KR20220136269A - 아크릴기로 수식된 조직 유래 세포외기질 유도체와 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아크릴기로 수식된 조직 유래 세포외기질 유도체와 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 하이드로젤용 조성물 및 이로부터 제조된 하이드로젤은 수식 또는 가교 정도에 따른 다양한 조직의 섬유화 양상을 모사할 수 있다.
Description
본 발명은 아크릴기로 수식된 조직 유래 세포외기질 유도체와 이의 용도에 관한 것이다.
조직의 섬유화는 콜라겐을 중심으로 하는 세포 외 매트릭스가 조직에 과도하게 생산·축적되는 것으로 생긴다. 조직은 산화 스트레스, 저산소 상태, 염증, 세포사멸(apoptosis)등의 자극에 의해 손상을 받았을 경우, 손상 조직을 세포 외 매트릭스로 대체하여 회복을 도모하지만, 손상이 중증의 경우나 해당 자극이 만성화됐을 경우 등에는 세포 외 매트릭스의 축적이 과도하게 되어 조직이 그 기능을 충분히 완수할 수 없게 된다. 섬유화는 간, 췌장, 폐, 신장, 골수, 심장 등의 각종 장기에서 보여지며 근섬유모세포(myofibroblast) 등의 콜라겐 생산 세포가 병태(病態)에 관여하고 있다고 생각되고 있다.
간섬유화는 세포외기질(ECM)이 비정상적으로 축적되어 생기는 질병으로 간경변이나 간암으로 발전할 수 있다. 간섬유화가 일어나면 손상된 간세포나 혈관세포에서 분비된 케모카인(chemokine)이 대식세포를 모이게 하고, 더불어 분비된 TGF-β로 인해 간조직내 존재하는 간성상세포(hepatic stellate cell)가 근섬유모세포 유사 세포(myofibroblast-like cell)이 되어 ECM 생산을 하게 되나, 이를 예방 및 치료하는 물질이나 방법에 대해서는 많이 알려진 바가 없다.
또한, 신장섬유화는 신장의 조직 및/또는 혈관이 단단하게 굳어지는 증상을 의미하며, 폐섬유화 또는 폐섬유증은 폐포벽에 미만성 섬유 증식을 특징으로 하는 건성 기침이나 노동 시 호흡 곤란을 주 증상으로 하는 질환으로 알려져 있다.
이에 본 발명자들은 이러한 섬유화를 연구하는데 사용 할 수 있는 모델을 개발하였고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 아크릴기로 수식된 조직 유래 세포외기질을 포함하는 하이드로젤용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 조성물을 가교시켜 제조된 하이드로젤을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 조직 유래 세포외기질을 아크릴기로 수식하는 단계를 포함하는 하이드로젤용 조성물 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 조직 유래 세포외기질을 아크릴기로 수식하여 하이드로젤용 조성물을 제조하는 단계; 및 상기 하이드로젤용 조성물을 가교시키는 단계를 포함하는 하이드로젤 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양상은 아크릴기로 수식된 조직 유래 세포외기질을 포함하는 하이드로젤용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예로 상기 아크릴기는 아크릴레이트기, 메타크릴레이트기 및 이타코네이트기중 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 메타아크릴기 일 수 있다.
상기 조직 유래 세포외기질은 조직 내 또는 세포 외의 공간을 채우고 있는 생체 고분자의 집합체로서, 교원질, 탄력소 등의 섬유성 단백질, 프로테오글리칸, 클리코사미노글리칸 등의 복합단백질, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴 등의 세포 부착성 당단백질 등 함유하는 것으로 알려져 있다. 한편 본 발명에서, 조직 유래의 세포외기질은 탈세포화 용액 등과 같이 당업계에서 널리 알려진 탈세포화 기술을 통하여 수득될 수 있으며, 상기 조직은 세포외 기질 성분을 함유하는 모든 생체 조직을 대상으로 할 수 있으나, 간 조직 유래 세포외기질, 폐 조직 유래 세포외기질, 신장 조직 유래 세포외기질, 심장 조직 유래 세포외기질, 장 조직 유래 세포외기질, 근육 조직 유래 세포외기질, 피부 조직 유래 세포외기질, 췌장 조직 유래 세포외기질, 골수 조직 유래 세포외기질, 뇌 조직 유래 세포외기질 및 척수 조직 유래 세포외기질 중 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 일 구체예로 상기 조성물은 하기 화학식 1로 표시되는 구조를 포함하는 것일 수 있다:
[화학식 1]
본 발명의 일 구체예로, 아크릴기와 조직 유래 세포외기질은 중량비가 1:1 내지 8:1, 구체적으로는 1:1, 2:1 또는 8:1일 수 있다. 후술되는 실시예에서 아크릴기는 상온에서 액체로 존재할 때 아크릴기와 세포외기질의 비율은 아크릴기의 부피비:세포외기질의 질량비를 의미하고, 이 때 사용된 아크릴기의 공지된 밀도에 따른 중량비 또한 모두 본 발명에 포함되는 것으로 해석된다. 다만, 상기 범위 외의 경우 목적하는 본 발명의 효과를 얻을 수 없다.
후술되는 바와 같이 상기 조성물은 하이드로젤로 되기 위한 가교의 과정을 거치게 되고 광가교를 통해 하이드로젤이 되는 경우를 위하여 광개시제를 더 포함할 수 있다. 상기 광개시제는 공지의 물질을 사용할 수 있고, 본 발명의 일 예시로 D2959를 사용할 수 있다. 이 때 광개시제는 0.1 내지 0.5%(w/v), 구체적으로 0.3%(w/v)으로 조성물에 포함될 수 있다.
상기 수식은 특정 작용기를 고분자에 결합시켜주는 것을 의미하고, 본 발명에서는 아크릴기를 세포외기질에 결합시켜주는 것을 의미한다. 본 발명의 일 구체예로 상기 수식은 8 내지 14의 pH에서 0 초과 8 시간 미만으로 처리한 뒤 6 내지 8의 pH에서 12 내지 28시간 처리하는 것일 수 있고, 이러한 수식을 통해 상기 조직 유래 세포외기질에 대한 아크릴기의 수식은 50 내지 75% 수준으로 이루어질 수 있다. 상기 범위 외의 수준으로 아크릴기 수식이 이루어질 경우 목적하는 섬유화 질환을 충분히 모사할 수 없다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 조성물을 가교시켜 제조된 하이드로젤을 제공한다.
본 발명에서, "하이드로젤 (hydrogel)"은 분산매가 물이거나 물이 기본 성분으로 들어 있는 젤로서, 본 발명에서의 하이드로젤은 아크릴기로 수식된 조직 유래 세포외기질을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예로 하이드로젤의 제조 시 상기 조성물은 농도가 0.1 내지 4.0% (w/v), 구체적으로 0.5 내지 2.5% (w/v), 더욱 구체적으로 1 내지 2% (w/v), 일 예시로 1 또는 2% (w/v) 일 수 있다.
상기 하이드로젤은 조직 유래 세포외기질을 아크릴기로 수식하여 하이드로젤용 조성물을 제조하는 단계 및 상기 하이드로젤용 조성물을 가교시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있으며, 상기 가교는 UV 조사에 의한 화학적 가교, 물리학적 가교 또는 생물학적 가교를 포함한다. 여기서, UV 조사에 의한 화학적 가교로는 광가교 (photo-crosslinking) 또는 반응성 가교제 (reactive crosslinker)를 활용한 가교 등이 있고, 생물학적 가교로는 헤파린과 성장인자의 결합력을 활용한 가교 또는 DNA 등의 상보적 결합을 이용한 가교, 등이 있으며, 물리적 가교로는 수소결합에 의한 가교, 소수성(hydrophobic) 상호작용에 의한 가교 또는 정전기적 상호작용을 활용한 가교 등이 있다,
한편, 본 발명의 다른 일 구체예로 상기 조성물은 광가교를 통해 가교되어 하이드로젤을 형성할 수 있으며, 이 때 상기 조성물은 광개시제를 더 포함하고, 이 때 가교는 UV 조사를 더 포함하여 이루어질 수 있다. 상기 광개시제는 공지의 물질을 사용할 수 있고, 본 발명의 일 예시로 D2959를 사용할 수 있다. 이 때 광 개시제는 0.1 내지 0.5%(w/v), 구체적으로 0.3%(w/v)으로 조성물에 포함될 수 있다. 또한, 상기 UV 조사는 공지의 조건에서 이루어질 수 있으나, 구체적으로 1 내지 20분간 이루어지는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서 광가교에 따른 하이드로젤 형성의 일 예시는 365 nm, 8900 μW/cm2 의 광원을 1, 3 또는 10분간 조사하여 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 조직 유래 세포외기질을 아크릴기로 수식하는 단계를 포함하는 하이드로젤용 조성물 제조방법을 제공한다.
전술한 바와 같이 상기 조직 유래 세포외기질과 아크릴기는 중량비가 1:1 내지 1:8일 수 있고, 구체적으로는 1:1, 2:1 또는 8:1일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 전술한 바와 같이 광개시제를 더 포함할 수 있으며 일 구체예로 광개시제로 D2959를 0.3%(w/v)으로 조성물에 포함될 수 있다.
상기 수식은 8 내지 14의 pH에서 0 초과 8 시간 미만으로 처리한 뒤 6 내지 8의 pH에서 12 내지 28시간 처리하는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다. 이러한 수식 단계를 통해 상기 조직 유래 세포외기질에 대한 아크릴기의 수식은 50 내지 75% 수준으로 이루어질 수 있다.
한편, 전술한 바와 같이 목적하는 하이드로젤의 특성을 나타내기 위해 상기 조성물은 농도가 0.1 내지 4.0% (w/v), 구체적으로 0.5 내지 2.5% (w/v), 더욱 구체적으로 1 내지 2% (w/v), 일 예시로 1 또는 2% (w/v) 인 것으로 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 조직 유래 세포외기질을 아크릴기로 수식하여 하이드로젤용 조성물을 제조하는 단계; 및 상기 하이드로젤용 조성물을 가교시키는 단계를 포함하는 하이드로젤 제조방법을 제공한다.
상기 하이드로젤용 조성물을 제조하는 단계는 전술한 조직 유래 세포외기질을 아크릴기로 수식하여 하이드로젤용 조성물을 제조하는 단계이다.
상기 가교시키는 단계는 상기 하이드로젤용 조성물을 가교시켜 하이드로젤로 제조하는 단계이다.
상기 가교시키는 단계가 광가교로 이루어질 경우 상기 하이드로젤용 조성물은 광개시제를 더 포함하고 상기 가교는 UV 조사하는 것을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 하이드로젤용 조성물 및 이로부터 제조된 하이드로젤은 수식 또는 가교 정도에 따른 다양한 조직의 섬유화 양상을 모사할 수 있다.
도 1은 ECM-MA 유도체 제작 및 모식도이다.
도 2는 ECM-MA 유도체를 이용한 하이드로젤 제작 및 광가교에 따른 물리적 성질 조절 가능성을 확인 결과이다.
도 3은 ECM-MA 유도체의 메타크릴기 수식 비율 조절에 따른 기계적 물성 조절 가능성을 확인한 결과이다.
도 4, 5는 ECM-MA 하이드로젤을 이용한 마우스 성체줄기세포 유래 간 오가노이드 배양 가능성을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6 및 7은 ECM-MA 하이드로젤을 이용한 마우스 성체줄기세포 유래 간 오가노이드 섬유화 (fibrosis) 모델링의 결과이다.
도 8 내지 12 는 인간 iPSC 유래 간 오가노이드 섬유화 (fibrosis) 모델링을 위한 최적화 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 ECM-MA 하이드로젤 기반 광가교 처리시간에 따른 인간 iPSC 유래 간 오가노이드의 독성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 14 및 15는 ECM-MA 하이드로젤 기반 제작된 인간 iPSC 유래 간 섬유화 오가노이드의 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 ECM-MA 하이드로젤을 이용한 폐 오가노이드의 섬유화 (fibrosis) 모델링 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 ECM-MA 하이드로젤을 이용한 신장 오가노이드의 섬유화 (fibrosis) 모델링 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 ECM-MA 유도체를 이용한 하이드로젤 제작 및 광가교에 따른 물리적 성질 조절 가능성을 확인 결과이다.
도 3은 ECM-MA 유도체의 메타크릴기 수식 비율 조절에 따른 기계적 물성 조절 가능성을 확인한 결과이다.
도 4, 5는 ECM-MA 하이드로젤을 이용한 마우스 성체줄기세포 유래 간 오가노이드 배양 가능성을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6 및 7은 ECM-MA 하이드로젤을 이용한 마우스 성체줄기세포 유래 간 오가노이드 섬유화 (fibrosis) 모델링의 결과이다.
도 8 내지 12 는 인간 iPSC 유래 간 오가노이드 섬유화 (fibrosis) 모델링을 위한 최적화 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 ECM-MA 하이드로젤 기반 광가교 처리시간에 따른 인간 iPSC 유래 간 오가노이드의 독성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 14 및 15는 ECM-MA 하이드로젤 기반 제작된 인간 iPSC 유래 간 섬유화 오가노이드의 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 ECM-MA 하이드로젤을 이용한 폐 오가노이드의 섬유화 (fibrosis) 모델링 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 ECM-MA 하이드로젤을 이용한 신장 오가노이드의 섬유화 (fibrosis) 모델링 결과를 나타낸 것이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: ECM-MA 유도체 제작 및 특성 확인
실시예 1-1. ECM-MA 유도체 제작 및 모식도
생체 조직을 적절한 탈세포 및 용액화 과정을 거쳐서 세포외기질 (extracellular matrix; ECM)을 수득하고, 메타크릴 (Methacryl; MA)기를 포함하고 세포외기질 내 작용기와 결합할 수 있는 물질 (예; Methacrylic anhydride; MAA)을 처리하는 화학적인 방식으로 메타크릴기를 수식함으로써 메타크릴레이트화 조직 유래 세포외기질 (ECM-MA)를 합성하였다.
구체적으로 ECM 용액을 2 mg/ml 농도로 준비하고, MAA를 다양한 비율 (ECM질량:MAA부피 = 1:1, 1:2, 1:8 mg/μl ratio)로 처리하고 4°C에서 24시간 반응시킨 뒤에 (24시간 중 pH > 8 이상으로 유지하는 시간을 다르게 하여 반응을 진행함) 미반응물을 dialysis로 제거해 줌으로써 ECM-MA 유도체를 제작하였다 (도 1). 수식된 MA의 비율은 대략 55~75% 수준임을 확인하였다.
실시예 1-2. ECM-MA 유도체를 이용한 하이드로젤 제작 및 광가교에 따른 물리적 성질 조절 가능성 확인
상기 실시예 1-1. 에서 합성된 유도체 ECM-MA (실시예로 탈세포 간 조직 유래 ECM인 liver extracellular matrix (LEM)을 사용하였음; LEM-MA)는 생체 내 환경과 유사한 생리적 조건(1x PBS, 중성 pH, 37℃)에서 세포외기질의 주요 성분의 콜라겐의 자가조립을 통해서 하이드로젤 형성이 가능함을 확인하였다. (도 2a)
여기에 광중합을 통해 세포외기질 고분자에 수식된 메타크릴기의 추가적인 가교를 유도하여 하이드로젤의 기계적 강도를 더욱 증가시킬 수 있음을 확인하였다. (도 2b, c) [광중합 반응은 실시예로 광개시제로 D2959 (최종 농도: 0.3% (w/v))를 사용하고 UV 광원 (365 nm, 8900 μW/cm2)을 이용하여 10분 조사하여 유도함] 특히, 광가교 시 빛에너지의 양을 조절 (여기서는 광원을 처리해주는 시간을 조절) 함으로써 LEM-MA 하이드로젤의 기계적 강도를 용이하게 조절할 수 있음을 확인하였다. (도 2d) UV를 조사하는 광가교 시간을 증가하면 LEM-MA 물성이 그에 비례하여 증가함을 확인하였다.
실시예 1-3. ECM-MA 유도체의 메타크릴기 수식 비율 조절에 따른 기계적 물성 조절 가능성 확인
메타크릴레이트 수식된 세포외기질 (ECM-MA, 구체적으로, 탈세포 간 조직 유래 ECM인 LEM을 사용하였음; LEM-MA) 합성 시 세포외기질과 메타크릴기를 포함한 화합물 (여기서는 Methacrylic anhydride, MAA)의 비율을 조절함으로써, 광가교를 통해 하이드로젤 형성 시 기계적 물성이 증가되는 정도를 조절할 수 있음을 확인하였다.
구체적으로 LEM-MA 하이드로젤 최종 농도는 2% (w/v)이고 광개시제로 D2959 (최종 농도: 0.3% (w/v))를 사용하고 UV 광원 (365 nm, 8900 μW/cm2)을 이용하여 UV를 10분 조사하여 광가교를 유도하였다 (도 3의 상단의 1X LEM-MA는 LEM:MAA=1:2 (w/v), 도 3의 하단의 4X LEM-MA는 LEM:MAA=1:8 (w/v)의 비율로 합성한 LEM-MA).
기계적 물성은 유변학 측정기 (rheometer)를 이용하여 frequency sweep mode에서 storage modulus (G′: 저장 탄성계수)와 loss modulus (G″: 손실 탄성계수)를 측정하였다. Elastic modulus (탄성 계수)는 1 Hz에서 측정된 G′ 값의 평균치를 계산하여 기계적 물성을 비교하는 값으로 사용하였고 Elasticity (탄성)는 1 Hz에서의 G″와 G′의 측정 값의 비율 (G″/G′)을 계산하여 강도를 비교하는 값으로 사용하였다.
그 결과 도 3에서 확인되는 바와 같이, 1X LEM-MA 하이드로젤의 경우 UV 비처리 그룹 (-UV 그룹) 대비 UV 10분 처리 그룹 (+UV 그룹)의 elastic modulus가 115.64 Pa에서 401.5 Pa로 3.47배 증가하였고, elasticity는 0.290에서 0.211로 감소하였다. 4X LEM-MA 하이드로젤의 경우 elastic modulus가 UV 비처리 그룹 (-UV 그룹) 207.092 Pa에서 UV 처리시 (+UV 그룹) 1088.42 Pa로 5.26배 증가하였고, elasticity는 0.283에서 0.176으로 감소하였다.
이는 합성 시 LEM:MAA의 비율을 다르게 하여 LEM-MA 유도체를 합성함으로써 LEM-MA 하이드로젤 기계적 물성의 최대치를 조절할 수 있을 뿐만 아니라, baseline 상태의 하이드로젤 대비 광가교를 통해 변화시킬 수 있는 물성 및 탄성의 비율을 조절할 수 있음을 의미한다.
실험예 1: ECM-MA 하이드로젤의 특성 확인
실험예 1-1. ECM-MA 하이드로젤을 이용한 마우스 성체줄기세포 유래 간 오가노이드 배양 가능성 확인 (1)
상기 실시예 1-2.에서 제작된 LEM-MA 유도체 기반 하이드로젤을 이용한 간 오가노이드 배양 가능성을 확인하기 위해 기존 배양 지지체인 매트리젤(MAT)과 methacrylic anhydride(MAA)를 수식하지 않은 탈세포 간 조직 유래 지지체인 LEM 하이드로젤에서 간 오가노이드 배양을 실시하여 비교하였다. 구체적으로, 간 오가노이드는 마우스 간 조직으로부터 분리한 담관세포를 이용하여 제작하였고 MAT에서 10일간 배양한 뒤 LEM 및 LEM-MA 지지체로 계대배양 하였다.
그 결과 도 4에서 확인되는 바와 같이, 매트리젤(MAT)과 마찬가지로 LEM (농도: 6 mg/ml) 및 LEM-MA 하이드로젤 [이 경우 광가교가 아닌 physiological condition (1X PBS, 중성 pH, 37°C) 조건에서 ECM 섬유 self-assembly를 통해 가교를 유도함]에서 모두 간 오가노이드가 정상적인 모양을 유지하며 잘 배양되는 것을 확인할 수 있다. 탈세포 간 조직 유래 지지체인 LEM 하이드로젤은 매트리젤과 물리적 물성이 가장 비슷하고 간 오가노이드 형성이 잘 되는 것으로 선행연구를 통해 확인된 농도인 6 mg/ml로 적용하였다.
실험예 1-2. ECM-MA 하이드로젤을 이용한 마우스 성체줄기세포 유래 간 오가노이드 배양 가능성 확인 (2)
오가노이드 배양에 가장 널리 이용되는 매트리젤(MAT)과 탈세포 간 조직 유래 LEM 하이드로젤 (6 mg/ml) 및 제작한 LEM-MA 하이드로젤(광가교가 아닌 37°C 조건에서의 ECM 섬유 assembly를 통해 가교)에서 배양된 간 오가노이드의 면역염색을 진행하였다. 구체적으로, 간 오가노이드는 쥐의 간 조직에서 추출한 담관세포를 이용하여 제작하였고 매트리젤에서 10일간 배양한 뒤 LEM 및 LEM-MA 지지체로 계대배양을 하여 배양 7일차에 면역염색을 통해 비교하였다. (도 5a)
간 특이적 마커인 KRT19에 대한 면역염색을 실시하여 양성 대조군인 MAT, LEM 하이드로젤에서 배양된 간 오가노이드와 비교하여 보았을 때, 도 5에서 확인되는 바와 같이, LEM-MA 하이드로젤에서 배양된 간 오가노이드에서도 양성 대조군 그룹들과 유사한 수준으로 간 조직 특이적 마커가 잘 발현되는 것을 확인하였다.
추가적으로 MAT, LEM, LEM-MA 하이드로젤에서 배양된 간 오가노이드의 유전자 발현량을 정량적 PCR (qPCR) 방법으로 비교하였을 때, 줄기세포능(stemness) 관련 마커의 발현은 LEM, LEM-MA 2%에서 조금 감소하고 MAT, LEM-MA 1%에서는 비슷하게 유지되는 것을 확인하였다. (도 5b)
간 분화관련 마커들(KRT19, HNF4A, HES1, KRT18)의 발현은 MAT, LEM, LEM-MA에서 모두 비슷하게 관찰되며 세포사멸 관련 마커(CASP3, BAX)의 경우 MAT에 비해 LEM과 LEM-MA에서 배양된 오가노이드에서 약간 낮게 발현되는 것을 확인하였다. (도 5c)
전반적으로 기존 오가노이드 배양 매트릭스인 MAT, LEM과 비교하여 LEM-MA 하이드로젤 역시 간 오가노이드 배양을 위해 적용할 수 있음을 검증하였다.
실험예 1-3. ECM-MA 하이드로젤을 이용한 마우스 성체줄기세포 유래 간 오가노이드 섬유화 (fibrosis) 모델링 (1)
실시예 1-2.의 LEM-MA 하이드로젤 지지체에서 간 오가노이드 배양 시, 간 섬유화를 모델링하기 위해 추가적으로 LEM-MA의 광가교를 유도하였다 (최종 LEM-MA 농도: 2% (w/v), 광개시제 D2959 농도: 0.3% (w/v)). 이 때 UV 광원 (365 nm, 8900 μW/cm2)을 조사하는 시간을 조절하여 하이드로젤의 기계적 강도를 증가시켰다. UV를 통한 광가교 시간을 1, 3, 10분으로 변화하면서 간 오가노이드의 유전자 발현량을 분석하였다. 간 오가노이드는 매트리젤에서 10일간 배양한 뒤 LEM-MA 지지체로 계대배양 하고 UV를 처리한 뒤 배양 3일차에 유전자 발현량을 비교하였다 (도 6a, b).
UV 광가교 시간에 따른 간 오가노이드의 유전자 발현량을 정량적 PCR (qPCR) 방법으로 비교하였을 때, 간 섬유화 관련 마커(α-SMA)의 발현과 줄기세포능(stemness) 관련 마커의 발현은 광가교를 위한 UV 처리 시간을 길게 해줄수록 점점 증가하는 양상을 확인하였고 분화 관련 마커(HES1)의 발현은 광가교 시간이 길어짐에 따라 다소 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 세포사멸 마커(BAX)의 발현은 광가교 시간에 따라 큰 차이가 없이 유지되는 것을 확인하였다. (도 6b)
이를 통해, UV를 10분간 처리한 경우 섬유화가 가장 잘 유발됨과 동시에 간 줄기세포(liver stem cells)가 활성화 되고 세포사멸에는 크게 영향을 주지 않음을 확인함으로써 이 조건이 가장 효과적으로 섬유화 모델을 유발할 수 있는 가교 시간임을 확인하였다.
실험예 1-4. ECM-MA 하이드로젤을 이용한 마우스 성체줄기세포 유래 간 오가노이드 섬유화 (fibrosis) 모델링 (2)
보다 정밀한 간 섬유화 모델을 제작하기 위해서 섬유화 유도 사이토카인(TGF-β)을 이용하여 생화학적으로 섬유화를 유발하는 방식과, UV 광가교 (광원: 365 nm, 8900 μW/cm2, UV 10분 조사, 광개시제 D2959 농도: 0.3% (w/v))를 통해 기계적 물성을 증가시켜 유발하는 방식과 생화학적, 기계적 자극을 동시에 가하여 섬유화를 유발하는 방식을 비교하였다 (LEM-MA 하이드로젤의 농도는 2% (w/v)).
구체적으로, 각각의 그룹에서 간 섬유화 유발정도를 비교하기 위해 3일 동안 배양된 간 오가노이드에 대한 면역염색을 진행했을 때, 섬유화 마커 (SMA, VIM)는 MAT, LEM-MA 그룹에서 거의 발현하지 않는 것에 비해 TGF-β (10 ng/ml) 처리를 통해 생화학적으로 섬유화를 유발한 그룹과 UV 광가교를 통해 기계적 물성을 증가시킨 그룹에서는 발현량이 증가하는 것을 확인하였으며, 두가지 자극 모두 처리하여 섬유화를 유발한 그룹에서 섬유화 마커가 가장 높게 발현하는 것을 확인하였다 (도 7a).
마찬가지로, 배양 3일차에 정량적 PCR 분석을 실시하여 각 그룹의 섬유화 정도를 유전자 발현량 비교를 통해 확인했을 때, 섬유화 관련 유전자(α-SMA, COL1A2)는 MAT 그룹에 비해 LEM-MA (NT), LEM-MA (TGF-β), LEM-MA (UV) 그룹에서 증가하고, LEM-MA (TGF-β + UV) 그룹에서 가장 유의미하게 증가하는 것을 확인하였다 (도 7b). 염증관련 유전자(TNF-α)의 발현량은 MAT 그룹에 비해 LEM-MA (NT)와 LEM-MA (UV)그룹에서 증가하고 특히 TGF-β 인자가 처리된 LEM-MA (TGF-β) 그룹과 LEM-MA (TGF-β + UV) 그룹에서 가장 유의미하게 증가하는 것을 확인하였다 (도 7b).
이를 통해, 섬유화 사이토카인을 이용한 생화학적 유도방식과 UV 광가교를 통한 기계적 물성 증가의 복합 적용을 통해 실제 간 섬유화 환경을 가장 잘 구현하는 오가노이드 모델을 제작할 수 있음을 확인하였다.
실험예 2:
인간 iPSC 유래 간 오가노이드 섬유화 (fibrosis) 모델링을 위한 ECM-MA 합성조건 최적화
실험예 2-1. 인간 iPSC 유래 간 오가노이드 섬유화 (fibrosis) 모델링을 위한 ECM-MA 합성조건 최적화
본 발명의 ECM-MA 하이드로젤의 인간 유래 오가노이드 적용 가능성을 검증하고, 섬유화를 가장 잘 유발하는 ECM-MA 조건을 스크리닝 하기 위해 서로 다른 조건에서 합성된 LEM-MA를 이용하여 인간 유도만능줄기세포(Human induced pluripotent stem cell; hiPSC) 유래 간 오가노이드의 배양 테스트를 진행하였다 (도 8a).
iPSC 유래 간 오가노이드의 경우, iPSC 세포로부터 내배엽, 간 내배엽 단계를 거쳐 분화된 간세포와 혈관내피세포(Human umbilical vein endothelial cells), 중간엽줄기세포(Human mesenchymal stem cells) 및 간 섬유화에 필수적인 간성상세포(iPSC 세포로부터 중배엽, 중피세포를 거쳐 간 성상세포로 분화)를 각각 10:7:2:2의 비율로 ultra low attachment plate (U-bottom plate)에서 공배양 하여 제작하였다.
Methacrylic anhydride (MAA)의 비율 및 총 24시간의 반응 시간 중 반응 촉진 pH (> 8) 유지 시간을 아래와 같이 다르게 하여 제작한 LEM-MA로 하이드로젤 (LEM-MA 농도: 2% (w/v))을 제작하여 그것의 성능 평가를 진행하였다:
#1 : LEM:MAA = 1:2 (mg/μl), pH 유지 (> 8) 3시간 + 이후 21시간 - 총 24시간 동안 4℃ 조건에서 반응하여 합성하였다.
상기 #1 그룹의 경우 ECM 섬유 self-assembly에 의한 가교만으로는 안정적인 하이드로젤 형성이 어려워서 1분 동안 UV 조사를 통한 광가교 (광개시제 D2959 농도: 0.3% (w/v), UV 광원: 365 nm, 8900 μW/cm2)를 유도하여 baseline 하이드로젤을 제작하였다.
#2 : LEM:MAA = 1:2 (mg/μl), pH 유지 (> 8) 6시간 + 이후 18시간 - 총 24시간 동안 4℃ 조건에서 반응하여 합성하였다.
상기 #2 그룹의 경우 ECM 섬유 self-assembly에 의한 가교만으로는 안정적인 하이드로젤 형성이 어려워서 1분 동안 UV 조사를 통한 광가교 (광개시제 D2959 농도: 0.3% (w/v), UV 광원: 365 nm, 8900 μW/cm2)를 유도하여 baseline 하이드로젤을 제작하였다.
#3 : LEM:MAA = 1:2 (mg/μl), pH 유지 (> 8) 0시간 + 이후 24시간 - 총 24시간 동안 4℃ 조건에서 반응하여 합성하였다.
상기 #3 그룹의 경우 UV 조사 없이 physiological condition 조건 (1X PBS, 중성 pH, 37℃)에서 ECM 섬유 self-assembly에 의한 가교를 유도하여 baseline 하이드로젤을 제작하였다.
#4 : LEM:MAA = 1:1 (mg/μl), pH 유지 (> 8) 3시간 + 이후 21시간 - 총 24시간 동안 4℃ 조건에서 반응하여 합성하였다.
상기 #4 그룹의 경우 UV 조사 없이 physiological condition 조건 (1X PBS, 중성 pH, 37℃)에서 ECM 섬유 self-assembly에 의한 가교를 유도하여 baseline 하이드로젤을 제작하였다.
기존 배양 지지체인 MAT 및 MAA로 수식되지 않은 LEM과 4가지 조건으로 합성된 LEM-MA 하이드로젤에서 각각 인간 iPSC 유래 간 오가노이드를 5일 동안 배양하고 간 분화 마커(AFP, HNF4A, ALB)의 유전자 발현량을 비교하였다 (도 8b). 그 결과, LEM-MA #1 조건의 하이드로젤에서 배양된 간 오가노이드의 간 분화 마커 발현이 MAT, LEM과 비슷하게 유지되거나 좀 더 높은 것을 확인하였고, LEM-MA #2 및 #4 조건의 하이드로젤에서는 간 분화 마커의 발현량이 현저하게 감소한 것을 확인하였다. LEM-MA #3 조건의 하이드로젤에서는 MAT 그룹과 비교하여 유사하거나 다소 낮은 발현을 확인하였다.
이를 통해 LEM-MA #2 및 #4 반응 조건으로 합성한 유도체는 인간 간 오가노이드 섬유화 모델링에 적용하기에 적합하지 않음을 확인하였다.
실험예 2-2. 인간 iPSC 유래 간 오가노이드 섬유화 (fibrosis) 모델링을 위한 ECM-MA 조건 최적화
상기 실험예 2-1.에서 합성한 서로 다른 4가지 조건의 LEM-MA 하이드로젤 (2% (w/v) 농도)에 대하여 UV를 10분 동안 처리한 뒤, 광가교 (광개시제 D2959 농도: 0.3% (w/v), UV 광원: 365 nm, 8900 μW/cm2)를 통한 하이드로젤 물성 증가에 따른 인간 iPSC 유래 간 오가노이드 (+UV 그룹)에서의 섬유화 유발 효율을 비교하였다. 5일 동안 배양한 뒤 정량적 PCR 분석을 통해 baseline 상태의 LEM-MA 하이드로젤 (baseline 그룹)에서 배양된 간 오가노이드와 섬유화 마커(α-SMA, VIM)의 유전자 발현량을 비교했을 때, UV로 광가교된 LEM-MA #1 하이드로젤에서 배양된 간 오가노이드의 경우 섬유화 마커 발현량이 UV로 광가교된 다른 합성 조건의 LEM-MA 하이드로젤에서 배양된 간 오가노이드에서 보다 가장 유의미한 증가를 나타내는 것을 확인하였다 (도 9a, b).
이전 결과와 종합하여, #1과 #3 조건으로 합성된 LEM-MA 하이드로젤이 오가노이드 분화 및 생존능 유지에 적합하지만, 섬유화 유발 정도에 있어서는 #1 조건의 LEM-MA 하이드로젤이 #3 조건의 LEM-MA 하이드로젤에 비해 섬유화 유발 효율이 유의미하게 높기 때문에 #1 조건으로 합성된 LEM-MA가 인간 iPSC 유래 간 오가노이드의 섬유화 모델링에 가장 적합한 것을 확인하였다.
실험예 2-3. 인간 iPSC 유래 간 오가노이드 섬유화 (fibrosis) 모델링을 위한 ECM-MA 조건 최적화 (합성 조건에 따른 수식 정도 확인)
상기 실험예 2-2.의 오가노이드 배양 실험을 통해 LEM-MA #2와 #4의 조건으로 합성한 하이드로젤은 인간 간 오가노이드 섬유화 모델링에 적용하기에 적합하지 않음을 확인하였고, #1과 #3 조건 중에서는 #1 조건이 본 연구에 더 적합한 것을 확인하였는데, 그 원인을 파악하고자 LEM에 대한 methacrylation 정도를 확인하기 위한 분석을 진행하였다.
구체적으로, 이를 위해 primary amine기에 대한 반응성을 갖는 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBSA)을 이용하여, LEM 내 methacryl기 수식에 따른 amine기의 감소 정도를 측정함으로써 methacrylation 정도를 정량 하였다 (methacryl기 수식을 위한 화학 반응 이전의 LEM 내 존재하는 amine기의 양과 비교하여 수식 이후 감소한 정도 = degree of methacrylation)
분석 결과, 도 10에서 확인되는 바와 같이 화학 반응이 촉진되는 pH (> 8)을 유지시켜 주는 시간이 길수록 methacrylation 정도가 증가함을 확인하였다. 이를 통해, #2 조건의 경우에는 (#1과 #3 조건과 비교하여) 과도한 methacrylation이 일어나서 LEM 내 존재하는 ECM 단백질들의 작용기들이 많이 소모가 되었기에 간 오가노이드 성장 및 분화에 필요한 ECM 단백질/펩타이드 등 조직 특이적 인자들이 제대로 작용하지 못하는 것으로 추측해 볼 수 있다.
실험예 2-4. 인간 iPSC 유래 간 오가노이드 섬유화 (fibrosis) 모델링을 위한 ECM-MA 조건 최적화 (수식 정도에 따른 물성 차이)
상기한 배양 능력 및 광가교 (광개시제 D2959 농도: 0.3% (w/v), UV 광원: 365 nm, 8900 μW/cm2)에 의한 섬유화 (fibrosis) 유발 성능 평가에서 #1 (Degree of methacrylation: 68.38%)과 #3 (Degree of methacrylation: 59.12%) 조건으로 합성된 LEM-MA 하이드로젤 모두 다 잘 작동하였지만, 그 중에서도 #1 조건의 하이드로젤이 baseline 상태 대비 광가교 이후 (UV 10분 처리) 물성(탄성계수)이 증가하는 정도가 최대 약 8.85배인 반면, #3 조건의 하이드로젤의 경우 baseline 상태 대비 UV 처리 10분 경과했을 때 물성 차이가 약 3.47배로 훨씬 작은 것을 rheometer를 이용한 유변학적 성질 측정을 통해 확인하였다.
또한, UV 10분 처리했을 때 하이드로젤의 탄성계수가 #1 조건의 경우 1163.28 Pa 정도인데 반해 #3 조건의 경우 401.5 Pa 수준으로, 동일 시간 UV 처리 시 유도 가능한 기계적 물성의 수치가 약 2.9배 정도 차이가 나는 것을 확인하였다 (도 11).
이를 통해 #1 조건에서 합성된 하이드로젤에서 더 효율적인 섬유화 모델링이 가능한 이유는 기계적 강도의 증가를 통해 섬유화 유발과 관련된 생물리학적 신호 활성화에 더 유리하기 때문일 것으로 추측된다. 따라서 이하의 섬유화 모델링 실험은 #1 조건에서 합성한 LEM-MA 하이드로젤을 이용하여 진행하였다.
실험예 2-5. 인간 iPSC 유래 간 오가노이드 섬유화 (fibrosis) 모델링을 위한 ECM-MA 조건 최적화 (수식 정도에 따른 내부 구조 차이)
전술한 #1과 #3 조건의 LEM-MA 하이드로젤의 기계적 강도 차이의 원인 파악을 위해 주사전자현미경 (Scanning Electron Microscope; SEM)을 이용하여 내부 구조를 관찰하였다 (광가교 조건은 광개시제 D2959 농도: 0.3% (w/v), UV 광원: 365 nm, 8900 μW/cm2, 10분 조사).
그 결과 #1 조건으로 제작된 LEM-MA 하이드로젤을 분석해 보면 500 X 배율에서 baseline 그룹과 광가교 그룹 (UV 10분 처리)을 비교해 보면, baseline 상태와 비교하여 UV 가교를 통한 경화 이후에 전체적으로 더욱 촘촘한 내부 구조로 변하는 것을 확인하였다 (도 12a). 이를 통해 광가교를 통해 경화가 되는 과정에서 내부적으로 고분자 네트워크가 더 견고해지면서 물성이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 20000 X 배율 이미지를 보면, ECM 하이드로젤 특유의 나노섬유(nanofiber) 구조가 관찰되는데 광가교로 인해 ECM 나노섬유 간의 추가적인 가교를 통한 촘촘한 다발 구조가 형성됨으로써 기계적 물성이 강화된 것으로 사료된다.
또한, #3 조건으로 제작된 LEM-MA 하이드로젤을 분석해 보면 #1 조건과 대조적으로 500 X 및 20000 X 배율에서 baseline 그룹과 광가교 그룹 (UV 10분 처리) 모두에서 전반적으로 기존 ECM 하이드로젤 내부에서 관찰되는 얇은 나노섬유로 구성된 그물망 구조로 이루어진 것을 볼 수 있었다. 이는 #3 조건의 경우에는 #1 조건 보다 methacrylation 정도가 낮아 #1 조건의 하이드로젤과 비교하여 콜라겐 섬유의 자가 결합 (self-assembly)이 더 빠르고 수월하게 일어났기 때문일 것으로 추측된다 (도 12b). 또한, UV 광가교를 통한 경화 이후에 내부 구조 네트워크가 약간 더 촘촘해 지긴 하였지만, baseline 그룹과 광가교 (UV 10분 처리) 그룹에서 크게 차이가 나지 않았다. 따라서 #3 합성 조건의 하이드로젤에서는 광가교에 따른 기계적 물성의 증가 수준이 작았을 것으로 추측된다.
실험예 3. ECM-MA 하이드로젤에서 배양된 오가노이드 평가
실험예 3-1.ECM-MA 하이드로젤 기반 광가교 처리시간에 따른 인간 iPSC 유래 간 오가노이드 독성 평가
상기에서 제작된 LEM-MA 하이드로젤 (#1 합성 조건, 2% (w/v) LEM-MA 농도)의 광가교 (광개시제 D2959 농도: 0.3% (w/v), UV 광원: 365 nm, 8900 μW/cm2) 시 UV에 의한 세포사멸 및 세포독성이 나타나지 않는지를 확인하기 위해, 인간 유도만능줄기세포 유래 간 오가노이드에 UV 광가교 처리 시간을 1, 3, 10분으로 변화해 주면서 UV 처리에 따른 오가노이드에서의 세포 독성을 평가하였다.
구체적으로, 제작한 인간 iPSC 유래 간 오가노이드를 LEM-MA 하이드로젤 내에 배양하고 UV를 시간별로 처리해 주었을 때, 10분 처리한 그룹에서도 간 오가노이드 배양이 잘 되는 것을 확인하였다. 3일간 배양후에 Live/Dead 염색을 통해 세포 생존을 확인했을 때에도 오가노이드 내부에 세포들이 잘 살아있는 것을 확인하였다. (도 13a)
UV 광가교 시간에 따른 간 오가노이드의 단백질 발현을 면역염색으로 비교 하였을 때, 필라멘트 섬유 마커인 F-actin과 간 분화 마커인 AFP, SOX17, ALB가 UV를 10분간 처리해 주며 광가교를 진행해도 오가노이드 내부에 잘 발현하는 것을 확인하였다. 이를 통해 UV 10분 처리는 오가노이드 자체에 독성을 나타내지 않으면서 LEM-MA 하이드로젤의 기계적 물성 증가는 가능하게 함을 확인하였다. (도 13b)
실험예 3-2. ECM-MA 하이드로젤 기반 제작된 인간 iPSC 유래 간 섬유화 오가노이드의 분석 (1)
정확한 간 섬유화 모델을 제작하기 위해서 섬유화 유도 사이토카인(TGF-
)을 이용하여 생화학적으로 섬유화를 유발하는 방식과 UV 광가교 (광개시제 D2959 농도: 0.3% (w/v), UV 광원: 365 nm, 8900 μW/cm2, 10분 조사)를 통해 기계적 물성을 증가시켜 유발하는 방식과 생화학적, 기계적 자극을 동시에 가하여 섬유화를 유발하는 방식을 인간 유도만능줄기세포 (iPSC) 유래 간 오가노이드 에서도 비교하고 섬유화가 가장 잘 유발되는 그룹을 확인하였다. 구체적으로, LEM-MA는 #1 그룹을 사용하였고 2% (w/v) 농도 조건으로 제작하였다.
각각의 그룹에서 간 섬유화 유발정도를 비교하기 위해 배양 5일차에 간 오가노이드에 대한 면역염색을 진행했을 때, 도 14a에서 확인되는 바와 같이, 섬유화 마커 (SMA, VIM)는 LEM-MA (NT) 그룹에서 거의 발현하지 않는 것에 비해 10 ng/ml의 TGF-
처리를 통해 생화학적으로 섬유화를 유발한 그룹과 UV 광가교를 통해 기계적 물성을 증가시킨 그룹에서는 발현량이 증가하는 것을 확인하였으며, 두 가지 자극 모두 처리하여 섬유화를 유발한 그룹에서 섬유화 마커가 가장 높게 발현하는 것을 확인하였다. 또한, 간 분화 마커인 ALB의 발현의 경우에는 어떠한 처리도 하지 않은 no treatment (NT) 그룹에 비해 섬유화를 유발한 그룹에서 발현이 감소함을 확인함으로써 간 기능성이 감소된 것을 확인하였다.
정량적 PCR 분석을 실시하여 각 그룹의 섬유화 정도를 유전자 발현량 비교를 통해 확인했을 때, 도 14b와 같이 섬유화 관련 유전자(α-SMA, COL1A1, PDGFRB)는 LEM-MA (NT) 그룹에 비해 LEM-MA + TGF-β, LEM-MA + UV 그룹에서 증가하고, LEM-MA + TGF-β + UV 그룹에서 가장 크게 유의미하게 증가하는 것을 확인하였다.
이를 통해, 섬유화 유발 사이토카인을 이용한 생화학적 유도 방식과 UV 광가교를 통한 기계적 물성 증가의 복합 적용을 통해 실제 간 섬유화 환경을 가장 잘 구현하는 인간 iPSC 유래 간 섬유화 오가노이드 모델을 제작할 수 있음을 알 수 있다.
실험예 3-3. ECM-MA 하이드로젤 기반 제작된 인간 iPSC 유래 간 섬유화 오가노이드의 분석 (2)
Yes-associated protein(YAP)은 세포 증식, 세포 사멸 및 이동에 중요한 기능을 하는 신호 전달 경로의 중요한 단백질로서 실제 간 섬유증이나 간경화 환자에서 활성화되어 높게 발현한다고 알려져 있다. LEM-MA 하이드로젤 (#1 그룹, 2% (w/v) LEM-MA 농도) 기반 UV 광가교 (광개시제 D2959 농도: 0.3% (w/v), UV 광원: 365 nm, 8900 μW/cm2, 10분 조사)로 제작된 간 오가노이드 섬유화 모델에서도 YAP 단백질의 발현이 증가하는지를 확인하기 위해 배양 5일차에 면역염색 및 정량 분석을 진행하였다.
그 결과 도 15a에서 확인되는 바와 같이, 간 오가노이드에 아무런 처리를 해주지 않은 no treatment (NT) 그룹에서는 YAP 단백질의 발현이 거의 관찰되지 않는 반면, 10 ng/ml TGF-β 처리를 통해 생화학적으로 섬유화를 유발한 그룹과 UV 광가교를 통해 기계적 물성을 증가시킨 그룹에서는 YAP 단백질 발현량이 증가하는 것을 확인하였으며, 두 가지 자극을 모두 처리하여 섬유화를 유발한 그룹에서 YAP 활성이 가장 높게 나타나는 것을 확인하였다.
또한, YAP 단백질은 세포의 상태에 따라 핵과 세포질 모두에 존재하는데 섬유화가 심하게 유발될수록 주변 ECM의 리모델링(remodeling)이 일어나면서 YAP 단백질이 nuclear localization 되면서 핵에 주로 존재하게 된다고 알려져 있다. YAP 단백질의 활성도를 분석하기 위해 핵에 발현하는 YAP 단백질과 세포질에 발현하는 YAP 단백질 양의 비율로 계산하여 정량했을 때에도 NT 그룹에 비해 생화학적 인자 처리 및 물리적인 가교를 통해 섬유화를 유발한 간 오가노이드에서 가장 높은 활성도를 가지는 것을 확인하였다 (도 15b).
이를 통해, LEM-MA 하이드로젤 기반 UV 광가교를 통해 제작한 간 오가노이드 섬유화 모델이 실제 섬유화 조직에서와 같이 YAP pathway의 활성이 증가된 분자적 수준에서의 섬유화 신호전달까지 구현할 수 있는 보다 정밀한 섬유화 체외모델을 제공할 수 있음을 확인하였다.
실험예 4: ECM-MA 하이드로젤을 이용한 폐 오가노이드의 섬유화 (fibrosis) 모델링
폐 섬유화 모델링을 위해서 탈세포 폐 조직 유래 세포외기질 (lung extracellular matrix; LuEM)에 MA를 수식하여 제작한 LuEM-MA 유도체의 UV 광가교 (광원: 365 nm, 8900 μW/cm2, UV 10분 조사, 광개시제 D2959 농도: 0.3% (w/v))를 통해 하이드로젤의 기계적 물성을 증가시켜 폐 오가노이드 내에 섬유화를 유발하였다. (LuEM-MA 하이드로젤의 농도는 2% (w/v))
UV 광가교를 통해 LuEM-MA 하이드로젤의 기계적 물성을 강화하면 배양되는 폐 오가노이드에 섬유화가 유발되는 양상이 관찰되었다 (도 16a).
LuEM-MA (NT) 그룹과 LuEM-MA (+UV) 그룹의 섬유화 유발 정도를 정량 비교하기 위해 7일 동안 배양된 폐 오가노이드에 대한 정량적 PCR 분석을 진행했을 때, 섬유화 마커인 Col1a1은 LuEM-MA (NT) 그룹 보다 LuEM-MA (UV) 그룹에서 더 높게 발현되는 것을 확인하였다 (도 16b).
따라서, UV 광가교에 의한 LuEM-MA 하이드로젤의 기계적 물성 증가를 통해 폐 오가노이드 기반 섬유화 질환 모델을 제작할 수 있음을 확인하였다.
실험예 5: ECM-MA 하이드로젤을 이용한 신장 오가노이드의 섬유화 (fibrosis) 모델링
신장 섬유화 모델을 제작하기 위해서 탈세포 신장 조직 유래 세포외기질 (kidney extracellular matrix; KEM)에 MA를 수식한 KEM-MA 유도체에 대한 UV 광가교 (광원: 365 nm, 8900 μW/cm2, UV 10분 조사, 광개시제 D2959 농도: 0.3% (w/v))를 통해 하이드로젤의 기계적 물성을 증가시켜 섬유화를 유발하였다. (KEM-MA 하이드로젤의 농도는 2% (w/v))
7일 동안 배양된 신장 오가노이드에 대한 면역염색을 진행하여 각각의 그룹에서 섬유화 유발정도를 비교한 결과, 섬유화 관련 마커인 SMA, VIM가 MAT (Matrigel) 그룹 및 KEM-MA (NT) 그룹에서는 거의 발현하지 않는 것에 비해 UV 광가교를 통해 하이드로젤의 기계적 물성을 증가시킨 그룹 (KEM-MA(+UV))에서는 발현이 크게 증가하는 것을 확인하였다 (도 17).
따라서, UV 광가교에 의한 KEM 하이드로젤의 기계적 물성 증가를 통해 신장 오가노이드 기반 섬유화 질환 모델을 제작할 수 있음을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (15)
- 아크릴기로 수식된 조직 유래 세포외기질을 포함하는 하이드로젤용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 아크릴기는 아크릴레이트기, 메타크릴레이트기 및 이타코네이트기 중 어느 하나 이상인 하이드로젤용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조직 유래 세포외기질은 간 조직 유래 세포외기질, 폐 조직 유래 세포외기질, 신장 조직 유래 세포외기질, 심장 조직 유래 세포외기질, 장 조직 유래 세포외기질, 근육 조직 유래 세포외기질, 피부 조직 유래 세포외기질, 췌장 조직 유래 세포외기질, 골수 조직 유래 세포외기질, 뇌 조직 유래 세포외기질 및 척수 조직 유래 세포외기질 중 어느 하나 이상인 하이드로젤용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 아크릴기와 조직 유래 세포외기질은 중량비가 1:1 내지 8:1 인 하이드로젤용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 수식는 8 내지 14의 pH에서 0 초과 8 시간 미만으로 처리한 뒤 6 내지 8의 pH에서 12 내지 28시간 처리하는 것인 하이드로젤용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조직 유래 세포외기질에 대한 아크릴기의 수식은 50 내지 75% 인 하이드로젤용 조성물.
- 제1항의 조성물을 가교시켜 제조된 하이드로젤.
- 제7항에 있어서,
상기 조성물은 농도가 0.1 내지 4.0% (w/v)인 하이드로젤.
- 제7항에 있어서,
상기 조성물은 광개시제를 더 포함하고,
상기 가교는 UV 조사를 더 포함하는 하이드로젤.
- 제9항에 있어서,
상기 UV 조사는 1 내지 20분간 이루어지는 것인 하이드로젤.
- 조직 유래 세포외기질을 아크릴기로 수식하는 단계를 포함하는 하이드로젤용 조성물 제조방법.
- 제11항에 있어서,
상기 조직 유래 세포외기질과 아크릴기는 중량비가 1:1 내지 1:8인 하이드로젤용 조성물 제조방법.
- 제11항에 있어서,
상기 수식은 8 내지 14의 pH에서 0 초과 8 시간 미만으로 처리한 뒤 6 내지 8의 pH에서 12 내지 28시간 처리하는 것인 하이드로젤용 조성물 제조방법.
- 조직 유래 세포외기질을 아크릴기로 수식하여 하이드로젤용 조성물을 제조하는 단계; 및
상기 하이드로젤용 조성물을 가교시키는 단계를 포함하는 하이드로젤 제조방법.
- 제14항에 있어서,
상기 하이드로젤용 조성물은 광개시제를 더 포함하고,
상기 가교는 UV 조사를 더 포함하는 하이드로젤 제조방법.
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