CN102268066B - 抗乙肝病毒寡肽及其衍生物 - Google Patents
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Abstract
本发明是从中药鳖甲中分离得到2个寡肽类成分，其序列号为GAGPHGG、GAGPHG，并合成之。作为药物，其在抗乙肝病毒、抗肝纤维化、抗肿瘤和提高免疫方面具有广泛的开发前景。
Description
技术领域
本发明属于天然药物化学成分提取分离鉴定和合成，具体地说是从中药鳖甲中提取分离具有抗乙肝、抗肝纤维化和抗肿瘤的2个活性寡肽，并通过人工合成的方法得到。
背景技术
鳖甲来源于鳖科动物鳖Trionyx Sinensis Wiegmann的背甲。主产于湖北、湖南、等地，具有软坚散结，养阴清热，潜阳熄风的功效。现代药理研究表明，其具有抗突变作用、抗疲劳及免疫调节作用和保肝作用等。
现有文献中普遍认为氨基酸为鳖甲的主要成分(龟板、鳖甲炮制前后化学成分的变化.中国药学杂志，1989，24(1)：26～28)，没有明确指出鳖甲的活性成分为寡肽类。经过试验研究，我们确定了鳖甲中主要含有寡肽类成分。
现有国内外文献和技术中，除过发明人，没有对鳖甲的寡肽类成分进行提取、分离和鉴定。
现有国内外文献和技术中，也没有对序列号为GAGPHGG和GAGPHG的寡肽进行合成，只是报道了大量的肽类合成方法。
现有国内外文献和技术中，也没有对序列号为GAGPHGG和GAGPHG的寡肽进行任何形式的活性报道。
发明内容
本发明是以软坚散结中药鳖甲为研究对象，利用各种化学分析分离鉴定技术和方法，对鳖甲寡肽类成分进行系统地分离和鉴定，利用液相肽合成技术对单体寡肽类成分进行全合成，利用鸭乙肝模型、小鼠CCL4急性肝损伤模型、大鼠CCL4肝纤维化模型和S180实体荷瘤鸡小鼠模型，对单体寡肽类成分进行活性测定，以寻找抗乙肝病毒、抗肝纤维化、抗肿瘤的寡肽类先导化合物。
为解决该技术问题，本发明研究了下述技术解决方案。
1.鳖甲中寡肽类化学成分的鉴识、提取、分离和纯化
2.鳖甲中寡肽类化学成分GAGPHGG和GAGPHG的鉴定
3.寡肽GAGPHGG和GAGPHG的合成
4.寡肽GAGPHGG的抗鸭乙肝病毒活性测定
5.寡肽GAGPHGG对小鼠急性肝损伤的保护作用
6.寡肽GAGPHGG抗大鼠肝纤维化作用
7.寡肽GAGPHGG的各类剂型的制备
具体实施方式
以下为本发明化合物的实施例，但这些实施例并不意味着对本发明的限制。
实施例1鳖甲中寡肽类化学成分的鉴识、提取、分离和纯化
1.鳖甲肽类化合物的鉴识-双缩脲反应
1.1仪器与试药
DK-98-Ⅰ型恒温水浴锅；RE-52A型旋转蒸发器；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵；鳖甲药材购于同仁堂药店，经本人鉴定为鳖科动物鳖Trionyx SinensisWiegman.的背甲；阳离子交换树脂和Sephadex LH-20均为进口分装，所用化学试剂均为分析纯。
1.2方法与结果
取鳖甲水提液2mL至试管中，加水稀释至5mL后加入4％NaOH溶液1滴和1％CuSO4溶液1滴，摇匀，随行空白对照，观察显色。鳖甲水提物溶液呈蓝紫色。
1.3结论
鳖甲水提物溶液与双缩脲反应阳性，表明鳖甲中确实有肽类化合物。
2.鳖甲中寡肽类化合物的提取、分离和纯化
2.1仪器与试药(同1.1仪器与试药)
2.2提取、分离和纯化
取鳖甲粗粉(20目)200g，加2000ml蒸馏水回流提取3次，每次2小时，提取液浓缩至相对密度为1.1-1.13，依次加乙醇至醇浓度为20％、60％、80％；取80％醇沉部分，水溶，上阳离子交换树脂，PH＝4-5的缓冲液洗脱，收集双缩尿试剂反应阳性部分，合并，冷冻干燥，水溶，继上Sephadex LH-20凝胶柱层析，纯水洗脱，收集HPLC检测单一色谱峰流分，合并，冷冻干燥，分别得到寡肽化合物1(20mg)和化合物2(10mg)。
实施例2寡肽GAGPHGG和GAGPHG的鉴定
1.材料与仪器
化合物1(自制)，经HPLC归一化法纯度测定大于98％；
化合物2(自制)，经HPLC归一化法纯度测定大于98％；
Agilent 1100 LC-MSD series trap(双高压溶剂泵，在线真空脱气机，自动进样器，柱温箱，DAD检测器，ESI离子阱质谱检测器，美国安捷伦公司)；
氨基酸自动分析仪(ABI PROCISETM492cLC)；
三氟乙酸(TFA，美国Sigma公司)，乙腈(色谱纯，fisher公司)，盐酸(分析纯)
2.鉴定
化合物1：白色无定形粉末。双缩脲反应阳性，易溶于水，不溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿等非极性溶剂。ESI-MS：574(M+Na)，552(M+H)。氨基酸种类的确定：6N HCI水解后，硅胶薄层检识(薄层条件：正丁醇-冰醋酸-乙醇-水(4∶1∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.5％茚三酮丙酮溶液，105℃加热至斑点显色清晰)，氨基酸的种类初步定为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、脯氨酸(P)、组氨酸(H)。氨基酸序列分析，测序结果为：GAGPHGG。
化合物2：白色无定形粉末。双缩脲反应阳性，易溶于水，不溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿等非极性溶剂。ESI-MS：517(M+Na)，495(M+H)。氨基酸种类的确定：6N HCI水解后，硅胶薄层检识(薄层条件：正丁醇-冰醋酸-乙醇-水(4∶1∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.5％茚三酮丙酮溶液，105℃加热至斑点显色清晰)，氨基酸的种类初步定为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、脯氨酸(P)、组氨酸(H)。氨基酸序列分析，测序结果为：GAGPHG。
实施例3寡肽GAGPHGG和GAGPHG的合成
1.材料与仪器
制备液相色谱仪；冷冻干燥机；RE-52A型旋转蒸发器；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵；
Agilent 1100 LC-MSD series trap(双高压溶剂泵，在线真空脱气机，自动进样器，柱温箱，DAD检测器，ESI离子阱质谱检测器，美国安捷伦公司)；
氨基酸自动分析仪(ABI PROCISETM492cLC)；
WANG树脂(天津南开和成科技有限公司)、Sephadex LH-20、保护氨基酸均为进口分装，化学试剂均为分析纯。
2.合成
2.1GAGPHGG的合成：
将Fmoc-G-OH(0.1mol)及HOBT(0.1mol)溶于二氯甲烷(DCM)中，然后加入DIC(0.1mol)，搅拌10min，再加入已溶胀好的Wang树脂(0.04mol)，加入DMAP(0.004mol)，密封反应容器，控温25°-28°，反应10h，停止反应，滤去反应液，用DMF洗剂反应树脂2次，滤去DMF；用20％PIP/DMF试剂反应15-20min脱保护后，用DCM洗剂树脂多次；加入试剂1(制备方法0.4molFmoc-G-OH及0.4molHOBT溶于DCM中，然后加入0.1mol DIC，搅拌10min)、0.004mol DMAP，反应10h，停止反应，滤去反应液，用DMF洗剂反应树脂2次，滤去DMF；参照上述步骤，依次缩合Fmoc-H-OH、Fmoc-P-OH、Fmoc-G-OH、Fmoc-A-OH、Fmoc-G-OH合成反应完毕，加入裂解液(TFA-硫代苯甲醚-1，2-乙二硫醇-苯甲醚，体积比为205∶12.5∶7.9∶4.6)，避光搅拌反应3h。过滤，适量TFA洗涤树脂。滤液加入冰冻的无水乙醚中，密封，陈化3h。离心收集沉淀，适量冰冻无水乙醚洗涤。沉淀水溶，经Sephadex LH-20凝胶柱脱盐后，继上制备型HPLC，收集单一色谱峰流分，合并，冷冻干燥，产率15.5％。ESI-MS分析，出现574(M+Na)，552(M+H)峰。HPLC归一化法纯度分析99.0％。
2.2GAGPHG的合成：
将Fmoc-G-OH(0.1mol)及HOBT(0.1mol)溶于二氯甲烷(DCM)中，然后加入DIC(0.1mol)，搅拌10min，再加入已溶胀好的Wang树脂(0.04mol)，加入DMAP(0.004mol)，密封反应容器，控温25°-28°反应10h，停止反应，滤去反应液，用DMF洗剂反应树脂2次，滤去DMF；用20％PIP/DMF试剂反应15-20min脱保护后，用DCM洗剂树脂多次；加入试剂1(制备方法0.4molFmoc-H-OH及0.4molHOBT溶于DCM中，然后加入0.1mol DIC，搅拌10min)、0.004mol DMAP，反应10h，停止反应，滤去反应液，用DMF洗剂反应树脂2次，滤去DMF；参照上述步骤，依次缩合Fmoc-P-OH、Fmoc-G-OH、Fmoc-A-OH、Fmoc-G-OH合成反应完毕，加入裂解液(TFA-硫代苯甲醚-1，2-乙二硫醇-苯甲醚，体积比为205∶12.5∶7.9∶4.6)，避光搅拌反应3h。过滤，适量TFA洗涤树脂。滤液加入冰冻的无水乙醚中，密封，陈化3h。离心收集沉淀，适量冰冻无水乙醚洗涤。沉淀水溶，经Sephadex LH-20凝胶柱脱盐后，继上制备型HPLC，收集单一色谱峰流分，合并，冷冻干燥，产率20.5％。ESI-MS分析，出现517(M+Na)，495(M+H)峰。HPLC归一化法纯度分析99.0％。
实施例4寡肽GAGPHGG抗鸭乙肝病毒活性测定
1.材料
1.1动物：1日龄北京鸭，购自北京前进种鸭饲养场；
1.2药物：七肽GAGPHGG(自制测定大于98％)；阳性药物拉米夫定(葛兰素威康制药公司)。
1.3主要试剂：鸭乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)强阳性鸭血清(采自上海麻鸭，-70℃保存)；α-32p-dCTP(北京福瑞生物技术工程公司)；缺口翻译药盒(普洛麦格公司)；Sephadex G-50、Ficoll PVP(瑞典Pharmacia公司；SDS(Merck公司)；鱼精DNA、牛血清白蛋白(中国科学院生物物理研究所)。
2.方法
2.1DHBV感染：1日龄北京鸭，经腿胫iv DHBV-DNA强阳性鸭血清，感染后7d取血，分离血清，-70℃保存。
2.2药物治疗试验：DHBV感染鸭随机分组，七肽给药组分别为0.5mg/Kg、1mg/Kg皮下注射，每2天一次，给药10d，病毒对照组，以生理盐水代替药物；阳性药物(拉米夫定)组，po药物50mg/kg，每天2次，连续10d。给药前、给药5、10d和停药后3d，分别自鸭腿胫静脉取血，分离血清，-70℃保存待检。
2.3检测方法：取上述待检鸭血清，每批同时点膜，测定鸭血清中DHBV-DNA的动态水平。按缺口翻译试剂盒说明书方法，用32p标记DHBV-DNA探针，作鸭血清斑点杂交，放射自显影膜片斑点，测定吸光度(A)值(490nm)，计算血清DHBV-DNA密度，以杂交斑点A值作为标本DHBV-DNA水平值。
2.4药效计算：计算每组不同时间点血清DHBV-DNA水平的x±s，各组用药前后比较采用配对t检验，计算DHBV-DNA抑制率，比较各组鸭血清DHBV-DNA抑制率的动态变化。给药组与病毒对照组比较，采用成组t检验。DHBV-DNA抑制率＝(给药前A值-给药后A值)/给药前A值×100％
3结果
DHBV 2DNA感染鸭各组用药前后血清DHBV-DNA水平半定量结果见表1。低剂量组(0.5mg/kg)给药后与病毒对照组比较，鸭血清DHBV-DNA水平无显著性降低；高剂量组(1mg/kg)给药后10d和停药后3d与病毒对照组比较，鸭血清DHBV-DNA抑制率显著提高，停药后鸭血清DHBV-DNA持续降低。
表1七肽对DHBV感染鸭血清DHBV-DNA水平的影响(x±s，n＝6)
与对照组比较，**P＜0.01
4.结论
七肽GAGPHGG(1mg/kg)有一定抑制鸭乙肝病毒作用。
实施例5寡肽GAGPHGG对小鼠急性肝损伤的保护作用
1.材料
1.1动物：健康昆明小鼠(20g左右，北京维通利华实验动物技术有限公司)。
1.2药物：七肽GAGPHGG(自制测定大于98％)；阳性药物联苯双酯滴丸(北京协和药厂)。
1.3主要试剂：丙氨酸氨基转移酶(ALT)，天冬氨酸转氨酶(AST)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，其他试剂均为国产分析纯.使用的仪器有小型离心机(Sigma 1213型)、722型分光光度计(厦门分析仪器厂)等。
2.方法：取60只雄性昆明种小鼠，按照随机数字表法分为正常对照组、模型对照组、联苯双酯组、七肽大、小剂量组，后2组分别按0.17mg/kg、0.085mg/kg的剂量皮下注射，每2日一次，连续7d；联苯双酯组按100mg/kg的剂量灌胃，每日1次，连续7d；正常对照组和模型对照组皮下注射等体积生理盐水；末次给药1h后，除正常对照组外，其余各组均按照5mL/kg剂量腹腔注射给予0.15％的四氯化碳橄榄油溶液，禁食，不禁水，12h后眼球取血，分离血清，备用，取血后处死小鼠，解剖，取出肝脏，匀浆，备用。按照试剂盒说明测定各组小鼠血清ALT，AST活性和肝组织GSH-Px活性及MDA含量，所有数据以均数士标准偏差(x±SD)表示，各组样本均数间差别的假设检验采用方差分析。
3.结果
3.1七肽对血清ALT和AST活性的影响由表2可见，七肽大、小剂量组小鼠血清ALT，AST活性较模型对照组明显下降，相比较均有显著性差异(P＜0.01)。
表2七肽对四氯化碳所致肝损伤小鼠血清ALT和AsT活性的影响(x±s，U/L)
与对照组比较，**P＜0.01
3.2七肽对肝组织GSH-Px活性和MDA含量的影响由表3可见，七肽大、小剂量组小鼠肝组织GSH-Px活性明显高于模型对照组，MDA含量明显低于模型对照组，相比较均有显著性差异(P＜0.01)。
表3七肽对肝组织GSH-Px活性和MDA含量的影响(x±s，μmol/g)
与对照组比较，**P＜0.01
4.结论：七肽可显著抑制四氯化碳所致急性肝损伤小鼠血清ALT，AST活性升高，对四氯化碳急性肝损伤具有保护作用。
实施例6寡肽GAGPHGG抗大鼠肝纤维化作用的实验研究
1.材料
1.1动物：健康雄性SD大鼠(150±10g，北京维通利华实验动物技术有限公司)。
1.2药物：七肽GAGPHGG(自制测定大于98％)；阳性药物联苯双酯滴丸(北京协和药厂)。
1.3主要试剂：丙氨酸氨基转移酶(ALT)，天冬氨酸转氨酶(AST)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、TGF-βmRNA原位杂交试剂盒和大鼠TIMP-ELISA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，其他试剂均为国产分析纯.。
2.方法：将48只大鼠随机分为对照组、模型组、七肽大剂量和七肽小剂量，每组12只。用橄榄油将CC14配成40％的溶液，按5ml/kg给动物皮下注射，每周2次，共8wk；GAGPHGG干预组在造模的同时给予七肽皮下注射(浓度0.12mg/kg，0.06mg/kg，每2天1次，共8周)。各组动物在最后一次CC14注射后48h处死，取血清和肝组织标本待检。血清按照试剂说明书检测ALT，AST及TGFβ1水平，肝组织标本以中性福尔马林溶液固定、石蜡包埋，以多聚赖氨酸涂布的载玻片制作5ttm组织切片，进行HE染色和Masson三重胶原染色作组织病理学检查。
3.结果
3.1七肽对肝纤维化大鼠血清ALT和AST水平的影响由表4可见，七肽大、小剂量组肝纤维化大鼠ALT，AST水平较模型对照组明显下降，相比较均有显著性差异(P＜0.01)。
表4七肽对肝纤维化大鼠血清ALT和AsT水平的影响(x±s，U/L)
与对照组比较，**P＜0.01
3.2七肽对肝纤维化大鼠肝组织TGFβ1和胶原面积的影响由表5可见，四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠血清TGFβ1水平显著升高(P＜0.01)，表明肝纤维化形成过程伴随有TGFβ1合成的显著增加，从而促进肝脏胶原纤维的合成与沉积；七肽大剂量组预防性治疗的大鼠血清TGFβ1水平则显著减少(与模型组比较P＜0.01)，肝脏胶原平均面积亦显著减少(与模型组比较P＜0.01)七肽小剂量组有减少的趋势，但无统计学意义。
表5七肽对肝纤维化大鼠肝组织TGFβ1和胶原面积的影响(x±s)
与对照组比较，**P＜0.01
4.结论：七肽GAGPHGG有一定抗肝纤维化作用，其抗肝纤维化机理尚需进一步研究。
实施例7
取七肽GAGPHGG10g，加入注射剂(包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂)适当辅料，按注射剂(包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂)工艺制备成注射剂。
实施例8
取七肽GAGPHGG10g，加入片剂(包括缓控释片、骨架片、包衣片、分散片等)适当辅料，按片剂(包括缓控释片、骨架片、包衣片、分散片等)工艺制备成舌下片、片剂。
实施例9
取七肽GAGPHGG10g，加入胶囊剂适当辅料，按胶囊剂工艺制备成肠溶胶囊剂、胶囊剂。
实施例10
取七肽GAGPHGG 10g，加入乳剂(包括微乳、纳米乳等)适当辅料，按乳剂(包括微乳、纳米乳等)工艺制备成微乳剂。
实施例11
取七肽GAGPHGG10g，加入缓释控释剂适当辅料，按缓释控释剂工艺制备成各种缓释、控释剂。
实施例12
取七肽GAGPHGG10g，加入脂质体剂型适当辅料，按脂质体工艺制备成各种脂质体剂型。
Claims (4)
1.一种寡肽类化合物，其特征在于序列号为GAGPHGG。
2.根据权利要求1所述的寡肽GAGPHGG与药学上适用载体混合在制备治疗乙肝药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的寡肽GAGPHGG与药学上适用载体混合在制备治疗肝纤维化，改善肝功能药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的寡肽GAGPHGG与药学上适用载体混合在制备抗乙肝病毒药物中的应用。
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