WO2020138510A1 - 大脳皮質細胞からのｌ１ｃａｍ陽性細胞の取得および細胞製剤としてのその使用 - Google Patents

Abstract

この出願は、ヒトなどの哺乳動物由来の大脳皮質細胞から細胞表面マーカーL1CAMを指標にしてL1CAM陽性細胞を分離し回収することを含むL1CAM陽性細胞を取得する方法、この方法によって得られるL1CAM陽性細胞、この細胞を含む大脳皮質障害および/または大脳皮質脊髄路障害を治療するための細胞製剤、ならびに、大脳皮質障害および/または大脳皮質脊髄路障害をもつ被験体の大脳皮質および/または大脳皮質脊髄路に細胞製剤を投与することを含む大脳皮質障害および/または大脳皮質脊髄路障害の治療方法を提供する。

Description

大脳皮質細胞からのＬ１ＣＡＭ陽性細胞の取得および細胞製剤としてのその使用

　本発明は、大脳皮質細胞からのＬ１ＣＡＭ陽性（Ｌ１ＣＡＭ^＋）細胞の取得方法に関する。
　本発明はまた、上記Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞を含む、大脳皮質障害および／または大脳皮質脊髄路障害を治療するための細胞製剤に関する。
　本発明はさらに、上記Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞を被験体に投与することを含む、大脳皮質障害および／または大脳皮質脊髄路障害を治療する方法に関する。

　細胞移植による皮質脊髄路（ｃｏｒｔｉｃｏｓｐｉｎａｌ　ｔｒａｃｔ、ＣＳＴ）の再構築は、脳障害や脳卒中の治療法の一つである。報告された研究によると、胎仔大脳皮質が移植された脳障害または中大脳動脈閉塞症モデルラットで行動の改善が観察された（非特許文献１~４）。さらに、逆行性ラベル法（ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ　ｌａｂｅｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ）によって、胎仔大脳皮質が成体脳内の損傷を受けた運動回路を再構築することができることが示された（非特許文献５）。最近、皮質ニューロンが、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）およびヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）から皮質細胞形成を模倣することによって樹立されている（非特許文献６および７）。これらのニューロンが前頭皮質に移植されたときには、ニューロンは複数の皮質標的に相当する軸索を生じさせて宿主の脳に組み込まれる。このため、ＣＳＴの再構築は、脳障害や脳卒中の基本的治療戦略として期待されている。しかしながら、哺乳動物の大脳皮質は、組織学的に遠位の６つの層に組織化された莫大な数のニューロンとグリア細胞から構成されているために、細胞療法を開発するうえで２つの課題がある。第１の課題は、有効性である。胎仔皮質が大脳運動野に投与されたとき、生着細胞のほとんどが脳の皮質下に分布する（非特許文献８）。一方、錐体交叉などの皮質下標的に達するための神経線維はほとんどまたは全く存在しない。第２の課題は、安全性である。移植されたｈｉＰＳＣによる腫瘍形成や神経細胞過剰増殖のリスクがある。これらの課題を克服するためには、大脳下投射ニューロン（ＳＣＰＮ）やその前駆細胞の細胞選択のための技術を開発する必要がある。
　特許文献１には、細胞表面マーカー（例えば、ＣＲＣＸ４、ＣＲＣＸ７、ＥＲＢＢ４、ＰＬＸＮＡ４など）を発現するヒト皮質組織から調製した神経前駆細胞が、細胞選別による濃縮（富化）および培養の後にｉｎ　ｖｉｔｒｏでＧＡＢＡを発現および分泌すること、ヒトＥＳＣからＭＧＥ型介在ニューロンを誘導し、細胞選別技術を用い、対象とする神経前駆体に関してさらに富化すること、ならびに、ｈＥＳ細胞由来の神経前駆細胞をマウス脳に移植すると生着し、高いレベルのＧＡＢＡを分泌することを確認したことが記載されている。
　また、非特許文献９では、大脳下投射ニューロンが、中間帯（ＩＺ）マーカーであるニューロピリン（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ）−１（ＮＲＰ１）に対する抗体を用いる細胞選別によって、マウス胎仔皮質から濃縮可能であることが報告されている。ＮＲＰ１は、アフリカツメガエルのおたまじゃくしの視蓋（ｏｐｔｉｃ　ｔｅｃｔｕｍ）に見いだされ、軸索発芽の初期ステージに必須であるセマホリン（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ）ＩＩＩ受容体である（非特許文献１０）。非特許文献９はさらに、大脳皮質運動ニューロン（ＣＳＭＮ）前駆体がＮＲＰ１陽性細胞集団中に含まれており、その結果、障害を受けた運動回路はＮＲＰ１陽性細胞の注入（投与）によって再構築されうることを報告している。
　さらにまた、非特許文献１１には、ヒト多能性幹細胞から分化誘導された大脳皮質ニューロンが、移植後、成体マウス損傷皮質内に領野特異的に、軸索投射、シナプス形成などの機能をもって組み込まれることが記載されている。

特表２０１８−５２９３８９号公報

Ｐｌｕｍｅｔ　Ｊ　ｅｔ　ａｌ．，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ　ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　６：９−２７，１９９３ Ｒｉｏｌｏｂｏｓ　ＡＳ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｌｅａｒｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｍｅｍｏｒｙ　７５：２７４−２９２，２００１ Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｘｐ　Ｎｅｕｒｏｌ　１３３：９６−１０２，１９９５ Ｍａｔｔｓｓｏｎ　Ｂ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ　２８：１２２５−１２３１，１９９７ Ｇａｉｌｌａｒｄ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　１０：１２９４−１２９９，２００７ Ｇａｓｐａｒｄ　Ｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　４５５：３５１−３５７，２００８ Ｅｓｐｕｎｙ−Ｃａｍａｃｈｏ　Ｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ　７７：４４０−４５６，２０１３ Ｂａｌｌｏｕｔ　Ｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ　ｉｎ　ｎｅｕｒａｌ　ｃｉｒｃｕｉｔｓ　１０：５５，２０１６ Ｓａｎｏ　Ｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ　ｉｎ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　１１：１２３，２０１７ Ｆｕｊｉｓａｗａ　Ｈ，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　５９：２４−３３，２００４ Ｅｓｐｕｎｙ−Ｃａｍａｃｈｏ　Ｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．２３（９）：２７３２−２７４３，２０１８

　移植により生着し神経突起をホストで伸ばす大脳皮質細胞を認識する細胞抗原を利用して得られた、障害のある大脳皮質に対する補充療法が可能となる、かつ大脳皮質細胞由来の実用性の高い神経細胞集団はこれまで知られていない。
　例えば非特許文献１１には、天然の皮質組織から分離された、あるいは、ヒトを含む哺乳動物細胞由来ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞から分化誘導された、移植によりホストの脳内で生着し軸索／神経線維をホスト脳内の限局された領域内だけでなく遠方へも伸展する神経細胞集団は記載されていない。また非特許文献９では、マウス胎仔大脳皮質から単離された大脳下投射ニューロンからＮＲＰ１陽性（ＮＲＰ１^＋）細胞を選別したことが記載されているが、ヒトｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞から分化誘導されたＮＲＰ１陽性細胞およびその効能については証明されていない。
　このような状況において、本発明者らは、今回、移植に適した大脳皮質細胞の遺伝子マーカーを鋭意探索したところ、複数の候補を見出し、そのなかで特にＬ１ＣＡＭ（Ｌ１　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を同定した。従来の大脳皮質細胞の分化誘導法により得られた細胞集団から当該マーカーを用いて、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞を単離し、哺乳動物ホストの脳内に移植したところ、生着して軸索伸長を起こし、例えば軸索を錐体交叉に投射することを可能にする細胞を単離することができた。従って、本発明は、移植に適した大脳皮質細胞を選別できる新規マーカーを提供する。
　すなわち、本発明者らは、今回、上記課題を解決するために、第１に、ＣＴＩＰ２が、グラフト（「移植片」ともいう。）から脊髄に投射する神経細胞マーカーの１つであることを見出した。第２に、本発明者らは、ＣＴＩＰ２：ＧＦＰノックイン（ＫＩ）マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）を作製し、ＣＴＩＰ２陽性（ＣＴＩＰ２^＋）深層ニューロン（ＤＬＮ；ｄｅｅｐ　ｌａｙｅｒ　ｎｅｕｒｏｎ）細胞またはその前駆細胞用の代替細胞表面マーカーとしてＬ１ＣＡＭを同定した。第３に、本発明者らは、大脳皮質細胞およびヒト大脳オルガノイドから単離された（細胞集団である）Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞が哺乳動物脳内への移植によって生着すること、ならびに、それらの軸索を脳内の限局された領域内だけでなく遠方へも伸展し異なる領域間での情報伝達を可能にすることを見出した。第４に、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、ＮＲＰ１陽性細胞を含む細胞集団である。
　本発明は、以下の特徴を包含する。
（１）哺乳動物由来の大脳皮質細胞から、細胞表面マーカーＬ１ＣＡＭを指標にしてＬ１ＣＡＭ陽性細胞を分離し回収することを含む、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞を取得する方法。
（２）前記大脳皮質細胞が、哺乳動物由来の多能性幹細胞から分化誘導された大脳皮質細胞である、上記（１）に記載の方法。
（３）前記大脳皮質細胞が、哺乳動物由来の大脳組織あるいは大脳オルガノイドの中間帯および／または皮質板から分離された大脳皮質細胞である、上記（１）に記載の方法。
（４）前記Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞が、Ｌ１ＣＡＭ陽性神経前駆細胞および／またはＬ１ＣＡＭ陽性成熟神経細胞を主成分として含み、かつ幹細胞を含まないか、または全細胞数の１０％以下の神経幹細胞を含む、上記（１）~（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞が、分化誘導期間が異なる初期、中期または後期Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞である、上記（２）または（４）に記載の方法。
（６）前記Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞が、被験体の大脳皮質および／または大脳皮質脊髄路に投与されたとき、軸索伸長を起こす、上記（１）~（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞が、軸索を錐体交叉に投射する、上記（６）に記載の方法。
（８）前記Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞が、被験体の大脳皮質および／または大脳皮質脊髄路に投与されたとき、大脳皮質運動ニューロンを生成する、上記（１）~（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記分離を、セルソーティングによって行う、上記（１）~（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）上記（１）~（９）のいずれかに記載の方法によって得られるもの、Ｌ１ＣＡＭ陽性神経前駆細胞および／またはＬ１ＣＡＭ陽性成熟神経細胞を主成分として含み、かつ幹細胞を含まないか、または全細胞数の１０％以下の神経幹細胞を含むもの、ならびに、被験体の大脳皮質および／または大脳皮質脊髄路に投与されたとき、軸索伸長を起こし、および大脳皮質運動ニューロンを生成するものである、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞。
（１１）ＮＲＰ１陽性細胞を含む細胞集団である、上記（１０）に記載のＬ１ＣＡＭ陽性細胞。
（１２）ＣＴＩＰ２陽性深層ニューロン（ＣＴＩＰ２^＋ＤＬＮ）および／またはＣＴＩＰ２^＋ＤＬＮ前駆細胞である、上記（１０）または（１１）に記載のＬ１ＣＡＭ陽性細胞。
（１３）前記軸索を少なくとも錐体交叉に投射する、上記（１０）~（１２）のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭ陽性細胞。
（１４）上記（１０）~（１３）のいずれかに記載のＬ１ＣＡＭ陽性細胞を有効成分として含む、被験体における大脳皮質障害および／または大脳皮質脊髄路障害を治療するための細胞製剤。
（１５）神経幹細胞を含む、上記（１４）に記載の細胞製剤。
（１６）大脳皮質障害および／または大脳皮質脊髄路障害が、脳梗塞、脳卒中、神経変性疾患（例えばアルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などを含む）、脳腫瘍、多発性硬化症、てんかん、頭部外傷、及び虚血からなる群から選択される、上記（１４）または（１５）に記載の細胞製剤。
（１７）大脳皮質障害および／または大脳皮質脊髄路障害をもつ被験体の大脳皮質に、上記（１４）~（１６）のいずれかに記載の細胞製剤を投与することを含む、被験体において大脳皮質障害および／または大脳皮質脊髄路障害を治療する方法。
　本発明により、哺乳動物脳内への細胞移植により軸索／神経線維の伸長を起こす（例えば軸索／神経線維を錐体交叉に投射／伸展する）ことが可能な大脳皮質細胞を単離することができる。具体的には、本発明のマーカーＬ１ＣＡＭを用いて単離した細胞は、ｉｎ　ｖｉｖｏでの移植により大脳皮質および／または大脳皮質脊髄路に生着し、例えば軸索／神経線維を錐体交叉へ投射／伸展するなどの効能のため、大脳皮質および／または大脳皮質脊髄路の障害を修復もしくは再生することが可能であり、本発明により、例えば神経変性疾患、多発性硬化症、脳腫瘍、脳梗塞、てんかん、頭部外傷などによって障害された大脳皮質および／または大脳皮質脊髄路に対する補充療法が可能となることから、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞を含む治療剤（細胞製剤）を提供することが可能となる。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１８−２４７９６０号の開示内容を包含する。

この図は、皮質第Ｖ層内の位置を推定する生着したＣＴＩＰ２^＋細胞が長距離の皮質脊髄投射を伸ばすことを示す。パネルＡは、２か月間にわたり成体マウスの皮質損傷部の腔（ｌｅｓｉｏｎ　ｃａｖｉｔｙ）内へＥ１４．５　ＧＦＰ　ＫＩマウス由来胎仔大脳皮質を移植したときの模式図である。パネルＢは、ＧＦＰ^＋線維の神経分布によって示されるように、移植された細胞が生存し、かつ宿主脳内に広がっていることを示す。パネル中のスケールバーはそれぞれ、１，０００μｍおよび１００μｍ（拡大図）を表す。パネルＣは、ＧＦＰ^＋線維が脳梁（Ｃｃ）、内包（Ｉｃ）、橋（Ｐｏ）、延髄（Ｍｏ）および錐体交叉（Ｐｙｘ）内に見出されたことを示す。スケールバーは５０μｍを表す。 この図は、皮質第Ｖ層内の位置を推定する生着したＣＴＩＰ２^＋細胞が長距離の皮質脊髄投射を伸ばすことを示す。パネルＤは、犠牲前７日目で移植した細胞が錐体交叉に投射し、同部位にファストブルー（Ｆａｓｔ　Ｂｌｕｅ；ＦＢ）を投与することでグラフト内に逆行性に標識されるＦＢが存在することを示す。皮質第Ｖ層内にＧＦＰ^＋／ＦＢ^＋ＣＳＭＮ（ここで、「ＣＳＭＮ」は、大脳皮質運動ニューロン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｐｉｎａｌ　ｍｏｔｏｒ　ｎｅｕｒｏｎ）である。）が見出された。スケールバーは２００μｍを表す。パネルＥは、抗ＧＦＰ抗体（緑）および抗ＣＴＩＰ２抗体（赤）で染色されたグラフトの免疫蛍光像であり、またＦＢ（青）は、ＧＦＰ^＋／ＦＢ^＋ＣＳＭＮが発現されたＣＴＩＰ２を示す。スケールバーは、５０μｍを表す。 この図は、ＣＴＩＰ２：ＧＦＰ　ＫＩ　ｍＥＳＣ内でのレポーター発現の特徴を示す。パネルＡは、ｍＥＳＣからの皮質分化の模式図である。パネルＢは、胚様体様凝集塊の迅速再凝集を伴う無血清浮遊培養（ＳＦＥＢｑ）によって培養された０日目~１２目目のｍＥＳＣ凝集塊の明視野およびＣＴＩＰ２：ＧＦＰ発現像を示す。１２日目以降、ＧＦＰシグナルが検出された。スケールバーは５００μｍを表す。パネルＣは、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）（ｎ＝４）によるＦｏｘｇ１、Ｒｅｌｎ、Ｃｔｉｐ２およびＣｕｘ１の遺伝子発現解析を示す。値はすべて平均±標準誤差として示す。 この図は、ＣＴＩＰ２：ＧＦＰ　ＫＩマウスＥＳ細胞（ｍＥＳＣ）内でのレポーター発現の特徴を示す。パネルＤは、ＧＦＰ（緑）、ＣＴＩＰ２（赤）、ＦＯＸＧ１（赤）、ＧＳＨ２（赤）およびＤＡＰＩ（青）で染色した１２日目のＣＴＩＰ２：ＧＦＰ　ＫＩ　ｍＥＳＣ凝集塊の免疫蛍光像を示す。スケールバーは１００μｍを表す。パネルＥは、抗ＧＦＰ抗体（緑）および抗Ｍ２／Ｍ６抗体（赤）で染色されたグラフトの免疫蛍光像であり、またＦＢ（青）は、宿主ＣＳＭＮ（ＧＦＰ⁻／Ｍ２Ｍ６⁻／ＦＢ^＋、白矢頭）およびグラフト由来ＣＳＭＮ（ＧＦＰ^＋／Ｍ２Ｍ６^＋／ＦＢ^＋、黒矢頭）を示す。スケールバーは１００μｍを表す。 この図は、Ｌ１ＣＡＭが皮質発生の間にＣＰおよびＩＺ内で発現されることを示す。Ｅ１４．５マウス前頭皮質の免疫蛍光像は、ＭＺマーカー（Ｒｅｌｎ；Ａ）、ＣＰマーカー（ＦＯＸＧ１；ＢおよびＣＴＩＰ２；Ｃ）、ＩＺマーカー（ＮＲＰ１；Ｄ）、ＳＶＺマーカー（ＴＢＲ２；Ｅ）ならびにＶＺマーカー（ＰＡＸ６；Ｆ）に関するものである。Ｌ１ＣＡＭは、ＣＰおよびＩＺ内で強く発現されており、ならびにＭＺおよびＳＶＺ内で部分的に発現されている。スケールバーは１００μｍを表す。 この図は、Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞の細胞選別によるＣＴＩＰ２^＋細胞（ＤＬＮまたはその前駆細胞）の濃縮を示す。前頭皮質をＥ１４．５マウスから取り出し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ研究に用いた。パネルＡは、選別の数時間後の非選別細胞、Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞およびＬ１ＣＡＭ⁻細胞由来の上記細胞の、ＣＴＩＰ２（緑），Ｌ１ＣＡＭ（赤）およびＤＡＰＩ（青）に関する免疫蛍光像を示す。スケールバーは３０μｍを表す。パネルＢは、ＤＡＰＩで染色された全細胞中のＣＴＩＰ２^＋細胞のパーセンテージを示す（非選別：ｎ＝６；Ｌ１ＣＡＭ^＋：ｎ＝６；Ｌ１ＣＡＭ⁻：ｎ＝６）。パネルＣは、選別の２日後の非選別細胞、Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞およびＬ１ＣＡＭ⁻細胞由来の上記細胞の、ＣＴＩＰ２（緑）およびＤＡＰＩ（青）に関する免疫蛍光像を示す。スケールバーは１００μｍを表す。パネルＤは、ＤＡＰＩで染色された全細胞中のＣＴＩＰ２^＋細胞のパーセンテージを示す（非選別：ｎ＝９；Ｌ１ＣＡＭ^＋：ｎ＝９；Ｌ１ＣＡＭ⁻：ｎ＝８）。値はすべて平均±標準誤差として示す。アスタリスクは、ｏｎｅ−ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ（一元配置分散分析）およびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの複数比較テストにより決定される統計学的有意を示し、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。 この図は、Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞の細胞選別によるＣＴＩＰ２^＋細胞（ＤＬＮまたはその前駆細胞）の濃縮を示す。前頭皮質をＥ１４．５マウスから取り出し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ研究に用いた。パネルＥは、選別の２日後の非選別細胞、Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞およびＬ１ＣＡＭ⁻細胞由来の上記細胞の、ＰＡＸ６（緑）、ＥｄＵ（赤）およびＤＡＰＩ（青）に関する免疫蛍光像を示す。固定の２時間前に、１０μＭ　ＥｄＵを培養培地に添加した。スケールバーは１００μｍを表す。パネルＦは、ＤＡＰＩで染色された全細胞中の、ＰＡＸ６^＋／ＥｄＵ^＋細胞のパーセンテージを示す（非選別：ｎ＝９；Ｌ１ＣＡＭ^＋：ｎ＝９；Ｌ１ＣＡＭ⁻：ｎ＝８）。値はすべて平均±標準誤差として示す。アスタリスクは、ｏｎｅ−ｗａｙ　ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの複数比較テストにより決定される統計学的有意を示し、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。 この図は、Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞が生着し成体脳に組み込まれることを示す。Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞およびＬ１ＣＡＭ⁻細胞を、Ｅ１４．５マウスの前頭皮質から単離し、そして２日後、これらの細胞を２か月間にわたり成体脳の大脳皮質に投与した。パネルＡは、上記グラフトのＧＦＰ（緑）に関する免疫蛍光像を示す。スケールバーは１ｍｍ（１０００μｍ）を表す。パネルＢは、Ｌ１ＣＡＭ⁻細胞に対するＬ１ＣＡＭ^＋細胞中のグラフト体積の定量を示す（Ｌ１ＣＡＭ^＋：ｎ＝６およびＬ１ＣＡＭ⁻：ｎ＝６）。パネルＣは、グラフト線維のＧＦＰ（緑）に関する免疫蛍光像を示す。ＧＦＰ^＋線維は、大脳皮質（Ｃｔｘ）、線条体（Ｓｔｒ）、内包（Ｉｃ）および大脳脚（Ｃｐ）中に見出された。スケールバーはそれぞれ１ｍｍおよび５０μｍを表す。パネルＤは、同側皮質および同側線条体中の上記グラフト線維の定量を示す（Ｌ１ＣＡＭ^＋：ｎ＝６およびＬ１ＣＡＭ⁻：ｎ＝６）。全線維長をＩｎ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　６０００によって計算した。値はすべて平均±標準誤差として示す。アスタリスクはＳｔｕｄｅｎｔ　ｔ−ｔｅｓｔによって決定される統計学的有意を示し、＊Ｐ＜０．０５および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。 この図は、移植後、ｉｎ　ｖｉｖｏでＬ１ＣＡＭ^＋細胞がＣＳＭＮを生成することを示す。パネルＡは、上記グラフトのＧＦＰ（緑）およびＣＴＩＰ２（赤）に関する免疫蛍光像を示す。スケールバーは５０μｍを表す。 この図は、移植後、ｉｎ　ｖｉｖｏでＬ１ＣＡＭ^＋細胞がＣＳＭＮを生成することを示す。パネルＢは、上記グラフトのＧＦＰ（緑）およびＦＢ（青）に関する免疫蛍光像を示す。犠牲の７日前、ＦＢを錐体交叉内に投与した。矢頭は、宿主由来のＣＳＭＮを示す。スケールバーは５０μｍを表す。 この図は、移植後、ｉｎ　ｖｉｖｏでＬ１ＣＡＭ^＋細胞がＣＳＭＮを生成することを示す。パネルＣは、上記グラフトのＧＦＰ（緑）およびＣＵＸ１（赤）に関する免疫蛍光像を示す。スケールバーは５０μｍを表す。 この図は、移植後、ｉｎ　ｖｉｖｏでＬ１ＣＡＭ^＋細胞がＣＳＭＮを生成することを示す。パネルＤは、Ｌ１ＣＡＭ⁻細胞グラフトに対するＬ１ＣＡＭ^＋細胞グラフト中のＣＴＩＰ２^＋細胞の全細胞数を示す（Ｌ１ＣＡＭ^＋：ｎ＝６およびＬ１ＣＡＭ⁻：ｎ＝６）。パネルＥは、Ｌ１ＣＡＭ⁻細胞グラフトに対するＬ１ＣＡＭ^＋細胞−グラフト中のＣＴＩＰ２^＋細胞密度を示す（Ｌ１ＣＡＭ^＋：ｎ＝６およびＬ１ＣＡＭ⁻：ｎ＝６）。パネルＦは、Ｌ１ＣＡＭ⁻細胞グラフトに対するＬ１ＣＡＭ^＋細胞グラフト中のＦＢ^＋細胞の全細胞数を示す（Ｌ１ＣＡＭ^＋：ｎ＝６およびＬ１ＣＡＭ⁻：ｎ＝６）。パネルＧは、Ｌ１ＣＡＭ⁻細胞グラフトに対するＬ１ＣＡＭ^＋細胞グラフト中のＣＵＸ１^＋細胞の全細胞数を示す（Ｌ１ＣＡＭ^＋：ｎ＝６およびＬ１ＣＡＭ⁻：ｎ＝６）。パネルＨは、Ｌ１ＣＡＭ⁻細胞−グラフトに対するＬ１ＣＡＭ^＋細胞−グラフト中のＣＵＸ１^＋細胞密度を示す（Ｌ１ＣＡＭ^＋：ｎ＝６およびＬ１ＣＡＭ⁻：ｎ＝６）。値はすべて平均±標準誤差として示す。アスタリスクはＳｔｕｄｅｎｔ　ｔ−ｔｅｓｔによって決定される統計学的有意を示し、＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１である。 この図は、ヒト初期Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞がＣＳＭＮを生成し、宿主脳に組み込まれることを示す。皮質ニューロンをＳＦＥＢｑ法によってヒトｉＰＳ細胞（ｈｉＰＳＣ）から生成した。パネルＡ−Ｄは、ｈｉＰＳＣ−凝集塊のＰＡＸ６（緑）、ＫＩ６７（緑）、Ｌ１ＣＡＭ（赤）、ＣＴＩＰ２（白）およびＤＡＰＩ（青）に関する免疫蛍光像を示す。スケールバーは５０μｍを表す。 この図は、ヒト初期Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞がＣＳＭＮを生成し、宿主脳に組み込まれることを示す。皮質ニューロンをＳＦＥＢｑ法によってｈｉＰＳ細胞から生成した。パネルＥは、選別の２日後の、１８日目のＬ１ＣＡＭ^＋細胞およびＬ１ＣＡＭ⁻細胞のＣＴＩＰ２（緑）、ＰＡＸ６（緑）、Ｌ１ＣＡＭ（赤）およびＤＡＰＩ（青）に関する免疫蛍光像を示す。スケールバーは５０μｍを表す。 この図は、ヒト初期Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞がＣＳＭＮを生成し、宿主脳に組み込まれることを示す。皮質ニューロンをＳＦＥＢｑ法によってｈｉＰＳＣから生成し、１７日目、３０日目および３７日目にＬ１ＣＡＭ^＋細胞を単離した。３~４日後に、これらの細胞を出生後のＳＣＩＤマウスの前頭皮質内に投与し、２か月にグラフトの免疫染色を行った。図７Ｆは、上記グラフトのＳＴＥＭ１２１（緑）に関する免疫蛍光像を示す。パネルＧは、グラフト体積の定量を示す（２０日目：ｎ＝４；３４日目：ｎ＝５；４１日目：ｎ＝６）。各群間に有意差はない。パネルＨは、宿主脳の錐体交叉内の２０日目のＬ１ＣＡＭ^＋細胞由来の線維（緑）の代表像を示す。スケールバーは５０μｍを表す。値はすべて平均±標準誤差として示されている。 この図は、ヒト初期Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞がＣＳＭＮを生成し、宿主脳に組み込まれることを示す。皮質ニューロンをＳＦＥＢｑ法によってｈｉＰＳＣから生成した。パネルＩは、上記移植における、線条体（Ｓｔｒ）、内包（Ｉｃ）、大脳脚（Ｃｐ）、錐体交叉（Ｐｙｘ）および視床（Ｔｈａ）中の神経線維の平均数を示す（２０日目：ｎ＝４；３４日目：ｎ＝５；４１日目：ｎ＝６）。値はすべて平均±標準誤差として示されている。アスタリスクは、ｏｎｅ−ｗａｙ　ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの複数比較テストにより決定される統計学的有意を示し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。 この図は、ＷＮＴ阻害薬を用いた大脳皮質誘導を示す。ＣＴＩＰ２：ＧＦＰノックインマウスＥＳ細胞を用いてＷＮＴ阻害薬（Ｃ５９またはＤＫＫ１）の効果を検証した。ＷＮＴ阻害薬を加えることによって、大脳皮質の吻側領域（ＣＯＵＰ−ＴＦ１陰性）が誘導され、かつＧＦＰ陽性の皮質第Ｖ層を効率的に誘導することができる。スケールバーは１００μｍ、２０μｍを表す。値はすべて平均±標準誤差として示されている。アスタリスクは、ｏｎｅ−ｗａｙ　ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの複数比較テストにより決定される統計学的有意を示し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。 この図は、ＣＴＩＰ２：ＧＦＰ陽性細胞の遺伝子プロファイルの解析結果を示す。ＣＴＩＰ２陽性細胞に発現する細胞表面抗原を同定するために、ＣＴＩＰ２：ＧＦＰノックインマウスＥＳ細胞を１２日間分化誘導し、その遺伝子プロファイルを比較解析した。パネルＡは、ＦＡＣＳを用いた細胞選別後の陽性分画および陰性分画の特徴を示す。陽性分画にはＧＦＰ陽性細胞が濃縮されており、かつ、内因性のＣＴＩＰ２陽性細胞の濃縮も確認された。スケールバーは５０μｍを表す。パネルＢは、マイクロアレイ解析を用いた分化誘導１２日目時点におけるＧＦＰ陽性分画とＧＦＰ陰性分画の遺伝子プロファイルを示す。パネルＣは、細胞表面抗原のスクリーニング手順を示す。まず、マイクロアレイを用いて、ＧＦＰ陽性分画で陰性分画よりも遺伝子発現量が２倍以上の遺伝子として３２４遺伝子を抽出する。次に、ＧＯ解析によって細胞膜（ｐｌａｓｍａ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）に関連がある遺伝子を２５遺伝子選択する。最後に、細胞選別に利用できる細胞表面抗原を文献ベースで検索して３遺伝子（Ｌ１ｃａｍ，Ｅｒｂｂ４，Ｒｏｂｏ２）を抽出する。なお、細胞選別に利用できる表面抗原は細胞体等全体的に発現している遺伝子である。一方で、神経軸索やシナプス間隙で限定的に発現する遺伝子の場合、表面抗原であっても選別操作に利用することは難しい。 この図は、Ｅ１４マウスの大脳皮質においてＣｔｉｐ２は皮質板（ｃｏｒｔｉｃａｌ　ｐｌａｔｅ；ＣＰ）だけでなく中間帯（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　ｚｏｎｅ；ＩＺ）にも発現することを示す。抗ＣＴＩＰ２抗体を用いた免疫組織染色ではＣＴＩＰ２陽性細胞がＣＰのみならずＩＺでも発現を認めた。この結果が正しいか否かを検証するために、Ｃｔｉｐ２　ｍＲＮＡ　ｐｒｏｂｅを用いたｉｎ−ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎを行った（遺伝子発現の解析）。その結果、Ｃｔｉｐ２遺伝子はＣＰで多量に発現する一方で、ＩＺにも多少発現することが分かった。これらの発現局在はＬ１ＣＡＭと一致しており、いずれも脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ｚｏｎｅ；ＶＺ）での発現は認めなかった。スケールバーは１００μｍ、１０μｍを表す。 この図は、Ｅ１４マウスの大脳皮質を用いたＬ１ＣＡＭの細胞選別によってどのような細胞が選別されるのかを検討した結果を示す。Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞、Ｌ１ＣＡＭ⁻細胞、非選別細胞（Ｕｎｓｏｒｔｅｄ）について、大脳皮質における各層マーカーの遺伝子発現を調べたところ、Ｌ１ＣＡＭ陽性分画では、パネルＡに示されるようにＲｅｌｎ、Ｃｔｉｐ２（ＣＰ）、Ｎｒｐ１（ＩＺ）の発現が増加し、一方で、パネルＢに示されるようにＣｔｇｆ（サブプレート（ｓｕｂｐｌａｔｅ））、Ｔｂｒ２（脳室下帯（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ｚｏｎｅ））、Ｐａｘ６（脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ｚｏｎｅ））の発現は減少していた。これらの結果はＬ１ＣＡＭの組織染色結果と相関しており、Ｌ１ＣＡＭを指標にした細胞選別によってＣＰおよびＩＺが濃縮できることが示された。値はすべて平均±標準誤差として示されている。アスタリスクは、ｏｎｅ−ｗａｙ　ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの複数比較テストにより決定される統計学的有意を示し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。 この図は、ヒトｉＰＳ細胞由来大脳皮質細胞の分化誘導を示す。パネルＡは、ヒトｉＰＳ細胞を使いＭｏｔｏｎｏ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　Ｔｒａｎｓｌ　Ｍｅｄ　５：５５２−５６０（２０１６）に倣って分化誘導を行うとき、６日目の時点で未分化マーカー（Ｏｃｔ４，Ｎａｎｏｇ）の発現が減少し、その一方で神経幹細胞マーカー（Ｐａｘ６）の発現は増加し、ならびに、大脳皮質発生におけるＩＺマーカー（Ｎｒｐ１）およびＣＰマーカー（Ｃｔｉｐ２）の発現は徐々に増加してくることを示す。値はすべて平均±標準誤差として示されている。 この図は、ヒトｉＰＳ細胞由来大脳皮質細胞の分化誘導を示す。パネルＢからパネルＤは、それぞれのタイミングで分化誘導細胞の免疫染色を行ったところ、１２日目では神経幹細胞（Ｎｅｓｔｉｎ／Ｐａｘ６）が多く認められ、２４日目になると細胞塊の中で大脳皮質マーカー（Ｆｏｘｇ１）の発現が確認できるようになることを示す。さらに分化が進むとＣｔｉｐ２陽性細胞の発現が認められるが、この時点では大脳皮質第Ｖ層（Ｃｔｉｐ２）と第ＶＩ層（Ｔｂｒ１）のマーカー発現が重複していることから、両者が区別される前段階の状態と考えられる。パネルＥは、ヒトｉＰＳ細胞の大脳皮質細胞への分化誘導におけるＬ１ＣＡＭ発現は分化誘導１８日目から増加することを示す。値はすべて平均±標準誤差として示されている。スケールバーは５０μｍを表す。 この図は、グラフト周囲に伸びた神経軸索の細胞特性解析結果を示す。Ｌ１ＣＡＭ陰性細胞の移植により移植片周囲（特に同側皮質（Ａ）、同側線条体（Ｂ）、同側外側中隔核（Ｃ））に軸索伸長を示したことから、これら投射部位に逆行性トレーサー（コレラ毒素Ｂサブユニット；ＣＴＢ）を投与することにより、ＣＴＩＰ２およびＣＵＸ１マーカーの発現を用いて大脳皮質のどのような細胞が寄与するのかを調べた。スケールバーは１ｍｍ、５０μｍ、５０μｍを表す。 この図は、多能性幹細胞からＬ１ＣＡＭ陽性細胞を含む大脳皮質細胞（集団）への分化誘導方法の概略を示す。 この図は、ヒトＥＳ細胞（Ｋｈ−ＥＳ１）からＬ１ＣＡＭ^＋細胞を含むヒト大脳オルガノイドを分化誘導したときの、分化誘導４５日目の時点のオルガノイド内の複数のロゼッタ構造を示す。赤は神経幹細胞（ＰＡＸ６）、緑は成熟神経細胞（ＣＴＩＰ２）である。ＤＡＰＩは核染色を示す。 この図は、図１５と同じ条件で作製された別サンプルの拡大図であり、ロゼッタが、内側に神経幹細胞（ＰＡＸ６、赤）、外側に成熟神経細胞（ＣＴＩＰ２、緑）によって構成されていることを示す。 この図は、上記ロゼッタ構造の周辺部にＬ１ＣＡＭ^＋細胞（緑）が発現されていることを示す。

　本発明をさらに詳細に説明する。
１．大脳皮質細胞の作製
　大脳皮質は、運動、知覚（視覚、触覚、聴覚、嗅覚、味覚など）、判断、思考、言語、人格、感情などを担当する高次脳機能の中枢である。大脳皮質は、新皮質（高次機能中枢；哺乳動物の大脳皮質の大半を占める）、旧皮質（記憶において重要な海馬とその関連組織）、古皮質（主に嗅覚の情報処理を行う組織）に分かれる。新皮質はさらに、前頭葉（運動野と人格を司る前頭前野など）、頭頂葉（触覚の知覚野と連合野など）、側頭葉（聴覚野など）、後頭葉（視覚野など）に分かれ、前頭葉は大脳の運動および行動出力の制御系であり、頭頂葉、側頭葉および後頭葉は知覚の処理および統合系である。大脳皮質は、主に神経細胞（別称、ニューロン）および神経線維、その他、神経膠細胞（別称、グリア細胞）および血管を含む。大脳皮質には神経細胞体が密集しているため灰色をしている。神経細胞は、細胞体と、細胞体から出て伸展する突起によって構成されており、突起には樹状突起と軸索がある。樹状突起は、細胞体や軸索の終末から枝のように伸びて他の神経細胞と接合してシナプスを形成する。一方、軸索は、細胞体から長く伸びた構造物であり、細胞体からの情報を末端の神経終末に伝える。軸索や樹状突起のうち、長く伸びているものを神経線維（単に「線維」と称する場合がある。）といい、白質に集合している。大脳皮質はまた、６層構造（第Ｉ層~第ＶＩ層）を有しており、具体的には、最も表層から、分子層、外顆粒層、外錐体細胞層、内顆粒層、神経細胞層（内錐体細胞層）および多型細胞層を形成している。
　本明細書における「大脳皮質細胞」は、大脳皮質神経幹細胞（多能性と複製能を有する細胞）、大脳皮質神経前駆細胞（分裂能を有するものも含み、神経細胞へ分化することが運命づけられた細胞）、大脳皮質神経細胞（分裂能を失った、分化した神経細胞）を含む細胞集団を意味する。
　大脳皮質細胞は、ヒトを含む哺乳動物の大脳皮質から、例えばＦｏｘｇ１陽性細胞集団であり、さらにＣＤ２３１、ＰＣＤＨ１７およびＣＤＨ８から成る群より選択される少なくとも一つのマーカーが陽性である細胞集団を分離することによって得ることができる（国際公開ＷＯ２０１６／１６７３７２号）。あるいは、多能性幹細胞からの大脳皮質細胞への分化誘導法を用いて大脳皮質細胞を作製することができる（国際公開ＷＯ２０１６／１６７３７２号）。
　大脳皮質細胞は、本発明者らによって見出された方法（国際公開ＷＯ２０１６／１６７３７２号に記載された方法）等を用いて作製することができる。以下に、国際公開ＷＯ２０１６／１６７３７２号に記載された方法を例示する。
＜多能性幹細胞＞
　使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞である。それらの多能性幹細胞の具体例は、以下のものに限定されないが、胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、精子幹細胞（「ＧＳ細胞」）、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（例えば、Ｍｕｓｅ細胞）などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、およびｉＰＳ細胞である。より好ましい多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞であり、特に好ましくはヒトＥＳ細胞、およびヒトｉＰＳ細胞である。
（Ａ）胚性幹細胞
　ＥＳ細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能とを有する幹細胞である。
　ＥＳ細胞は、受精卵の８細胞期または桑実胚段階の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ＥＳ細胞は、マウスで１９８１年に発見され（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ　ａｎｄ　Ｍ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１５４−１５６）、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもＥＳ細胞株が樹立された（Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９８），Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２：１１４５−１１４７、Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：７８４４−７８４８、Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９６），Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５５：２５４−２５９およびＪ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ　ａｎｄ　Ｖ．Ｓ．Ｍａｒｓｈａｌｌ（１９９８），Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３８：１３３−１６５）。
　ＥＳ細胞の樹立は、当分野で知られた方法が用いられる。例えば、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養によるＥＳ細胞の維持は、白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ））、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ））などの物質を添加した培地を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのＥＳ細胞の樹立と維持の方法については、例えばＨ．Ｓｕｅｍｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ．（２００６），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３４５：９２６−９３２、Ｍ．Ｕｅｎｏ　ｅｔ　ａｌ．（２００６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：９５５４−９５５９、Ｈ．Ｓｕｅｍｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ．（２００１），Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２２２：２７３−２７９およびＨ．Ｋａｗａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．（２００２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１５８０−１５８５などに記載されている。
　ＥＳ細胞作製のための培養方法は、当分野で知られた方法が用いられる。培養液として、例えば０．１ｍＭ　２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ　非必須アミノ酸、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、２０％ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）及び４ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を使用し、３７℃、５％ＣＯ_２湿潤雰囲気下でヒトＥＳ細胞を維持することができる。また、ＥＳ細胞は、３~４日おきに継代してもよく、このとき、継代は、例えば１ｍＭ　ＣａＣｌ_２及び２０％ＫＳＲを含有するＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中の０．２５％トリプシン及び０．１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶを用いて行うことができる。
　ＥＳ細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ−３／４、Ｎａｎｏｇなどの遺伝子マーカーの発現を指標にして行うことができる。特に、ヒトＥＳ細胞の選択では、ＯＣＴ−３／４、ＮＡＮＯＧ、などの遺伝子マーカーの発現をＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ法で検出する、および／または、細胞表面抗原であるＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１を免疫染色法にて検出することで行うことができる（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ　Ｉ，ｅｔ　ａｌ．（２００６），Ｎａｔｕｒｅ．４４４：４８１−４８５）。
　マウスＥＳ細胞としては、ｉｎＧｅｎｉｏｕｓ社、理化学研究所（理研）等が樹立した各種マウスＥＳ細胞株が利用可能である。ヒトＥＳ細胞としては、ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、京都大学等が樹立した各種ヒトＥＳ細胞株が利用可能である。たとえばヒトＥＳ細胞株としては、ＥＳ　Ｃｅｌｌ　ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのＨＥＳ１~ＨＥＳ６株、ＷｉＣｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＨ１株、Ｈ９株、京都大学ウイルス・再生医科学研究所（京都、日本）のＫｈＥＳ−１株、ＫｈＥＳ−２株、ＫｈＥＳ−３株、ＫｈＥＳ−４株、ＫｈＥＳ−５株及びＫｔｈＥＳ１１株、国立成育医療研究センター（東京、日本）のＳＳＥＳ１株、ＳＳＥＳ２株、ＳＳＥＳ３株、等を利用することができる。
（Ｂ）精子幹細胞
　精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ＥＳ細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ（Ｍ．Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，６９：６１２−６１６；Ｋ．Ｓｈｉｎｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．（２００４），Ｃｅｌｌ，１１９：１００１−１０１２）。精子幹細胞は、神経膠細胞系由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ））を含む培地で自己複製可能であるし、ＥＳ細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって精子幹細胞を得ることができる（竹林正則ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４１~４６頁，羊土社（東京、日本））。
（Ｃ）胚性生殖細胞
　胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ＥＳ細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、幹細胞因子（ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ）などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる（Ｙ．Ｍａｔｓｕｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２），Ｃｅｌｌ，７０：８４１−８４７；Ｊ．Ｌ．Ｒｅｓｎｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２），Ｎａｔｕｒｅ，３５９：５５０−５５１）。
（Ｄ）人工多能性幹細胞
　人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、ある特定の１種もしくは複数種の初期化物質を、ＤＮＡまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することによるか、または、ある特定の１種もしくは複数種の薬剤の使用により初期化物質の内在性のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現量を上昇させることによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ａｎｄ　Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）Ｃｅｌｌ，１２６：６６３−６７６、Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ，１３１：８６１−８７２、Ｊ．Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７−１９２０、Ｍ．Ｎａｋａｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：１０１−１０６、国際公開ＷＯ　２００７／０６９６６６および国際公開ＷＯ　２０１０／０６８９５５）。初期化物質は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇ　ＲＮＡ、またはＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇ　ＲＮＡ、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。特に限定されないが、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ５、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ１８、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０　Ｌａｒｇｅ　Ｔ　ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、Ｂｍｉｌ、Ｌｉｎ２８、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｎａｎｏｇ、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｅｓｒｒｇ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３およびＧｌｉｓ１が例示される。これらの初期化物質は、ｉＰＳ細胞樹立の際には、単独で使用されてもよく、組み合わされて使用されてもよい。そのような組合せは、上記初期化物質を、少なくとも１種、２種もしくは３種を含む組み合わせ、好ましくは３種もしくは４種を含む組み合わせとすることができる。
　上記の各初期化物質のマウスおよびヒトｃＤＮＡのヌクレオチド配列情報、並びに、該ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列情報は、ＷＯ２００７／０６９６６６に記載のＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）またはＥＭＢＬ（ドイツ国）のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒｓにアクセスすることによって入手可能である。また、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｅｓｒｒｂ、ＥｓｒｒｇおよびＧｌｉｓ１のマウスおよびヒトのｃＤＮＡ配列情報およびアミノ酸配列情報については、表１に示したＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒｓにアクセスすることにより取得できる。当業者は、該ｃＤＮＡ配列またはアミノ酸配列情報に基づいて、常法により所望の初期化物質を調製することができる。

　これらの初期化物質は、タンパク質の形態で、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ由来のＴＡＴおよびポリアルギニン）との結合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよいし、あるいは、ＤＮＡの形態で、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソームの使用、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（これらのベクターは、Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６；Ｃｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７；Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８，ｐｐ．１９１７−１９２０，２００７に準ずる。）、アデノウイルスベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２，９４５−９４９，２００８）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（Ｐｒｏｃ　Ｊｐｎ　Ａｃａｄ　Ｓｅｒ　Ｂ　Ｐｈｙｓ　Ｂｉｏｌ　Ｓｃｉ．８５，３４８−６２，２００９）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣおよびＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２：９４９−９５３，２００８）。ベクターには、初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトもしくはポリアデニル化シグナルなどの制御配列を含むことができる。使用されるプロモーターとしては、例えばＥＦ１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、ＥＦ１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＭｏＭｕＬＶ　ＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい例として挙げられる。さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子またはピューロマイシン耐性遺伝子）、チミジンキナーゼ遺伝子、およびジフテリアトキシン遺伝子もしくはその断片などの選択マーカー配列、並びに、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）またはＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化物質をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化物質をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にＬｏｘＰ配列を有してもよい。別の好ましい実施態様においては、トランスポゾンを用いて染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、プラスミドベクターもしくはアデノウイルスベクターを用いて細胞に転移酵素を作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるｐｉｇｇｙＢａｃ等が挙げられる（Ｋａｊｉ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，（２００９），Ｎａｔｕｒｅ，４５８：７７１−７７５、Ｗｏｌｔｊｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，（２００９），Ｎａｔｕｒｅ，４５８：７６６−７７０、ＷＯ　２０１０／０１２０７７）。さらに、ベクターには、染色体への組み込みがなくとも複製されて、エピソーマルに存在するように、リンパ指向性ヘルペスウイルス（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｈｅｒｐｅｓ　ｖｉｒｕｓ）、ＢＫ　ウイルスおよび牛乳頭腫ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）の起点とその複製に関わる配列を含んでいてもよい。例えば、ＥＢＮＡ−１およびｏｒｉＰ、または、ＬａｒｇｅＴおよびＳＶ４０ｏｒｉ配列を含むことが挙げられる（ＷＯ　２００９／１１５２９５、ＷＯ　２００９／１５７２０１およびＷＯ　２００９／１４９２３３）。また、２種またはそれ以上の初期化物質を同時に導入するために、ポリシストロニックに発現させることができる発現ベクターを用いてもよい。ポリシストロニックに発現させるためには、遺伝子をコードする配列と配列の間は、ＩＲＥＳまたは口蹄病ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａコード領域により結合されていてもよい（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２：９４９−９５３，２００８、ＷＯ　２００９／０９２０４２およびＷＯ　２００９／１５２５２９）。
　初期化に際して、ｉＰＳ細胞の誘導効率を高めるために、上記の因子の他に、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤［例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６（７）：７９５−７９７（２００８））、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例えば、ＨＤＡＣ１　ｓｉＲＮＡ　Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨｕＳＨ　２９ｍｅｒ　ｓｈＲＮＡ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ＨＤＡＣ１（ＯｒｉＧｅｎｅ）等）等の核酸性発現阻害剤など］、ＤＮＡ　メチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば５’−アザシチジン（５’−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ））（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６（７）：７９５−７９７（２００８））、Ｇ９ａ　ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、ＢＩＸ−０１２９４（Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，２：５２５−５２８（２００８））等の低分子阻害剤、Ｇ９ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例、Ｇ９ａ　ｓｉＲＮＡ（ｈｕｍａｎ）（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等）等の核酸性発現阻害剤など］、Ｌ−チャネルカルシウムアゴニスト（Ｌ−ｃｈａｎｎｅｌ　ｃａｌｃｉｕｍ　ａｇｏｎｉｓｔ）（例えばＢａｙｋ８６４４）（Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，３，５６８−５７４（２００８））、酪酸、ＴＧＦβ阻害剤またはＡＬＫ５阻害剤（例えば、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ４３１５４２、６１６４５３およびＡ−８３−０１）、ｐ５３阻害剤（例えばｐ５３に対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）（Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，３，４７５−４７９（２００８））、Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子（例えば可溶性　Ｗｎｔ３ａ）（Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，３，１３２−１３５（２００８））、ＬＩＦまたはｂＦＧＦなどの増殖因子、ＡＬＫ５阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２）（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６：８０５−８（２００９））、有糸分裂活性化プロテインキナーゼシグナル伝達（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ｇｌｙｃｏｇｅｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｋｉｎａｓｅ）−３　阻害剤（ＰｌｏＳ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，６（１０），２２３７−２２４７（２００８））、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５およびｍｉｒ−３０２などのｍｉＲＮＡ（Ｒ．Ｌ．Ｊｕｄｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２７：４５９−４６１（２００９））、等を使用することができる。
　薬剤によって初期化物質の内在性のタンパク質の発現量を上昇させる方法に使用される、そのような薬剤としては、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム、インジルビン−５−ニトロ−３’−オキシム、バルプロ酸、２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン、１−（４−メチルフェニル）−２−（４，５，６，７−テトラヒドロ−２−イミノ−３（２Ｈ）−ベンゾチアゾリル）エタノンＨＢｒ（ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−ａｌｐｈａ）、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンＪ２およびプロスタグランジンＥ２）等が例示される（ＷＯ　２０１０／０６８９５５）。
　また、樹立効率を高めることを目的として、ＡＲＩＤ３Ａ阻害剤（例えば、ＡＲＩＤ３Ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、神経ペプチドＹ、ＵＴＦ１、ＩＲＸ６、ＰＩＴＸ２、ＤＭＲＴＢ１等を用いてもよい。
　初期化物質等の組み合わせとしては、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８８２０、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００９／０３２１９４、ＷＯ２００９／０５８４１３、ＷＯ２００９／０５７８３１、ＷＯ２００９／０７５１１９、ＷＯ２００９／０７９００７、ＷＯ２００９／０９１６５９、ＷＯ２００９／１０１０８４、ＷＯ２００９／１０１４０７、ＷＯ２００９／１０２９８３、ＷＯ２００９／１１４９４９、ＷＯ２００９／１１７４３９、ＷＯ２００９／１２６２５０、ＷＯ２００９／１２６２５１、ＷＯ２００９／１２６６５５、ＷＯ２００９／１５７５９３、ＷＯ２０１０／００９０１５、ＷＯ２０１０／０３３９０６、ＷＯ２０１０／０３３９２０、ＷＯ２０１０／０４２８００、ＷＯ２０１０／０５０６２６、ＷＯ２０１０／０５６８３１、ＷＯ２０１０／０６８９５５、ＷＯ２０１０／０９８４１９、ＷＯ２０１０／１０２２６７、ＷＯ２０１０／１１１４０９、ＷＯ２０１０／１１１４２２、ＷＯ２０１０／１１５０５０、ＷＯ２０１０／１２４２９０、ＷＯ２０１０／１４７３９５、ＷＯ２０１０／１４７６１２、Ｈｕａｎｇｆｕ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：７９５−７９７、Ｓｈｉ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，２：５２５−５２８、Ｅｍｉｎｌｉ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．（２００８），Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．２６：２４６７−２４７４、Ｈｕａｎｇｆｕ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ．（２００８），Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１２６９−１２７５、Ｓｈｉ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，３，５６８−５７４、Ｚｈａｏ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，３：４７５−４７９、Ｍａｒｓｏｎ　Ａ，（２００８），Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，３，１３２−１３５、Ｆｅｎｇ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ．（２００９），Ｎａｔ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１１：１９７−２０３、Ｒ．Ｌ．Ｊｕｄｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，（２００９），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２７：４５９−４６１、Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓ　ＣＡ，ｅｔ　ａｌ．（２００９），Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．１０６：８９１２−８９１７、Ｋｉｍ　ＪＢ，ｅｔ　ａｌ．（２００９），Ｎａｔｕｒｅ．４６１：６４９−６４３、Ｉｃｈｉｄａ　ＪＫ，ｅｔ　ａｌ．（２００９），Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．５：４９１−５０３、Ｈｅｎｇ　ＪＣ，ｅｔ　ａｌ．（２０１０），Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．６：１６７−７４、Ｈａｎ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．（２０１０），Ｎａｔｕｒｅ．４６３：１０９６−１００、Ｍａｌｉ　Ｐ，ｅｔ　ａｌ．（２０１０），Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．２８：７１３−７２０、Ｍａｅｋａｗａ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．（２０１１），Ｎａｔｕｒｅ．４７４：２２５−９．に記載の組み合わせが例示される。
　ｉＰＳ細胞誘導のための培養培地としては、例えば（１）１０~１５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥ培地（これらの培地にはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、２−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）、（２）ｂＦＧＦまたはＳＣＦを含有するＥＳ細胞培養用培地、例えばマウスＥＳ細胞培養用培地（例えばＴＸ−ＷＥＳ培地、トロンボＸ社）または霊長類ＥＳ細胞培養用培地（例えば霊長類（ヒトまたはサル）ＥＳ細胞用培地（販売先：リプロセル、京都、日本）、ｍＴｅＳＲ−１）、などが含まれる。
　培養法の例としては、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２存在下にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で体細胞と初期化物質（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質）を接触させ約４~７日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上にまきなおし、体細胞と初期化物質の接触から約１０日後からｂＦＧＦ含有霊長類ＥＳ細胞培養用培地で培養し、該接触から約３０~約４５日またはそれ以上ののちにＥＳ細胞様コロニーを生じさせることができる。また、ｉＰＳ細胞の誘導効率を高めるために、５~１０％と低い酸素濃度の条件下で培養してもよい。
　あるいは、上記細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２存在下にて、フィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞またはＳＮＬ細胞等）上で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（これにはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、２−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約２５~約３０日またはそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを形成させることができる。フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．（２００９），ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．４：ｅ８０６７またはＷＯ２０１０／１３７７４６）、もしくは細胞外マトリックス（例えば、Ｌａｍｉｎｉｎ−５（ＷＯ２００９／１２３３４９）およびマトリゲル（ＢＤ社））を用いる方法も例示される。
　この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Ｓｕｎ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．（２００９），Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．１０６：１５７２０−１５７２５）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（０．１％以上、１５％以下の酸素濃度）によりｉＰＳ細胞を樹立しても良い（Ｙｏｓｈｉｄａ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．（２００９），Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．５：２３７−２４１またはＷＯ２０１０／０１３８４５）。
　上記培養の間には、培養開始２日目以降から毎日１回新鮮な培地と培地交換を行う。また、初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ（１００ｃｍ^２）あたり約５×１０^３~約５×１０^６細胞の範囲である。
　ｉＰＳ細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。マーカー遺伝子として、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡを用いた場合は、対応する薬剤を含む培地（すなわち、選択培地）で細胞の培養を行うことによりマーカー遺伝子発現細胞（すなわち、樹立したｉＰＳ細胞）を選択することができる。またマーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、または、発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、マーカー遺伝子発現細胞（すなわち、樹立したｉＰＳ細胞）を検出又は選択することができる。
　本明細書中で使用する「体細胞」は、生殖細胞以外のいかなる細胞（好ましくは、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタおよびラット）細胞）であってもよい。体細胞には、非限定的に、胎児（仔）の体細胞、新生児（仔）の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、Ｉ型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Ｔリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞（組織前駆細胞）等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞もしくは幹細胞（体性幹細胞も含む）であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な幹細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
　また、ｉＰＳ細胞および／またはそれらから分化誘導した細胞を移植用細胞の材料として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のＨＬＡ遺伝子型が同一もしくは実質的に同一である体細胞を用いることが望ましい。ここで、ＨＬＡの型が「実質的に同一」とは、細胞を移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にＨＬＡ遺伝子型が一致していることであり、例えば、主たるＨＬＡ（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲの３遺伝子座あるいはＨＬＡ−Ｃを加えた４遺伝子座）が一致するＨＬＡ型を有する体細胞である。
（Ｅ）核移植により得られたクローン胚由来のＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）
　ｎｔＥＳ細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のＥＳ細胞であり、受精卵由来のＥＳ細胞とほぼ同じ特性を有している（Ｔ．Ｗａｋａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：７４０−７４３；Ｓ．Ｗａｋａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．（２００５），Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，７２：９３２−９３６；Ｊ．Ｂｙｒｎｅ　ｅｔ　ａｌ．（２００７），Ｎａｔｕｒｅ，４５０：４９７−５０２）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたＥＳ細胞がｎｔＥＳ（ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ＥＳ）細胞である。ｎｔＥＳ細胞の作製のためには、核移植技術（Ｊ．Ｂ．Ｃｉｂｅｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：６４２−６４６）とＥＳ細胞作製技術（上記）との組み合わせが利用される（若山清香ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４７~５２頁，羊土社（東京、日本））。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
（Ｆ）Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｅｎｄｕｒｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ（Ｍｕｓｅ細胞）
　Ｍｕｓｅ細胞は、ＷＯ２０１１／００７９００に記載された方法にて製造された多能性幹細胞であり、詳細には、線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは８時間または１６時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞であり、ＳＳＥＡ−３およびＣＤ１０５が陽性である。
＜大脳皮質細胞の作製＞
　例えば、以下の工程を含む方法によって多能性幹細胞から大脳皮質細胞を製造することができる。
（ｉ）多能性幹細胞をＴＧＦβ阻害剤、ｂＦＧＦ、Ｗｎｔ阻害剤、およびＢＭＰ阻害剤を含む培養液中で浮遊培養する工程、
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で得られた細胞をＷｎｔ阻害剤、およびＢＭＰ阻害剤を含む培養液中で浮遊培養する工程、
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で得られた細胞を培養する工程。
　本発明において、大脳皮質細胞とは、特に断りがなければ、大脳皮質神経細胞、大脳皮質神経幹細胞及び大脳皮質神経前駆細胞から成る群から選択される複数の細胞を含むものとする。上記の方法によって製造される大脳皮質細胞は、好ましくは、Ｆｏｘｇ１が陽性である細胞である。ここで、Ｆｏｘｇ１としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００５２４９で示されるポリヌクレオチドおよびこれらがコードするタンパク質が挙げられる。上記の方法によって製造される大脳皮質細胞は、より好ましくは、大脳皮質の運動野の神経細胞または上位運動ニューロン、すなわち、大脳皮質の前方の神経細胞であり、さらに好ましくは大脳皮質の運動野の第Ｖ層の神経細胞である。このような神経細胞は、Ｃｔｉｐ２が陽性である細胞集団である。Ｃｔｉｐ２としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１２８２２３７、ＮＭ＿００１２８２２３８、ＮＭ＿０２２８９８またはＮＭ＿１３８５７６で示されるポリヌクレオチドおよびこれらがコードするタンパク質が挙げられる。
　大脳皮質細胞は、他の細胞種が含まれる細胞集団として製造されてもよく、例えば、製造された細胞集団において１５％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上または５０％以上が大脳皮質細胞であってもよい。大脳皮質細胞を製造後、当該細胞を濃縮してもよい。大脳皮質細胞を濃縮する方法として、ＣＤ２３１、ＰＣＤＨ１７およびＣＤＨ８から成る群より選択される少なくとも一つのマーカータンパク質が陽性である細胞を抗体により標識し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）や磁気細胞分離装置（ＭＡＣＳ）を用いて濃縮する方法が例示される。これらの抗体は、市販の抗体を適宜利用することができる。従って、工程（ｉｖ）として、工程（ｉｉｉ）で得られた細胞から、ＣＤ２３１、ＰＣＤＨ１７およびＣＤＨ８から成る群より選択される少なくとも一つのマーカータンパク質が陽性である細胞を抽出する工程をさらに含んでもよい。抽出後にさらに培養を継続しても良い。抽出後の培養は、例えば、工程（ｉｉｉ）と同様の条件で培養する方法が例示されるが、特に限定されない。
＜ＴＧＦβ阻害剤＞
　ＴＧＦβ阻害剤としては、ＴＧＦβの受容体への結合からＳＭＡＤへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるＡＬＫファミリーへの結合を阻害する物質、またはＡＬＫファミリーによるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する物質が挙げられる。このようなＴＧＦβ阻害剤としては、例えば、Ｌｅｆｔｙ−１（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．として、マウス：ＮＭ＿０１００９４、ヒト：ＮＭ＿０２０９９７が例示される）、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ２０２１９０（以上、Ｒ．Ｋ．Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ，２００３，２：２０）、ＳＢ５０５１２４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＮＰＣ３０３４５、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＳＤ２０８（Ｓｃｉｏｓ）、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６（Ｌｉｌｌｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａ−８３−０１（ＷＯ　２００９１４６４０８）およびこれらの誘導体などが例示される。ＴＧＦβ阻害剤は、好ましくは、下記の式Ｉで表されるＳＢ４３１５４２または下記の式ＩＩで表されるＡ−８３−０１であり得る。

　培養液中におけるＳＢ４３１５４２の濃度は、ＡＬＫ５を阻害する濃度であれば特に限定されないが、例えば１００ｎＭ~１ｍＭ、例えば、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、５００μＭ、１ｍＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、１μＭから１００μＭであり、より好ましくは、１０μＭである。
　培養液中におけるＡ−８３−０１の濃度は、ＡＬＫ５を阻害する濃度であれば特に限定されないが、例えば１ｎＭ~５０μＭ、例えば、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、５００ｎＭから５μＭであり、より好ましくは、５００ｎＭから２μＭである。
＜ｂＦＧＦ＞
　ｂＦＧＦは、ＦＧＦ２とも称し、例えば富士フィルム（日本）やＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、当業者に公知の方法によって細胞へ強制発現によって得てもよい。
　培養液中におけるｂＦＧＦの濃度は、例えば０．１ｎｇ／ｍＬ~１０００ｎｇ／ｍＬ、例えば、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬであるがこれらに限定されない。好ましくは、１ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは、１０ｎｇ／ｍＬである。
＜Ｗｎｔ阻害剤＞
　Ｗｎｔ阻害剤としては、Ｗｎｔの産生を抑制する物質、またはＷｎｔの受容体への結合からβカテニンの蓄積へと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーへの結合を阻害する物質、またはβカテニンの分解を促進する物質などが挙げられる。このようなＷｎｔ阻害剤としては、例えば、ＤＫＫ１タンパク質（例えば、ヒトの場合、ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０１２２４２）、スクレロスチン（例えば、ヒトの場合、ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０２５２３７）、ＩＷＲ−１（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＩＷＰ−２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＷＰ−３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＷＰ−４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＷＰ−Ｌ６（ＥＭＤ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｃ５９（または、Ｗｎｔ−Ｃ５９）（Ｃｅｌｌａｇｅｎ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＩＣＧ−００１（Ｃｅｌｌａｇｅｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＬＧＫ−９７４（または、ＮＶＰ−ＬＧＫ−９７４）（Ｃｅｌｌａｇｅｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＦＨ５３５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＷＩＫＩ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＫＹ０２１１１（Ｍｉｎａｍｉ　Ｉ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．２：１４４８−１４６０，２０１２）、ＰＮＵ−７４６５４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＸＡＶ９３９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）およびこれらの誘導体などが例示される。多能性幹細胞から大脳皮質細胞を製造するにあたり、好ましいＷｎｔ阻害剤は、Ｗｎｔの産生を抑制する物質であり、例えば、Ｗｎｔタンパク質のプロセシングに関与するＰＯＲＣＮ（ヒトの場合、ＮＣＢＩのアクセション番号：ＮＰ＿００１２６９０９６、ＮＰ＿０７３７３６、ＮＰ＿９８２２９９、ＮＰ＿９８２３００、またはＮＰ＿９８２３０１で表されるタンパク質が例示される）を阻害する物質が挙げられ、例えば、Ｃ５９、ＩＷＲ−１、ＩＷＰ−３、ＩＷＰ−４、ＩＷＰ−Ｌ６またはＬＧＫ−９７４である。より好ましいＷｎｔ阻害剤は、下記の式ＩＩＩで表されるＣ５９、およびＩＷＲ−１（４−（１，３，３ａ，４，７，７ａ−ヘキサヒドロ−１，３−ジオキソ−４，７−メタノ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）−Ｎ−８−キノリニル−ベンズアミド）である。

　培養液中におけるＣ５９の濃度は、Ｗｎｔを阻害する濃度であれば特に限定されないが、例えば０．１ｎＭ~１００ｎＭ、例えば、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、２．５ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、７．５ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、１ｎＭから５０ｎＭであり、例えば、２ｎＭから５０ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭから５０ｎＭであるか、あるいは、１０ｎＭ未満の濃度であり、例えば、２ｎＭ以上、１０ｎＭ未満である。
　また、下記の式ＩＶで表されるＬＧＫ−９７４もＷｎｔ阻害剤として好ましく利用することができる。

　培養液中におけるＬＧＫ−９７４の濃度は、Ｗｎｔを阻害する濃度であれば特に限定されないが、例えば１ｎＭ~１μＭ、例えば、１ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、１ｎＭから１μＭであり、例えば、１ｎＭから５００ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭから２００ｎＭであるか、あるいは、１０ｎＭから１５０ｎＭの濃度であり、例えば、１０ｎＭ以上、１００ｎＭ以下である。
＜ＢＭＰ阻害剤＞
　ＢＭＰ阻害剤としては、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ、などのタンパク質性阻害剤、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（すなわち、６−［４−（２−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ−１−ｙｌ−ｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］−３−ｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌ−ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）、その誘導体（Ｐ．Ｂ．Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．（２００７），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１６：ＩＩ＿６０；Ｐ．Ｂ．Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：３３−４１；Ｊ．Ｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．（２００８），ＰＬｏＳ　ＯＮＥ，３（８）：ｅ２９０４）およびＬＤＮ１９３１８９（すなわち、４−（６−（４−（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ−１−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−３−ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）が例示される。ＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎおよびＬＤＮ１９３１８９は市販されており、それぞれＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社およびＳｔｅｍｇｅｎｔ社から入手可能である。ＢＭＰ阻害剤は、好ましくは、下記の式Ｖで表されるＬＤＮ１９３１８９であり得る。

　培養液中におけるＬＤＮ１９３１８９の濃度は、ＢＭＰを阻害する濃度であれば特に限定されないが、例えば１ｎＭ~５０μＭ、例えば、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、２μＭ以下の濃度であり、例えば、１００ｎＭから２μＭであり、より好ましくは、５００ｎＭから２μＭであるか、あるいは、２μＭ未満の濃度であり、例えば、１００ｎＭ以上、２μＭ未満であり、より好ましくは、５００ｎＭ以上、２μＭ未満である。
＜工程（ｉ）＞
　工程（ｉ）で用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として、上述したＴＧＦβ阻害剤、ｂＦＧＦ、Ｗｎｔ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤を添加して調製することができる。基礎培地としては、例えば、Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ　Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、ＤＭＥＭとＨａｍ’ｓ　Ｆ１２培地を１：１で混合した培地である。基礎培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは血清に代えて血清代替物を添加してもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素およびこれらから選択される複数の組み合わせなどが挙げられる。好ましくは、血清代替物はＫＳＲである。上記工程（ｉ）において、ＫＳＲを用いる場合、基礎培地における濃度は、例えば５~２０％、例えば、５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％が挙げられるが、好ましくは、２０％未満、例えば１０％以上１５％以下の濃度である。基礎培地には、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。好ましい基礎培地は、ＫＳＲ、２−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸およびＬ−グルタミンを含有するＤＭＥＭとＨａｍ’ｓ　Ｆ１２培地を１：１で混合した培地である。
　上記工程（ｉ）において、多能性幹細胞を解離させて用いてもよく、細胞を解離させる方法としては、例えば、力学的に解離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）およびＡｃｃｕｍａｘ（登録商標）など）またはコラゲナーゼ活性のみを有する解離溶液を用いた解離方法が挙げられる。好ましくは、Ａｃｃｕｍａｘが例示される）を用いて多能性幹細胞を解離する方法が用いられる。細胞を解離させた場合、ＲＯＣＫ阻害剤を適宜、解離後に添加して培養することが望ましい。ＲＯＣＫ阻害剤を添加する場合、少なくとも１日間添加して培養すればよい。多能性幹細胞を解離させる１日以上前、好ましくは１日前より、ＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地で培養してもよい。
　ＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Ｙ−２７６３２（例えば、Ｉｓｈｉｚａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７，９７６−９８３（２０００）；Ｎａｒｕｍｉｙａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２５，２７３−２８４（２０００）参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（例えば、Ｕｅｎａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３８９：９９０−９９４（１９９７）参照）、Ｈ−１１５２（例えば、Ｓａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．９３：２２５−２３２（２００２）参照）、Ｗｆ−５３６（例えば、Ｎａｋａｊｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２（４）：３１９−３２４（２００３）参照）およびそれらの誘導体、ならびにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の低分子化合物も知られているので、このような化合物またはそれらの誘導体も使用できる（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２０９２６１号、同第２００５／０１９２３０４号、同第２００４／００１４７５５号、同第２００４／０００２５０８号、同第２００４／０００２５０７号、同第２００３／０１２５３４４号、同第２００３／００８７９１９号、及び国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、同第２００４／０３９７９６号参照）。上記工程（ｉ）では、１種または２種以上のＲＯＣＫ阻害剤が使用され得る。ＲＯＣＫ阻害剤は、好ましくは、下記式ＶＩで表されるＹ−２７６３２であり得る。

　培地中のＹ−２７６３２の濃度は、例えば１００ｎＭ~１００μＭ、例えば、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、１０μＭ以上、５０μＭ以下、例えば２０μＭおよび５０μＭである。
　上記工程（ｉ）の培養では、浮遊培養によって行われることが好ましい。ここで、浮遊培養とは、細胞を培養容器へ非接着の状態で凝集塊（「スフェア（ｓｐｈｅｒｅ）」とも言う）を形成させて培養することであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていない培養容器、若しくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ）、非イオン性の界面活性ポリオール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ−１２７等）またはリン脂質類似構造物（例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを構成単位とする水溶性ポリマー（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ））によるコーティング処理した培養容器を使用することによって行う培養である。
　工程（ｉ）の培養条件について、培養温度は、特に限定されないが、約３０~４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ_２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ_２濃度は、好ましくは約２~５％である。Ｏ_２濃度は、通常の空気中におけるＯ_２濃度であってもよく、あるいは、通常以上の高酸素条件であっても通常以下の低酸素条件であってもよい。ここで、高酸素条件とは、２５％以上のＯ_２濃度、３０％以上のＯ_２濃度、３５％以上のＯ_２濃度、または４０％以上のＯ_２濃度が例示される。低酸素条件とは、１０％以下のＯ_２濃度、５％以下のＯ_２濃度、４％以下のＯ_２濃度、３％以下のＯ_２濃度、２％以下のＯ_２濃度、または１％以下のＯ_２濃度が例示される。
　工程（ｉ）は、特に限定されないが、例えば、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、またはそれ以上の日数が挙げられ、上限は特に限定されないが、例えば、３６日以下、３０日以下、２４日以下、１８日以下、または１２日以下が挙げられる。より好ましくは、３日以上、１２日以下であり、さらに好ましくは、６日である。
＜工程（ｉｉ）＞
　工程（ｉｉ）で用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として、上述したＷｎｔ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤を添加して調製することができる。基礎培地としては、例えば、Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ　Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、ＤＭＥＭとＨａｍ’ｓ　Ｆ１２培地を１：１で混合した培地である。基礎培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは血清に代えて血清代替物を添加してもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素およびこれらから選択される複数の組み合わせなどが挙げられる。好ましくは、血清代替物はＫＳＲである。工程（ｉｉ）において、ＫＳＲを用いる場合、基礎培地における濃度は、例えば５~２０％、例えば、５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％が挙げられるが、好ましくは、２０％未満、例えば１０％以上１５％以下の濃度である。基礎培地には、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。好ましい基礎培地は、ＫＳＲ、２−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸およびＬ−グルタミンを含有するＤＭＥＭとＨａｍ’ｓ　Ｆ１２培地を１：１で混合した培地である。
　工程（ｉｉ）において、前記工程（ｉ）で得られた細胞を解離させて用いてもよく、そのまま用いても良い。より好ましくは、前記工程（ｉ）で得られた細胞において、培養液を交換して培養を継続する方法である。従って、工程（ｉｉ）の培養では、浮遊培養によって行われることが好ましい。
　工程（ｉｉ）の培養条件について、培養温度は、特に限定されないが、約３０~４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ_２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ_２濃度は、好ましくは約２~５％である。Ｏ_２濃度は、通常の空気中におけるＯ_２濃度であってもよく、あるいは、通常以上の高酸素条件であっても通常以下の低酸素条件であってもよい。
　工程（ｉｉ）は、特に限定されないが、例えば、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、またはそれ以上の日数が挙げられ、上限は特に限定されないが、４８日以下、４２日以下、３６日以下、３０日以下、２４日以下、１８日以下が挙げられる。より好ましくは、６日以上１８日以下であり、さらに好ましくは、１２日である。
＜工程（ｉｉｉ）＞
　工程（ｉｉｉ）で用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地を用いることができる。基礎培地としては、例えば、Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ　Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍである。基礎培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは血清に代えて血清代替物を添加してもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素およびこれらから選択される複数の組み合わせなどが挙げられる。好ましくは、血清代替物はＢ２７サプリメントである。基礎培地には、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。好ましい基礎培地は、Ｂ２７サプリメントおよびＬ−グルタミンを含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍである。工程（ｉｉｉ）で用いる培養液は、上記基礎培地に例えば、ＦＧＦ８（線維芽細胞成長因子８（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　８）、神経栄養因子などを適宜添加したものを用いることができる。
　ＦＧＦ８としては、特に限定されないが、ヒトＦＧＦ８の場合、ＦＧＦ８ａ、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ８ｅまたはＦＧＦ８ｆの４つのスプライシングフォームが例示され、より好ましくは、ＦＧＦ８ｂである。ＦＧＦ８は、例えば富士フィルム（日本）やＲ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、当業者に公知の方法によって細胞へ強制発現によって得てもよい。
　培養液中におけるＦＧＦ８の濃度は、例えば１ｎｇ／ｍＬ~５０００ｎｇ／ｍＬ、例えば、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、５０００ｎｇ／ｍＬであるがこれらに限定されない。好ましくは、１００ｎｇ／ｍＬである。
　神経栄養因子としては、神経細胞の生存と機能維持に重要な役割を果たしている膜受容体へのリガンドであり、例えば、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＮＧＦ））、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ））、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）、ニューロトロフィン６（ＮＴ−６）、ｂＦＧＦ、酸性ＦＧＦ、ＦＧＦ−５、上皮細胞増殖因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ））、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ））、インスリン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ２）、グリア細胞株由来神経栄養因子（Ｇｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ））、ＴＧＦ−ｂ２、ＴＧＦ−ｂ３、インターロイキン６（ＩＬ−６）、毛様体神経栄養因子（Ｃｉｌｉａｒｙ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ（ＣＮＴＦ））およびＬＩＦなどが挙げられる。神経栄養因子は、例えば富士フィルム（日本）やＲ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、当業者に公知の方法によって細胞へ強制発現によって得てもよい。
　工程（ｉｉｉ）では、前記工程（ｉｉ）で得られた細胞を培養する工程であり、当該培養は、接着培養であっても浮遊培養であっても良い。接着培養を行う場合、細胞外基質をコーティング処理された培養容器を用いて培養することによって行い得る。コーティング処理は、細胞外基質を含有する溶液を培養容器に入れた後、当該溶液を適宜除くことによって行い得る。
　細胞外基質とは、細胞の外に存在する超分子構造体であり、天然由来であっても、人工物（組換え体）であってもよい。例えば、ポリリジン、ポリオルニチン、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリリン、ラミニンといった物質およびこれらの断片が挙げられる。これらの細胞外基質は、組み合わせて用いられてもよく、例えば、ＢＤ　Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）などの細胞からの調製物であってもよい。好ましくは、ポリオルニチン、ラミニンおよびフィブロネクチンの混合物である。
　工程（ｉｉｉ）において、浮遊培養を行う場合、前記工程（ｉｉ）で得られた細胞の培養液を適宜、上述の工程（ｉｉｉ）で用いる培養液に置換することによって行い得る。工程（ｉｉｉ）において、培養液を置換するにあたり、全ての培養液を置換してもよく、例えば、半量の置換を数回に分けて行っても良い。
　工程（ｉｉｉ）の培養条件について、培養温度は、特に限定されないが、約３０~４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ_２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ_２濃度は、好ましくは約２~５％である。Ｏ_２濃度は、通常の空気中におけるＯ_２濃度であってもよく、あるいは、通常以上の高酸素条件であっても通常以下の低酸素条件であってもよい。
　工程（ｉｉｉ）は、大脳皮質細胞が得られるという観点から、長期にわたって培養を継続しても特に弊害がないことから、特に上限を設定する必要はないが、例えば、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１４日以上、２１日以上、２８日以上、３０日以上、３５日以上、またはそれ以上の日数が挙げられる。より好ましくは、２８日以上であり、さらに好ましくは、２８日または３０日である。
２．大脳皮質細胞の細胞表面マーカーＬ１ＣＡＭおよびその特性
　本発明者らは、今回、上記１．で作製された大脳皮質細胞（集団）中に、軸索伸長を起こす、例えば少なくとも錐体交叉に軸索を伸長（もしくは伸展）する、大脳皮質神経細胞（もしくは細胞集団）を選別することを可能にする細胞表面マーカー（Ｌ１ＣＡＭ）を見出した。この知見により、Ｌ１ＣＡＭの発現に基づく手法（例えば、細胞選別法など）を使用することによって、大脳皮質細胞からＬ１ＣＡＭ陽性細胞を濃縮することが可能であり、一方、Ｌ１ＣＡＭ陰性細胞を分離、除去もしくは排除することができる。
　Ｌ１ＣＡＭはまた、発生初期から後期にかけての大脳組織、あるいは例えば培養初期の大脳オルガノイド、の中間帯（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　ｚｏｎｅ；ＩＺ）および皮質板（ｃｏｒｔｉｃａｌ　ｐｌａｔｅ；ＣＰ）に発現しているので、かかる組織やオルガノイドからＩＺおよび／またはＣＰをＬ１ＣＡＭを指標にして選別することが可能である（図１１）。また、かかる組織やオルガノイドから、あるいはＩＺおよび／またはＣＰから、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞をＬ１ＣＡＭを指標にして分離または濃縮することが可能である（図３）。ここで大脳オルガノイドは、大脳皮質細胞を例えば無血清凝集浮遊培養法（ＳＦＥＢｑ；Ｗａｔａｎａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　８：２８８−２９６，２００５）、３次元立体培養する方法などによって例えば大脳皮質に類似した多層構造が自己組織化的に形成されたミニブレインである。
　Ｌ１ＣＡＭ陰性細胞は、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞以外の細胞であり、例えば神経幹細胞、（大脳皮質細胞誘導時の不純物としての）多能性幹細胞などの細胞を含み、好ましくは神経幹細胞を主として含む。
　上記のように濃縮されたＬ１ＣＡＭ陽性細胞（もしくは細胞集団）には、全細胞数の１０％以下のＬ１ＣＡＭ陰性細胞（例えば、神経幹細胞）を含むことができるが、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞のみからなることが好ましい。
　Ｌ１ＣＡＭは、別称ＣＤ１７１、Ｓ１０、ＨＳＡＳ、ＭＡＳＡ、ＭＩＣ５、ＳＰＧ１、ＣＡＭＬ１、ＨＳＡＳ１、Ｎ−ＣＡＭＬ１、ＮＣＡＭ−Ｌ１、Ｎ−ＣＡＭ−Ｌ１などであり、免疫グロブリンスーパーファミリー細胞接着分子（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；ＣＡＭｓ）の一つであり、細胞と細胞の接着を仲介する分子量２００~２２０ｋＤａの糖タンパク質である（例えばＵＳ２０１５／０３４４５７１Ａ１）。ヒトＬ１ＣＡＭは、１，２５７アミノ酸からなる１型膜貫通タンパク質であり、そのアミノ末端部が細胞膜外にあり、そのカルボキシ末端部は細胞質内に存在し、ならびに、細胞外ドメインは、６つの免疫グロブリン２型ドメイン、５つのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメイン、および２０個のＮ−グリコシル化部位を有する（Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ　Ｍ，Ａｎｎ　Ｎ　Ｙ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　６３３：１０５−１１２，１９９１）。アミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ（米国）のＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号として例えばＭ７４３８７、ＮＭ＿００１１４３９６３．２、ＮＭ＿０２４００３．３、ＮＭ＿０００４２５．４、ＡＡ１３６４４８などに記載されている。
　哺乳動物では、Ｌ１ＣＡＭの発現は、神経系を介して認められ、ならびに発生期の軸索の成長やガイダンスに、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞と軸索との相互作用に、神経細胞の移動に、神経細胞の生存に、シナプス形成、および髄鞘形成に関与する（Ｂｉｘｂｙ　ＪＬ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１０７：３５３−３６１，１９８８、Ｌｉｎｄｎｅｒ　Ｊ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３０５：４２７−４３０，１９８３、Ｃｈｅｎ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ　３８：４２８−４３９，１９９９）。Ｌ１ＣＡＭのｍＲＮＡは、発達する皮質由来の皮質板（ＣＰ）内で強く発現され中間帯（ＩＺ）内で強く発現されない。さらに、このタンパク質の発現は、成人の皮質第Ｖ層内に特異的に局在する（Ｍｕｎａｋａｔａ　Ｈ　ｅｔ　ａｌ．，ＢＭＣ　ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　４：７，２００３）。
　特許文献１には、多能性幹細胞から分化誘導された神経前駆細胞集団であって、脳への移植によってＧＡＢＡ作動性抑制性介在ニューロンへ成熟することができる神経前駆細胞が記載されており、また、このような細胞集団の細胞選別によって濃縮（もしくは富化）することを可能にする細胞表面マーカーとして、ＰＬＥＸＩＮＡ４と、ＡＴＲＮＬ１、ＣＤ２００、Ｌ１ＣＡＭなどの多数のマーカー群の少なくとも１つとの組み合わせが記載されている。マーカーの１つとしてＬ１ＣＡＭも記載されているが、本発明では発生の特定時期、すなわちＬ１ＣＡＭ陽性深層ニューロン（Ｌ１ＣＡＭ^＋ＤＬＮ）およびその前駆細胞が豊富に作られる時期の選別によって、結果的に大脳皮質細胞（ＣＴＩＰ２陽性細胞集団）からＣＴＩＰ２陽性深層ニューロン（ＣＴＩＰ２^＋ＤＬＮ）およびその前駆細胞を選別することから特許文献１に記載の神経前駆細胞集団と異なる。ＣＴＩＰ２^＋ＤＬＮおよびその前駆細胞は、軸索を脳内の特定の神経集団（例えば、神経核や大脳皮質領野など）の中だけに限局せず遠方にも伸展し異なる領域間の情報伝達を担うことができる。
３．大脳皮質細胞からのＬ１ＣＡＭ陽性細胞の取得方法
　本発明の第１の態様により、哺乳動物由来の大脳皮質細胞から細胞表面マーカーＬ１ＣＡＭを指標にしてＬ１ＣＡＭ陽性細胞を分離し回収することを含む、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞を取得する方法を提供する。
　Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、単一細胞として取得されてもよく、あるいは複数細胞を含む細胞塊（例えば、球状の細胞塊（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ））として取得されてもよい。
　Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞を分離または単離するための大脳皮質細胞は、上記１．に記載されるとおり、ヒトを含む哺乳動物の大脳皮質から、例えばＦｏｘｇ１陽性細胞集団であり、さらにＣＤ２３１、ＰＣＤＨ１７およびＣＤＨ８から成る群より選択される少なくとも一つのマーカーが陽性である細胞集団を分離することによって得ることができる、あるいは、多能性幹細胞から大脳皮質細胞への分化誘導法を用いて上記大脳皮質細胞を作製することができる（例えば国際公開ＷＯ２０１６／１６７３７２号）。
　一実施形態において、哺乳動物の発生初期から後期にかけての大脳皮質細胞または例えば培養初期の大脳オルガノイド（ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｏｒｇａｎｏｉｄｓ）から細胞表面マーカーＬ１ＣＡＭを指標にしてＬ１ＣＡＭ陽性細胞を選別することにより、ＣＴＩＰ２陽性深層ニューロン（ＣＴＩＰ２^＋ＤＬＮ）および／またはその前駆細胞を選別することができる（図７Ｅ）。大脳オルガノイドは、大脳皮質細胞を例えば無血清凝集浮遊培養法（ＳＦＥＢｑ；Ｗａｔａｎａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　８：２８８−２９６，２００５）、３次元立体培養する方法によって、例えば大脳皮質に類似した多層構造が自己組織化的に形成されたミニブレインである。
　あるいは、別の実施形態において、哺乳動物の発生初期から後期にかけての大脳皮質細胞または例えば培養初期の大脳オルガノイドから細胞表面マーカーＬ１ＣＡＭを指標にして、中間帯および／または皮質板を選別し、Ｌ１ＣＡＭを指標にして中間帯および／または皮質板からＬ１ＣＡＭ陽性細胞を分離し回収することができる。
　Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、一実施形態において、Ｌ１ＣＡＭ陽性神経細胞および／またはその前駆細胞を主成分として含み、かつ幹細胞を含まないか、または全細胞数の１０％以下の神経幹細胞を含む細胞集団である。
　Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、大脳皮質細胞（集団）のＬ１ＣＡＭ陽性分画に主成分として含まれ、深層ニューロンである成熟神経細胞（ＮＲＰ１陰性）および／または深層ニューロンの前段階である神経前駆細胞（ＮＲＰ１陽性）を主成分として含む。このため、深層ニューロンの破綻による障害の再生医療においては、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞を移植することができる。
　上記神経前駆細胞は、限られた分裂回数の後に（成熟）神経細胞に分化を遂げるように運命付けられた細胞である。また、幹細胞は、例えば神経幹細胞や、分化誘導の際に残留する多能性幹細胞であり、特に多能性幹細胞は腫瘍形成を生じさせる可能性があるため移植用細胞に混入することは望ましくない。一方、神経幹細胞は、大脳皮質細胞（集団）のＬ１ＣＡＭ陰性分画に主成分として含まれ、上層ニューロン及びその前駆細胞への細胞系譜を有し、すなわち、神経前駆細胞および神経細胞（すなわち、ニューロン）、ならびに、グリア前駆細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトなどに分化するため、上層ニューロンの破綻による障害の再生医療のための移植用細胞として使用し得る。
　Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、哺乳動物の大脳皮質組織由来の皮質細胞から取得されてもよいし、あるいは、多能性幹細胞から分化誘導によって作製された大脳皮質細胞から取得されてもよい。前者の場合、皮質細胞中のＬ１ＣＡＭ陽性細胞の割合は、約３０％~約５０％であり、発生が進むとＬ１ＣＡＭ陽性細胞の割合は増加する。胎仔期には幹細胞から神経細胞が作られる過程のためＬ１ＣＡＭ陰性細胞も半数程度（例えば約５０％）存在する。後者の場合、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞中の神経前駆細胞および（成熟）神経細胞の割合は分化誘導期間（初期、中期、後期）に応じて変化する。ここで、初期は、例えば分化誘導開始日から約１８日目までの期間、中期は、例えば約１９日目から約３５日目までの期間、ならびに後期は、例えば約３６日目以降（例えば、約５０日目まで）の期間とし得る。
　Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、一実施形態において、多能性幹細胞から分化誘導により大脳皮質細胞が作製される際の分化過程の初期段階（この段階は、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞が発現（もしくは出現）し始める時期、すなわち神経細胞が発現し始める時期、言い換えれば神経幹細胞から神経分化を開始する時期である。分化誘導法が変われば、上記基準に至るまでの日数も変わるが、例えば、ヒトｉＰＳ細胞の場合、約１６~１８日、例えば１７日）で選別され得る。本明細書では、分化過程の初期段階で選別されるＬ１ＣＡＭ陽性細胞を「初期Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞」と称する。Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、例えば、軸索が遠い距離に伸長（もしくは伸展）可能であり、ｉｎ　ｖｉｖｏでレシピエントの錐体交叉に到達することができる（後述の実施例）。また、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞の細胞線維は、線条体（Ｓｔｒ）、内包（Ｉｃ）、大脳脚（Ｃｐ）、錐体交叉（Ｐｙｘ）および視床（Ｔｈａ）などの大脳下標的に高頻度に伸展することができるという性質をもつ。
　本発明との関連ではまた、上記分化過程の初期だけでなく中期や後期で選別されるＬ１ＣＡＭ陽性細胞（「中期Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞」及び「後期Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞」）でもよく、初期Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞、中期Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞及び後期Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞の対比において、神経前駆細胞と（成熟）神経細胞の比率が変わるうえに、それぞれのＬ１ＣＡＭ陽性細胞の細胞特性は、Ｌ１ＣＡＭを発現している点では同じであるが、その他の特性は若干変化している。とりわけ初期Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、ｉｎ　ｖｉｖｏで最も高い軸索伸長を示す。
　大脳皮質細胞からのＬ１ＣＡＭ陽性細胞の分離方法として、例えば、サイズや密度による細胞分画を利用する方法（例えば分離膜の使用、遠心分離など）、誘導泳動やフィールドフロー分画を利用する方法（例えば、細胞の電気特性や屈曲性の利用）、アフィニティーを利用する方法（例えば、モノクローナル抗体が結合した蛍光色素や磁気ビーズを用いるフローサイトメトリーなど）を挙げることができる。好ましくは、フローサイトメーターを利用する蛍光活性化セルソーティング（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ；ＦＡＣＳ）、磁気細胞分離装置を利用する磁気活性化セルソーティング（Ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ；ＭＡＣＳ）などの細胞選別法（「セルソーティング」）である。
　ＦＡＣＳでは、特定の細胞表面マーカーであるタンパク質に対する抗体と結合した蛍光標識を用いてラベル化した標的細胞を含む細胞集団懸濁液をフローセル内に通してレーザー光を照射し、標的細胞からの特定の散乱光および蛍光のパラメータの特性に基づいて標的細胞を選別することができる。
　ＭＡＣＳでは、細胞集団懸濁液の中の標的細胞を、特定の細胞表面マーカーであるタンパク質に対する抗体と結合した磁気標識を用いてラベル化することによって、磁力により磁気標識された標的細胞を選別することができる。
　細胞選別に使用されるモノクローナル抗体（例えば抗Ｌ１ＣＡＭ抗体など）としては、市販のマウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体などを使用してもよいし、あるいは、ヒトＬ１ＣＡＭタンパク質などの標的マーカータンパク質をマウスやラットに免疫し、免疫した動物から、脾臓を取り出し、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの融合剤を使用してミエローマ細胞（例えばＰ６）と融合を行い、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地で融合細胞（ハイブリドーマ）を選抜し、この細胞を培養して目的の抗体を得ることを含む周知のモノクローナル抗体作製技術を利用してもよい。
　蛍光物質は、特に限定されないが、例えばＦＩＴＣ（フルオレセイン・イソチオシアネート）、Ｒ−フィコエリトリン（Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ；ＲＰＥ）などを含むことができる。
　磁性ビーズとしては、可磁化物質（例えばＦｅ_３Ｏ_４、γＦｅ_２Ｏ_３）の表面を、例えば官能基を有する高分子ポリマー等の材料でコーティングされたものが使用されうる。
　本発明の方法において、Ｌ１ＣＡＭを用いる細胞選別は、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞である、ＣＴＩＰ２^＋ＤＬＮおよび／またはＣＴＩＰ２^＋ＤＬＮ前駆細胞の濃縮に有用である。また一方、この選別によって分離されるＰＡＸ６^＋ＮＳＣ（神経幹細胞）は、例えば抗ＰＡＸ６抗体を使用したセルソーティングによって他の細胞（例えば、多能性幹細胞）から分離することができる。
　本発明の方法はまた、腫瘍形成や神経細胞過剰増殖が認められないことから、神経幹細胞や、場合により多能性幹細胞などの幹細胞を実質的に含まないＬ１ＣＡＭ陽性細胞を取得することを可能にする（図７Ｇ）。一方、神経幹細胞を多能性幹細胞から分離することも可能にする。
４．Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞
　本発明の第２の態様により、上記３．に記載した本発明の方法によって得られるもの、Ｌ１ＣＡＭ陽性神経前駆細胞および／またはＬ１ＣＡＭ陽性成熟神経細胞を主成分として含み、かつ幹細胞を含まないか、または全細胞数の１０％以下の神経幹細胞を含むもの、ならびに、被験体の大脳皮質および／または大脳皮質脊髄路に投与（例えば、注入もしくは移植）されたとき、軸索伸長を起こし、および大脳皮質運動ニューロン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｐｉｎａｌ　ｍｏｔｏｒ　ｎｅｕｒｏｎ；ＣＳＭＮ）を生成するものである、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞を提供する。ある実施形態では、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、軸索を少なくとも錐体交叉に投射する。
　一実施形態において、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、大脳皮質細胞への分化誘導過程の初期、中期または後期のＬ１ＣＡＭ陽性細胞を主成分として含む細胞集団であり、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞中の神経前駆細胞および成熟神経細胞の割合は分化誘導期間に応じて変化する。初期Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は前駆細胞の割合がより高く、一方、中期および後期Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は前駆細胞と成熟細胞の割合がおよそ同等レベルであるか、あるいは成熟細胞の割合がより高くなる。
　本発明のＬ１ＣＡＭ陽性細胞について、上記３．に記載した本発明の方法に従って作製された、Ｌ１ＣＡＭマーカーを指標にして分離された全細胞数の例えば９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または９９．５％以上がＬ１ＣＡＭ陽性細胞であり、全細胞（１００％）がＬ１ＣＡＭ陽性細胞であることが好ましい。Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞を主成分として含む細胞集団中の他の細胞には、例えば神経幹細胞を含むＬ１ＣＡＭ陰性細胞、好ましくは神経幹細胞からなるＬ１ＣＡＭ陰性細胞が含まれてもよい。Ｌ１ＣＡＭ陰性細胞、例えば神経幹細胞は、全細胞数の１０％以下、５％以下、１％以下、０．１％以下、０．０１％以下又は０．００１％以下の割合で含まれていてもよいが、不含有であることが好ましい。
　Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、一実施形態において、Ｌ１ＣＡＭ陽性神経前駆細胞を主成分として含む細胞集団である。このとき、細胞集団中に、Ｌ１ＣＡＭ陽性成熟神経細胞は含まれていてもよいし、含まれなくてもよい。場合により、Ｌ１ＣＡＭ陰性細胞、例えば神経幹細胞が、全細胞数の１０％以下、５％以下、１％以下、０．１％以下、０．０１％以下又は０．００１％以下の割合で含まれていてもよいが、不含有であることが好ましい。
　Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、一実施形態において、Ｌ１ＣＡＭ陽性神経前駆細胞を、例えば５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上含み、好ましくはＬ１ＣＡＭ陰性細胞もしくは幹細胞（例えば、神経幹細胞）を含まない細胞集団である。
　Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、一実施形態において、Ｌ１ＣＡＭ陽性成熟神経細胞を、例えば５％以下、１０％以下、２０％以下、３０は％以下、４０％以下、または５０％以下含み、好ましくはＬ１ＣＡＭ陰性細胞もしくは幹細胞（例えば、神経幹細胞）を含まない細胞集団である。
　あるいは、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、一実施形態において、Ｌ１ＣＡＭ陽性成熟神経細胞を主成分として含む細胞集団である。このとき、細胞集団中に、Ｌ１ＣＡＭ陽性神経前駆細胞は含まれていてもよいし、含まれなくてもよい。場合により、Ｌ１ＣＡＭ陰性細胞、例えば神経幹細胞が、全細胞数の１０％以下、５％以下、１％以下、０．１％以下、０．０１％以下又は０．００１％以下の割合で含まれていてもよいが、不含有であることが好ましい。
　Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、一実施形態において、Ｌ１ＣＡＭ陽性成熟神経細胞を、例えば５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上含み、好ましくはＬ１ＣＡＭ陰性細胞もしくは幹細胞（例えば、神経幹細胞）を含まない細胞集団である。
　Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、一実施形態において、Ｌ１ＣＡＭ陽性神経前駆細胞を、例えば５％以下、１０％以下、２０％以下、３０は％以下、４０％以下、または５０％以下含み、好ましくはＬ１ＣＡＭ陰性細胞もしくは幹細胞（例えば、神経幹細胞）を含まない細胞集団である。
　本発明のＬ１ＣＡＭ陽性細胞は、次のような特長を有する。
　第１に、ｉｎ　ｖｉｖｏでレシピエントの大脳皮質および／または大脳皮質脊髄路への投与（例えば、移植もしくは注入）により、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、大脳皮質および／または大脳皮質脊髄路に生着し、軸索／神経線維の伸長を起こすことができる。例えば、本発明のＬ１ＣＡＭ陽性細胞は、軸索／神経線維を錐体交叉へ投射／伸長することができる。このような投射／伸長は、初期、中期または後期Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞、好ましくは初期Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞の投与によって高頻度で認められる。
　第２に、ｉｎ　ｖｉｖｏでレシピエントの大脳皮質および／または大脳皮質脊髄路への投与により、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、Ｌ１ＣＡＭ陰性細胞と比べて大脳皮質運動ニューロン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｐｉｎａｌ　ｍｏｔｏｒ　ｎｅｕｒｏｎ；ＣＳＭＮ）の数を顕著に（例えば、約５~１０倍、もしくはそれ以上）増加させることができる（図６Ｆ）。
　第３に、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、ＣＴＩＰ２陽性およびＮＲＰ１陽性である。あるいは、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、Ｃｔｇｆ、Ｔｂｒ２およびＰａｘ６遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子と比べて、Ｎｒｐ１、Ｃｔｉｐ２およびＲｅｌｎ遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子をより高いレベル（相対比、例えば、約２~７もしくは、それ以上）で発現する（図１１、図１２）。
　第４に、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、ＮＲＰ１陽性細胞を含む細胞集団である（図１１、図１２）。
　第５に、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、ＣＴＩＰ２^＋深層ニューロン（ＤＬＮ）および／またはＣＴＩＰ２^＋ＤＬＮ前駆細胞である。
　Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、凍結保存によって保存することが可能である。細胞を凍結するときには、細胞内で氷晶形成がなく細胞傷害や細胞死を防止することができるような凍結速度で凍結を行うのがよい。凍結は、一般的な冷媒または装置、例えば液体窒素、ディープフリーザー（例えば−８０℃まで冷却可能）などを用いて行うことができる。凍結の際、凍結保存培地中に、例えばグリセロール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの凍結保護剤を添加するとよい。凍結保護剤の含有量は、限定されないが、例えば約２~１０ｖｏｌ％とすることができる。凍結温度は、例えば−８０℃、−１９７℃などの、細胞凍結保存で通常使用される温度としうる。
５．Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞を含む細胞製剤
　本発明は、第３の態様により、上記４．に記載したＬ１ＣＡＭ陽性細胞を有効成分として含む、被験体における大脳皮質障害を治療するための細胞製剤を提供する。
　あるいは、上記態様の変形として、本発明は、上記４．に記載したＬ１ＣＡＭ陽性細胞を有効成分として含む、被験体における大脳皮質障害および／または大脳皮質脊髄路障害の治療への使用のための細胞製剤を提供する。
　あるいは、上記態様の別の変形として、本発明は、有効成分としての上記４．に記載したＬ１ＣＡＭ陽性細胞の、被験体における大脳皮質障害および／または大脳皮質脊髄路障害を治療するための細胞製剤の製造における使用を提供する。
　本明細書における「細胞製剤」は、治療剤、医薬品、医薬組成物などの用語と代替的に置換することができる。
　製剤中のＬ１ＣＡＭ陽性細胞は、一個体、一投与または一バイアルあたりの治療上有効量として、限定されないが、細胞数で例えば１×１０^４以上、５×１０^４以上、１×１０^５以上、５×１０^５以上、１×１０^６以上、５×１０^６以上、１×１０^７以上、５×１０^７以上、１×１０^８以上、５×１０^８以上、１×１０^９以上、５×１０^９以上などである。
　本明細書における「有効量」は、大脳皮質障害および／または大脳皮質脊髄路障害の症状を軽減または改善するのに十分に有効な量を指す。
　細胞製剤には、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞を懸濁するための生体適合性塩類溶液、例えば生理食塩水、緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）などの薬学上許容されうる担体を含むことができる。
　Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞は、輸送時には通常、凍結形態であり、使用時（例えば移植時）に解凍し、好ましくは、例えば遠心分離法によって液体部を上記担体と置換する。細胞が凍結形態の場合には、上記４．で記載したように、凍結保護剤を含有する凍結保存培地に細胞が懸濁されているため、移植の際には培地や保護成分を除去し、生体適合性塩類溶液と置換する必要がある。
　大脳皮質障害および／または大脳皮質脊髄路障害として、以下のものに限定されないが、例えば、虚血や頭部外傷等による神経細胞欠損、脳梗塞、脳卒中、神経変性疾患（例えばパーキンソン病、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン舞踏病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、アルツハイマー病など）、脳腫瘍、多発性硬化症、てんかんなどが挙げられる。
　細胞製剤にはさらに、神経幹細胞を含むことができる。神経幹細胞は、例えば上記３で分離された神経幹細胞（すなわち、天然もしくは人工大脳皮質細胞から分離された神経幹細胞）である。一般に、神経幹細胞は、神経前駆細胞および神経細胞（すなわち、ニューロン）、ならびに、グリア前駆細胞、アストロサイト及びオリゴデンドロサイトに分化することができる。神経幹細胞の含有量は、非限定的に、細胞製剤中の全細胞数の、例えば、０．００１％以上、０．０１％以上または０．１％以上、かつ１０％以下、５％以下または１％以下とすることができる。
　細胞製剤は、大脳皮質内に、例えば適切なゲージの注射針等の器具を用いて、あるいは外科手術によって、投与（例えば、注入もしくは移植）することができる。その際、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞の用量および投与法については、例えば上記および下記６．に記載のとおりであり、被験体の年齢、性別、体重、障害の種類や症状、重症度などによって、医師が適切と思われるものを適宜選択することができる。
　本明細書における「被験体」は、哺乳動物であり、哺乳動物には、非限定的に、例えばヒト、ペット動物（例えばイヌ、ネコなど）、観賞用動物（例えば動物園で飼育される動物）などであり、好ましくはヒトである。
６．大脳皮質障害および／または大脳皮質脊髄路障害の治療方法
　本発明は、第４の態様により、大脳皮質障害および／または大脳皮質脊髄路障害をもつ被験体の大脳皮質および／または大脳皮質脊髄路の障害部位またはその周辺領域に、上記５．に記載したＬ１ＣＡＭ陽性細胞を含む細胞製剤を投与することを含む、被験体において大脳皮質障害および／または大脳皮質脊髄路障害を治療する方法を提供する。
　用量、大脳皮質障害および／または大脳皮質脊髄路障害等については、上記５．に記載したとおりである。
　本発明の治療方法は、一実施形態により、障害を受けた例えば運動回路、皮質−皮質間神経回路などを再構築するために使用することができる。大脳皮質脊髄路障害（例えば、虚血や頭部外傷等による神経細胞の欠損、脳梗塞、脳卒中、神経変性疾患、脳腫瘍、虚血、頭部外傷など）のために例えば運動機能が著しく低下した被験体に、本発明の細胞製剤を投与することによって、運動機能を改善することができる。あるいは、大脳皮質障害（例えば、虚血、脳梗塞、脳卒中、神経変性疾患、脳腫瘍、てんかんなど）のために、運動、知覚（視覚、触覚、聴覚、嗅覚、味覚など）、判断、思考、言語、人格、感情などの高次脳機能が著しく低下した被験体に、本発明の細胞製剤を投与することによって、前記高次脳機能を改善することができる。
　本発明の細胞製剤を被験体の脳に移植する場合、自己移植でもよいし、あるいは他家移植でもよい。上記１．に記載したように、本発明の細胞製剤中の細胞集団が由来する大脳皮質細胞は、多能性幹細胞から分化誘導によって作製することができるが、この場合、多能性幹細胞は、自己の体細胞から誘導することができるし、あるいは非自己の体細胞から誘導することができる。拒絶反応を回避するためには、自己細胞に由来する大脳皮質細胞を使用することが望ましいが、ヒトの場合、白血球の型「ＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ）」が類似したヒトの体細胞から作製されたｉＰＳ細胞から誘導された大脳皮質細胞を使用することによって拒絶反応を抑制することができる。
　本発明の細胞製剤は、上記の投与量にて、非限定的に、例えば１週間に１回、２週間に１回、１か月間に１回、３か月に１回、６か月に１回、１２か月に１回などの投与回数で被験体に投与しうる。投与は、侵襲性であるため、投与回数は少ない方が好ましいが、必要に応じて、上記例示の期間内の回数を複数回（例えば２~５回）としてもよい。
　また、本発明の細胞製剤の大脳皮質障害部位またはその周辺領域への移植は、例えば、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ．，３４４：７１０−７１９（２００１）に記載されるような手法によって行うことができる。具体的には、例えば、被験体の頭部に開けた小穴から注射針を用いて患部周辺に細胞を移植することができる。
　大脳皮質に移植されたＬ１ＣＡＭ陽性細胞を含む細胞製剤は、大脳皮質に生着し、軸索／神経線維の伸長を起こし、例えば軸索／神経線維を錐体交叉へ投射／伸長して、大脳皮質運動ニューロン（ＣＳＭＮ）の数を増加することができる。ＣＳＭＮは脳の皮質第Ｖ層中に存在し、その一次運動野には巨大なＢｅｔｚ細胞があり、その錐体路（皮質脊髄路）を形成することから、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞を含む細胞製剤を移植することにより、障害を受けた運動回路を再構築することができる。このため、本発明の細胞製剤は、大脳皮質脊髄路障害によって、例えば運動機能が著しく低下した被験体の運動機能を改善もしくは回復するために有用である。また、神経幹細胞は、大脳皮質を構成するすべての神経細胞に分化することが可能であるため、大脳皮質障害による運動、知覚（視覚、触覚、聴覚、嗅覚、味覚など）、判断、思考、言語、人格、感情などの高次脳機能の低下の改善に有用である。

　本発明をさらに以下の実施例を参照しながら具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例によって制限されないものとする。
　なお、以下の参考実施例１および２は、本出願人による国際公開ＷＯ２０１６／１６７３７２号の明細書中、実施例３および４に記載された大脳皮質細胞の分化誘導の具体例を示す。
［参考実施例１］
大脳皮質細胞の分化誘導（方法１）
　Ｌａｍｉｎｉｎ５１１Ｅ８を用いてフィーダーフリー条件で培養したｉＰＳ細胞（８３６Ｂ１、京都大学（京都、日本）作製）をＡｃｃｕｍａｘ（登録商標）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，米国）を用いて解離させ、９６ウエルプレート（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ−ｃｏａｔ９６ｗｅｌｌプレート）に１ウエルあたり９×１０^３個を移し、５０μＭ　Ｙ−２７６３２、１０μＭ　ＳＢ４３１５４２、１０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ、１０ｎＭ−５０ｎＭ　Ｃ５９、０．１μＭ　ＬＤＮ１９３１８９、１０％ＫＳＲ、０．１ｍＭ　ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．１ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、浮遊培養を行った（分化誘導開始、０日目）。３日後、培地交換に際して、Ｙ−２７６３２を含有しない同培地へ交換した（３日目）。３日後、１０ｎＭ−５０ｎＭ　Ｃ５９、０．１μＭ　ＬＤＮ１９３１８９、１０％ＫＳＲ、０．１ｍＭ　ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．１ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭ　Ｌ−グルタミン（Ｇｌｎ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２へ培地を交換した（６日目）。以後、３日毎に同じ培地に交換し、分化誘導開始から１８日間培養を行った（１８日目）。
　１８日目の培地を半量吸引除去し、Ｂ２７、２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎ、および、１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌを除去した量だけ添加した。同様に、２１日目においても半量の培地を交換した。２４日目において、ペトリディッシュへ細胞を移し、以後、３または４日毎に半量の培地を交換した。４６日目にて、得られた細胞において、ＣｏｕｐＴＦ１およびＣｔｉｐ２に対する抗体を用いて免疫染色を行ったところ、ＣｏｕｐＴＦ１およびＣｔｉｐ２の発現を確認した。以上より、１８日目以降においても浮遊培養によって、所望の大脳皮質運動野に存在する大脳皮質細胞（神経細胞）が誘導できることが確認された。
［参考実施例２］
大脳皮質細胞の分化誘導（方法２）
　分化誘導前日に１０μＭ　Ｙ２７６３２を培養液へ添加して培養したｉＰＳ細胞（８３６Ｂ１）をＳＮＬ　ｆｅｅｄｅｒ上から分離させるためにＣＴＫでＳＮＬ細胞を除去した後、Ａｃｃｕｍａｘを用いて解離させ、９６ウエルｐｌａｔｅ（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ−ｃｏａｔ　９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ）に１ウエルあたり９×１０^３個を移し、５０μＭ　Ｙ−２７６３２、１０μＭ　ＳＢ４３１５４２、１０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ、各種Ｗｎｔ阻害剤（Ｃ５９　５０ｎＭ，ＬＧＫ−９７４　１００ｎＭ，ＩＣＧ−００１　１μＭ（Ｃｅｌｌａｇｅｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））、１００ｎＭ　ＬＤＮ１９３１８９、１０％ＫＳＲ、０．１ｍＭ　ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．１ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、浮遊培養を行った（分化誘導開始、０日目）。３日後、培地交換に際して、Ｙ−２７６３２を含有しない同培地へ交換した（３日目）。３日後、各種ＷＮＴ阻害剤（Ｃ５９，ＬＧＫ−９７４，ＩＣＧ−００１）、１００ｎＭ　ＬＤＮ１９３１８９、１０％ＫＳＲ、０．１ｍＭＭＥＭ非必須アミノ酸、０．１ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２へ培地を交換した（６日目）。以後、３日毎に同じ培地に交換し、分化誘導開始から１８日間培養を行った（１８日目）。
　１８日目の培地を半量吸引除去し、Ｂ２７、２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎ、および、１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン及びストレプトマイシンを添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌを除去した量だけ添加した。同様に、２１日目においても半量の培地を交換した。２４日目において、ペトリディッシュへ細胞を移し、以後、３または４日毎に半量の培地を交換した。４６日目にて、得られた細胞において、ＣｏｕｐＴＦ１およびＣｔｉｐ２に対する抗体を用いて免疫染色を行ったところ、Ｃｔｉｐ２の発現が確認された。また、ＣｏｕｐＴＦ１陰性でＣｔｉｐ２陽性細胞の誘導効率はＣ５９と類似の作用をもつＬＧＫ−９７４において、大きな違いはなかったが、Ｃ５９と異なる作用をもつＩＣＧ−００１においては、著しく低かった。以上より、Ｃ５９と類似の作用をもつＷＮＴ阻害剤ＬＧＫ−９７４を利用しても、所望の大脳皮質運動野に存在する大脳皮質細胞（神経細胞）が誘導できることが確認された。
［実施例１］
大脳皮質細胞からのＬ１ＣＡＭマーカーの選択およびＬ１ＣＡＭ陽性細胞の分離
［Ｉ．材料および方法］
＜１．動物＞
　動物実験はすべて京都大学の動物実験ガイドライン（京都、日本）、実験室動物資源研究所の実験室動物の取扱と利用（ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ　ｆｏｒ　Ｃａｒｅ　ａｎｄ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）に関するガイドライン（ＩＬＡＲ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，米国）、および研究における動物に関するガイドライン：インビボ実験の報告（ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ａｎｉｍａｌｓ　ｉｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）（ＡＲＲＩＶＥ）に従って実施した。１６週齢の雌ヌードラット（Ｆ３４４／ＮＪｃ１−ｒｎｕ／ｒｎｕ）はＣＬＥＡジャパン（東京、日本）から入手した。また、３日齢のマウス（Ｃ．Ｂ−１７／ｌｃｒＨｓｄ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ）、９週齢の雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒＳｌｃ）およびＥ１４．５マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒＳｌｃ、Ｃ５７ＢＬ／６　６−Ｔｇ）はともに清水実験材料（株）（京都、日本）から入手した。すべての動物は日中照明する条件（明、１２時間／暗、１２時間）で飼育され、標準食餌と水が自由に与えられた。
＜２．成体動物への移植＞
　上記動物をイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）（インターベット（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ，Ｉｎｃ．）、東京、日本）で麻酔し、各ドナー脳左半球の脳梁上の、０．５~２．０ｍｍ外側から正中まで、ならびに、０．５~２．０ｍｍ吻側から前頂まで、運動野を吸引した。吸引後７日目に、ＧＦＰトンスジェニックマウスからＥ１４．５マウス前頭皮質を単離し、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，米国）を用いて３７℃１０分間皮質を酵素により消化した。２ｍＭ　Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ；Ｍｅｒｃｋ、東京、日本）、０．１ｍＭ　２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ；富士フィルム、東京、日本）、１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｎ２サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、東京、日本）、２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｂ−２７サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ペニシリン−ストレプトマイシン（ＰＳ；Ｍｅｒｃｋ）および１０μＭ　Ｙ−２７６３２（富士フィルム、東京、日本）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（富士フィルム、東京、日本）中、細胞密度を１μｌあたり１０×１０^４細胞に調整した。その細胞懸濁液（１部位あたり２μｌ）を宿主の病変部の内腔に投与した。選別した細胞凝集塊を病変部の腔内に投与したとき、最上級表面をもつ９６ウエルプレート（住友ベークライト、東京、日本）中で、２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎ、０．１ｍＭ　２−ＭＥ、１％　Ｎ２アプリメント、２％　Ｂ−２７サプリメント、１％　ＰＳおよび１０μＭ　Ｙ−２７６３２を含有する２００μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２中１ウエルあたり２×１０^４細胞の密度で、選別した細胞を再び平板培養した。２日後、細胞凝集体を２０×１０^４細胞（約７~１１細胞凝集塊）に調整し、宿主の病変部の内腔に入れた。移植後、動物を犠牲にし、免疫組織化学研究用に作製された。
＜３．新生仔マウスへの移植＞
　最上級表面をもつ９６ウエルプレート中で、２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎ、２％Ｂ−２７サプリメント、１％ＰＳ、２０ｎｇ／ｍｌ　ＢＤＮＦ（富士フィルム、東京、日本）、１０ｎｇ／ｍｌ　ＧＤＮＦ（富士フィルム、東京、日本）および３０μＭ　Ｙ−２７６３２を含有する２００μｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ（ＮＢ；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中１ウエルあたり３×１０^４細胞の密度で、選別したヒトｉＰＳ細胞を再平板培養した。３~４日後、選別した細胞凝集塊（ｓｐｈｅｒｅ）を、Ａｃｃｕｍａｘを用いて解離し、１μｌあたり１５~２０×１０^４細胞の密度に調整した。新生仔マウスを氷上で新生仔マウスを冷麻酔した。細胞懸濁液（１部位あたり０．５μｌ）を、運動野（前頂から、前部１．８ｍｍ；側部１．１ｍｍ；垂直部，０．７ｍｍ）中に３２ゲージ針（伊藤製作所、静岡、日本）を介して定位固定した状態で投与した。投与後、投与部位の尾側に２６ゲージ針を用いて皮質病変を作った。移植後の２か月目に、マウスを犠牲にし、免疫組織化学的研究用に作製した。
＜４．逆行性標識＞
　Ｆａｓｔ　Ｂｌｕｅ（ＦＢ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，米国）およびコレラ毒素Ｂ　サブユニット（ＣＴＢ；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を逆行性標識分析のために用いた。マウス皮質または選別細胞を移植した動物においてラベル化するために、４％（ｖｏｌ／ｗｔ）ＦＢ、４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ジメチルスルホキシド（Ｍｅｒｃｋ）および人工脳脊髄液（Ｈａｒｖａｒｄ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ，米国）を含有するＦＢ溶液を、動物の犠牲７日前に錐体交叉内に投与した。マウス脳の投射ニューロン内をラベル化するために、０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ；富士フィルム、東京、日本）を含有するＣＴＢを、動物の犠牲６日前に、大脳皮質（前頂から、前部０．５ｍｍ；側部２．５ｍｍ；垂直部１．０ｍｍ）、線条体（前頂から、前部０．５ｍｍ；側部２．０ｍｍ；鉛直部２．５ｍｍ）および外側中隔（前頂から、前部０．５ｍｍ；側部０．１ｍｍ；垂直部２．５ｍｍ）内に投与した。
＜５．免疫染色＞
　脳切片を染色するために、マウス皮質または選別細胞を移植した動物をペントバルビタール（東京化成工業、東京、日本）を用いて犠牲にし、一晩４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；富士フィルム、東京、日本）を灌流し、その後、一晩、それぞれＰＢＳ中の１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクロースおよび２０％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクロース（ナカライテスク、京都、日本）と置換した。固定した脳を、ＯＣＴ化合物（サクラファインテックジャパン、東京、日本）中に包埋し、クリオスタット（ＣＭ−３０５０；Ｌｅｉｃａ　Ｉｎｃ．）を用いて厚さ３０μｍに薄切した。脳切片を、使用するまで、−２０℃で、３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エチレングリコール（富士フィルム、東京、日本）、３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロール（ナカライテスク、京都、日本）、０．２４３％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＮａＨ_２ＰＯ_４、０．８７４％（ｗｔ／ｖｏｌ）Ｎａ_２ＨＰＯ_４および０．３４％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＮａＣｌを含有する蒸留水（ＤＷ；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に入れた。細胞凝集塊を染色するために、この細胞凝集塊を、１５分間４％ＰＦＡを用いて灌流し、その後、一晩、ＰＢＳ中の１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクロースと置換した。固定した細胞凝集塊をＯＣＴ中に包埋し、クリオスタットを用いて厚さ２０μｍに切断した。切片を、ＭＡＳをコートしたスライドガラス（松浪硝子工業、大阪、日本）の表面上に付着し、使用するまで−２０℃で保存した。培養した細胞を染色するために、細胞を、１５分間、４％ＰＦＡを用いて灌流し、ＰＢＳで洗浄した。固定した細胞を、使用するまで４℃で保存した。
　サンプルを、３０分間、２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（ＰＢＳＴ；ナカライテスク、京都、日本）を含有するＰＢＳ中で透過処理した。ブロッキング前、マイクロウェーブオーブン中で５分間加熱することを含む抗原回収法を抗Ｋ１６７抗体（１：５００；＃ＮＣＬ−ＫＩ６７Ｐ，Ｌｅｉｃａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ，英国）に対し使用した。その後、サンプルを４％（ｗｔ／ｖｏｌ）Ｂｌｏｃｋ　Ａｃｅ（大日本住友製薬、東京、日本）および０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含有するＰＢＳで３０分間ブロックした。第１抗体を４％（ｗｔ／ｖｏｌ）Ｂｌｏｃｋ　Ａｃｅを含有する０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＰＢＳＴで希釈し、４℃で一晩インキュベーションした。サンプルを、室温（ＲＴ）で６０分間、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＰＢＳＴで洗浄し、４％（ｗｔ／ｖｏｌ）Ｂｌｏｃｋ　Ａｃｅを含有する０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＰＢＳＴ中の第２抗体と一緒にインキュベーションし、その後、０．１％ＰＢＳＴで洗浄し、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と一緒に室温で５分間インキュベーションした。最後に、サンプルを、４４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ナカライテスク、京都、日本）、２２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロール（富士フィルム、東京、日本）、０．０２％（ｗｔ／ｖｏｌ）１，４−ジアザビシクロ［２，２，２］オクタン（ＤＡＢＣＯ；富士フィルム、東京、日本）および０．０９％（ｗｔ／ｖｏｌ）Ｍｏｗｉｏｌ　４−８８試薬（Ｍｅｒｃｋ）を含有する蒸留水を用いて封入した。
　第１抗体は、以下のものを使用した。すなわち、抗ＧＦＰ抗体（１：１，０００；＃５９８、医学生物学的研究所、名古屋、日本、および１：１，０００；＃０４４０４−２６、ナカライテスク、京都、日本）、抗ＣＴＩＰ２抗体（１：２００；＃１２１２０Ｓ、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、東京、日本、および１：１，０００；＃ａｂ１８４６５、Ａｂｃａｍ　Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，米国）、抗ＦＯＸＧ１抗体（１：５００；＃ａｂ１８２５９、Ａｂｃａｍ）、抗ＧＳＨ２抗体（１：５，０００；Ｄｒ．Ｍｏｔｏｔｓｕｇｕ　Ｅｉｒａｋｕ（ＲＩＫＥＮ，ＣＤＢ）からの恵与）、抗Ｍ２抗体（１：１００；＃ＡＢ５３１７８５、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｓｔｕｄｉｅｓ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｂａｎｋ（ＤＳＨＢ））、抗Ｍ６抗体（１：１００；ＡＢ２１４９６０７，ＤＳＨＢ）、抗ＲＥＥＬＩＮ（１：５００；＃ＮＢ６００−１０８１、Ｎｏｖｕｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ，米国）、抗Ｌ１ＣＡＭ抗体（１：１，０００；＃ＭＡＢ５６７４，Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，米国；１：５００；＃５５４２７３，ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，カナダ）、抗ＮＲＰ１抗体（１：５００；＃ＮＰ２１１１，ＥＣＭ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｅｒｓａｉｌｌｅｓ，ＫＹ，米国）、抗ＴＢＲ２抗体（１：５００；＃ａｂ２３３４５，Ａｂｃａｍ）、抗ＰＡＸ６抗体（１：１，０００；ＰＲＢ−２７８Ｐ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，米国；１：５００；＃５６１４６２，ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＵＸ１抗体（１：２００；＃ｓｃ−１３０２４，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，ＣＡ，米国）、抗ＣＯＵＰ−ＴＦ１抗体（１：１，０００；＃ＰＰ−Ｈ８１３２−００，Ｐｅｒｓｅｕｓ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、東京、日本）、抗ＳＴＥＭ１２１抗体（１：１，０００；＃Ｙ４０４１０、タカラバイオ、滋賀、日本）、抗ＮＥＳＴＩＮ抗体（１：１，０００；＃ＭＡＢ５３２６，Ｍｅｒｃｋ）、抗ＴＵＪ１抗体（１：２，０００；＃ＰＲＢ４３５Ｐ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ならびに抗ＴＢＲ１抗体（１：１，０００；＃ＡＢ１０５５４，Ｍｅｒｃｋ）。また、Ａｌｅｘａ蛍光結合抗体類（１：５００；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を第２抗体として使用した。
＜６．ＣＴＩＰ２：ＧＦＰノックイン（ＫＩ）ｍＥＳ細胞系の作製＞
　ＣＴＩＰ２：ＧＦＰ　ＫＩターゲティングベクターを、ｐＢＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ｐｏｌｙＡ−ｎｅｏ−ＤＴＡを用いて構築した。具体的には、Ｃｔｉｐ２遺伝子第４エクソンのＯＲＦ領域を含む４ｋｂ５’アームゲノム断片およびＣｔｉｐ２遺伝子ストップコドンのすぐ下流の３．５ｋｂ３’アーム断片を、鋳型として１２９ＳＶゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲによって増幅し、さらにｐＢＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ｐｏｌｙＡ−ｎｅｏ−ＤＴＡのＮｏｔＩ／ＸｈｏＩ部位およびＳａｌＩ／ＳｐｅＩ部位に別々にクローニングして上記ターゲティングベクターを作製した。ＣＴＩＰ２：ＧＦＰ　ＫＩ　ＥＳ細胞を、標準の手順に従い１２９ＳＶＥＶ胚性幹細胞系中に相同組換えによって作製し、さらにＰＣＲによって遺伝子型を確認した。Ｎｅｏカセットの存在は類似のＢｃｌ１１ｂ−ＹＦＰＫＩマウスでレポーター遺伝子発現に影響を及ぼさなかったため（Ｋｕｅｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１７：９５６−９６５，２０１６）、本発明者らは、以下の実験でＮｅｏカセットを含むＣＴＩＰ２：ＧＦＰ　ＫＩ　ＥＳ細胞を使用した。
＜７．細胞培養＞
　マウスＥＳ（ｍＥＳ）細胞（ＥＢ５；継代回数３５~４５）およびＣＴＩＰ２：ＧＦＰ　ＫＩ　ｍＥＳ細胞（継代回数１１~２１）が、２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｍｅｒｃｋ）、１％ＰＳ、０．１ｍＭ　２−ＭＥ、２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎ、２，０００Ｕ／ｍｌ白血病阻止因子（ＬＩＦ；Ｍｅｒｃｋ）、および１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ヌクレオシド（Ｍｅｒｃｋ）を補充したＫｎｏｃｋＯｕｔ　ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、有糸分裂が不活性化されたマウス胚線維芽細胞フィーダー層上に維持された。培養培地のすべてを毎日新鮮な培地と交換した。皮質ニューロンの誘導のために、マウスＥＳ細胞を、最上級表面をもつ９６ウエルプレート（住友ベークライト、東京、日本）中、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＫｎｏｃｋＯｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１ｍＭ　ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＮＥＡＡ；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１ｍＭ　２−ＭＥ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム溶液（Ｐｙｒｕｖａｔｅ；Ｍｅｒｃｋ）、および２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎを補充したＧＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する分化培地中で、１ウエルあたり９，０００細胞の密度で再び平板培養した。さらに、１０μＭ　ＳＢ−４３１５４２（Ｍｅｒｃｋ、ＴＧＦ−β阻害剤）と２５０ｎｇ／ｍｌ　ＤＫＫ１（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）もしくは２０ｎＭ　ＷＮＴ−Ｃ５９（Ｃｅｌｌａｇｅｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，米国；ＷＮＴ阻害剤）とを６日目までに添加した。６日目に、ＧＭＥＭから、０．１ｍＭ　２−ＭＥ、２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎ、１％　Ｎ２サプリメント、および２％Ｂ−２７サプリメントを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（富士フィルム、東京、日本）に交換した。３日毎に、培地の半分を新鮮な上記培地と置換した。
　ヒトｉＰＳ細胞（１０３９Ａ１；継代回数１５~２５）を、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１（ニッピ、東京、日本）をコートした６ウエルプレート上、１ウエルあたり１．５~３．０×１０^４細胞の密度で、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ（リプロセル、神奈川、日本）と一緒に維持した。神経細胞分化を開始したとき、ヒトｉＰＳ細胞を、Ａｃｃｕｍａｘを用いて単一細胞に解離し、その後、最上級表面をもつ９６ウエルプレート中、２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎ、０．１ｍＭ　２−ＭＥ、０．１ｍＭ　ＮＥＡＡ、１５％ＫＳＲ、２０ｎＭ　ＷＮＴ−Ｃ５９、および１００ｎＭ　ＬＤＮ１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，米国）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む分化培地中で、１ウエルあたり９，０００細胞の密度で維持した。アノイキス（ａｎｏｉｋｉｓ）を避けるために、３日目までに５０μＭ　Ｙ−２７６３２を添加した。さらに、１０μＭ　ＳＢ−４３１５４２および５ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を６日目までに添加した。１８日目に、培地を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２から２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎ、２％Ｂ−２７サプリメント、および１％ＰＳを補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ（ＮＢ；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に交換した。３日毎に培地の半分を新鮮な培地と置換した。
＜８．多能性幹細胞（ｈＥＳ細胞またはｈｉＰＳ細胞）からＬ１ＣＡＭ陽性細胞を含む大脳皮質細胞集団への分化誘導＞
　分化誘導のための条件の概略を図１４に示す。また、分化誘導の手順の詳細を以下に記載する。
１．ｈＥＳ分化培地（０日目~１７日目に使用する）
・ＧＭＥＭ　５００ｍＬ
・非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）　６．６ｍＬ
・ピルビン酸ナトリウム　６．６ｍＬ
・ＫＳＲ　１２７ｍＬ
・２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）（０．１Ｍ）　６６０μＬ
・ペニシリン（Ｐｅｎ）／ストレプトマイシン（Ｓｔｒｅｐ）　５ｍＬ
２．２−ＭＥ（０．１Ｍ）の調製
・２−ＭＥ　５０μＬ
・ＰＢＳ　７．０５ｍＬ
３．ＳＢ　４３１５４２（１０ｍＭ）の調製
・ＳＢ　４３１５４２　１０ｍｇをエタノール２．６ｍＬで溶解する。
・２００μＬ×１３本に分注し、−３０℃に保存する。
４．ＩＷＲ１ｅ（ＩＷＲ−１−ｅｎｄｏ；ＣＡＳ　ｎｕｍｂｅｒ　１１２７４４２−８２−３）（３０ｍＭ）の調製
・ＩＷＲ１ｅ１０ｍｇをＤＭＳＯ８１０μＬで溶解する。
・４０μＬ×２０本に分注し、−３０℃に保存する。
５．ｈＥＳ分化培地（１８日目から使用する）
・ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＧｌｕｔａＭＡＸ　５００ｍＬ（ｇｉｂｃｏ＃１０５６５−０１８）
・ＣＤ　Ｌｉｐｉｄ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ　５ｍＬ（ｇｉｂｃｏ　＃１１９０５−０３１）
・Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ　５ｍＬ（ｇｉｂｃｏ　＃１５１４０−１２２）
・アンホテリシン（Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ）Ｂ　５００μＬ（ｇｉｂｃｏ　＃１５２９０−０１８）
＜分化誘導０日目（１ディッシュ→２プレート）＞
　準備および手技１、２は次のとおりである。
１．準備
・ｈＥＳ維持培地
・ｈＥＳ分化培地
・解離液、ＴｒｉｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ
・ＤＮａｓｅ、Ｙ−２７６３２（５ｍＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０ｍＭ）、ＩＷＲ１ｅ（３０ｍＭ）
２．手技１
１）解離液を室温で解凍し、遠心機で遠心分離する。
２）維持培地２０ｍＬを３７℃に加温する。
３）直径１０ｃｍの培養ディッシュ（ｄｉｓｈ）１枚をゼラチン７ｍＬでコートし、室温で１５分静置する。
４）ｈＥＳＣｓまたはｈｉＰＳＣｓディッシュをＰＢＳ１２ｍＬで洗浄×２（２５ｍＬオートピペット使用）を行う。
５）解離液１．５ｍＬ（７５０μＬ×２）を添加し、インキュベーションを８分（３７℃、２％ＣＯ_２）行う。
６）解離液を１ｍＬ除去する。
７）ＤＮａｓｅ２μＬを添加し、手で叩いて剥がす。
８）維持培地２ｍＬ（１ｍＬ×２）を添加し、ピペッティング（１０００μＬピペットマン使用）を行い、１５ｍＬチューブへ回収する。これにより、２ｍＬ×４回、計８ｍＬのコロニー液を作成する。
９）遠心分離を２分（４℃、１０００ｒｐｍ）行う。
１０）上清を除去し、タッピングを行い、維持培地を７ｍＬ添加する。
１１）Ｙ−２７６３２　１４μＬを添加する（最終濃度１０μＭ）。
１２）コートしたディッシュのゼラチンを除去し、コロニー液７ｍＬを播種する（１０ｍＬオートピペット使用）。
１３）インキュベーションを１．５~２時間（３７℃、２％ＣＯ_２）行う。
（ＭＥＦ細胞を分離するため）
３．手技２
１）分化培地１３ｍＬ（回収用）を加温し、同培地２０ｍＬ（培養用）も室温に戻し、遠心機で遠心分離する。
２）ＴｒｉｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　２ｍＬにＤＮａｓｅ７．５μＬ、Ｙ−２７６３２　２４μＬ（１２ｍＬで１０μＭとなる。）を添加し、室温まで加温する。
３）コロニー液７ｍＬを回収し、１５ｍＬチューブに移す（１０ｍＬオートピペット使用）。
４）維持培地３ｍＬでコロニーを追加回収する（コロニー液：計１０ｍＬ）。
５）遠心分離を１分（４℃、１０００ｒｐｍ）行う。
６）上清を除去し、タッピングを行い、ＰＢＳ１０ｍＬを添加する。
７）遠心分離を１分（４℃、１０００ｒｐｍ）行う。
８）上清を除去し、タッピングを行い、ＴｒｉｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　２ｍＬを添加する。
９）３７℃で５分加温し、前半の３分は手で振盪する。
１０）分化培地（回収用）１ｍＬを添加し、ピペッティングを１０回行う。
１１）分化培地（回収用）９ｍＬを添加する（計：１２ｍＬ）。
１２）遠心分離を５分（４℃、１０００ｒｐｍ）行う。
１３）上清を除去し、タッピングを行い、分化培地２ｍＬを添加する。
１４）Ｙ−２７６３２　８μＬを添加する（最終濃度２０μＭ）。
１５）細胞数をカウントし、１８０万細胞（９０万細胞／プレート）となる細胞液量を計算する。
１６）細胞液を加える分だけ、まず分化培地２０ｍｌの量を減らし、細胞液を添加する。
１７）Ｙ−２７６３２　２００μＬ（最終濃度５０μＭ）、ＳＢ４３１５４２　１０μＬ（最終濃度５μＭ）、ＩＷＲ１ｅ　２μＬ（最終濃度３μＭ）を添加する。
１８）９６ウエルプレートに播く。
１９）インキュベーションを行う（３７℃、５％ＣＯ_２）。
＜分化誘導３日目＞
　手順は次のとおりである。
１）分化培地１０ｍＬプレートを３７℃に加温する。
２）ＳＢ４３１５４２：５μＬ／プレート（最終濃度５μＭ）、ＩＷＲ１ｅ：１μＬ／プレート（最終濃度３μＭ）を添加する。
３）９６ウエルプレートに１００μＬ／ウエルずつ加える（これにより、２００μＬ／ウエルとなる）。
４）インキュベーション（３７℃、５％ＣＯ_２）を行う。
＜分化誘導６日目＞
　手順は次のとおりである。
１）分化培地８ｍＬ／プレートを３７℃に加温する。
２）ＳＢ４３１５４２：４μＬ／プレート（最終濃度５μＭ）、ＩＷＲ１ｅ：０．８μＬ／プレート（最終濃度３μＭ）を添加する。
３）９６ウエルプレートから１２５μＬ／ウエルを除去し、８０μＬ／ウエルを添加する（およそ１５０μＬ／ウエルとなる）。
４）インキュベーション（３７℃、５％ＣＯ_２）を行う。
＜分化誘導９、１２および１５日目＞
　手順は次のとおりである。
１）分化培地８ｍＬプレートを５０ｍＬチューブに入れ、３７℃に加温する。
２）ＳＢ４３１５４２：４μＬ／プレート（最終濃度５μＭ）、ＩＷＲ１ｅ：０．８μＬ／プレート（最終濃度３μＭ）を添加する。
３）９６ウエルプレートから７５μＬ／ウエルを除去し、８０μＬ／ウエルを添加する。
４）インキュベーション（３７℃、５％ＣＯ_２）を行う。
＜分化誘導１８日目＞
　準備および手順は次のとおりである。
１．準備
・分化培地（１８日目から使用する、「Ｎ２−培地」）
・Ｎ２サプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、＃１７５０２−０４８、５ｍＬ）
・１０ｃｍＥＺＳＰＨＥＲＥ（ＡＧＣ、＃４０２０−９００、１４，０００ウエル／ディッシュ）
２．手順
１）Ｎ２−培地（１８日目から使用する）１２ｍＬ／プレートを３７℃に加温する。
２）２００μＬピペットマン（広口チップ）で凝集塊（ｓｐｈｅｒｅ）をＥＺＳＰＨＥＲＥへ回収する。
３）２００μＬピペットマン（通常チップ）で培地を除去する。
４）Ｎ２−培地にＮ２サプリメント１２０μＬ／プレートを添加し、ＥＺＳＰＨＥＲＥへ添加する。
５）インキュベーション（３７℃、４０％Ｏ_２、５％ＣＯ_２）を行う。
＜分化誘導２１日目以降（３日に１回）＞
　準備および手順は次のとおりである。
１．準備
・分化培地（１８日目から使用する、「Ｎ２−培地」）
・Ｎ２サプリメント
・ＦＢＳ（最終濃度１０％）、ヘパリン（最終濃度５μｇ／ｍＬ）、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（最終濃度１％）（いずれも、３５日目から使用する）
２．手順
１）Ｎ２−培地１２ｍＬ／プレートを３７℃に加温する。
２）Ｎ２サプリメント１２０μＬ／プレートを添加する。
３）１０００μＬピペットマンで旧培地を除去する。
４）２５ｍＬオートピペットで新培地を添加し、凝集塊（ｓｐｈｅｒｅ）を満遍なく配置する。
５）インキュベーション（３７℃、４０％Ｏ_２、５％ＣＯ_２）を行う。
＜９．定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）＞
　全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）またはＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｃｒｏ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてマウス胚および培養細胞から抽出した。Ｓｕｐｅｒ　Ｓｃｒｉｐｔ　ＩＩＩ　Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｃＤＮＡを合成した。ｑＰＣＲを、ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（タカラバイオ、滋賀、日本）を用いて、ならびに、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ、滋賀、日本）を用いて行った。データは、デルタ−デルタＣｔ法を用いて解析し、Ｇａｐｄｈレベルによって正規化した。プライマーをｐｒｉｍｅ３　ｐｌｕｓ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）を用いて設計し、その配列は以下のとおりである。
ｍＧａｐｄｈ：

ｍＦｏｘｇ１：

ｍＲｅｅｌｉｎ：

ｍＣｔｉｐ２：

ｍＣｕｘ１：

ｍＮｒｐ１：

ｍＣｔｇｆ：

ｍＴｂｒ２：

ｍＰａｘ６：

ｈＧａｐｄｈ：

ｈＯｃｔ４：

ｈＮａｎｏｇ：

ｈＰａｘ６：

ｈＮｒｐ１：

ｈＣｔｉｐ２：

ｈＬ１ＣＡＭ：

＜１０．細胞選別＞
　細胞懸濁液を、Ａｃｃｕｍａｘを用いて調製し、その後、細胞を、２％ＦＢＳ、２０ｍＭ　Ｄ（＋）−グルコース（富士フィルム、東京、日本）、および１％ＰＳを含有するＰＢＳ中に再懸濁した。サンプルを抗Ｌ１ＣＡＭ抗体で２０分間染色した。第１抗体との反応後、サンプルをＡｌｅｘａ蛍光結合抗体（１：４００）で２０分間染色した。死細胞は、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ；ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でラベル化した。細胞選別を、ＦＡＣＳ　Ａｒｉａ　ＩＩ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行い、データをＦＡＣＳ　Ｄｉｖａソフトウエア（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって解析した。
　選別後、マウス細胞を、２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎ、１％Ｎ２サプリメント、２％Ｂ−２７サプリメント、１％ＰＳ、２０ｎｇ／ｍｌ　ＢＤＮＦ（富士フィルム、東京、日本）、１０ｎｇ／ｍｌ　ＧＤＮＦ（富士フィルム、東京、日本）、および３０μＭ　Ｙ−２７６３２を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。一方、ヒト細胞を、２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎ、２％Ｂ−２７サプリメント、１％ＰＳ、２０ｎｇ／ｍｌ　ＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍｌ　ＧＤＮＦ、および３０μＭ　Ｙ−２７６３２を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ（ＮＢ；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で培養した。
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ研究のために、選別した細胞を、ポリ−Ｌ−オルニチン（５０μｇ／ｍｌ，Ｍｅｒｃｋ）、ラミニン（５μｇ／ｍｌ，Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびファイブロネクチン（５μｇ／ｍｌ，Ｍｅｒｃｋ）でコートされた、かつ区画を有する細胞培養スライド（ｃｈａｍｂｅｒｅｄ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｌｉｄｅｓ；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で培養した。ｉｎ　ｖｉｖｏ研究のために、選別した細胞を、低細胞接着性の９６ウエルプレート内で１ウエルあたり３×１０^４細胞の密度で再び平板培養した。それぞれ、３日毎に、培養培地の半分を新鮮な培地で置換した。
＜１１．ＥｄＵ取り込みアッセイ＞
　固定の２時間前に、培地中に１０μＭ　ＥｄＵ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。ＤＮＡへのＥｄＵ取り込みの検出をＣｌｉｃｋ−ｉＴ　Ｐｌｕｓ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。固定した細胞を、室温で３０分間、０．３％ＰＢＳＴと一緒にインキュベーションした。製造業者の指示に従ってＣｌｉｃｋ−ｉＴ反応カクテルを調製し、サンプルを３０分間Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ反応カクテルと一緒にインキュベーションした。洗浄後、サンプルを免疫染色手順に掛けた。
＜１２．マイクロアレイ分析＞
　全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔを用いて抽出した。サンプルを、ＧｅｎｅＣｈｉｐ　Ｍｏｕｓｅ　Ｇｅｎｅ１．０ＳＴ　Ａｒｒａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いるマイクロアレイ分析に掛けた。アレイをＭｉｃｒｏａｒｒａｙ　Ｓｃａｎｎｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒｅ，ＣＡ）を用いてスキャンした。データの解析には、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウエアプログラム（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。プローブセットの発現シグナルはＲＭＡ１６を用いて算出した。マイクロアレイデータは、登録番号ＧＳＥ７２８７５でＧｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ　ｄａｔａｂａｓｅ）から入手可能である。
＜１３．蛍光ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）＞
　マウス胚を、４℃で一晩、４％ＰＦＡを含有するＰＢＳ中で固定した。固定したサンプルを、４℃で一晩、１５％スクロースを含有するＰＢＳ中で脱水した。その後、サンプルを、クリオスタット（ｃｒｙｏｓｔａｔ）を用いて１５μｍの厚さの切片にし、ＭＡＳをコートしたスライドガラス（松浪硝子工業、大阪、日本）上に付着した。ＲＮＡＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）を、ＲＮＡｓｃｏｐｅ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｖ２　ｋｉｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，米国）を用いて行った。サンプルスライドを３分間標的賦活化バッファ中で煮沸し、３分間９９．５％エタノール（富士フィルム、東京、日本）中ですすぎ、空気中で乾燥した。サンプルスライドを４０℃１５分間プロテアーゼ消化に掛け、その後、該スライドを４０℃２時間ＲＮＡｓｃｏｐｅオリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｔｉｐ２，ＮＭ＿０２１３９９．２）と一緒にインキュベーションした。ハイブリダイゼーション後、サンプルスライドをそれぞれＡＭＰ１およびＡＭＰ２と一緒に４０℃３０分間インキュベーションした。その後、サンプルスライドをＡＭＰ３と一緒に４０℃１５分間インキュベーションした。最後に、サンプルスライドを４０℃３０分間ＯＰＡＬ　５９０（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｊａｐａｎ　Ｃｏ，Ｌｔｄ．、横浜、日本）でラベル化した。この反応を、４０℃３０分間ＨＲＰブロッカーで止めた。洗浄後、サンプルスライドを免疫染色手法に掛けた。
＜１４．画像およびデータ解析＞
　画像を蛍光顕微鏡（ＢＺ−９０００；キーエンス，大阪，日本）、Ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ６０００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）、および共焦点レーザー顕微鏡（Ｆｌｕｏｖｉｅｗ　ＦＶ１０００Ｄ；オリンパス）を用いて視覚化した。細胞数を測定するために、少なくとも３つの独立したサンプルについて免疫陽性細胞を手動でカウントし、各マーカーについて陽性細胞のパーセンテージを計算した。グラフト中への免疫陽性細胞の数を、グラフト全体にわたり６切片毎に定量し補正した。グラフトの数を測定するために、低倍率のＧＦＰ画像をＢＺ−ＩＩ　Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウエア（キーエンス）中に入れて、グラフト全体にわたり６切片毎に定量した。概算されたグラフト体積を脳スライスの厚さに基づいて計算した。グラフトを含む捉えた画像を用いて神経突起の長さを計算した。グラフト由来の神経突起を、ＧＦＰもしくはＳＴＥＭ１２１の発現に基づいて同定した。線維の全長を、Ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて定量した。線維総数は、各領野内に手動でカウントされた。
＜１５．統計分析＞
　統計分析は、ソフトウエアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ　７；ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて行った。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験およびｉｎ　ｖｉｖｏ実験からのデータを、Ｓｔｕｄｅｎｔ　ｔ−ｔｅｓｔまたはｏｎｅ−ｗａｙ　ＡＮＯＶＡとＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較テストとを用いることによって解析した。データは、ｐ＜０．０５であるとき統計的に有意であるとみなし、また平均±標準誤差（ＳＥＭ）として示された。データはすべて少なくとも３つの独立した実験から得られた。
［ＩＩ．実験と結果］
＜１．グラフト由来ＣＴＩＰ２^＋深層ニューロン（ＤＬＮ）は成体脳の脳脊髄に投射する＞
　グラフトの移植後、軸索を脳脊髄に投射する細胞の特性を調べるために、胎生（Ｅ）１４．５日のＧＦＰノックイン（ＫＩ）マウス（Ｏｋａｂｅ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＢＳ　ｌｅｔｔｅｒｓ４０７：３１３−３１９，１９９７）から皮質を単離し、その細胞を成体マウスの脳病変部の腔（ｌｅｓｓｉｏｎ　ｃａｖｉｔｙ）内に移植した。移植後２か月目に、ＧＦＰの発現に基づきＧＦＰ^＋細胞を同定した（図１Ａ，Ｂ）。皮質脊髄路（ｃｏｒｔｉｃｏｓｐｉｎａｌ　ｔｒａｃｔ、ＣＳＴ）と共にＧＦＰ標識線維（例えば、脳梁（Ｃｃ）、内包（Ｉｃ）、橋（Ｐｏ）、延髄（Ｍｏ）および錐体交叉（Ｐｙｘ））が見いだされた（図１Ｃ）。しかし、脳脊髄に投射するタイプの細胞はよく知られていない。このことを検証するために、中枢神経系（ＣＮＳ）内のニューロンをラベルする逆行性軸索トレーサーであるファストブルー（Ｆａｓｔ　Ｂｌｕｅ；ＦＢ）を、動物を安楽死させる前の７日間、錐体交叉に投与した。安楽死後、宿主脳の皮質第Ｖ層中のＣＳＴ構成成分である明るくラベルされたＦＢ^＋大脳皮質運動ニューロン（ＣＳＭＮ）が認められた。興味深いことに、グラフトの周囲にＧＦＰ^＋／ＦＢ^＋細胞が認められ、これらの細胞はまた、皮質第Ｖ層中に局在した（図１Ｄ）。これらの知見に基づいて、本発明者らは、ＧＦＰ^＋／ＦＢ^＋細胞がＣＳＭＮの特性を有するという仮説を立てた。この仮説を確認するために、ｉｎ　ｖｉｖｏで脊髄にＣＳＭＮ軸索投射する発生で重要な役割を果たすことが知られているＣＴＩＰ２に対しＧＦＰとの二重免疫染色を行った（Ａｒｌｏｔｔａ　Ｐ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ　４５：２０７−２２１，２００５）。従って、すべてのＧＦＰ^＋／ＦＢ^＋細胞がＣＴＩＰ２で染色されたことから、ＣＴＩＰ２がグラフト由来ＣＳＭＮのマーカーの一つであることが示唆された（図１Ｅ）。
＜２．マウス胚性幹（ＥＳ）細胞から分化誘導されたＣＴＩＰ２^＋細胞はＣＳＭＮの特性を有する＞
　ＣＴＩＰ２^＋細胞の特性を検証するために、ＣＴＩＰ２：ＧＦＰ　ＫＩ　ｍＥＳ細胞を作製した。ＣＴＩＰ２は、成体の大脳皮質中に弱く発現し、また胎生期の例えば大脳基底核、中脳および小脳中で発現される（Ｍ，Ｉｓｈｍａｅｌ　ＪＥ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒ　Ｐａｔｔｅｒｎｓ　４：７３３−７３９，２００４）。皮質誘導の効率を高めるために、分化の最初の６日目にＷＮＴ阻害剤、ＤＫＫ１またはＷＮＴ−Ｃ５９、を前脳皮質に添加した（図２Ａ）（Ｍｏｔｏｎｏ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　Ｔｒａｎｓｌ　Ｍｅｄ　５：５５２−５６０，２０１６）。凝集塊の大きさが徐々に増加し、ＧＦＰ発現が１２日目から凝集塊の周囲で検出可能になった（図２Ｂ）。ＣＴＩＰ２^＋／ＣＯＵＰ−ＴＦ１⁻前脳皮質が、コントロールと比べてより高い頻度で、ＤＫＫ１またはＷＮＴ−Ｃ５９で処理された凝集塊中で認められた（８３．２±２．５％（ＤＫＫ１）または８８．５±３．８％（ＷＮＴ−Ｃ５９）対６６．９±３．８％（コントロール）；ｎ＝４；図８）。これらの理由およびＤＫＫ１より安価のために、以下の実験ではＷＮＴ−Ｃ５９を使用した。予備的な遺伝子発現分析により、Ｆｏｘｇ１（終脳前駆体）、Ｒｅｅｌｉｎ（第Ｉ層）、Ｃｔｉｐ２（第Ｖ／ＶＩ層）およびＣｕｘ１（第ＩＩ／ＩＩＩ／ＩＶ層）の発現が、分化後、徐々に増加することが示された（図２Ｃ）。１２日目に凝集塊の免疫染色を行い、その結果、ＧＦＰシグナルの局在がＣＴＩＰ２^＋細胞およびＦＯＸＧ１^＋細胞と一致し、外側基底核原基のマーカーであるＧＳＨ２^＋細胞と一致しないことが示された（図２Ｄ）。これらの結果は、ＣＴＩＰ２^＋ＤＬＮが使用した条件でｍＥＳ細胞から誘導可能であることを示した。
　分化誘導されたＣＴＩＰ２^＋ＤＬＮが脳内に生着し、かつそれらの軸索を脳脊髄標的に投射するかどうかを検証するために、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）によって１２日目にｍＥＳ細胞からＣＴＩＰ２：ＧＦＰ^＋細胞を単離した。２日後、ＣＴＩＰ２：ＧＦＰ^＋細胞の凝集塊を、成体ヌードラットの病変部の内腔に投与した。移植後３か月目に、錐体交叉中にＦＢを投与し、そして７日後、ラットを犠牲にした。まずマウスの神経細胞またはアストロサイトの細胞膜に特異的マーカーであるＭ２およびＭ６の発現に基づいて生着細胞を同定した。Ｍ２^＋／Ｍ６^＋細胞中にＦＢ^＋細胞が認められたことから、ＣＴＩＰ２：ＧＦＰ^＋細胞がＣＳＭＮの特性をもつことが示された（図２Ｅ）。
＜３．マウスＥＳ細胞から誘導されたＣＴＩＰ２^＋細胞の遺伝子発現プロファイル＞
　ＣＴＩＰ２^＋細胞の細胞表面マーカーを確定するために、１２日目にＣＴＩＰ２：ＧＦＰ　ＫＩ　ｍＥＳ細胞の細胞選別を行ったのち、細胞をマイクロアレイ分析に掛けた。ＣＴＩＰ２産生細胞を、ＦＡＣＳによって、ＣＴＩＰ２：ＧＦＰが陽性的または陰性的に発現される細胞に分離した（図９Ａ）。１２日目にＣＴＩＰ２：ＧＦＰ^＋細胞とＣＴＩＰ２：ＧＦＰ⁻細胞との間で遺伝子発現プロファイルを比較したところ、ＣＴＩＰ２：ＧＦＰ^＋細胞集団において、３２４遺伝子が２倍以上（≧２）の発現上昇したことが示された（図９Ｂ）。この基準では、ＣＴＩＰ２：ＧＦＰ^＋細胞集団内で発現が有意に増加した遺伝子類にはＣｔｉｐ２遺伝子が含まれていた。ＣＴＩＰ２：ＧＦＰ^＋がアップレギュレーションされた遺伝子をＧｅｎｅ　Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）分析により分類したところ、２５遺伝子が膜タンパク質をコードすることが示された。ＦＡＣＳ使用をサポートしないようであるドメイン内で発現されることが知られている候補遺伝子は本実験から排除された（例えば、シナプス間隙で発現されるＧｒｉａ１およびＧｉｒａ２）。最終的に、本発明者らは、細胞表面抗原をコードし細胞体中で発現する３つの遺伝子、すなわちＲｏｕｎｄａｂｏｕｔ　ｇｕｉｄａｎｃｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ２（Ｒｏｂｏ２）、Ｅｒｂ−ｂ２　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　４（Ｅｒｂｂ４）およびＬ１　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ（Ｌ１ＣＡＭ）を選択した（図９Ｃ）。
　発達する皮質では、Ｒｏｂｏ２は、細胞接着分子の免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、分泌型ＳＬＩＴリガンドと結合することによってガイダンス受容体として作用する（Ｈｏｌｍｅｓ　ＧＰ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｃｈ　Ｄｅｖ　７９：５７−７２，１９９８、Ｈｏｌｍｅｓ　ＧＰ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ　４２：２１３−２２３，２００４）。Ｒｏｂｏ２は、中間帯（ＩＺ）内で明瞭に発現される。中間帯では、予想される介在ニューロン（ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎｓ）と投射ニューロン（ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ　ｎｅｕｒｏｎｓ）が脳室帯（ＶＺ）および脳室下帯（ＳＶＺ）から皮質板（ＣＰ）に接線方向に移動する（Ａｎｄｒｅｗｓ　ＷＤ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ａｎａｔ　２１１：１８８−１９８，２００７、Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｎｄｉｔｏ　Ｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　２７：３３９５−３４０７，２００７）。
　Ｅｒｂｂ４は、Ｉ型受容体チロシンキナーゼサブファミリーのメンバーであり、細胞増殖、移動および分化に関与する可能性がある（Ｂｕｒｄｅｎ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ　１８：８４７−８５５，１９９７、Ａｄｌｋｏｆｅｒ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｌｉａ　２９：１０４−１１１，２０００、Ｂｕｏｎａｎｎｏ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ　１１：２８７−２９６，２００１）。発達する皮質では、Ｅｒｂｂ４は、ＩＺ内で発現される（Ｙａｕ　ＨＪ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｒｅｂ　Ｃｏｒｔｅｘ　１３：２５２−２６４，２００３）。このタンパク質は、成人の大脳皮質で、パルブアルブミン（ｐａｒｖａｌｂｕｍｉｎ）^＋介在ニューロン内および他のＧＡＢＡ作動性介在ニューロンのサブセット内で優先的に発現される。
　Ｌ１ＣＡＭは、６つの免疫グロブリンドメインと５つのフィブロネクチンＩＩＩ型リピートからなる膜貫通糖タンパク質である（Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ　Ｍ，Ａｎｎ　Ｎ　Ｙ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　６３３：１０５−１１２，１９９１）。哺乳動物では、Ｌ１ＣＡＭの発現は神経系を介して認められ、ならびに発生期の軸索の成長やガイダンスに、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞と軸索との相互作用に、神経細胞の移動に、神経細胞の生存に、シナプス形成および髄鞘形成に関与する（Ｂｉｘｂｙ　ＪＬ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１０７：３５３−３６１，１９８８、Ｌｉｎｄｎｅｒ　Ｊ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３０５：４２７−４３０，１９８３、Ｃｈｅｎ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ　３８：４２８−４３９，１９９９）。Ｌ１ＣＡＭのｍＲＮＡは、発達する皮質由来のＣＰ内で強く発現され、ＩＺ内で強く発現されない。さらに、このタンパク質の発現は、成人の皮質第Ｖ層内に特異的に局在する（Ｍｕｎａｋａｔａ　Ｈ　ｅｔ　ａｌ．，ＢＭＣ　ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　４：７，２００３）。これらの特徴的な違いに基づいて、本発明者らは、以下の実験においてＬ１ＣＡＭに注目した。
＜４．Ｌ１ＣＡＭはＥ１４．５マウス皮質内のＣＴＩＰ２^＋ＤＬＮに対する細胞表面マーカーである＞
　免疫組織化学分析により、Ｌ１ＣＡＭの発現は辺縁帯（ＭＺ）（Ｒｅｌｎ^＋；図３Ａ），ＣＰ（ＦＯＸＧ１^＋およびＣＴＩＰ２^＋；図３Ｂ，Ｃ）ならびにＩＺ（ＮＲＰ１^＋；図３Ｄ）で認められたが、この発現は、マウスの発達する皮質内の、ＳＶＺ（ＴＢＲ２^＋；図３Ｅ）で部分的に認められ、あるいは、ＶＺ（ＰＡＸ６^＋；図３Ｆ）でほとんど認められなかった。本発明者らの実験では、ＣＴＩＰ２^＋細胞はＩＺ内で強くラベル化されなかった。
　ＣＴＩＰ２がＥ１４．５マウス前脳皮質のＩＺ内で発現されるかどうかを検証するために、Ｌ１ＣＡＭに対する免疫染色と組み合わせて、Ｃｔｉｐ２ＲＮＡプローブを用いた蛍光ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を行った。Ｃｔｉｐ２シグナルは、ＣＰ内で強く発現されるが、ＩＺ内でわずかに発現され、ＶＺ内で発現されなかった（図１０）。これらの結果は、ＣＴＩＰ２^＋ＤＬＮおよび／またはＣＴＩＰ２^＋ＤＬＮ前駆細胞が細胞選別によりＬ１ＣＡＭ陽性（Ｌ１ＣＡＭ^＋）細胞として濃縮可能であることを示した。
　この仮説を証明するために、Ｅ１４．５マウスの前脳皮質を分離したのち、ＦＡＣＳによって非選別細胞、Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞およびＬ１ＣＡＭ陰性（Ｌ１ＣＡＭ⁻）細胞を単離した。免疫蛍光法により、ＣＴＩＰ２^＋細胞が、Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞集団で、他の細胞集団（非選別およびＬ１ＣＡＭ⁻）よりも高い頻度で認められた（それぞれ７５．８±５．０％対３６．４±２．９％対１３．９±２．７％；ｎ＝６；図４Ａ，Ｂ）。さらにまた、定量逆転写トランスクリプターゼポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）分析により、Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞が、Ｌ１ＣＡＭ⁻細胞と比べて比較的高レベルでＲｅｌｎ、Ｃｔｉｐ２およびＮｒｐ１　ｍＲＮＡを発現することが示された（図１１Ａ）。一方、Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞は、Ｌ１ＣＡＭ⁻細胞と比べて比較的低レベルでＣｔｇｆ、Ｔｂｒ２およびＰａｘ６ｍＲＮＡを発現した（図１１Ｂ）。さらにまた、選別した細胞の培養を継続し、２日目に免疫染色を行った。その結果、ＣＴＩＰ２^＋細胞は、Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞集団内で、他の細胞集団（非選別およびＬ１ＣＡＭ⁻）よりも高い頻度で認められた（それぞれ４７．２±２．０％対３２．９±４．０％対２４．５±２．１％，ｎ＝９，９および８；図４Ｃ，Ｄ）。一方、Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞集団は、非選別細胞集団またはＬ１ＣＡＭ⁻細胞集団と比べて、より少ないＥｄＵ^＋／ＰＡＸ６^＋増殖性細胞を含んでいた（それぞれ６．４±１．０％対１５．６±１．６％対２１．１±１．０％，ｎ＝９，９および８；図４Ｅ，Ｆ）。これらの結果は、Ｌ１ＣＡＭの発現に基づいた細胞選別がＣＴＩＰ２^＋ＤＬＮおよび／またはＣＴＩＰ２^＋ＤＬＮ前駆細胞を濃縮することができること、ならびに、Ｅ１４．５マウス前脳皮質においてＰＡＸ６^＋増殖性細胞を排除することができることを示した。
＜５．ｉｎ　ｖｉｖｏでＬ１ＣＡＭ^＋細胞は生着しＣＳＭＮに分化する＞
　ｉｎ　ｖｉｖｏでＬ１ＣＡＭ^＋細胞の生着および増殖を検証するために、Ｅ１４．５ＧＦＰ　ＫＩマウスから皮質を単離し、ＦＡＣＳを用いることによってＬ１ＣＡＭ^＋細胞集団とＬ１ＣＡＭ⁻細胞集団に分離した。選別の２日後に、選別した細胞の凝集塊を成体マウスの脳病変部の内腔に移植した。２か月間マウスを飼育した。犠牲する７日前に、ＦＢをマウスの錐体交叉に投与した。細胞の生着は、ＧＦＰ発現によって評価した（図５Ａ）。Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞グラフトのサイズは、Ｌ１ＣＡＭ⁻細胞グラフトのサイズよりかなり小さかった（それぞれ０．０９±０．０２ｍｍ^３対０．１８±０．０３ｍｍ^３；ｎ＝６；図５Ｂ）。グラフト線維の分布を研究するために、異なる脳領域中のＧＦＰ標識線維を調べた（図５Ｃ）。Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞線維（ｃｅｌｌ　ｆｉｂｅｒｓ）は、Ｌ１ＣＡＭ⁻細胞線維と比べて、内包および大脳脚（ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｐｅｄｕｎｃｌｅ）などのＣＳＴを介してより頻繁に認められた。一方、Ｌ１ＣＡＭ⁻細胞線維は、同側皮質（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ　ｃｏｒｔｅｘ）および同側線条体（ｉｐｓｉｌａｔｅｒａｌ　ｓｔｒｉａｔｕｍ）中でかなり増加していた（図５Ｄ）。グラフト中心を含むグラフト線維の全体の長さは、Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞グラフトとＬ１ＣＡＭ⁻細胞グラフトとではっきりと異なっていた（同側皮質：それぞれ９１８４±４７３１μｍ^２対２４６２８±２６７０μｍ^２，同側線条体：それぞれ３９２２±１０７５μｍ^２対３３７４０±３５６４μｍ^２；ｎ＝６）。これらの結果は、ｉｎ　ｖｉｖｏでＬ１ＣＡＭ^＋細胞がＳＣＰＮの特性をもつことを示唆した。
　この仮説を裏付けるために、抗ＣＴＩＰ２抗体および抗ＣＵＸ１抗体の両方を用いてグラフト成分を調べた。免疫組織化学的方法により、ＣＴＩＰ２^＋ＤＬＮがＬ１ＣＡＭ^＋細胞グラフト中でＬ１ＣＡＭ⁻細胞グラフトよりもより高い頻度で認められた（図６Ａ，Ｄ）。Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞グラフト内のＣＴＩＰ２^＋ＤＬＮの密度は、Ｌ１ＣＡＭ⁻細胞グラフトよりも高かった（図６Ｅ）。さらにまた、ＦＢ^＋ＣＳＭＮは、Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞グラフト中でＬ１ＣＡＭ⁻細胞グラフトと比較してより高い頻度で認められた（それぞれ１２５±４８細胞対１６±８細胞；ｎ＝６；図６Ｂ，Ｆ）。一方、Ｌ１ＣＡＭ⁻細胞グラフト中では、ＣＵＸ１^＋上層ニューロン（ＵＬＮ）がより高い頻度で認められた（図６Ｃ，Ｇ）が、その密度は、Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞グラフトと比較して有意な差はなかった（図６Ｈ）。
　さらに補足実験として、Ｌ１ＣＡＭ陰性細胞の移植により移植片周囲（特に同側皮質、同側線条体、同側外側中隔核）に軸索伸長を示したことから、これら投射部位に逆行性トレーサー（ＣＴＢ）を投与することにより、ＣＴＩＰ２およびＣＵＸ１マーカーの発現を用いて大脳皮質のどのような細胞が寄与するのかを調べた。同側皮質および同側線条体にＣＴＢを投与した場合はＵＬＮｓ（上層ニューロン）とＤＬＮｓ（深層ニューロン）の両方で標識細胞が認められたが、同側外側中隔核にＣＴＢを投与した場合はＵＬＮｓが優先的に標識された。これらの結果は、Ｌ１ＣＡＭ陰性細胞の移植によって周辺領域に神経軸索を伸ばしたのは、細胞選別によりＵＬＮｓが濃縮された結果であることを示す（図１３Ａ，Ｂ，Ｃ）。
＜６．ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導された初期Ｌ１ＣＡＭ陽性（Ｌ１ＣＡＭ^＋）細胞は宿主脳に効率的に組み込まれた＞
　ｈｉＰＳ細胞から分化誘導されたＬ１ＣＡＭ^＋細胞が、腫瘍を形成せずに宿主脳に組み込まれるかどうかを検証するために、先に報告された手順（Ｍｏｔｏｎｏ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．２０１６，上記）でｈｉＰＳ細胞から大脳オルガノイド（ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｏｒｇａｎｏｉｄ）を誘導した。予備的遺伝子発現の比較分析（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｔｅｍｐｏｒａｌ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ）により、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇ（いずれも多能性マーカー）の発現が徐々に減少したが、分化の際にＰａｘ６の発現が一過性に増加した（図１２Ａ）。Ｎｒｐ１およびＣｔｉｐ２の発現は徐々に増加した。さらにまた、凝集塊（ｓｐｈｅｒｅ）の免疫蛍光分析により、１２日目にＮＥＳＴＩＮ^＋／ＰＡＸ６^＋神経幹細胞（ＮＳＣ）が認められることが示された（図１２Ｂ）。その後、ＦＯＸＧ１^＋終脳前駆体（ｔｅｌｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）が凝集塊内への細根と共に認められた（図１２Ｃ）。４８日目に、ＤＬＮマーカー（例えばＣＴＩＰ２およびＴＢＲ１）が凝集塊の周囲に明らかに認められた（図１２Ｄ）。この条件で、１８日目以降、Ｌ１ｃａｍの発現が増加した（図１２Ｅ）。免疫蛍光分析により、１８日目に、Ｌ１ＣＡＭおよびＰＡＸ６が凝集塊内での明確な発現パターンを示すことが明らかになった（図７Ａ）。同様に、Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞の局在は、凝集塊内でＫＩ６７^＋細胞と一致しなかった（図７Ｂ）。その後、３０日目にＬ１ＣＡＭ^＋細胞がＰＡＸ６^＋細胞の周囲に認められた（図７Ｃ）。さらに成熟化すると、Ｌ１ＣＡＭの発現パターンは２つのタイプに分けられた（図７Ｄ）。すなわち、濃い領域はＩＺ様構造を示し、薄い領域はＣＰ様構造を示す。抗Ｌ１ＣＡＭ抗体を用いる細胞選別がＣＴＩＰ２^＋ＤＬＮの濃縮およびＰＡＸ６^＋ＮＳＣの排除に寄与するかどうかを検証するために、１８日目にＦＡＣＳによってｈｉＰＳ細胞からＬ１ＣＡＭ^＋細胞とＬ１ＣＡＭ⁻細胞を単離した。選別後２日目に、免疫染色により、ＣＴＩＰ２^＋細胞がＬ１ＣＡＭ^＋細胞内に濃縮されるが、一方ＰＡＸ６^＋細胞はＬ１ＣＡＭ⁻細胞内に濃縮されることが明らかになった（図７Ｅ）。これらの結果は、Ｌ１ＣＡＭを用いる細胞選別がＣＴＩＰ２^＋ＤＬＮの濃縮に有用であり、ならびにＰＡＸ６^＋ＮＳＣ（神経幹細胞）の分離に有用であることを示した。
　最後に、分化過程の異なる時点（初期、中期および後期）での、ｈｉＰＳ細胞から誘導されたＬ１ＣＡＭ^＋細胞の生着と軸索伸長を検証した。Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞は、１７日目、３０日目および３７日目にｈｉＰＳ細胞から選別された。３~４日後（すなわち、それぞれ２０日目、３４日目、４１日目）、選別した細胞凝集塊を、２カ月間、出生後のＳＣＩＤマウスの前脳皮質内に投与した。ＳＴＥＭ１２１（ヒト細胞質マーカー）に対する免疫染色により、グラフト移植した細胞が宿主脳内に生着することが明らかになった（図７Ｆ）。これらのグラフトのサイズは著しく小さく（＜０．００１ｍｍ^３）、各グループ（群）間で有意な差はなかった（図７Ｇ）。しかしながら、軸索伸長が、初期Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞から誘導されたグラフトにおいて、他のタイミングのグループ（群）と比べて、より高い頻度で認められた。初期Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞線維だけが宿主脳の錐体交叉に到達した（図７Ｈ）。統計学的解析により、初期Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞のグラフト線維が、他のタイミングのグループ（群）と比べて、線条体（Ｓｔｒ）、内包（Ｉｃ）、大脳脚（Ｃｐ）、錐体交叉（Ｐｙｘ）および視床（Ｔｈａ）などの大脳下標的に沿ってより高い頻度で認められた（図７Ｉ）。これらの結果は、ｈｉＰＳ細胞から誘導された初期Ｌ１ＣＡＭ^＋細胞が生着し、腫瘍を形成することなく宿主脳内に効率よく組み込まれたことを示した。
＜７．ヒトＥＳ細胞から分化誘導されたＬ１ＣＡＭ陽性（Ｌ１ＣＡＭ^＋）細胞＞
　上記［Ｉ．材料および方法］の項目８および図１４に記載の手順にしたがって、ヒトＥＳ細胞（Ｋｈ−ＥＳ１）からＬ１ＣＡＭ^＋細胞を含むヒト大脳オルガノイドを分化誘導した。
　その結果、分化誘導４５日目の時点でオルガノイド内に複数のロゼッタ構造が認められた（図１５）。ロゼッタは、内側が神経幹細胞（ＰＡＸ６、赤）、外側が成熟神経細胞（ＣＴＩＰ２、緑）で構成されている（図１６）。さらに、ロゼッタ構造の周辺部でＬ１ＣＡＭ^＋細胞の発現を確認することができた（図１７）。

　本発明の細胞製剤は、大脳皮質障害および／または大脳皮質脊髄路障害を治療するために、あるいは、前記障害による運動、知覚機能などの高次脳機能の顕著な低下を改善または前記機能を回復するために、あるいは、例えば脳梗塞や頭部外傷後に欠損した大脳皮質および／または大脳皮質脊髄路に対する補充療法のために有用である。

Claims (17)

1. 　哺乳動物由来の大脳皮質細胞から、細胞表面マーカーＬ１ＣＡＭを指標にしてＬ１ＣＡＭ陽性細胞を分離し回収することを含む、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞を取得する方法。
2. 　前記大脳皮質細胞が、哺乳動物由来の多能性幹細胞から分化誘導された大脳皮質細胞である、請求項１に記載の方法。
3. 　前記大脳皮質細胞が、哺乳動物由来の大脳組織あるいは大脳オルガノイドの中間帯および／または皮質板から分離された大脳皮質細胞である、請求項１に記載の方法。
4. 　前記Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞が、Ｌ１ＣＡＭ陽性神経前駆細胞および／またはＬ１ＣＡＭ陽性成熟神経細胞を主成分として含み、かつ幹細胞を含まないか、または全細胞数の１０％以下の神経幹細胞を含む、請求項１~３のいずれか１項に記載の方法。
5. 　前記Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞が、分化誘導期間が異なる初期、中期または後期Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞である、請求項２または４に記載の方法。
6. 　前記Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞が、被験体の大脳皮質および／または大脳皮質脊髄路に投与されたとき、軸索伸長を起こす、請求項１~５のいずれか１項に記載の方法。
7. 　前記Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞が、軸索を錐体交叉に投射する、請求項６に記載の方法。
8. 　前記Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞が、被験体の大脳皮質および／または大脳皮質脊髄路に投与されたとき、大脳皮質運動ニューロンを生成する、請求項１~７のいずれか１項に記載の方法。
9. 　前記分離を、セルソーティングによって行う、請求項１~８のいずれか１項に記載の方法。
10. 　請求項１~９のいずれか１項に記載の方法によって得られるもの、Ｌ１ＣＡＭ陽性神経前駆細胞および／またはＬ１ＣＡＭ陽性成熟神経細胞を主成分として含み、かつ幹細胞を含まないか、または全細胞数の１０％以下の神経幹細胞を含むもの、ならびに、被験体の大脳皮質および／または大脳皮質脊髄路に投与されたとき、軸索伸長を起こし、および大脳皮質運動ニューロンを生成するものである、Ｌ１ＣＡＭ陽性細胞。
11. 　ＮＲＰ１陽性細胞を含む細胞集団である、請求項１０に記載のＬ１ＣＡＭ陽性細胞。
12. 　ＣＴＩＰ２陽性深層ニューロン（ＣＴＩＰ２^＋ＤＬＮ）および／またはＣＴＩＰ２^＋ＤＬＮ前駆細胞である、請求項１０または１１に記載のＬ１ＣＡＭ陽性細胞。
13. 　前記軸索を少なくとも錐体交叉に投射する、請求項１０~１２のいずれか１項に記載のＬ１ＣＡＭ陽性細胞。
14. 　請求項１０~１３のいずれか１項に記載のＬ１ＣＡＭ陽性細胞を有効成分として含む、被験体における大脳皮質障害および／または大脳皮質脊髄路障害を治療するための細胞製剤。
15. 　神経幹細胞を含む、請求項１４に記載の細胞製剤。
16. 　大脳皮質障害および／または大脳皮質脊髄路障害が、脳梗塞、脳卒中、神経変性疾患、脳腫瘍、多発性硬化症、てんかん、頭部外傷、及び虚血からなる群から選択される、請求項１４または１５に記載の細胞製剤。
17. 　大脳皮質障害および／または大脳皮質脊髄路障害をもつ被験体の大脳皮質および／または大脳皮質脊髄路の障害部位に、請求項１４~１６のいずれか１項に記載の細胞製剤を投与することを含む、被験体において大脳皮質障害および／または大脳皮質脊髄路障害を治療する方法。

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