WO2013063755A1

WO2013063755A1 - 一种治疗肝纤维化和/或治疗乙肝和/或改善肝功能的寡肽

Info

Publication number: WO2013063755A1
Application number: PCT/CN2011/081620
Authority: WO
Inventors: 雷海民; 李强
Original assignee: Lei Haimin; Li Qiang
Priority date: 2011-11-01
Filing date: 2011-11-01
Publication date: 2013-05-10
Also published as: US8957019B2; US20140221275A1

Abstract

本发明公开一种治疗肝纤维化和/或治疗乙肝和/或改善肝功能的寡肽，由鳖甲经水回流提取、醇沉、过阳离子交换树脂柱和凝胶树脂柱分离得到，本发明制备的寡肽可加入药学上常规的辅料，制备成各种剂型。该寡肽在治疗肝纤维化和改善肝功能方面具有很好的疗效。

Description

一种治疗肝纤维化和 /或治疗乙肝和 /或改善肝功能的寡肽技术领域

本发明涉及寡肽，具体地说是从中药鳖曱中提取分离具有抗乙肝、抗肝纤维化和抗肿瘤的寡肽。背景技术

鳖曱来源于鳖科动物鳖 Triony c Sinensis Wiegmann的背曱。主产于湖北、湖南等地，具有软坚散结，养阴清热，潜阳熄风的功效。现代药理研究表明，其具有抗突变作用、抗疲劳及免疫调节作用和保肝作用等。

现有文献中普遍认为氨基酸为鳖曱的主要成分（龟板、鳖曱炮制前后化学成分的变化.中国药学杂志， 1989,24(1):26 ~ 28 ), 没有明确指出鳖曱的活性成分为寡肽类。经过试验研究，我们确定了鳖曱中主要含有寡肽类成分。

现有国内外文献和技术中，除了发明人，没有对鳖曱的寡肽类成分进行提取、分离和鉴定。

现有国内外文献和技术中，也没有对序列号为 GAGPHGG和 GAGPHG 的寡肽进行合成，只是报道了大量的肽类合成方法。

现有国内外文献和技术中，也没有对序列号为 GAGPHGG和 GAGPHG 的寡肽进行任何形式的活性报道。发明内容

本发明的目的在于提供一种抗乙肝病毒、治疗肝纤维化的寡肽；本发明的目的还在于提供一种抗乙肝病毒、治疗肝纤维化的寡肽的制备方法；

本发明的目的还在于提供一种寡肽在治疗乙肝、肝损伤及肝纤维化疾病的方法；

本发明的目的还在于提供一种寡肽在在制备治疗乙肝、肝损伤及肝纤维化疾病药物中的应用。本发明是以软坚散结中药鳖曱为研究对象，利用各种化学分析分离鉴定技术和方法，对鳖曱寡肽类成分进行系统地分离和鉴定，利用液相肽合成技术对单体寡肽类成分进行全合成，利用鸭乙肝模型、小鼠 CCL4急性肝损伤模型、大鼠 CCL4肝纤维化模型和 S180实体荷瘤鸡小鼠模型，对单体寡肽类成分进行活性测定，以寻找抗乙肝病毒、抗肝纤维化、抗肿瘤的寡肽类先导化合物。

为实现上述发明目的，可以选择如下方案 1或方案 2。

方案 1:

本发明提供一种抗乙肝病毒、治疗或预防肝纤维化寡肽，其 SEQ.ID.N0.1 为： Gly-Ala-Gly-Pro-His-Gly-Gly。

所述 SEQ.ID.NO.1 寡肽为白色无定形粉末，双缩脲反应呈阳性，易溶于水，不溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿等非极性溶剂，其氨基酸序列经 ESI-MS分析 ESI-MS(M/e): 551(GAGPHGG),494(AGPHGG),423(GPHGG), 366(PHGG), 269(HGG), 132(GG),75(G)和 478(GAGPHG)、 421(GAGPH)、 284(GAGP)、 187(GAG)、 130(GA)、 59 ( G+H-OH )„

所述 SEQ.ID.NO.l寡肽为 L型氨基酸或 D型氨基酸。

本发明提供一种 SEQ.ID.NO.l 寡肽的制备方法，该方法为：由鳖曱中分离 SEQ.ID.NO.l寡肽。

所述 SEQ.ID.NO.l寡肽的制备方法，该方法包括如下步骤：

步骤 1 : 鳖曱粗粉，加水，回流提取，浓缩，浓缩液；

步骤 2: 步骤 1的浓缩液加醇进行醇沉，得到醇沉部分；

步骤 3: 步骤 2的醇沉部分进行分离，检测，收集 SEQ.ID.NO.l寡肽。上述 SEQ.ID.NO.l寡肽的制备方法，其中步骤 2中优选 2-4次醇沉，每次醇沉乙醇的浓度由低至高。

所述步骤 3的分离为先进行阳离子交换树脂分离，后进行凝胶柱层析；所述步骤 3的检测可以采用高效液相（HPLC )方法检测,质谱（ESI-MS ) 确证。

上述 SEQ.ID.NO.l寡肽的制备方法，其中步骤 2为：步骤 1的回流提取液加乙醇至醇浓度为 20%, 离心，上清液继续加乙醇至醇浓度为 60%, 离心，上清液继续加乙醇至醇浓度为 80%;

上述 SEQ.ID.N0.1寡肽的制备方法，其中步骤 3优选为：将乙醇沉淀部分溶解，先进行阳离子交换树脂分离，后进行 Sephadex LH-20凝胶柱层析， HPLC检测，收集 SEQ.ID.NO.1寡肽。

上述 SEQ.ID.N0.1寡肽的制备方法，其中步骤 3:取 80%醇沉部分，水溶，上阳离子交换树脂， PH=4-5 的緩沖液洗脱，收集双缩尿试剂反应阳性部分，合并，冷冻干燥，水溶，上 Sephadex LH-20凝胶柱层析，纯水洗脱，收集 HPLC 检测单一色语峰流分，合并，冷冻干燥，收集 SEQ.ID.NO.1寡肽。

上述 SEQ.ID.N0.1寡肽的制备方法，其中步骤 1 中鳖曱粗粉（醋制 )加 6- 10倍量水，回流提取 1 -3次，每次 1 -2小时，提取液浓缩至相对密度为 1.1 - 1.13。

本发明还进一步提供 SEQ.ID.NO.1 寡肽的制备方法，该方法用液相合成方法得到。

本发明还进一步提供 SEQ.ID.NO.1 寡肽的制备方法，该方法用固相合成方法得到。

所述寡肽序列的鉴定步骤如下：

1、利用双缩脲反应进行化学鉴定，后分别对水，乙酸乙酯、丙酮、氯仿等溶剂的溶解性进行鉴定；

2、测定所述的寡肽的分子量， ESI-MS:574 ( M+Na ), 552 ( M+H );

3、进行硅胶薄层鉴定初步确定氨基酸的种类；

4、利用电喷雾质谱（ ESI-MS )及氨基酸自动分析仪进行分析得到两种寡肽的氛基酸序列。

本发明提供任何可方便给药形式的 SEQ.ID.N0.1 寡肽的药用组合物，包括经口或胃肠外给药形式。它们特别适合制备为注射给药形式。

上述 SEQ.ID.N0.1寡肽可加入药学上常规的辅料，制备成各种剂型，包括注射剂、片剂（骨架片、包衣片、分散片等）、胶嚢剂、緩释剂、控释剂、月旨质体等剂型、。

为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：溶剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。溶剂包括注射用水、甘油、聚乙二醇，填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、曱壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧曱基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧曱基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基曱基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基曱基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯曱酸、苯曱酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括： PEG6000, PEG4000, 虫蜡等。

本发明进一步提供抗乙肝病毒或抗肝纤维化的方法，该方法包括每日给予需要的药学上可接受形式的 SEQ.ID.NO.1。

本发明进一步提供 SEQ.ID.NO.1在制备用于治疗肝纤维化和 /或改善肝功能的药物中的应用。

本发明进一步提供 SEQ.ID.NO.1在制备抗乙肝病毒药物中的应用。

本发明进一步提供 SEQ.ID.NO.1在制备抗抗肿瘤药物中的应用。方案 2:

本发明提供一种抗乙肝病毒、抗肝纤维化寡肽，其 SEQ.ID.N0.2 为： Gly-Ala-Gly-Pro-His-Gly。

所述 SEQ.ID.N0.2为白色无定形粉末。双缩脲反应阳性，易溶于水，不溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿等非极性溶剂。其氨基酸序列经 ESI-MS 分析， ESI-MS(M/e):494(GAGPHG),423(AGPHG), 366(GPHG), 269(PHG), 132(HG), 75(G)和 421(GAGPH)、 284(GAGP)、 187(GAG)、 130(GA)、 59 ( G+H-OH )数据所确证。

所述 SEQ.ID.N0.2寡肽为 L型氨基酸或 D型氨基酸。

本发明提供一种 SEQ.ID.N0.2 寡肽的制备方法，该方法为：由鳖曱中分离 SEQ.ID.N0.2寡肽。

所述 SEQ.ID.N0.2寡肽的制备方法，该方法包括如下步骤：

步骤 1 : 鳖曱粗粉，加水，回流提取，浓缩，浓缩液；步骤 2: 步骤 1的浓缩液加醇进行醇沉，得到醇沉部分；

步骤 3: 步骤 1的醇沉部分进行分离，检测，收集 SEQ.ID.N0.2寡肽。上述 SEQ.ID.N0.2寡肽的制备方法，其中步骤 2中优选 2-4次醇沉，每次醇沉乙醇的浓度由低至高。

所述步骤 3的分离为先进行阳离子交换树脂分离，后进行凝胶柱层析；所述步骤 3的检测可以采用高效液相 ( HPLC )方法检测，质谱（ ESI-MS ) 确证。

上述 SEQ.ID.N0.2寡肽的制备方法，其中步骤 2为：步骤 1的回流提取液加乙醇至醇浓度为 20%, 离心，上清液继续加乙醇至醇浓度为 60%, 离心，上清液继续加乙醇至醇浓度为 80%;

上述 SEQ.ID.N0.2寡肽的制备方法，其中步骤 3优选为：将乙醇沉淀部分溶解，先进行阳离子交换树脂分离，后进行 Sephadex LH-20凝胶柱层析， HPLC检测，收集 SEQ.ID.N0.2寡肽。

上述 SEQ.ID.N0.2寡肽的制备方法，其中步骤 3: 取 80%醇沉部分，水溶，上阳离子交换树脂， PH=4-5 的緩沖液洗脱，收集双缩尿试剂反应阳性部分，合并，冷冻干燥，水溶，上 Sephadex LH-20凝胶柱层析，纯水洗脱，收集 HPLC 检测单一色语峰流分，合并，冷冻干燥，收集 SEQ.ID.N0.2寡肽。

上述 SEQ.ID.N0.2寡肽的制备方法，其中步骤 1 中鳖曱粗粉（醋制 )加 6- 10倍量水，回流提取 1 -3次，每次 1 -2小时，提取液浓缩至相对密度为 1.1 - 1.13。

所述寡肽序列的鉴定步骤如下：

2、测定所述的寡肽的分子量， ESI-MS: 517 ( M+Na ) , 495 ( M+H );

3、进行硅胶薄层鉴定初步确定氨基酸的种类；

本发明还进一步提供 SEQ.ID.N0.2 寡肽的制备方法，该方法用液相合成方法得到。

本发明还进一步提供 SEQ.ID.N0.2 寡肽的制备方法，该方法用固相合成方法得到。

本发明提供任何可方便给药形式的 SEQ.ID.N0.2 寡肽的药用组合物，包括经口或胃肠外给药形式。它们特别适合制备为经注射给药形式。

上述 SEQ.ID.N0.2寡肽可可加入药学上常规的辅料，制备成各种剂型，包括注射剂、片剂（骨架片、包衣片、分散片等）、胶嚢剂、微乳剂、緩释剂、控释剂、脂质体等剂型、颗粒剂、栓剂、液体制剂如口服。

为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：例如：溶剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。溶剂包括注射用水、甘油、聚乙二醇；填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、曱壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧曱基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧曱基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基曱基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基曱基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯曱酸、苯曱酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括： PEG6000, PEG4000, 虫蜡等。

本发明进一步提供抗乙肝病毒或抗肝纤维化的方法，该方法包括每日给予需要的药学上可接受形式的 SEQ.ID.N0.2。能的药物中的应用。

本发明进一步提供 SEQ.ID.N0.2在制备抗乙肝病毒药物中的应用。

本发明进一步提供 SEQ.ID.N0.2在制备抗抗肿瘤药物中的应用。附图说明：

附图 1 : 寡肽化合物 1的液相图；

附图 2：寡肽化合物 2的液相图；

附图 3-11 : 寡肽化合物 1氨基酸分析仪得到的氨基酸序列图，附图 3: 空白对照图，附图 4: N端甘氨酸分析图，附图 5: N端丙氨酸分析图，附图 6: N 端甘氨酸分析图，附图 7: N端脯氨酸分析图，附图 8: N端组氨酸分析图，附图 9: N端甘氨酸分析图，附图 10: N端甘氨酸分析图，附图 11 : 标准氨基酸图；

附图 12-19: 寡肽化合物 2氨基酸分析仪得到的氨基酸序列图，附图 12: 空白对照图，附图 13: N端甘氨酸分析图，附图 14: N端丙氨酸分析图，附图 15: N端甘氨酸分析图，附图 16: N端脯氨酸分析图，附图 17: N端组氨酸分析图，附图 18: N端甘氨酸分析图，附图 19: 标准氨基酸序列图。具体实施方式

以下为本发明化合物的实施例，但这些实施例并不意味着对本发明的限制。实施例 1 鳖曱中寒肽类化学成分的鉴识、提取、分离和纯化

1. 鳖曱肽类化合物的鉴识 -双缩脲反应

1.1 仪器与试药

DK-98-I型恒温水浴锅； RE-52A型旋转蒸发器； SHB-III型循环水式多用真空泵；鳖曱药材购于同仁堂药店，经北京中医药大学中药学院刘春生教授鉴定为鳖科动物鳖 Trionyx Sinensis Wiegman.的背曱；阳离子交换树脂和 Sephadex LH-20均为进口分装，所用化学试剂均为分析纯。

1.2方法与结果

取鳖曱水提液 2mL至试管中，加水稀释至 5mL后加入 4%NaOH溶液 1滴和 1%CUS0₄溶液 1滴，摇匀，随行空白对照，观察显色。鳖曱水提物溶液呈蓝紫色。

1.3结论

鳖曱水提物溶液与双缩脲反应阳性，表明鳖曱中确实有肽类化合物。

2. 整曱中寡肽类化合物的提取、分离和纯化

2.1 仪器与试药（同 1.1仪器与试药） 2.2 提取、分离和纯化

取鳖曱粗粉 ( 1mm士 0.1mm ) 200g, 加 2000ml蒸馏水回流提取 3次，每次 2小时，提取液浓缩至相对密度为 1.1-1.13 , 依次加乙醇至醇浓度为 20%、 60%、 80%; 取 80%醇沉部分，水溶 20ml或至全溶，进行阳离子交换树脂分离，用 PH=4-5的緩沖液洗脱（ 5%NaAC溶液， HAc调 PH为 4.5 ), 收集双缩脲试剂反应阳性部分，合并，冷冻干燥，水溶，后 Sephadex LH-20凝胶柱层析，纯水洗脱， HPLC检测【HPLC检测条件：色语柱： SB-C18(5 m, 4.6x250mm), 流速： l.Oml/min; 紫外检测波长： 234nm, 210nm; 进样量: ΙΟμΙ^; 柱温： 35 °C , 流动相： 5%乙腈 - 0.1%三氟乙酸水溶液】，收集保留时间 2.67分钟单一流份，合并，冷冻干燥，得到寡肽化合物 1 ( 20mg ) (图 1 ), 收集保留时间 4.89分钟单一流份，合并，冷冻干燥，得到寡肽化合物 2 ( 10mg ) (图 2 )。实施例 2 寡肽 GAGPHGG和 GAGPHG的鉴定

1.材料与仪器

化合物 1 (自制），经 HPLC归一化法纯度测定大于 98%;

化合物 2 (自制），经 HPLC归一化法纯度测定大于 98%;

Agilent 1100 LC-MSD series trap (双高压溶剂泵，在线真空脱气机，自动进样器，柱温箱， DAD检测器， ESI离子阱质语检测器，美国安捷伦公司）；氨基酸自动分析仪（ ABI PROCISETM492cLC );

三氟乙酸（TFA, 美国 Sigma公司 ), 乙腈（色谱纯， fisher公司 ), 盐酸（分析纯）

2.鉴定

化合物 1 : 取实施例 1制备的其中一种白色无定形粉末。进行双缩脲反应呈阳性，易溶于水，不溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿等非极性溶剂。 ESI-MS:574( M+Na ), 552 ( Μ+Η 氨基酸种类的确定：浓 HC1水解后，硅胶薄层检识（薄层条件：硅胶 G板，正丁醇 -冰醋酸-乙醇-水（4:1:1:2 ) 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 0.5%茚三酮丙酮溶液， 105°C加热至斑点显色清晰），经与标准氨基酸（甘氨酸（G )、丙氨酸（A )、脯氨酸（P )、组氨酸（H )共薄层对照，确定化合物 1氨基酸的种类为甘氨酸（G )、丙氨酸（A )、脯氨酸（P )、组氨酸（H )。利用氨基酸序列自动分析仪分析，得到氨基酸序列分析（图 3-11 ), 测序结果为： GAGPHGG , 其氨基酸序列进一步进行 ESI-MS 分析为

GG), 132(GG),75(G)和 478(GAGPHG)、 421(GAGPH)、 284(GAGP)、 187(GAG)、 130(GA)、 59( G+H-OH )数据所确证，其中，质谱条件为： Mass Rang Mode： Ultra Scan, Ion Polarity ： positive, Ion Source Type ： ESI, Dry Temp :350, Nebulizer :50.00psi, Dry Gas : 10.001/min。

化合物 2: 白色无定形粉末。双缩脲反应阳性，易溶于水，不溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿等非极性溶剂。 ESI-MS:517 ( M+Na ) , 495 ( Μ+Η )。氨基酸种类的确定：浓 HCl水解后，硅胶薄层检识（薄层条件：硅胶 G板，正丁醇- 冰醋酸-乙醇-水（4: 1 : 1 :2 )为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 0.5%茚三酮丙酮溶液， 105°C加热至斑点显色清晰），经与标准氨基酸（甘氨酸（G )、丙氨酸（A )、脯氨酸（P )、组氨酸（H ) )共薄层对照，确定化合物 2氨基酸的种类为甘氨酸（G )、丙氨酸（A )、脯氨酸（P )、组氨酸（H )。对上述的寡肽利用氨基酸序列自动分析仪分析，得到氨基酸序列分析，测序结果为： GAGPHG

( 图 12-19 )。对化合物 2 氨基酸序歹 'j 进行 ESI-MS 分析为 ESI-MS(M/e):494(GAGPHG),423(AGPHG), 366(GPHG), 269(PHG), 132(HG),75(G)和 421(GAGPH) 、 284(GAGP) 、 187(GAG) 、 130(GA) 、 59

( G+H-OH )。

其中, 质谱条件为： Mass Rang Mode : Ultra Scan, Ion Polarity ： positive, Ion Source Type： ESI, Dry Temp :350, Nebulizer :50.00psi, Dry Gas : 10.001/min。

实施例 3 寡肽 GAGPHGG和 GAGPHG的合成

1.材料与仪器

制备液相色谱仪；冷冻干燥机； RE-52A型旋转蒸发器； SHB-III型循环水式多用真空泵；

Agilent 1100 LC-MSD series trap (双高压溶剂泵，在线真空脱气机，自动进样器，柱温箱， DAD检测器， ESI离子阱质语检测器，美国安捷伦公司）；氨基酸自动分析仪（ ABI PROCISETM492cLC ) ；

WANG树脂（天津南开和成科技有限公司）、 Sephadex LH-20, 保护氨基酸均为进口分装，化学试剂均为分析纯。

2.合成

参照黄惟德. 《多肽合成》 .科学出版社, 1985,第 1版固相合成部分。

2.1 GAGPHGG的合成：

将 Fmoc-G-OH(O. lmol) (氨基被 9-芴曱氧羰基保护的甘氨酸）及 HOBT ( 1- 羟基苯并三唑）（O. lmol)溶于二氯曱烷（DCM ) 中，然后加入 DIC(N, N-二异丙基碳二亚胺)（ O.lmol ),搅拌 lOmin,再加入已溶胀好的 Wang树脂（ 0.04mol ), 加入 DMAP (催化量 4-二曱氨基吡啶）（ 0.004mol ) , 密封反应容器，控温 25°C-28°C , 反应 10 h, 停止反应，滤去反应液，用 DMF洗剂反应 Wang树脂 2次，滤去 DMF; 用 20%PIP/DMF试剂反应 15-20min脱保护后，用 DCM洗剂树脂多次；加入试剂 1 (制备方法 0.4molFmoc-G-OH及 0.4molHOBT溶于 DCM中，然后加入 O. lmol DIC, 搅拌 10min )、 0.004mol DMAP, 反应 10h, 停止反应，滤去反应液，用 DMF洗剂反应 4对脂 2次，滤去 DMF;

参照上述步骤，依次缩合 Fmoc-H-OH、 Fmoc-P-OH、 Fmoc-G-OH、 Fmo c-A-OH、 Fmoc-G-OH合成反应完毕，加入裂解液（ TFA-硫代苯曱醚 -1 , 2- 乙二硫醇-苯曱醚,体积比为 205 ： 12.5： 7.9： 4.6),避光搅拌反应 3 h。过滤,适量 TFA洗涤树脂。滤液加入冰冻的无水乙醚中,密封,陈化 3 h。离心收集沉淀, 适量冰冻无水乙醚洗涤。沉淀水溶，经 Sephadex LH-20凝胶柱脱盐后，继上制备型 HPLC, 收集单一色语峰流分，合并，冷冻干燥，产率 15.5%。 ESI-MS 分析，出现 574 ( M+Na ) ， 552 ( M+H ), 551 (GAGPHGG),494(AGPHGG),423 (GPHGG), 366(PHGG), 269(HGG), 132(GG),75(G)和 478(GAGPHG)、 421(GA GPH)、 284(GAGP)、 187(GAG)、 130(GA)、 59 ( G+H-OH )„ HPLC 归一化法纯度分析 99.0%。 HPLC归一化法纯度分析 99.0%。

2.2 GAGPHG的合成：

将 Fmoc-G-OH(0. lmol)及 HOBT(0. lmol)溶于二氯曱烷（ DCM )中，然后加入 DIC ( O. lmol ), 搅拌 lOmin, 再加入已溶胀好的 Wang树脂（ 0.04mol ), 加入 DMAP ( 0.004mol ), 密封反应容器，控温 25。-28。反应 10h, 停止反应，滤去反应液，用 DMF洗剂反应树脂 2次，滤去 DMF; 用 20%PIP/DMF试剂反应 15-20min 脱保护后，用 DCM 洗剂树脂多次；加入试剂 1 (制备方法 0.4molFmoc-H-OH及 0.4molHOBT溶于 DCM中，然后加入 O.lmol DIC,搅拌 10min )、 0.004mol DMAP, 反应 10h, 停止反应，滤去反应液，用 DMF洗剂反应树脂 2次，滤去 DMF;

参照上述步骤，依次缩合 Fmoc-P-OH、 Fmoc-G-OH、 Fmoc-A-OH、 Fmoc-G-OH合成反应完毕，加入裂解液（ TFA-硫代苯曱醚 -1 , 2-乙二硫醇 -苯曱醚,体积比为 205 ： 12.5： 7.9： 4.6),避光搅拌反应 3 h。过滤,适量 TFA洗涤树脂。滤液加入冰冻的无水乙醚中,密封,陈化 3 h。离心收集沉淀,适量冰冻无水乙醚洗涤。沉淀水溶，经 Sephadex LH-20凝胶柱脱盐后，继上制备型 HPLC, 收集单一色谱峰流分，合并，冷冻干燥，产率 20.5%。 ESI-MS分析，出现 517

( M+Na ), 495 ( M+H ), 494(AGPHGG),423(GPHGG), 366(PHGG), 269(HGG), 132(GG),75(G)和 421(GAGPH) 、 284(GAGP) 、 187(GAG) 、 130(GA) 、 59

( G+H-OH )。 HPLC归一化法纯度分析 99·0%。

实施例 4 寡肽 GAGPHGG抗鸭乙肝病毒活性测定

1.材料

1.1 动物： 1日龄北京鸭，购自北京前进种鸭饲养场；

1.2 药物：七肽 GAGPHGG (自制测定大于 98%);阳性药物拉米夫定 (葛兰素威康制药公司）。

1.3 主要试剂：鸭乙型肝炎病毒 DNA(DHBV-DNA )强阳性鸭血清 (采自上海麻鸭, - 70°C保存)； a-32p-dCTP (北京福瑞生物技术工程公司）；缺口翻译药盒 (普洛麦格公司）； Sephadex G-50、 Ficoll P VP (瑞典 Pharmacia公司； SDS (Merck公司）;鱼精 DNA、牛血清白蛋白（中国科学院生物物理研究所)。

2.方法

2.1 DHBV感染: 1曰龄北京鸭,经腿胫 iv DHBV-DNA强阳性鸭血清,感染后 7d 取血,分离血清, -70 V保存。

2.2 药物治疗试验: DHBV感染鸭随机分组，七肽给药组分别为 0.5mg/Kg、 lmg/Kg皮下注射，每 2天一次，给药 10d, 病毒对照组,以生理盐水代替药物；阳性药物 (拉米夫定)组， po药物 50mg/kg,每天 2次,连续 10d。给药前、给药 5、 10 d和停药后 3d,分别自鸭腿胫静脉取血,分离血清, -70°C保存待检。

2.3检测方法：取上述待检鸭血清,每批同时点膜,测定鸭血清中 DHBV-DNA 的动态水平。按缺口翻译试剂盒说明书方法,用 32p标记 DHBV-DNA探针，作鸭血清斑点杂交,放射自显影膜片斑点,测定吸光度 )值(490 nm), 计算血清 DHBV-DNA 密度,以杂交斑点 A值作为标本 DHBV-DNA 水平值。

2.4 药效计算：计算每组不同时间点血清 DHBV-DNA 水平的 ±s, 各组用药前后比较采用配对检验，计算 DHBV-DNA抑制率，比较各组鸭血清

DHBV-DNA抑制率的动态变化。给药组与病毒对照组比较，采用成组检验。 DHBV-DNA抑制率 = (给药前 A值- 给药后 A值) /给药前 A值 xl00%

3 结果

DHBV 2DNA感染鸭各组用药前后血清 DHBV-DNA 水平半定量结果见表 1。低剂量组（0.5mg/kg )给药后与病毒对照组比较，鸭血清 DHBV-DNA 水平无显著性降低；高剂量组（lmg/kg )给药后 10d和停药后 3d与病毒对照组比较，鸭血清 DHBV-DNA抑制率显著提高,停药后鸭血清 DHBV-DNA持续降低。表 1 七肽对 DHBV感染鸭血清 DHBV-DNA 水平的影响 ( ± n= 6) 剂 A( 给 A( 抑制抑制抑制量 it) 5d) Wd) 3d) 率⁰ h 率⁰ k 率⁰ k mg/ 给药给药 kg 5d lOd 3d

- 1.083±0. 1.158±0. 1.248±0.2 1.328±0.1 -6.93 -15.2 -22.6

24 16 0 8 4 2

0.5 3.65

1 1.286±0. 1.239±0. 1.198±0.1 1.184±0.1 5.49 6.84 7.93

25 12 16 8 9 6.39 29.91 30.61

1.274±0. 1.204±0. 0·893±0· 1 0.884±0.1

14 21 3 6 48.90 10.72

1.362±0. 1 ·275±0· 0.696±0.2 1.216±0.2

18 09 3 6

与对照组比较， ** Ρ<0.01

4.结论

七肽 GAGPHGG ( lmg/kg )有一定抑制鸭乙肝病毒作用实施例 5 寡肽 GAGPHGG对小鼠急性肝损伤的保护作用

1.材料

1.1 动物：健康昆明小鼠（20g左右，北京维通利华实验动物技术有限公司）。

1.2 药物：七肽 GAGPHGG (自制测定大于 98%);阳性药物联苯双酯滴丸 (北京协和药厂：)。

1.3 主要试剂：丙氨酸氨基转移酶 (ALT),天冬氨酸转氨酶 (AST)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)和丙二醛 (MDA) 试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,其他试剂均为国产分析纯. 使用的仪器有小型离心机（ Sigma 型）、，11 型分光光度计 (厦门分析仪器厂）等。 2.方法：取 60只雄性昆明种小鼠,按照随机数字表法分为正常对照组、模型对照组、联苯双酯组、七肽大、小剂量组，后 2组分别按 0.17mg/kg、 0.085mg/kg 的剂量皮下注射，每 2日一次，连续 7d;联苯双酯组按 100mg/ kg的剂量灌胃，每日 1次,连续 7 d; 正常对照组和模型对照组皮下注射等体积生理盐水；末次给药 1 h后,除正常对照组外,其余各组均按照 5mL/kg剂量腹腔注射给予 0.15 % 的四氯化碳橄榄油溶液,禁食,不禁水， 12h后目艮球取血，分离血清,备用，取血后处死小鼠，解剖，取出肝脏，匀浆，备用。按照试剂盒说明测定各组小鼠血清 ALT , AST 活性和肝组织 GSH-Px活性及 MDA含量，所有数据以均数士标准偏差 (x±SD)表示,各组样本均数间差别的假设检验采用方差分析。

3.结果

3.1 七肽对血清 ALT和 AST 活性的影响由表 2可见,七肽大、小剂量组小鼠血清 ALT,AST活性较模型对照组明显下降，相比较均有显著性差异 (Ρ Ο.ΟΙ)» 表 2七肽对四氯化碳所致肝损伤小鼠血清 ALT和 AST活性的影响 (x±s，U/L) 组别 n 剂量 ( mg/kg ) ALT AST 正常对照组 12 - 36.24 ±9.62 141.36 ±11.26 模型对照组 12 - 346.72 ±46.17 286.78 ±42.15 七肽组 12 0.085 123.24 186.97

±19.73 ±37.56

12 0.17 86.52 ±28.72" 148.62

±31.25 联苯双酯组 12 100 92.36 ±35.27" 156.24

±34.12 与对照组比较， ** P<0.01

3.2七肽对肝组织 GSH-Px活性和 MDA含量的影响由表 3可见,七肽大、小剂量组小鼠肝组织 GSH-Px活性明显高于模型对照组, MDA含量明显低于模型对照组,相比较均有显著性差异（ P<0.01)。

表 3七肽对肝组织 GSH-Px活性和 MDA含量的影响 (x±s mol/ g)

组别 n 剂量（mg/kg ) GSH-PX MDA 正常对照组 12 - 317.56 ±26.52 1.82 ±1.21 模型对照组 12 - 2.27 ±14.71 11.52 ±2.51 七肽组 12 0.085 267.18 6.48 ±1.65**

±32.13**

12 0.17 308.28 2.75士 1.36** 士 38.54**

联苯双酯组 12 100 296.82 5.29士 1.25**

±18.31 **

与对照组比较， ** P<0.01

4.结论：七肽可显著抑制四氯化碳所致急性肝损伤小鼠血清 ALT , AST 活性升高,对四氯化碳急性肝损伤具有保护作用。

实施例 6 寡肽 GAGPHGG抗大鼠肝纤维化作用的实验研究

1.材料

1.1 动物：健康雄性 SD 大鼠（150±10g, 北京维通利华实验动物技术有限公司）。

1.3 主要试剂：丙氨酸氨基转移酶 (ALT),天冬氨酸转氨酶 (AST)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)、丙二醛 (MDA) 、 TGF-PmRNA原位杂交试剂盒和大鼠 ΉΜΡ- ELISA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,其他试剂均为国产分析纯.。

2.方法：将 48只大鼠随机分为对照组、模型组、七肽大剂量和七肽小剂量，每组 12只。用橄榄油将 CC14配成 40 %的溶液，按 5ml/kg给动物皮下注射，每周 2 次，共 8wk; GAGPHGG干预组在造模的同时给予七肽皮下注射 (浓度 0.12mg / kg, 0.06mg / kg, 每 2天 1次，共 8周）。各组动物在最后一次 CC14注射后 48h 处死，取血清和肝组织标本待检。血清按照试剂说明书检测 ALT,AST及 TGFpi 水平，肝组织标本以中性福尔马林溶液固定、石蜡包埋，以多聚赖氨酸涂布的载玻片制作 5ttm组织切片，进行 HE染色和 Masson三重胶原染色作组织病理学检查。

3.结果

3.1 七肽对肝纤维化大鼠血清 ALT和 AST水平的影响由表 4可见,七肽大、小剂量组肝纤维化大鼠 ALT,AST水平较模型对照组明显下降，相比较均有显著性差异 (P <0.01)。

表 4七肽对肝纤维化大鼠血清 ALT和 AST7J平的影响 (x±s，U/L)

组别 n 剂量 ( mg/kg ) ALT AST 正常对照组 12 - 38.67 ±8.46 85.63 ±12.21 模型对照组 10 - 296.38 ±76.82 484.51 七肽组 12 0.06 148.24 ±136.06

±32.52 180.35

±28.49

12 0.12 96.37 ±35.12** 108.75

±42.21 与对照组比较， ** Ρ<0.01

3.2七肽对肝纤维化大鼠肝组织 TGFpi和胶原面积的影响由表 5可见，四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠血清 TGFP1水平显著升高 (PO.01),表明肝纤维化形成过程伴随有 TGFpi合成的显著增加，从而促进肝脏胶原纤维的合成与沉积；七肽大剂量组预防性治疗的大鼠血清 TGFpi水平则显著减少（与模型组比较 PO.01 ), 肝脏胶原平均面积亦显著减少（与模型组比较 PO.01 )七肽小剂量组有减少的趋势，但无统计学意义。

表 5七肽对肝纤维化大鼠肝组织 TGFpi和胶原面积的影响（x±s) 组别 n 剂量 ( mg/kg ) TGF i ( mg/L ) 胶原面积

( μηι2 ) 正常对照组 12 - 15.62±6.59 66.28 ±13.52 模型对照组 10 - 96.82±16.32 632.57 七肽组 12 0.06 74.24±18.58 ±121.36

380.82 ±78.89

12 0.12 32·65±11·02** 138.12

±62.58 与对照组比较， ** Ρ<0.01

4.结论：七肽 GAGPHGG有一定抗肝纤维化作用，其抗肝纤维化机理尚需进一步研究。实施例 7 取七肽 GAGPHGGlOg, 加入注射剂（包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂 )适当辅料，按注射剂（包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂 )工艺制备成注射剂。

实施例 8 取七肽 GAGPHGGlOg, 加入片剂（包括緩控释片、骨架片、包衣片、分散片等）适当辅料，按片剂（包括緩控释片、骨架片、包衣片、分散片等）工艺制备成舌下片、片剂。

实施例 9 取七肽 GAGPHGGlOg, 加入胶嚢剂适当辅料，按胶嚢剂工艺制备成肠溶胶嚢剂、胶嚢剂。

实施例 10 取七肽 GAGPHGG 10g, 加入乳剂（包括微乳、纳米乳等）适当辅料，按乳剂（包括微乳、纳米乳等）工艺制备成微乳剂。

实施例 11 取七肽 GAGPHGGlOg, 加入緩释控释剂适当辅料，按緩释控释剂工艺制备成各种緩释、控释剂。

实施例 12 取七肽 GAGPHGGlOg, 加入脂质体剂型适当辅料，按脂质体工艺制备成各种脂质体剂型。

Claims

权利要求书

1、一种具有 SEQ.ID.NO.l ( GAGPHGG )氨基酸序列的寡肽。

2、如权利要求 1所述的寡肽，其为 L型氨基酸或 D型氨基酸。

3、如权利要求 1所述的寡肽，其由鳖曱中分离。

4、如权利要求 1所述的寡肽的制备方法，其为液相或固相合成方法。

5、如权利要求 3所述的寡肽的制备方法，该方法包括如下步骤：步骤 1 : 鳖曱粗粉，加水，回流提取，浓缩，浓缩液；

步骤 2: 步骤 1的浓缩液加醇进行醇沉，得到醇沉部分；

步骤 3: 步骤 2的醇沉部分进行分离，检测，收集 SEQ.ID.NO.l寡肽。

6、如权利要求 5所述的方法，其中：步骤 2中醇沉 2-4次，每次醇沉乙醇的浓度由低至高。

7、如权利要求 5所述的方法，其中步骤 3的分离为先进行阳离子交换树脂分离，后进行凝胶柱层析。

8、如权利要求 5所述的方法，其中所述步骤 3的检测为采用高效液相方法检测，质谱（ESI-MS )确证。

9、一种药物组合物，包括活性成分为权利要求 1的寡肽及药学上可接受的载体。

10、一种抗 HBV或肝纤维化的方法，该方法包括每日给予需要的药学上可接受形式的 SEQ.ID.NO.1。

11、 SEQ.ID.NO.l 在制备用于治疗肝纤维化和 /或治疗乙肝和 /或改善肝功能的药物中的应用。

12、 SEQ.ID.NO.l在制备抗 HBV药物中的应用。

13、一种具有 SEQ.ID.N0.2 ( GAGPHG )氨基酸序列的寡肽。

14、如权利要求 13所述的寡肽，其为 L型氨基酸或 D型氨基酸。

15、如权利要求 13所述的寡肽，其由鳖曱中分离。