KR20180108789A - 간 섬유화의 모델 시스템 및 그의 제조 및 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 명세서에 간 세포외 매트릭스, 및 상기 매트릭스 상의 포유동물 간 세포(예를 들면, 일차 간 세포)의 조합을 포함하는, 간 섬유화의 모델 시스템이 제공된다. 일부 구체예에서, 간 세포의 조합은: (a) 간 전구체 세포(liver progenitor cell), (b) 쿠퍼 세포(Kupffer cell), 및 (c) 간 성상 세포(hepatic stellate cell)를 포함한다. 모델 시스템을 제조하는 방법 및 활성제를 스크리닝하기 위해 모델 시스템을 사용하는 방법도 제공된다.
Description
본 명세서에 간 세포외 매트릭스, 및 상기 매트릭스 상의 포유동물 간 세포(예를 들면, 일차 간 세포)의 조합을 포함하는, 간 섬유화의 모델 시스템이 제공된다. 일부 구체예에서, 간 세포의 조합은: (a) 간 전구체 세포(liver progenitor cell), (b) 쿠퍼 세포(Kupffer cell), 및 (c) 간 성상 세포(hepatic stellate cell)를 포함한다. 모델 시스템을 제조하는 방법 및 활성제를 스크리닝하기 위해 모델 시스템을 사용하는 방법도 제공된다.
관련 출원
본 출원은, 그의 개시가 전체로서 참조에 의해 본 명세서에 포함된, 2016년 2월 10일자로 출원된 미국 임시 특허 출원 제62/293,469호의 이익을 주장한다.
발명의 배경
다양한 병인의 만성 간 손상은, 간에서 간 성상 세포(HSC) 활성화, 증식 및 세포외 매트릭스(extracellular matrix)의 점진적 축적을 특징으로 하는 간 섬유화를 유발할 수 있다. 간의 급성 섬유화는 통상적으로 증상이 없고, 가역성이나, 만성 섬유화는 간에 영구적인 손상을 유발할 수 있고, 현재까지 유일한 효과적인 치료는 간 이식이다.
간 섬유화에 대한 효과적인 치료법이 아직 없으므로, 질병 및/또는 독성-유도 간 섬유화의 발병의 근본적인 기전의 연구가 진행되고 있다. 이러한 연구를 위한 세포주 또는 살아있는 간 슬라이스(liver slice)를 포함하는 세포 배양 모델의 이용이 보고되었다. 그러나, 이러한 테스트 플랫폼은 실제 간 조직에 대한 타당성 및/또는 생존력의 부재의 주요한 한계점을 갖는다.
따라서, 간 섬유화의 개선된 모델 시스템, 특히, 항-섬유화제(anti-fibrotic agent)의 스크리닝을 위해 유용한 모델 시스템이 요구된다.
발명의 요약
본 명세서에 간에서 섬유화의 기전의 연구 등을 위해 유용하고, 항-섬유화(anti-fibrotic) 활성을 갖는 작용제의 스크리닝을 위해 유용한 간 섬유화의 모델 시스템(model system)이 제공된다.
따라서, 일부 구체예에 따라, 간 섬유화에 대한 모델 시스템으로서, 상기 시스템은 간 세포외 매트릭스 (예를 들면, 탈세포화 간 디스크(decellularized liver disk)와 같은 탈세포화 간 조직), 및 상기 매트릭스 상에 있는 포유동물 간 세포(예를 들면, 일차 간 세포(primary liver cell))의 조합(combination)을 포함하는 것인 모델 시스템이 제공된다. 일부 구체예에서, 간 세포의 조합은: (a) 간 전구체 세포(liver progenitor cell), (b) 쿠퍼 세포(Kupffer cell), 및 (c) 간 성상 세포(hepatic stellate cell)를 포함한다. 일부 구체예에서, 조합은 개수(number) 기준으로, 70 내지 90 퍼센트의 간 전구체 세포, 5 내지 20 퍼센트의 쿠퍼 세포, 및 5 내지 20 퍼센트의 간 성상 세포를 포함한다.
일부 구체예에서, 간 성상 세포는 활성화된 간 성상 세포 및/또는 근섬유모세포(예를 들면, EZH2 발현 세포)이다.
일부 구체예에서, 상기 시스템은 조직 배양 디쉬(tissue culture dish)에 제공된다. 일부 구체예에서, 상기 시스템은 모듈형(modular) 및/또는 미세유체 장치에 제공된다. 일부 구체예에서, 시스템은 인 비보 이식형이다.
또한, 간 섬유화를 조절(modulate)하는 목적 작용제(agent of interest)의 활성을 스크리닝하는 방법으로서, 상기 방법은 : (a) 본 명세서에 교시된 모델 시스템을 제공하는 단계, (b) 상기 목적 작용제를 상기 모델 시스템과 접촉시키는 단계, (c) 상기 모델 시스템에서 섬유화를 측정하는 단계, 및 (d) 상기 접촉에 반응하여 섬유화가 증가 또는 감소되는지 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있어서, 간 섬유화의 조절에서 목적 작용제의 활성을 스크리닝하는 것인 방법이 제공된다.
일부 구체예에서, 상기 측정은 상기 모델 시스템에서 EZH2의 활성을 측정하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 측정은 광학적 투명화(optical clearing)(예를 들면, inCITE 광학적 투명화) 및 분석을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 목적 작용제는 EZH2 억제제 (예를 들면, GSK-126), 안지오텐신 타입 1(AT1) 수용체 차단제(예를 들면, 로스타틴), 할로푸기논(halofuginone), 라이실 산화효소(lysyl oxidase) 또는 lox-유사 효소 억제제(lox-like enzyme inhibitor), A2B 아데노신 수용체 길항제, 또는 단일클론 항체(monoclinal antibody) (예를 들면, GS-6624 (심투주맙(simtuzumab))이다.
또한, 본 명세서에 교시된 모델 시스템을 제조하는 방법으로서: (a) 간 세포외 매트릭스를 제공하는 단계, 및 (b) 간 전구체 세포, 쿠퍼 세포, 및 간 성상 세포를 상기 간 세포외 매트릭스에 접종하는 단계, 및 (c) 상기 매트릭스 상에서 상기 세포를 인 비트로 증식시키는 단계를 포함하여, 상기 간 섬유화를 위한 모델 시스템을 형성하는 것인 방법이 제공된다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 섬유화 유도성(pro-fibrogenic) 사이토카인 또는 화합물을 상기 모델 시스템에 투여하는 것에 의해 상기 간 성상 세포를 활성화시키는 것을 더 포함한다.
본 발명은 본 명세서에 포함된 도면 및 상세한 설명에서 더 상세하게 설명된다. 본 명세서에서 인용된 모든 미국 특허 문헌의 개시는 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 내포된다.
예시적 구체예(illustrative embodiments)의 상세한 설명
하기에서 본 발명은 본 발명의 구체예가 도시된 첨부 도면을 참조하여, 보다 완전하게 기술된다. 그러나, 본 발명은 다수의 상이한 형태로 구현될 수 있고, 본 명세서에 기재된 구체예로 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다; 오히려, 이 구체예들은 본 개시가 철저하고 완전하게 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 본 발명의 범위를 완전하게 전달하기 위해 제공된다.
본 명세서에서 사용된 용어는 특정한 구체예를 기술하기 위한 목적만을 가지며, 본 발명의 범위를 한정하도록 의도되지 않는다. 본 명세서에서 사용된, 단수 형태 "하나(a, an)" 및 "그(the)"는, 문맥상 명확하게 달리 표시되지 않으면, 복수 형태도 포함하도록 의도된다. 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"은 명시된 특징, 정수, 단계, 작업(operation), 요소, 성분 및/또는 이들의 그룹 또는 조합의 존재를 특정하나, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 작업, 요소, 성분 및/또는 이들의 그룹 또는 조합의 존재 또는 첨가를 배제하지 않는 것으로 더 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "및/또는(and/or)"은 관련하여 열거된 항목들의 모든 가능한 조합, 또는 하나 이상을 포함하고, 및 대안적으로("또는") 해석되는 경우, 조합의 부재도 포함한다.
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 용어(기술 및 과학 용어 포함)는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 사용되는 사전에서 정의된 것과 같은 용어들은 명세서 및 청구항의 문맥에서 그들의 의미와 일관된 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하고 본 명세서에서 명시적으로 정의되지 않은 경우, 이상화된 또는 과도하게 형식적인(formal) 방식으로 해석되어서는 안 되는 것으로 이해될 것이다. 잘 알려진 기능이나 구성(construction)은 간결성 및/또는 명확성을 위해 상세하게 기재되지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "세포(Cell)"는 일반적으로, 포유동물 세포, 예를 들면, 개, 고양이, 소, 염소, 말, 양, 마우스, 토끼, 랫트, 흰담비(ferret) 등의 세포이다. 일부 바람직한 구체예에서, 세포는 인간 세포이다. 적합한 세포가 공지되어 있고 상업적으로 이용가능하며, 및/또는 공지된 기법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, 미국특허 제6,737,270호 참조. 일부 구체예에서, 본 발명에 따라 사용되는 세포는, 세포주(cell line)의 세포들(예를 들면, 종양 세포 또는 인위적으로 불멸화되어, 지속적을 증식하는 세포 집단)과 대조적으로, 조직으로부터 취해지고, 집단 배가(population doubling) 없이 또는 매우 소수(예를 들면, 1 내지 3회)의 집단 배가로 사용된, 일차 세포(primary cell) 이다.
"간 전구체 세포(liver progenitor cell)"는 공지되어 있고, 예를 들면, 미국특허 제8,709,800호, 제8,278,105호, 제9,107,910호, 미국출원공개 제2010/0003752호, 제2011/0129439호에 기재된다.
당해 분야에서 알려진 "쿠퍼 세포(Kupffer cell)"는 동양 혈관(sinusoid)의 벽을 싸는(line) 간의 특화된 대식세포이다.
"간 성상 세포(hepatic stellate cell)" 또는 "HSC"는 간의 동양 혈관 주위 공간(perisinusoidal space)에서 발견되는 세포이다. 본 명세서에서 사용된 "활성화된(activated)" 간 성상 세포는 EZH2의 발현의 증가된 수준을 갖고 및/또는 근섬유모세포 표현형을 보이는 HSC이다. 섬유증 간(fibrotic liver)의 활성화된 HSC/근섬유모세포의 기타 마커는 FAP(Fibroblast Activation Protein), FSP(Fibroblast Specific Protein), α-SMA(α-smooth muscle actin), IL-6, TGF-β, 콜라겐 I 및 비멘틴을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
인 비보에서 간 섬유화를 유도하는 방법이 알려져 있고, 간 세포에 대한 화학적 손상을 유도하는, 사염화탄소(CCl4)의 투여, 및 간 내의 담관의 폐쇄를 유도하는 담관 결찰술(bile duct ligation)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 인 비트로에서 섬유화를 유도하는 방법은 CCl4, 메토트렉세이트, 알릴 알코올, 아세트아미노펜, TGFβ(transforming growth factor β), 디메틸니트로스아민, 등과 같은 섬유화 유도성(pro-fibrogenic) 사이토카인 또는 화학 물질의 투여를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
암의 치료에서 화학요법 및 방사선 요법이 간독성 치료(hepatotoxic treatment)의 가장 일반적인 종류 중 두 가지이다. 암의 치료를 위해 사용되는 간 독성 약물은 아드리아미신(adriamycin), 메토트렉세이트, 6 머캅토퓨린, 카르보플라틴, DTIC(다카르바진), BiCNU, L-아스파라기나아제, 및 펜토스타틴을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 교시된 모델 시스템에서 간 섬유화를 유도하기 위해 이용될 수 있는 기타 작용제 또는 약물은 하기를 포함할 수 있으나, 그에 한정되지 않는다: 아세부톨롤(acebutolol); 아세트아미노펜(acetaminophen); 액티노마이신(actinomycin) d; 아드레노코르티칼 스테로이드(adrenocortical steroid); 아드리아마이신(adriamycin); 알로퓨리놀(allopurinol); 아목실린/클라불라네이트(amoxicillin/clavulanate); 동화성 스테로이드(anabolic steroid); 항염제(anti-inflammatory drugs); 항갑상선제(antithyroid drugs); 아스피린; 아테놀롤(atenolol); 아자티오프린(azathioprine); 캅토프릴(captopril); 카르바마제핀(carbamazepine); 카르비마졸(carbimazole); 카르무스틴(carmustine); 세팔로스포린(cephalosporins); 클로르디아제폭시드(chlordiazepoxide); 클로르프로마진(chlorpromazine); 클로르프로마진/발프로산(chlorpromazine/valproic acid); 클로르프로파미드(chlorpropamide); 클로르프로파미드/에리트로마이신(chlorpropamide/erythromycin)(복합(combination)); 시메티딘(cimetidine); 클록사실린 플레카이니드(cloxacillin flecainide); 시클로포스파미드(cyclophosphamide); 시클로포스파미드/시클로스포린(cyclophosphamide/cyclosporine); 시클로스포린; 다카르바진(dacarbazine); 다나졸(danazol); 단트롤렌(dantrolene); 디아제팜(diazepam); 디클로페낙(diclofenac); 딜티아젬(diltiazem); 디소피라미드(disopyramide); 에날라프릴(enalapril); 엔플루란(enflurane); 에리트로마이신(erythromycin); 에탐부톨(ethambutol); 에티온아미드(ethionamide); 플루라제팜(flurazepam); 플루타미드(flutamide); 글리부리드(glyburide); 금(gold); 그리세오풀빈(griseofulvin); 할로페리돌(haloperidol); 할로탄(halothane); 히드랄라진(hydralazine); 이부프로펜(ibuprofen); 이미프라민(imipramine); 인도메타신(indomethacin); 이소니아지드(isoniazid); 케토코나졸(ketoconazole); 라베탈롤(labetalol); 마프로틸린(maprotiline); 머캅토퓨린(mercaptopurine); 메토트렉세이트(methotrexate); 메틸도파(methyldopa); 메틸테스토스테론(methyltestosterone); 메토프롤롤(metoprolol); 미안세린(mianserin); 미토마이신(mitomycin); 나프록센(naproxen); 니코틴산(nicotinic acid); 니페디핀(nifedipine); 니트로프란토인(nitrofurantoin); 비스테로이드(nonsteroidal); 노르에탄드롤론(norethandrolone); 경구 피임약; 옥사실린(oxacillin); 파라-아미노살리실산(para-aminosalicylic acid); 페니실아민(penicillamine); 페니실린; 페니실린(penicillins); 페넬진(phenelzine); 페닌디온(phenindione); 페노바르비탈(phenobarbital); 페노티아진(phenothiazine); 페닐부타존(phenylbutazone); 페닐로인(phenyloin); 페닐로인 트롤레안도마이신(phenyloin troleandomycin); 피록시캄(piroxicam); 프로베네시드(probenecid); 프로카인아미드(procainamide); 프로폭시펜(propoxyphene); 피라진아미드(pyrazinamide); 퀴니딘(quinidine); 퀴닌(quinine); 라니티딘(ranitidine); 살리실레이트(salicylate); 술폰아미드(sulfonamide); 술린닥(sulindac); 타목시펜tamoxifen); 테르비나핀(terbinafine) HCl (라미실(Lamisil), 스포라녹스(Sporanox)); 테스토스테론; 테트라사이클린(tetracycline); 티아벤다졸(thiabendazole); 티오쿠아닌(thioquanine); 토로트라스트(thorotrast); 톨부타미드(tolbutamide); 삼중고리 항우울제(tricyclic antidepressant); 발프로산; 베라파밀(verapamil); 빈크리스틴(vincristine); 및 비타민 A. Belardinelli 등에 의한 미국 특허 제8,609,671호 참조.
간 섬유화를 모니터링하거나 또는 검출하는 방법은 조직학적 검사(histological examination) 및/또는 EZH2와 같은 특정 마커의 발현 측정을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 측정될 수 있는 간 섬유화의 기타 마커가 Hsieh 등에 의한 미국특허 제7.972,785호에 제공된다.
"EZH2" 또는 "제스트 동족체 2의 인핸서(enhancer of zeste homolog 2)"는 활성화된 HSC 중 PRC(polycomb repressor complex)의 메틸트랜스퍼라아제 및 성분이다. EZH2는 일부 암의 증식에 관여되고, 따라서, EZH2 억제제가 암 치료에서의 사용에 대해 연구되고 있다.
간 섬유화의 조절에서 목적 작용제는 EZH2 억제제 및 크로마틴 변형 효소(chromatic modifying enzyme)의 기타 억제제 (예를 들면, GSK-126, DZNep(3-deazaneplanocin A), SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid), MC1948, MC1945, 등)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. EZH2의 억제제가 알려져 있고, 다수가 EZH2의 SET 도메인 활성 부위를 표적으로 한다. 예를 들면, 참조에 의해 본 명세서에 포함된, PCT/US2011/035336, PCT/US2011/035340, 및 PCT/US2011/035344 참조.
기타 목적 작용제는 안지오텐신 타입 1 (AT1) 수용체 차단제(예를 들면, 로스타틴); 콜라겐 억제제, 예를 들면, 할로푸기논(미국특허 제8,668,703호 참조); 라이실 옥시다아제(lysyl oxidase) 또는 lox-유사 효소 억제제(lox-like enzyme inhibitor); 단일클론 항체(monoclinal antibody) (예를 들면, GS-6624); Lei 등에 의한 미국특허 제8,957,019호에서 발견된 것과 같은 올리고펩티드; Yang에 의한 미국출원 공개 제2010/0113596호에서 발견된 것과 같은 레티노산 유도체; 3-n-프로필크산틴(propylxanthine)(엔프로필린(enprofylline)), 1,3-디프로필-8-(p-아크릴릭)페닐크산틴, 또는 Kalla 등에 의한 미국특허 제6,825,349호, Belardinelli 등에 의한 미국특허 제8,609,671호에서 발견된 것과 같은 A2B 아데노신 수용체 길항제; Ishikawa 등에 의한 미국특허 제7,847,132호에서 발견된 것과 같은 화합물; 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 "간 세포외 매트릭스(liver extracellular matrix)"는 간에서 정상적으로 발견되는 세포외 매트릭스 단백질을 포함하는 스카폴드(scaffold), 예를 들면, 그의 개시가 참조에 의해 그 전체로 본 명세서에 포함된 Y. Zhang 등의 미국출원공개 제20130288375호에 기재된 것들을 의미한다. 예를 들면, 탈세포화 간 조직(decellularized liver tissue)은 동결건조되고 가루로 분쇄되어 간에서 정상적으로 발견되는 세포외 매트릭스 단백질을 제공할 수 있고, 이들은 바이오폴리머(예를 들면, 콜라겐, 키토산, 히알루론산 등)와 조합되어 히드로겔을 형성할 수 있다. 간 세포외 매트릭스는 또한 탈세포화 간 기관 또는 그의 일부(예를 들면, 개별 간엽(lobe), 또는 그로부터 형성된 조직 디스크(disk))의 이용에 의해 제공될 수 있다. 간 조직의 탈세포화 방법이 알려져 있고, 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함되는, US 20130288375에 기재된다. 또한, Baptista et al., Hepatology 2011, 53(2): 604-617 참조. 간 세포외 매트릭스는 적절한 인간 또는 인간을 제외한 포유동물, 예를 들면, 개, 고양이, 소, 염소, 말, 양, 마우스, 토끼, 랫트, 등 세포로부터 유래될 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 간 세포외 매트릭스는 흰담비로부터 유래된다.
일부 구체예에서, 간 세포외 매트릭스는 콜라겐 I, 콜라겐 II, 콜라겐 III, 콜라겐 IV, 라미닌 및 피브로넥틴으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함한다.
본 명세서에서 교시된 간 섬유화를 위한 모델 시스템으로 유용한 간 구조체(liver construct)(또는 "오가노이드(ogranoids)")는 조합으로: (a) 간 전구체 세포, (b) 쿠퍼 세포, 및/또는 (c) 간 성상 세포를 포함할 수 있다. 일반적으로, 세포를 인 비트로로, 예를 들면, 조직 배양 디쉬에 제공된 간 세포외 매트릭스(예를 들면, 탈세포화 간 또는 그의 이룹)(예를 들면, 48-웰 디쉬 중 간 ECM 디스크) 상에 접종할 수 있다. 일부 구체예에서, 간 전구체 세포는 개수 기준으로 70 내지 90 퍼센트의 양(가장 바람직하게는 약 80 퍼센트, 예를 들면, 3x105)으로 접종될 수 있고; 쿠퍼 세포는 개수 기준으로 5 내지 20 퍼센트(가장 바람직하게는 약 10 퍼센트, 예를 들면, 4x104)의 양으로 포함될 수 있고; 및/또는 간 성상 세포는 개수 기준으로 5 내지 20 퍼센트(가장 바람직하게는 10 퍼센트, 예를 들면, 4x104)의 양으로 포함될 수 있다.
일부 구체예에서, 접종된 구조체(예를 들면, 스페로이드(spheroid)의 형태)은 예를 들면, 1 내지 4주, 또는 1 내지 3주, 또는 2 내지 3주 동안 인 비트로에서 증식되어 성숙 간 구조를 형성할 수 있다. 그러한 간 구조는 예를 들면, 담관 구조체, 군집된 간 세포(clustered hepatocytes) 등을 포함할 수 있다.
장치. 본 발명의 모델 시스템을 이용한 인 비트로 화합물 스크리닝을 위해 유용한 장치가 (a) 그 내부에 형성된 하나 이상의 챔버(챔버는 바람직하게는 그 내부에 형성된 유입(inlet) 및 유출(outlet) 개구부를 갖는다)를 갖는 기판 또는 장치 본체(device body)(예를 들면, 조직 배양 디쉬, 미세유체 장치, 등)를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 챔버 내에 전술된 바와 같은 하나 이상의 구조체(construct)(그 자체로, 또는 히드로겔과 조합된 그의 조성물로서)를 침착(deposit)시키는 단계에 의해 제조될 수 있다. 상기 장치는 펌프, 배양 배지 저장소(culture media reservior), 검출기 등을 포함하는 더 큰 장치로의 삽입 또는 "플러그 인(plug in)"을 위한 카트리지의 형태로 제공될 수 있다.
장치 본체는 그 자체로, 적합한 물질 또는 물질의 조합으로 형성될 수 있다. 예는 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA), 폴리아크릴아미드, 관능화(functionalized) PEG(예를 들면, PEG 디아크릴레이트, PEG 디아크릴아미드, PEG 디메타크릴레이트 등, 또는 다중-암(multi-arm) 형태의 전술된 PEG, 등)을 포함한 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 가교되거나 또는 경화될 수 있는 천연 폴리머, 또는 단백질(예를 들면, 가교를 지원하기 위한 화학 작용기로 관능화된 그의 유도체를 포함한, 히알루론산, 젤라틴, 콘드로이틴 술페이트, 알기네이트 등, 및 그들의 조합)을 포함하나, 그에 한정되지 않는다. 장치 본체는 주조(molding), 주물(casting), 적층 가공(additive manufacturing)(3d 프린팅), 리소그래피 등 및 그들의 조합을 포함한 적절한 공정에 의해 형성될 수 있다.
장치의 보관 및 운송(Storing and shipping of devices). 일단 제조되면, 카트리지 형태의 전술된 장치는 즉시 사용되거나, 또는 보관 및/또는 수송을 위해 준비될 수 있다.
제품을 보관하고 운송하기 위해, 실온(예를 들면, 25℃)에서 유동성 있는 액체이나, 냉장 온도(예를 들면, 4℃)에서 겔화되거나 고화되는 일시적 보호성 지지 매질(transient protective support media), 예를 들면, 물과 혼합된 젤라틴이 실질적으로 또는 완전히 챔버, 및 바람직하게는 연결된 도관(conduit)를 채우기 위해, 장치에 첨가될 수 있다. 유입 및 유출 포트는 적절한 캡핑 요소 (예를 들면, 플러그) 또는 캡핑 물질(예를 들면, 왁스)로 캡핑된다. 그 후, 장치를 냉각 요소(cooling element)(예를 들면, 얼음, 드라이 아이스, 열전기 냉각기(thermoelectric chiller) 등)와 함께 패키징하여 (바람직하게는 단열된(insulated)) 패키지 내에 배치한다.
대안적으로, 제품을 보관하고 수송하기 위해, 냉각된 온도(예를 들면, 4℃)에서 유동성 있는 액체이나, 실온(예를 들면, 20℃) 또는 체온(예를 들면, 37℃)과 같은 가온(warmed) 온도에서 겔화되거나 고화되는 일시적 보호성 지지 매질, 예를 들면, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 및 폴리(에틸렌 글리콜) 블록 공중합체가 제공될 수 있다.
수령시, 최종 사용자는 단순히 장치를 연관된 패키지 및 냉각 요소로부터 분리하고, (일시적 보호성 지지 매질의 선택에 따라) 온도가 상승 또는 하강하게 하고, 포트를 열고, 주사기로(예를 들면, 성장 배지로 플러싱하는 것에 의해) 일시적 보호성 지지 매질을 제거할 수 있다.
장치의 사용 방법. 전술된 장치는 약리학적 및/또는 독성학적 활성에 대해 목적 작용제(또는 복수의 목적 작용제)의 인 비트로 스크리닝(고효율 대용량(high through-put) 스크리닝 포함)을 위해 이용될 수 있다. 그러한 스크리닝은: (a) 전술된 바와 같은 장치를 제공하는 단계; (b) (예를 들면, 구조체를 포함하는 챔버를 통해 흐르는 성장 배지에 첨가하여) 화합물을 구조체에 투여하는 단계; 및 그 후, (c) 상기 구조체의 하나 이상의 세포로부터 상기 화합물에 대한 약리학적 및/또는 독성학적 반응을 검출하는 단계에 의해 수행될 수 있다. 반응의 검출은 검출될 특정한 반응 또는 반응의 세트에 따라, 현미경 관찰, 조직학적 분석(histology), 면역분석, 또는 이들의 조합을 포함한 적절한 기법에 의해 수행될 수 있다. 그러한 반응 또는 반응들은 세포 사망(노화 및 아폽토시스(apoptosis) 포함), 세포 증식(예를 들면, 양성 및 전이성 세포 증식), 화합물의 ADME(absorption, distribution, metabolism, or excresion), 또는 생리적 반응(예를 들면, 하나 이상의 세포에 의한 화합물의 생성의 상향 조절 또는 하향 조절), 또는 간 섬유화에 대한 약리학적 및/또는 독성학적 활성과 관련된 기타 생물학적 반응일 수 있다.
일부 구체예에서, 간 모델이 광학적 선명도(optical clarity)를 위해 가공될 수 있다. 일부 구체예에서, inCITE(index-matched Clear Imaging for Tissue Evaluation)("조직이 유리가 되게 한다(turns tissue into glass)")에 의해 간 모델로부터 지질을 제거하는 것에 의해 간 모델이 고정되고 가공된다. 전체 기관(또는 오가노이드)가 완전한 세포 수준 해상도(full cellular level resolution)를 위해 1μM 스케일로 시각화될 수 있는 것인 inCITE 광학적 투명화(optical clearing) 및 분석 기술이 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된, 2015년 8월 7일자로 제출되고, 2016년 2월 11일자로 WO2016023009로 공개된 PCT/US2015/044376에 기재된다. 상기 방법은 예를 들면, 고정된 조직을 소디움 도데실 술페이트(SDS), 3-(N,N-디메틸미리스틸암모니오)프로판술포네이트(SB3-14), Tween® 20(폴리소르베이트 20), 비-이온성 계면활성제, 예를 들면, TritonTM X-100, 소디움 데옥시콜레이트, 및 염(예를 들면, 소디움 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 및/또는 소디움 메타보레이드(metaborate))를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것에 의해 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 조성물은 포스포리파아제 A2를 포함할 수 있다. 그 후, 이미징을 위해 준비하기 위해, 조직을 2'2'-티오디에탄올과 접촉시킬 수 있다. "시스루(see-thru)" 또는 유리-유사 "젤리빈(jellybean)"으로 보이는, 투명화된 조직을 현미경 대물렌즈(microscope objectives)와 인덱스 매칭시키고 이미징할 수 있다. 각각의 전체 장착된 조직(whole mount tissue)은 투명화(clearing)를 위해 최대 10일을 요구할 수 있다. 이 이미징 기술로부터의 데이터는 완전히 정량될 수 있고, 섬유화의 하드 메트릭스(hard metrics)(섬유 길이, 폭, 배향(orientation), 섬유화의 양, 비등방성(anisotropy) 등)를 평가하고, 현재의 표준 Metvir 병리학 평점(Metvir pathological scoring)에 비교할 수 있다.
조직은 예를 들면, 조직을 아크릴아미드 및 고정액(fixative), 예를 들면, 파라포름알데히드, 포르말린, 젠커 고정액(Zenker's fixative), 헬리 고정액(Helly's fixative), B-5 고정액, 부인 용액(Bouin's solution), 홀란드 용액(Hollande's), 겐드레 용액(Gendre's solution), 클라크 용액(Clarke's solution), 크로노이 용액(Cronoy's solution), 메타칸(Methacarn), 포르몰 아세트산 알코올(Formol acetic alcohol) 등을 포함하는 용액과 접촉시키거나, 상기 용액을 주입(infuse)하는 것에 의해 고정될 수 있다. 용액은 또한 사포닌을 포함할 수 있다. 조직은 그 후, 고정되기에 충분한 시간(예를 들면, 2일, 3일, 4일, 또는 5일) 동안, 상기 용액과 접촉된 상태로(예를 들면, 가벼운 교반 하에, 약 4℃에서) 방치될 수 있다.
본 발명은 하기의 비-한정적 실시예에서 보다 상세하게 설명된다.
도 1a-도 1c. 생체공학적 간 조직의 모델(Models of bioengineered liver tissue). 도 1a: 중요한 간 ECM 분자의 보존을 보여주는, 간 탈세포 화(decellularization) 과정 및 무세포 흰담비 간(acellular ferret liver) 및 신선한 간 조직 중 ECN의 특성 규명(characterization). 도 1b: 무손상 간엽 모델(intact liver lobe model): 특화된 생물반응기 시스템을 이용하여 인간 간 전구체를 무세포 흰담비 간 ECM 내에 주입(infuse)했다. 배양 3주 후에, 간 전구체는 기능성 간 세포로 분화되어, CYP3A와 알부민 및 CK19+ 담관 구조체(biliary structure)를 발현시켰다. 도 1c: 간 오가노이드 모델(liver organoid model): 무세포 간 ECM으로부터 "펀칭되고(punched)" 인간 간 전구체가 접종된 8 mm 디스크. 3주 후에, 담관 구조체(화살표) 및 간 세포 군집(CK18 및 알부민-Alb)을 포함하는, 직경 0.5-2 mm의 스페로이드가 관찰되었다. Jagged-1, α-SMA 및 비멘틴(Vim)을 발현하는, 풍부한 성상 세포가 담관 및 간 세포 구조물을 둘러쌌다(막대 크기=100μm).
도 2a-도 2c. 간 오가노이드의 조직 성숙. 도 2a: 배양 중 분화의 1주 및 3주 동안 LPC의 분포 및 표현형 특성. 세포를 EpCAM(epithelial cell adhesion molecule), ALB(알부민), AFP(a-fetoprotein), CK19(cytokeratin19) 및 세포 핵(DAPI)에 대해 염색했다. 도 2b: 신선하게 단리된(freshly isolated) LPC, 1주 및 3주 분화 후 간 오가노이드, 및 성체 간 조직(adult liver tissue) 중, 간 전사인자(hepatic transcription factor), 간 세포 분화를 조절하는 HNF(hepatocyte nuclear factor) 4a, 및 담관 상피 분화(bile epithelial differentiation)를 조절하는 HNF6 발현의 RT-PCR 분석. 도 2c: 3주의 분화 동안 배양 디쉬 중 간 오가노이드 및 LPC의 조건화 배지(conditioned media)의 알부민 분비 및 우레아 농도의 측정. 도 2d: CK19 및 아세틸화 a-튜뷸린(상단) 및 EpCAM 및 ASBT(apical sodium dependent bile transporter) (하단)의 발현에 대한 세관 구조(ductular structure)의 특성규명.
도 3. 이식된 간 오가노이드에 대한 CCl 4 처리의 효과. 간 오가노이드를 8 mm 생검 펀치(biopsy punch)로 새긴 작은 구멍을 통해 마우스 간의 상부(top)에 삽입하고, 피브린 아교(fibrin glue)로 고정화시켰다. 일부 마우스를 격주로(bi-weekly) 피하 주사를 통해 4㎕/g CCl4로 처리했다. 1주 및 3주 후에 간 오가노이드를 수집하고 인간 간세포(Hep-1) 및 증식 세포(PCNA)에 대해 면역염색했다. 이식물 마진(implant margin)이 도시된다.
도 4a-도 4f. LX -2 세포의 분석. 도 4a: 근섬유모세포 및 LX-2에서 αSMA 및 PRC2 성분/마커의 웨스턴 블롯 비교. 도 4b: 근섬유모세포 대 LX-2 웨스턴 블롯의 농도측정(densitometry) 비교. 도 4c: 24시간 또는 48시간 동안 TGFβ로 처리된 LX-2 세포 중 αSMA 및 PRC2 성분/마커의 웨스턴 블롯 분석. 도 4d: TGFβ 처리 LX-2의 농도측정 분석. 도 4e: EZH2의 화학적 억제제인 GSK-126으로 처리된 중배엽 줄기 세포(Mesenchymal Stem Cell)로부터 이행된 근섬유모세포 중 EZH2 활성에 대한 EZH2 마커(H3K27me3)의 웨스턴 블롯 분석. DMSO는 비히클 대조군(vehicle control)이다. 도 4f: EZH2 마커의 농도측정 분석은 GSK-126으로 처리된 경우, EZH2의 활성의 효과적인 감소를 보여준다.
도 5. LX -2 세포에 대한 TGF -β 효과의 qPCR 분석. TGF-β로 처리된 LX-2 세포의 유전자 발현을 조사하기 위해 정량적 PCR을 수행했다. LX-2 세포(P5)를 24시간 또는 48시간 동안 TGF-β로 처리했다.
도 2a-도 2c. 간 오가노이드의 조직 성숙. 도 2a: 배양 중 분화의 1주 및 3주 동안 LPC의 분포 및 표현형 특성. 세포를 EpCAM(epithelial cell adhesion molecule), ALB(알부민), AFP(a-fetoprotein), CK19(cytokeratin19) 및 세포 핵(DAPI)에 대해 염색했다. 도 2b: 신선하게 단리된(freshly isolated) LPC, 1주 및 3주 분화 후 간 오가노이드, 및 성체 간 조직(adult liver tissue) 중, 간 전사인자(hepatic transcription factor), 간 세포 분화를 조절하는 HNF(hepatocyte nuclear factor) 4a, 및 담관 상피 분화(bile epithelial differentiation)를 조절하는 HNF6 발현의 RT-PCR 분석. 도 2c: 3주의 분화 동안 배양 디쉬 중 간 오가노이드 및 LPC의 조건화 배지(conditioned media)의 알부민 분비 및 우레아 농도의 측정. 도 2d: CK19 및 아세틸화 a-튜뷸린(상단) 및 EpCAM 및 ASBT(apical sodium dependent bile transporter) (하단)의 발현에 대한 세관 구조(ductular structure)의 특성규명.
도 3. 이식된 간 오가노이드에 대한 CCl 4 처리의 효과. 간 오가노이드를 8 mm 생검 펀치(biopsy punch)로 새긴 작은 구멍을 통해 마우스 간의 상부(top)에 삽입하고, 피브린 아교(fibrin glue)로 고정화시켰다. 일부 마우스를 격주로(bi-weekly) 피하 주사를 통해 4㎕/g CCl4로 처리했다. 1주 및 3주 후에 간 오가노이드를 수집하고 인간 간세포(Hep-1) 및 증식 세포(PCNA)에 대해 면역염색했다. 이식물 마진(implant margin)이 도시된다.
도 4a-도 4f. LX -2 세포의 분석. 도 4a: 근섬유모세포 및 LX-2에서 αSMA 및 PRC2 성분/마커의 웨스턴 블롯 비교. 도 4b: 근섬유모세포 대 LX-2 웨스턴 블롯의 농도측정(densitometry) 비교. 도 4c: 24시간 또는 48시간 동안 TGFβ로 처리된 LX-2 세포 중 αSMA 및 PRC2 성분/마커의 웨스턴 블롯 분석. 도 4d: TGFβ 처리 LX-2의 농도측정 분석. 도 4e: EZH2의 화학적 억제제인 GSK-126으로 처리된 중배엽 줄기 세포(Mesenchymal Stem Cell)로부터 이행된 근섬유모세포 중 EZH2 활성에 대한 EZH2 마커(H3K27me3)의 웨스턴 블롯 분석. DMSO는 비히클 대조군(vehicle control)이다. 도 4f: EZH2 마커의 농도측정 분석은 GSK-126으로 처리된 경우, EZH2의 활성의 효과적인 감소를 보여준다.
도 5. LX -2 세포에 대한 TGF -β 효과의 qPCR 분석. TGF-β로 처리된 LX-2 세포의 유전자 발현을 조사하기 위해 정량적 PCR을 수행했다. LX-2 세포(P5)를 24시간 또는 48시간 동안 TGF-β로 처리했다.
실시예
1
일차 간 세포를 포함하는 생체공학적 간 모델(bioengineered liver model)을 간 세포외 매트릭스(탈세포화 간 디스크) 상에 생성했다. 인 비트로에서 3-주 성숙을 통해, 생체공학적 간은 원형의(native) 간 구조(anatomy) 및 간-연관 기능을 갖는, 소형 오가노이드를 형성했다.
인 시투 오가노이드 모델( In situ organoid model): 간 생체공학을 위해, 간 순환(hepatic circulation)을 통한 다량의 디터전트의 공급(profusion)이 원형의 간 ECM으로 구성되고, 특징적인 3D 아키텍쳐 및 형태를 갖는, 무세포 간 스카폴드(acellular liver scaffold)를 생성했다(도 1a). 현저하게, 혈관 네트워크의 채널이 명백하게(patent) 보인다. 비-인간 간 스카폴드에 일차 인간 세포: 혈관 채널을 덮기 위해, 혈관 내피 세포(EC), 및 실질(parenchyma)을 재구성하기 위해 인간 태아 간 전구체(LPC)를 접종했다(도 1b). 그러한 세포-접종 구조체(cell-seeded construct)는 3주 이상의 기간 동안 관류 생물 반응기(perfusion bioreactor)에서 유지될 수 있고, 세포들은 알부민 발현 간 세포 군집(cluster) 및 CK19-양성 담낭 세관 구조(biliary ductular structure)를 포함한, 정상 간의 조직 구조 같은, 조직 구조로 조직된다(도 1c). 또한, 이 오가노이드는 알부민 합성, 우레아의 분비 및 디아제팜의 I상 대사산물(phase I metabolite); 테마제팜 및 노르디아제팜(각각 CYP2C 및 CYP3A에 의해 생성됨)으로의 대사를 포함한, 일반적인 간 기능을 수행하여, 간 오가노이드의 CYP3A 염색을 확인했다(도 1b).
단순화하고, 보다 높은 처리량 적용에 적응시키기 위해, 작은 (8mm 직경, 300μm 두께) 탈세포화 간 ECM 디스크를 LPC 접종을 위해 준비했다(도 1c). LPC는 간 ECM에 재생되고(repopulate), 원형의 간(native liver)과 유사한 간세포 및 세관(ductular) 구조를 포함하는, 3D 스페로이드 구조(오가노이드)로 자가-조립되었다(도 1c). 또한, 점진적인 세포 조직화(cellular organization) 및 분화가 관찰되었다. 간모세포(hepatoblast) 마커(ALB+/CK19+/EpCAM+) 및 AFP(α-fetoprotein)와 알부민을 발현하는 세포의 대형 군집이 배양 1주 후에 관찰되어, 간모세포로의 계통 한정(lineage restriction)을 시사했다(도 2a, 상단). 3주 후에, ALB-/CK19+/EpCAM+ 세관 구조 및 ALB+/CK19-/EpCAM- 군집, 및 AFP 발현의 완전한 상실을 포함한, 세포 표현형의 명확한 변화가 있었고, 각각 분극된 담관세포(polarized cholangiocyte) 및 간세포로의 평행 계통 특화(parallel linease specification)를 시사했다(도 2a, 하단). 유전자 발현 분석은 간세포 분화 조절자, HNF4α 및 담관세포 분화 주요 조절자(cholangiocyte differentiation major regulator), HNF6의 발현이 FPLC 대비 오가노이드에서 점진적으로 증가했다는 것을 보여주었다(도 2b). 간 오가노이드는 배양 플레이트에서 분화된 LPC에 비해 유의성 있게 더 높은 알부민 및 우레아 분비를 보였고(도 2c) 담관 구조(biliary structure)는 첨단 막(apical membrane) 중 일차 섬모(α-아세틸화 튜뷸린에 대해 염색됨) 및 담즙산염 수송체(bile salt transporter)(ASBT)의 존재에 의해 나타난 바와 같이, 전형적인 첨단-기저 극성(apical-basal polarity)를 보였다(도 2d).
종합하여, 이러한 결과는 무세포 간 디스크가 LPC가 조직화되고 성숙되어, 원형의 간 조직과 유사한 구조를 갖는 기능성 간 오가노이드를 형성하도록 적절한 조건을 제공한다는 것을 나타낸다.
이식된 간 오가노이드에 대한 CCl 4 처리의 효과: 간 오가노이드가 인 비트로에서 발생되었고 기능성(functionality) 및 간 조직 구조를 보였다. 그러나, 인 비트로 배양 조건은, 인 비보에 존재하는 다수의 인자들, 단지 몇가지 언급하자면, 혈액의 성분 및 면역 세포를 포함한, 다수의 인자들이 결핍된다. 따라서, 본 발명자들은 누드 마우스의 간 위에 생검 펀치로 작은 구멍을 생성하여 오가노이드를 이식하고, 피브린 아교(fibrin glue)로 고정화시켰다. 1주 후 회수된 오가노이드는 다수의 살아있는 인간 간세포 및 많은 수의 증식하는 기질(성상) 및 내피 세포를 보였다(도 3, 상단 패널). 병행하여, 본 발명자들은 이식받은 마우스에 격주로(bi-weekly) 피하 주사를 통해 올리브 오일 중 4ml/g의 CCl4(1:1)를 처리했다. 대략적으로(grossly), CCl4 처리의 1주 후 회수된 오가노이드는 대조군 마우스와 현저한 차이를 보이지 않았다. 그러나, 상세한 검사는 오가노이드 내에 유핵 인간 간세포의 부재 및 섬유화의 초기 징후를 보여주었다. CCl4 처리의 3주 후 회수된 오가노이드는 보다 많은 수의 증식성 기질 및 내피 세포를 보였다. 이러한 결과는 간 오가노이드가 이식 후 생존했고, CCl4에 의한 처리 후 섬유화의 징후를 보였다는 것을 나타낸다. 아마도 숙주 간의 CCl4-유도 손상 때문에, 오가노이드 내에서 혈관신생(neovascularization)도 관찰되었다.
섬유증 간 조직에서, 근섬유모세포의 약 90%는 HSC로부터 유래되고(Liedtke, C., et al., Experimental liver fibrosis research: update on animal models, legal issues and translational aspects. Fibrogenesis Tissue Repair, 2013. 6(1): p. 19), EZH2는 HSC 활성화 및 근섬유모세포로의 이행의 후생적 조절자(epigentic regulator)일 수 있다. 근섬유모세포(MF-10)와 같이, HSC 세포주(LX-2)는 인 비트로에서 EZH2 및 PRC 성분을 발현하는 것으로 확인되었다(도 4a, 도 4b). 그 후, LX-2의 TGFβ와의 인큐베이션이 EZH2 활성, 및 Suz12를 포함한 PRC 기구(machinery)와 활성 마커 H3K27me3를 유도한다는 것이 입증되었다(도 4c, 도 4d).
EZH2 특이적 소형 분자 억제제 GSK-126은 인 비트로에서 림프종 및 비소세포폐암 세포주 중 H3K27me3을 예방하는데 효과적이다. 실제로, EZH2 활성화 돌연변이(activating mutation)를 갖는 암세포주에서 EZH2를 억제하기 위한 GSK-126의 사용은 이러한 개별적인 세포주에서 EZH2에 대한 의존 때문에 세포 사망을 초래하나, 반면에, 세포가 활성화 EZH2 돌연변이를 갖지 않는 경우에는, 고 용량에서도 치명적이 아니다.
종양-연관 섬유모세포(TAF)와 GSK-126의 인큐베이션은 H2K27me3의 완전한 상실을 초래했다(도 4e, 도 4f).
실시예
2
간 오가노이드는 간 전구체 세포(LPC), 간 성상 세포(HSC) 및 쿠퍼 세포(KC)를 공-접종(co-seed)하여 형성시킨다. 섬유화 유도 조건에 반응하여, HSC 세포가 활성화되고, 증식하여 오가노이드에서 섬유화 과정을 개시할 것이다. 섬유화 간 오가노이드는 다양한 정량적 척도(range quantitative measures)를 통해 정밀하게 조사될 것이다. HSC 중 EZH2의 발현(상관관계 척도(correlative measure))의 평가를 통해 및 특이적 EZH2 억제(직접적 척도)를 이용하여 HSC의 근섬유모세포로의 이행(transition)/활성화에서 EZH2의 역할을 결정하기 위해 인 비트로 및 인 비보 실험을 수행할 수 있다.
간 성상 세포(HSC)는 간 섬유화의 주요한 동인(main driver)이다. 현재까지, 인 비트로에서 HSC를 연구하기 위한 대부분의 실험 모델은 단순한, HSC 단독, 2D 배양 시스템(simple, HSC only, 2D culture system)을 사용하나, 이는 인 비보 간 섬유화에서의 그들의 역할을 부실하게 대표한다. 본 명세서에 교시된 생체공학적 간 오가노이드가 HSC 및 간 섬유화에 영향을 미치는 인자들을 더 우수하게 모델링하고 설명한다.
태아 간 조직(Advanced Bioscience Resources, Alameda, CA)을 분해(digest)시키고, 저속으로 스피닝하여 적혈구를 제거하고, 콜라겐 4 및 라미닌이 코팅된 디쉬에 플레이팅한다. 약 10일 후에 나타나는, LPC 콜로니를 분해하고, 실질 (LPC) 세포를 비-실질(non-parenchymal) (성상) 세포로부터 분리하기 위해 밀도 원심분리(density centrifugation)를 이용한다. 인간 쿠퍼 세포(KC)는 Life Technologies (ThermoFisher Scientific)로부터 구입할 수 있다. 상이한 간 세포 종류의 자연적 비율을 재현하기 위해, 48 웰 디쉬 내부에 배치된 ECM 디스크에 ~80% LPC(3x105), ~ 10%HSC(4x104) 및 ~10%KC(4x104)를 접종할 것이다. 이 수치들은 성숙 오가노이드의 조직학 결과에 근거하여 최적화될 수 있다. 1% 우태아혈청 및 정의된 보충물(defined supplements)(덱사메타손, cAMP, 프롤락틴, 글루카곤, 니아신아미드, α-리포산, 트리요오도티로닌(triiodothyronine), EGF, HDL, HGF, GH)을 포함하는 RPMI 배지가 3D 간 ECM 스카폴드(3D liver ECM scaffold)에서 LSC 증식 및 분화를 지원한다.
오가노이드는 2주 동안 성숙되게 할 수 있고, 이는 통상적으로 이 시점까지 세관 구조 및 간세포 병소(hepatocyte foci)가 뚜렷하게 관찰될 수 있기 때문이다. 섬유화는 3가지 상이한 방식: 1) 직접적으로, 3종의 공지된 섬유화 유도 성장 인자: TGFb, PDGF-BB 및 TNFα에 의해 HSC를 활성화시키거나; 2) 간접적으로, 오가노이드의 LPS 및 IL2로의 노출에 의해, KC가 섬유화 유도 인자를 분비하도록 자극하는 것에 의해; 및 3) 간 세포를 손상시키는 CCl4 를 이용하여 간 "손상(injury)"을 유도하여, 그에 의해 섬유화 유도 독극물의 분비를 유발하는 것을 이용하여 유도될 것이다. 상당한 세포 사망 없이, 섬유화를 유도할 농도를 결정하기 위해 용량 증가 실험(dose escalating experiment)이 수행될 수 있다.
이러한 오가노이드를 고효율 대용량(high-throughput) 테스트를 위해 대량 생산할 수 있고, 간 섬유화에 대한 영향을 오가노이드의 각 구성요소를 조작하고 평가할 수 있다. 오가노이드는 활성화된 HSC에서 PRC(polycomb repressor complex)의 메틸트랜스퍼라아제 및 성분인 EZH2의 발현의 높은 수준을 보여서, HSC의 근섬유모세포 표현형으로의 활성화를 보여준다.
면역형광 조직화학: inForm 소프트웨어 패키지를 이용하여 섬유화 간 또는 오가노이드 절편을 검사한다. 섬유화를 입증하기 위해 절편을 H&E에 의해 염색할 것이다. 섬유화 간 또는 오가노이드는 또한 근섬유모세포 마커, 예를 들면, 콜라겐 I, 데스민(Desmin) 및 αSMA에 대해 염색될 것이다. cellSens 이미징 소프트웨어를 이용하여, 섬유화 간 내에서 근섬유모세포 마커 발현의 동시 국소화(colocalization)를 결정하기 위해 3개의 마커 모두를 멀티스펙트럼(multispectrally) 이미징할 것이다. 이미징 후에, (콜라겐 I, 데스민, 및/또는 αSMA 양성 염색에 의해 나타나는) 근섬유모세포의 비율을 결정하기 위해 inForm가 이용될 것이다. 간 절편은 또한 근섬유모세포 마커에 의한 EZH2/H3K27me3의 동시 국소화에 의해 EZH2와 근섬유모세포 존재 간의 상관관계에 대해 분석될 것이다.
실시예
3
인 비트로 및 인 비보에서 오가노이드에서 간 섬유화를 조절하기 위해 HSC를 조작한다. 예를 들면, 섬유화를 유도하고, 그러한 활성에 대해 공지된 작용제(예를 들면, GSK126)로 EZH2 활성을 억제할 수 있다. 오가니오드에 높은 비율의 HSC가 존재하나, 그들은 표준 간 분화/유지 배지(standard liver differentiation/maintenacne media) 하에서 섬유화 표현형을 유도하지 않는 것으로 확인되었다. 이는 이들이 일차/휴지(quiescent) HSC라는 사실 때문일 수 있다.
일련의 정량적 이미징 방법(a suite of quantitative imaging methodologies)이 인 비트로에서 오가노이드 및 이식시, 전임상 모델(pre-clinical model)(예를 들면, 마우스 간) 중 섬유화를 측정하기 위해 척도(metrics)를 부여하기 위해 이용될 수 있다. 각 카테고리별 주요한 척도를 이용하여, 섬유화 표현형의 여러 양태가 측정될 수 있다: HSC 및 KC 활성화, 간 조직 구조(anatomy), 기능 및 손상 및 ECM 특성.
간 오가노이드 모델은 항-섬유화 치료제, 예를 들면, 인간 환자에서 현재 시험되고 있는 크로마틴-변형 효소의 억제제의 신속한 스크리닝을 가능하게 하고, 이는 임상 시험으로 빠르게 전환(translate)될 수 있다.
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전술된 내용은 본 발명을 설명하며, 그를 한정하는 것으로 받아들여서는 안 된다. 본 발명은 하기의 청구항에 의해 정의되며, 청구항의 균등물은 그에 속한다.
Claims (22)
- 간 섬유화를 위한 모델 시스템(model system)으로서, 상기 시스템은 간 세포외 매트릭스, 및 상기 매트릭스 상에 있는 포유동물 간 세포의 조합을 포함하고, 상기 조합은:
(a) 간 전구체 세포(liver progenitor cell),
(b) 쿠퍼 세포, 및
(c) 간 성상 세포(hepatic stellate cell)를 포함하는 것인 모델 시스템. - 청구항 1에 있어서, 상기 간 세포외 매트릭스 및 상기 매트릭스 상에 있는 상기 포유동물 간 세포의 조합은 스페로이드(spheroid)의 형태로 제공되는 것인 모델 시스템.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 조합은 개수 기준으로, 70 내지 90 퍼센트의 간 전구체 세포, 5 내지 20 퍼센트의 쿠퍼 세포, 및 5 내지 20 퍼센트의 간 성상 세포를 포함하는 것인 모델 시스템.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 성상 세포는 활성화된 간 성상 세포 및/또는 근섬유모세포(예를 들면, EZH2를 발현하는 세포)를 포함하는 것인 모델 시스템.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 세포외 매트릭스는 탈세포화 간 조직(예를 들면, 탈세포화 간 디스크)을 포함하는 것인 모델 시스템.
- 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템이 조직 배양 디쉬에 제공되는 것인 모델 시스템.
- 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템이 모듈형(modular) 및/또는 미세유체(microfluidic) 장치에 제공되는 것인 모델 시스템.
- 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 인 비보로 이식가능한 것인 모델 시스템.
- 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 전구체 세포, 쿠퍼 세포 및/또는 간 성상 세포는 인간 세포인 것인 모델 시스템.
- 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 세포외 매트릭스는 비-인간(non-human) 포유동물 간 세포외 매트릭스인 것인 모델 시스템.
- 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매트릭스 상에 있는 포유동물 간 세포의 조합은 1주 내지 4주 동안 인 비트로에서 배양된 것인 모델 시스템.
- 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모델 시스템은 담관 구조체(biliary ductal structure) 및/또는 군집화된 간 세포(clustered hepatoctyes)와 같은 간 구조체를 포함하는 것인 모델 시스템.
- 간 섬유화를 조절하는 목적 작용제(agent of interest)의 활성을 스크리닝하는 방법으로서:
(a) 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항의 모델 시스템을 제공하는 단계,
(b) 상기 목적 작용제를 상기 모델 시스템과 접촉시키는 단계,
(c) 상기 모델 시스템에서 섬유화를 측정하는 단계, 및
(d) 상기 접촉에 대한 반응으로 섬유화가 증가 또는 감소되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하여, 간 섬유화를 조절하는 목적 작용제의 활성을 스크리닝하는 것인 방법. - 청구항 13에 있어서, 상기 모델 시스템이 조직 배양 디쉬에 제공되는 것인 방법.
- 청구항 13 또는 청구항 14에 있어서, 상기 모델 시스템이 모듈형 및/또는 미세유체 장치에 제공되는 것인 방법.
- 청구항 13에 있어서, 상기 모델 시스템이 인 비보로 간 조직 상에 또는 간 조직 내에 이식되는 것인 방법.
- 청구항 13 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정하는 단계는 상기 모델 시스템에서 EZH2의 활성을 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 13 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정하는 단계는 광학적 투명화(예를 들면, inCITE 광학적 투명화) 및 분석을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 13 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목적 작용제는 EZH2 억제제(예를 들면, GSK-126), 안지오텐신 타입 1(AT1) 수용체 차단제(예를 들면, 로스타틴), 할로푸기논(halofuginone), 라이실 산화효소(lysyl oxidase) 또는 lox-유사 효소 억제제(lox-like enzyme inhibitor), A2B 아데노신 수용체 길항제, 또는 단일클론 항체(monoclinal antibody) (예를 들면, GS-6624(심투주맙))인 것인 방법.
- 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항의 모델 시스템을 제조하는 방법으로서:
(a) 간 세포외 매트릭스를 제공하는 단계, 및
(b) 간 전구체 세포, 쿠퍼 세포, 및 간 성상 세포를 상기 간 세포외 매트릭스에 접종하는 단계, 및 그 후,
(c) 상기 매트릭스 상에서 상기 세포를 인 비트로 증식시키는 단계를 포함하여, 상기 간 섬유화를 위한 모델 시스템을 형성하는 것인 방법. - 청구항 20에 있어서, 상기 증식은 1주 내지 3주의 시간 동안 수행되는 것인 방법.
- 청구항 20 또는 청구항 21에 있어서, 상기 모델 시스템에 섬유형성 유도성(pro-fibrogenic) 사이토카인 또는 화합물을 투여하는 것에 의해 상기 간 성상 세포를 활성화시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
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