CN101914489A - 肝炎病毒体外培养模型及其构建方法与应用 - Google Patents

肝炎病毒体外培养模型及其构建方法与应用 Download PDF

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    • C12N2770/24251—Methods of production or purification of viral material

Abstract

本发明涉及肝炎病毒体外培养模型及其构建方法与应用，所述肝炎病毒体外培养模型采用人胎肝干细胞构建而成，包括分离培养人胎肝干细胞、免疫组化鉴定人胎肝干细胞、肝炎病毒血清感染人胎肝干细胞、验证肝炎病毒已感染人胎肝干细胞且病毒已繁殖并持续性分泌到细胞外，该模型可用于体外抗肝炎病毒药物的筛选与效果评价，所述肝炎病毒体外培养模型采用的人胎肝干细胞可感染肝炎病毒并持续性的分泌肝炎病毒；人胎肝干细胞可以传代培养；方法简便；重复性好。

Description

肝炎病毒体外培养模型及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及体外培养模型及其构建方法与应用，尤其是肝炎病毒体外培养模型及其构建方法与应用。
背景技术
众所周知，乙型肝炎病毒(HBV)是引起肝脏疾病的最主要原因之一，全球大约有3.5亿人是慢性HBV携带者，严重的可导致肝硬化、原发性肝癌。病毒性乙型肝炎流行面广，传染性强，是世界上最常见的感染性疾病之一，人一旦被乙肝病毒感染，肝脏就会发生炎性病变，肝细胞受损，对人体造成极大的危害，因此研究HBV的发病机制及其防治方法具有重要的意义。
研究HBV生物学特性、乙型肝炎发病机制、体外抗HBV药物筛选及其防治方法的重要环节之一就是要建立方便有效的HBV体内外培养模型。现在用于研究HBV的动物培养体内模型，主要有灵长类、树鼩、鸭和应用最多的转基因小鼠模型及人鼠嵌合肝模型；建立模型的细胞包括成人肝细胞、胎肝细胞、HepRG细胞系及以HepG-2为基础的转基因细胞。动物模型虽然能模拟体内HBV感染过程，但是仍存在HBV复制表达水平不高，种间差异及免疫缺陷等问题。而建立的细胞培养体外模型，由于均存在不同程度的局限性，因而仍然没有合适理想的模型，如成人肝细胞是一类终末分化的细胞，不能传代培养，且在肝细胞铺板后，成熟肝细胞的功能如白蛋白产生能力下降、失去典型多角形态，对病毒敏感性也逐渐下降，因此限制其实际应用；胎肝细胞也终究因为不能传代培养而在应用中受到制约；HepRG细胞系模型不仅不能获得完整的HBV颗粒，而且难以去除添加物对HBV感染过程的可能影响；而在目前应用最广的以HepG-2为基础的HepG2.2.15转基因细胞中，由于HBV整合在宿主细胞染色体上且不能被清除，因而其复制方式与自然感染不同，细胞培养中不产生cccDNA(复制中间体)，病毒复制水平低，另外，HBV与转染肝癌细胞长期稳定的整合状态难以用于研究细胞的转化机制。
此外，人们还探讨了HBV感染的非肝源性细胞，并且，越来越多的研究表明，HBV不仅感染肝源性细胞，也可以感染其它如骨髓干细胞、内皮祖细胞、胎盘滋养层细胞等具干细胞特性的细胞，但是，由于HBV不能或很难在这些细胞中复制繁殖，且这些细胞为非肝脏源细胞，HBV感染机制可能不同，因此仍然不能用于建立理想的细胞培养模型。
丙型肝炎病毒(HCV)也呈全球性流行，根据世界卫生组织的统计，HCV在人群中的感染率约为3％，全球约有1.7亿人感染HCV，每年新发病型肝炎病例约3.5万例。我国进行的全国HCV血清流行病学调查显示，我国一般人群抗HCV阳性率为3.2％，约有4000万人感染HCV。HCV是引起人类慢性肝炎和输血后肝炎的主要病原体之一，约60％的急性丙型肝炎患者转化为慢性，而慢性患者中分别有8-46％和11-19％发展成肝硬化和肝细胞癌。
由于HCV在被感染组织和血清中浓度较低，HCV的高度变异，缺乏稳定的HCV体外细胞培养系统及理想的实验动物模型等问题，阻碍了对HCV的进一步研究。除人之外，黑猩猩是目前报道的唯一可以感染HCV的实验动物，由于来源不便，耗资巨大，使其应用受到限制。
到目前为止，以干扰素为主的抗病毒治疗只能使30％左右的患者得到根治，尚未发现令人满意的治疗药物和有效疫苗。因此，迫切需要寻找预防和治疗HCV感染的有效方法。而其关键是建立稳定的维持病毒复制和传代的细胞模型，以深入了解丙肝病毒的生命周期和发病机理。
HCV体外细胞培养模型研究现状是：1肝源细胞模型，即包括原代肝细胞、胎肝细胞，但因为其复制水平低，也不稳定，不能满足药物筛选研究的要求；肝癌细胞系则不能用于感染机制的研究。2HCV基因组转染模型：包括Huh-7细胞转染HCV JFH-1 RNA、胎肝细胞转染无适应性突变的HCV RNA但缺陷在于仅HCV 2a、1a型可传代培养，细胞培养所分泌的病毒颗粒较之动物实验高同质性和低感染性。3肝外细胞模型包括人淋巴细胞、纤维母细胞、单核白血病细胞、胆管癌细胞、T细胞系、PBMC但病毒感染非肝细胞的方式和途径是否与体内感染肝细胞相似，且在非肝细胞中长期培养的HCV，其生物学特性是否发生改变迄今尚不清楚。
胎肝干细胞(hepatic stem cell，HSC)是胎儿体内存在的一种具有自我增殖能力和多向分化潜能的肝源性干细胞，既可以向胆管细胞分化，又可向肝细胞分化。它并非特指某一种类的细胞，而是由与肝脏胚胎发育及再生有关的各类具有干细胞特性的细胞组成，如肝脏在胚胎期出现的胎肝干细胞及成肝细胞(哺乳动物胚胎发育早期阶段肝内的干细胞，它同时表达肝细胞表型和胆管细胞表型，后两者又可进一步分化成为成熟肝细胞和胆管细胞)、成年肝脏内存在的兼性肝细胞及其子代细胞卵圆细胞等。肝干细胞作为治疗肝脏相关疾病的一种细胞来源，对肝的细胞移植，组织工程和基因治疗等有很重要的作用。
截至目前，尚未见利用人胎肝干细胞构建HBV、HCV体外培养模型的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供肝炎病毒体外培养模型。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述肝炎病毒体外培养模型的构建方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述肝炎病毒体外培养模型的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
肝炎病毒体外培养模型，是采用人胎肝干细胞构建而成的，包括分离培养人胎肝干细胞、免疫组化鉴定人胎肝干细胞、肝炎病毒血清感染人胎肝干细胞、验证肝炎病毒已感染人胎肝干细胞且病毒已繁殖。
优选的，上述肝炎病毒体外培养模型，所述肝炎病毒为乙肝病毒或丙肝病毒或丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒。
优选的，上述肝炎病毒体外培养模型，所述人胎肝干细胞是与肝脏胚胎发育及再生有关的各类具有干细胞特性的细胞。
优选的，上述肝炎病毒体外培养模型，所述人胎肝干细胞包括卵圆细胞、成肝细胞、兼性肝细胞、小肝细胞、肝侧群细胞或肝前体细胞。
肝炎病毒体外培养模型的构建方法，采用人胎肝干细胞用于构建肝炎病毒体外培养模型，包括人胎肝干细胞的分离培养、鉴定人胎肝干细胞、肝炎病毒血清感染人胎肝干细胞、验证肝炎病毒已感染细胞且病毒已繁殖并持续性分泌到细胞外。
优选的，上述肝炎病毒体外培养模型的构建方法，具体步骤为：
I.分离培养人胎肝干细胞：
(1).胎肝干细胞的分离培养：将胶原酶原位灌注肝脏-剥离肝细胞悬液-过滤-充分散开细胞-离心细胞悬液-弃掉上清液-沉淀的细胞用培养基悬浮-将细胞放入离心管中-置于冰上沉淀-利用肝干细胞黏附作用使细胞沉淀-去除细胞悬液-离心沉淀细胞-细胞用PBS液悬浮-用PBS液将Percoll按体积分数配成30％-90％的浓度梯度-离心并吸取位于不同Percoll之间细胞层悬浮沉淀的细胞-接种于塑料培养瓶中，培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液-并在37℃、5％CO2孵箱中培养过夜，新分离的细胞用0.25％台盼蓝染色观察细胞活力；
(2).胎肝干细胞的培养与传代：细胞接种18h后首次更换培养液，弃去未贴壁细胞，以后每3-5天换液1次。两周后细胞数量成对数生长，形成小细胞克隆，四周后，小克隆逐渐增多，铺满瓶底，质量分数0.25％胰蛋白酶消化细胞，按1∶2比例传代。
II.免疫组化鉴定人胎肝干细胞：采用SP免疫组化试剂盒检测AFP、OV-6、CK19、CD34、CK18表面标志，以PBS代替各表面标志的一抗作为阴性对照，步骤如下：消化细胞后低速离心，PBS悬起细胞-接种于盖玻片上-通风晾干-PBS充分洗涤-抗原热修复-PBS洗涤多次后呈红棕色染色为阳性-苏木素复染；
III.肝炎病毒高拷贝阳性血清感染人胎肝干细胞：将肝炎病毒血清接种到无血清培养液的六孔板胎肝干细胞中；孵育后，吸取上清液，采用培养液培养细胞，每隔48h取上清即可获得肝炎病毒。
IV.采用以下一种或几种方法验证肝炎病毒已感染人胎肝干细胞且繁殖：
(1).荧光定量PCR检测不同时间细胞上清的病毒滴度；
(2).ELISA检测不同时间细胞上清中病毒抗原分泌情况：采用肝炎病毒抗原检测试剂盒对不同时间细胞上清进行病毒表面抗原或核心抗原的检测；
(3).原位杂交检测细胞内病毒：将感染病毒的细胞，于病毒洗去后第三天和第七天进行生物素(POD)和荧光探针标记原位杂交。
操作时可采用上述三种方法反复验证肝炎病毒已感染人胎肝干细胞且繁殖并持续性分泌到细胞外。
优选的，上述肝炎病毒体外培养模型的构建方法，所述肝炎病毒为乙肝病毒或丙肝病毒或丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒。
优选的，上述肝炎病毒体外培养模型的构建方法，所述人胎肝干细胞是与肝脏胚胎发育及再生有关的各类具有干细胞特性的细胞。
优选的，上述肝炎病毒体外培养模型的构建方法，所述人胎肝干细胞包括卵圆细胞、成肝细胞、兼性肝细胞、小肝细胞、肝侧群细胞或肝前体细胞。
肝炎病毒体外培养模型的应用，采用上述肝炎病毒体外培养模型用于体外抗肝炎病毒药物的筛选与效果评价。
具体操作为将稳定生长的人胎肝干细胞接种六孔板中24h后，将其与上述肝炎病毒体外培养模型的肝炎病毒血清孵育24h，吸去病毒液，PBS洗6遍，留洗后液待检；分别加入200IU/ml、500IU/ml、1000IU/ml、2000IU/ml的抗病毒药物，与不加抗肝炎病毒药物组做阳性对照，不加病毒及抗肝炎病毒药物组作阴性对照，每组重复三孔，37℃孵育，3天后取上清，荧光定量PCR和电泳检测肝炎病毒的繁殖抑制情况。
也可以将稳定生长的人胎肝干细胞与上述肝炎病毒体外培养模型的子代肝炎病毒进行孵育，其他步骤同上，从而进行体外抗肝炎病毒药物的筛选与效果评价。
优选的，上述肝炎病毒体外培养模型的应用，所述模型中人胎肝干细胞是与肝脏胚胎发育及再生有关的各类具有干细胞特性的细胞。
优选的，上述肝炎病毒体外培养模型的应用，所述模型中人胎肝干细胞包括卵圆细胞、成肝细胞、兼性肝细胞、小肝细胞、肝侧群细胞或肝前体细胞。
优选的，上述肝炎病毒体外培养模型的应用，所述体外抗肝炎病毒药物包括化学药物、中草药、生物工程药或干扰素。
本发明的有益效果是：
所述肝炎病毒体外培养模型，人胎肝干细胞可感染肝炎病毒并持续性的分泌肝炎病毒，因而该模型可用于体外抗肝炎病毒药物的筛选与效果评价且方法简便，重复性好；人胎肝干细胞可以传代培养，因而大大扩大其应用。
附图说明
图1是本发明实施例1的方法流程示意图；
图2是人胎肝干细胞不同培养时间细胞形态示意图；其中
A为刚分离胎肝干细胞(40×)示意图；
B为刚分离胎肝干细胞(100×)示意图；
C为台盼蓝染色(40×)示意图；
D为HE染色(200×)示意图；
E为培养1周后胎肝干细胞(100×)示意图；
F为培养1周后胎肝干细胞(200×)示意图；
G为分离培养2周后胎肝干细胞(100×)示意图；
H为分离培养4周后胎肝干细胞(100×)示意图；
I为传代培养5天细胞(100×)示意图；
J为传代2周后细胞(100×)示意图；
图3是人胎肝干细胞不同表面标志物的免疫细胞化学染色(×200)示意图。其中
A为AFP；B为OV-6；C为CD34；D为CK18；E为CK19；
F为阴性对照。
图4是检测细胞内HBV DNA的原位杂交(200×)示意图。其中
A、B为感染3d后的细胞；C、D为感染7d后细胞；
E、F为阴性对照；      A、C、E为生物素标记；
B、D、F为荧光标记。
图5是不同浓度干扰素(IFN)作用HBV后HBV DNA的PCR产物电泳示意图。其中，
1.200IU IFN；2.500IU IFN；3.1000IU IFN；
4.2000IU IFN；5.感染组对照组；6.阴性对照；
M.DL2000Marker。
图6是本发明实施例3的方法流程示意图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式及附图对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例1构建肝炎病毒体外培养模型如图1-图4所示
I.分离培养人胎肝干细胞：
(1).胎肝干细胞的分离培养：将胶原酶原位灌注肝脏，待肝脏呈灰白色时停止灌注，小刮刀小心剥离肝细胞悬液，经100目筛网过滤，吸管吹打使细胞充分散开。细胞悬液经D-Hank’s液2000r/min，4℃离心5min。弃掉上清液，沉淀的细胞用2ml DMEM培养基悬浮，加入50ml含0.1％Pronase E和0.005％ DNaseI的DMEM培养基，37℃、5％CO2培养30min。然后将细胞转移至离心管中，置于冰上沉淀20min，利用肝干细胞黏附作用使细胞沉淀。去除细胞悬液，沉淀细胞经4℃、2000r/min离心10min。细胞用PBS液悬浮。用PBS液将Percoll按体积分数配成30％-90％的浓度梯度，经4℃、10000r/min离心30min，吸取位于50％与70％Percoll之间细胞层。2ml DMEM/F12悬浮沉淀的细胞，接种于0.25％明胶处理塑料培养瓶中，培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液，并在37℃、5％CO2孵箱中培养过夜。细胞接种18h后首次更换含10％FBS、10ng/ml SCF、10ng/ml HGF、20ng/ml EGF、10ng/ml LIFf及1μg/ml胰岛素的DMEM/F12培养液，弃去未贴壁细胞。以后每3-5天换液1次。
新分离的干细胞用0.25％台盼蓝染色观察细胞活力。显微镜下可见细胞大小均匀，光亮而透明，细胞核质比大，细胞直径为10-15μm，核为圆形或卵圆形，呈鹅卵石形态(如图2A，B所示)，Trypanblue染色细胞平均活性率为90％(如图2C所示)，常规HE染色核较大(如图2D所示)，胞浆少，细胞形态均一。继续培养发现该细胞生长相对缓慢，接种培养瓶24h后半贴壁状态，培养3-10d后细胞体积才有所增大(如图2E，F所示)，细胞增殖明显活跃，原代连续培养两周后细胞呈集落样生长，排列成葡萄状(如图2G所示)；培养一个月后，细胞的克隆增大，克隆数逐渐增多(如图2H所示)，胰酶消化1∶2传代，传代后细胞成克隆生长(如图2I，J所示)，随着传代，细胞逐渐脱落，但仍然可见小克隆。
(2).胎肝干细胞的培养与传代：细胞接种18h后首次更换含10％FBS、10ng/ml SCF(人干细胞生长因子)、10ng/ml HGF(人肝细胞生长因子)、20ng/ml EGF(表皮生长因子)、10ng/ml LIF(人白血病抑制因子)及1μg/ml胰岛素的DMEM/F12培养液，弃去未贴壁细胞。以后每3-5d换液1次。两周后细胞数量成对数生长，形成小细胞克隆，四周后，小克隆逐渐增多，铺满瓶底。质量分数0.25％胰蛋白酶消化细胞，按1∶2比例传代。
II.免疫组化鉴定人胎肝干细胞：采用SP免疫组化试剂盒检测AFP、OV-6、CK19、CD34、CK18表面标志，以PBS代替一抗作为阴性对照，操作步骤如下：
(1).消化细胞后低速离心，PBS悬起细胞，取100μl接种于盖玻片上，通风晾干，95％酒精室温固定15min；
(2).PBS充分洗涤后，以30ml/L过氧化氢溶液浸泡10min灭活内源性过氧化物酶；
(3).抗原热修复后，PBS洗三次，5min/次，以正常山羊血清室温封闭30min；
(4).甩干，加第一抗体(AFP、CK19、CD34、OV-6)PBS 1∶100稀释4℃过夜；
(5).PBS洗三次，5min/次，加生物素标记的第二抗体37℃45min；
(6).PBS洗三次，5min/次，加结合过氧化物酶链霉亲和素37℃45min；
(7).PBS洗三次，5min/次，加新鲜配制的DAB，显微镜下观察5-10min红棕色染色为阳性；
(8).苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
显色结果表明，新分离的人胎肝干细胞AFP、CK19、CK18、OV-6、CD34均为阳性染色，其中胎肝细胞标志AFP和肝卵圆细胞标志OV-6、CK18表达较强，阳性细胞胞浆呈棕红色，CD34也有表达，胞浆红棕色染色相对较少，CK19阳性细胞染色较弱(如图3A-F所示)。
III.HBV高拷贝阳性血清感染人胎肝干细胞：将HBV(107-108Copies)血清100ul接种到1ml DMEM/F12培养液(无血清)的六孔板细胞中；37℃孵育24h后，吸取上清液，采用DMEM/F12培养液(10％FBS)培养细胞，每隔48h取上清即可获得HBV，可连续取样5次。
IV.验证乙肝病毒已感染人胎肝干细胞且繁殖并持续性分泌到细胞外：
采用荧光定量PCR检测不同时间细胞上清的病毒滴度。
(1).DNA提取：采用乙肝病毒核酸定量检测试剂盒提取DNA并保存于-20℃，阴阳性质控样品经同样处理后备用。
(2).荧光定量PCR扩增：利用PCR-荧光探针法，采用乙肝病毒核酸定量检测试剂盒进行荧光定量PCR扩增(杭州博日公司)，具体使用方法参见产品说明书。
PCR反应体系：PCR反应液37.7μl；Taq酶0.3μl；UDG酶0.1μl；标本液或对照品或标准品2μl。
PCR反应条件：37℃5min；93℃2min；以下40个循环：95℃5s；
60℃40s。
结果表明：各取样时间点的PBS洗后液中未检测到病毒；HBV高拷贝血清可感染人胎肝干细胞并能在细胞内繁殖，且细胞可持续分泌病毒DNA至上清达10天，且HBV DNA含量在102-105copies之间，第二天最高能达8.9×104copies。
采用ELISA检测不同时间细胞上清中病毒HBsAg分泌情况和原位杂交检测细胞内病毒分布。采用乙肝病毒s抗原检测试剂盒(英科新创科技有限公司)进行ELISA检测(按照试剂盒说明书操作)的结果表明，在细胞上清液中能持续检测到HBsAg；
采用人HBVDNA生物素标记(POD)和荧光原位杂交双染色试剂盒(天津灏洋生物技术公司)于病毒洗去后第三天和第七天进行原位杂交检测(按照试剂盒说明书操作)的结果表明，在感染病毒的细胞孔中显示棕红色颗粒或绿色荧光信号，未接病毒的细胞孔均为阴性结果，说明乙肝病毒细胞内存在病毒颗粒(如图4A-F所示)。
V.验证本模型子代HBV肝炎病毒具有感染性
本模型子代HBV肝炎病毒感染人胎肝干细胞：感染人胎肝干细胞：将本模型子代HBV肝炎病毒(104-105Copies)接种到1ml DMEM/F12培养液(无血清)的六孔板细胞中；37℃孵育24h后，吸取上清液，采用DMEM/F12培养液(10％FBS)培养细胞，每隔48h取上清即可获得HBV，可连续取样5次。
利用上述子代HBV体外感染模型，采用荧光定量PCR检测不同时间细胞上清的病毒滴度，结果表明，子代HBV肝炎病毒可感染人胎肝干细胞并能在细胞内繁殖，且细胞可持续分泌病毒至上清中达10d，其中，HBV DNA检测值均在102-105copies之间，ELISA方法检测细胞分泌的HBsAg均呈阳性。
采用上述三种方法反复验证乙肝病毒(包括HBV高拷贝阳性血清和本模型子代HBV肝炎病毒)已感染人胎肝干细胞且繁殖并持续性分泌到细胞外。
实施例2
I.HCV高拷贝阳性血清感染人胎肝干细胞：将HCV(105-107Copies)血清100ul接种到1ml DMEM/F12培养液(无血清)的六孔板细胞中；37℃孵育24h后，吸取上清液，采用DMEM/F12培养液(10％FBS)培养细胞，每隔48h取上清即可获得HCV，可连续取样5次。
II.验证丙肝病毒已感染人胎肝干细胞且繁殖并持续性分泌到细胞外：
采用荧光定量PCR检测不同时间细胞上清的病毒滴度法
(1).RNA提取：采用丙肝病毒核酸定量检测试剂盒提取RNA并保存于-20℃，阴阳性质控样品经同样处理后备用。
(2).荧光定量PCR扩增：利用PCR-荧光探针法，采用丙肝病毒核酸定量检测试剂盒进行荧光定量PCR扩增(杭州博日公司)，具体使用方法参见产品说明书。
PCR反应体系：RT-PCR MIX 25ul；Mn2+2.5ul；HCV Pribe MIX1.5ul；internal Control 1ul；标本液或对照品或标准品20μl。
PCR反应条件：90℃30S；61℃20min；95℃1min；以下50个循环：95℃15s；60℃60s。
结果表明：各取样时间点的PBS洗后液中未检测到病毒；HCV高拷贝血清可感染人胎肝干细胞并能在细胞内繁殖，且细胞可持续分泌病毒RNA至上清达10天，且HCV RNA含量在102-105copies之间，第八天最高能达5.3×105copies。
ELISA方法检测细胞分泌的HCeAg均呈阳性。
III.验证本模型子代HCV肝炎病毒具有感染性
本模型子代HCV肝炎病毒感染人胎肝干细胞：将本模型子代HCV肝炎病毒(105Copies)100ul接种到1ml DMEM/F12培养液(无血清)的六孔板细胞中；37℃孵育24h后，吸取上清液，采用DMEM/F12培养液(10％FBS)培养细胞，每隔48h取上清即可获得HCV，可连续取样5次。
利用上述子代HCV体外感染模型，采用荧光定量PCR检测不同时间细胞上清的病毒滴度，结果表明，子代HCV肝炎病毒可感染人胎肝干细胞并能在细胞内繁殖，且细胞可持续分泌病毒RNA，HCV RNA含量在102-104copies之间。
其他步骤同实施例1。
实施例3如图6所示，与实施例1的不同点如下：
I.分离培养人胎肝干细胞中胎肝干细胞的分离培养：将胶原酶原位灌注肝脏，待肝脏呈灰白色时停止灌注，小刮刀小心剥离肝细胞悬液，经100目筛网过滤，吸管吹打使细胞充分散开。细胞悬液经D-Hank’s液2000r/min，4℃离心5min。弃掉上清液，沉淀的细胞用2ml DMEM培养基悬浮，加入50ml含0.1％Pronase E和0.005％DNase I的DMEM培养基，37℃、5％CO2培养30min。然后将细胞转移至离心管中，置于冰上沉淀20min，利用肝干细胞黏附作用使细胞沉淀。去除细胞悬液，沉淀细胞经4℃、2000r/min离心10min。细胞用PBS液悬浮。用PBS液将Percoll按体积分数配成30％-90％的浓度梯度，经4℃、10000r/min离心30min，吸取位于70％与90％Percoll之间细胞层。2ml DMEM/F12悬浮沉淀的细胞，接种于0.25％明胶处理塑料培养瓶中，培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液，并在37℃、5％CO2孵箱中培养过夜。细胞接种18h后首次更换含10％FBS、10ng/ml SCF、10ng/ml HGF、20ng/ml EGF、10ng/ml LIFf及1μg/ml胰岛素的DMEM/F12培养液，弃去未贴壁细胞。以后每3-5天换液1次，而分离出干细胞。
其它各步骤的内容均与实施例1相同。
实施例4以干扰素IFN药物为准进行体外抗HBV药物的筛选与效果评价试验
如图5所示，应用实施例1所述HBV体外培养模型，采用人胎肝干细胞用于体外抗HBV药物的筛选与效果评价是将稳定生长的人胎肝干细胞接种六孔板中24h后，将其与HBV病毒血清孵育24h，吸去病毒液，PBS洗6遍，留洗后液待检；分别加入200IU/ml、500IU/ml、1000IU/ml、2000IU/ml的干扰素IFN，不加干扰素组做阳性对照，不加病毒及干扰素组作阴性对照，做阳性对照，不加病毒及抗HBV药物组作阴性对照，每组重复三孔，37℃孵育，3天后取上清，荧光定量PCR和电泳方法检测HBV的繁殖抑制情况。
结果表明如图5中1-6，M所示：干扰素可以抑制HBV病毒颗粒在细胞内的复制，且不同浓度的干扰素作用显示不同的抑制效果。这说明成功构建了HBV体外培养模型并可用于抗HBV药物筛选和效果评价。
实施例5以干扰素IFN药物为准进行体外抗HCV药物的筛选与效果评价试验
应用实施例2所述HCV体外培养模型，采用人胎肝干细胞用于体外抗HCV药物的筛选与效果评价是将稳定生长的人胎肝干细胞接种六孔板中24h后，将其与HCV病毒血清孵育24h，吸去病毒液，PBS洗6遍，留洗后液待检；分别加入200IU/ml、500IU/ml、1000IU/ml、2000IU/ml的干扰素IFN，不加干扰素组做阳性对照，不加病毒及干扰素组作阴性对照，做阳性对照，不加病毒及抗HCV药物组作阴性对照，每组重复三孔，37℃孵育，3天后取上清，荧光定量PCR和电泳方法检测HCV的繁殖抑制情况。
结果表明：干扰素可以抑制病毒颗粒在细胞内的复制。这说明成功构建了HCV体外培养模型并可用于抗HBV药物筛选和效果评价。
此外，实施例4和实施例5中除采用干扰素IFN药物还可以是化学药物或中草药或生物工程药等。
综上所述，所述肝炎病毒体外培养模型中采用的人胎肝干细胞可感染乙型、丙型肝炎病毒并持续性的分泌乙型、丙型肝炎病毒；且人胎肝干细胞可以传代培养；方法简便；重复性好。
上述参照具体实施方式对该肝炎病毒体外培养模型及其构建方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.肝炎病毒体外培养模型，其特征在于：是采用人胎肝干细胞构建而成的，包括分离培养人胎肝干细胞、免疫组化鉴定人胎肝干细胞、肝炎病毒血清感染人胎肝干细胞、验证肝炎病毒已感染人胎肝干细胞且病毒已繁殖并持续性分泌到细胞外。
2.根据权利要求1所述的肝炎病毒体外培养模型，其特征在于：所述肝炎病毒为乙肝病毒或丙肝病毒或丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒。
3.根据权利要求1所述的肝炎病毒体外培养模型，其特征在于：所述人胎肝干细胞是与肝脏胚胎发育及再生有关的各类具有干细胞特性的细胞。
4.根据权利要求3所述的肝炎病毒体外培养模型，其特征在于：所述人胎肝干细胞包括卵圆细胞、成肝细胞、兼性肝细胞、小肝细胞、肝侧群细胞或肝前体细胞。
5.权利要求1所述的肝炎病毒体外培养模型的构建方法，其特征在于：采用人胎肝干细胞用于构建肝炎病毒体外培养模型，包括人胎肝干细胞的分离培养、鉴定人胎肝干细胞、肝炎病毒血清感染人胎肝干细胞、验证肝炎病毒已感染细胞且病毒已繁殖并持续性分泌到细胞外。
6.根据权利要求5所述的肝炎病毒体外培养模型的构建方法，其特征在于：所述肝炎病毒为乙肝病毒或丙肝病毒或丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒。
7.根据权利要求5所述的肝炎病毒体外培养模型的构建方法，其特征在于：所述人胎肝干细胞包括卵圆细胞、成肝细胞、兼性肝细胞、小肝细胞、肝侧群细胞或肝前体细胞。
8.权利要求1所述的肝炎病毒体外培养模型的应用，其特征在于：采用上述肝炎病毒体外培养模型用于体外抗肝炎病毒药物的筛选与效果评价。
9.根据权利要求8所述的肝炎病毒体外培养模型的应用，其特征在于：所述模型中人胎肝干细胞包括卵圆细胞、成肝细胞、兼性肝细胞、小肝细胞、肝侧群细胞或肝前体细胞。
10.根据权利要求8所述的肝炎病毒体外培养模型的应用，其特征在于：所述体外抗肝炎病毒药物包括化学药物、中草药、生物工程药或干扰素。
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