞株である１２１０Ｂ２から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果であり、図２４（ｃ）はヒトＥＳ細胞株であるＫｈＥＳ１から分化誘導した前脳型神経細胞を用いた結果である。
　その結果、いずれの多能性幹細胞から分化誘導した場合においても、作製した前脳型神経細胞は、Ａβ４２ペプチドによる神経毒性を示すことが明らかとなった。この結果は、図５に示すスケジュールで分化誘導した前脳型神経細胞が機能的な神経細胞であることを更に支持するものであり、本誘導系により分化誘導した前脳型興奮性神経細胞を用いて神経毒性を評価可能であることを示すものである。
［実験例１２］
（多能性幹細胞から分化誘導した前脳型興奮性神経細胞の機能解析８）
　図５に示すスケジュールで複数の多能性幹細胞を分化誘導し、前脳型神経細胞を作製した。多能性幹細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７を使用した。
　５週間分化誘導した後、得られた前脳型神経細胞の培地を、γセクレターゼ阻害剤を添加した培地に全量交換し、２日間インキュベートした。γセクレターゼ阻害剤としてはＤＡＰＴを終濃度１０μＭで使用した。また、対照として、γセクレターゼ阻害剤を添加しない群も用意した。
　続いて、各前脳型神経細胞の培養上清を回収し、含まれるアミロイドβ４０ペプチド（以下、「Ａβ４０ペプチド」という場合がある。）及びアミロイドβ４２ペプチド（以下、「Ａβ４２ペプチド」という場合がある。）の濃度を測定した。続いて各前脳型神経細胞を破砕し、全タンパク質を抽出し、タンパク質濃度を測定した。続いて、Ａβ４０ペプチド及びＡβ４２ペプチドの濃度をタンパク質濃度により補正した。Ａβ４０ペプチドの濃度の測定には、市販のキット（製品名「ヒトβアミロイド（１－４０）ＥＬＩＳＡキットワコーＩＩ」、Ｃａｔ　Ｎｏ．２９８－６４６０１、富士フィルム和光純薬株式会社製）を使用した。また、Ａβ４２ペプチドの濃度の測定には、市販のキット（製品名「ヒトβアミロイド（１－４２）ＥＬＩＳＡキットワコー、高感度品」、Ｃａｔ　Ｎｏ．２９６－６４４０１、富士フィルム和光純薬株式会社製）を使用した。
　図２５（ａ）はＡβ４０ペプチドの産生量の測定結果を示すグラフである。また、図２５（ｂ）はＡβ４２ペプチドの産生量の測定結果を示すグラフである。図２５（ａ）及び（ｂ）中、「Ｃｔｌ」はγセクレターゼ阻害剤を添加しなかった対照の結果であることを示し、「＋ＤＡＰＴ」はＤＡＰＴを添加した結果であることを示す。また、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差が存在することを示し、「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差が存在することを示す。
　その結果、作製した前脳型神経細胞にγセクレターゼ阻害剤を添加することにより、Ａβ４０ペプチド及びＡβ４２ペプチドの産生量が有意に低下することが明らかとなった。この結果は、図５に示すスケジュールで分化誘導した前脳型神経細胞が機能的な神経細胞であることを更に支持するものであり、本誘導系により分化誘導した前脳型興奮性神経細胞を用いてＡβ４０ペプチド及びＡβ４２ペプチドの産生量を評価可能であることを示すものである。したがって、本実験系をＡβ４０ペプチド又はＡβ４２ペプチドの産生を抑制する化合物のスクリーニング等に利用することができる。
［実験例１３］
（多能性幹細胞から分化誘導した前脳型興奮性神経細胞の機能解析９）
　図５に示すスケジュールで複数の多能性幹細胞を分化誘導し、前脳型神経細胞を作製した。多能性幹細胞としては、健常人由来のヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７、及び、変異型プレセニリン１を発現する家族性アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞株であるＰＳ１（Ａ２４６Ｅ）を使用した。
　５週間分化誘導した後、得られた各前脳型神経細胞の培地を、γセクレターゼ阻害剤を添加した培地に全量交換し、２日間インキュベートした。γセクレターゼ阻害剤としてはＤＡＰＴを終濃度１０μＭで使用した。また、対照として、γセクレターゼ阻害剤を添加しない群も用意した。
　続いて、各前脳型神経細胞の培養上清を回収し、含まれるＡβ４０ペプチド及びＡβ４２ペプチドの濃度を測定した。続いて各前脳型神経細胞を破砕し、全タンパク質を抽出し、タンパク質濃度を測定した。続いて、Ａβ４０ペプチド及びＡβ４２ペプチドの濃度をタンパク質濃度により補正した。Ａβ４０ペプチドの濃度の測定には、市販のキット（製品名「ヒトβアミロイド（１－４０）ＥＬＩＳＡキットワコーＩＩ」、Ｃａｔ　Ｎｏ．２９８－６４６０１、富士フィルム和光純薬株式会社製）を使用した。また、Ａβ４２ペプチドの濃度の測定には、市販のキット（製品名「ヒトβアミロイド（１－４２）ＥＬＩＳＡキットワコー、高感度品」、Ｃａｔ　Ｎｏ．２９６－６４４０１、富士フィルム和光純薬株式会社製）を使用した。
　図２６（ａ）はＡβ４０ペプチドの産生量の測定結果を示すグラフである。また、図２６（ｂ）はＡβ４２ペプチドの産生量の測定結果を示すグラフである。また、図２６（ｃ）は、図２６（ａ）及び図２６（ｂ）に基づいて、Ａβ４０ペプチド及びＡβ４２ペプチドの産生量の比（Ａβ４２ペプチドの産生量／Ａβ４０ペプチドの産生量）を算出した結果を示すグラフである。
　図２５（ａ）～（ｃ）中、「＋ＤＡＰＴ」はＤＡＰＴを添加した結果であることを示す。また、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差が存在することを示し、「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差が存在することを示す。
　その結果、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞から作製した前脳型神経細胞は、健常人由来のｉＰＳ細胞から作製した前脳型神経細胞と比較して、Ａβ４０ペプチドの産生量及びＡβ４２ペプチドの産生量が有意に高いことが明らかとなった。また、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞から作製した前脳型神経細胞は、健常人由来のｉＰＳ細胞から作製した前脳型神経細胞と比較して、Ａβ４０ペプチド及びＡβ４２ペプチドの産生量の比（Ａβ４２ペプチドの産生量／Ａβ４０ペプチドの産生量）が有意に高いことが明らかとなった。
　この結果は、図５に示すスケジュールで分化誘導した前脳型神経細胞が、アルツハイマー病の病態を再現できることを示す。また、各前脳型神経細胞にγセクレターゼ阻害剤を添加することにより、Ａβ４０ペプチド及びＡβ４２ペプチドの産生量が有意に低下することが明らかとなった。この結果は、図５に示すスケジュールで分化誘導した前脳型神経細胞が機能的な神経細胞であることを更に支持するものである。
　本発明によれば、成熟した機能的な神経細胞を製造する技術を提供することができる。

Claims (11)

  1. 　前脳型興奮性神経細胞の製造方法であって、
    　多能性幹細胞を、Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）阻害剤、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－β（ＴＧＦ－β）阻害剤及びＷｎｔ阻害剤の存在下で接着培養し、前脳型神経前駆細胞を得る工程と、
    　前記前脳型神経前駆細胞を、Ｇｌｉａｌ－Ｃｅｌｌ　Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ）、Ｂｒａｉｎ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ）、アスコルビン酸、ジブチリルｃＡＭＰ、細胞周期阻害剤及びγセクレターゼ阻害剤の存在下で接着培養し、前脳型興奮性神経細胞を得る工程と、
    　を含む、製造方法。
  2. 　前記細胞周期阻害剤が、Ｇ１期特異的細胞周期阻害剤である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記Ｇ１期特異的細胞周期阻害剤がＣｙｃｌｉｎ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｋｉｎａｓｅ（ＣＤＫ）４又はＣＤＫ６の阻害剤である、請求項２に記載の製造方法。
  4. 　前記前脳型神経前駆細胞を得る工程は、
    　多能性幹細胞を、ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤及びＷｎｔ阻害剤の存在下で接着培養する第１工程と、
    　前記第１工程の後の前記細胞を、ＢＭＰ阻害剤及びＴＧＦ－β阻害剤の存在下で接着培養する第２工程と、
    　を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
  5. 　前記前脳型神経前駆細胞の純度が９０％以上である、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. 　前記前脳型興奮性神経細胞の純度が９０％以上である、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 　培養容器に収容され、純度が９０％以上であり、α－アミノ－３－ヒドロキシ－５－メチル－４－イソオキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体及びＣａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ＩＩ　α（ＣＡＭＫ２α）が陽性であり、自発発火する、前脳型興奮性神経細胞。
  8. 　請求項７に記載の前脳型興奮性神経細胞及びアストロサイトの共培養物。
  9. 　被験物質の存在下で、請求項７に記載の前脳型興奮性神経細胞を培養する工程と、
    　前記前脳型興奮性神経細胞の、形態、シナプス小胞、電気生理学的パラメータ又はマーカーの発現を評価し、評価結果を得る工程と、
    　前記評価結果が、被験物質の非存在下における評価結果と比較して有意に変化したことが、前記被験物質が神経疾患の治療薬の候補であることを示す、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。
  10. 　被験物質の存在下で、請求項７に記載の前脳型興奮性神経細胞及びアストロサイトを共培養する工程と、
    　前記前脳型興奮性神経細胞の、形態、シナプス小胞、電気生理学的パラメータ又はマーカーの発現を評価し、評価結果を得る工程と、
    　前記評価結果が、被験物質の非存在下における評価結果と比較して有意に変化したことが、前記被験物質が神経疾患の治療薬の候補であることを示す、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。
  11. 　ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、アスコルビン酸、ジブチリルｃＡＭＰ、細胞周期阻害剤及びγセクレターゼ阻害剤を含有する、前脳型神経前駆細胞から前脳型興奮性神経細胞への分化誘導用培地。
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