PT1891208E - Novas composições celulares e métodos para a sua preparação - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO "NOVAS COMPOSIÇÕES CELULARES E MÉTODOS PARA A SUA PREPARAÇÃO"
Campo da Invenção: A presente divulgação refere-se a novas composições de células (e. g. , hepatócito, etc.) e métodos para a sua preparação e utilização. Em particular, a invenção refere-se a métodos de processamento das preparações destas células de modo a permitir a sua criopreservação repetida e descongelação embora retendo uma substancial viabilidade.
Antecedentes da Invenção:
Os hepatócitos são células do parênquima do fígado e constituem até 60-80% da massa citoplasmática do fígado. Os hepatócitos desempenham um papel chave na destoxificação, modificação e excreção de substâncias exógenas e endógenas (Ponsoda, X. et al. (2004) "Drug Metabolism By Cultured Human Hepatocytes: How Far Are We From The In Vivo Reality?" Altern Lab Anim. 32(2):101-1 10). Uma das funções de destoxificação dos hepatócitos é a modificação da amónia em ureia para a excreção. Estes são também importantes na síntese de proteínas e armazenamento, na transformação de carbo-hidratos e na síntese de colesterol, sais biliares e fosfolípido (Postic, C. et al. (2004) "Role Of The Liver In The Control Of Carbohydrate and Lipid Homeostasis" Diabetes Metab. 30(5):398-408). O hepatócito 1 é a única célula no corpo que prepara a albumina, fibrinogénio e o grupo protrombina de factores de coagulação. É o sitio principal para a síntese de lipoproteínas, ceruloplasmina, transferrina e glicoproteínas. Os hepatócitos fabricam as suas próprias proteínas estruturais e enzimas intracelulares. Os hepatócitos são também importantes depósitos para a vitamina B12 e ferro.
Devido a estes atributos, hepatócitos isolados e cultivados tornaram-se muito atrativos como sistemas modelos para o estudo das funções do fígado (Chesne, C. et al. (1993) "Viability and Function In Primary Culture Of Adult Hepatocytes From Various Animal Species and Human Beings After Cryopreservation" Hepatology 18 (2) :406-414; Guillouzo, A. et al. (1986) "Isolated and Cultured Hepatocytes," Paris: Edições INSERM e Londres: John Libbey Eurotext); Ponsoda, X. et al. (2004) "Drug Metabolism By Cultured Human Hepatocytes: How Far Are We From The In Vivo Reality?" Altern Lab Anim. 32(2):101-110; Gomez-Lechon, MJ. et al. (2004) "Human Hepatocytes In Primary Culture: The Choice To Investigate Drug Metabolism In Man," Curr Drug Metab. 5 (5) :443-462; Lemaigre, F. et al. (2004) "Liver Development Update: New Embryo Models, Cell Lineage Control, and Morphogenesis" Curr Opin Genet Dev. 14 (5) :582-590; Nanji, A.A. (2004) "Animal Models Of Nonalcoholic Fatty Liver Disease and Steatohepatitis," Clin Liver Dis. 8(3):559-574; Hewitt, NJ. et al. (2004) Cryopreserved Rat, Dog e Monkey Hepatocytes: Measurement Of Drug Metabolizing Enzymes In Suspensions and Cultures," Hum Exp Toxicol. 23 (6): 307-316).
Além da sua utilização em modelos de fígado, os hepatócitos possuem o potencial de ser utilizados para produzir Fígados Bioartificiais (BAL) ou em transplante de hepatócitos que podem 2 proporcionar as funções do fígado para indivíduos que sofrem de doenças hepáticas ou falência hepática. Os fígados bioartificiais (BAL) são descritos por Anand, A.C. (1996) "Bioartificial Livers: The State Of The Art," Trop Gastroenterol. 17(4):197-198, 202-211; Gan, J.H. et ai. (2005) "Hybrid Artificial Liver Support System For Treatment Of Severe Liver Failure" World J Gastroenterol. 11(6):890-894; Fukuda, J. et al. (2004) "Hepatocyte Organoid Culture In Elliptic Hollow Fibers To Develop A Hybrid Artificial Liver," Int J Artlf Organs. 27 (12): 1091-1099; Meng, Q. et al. (2004) "Hepatocyte Culture In Bioartificial Livers With Different Membrane Characteristics" Blotechnol Lett. 26(18):1407-1412; Sekido, H. et al. (2004) "Usefulness Of Artificial Liver Support For Pretransplant Patients With Fulminant Hepatic Failure", Transplant Proc. 36 (8):2355-2356; documentos WO03/105663A2, W005/000376A2, e Patente U.S. N° 6759245. O transplante de hepatócitos é descrito por Chan, C. et al. (2004) "Hepatic Tissue Engineering For Adjunct and Temporary Liver Support: Criticai Technologies" Liver Transpl. 10 (11) : 1331-1342; Lee, S.W. et al. (2004) "Hepatocyte Transplantation: State Of The Art and Strategies For Overcoming Existing Hurdles", Ann. Hepatol. 3 (2) :48 — 53; Horslen, S.P. (2004) "Hepatocyte Transplantation" Transplantation 77 (10):1481-1486 ; Burlina, A.B. (2004) "Hepatocyte Transplantation For Inborn Errors Of Metabolism", J. Inherit. Metab. Dis. 2 7 (3) : 3 73-83; e Fox, IJ. et al. (2004) "Hepatocyte Transplantation", Am. J. Transplant. 4 Supl. 6:7-13.
Um factor limitante no desenvolvimento deste sistema modelo e no desenvolvimento de Fígados Bioartificiais (BAL) foi a fonte errática e a disponibilidade limitada de hepatócitos, especialmente hepatócitos humanos. Os hepatócitos frescos são obteníveis apenas a partir de ressecções de fígado ou fígados 3 não transplantáveis de dadores multi-orgão (Lloyd, T.D.R. et al. (2003) Cryopreservation Of Hepatocytes: A Review Of Current Methods For Banking" Cell and Tissue Culture Banking 4:3-15). O fornecimento deste tecido é inconsistente e freguentemente geograficamente inconveniente à luz do tempo de vida funcional limitado do tecido do fígado (Smrzova, J. et al. (2001) "Optimization Of Porcine Hepatocytes Criopreservation By Comparison Of Viability And Enzymatic Activity Of Fresh And Cryopreserved Cells," Acta Veterinária Brunensis 70: 141-147).
Uma abordagem para direccionar este problema envolveu o desenvolvimento das condições de armazenamento de hepatócitos que permitem que os hepatócitos sejam mantidos ao longo do tempo com as suas funções celulares preservadas. Os métodos de criopreservação para o armazenamento de hepatócitos foram desenvolvidos para ultrapassar esta necessidade (ver, Lloyd, T.D.R. et al. (2003) Cryopreservation Of Hepatocytes: A Review Of Current Methods For Banking" Cell and Tissue Culture Banking 4:3-15; Loretz, L.J. et al. (1989) "Optimization Of Cryopreservation Procedures For Rat and Human Hepatocytes", Xenobiotica. 19 (5) : 489-498; Shaddock, J,G. et al. (1993) "Cryopreservation and Long-Term Storage Of Primary Rat Hepatocytes: Effects On Substrate-Specific Cytochrome P450-Dependent Activities and Unscheduled DNA Synthesis", Cell Biol Toxicol. 9 (4) : 3 45-35 7; Novicki, D.L. et al. (1982) "Cryopreservation Of Isolated Rat Hepatocytes", In Vitro. 18 ( 4) : 3 93-3 9 9 ; Zaleski, J. et al. (1993) "Preservat ion Of The Rate And Profile Of Xenobiotic Metabolism In Rat Hepatocytes Stored In Liquid Nitrogen", Biochem Pharmacol. 46(1): 111-116). Tipicamente, estas medidas compreendem o armazenamento em azoto líquido (-196 °C) ou gás de azoto congelado gás (-150 °C). Verificou-se que a capacidade para recuperar células 4 descongeladas viáveis dependia de múltiplos factores, tais como a velocidade de congelação, a concentração de hepatócitos, o tipo de crioprotector empregue e a temperatura de arrefecimento final. As concentrações celulares de 106-107 células/mL foram tipicamente empregues. Os hepatócitos isolados são tipicamente incubados em suspensão durante um período (e. g., 4-48 horas) para lhes permitir recuperar do processo de isolamento. Depois, é adicionado um crioprotector (tal como glicerol, DMSO, polivinilpirrolodina ou dextrano) e os hepatócitos são congelados. A técnica desenvolveu vários procedimentos de congelação, todos concebidos para minimizar ou prevenir a ocorrência de gelo intracelular. As velocidades de congelação variam tipicamente de -0,05 °C/min a -50 °C/min (ver, Lloyd, T.D.R. et al. (2003) "Cryopreservation Of Hepatocytes: A Review Of Current Methods For Banking", Cell and Tissue Culture Banking 4:3-15) .
Embora o desenvolvimento dos métodos de criopreservação para o armazenamento de hepatócitos tenha facilitado significativamente a disponibilidade de hepatócitos humanos, verificou-se que a criopreservação provoca um decréscimo significativo na viabilidade celular (e. g., 25-35%) (Dou, M. et al. (1992) "Thawed Human Hepatocytes In Primary Culture", Cryobiology 29:454-469; Alexandre, E. et al. (2002) "Cryopreservation Of Adult Human Hepatocytes Obtained From Resected Liver Biopsies", Cryobiology 44:103-113). Coundouris, J.A. et al (1993) reportaram a viabilidade de 67% após 24 horas, declinando para 49% após 14 dias (Coundouris, J. A. et al. (1993) "Cryopreservation Of Human Adult Hepatocytes For Use In Drug Metabolism and Toxicity Studies", Xenobiotica. 23(12): 1399-1409). Adams, R.M. et al. reportaram que a viabilidade dos hepatócitos podia ser melhorada em mais de 90% utilizando 5 fluidos de criopreservação especializados, contudo, verificou-se que apenas 16% de células eram capazes de replicação (Adams, R.M. et ai. (1995) "Effective Cryopreservation And Long-Term Storage Of Primary Human Hepatocytes With Recovery Of Viability, Differentiation, And Replicative Potential", Cell Transplant. 4(6):579-586). São divulgados métodos de criopreservação na Patente U.S. N° 5795711, 6136525, 5895745; Publicações de Patente Internacional W004/009766, W092/12722, WO/0153462, Patente Europeia N° EP0834252B e Publicação de Pedidos de Patente dos Estados Unidos N° US20020039786A1, US20030134418A1. A baixa recuperação de células quando criopreservadas continua a limitar a utilização de hepatócitos em modelos de fígado in vitro.
Um segundo problema importante que afecta a utilização de hepatócitos frescos e criopreservados é a variação da expressão de enzimas do fígado que é observada no tecido de diferentes dadores (Li, A.P. et ai. (1999) "Present Status Of The Application Of Cryopreserved Hepatocytes In The Evaluation Of Xenobiotics: Consensus Of An International Expert Panei", Chem Biol Interact. 121(1):117-123,- Li, A.P. et al. (1999) "Cryopreserved Human Hepatocytes: Characterization Of Drug-Metabolizing Enzyme Activities and Applications In Higher Throughput Screening Assays For Hepatotoxicity, Metabolic Stability, and Drug-Drug Interaction Potential", Chem Biol Interact. 121 (1) :17-35; 0'Brien, Z.Z. et al. (sem data) "The Construction Of A Representative Human Cryopreserved Hepatocyte Pool For Metabolism Study", www.lionscience.com/repository/ISSX-2002.pdf). Uma solução para esta variação de amostra envolve a mistura de amostras de diferentes fontes para produzir uma preparação "compósito" de hepatócitos possuindo as características da "média" das células hepáticas. Contudo, a 6 frequência da recepção de tecido fresco e a necessidade de criopreservar hepatócitos imediatamente após o isolamento que foram citados como prevenindo a preparação de misturas de hepatócitos. Deste modo, várias companhias (e. g., Xenotech, LLC; BD Biosciences) retraem-se da venda de hepatócitos misturados forçando deste modo o utilizador final a descongelar e misturar hepatócitos de vários dadores diferentes. Esta dificuldade permanece embora os hepatócitos humanos misturados criopreservados sejam um modelo válido para estudos metabólicos (Zhang, J.G. et al. (sem data) "Validation Of Pooled
Cryopreserved Human Hepatcytes As A Model For Metabolic Studies (http://www.bdbiosciences.com/discovery_ labware/gentest/products/pdf/S04T126.pdf).
Ostrowska, A. et al., (2000) "Investigation of Functional and Morphological Integrity of Freshly Isolated and
Cryopreserved Human Hepatocytes," Cell and Tissue Banking 1:55-68, divulgam preparações hepatócitos que sofreram criopreservação uma vez. Tendo, desse modo, uma viabilidade média inferior a 70%.
Deste modo, apesar de todos os avanços anteriores, permanece a necessidade de processos que podem possibilitar a disponibilidade de hepatócitos para investigação médica e outros objectivos. Existe uma outra necessidade para uma fonte estável e reprodutível de hepatócitos humanos. A presente invenção permite a produção e disponibilidade de preparações de hepatócitos que podem ser repetidamente criopreservados e descongeladas sem perda inaceitável de viabilidade. A invenção permite deste modo que múltiplas amostras de hepatócito sejam misturadas para produzir preparações de hepatócitos misturados, especialmente preparações de hepatócitos misturados 7 criopreservados. Utilizando este avanço, os hepatócitos humanos misturados criopreservados estão agora comercialmente disponíveis em In Vitro Technologies (Baltimore, MD).
Sumário da Invenção: A invenção refere-se a métodos de processamento de preparações de hepatócitos , de modo a permitir a sua criopreservação repetida e descongelação embora retendo uma substancial viabilidade. É também divulgada uma preparação de hepatócitos multi-criopreservada compreendendo hepatócitos que foram congelados e descongelados, pelo menos, duas vezes, em que mais do que 50% e, de um modo mais preferido, 70% ou mais dos hepatócitos da preparação são viáveis. É descrita esta preparação de hepatócitos multi-criopreservados em que os hepatócitos são selecionados do grupo consistindo em hepatócitos humanos, hepatócitos porcinos, hepatócitos símios, hepatócitos caninos, hepatócitos felinos, hepatócitos bovinos, hepatócitos equinos, hepatócitos ovinos e hepatócitos de roedores. É descrita esta preparação de hepatócitos multi-criopreservados em que a preparação compreende uma preparação de hepatócitos misturados de múltiplas fontes, que podem ser do mesmo género ou diferente, raça ou estado de saúde, ou que proporcionam a preparação misturada com um nível desejado de uma actividade metabólica (especialmente quando a actividade metabólica é selecionada do grupo consistindo em coumarina (COUM), dextrometorfano (DEX), etoxi-coumarina (ECOD), 7-hidroxicoumarinoglucuronídeo (7-HCG), sulfato de hidroxicoumarina (7-HCS), mefenetoína (ΜΕΡΗ), testosterona (TEST), fenacetina (PHEN) e clorozoxazona (CZX). A invenção refere-se a um método de produção de uma preparação desejada de hepatócitos multi-criopreservados, sendo os hepatócitos capazes de serem congelados e descongelados, pelo menos, duas vezes e em que mais do que 70% dos hepatócitos da preparação são viáveis, compreendendo o método: (A) proporcionar hepatócitos de múltiplas fontes que foram criopreservados e descongelados (B) misturar estes hepatócitos e submetê-los a fracionamento por gradiente de densidade (especialmente centrifugação em gradiente de percoll) para separar hepatócitos viáveis de hepatócitos não viáveis, (C) recuperar os hepatócitos viáveis separados, e (D) criopreservar os hepatócitos viáveis recuperados para assim formar a preparação de hepatócitos desejados. A invenção refere-se ainda à forma de realização de um destes métodos em que os hepatócitos são selecionados do grupo consistindo em hepatócitos humanos, hepatócitos porcinos, hepatócitos simios, hepatócitos caninos, hepatócitos felinos, hepatócitos bovinos, hepatócitos equinos, hepatócitos ovinos e hepatócitos de roedores. A invenção refere-se à forma de realização de um destes métodos em que a preparação compreende uma preparação de hepatócitos misturados de múltiplas fontes, que podem ser do 9 mesmo sexo ou diferente, raça ou estado de saúde, ou que proporcionam a preparação misturada com um nível desejado de uma actividade metabólica (especialmente quando a actividade metabólica é selecionada do grupo consistindo em COUM, DEX, ECOD, 7-HCG, 7-HCS, ΜΕΡΗ, TEST, PHEN e CZX). É também divulgado um método de investigar in vitro o metabolismo do fármaco compreendendo a incubação de hepatócitos de uma preparação de hepatócitos multi-criopreservados na presença de um xenobiótico e determinação do destino metabólico do xenobiótico, ou o efeito do xenobiótico nos hepatócitos ou numa sua actividade de enzima ou metabólica, em que os hepatócitos foram congelados e descongelados, pelo menos, duas vezes e em que mais de 50% e, de um modo mais preferido, 70% ou mais dos hepatócitos da preparação são viáveis.
Descrição das Formas de Realização Preferidas: São divulgadas novas composições de células e métodos para a sua preparação e utilização. Em particular, são divulgados métodos de processamento de preparações de células de modo a permitir a sua criopreservação e descongelação repetida embora retendo uma substancial viabilidade. Os métodos são geralmente aplicáveis a uma vasta variedade de tipos de células, incluindo hepatócitos, células do rim, células do baço, células do timo, células da medula óssea, células estaminais, células musculares (incluindo células do músculo cardíaco), células endócrinas (incluindo células pancreáticas, células adrenais, células da tiróide, etc.) células epidérmicas, células endodérmicas, etc. Os métodos da presente invenção são ilustrados a seguir no que respeita a um tipo de célula preferido: hepatócitos. 10 São divulgadas preparações de células, e. g., hepatócitos, que foram repetidamente criopreservados e descongelados para obter uma preparação com elevada viabilidade útil para uma variedade de propósitos experimentais, de diagnóstico e terapêuticos. A presente invenção estende a capacidade dos hepatócitos serem criopreservados e descongelados para utilização posterior, de modo a permitir que as preparações de hepatócitos sejam repetidamente criopreservadas e descongeladas sem uma perda de viabilidade inaceitável.
Como aqui utilizado, a expressão "preparação de células" denota uma composição líquida ou congelada de células de uma ou mais fontes (e. g., "preparação de hepatócito" denota uma composição de células de fígado de uma ou mais fontes) . As fontes pode ser células primárias que foram dissociadas ou isoladas do tecido por resseção, biópsia ou de órgãos dadores, ou estes podem ser secundariamente, células em cultura imortalizadas ou transformadas. As células podem ser derivadas a partir de qualquer fonte de mamífero, incluindo fontes humanas, porcinas, símias, caninas, felinas, bovinas, equinas, ovinas ou roedores. A utilização de células humanas, porcinas ou de roedores (especialmente rato) é preferida. De um modo preferido, mais do que 50% e, de um modo mais preferido, 70% ou mais dos hepatócitos destas preparações será viável.
Como aqui utilizado, a expressão "preparação de células criopreservadas" denota uma preparação de células que foi congelada e depois descongelada, pelo menos, duas vezes (e. g., uma "preparação de hepatócitos multi-criopreservados" denota uma preparação de hepatócitos que foi congelada e, depois, descongelada, pelo menos, duas vezes). Estas preparações podem ser congeladas e descongeladas três, quatro, cinco ou mais 11 vezes . A expressão "preparação misturada" denota uma preparação de células (e. g. , hepatócito) em que as células (e. g., hepatócitos) são derivadas de duas, três, quatro, cinco ou mais fontes diferentes, tais como diferentes dadores, biópsias, resseções de tecidos de diferentes amostras de tecido ou diferentes fontes de tecido, ou diferentes culturas celulares primárias, secundárias, imortalizadas ou transformadas (e. g., hepatócito). As células destas preparações misturadas podem ser células aleatoriamente selecionadas ou podem ser selecionadas para proporcionar a preparação misturada com um nível desejado de uma ou mais actividades metabólicas (tal como por exemplo, uma preparação de hepatócitos possuindo um nível desejado de actividade COUM, DEX, ECOD, 7-HCG, 7-HCS, ΜΕΡΗ, TEST, PHEN e/ou CZX), ou uma célula desejada característica (tal como, por exemplo, uma preparação de hepatócitos derivada de fontes do mesmo sexo, idade, raça (e. g., Caucasiana, etc.) ou estado de saúde (e. g., hepatócitos de fígado infectado com o vírus da hepatite, hepatócitos de fígado infectado com HIV-I, hepatócitos de fígado saudável, hepatócitos de fumadores de cigarros, hepatócitos de indivíduos que sofrem de cirrose do fígado ou a partir de outras doenças ou estados). Por exemplo, para obter uma preparação de hepatócitos misturados com actividade mínima de DEX, uma preparação misturada pode ser preparada dos números de Lote N° 067, CEK, ETR, PFM, VTA ou WWM (ver, Tabela III).
Numa forma de realização preferida, ilustrada relativamente a células de hepatócitos, a prática compreende alguns dos passos que se seguem: o isolamento de hepatócitos, uma primeira criopreservação dos hepatócitos primários isolados para obter uma primeira preparação de hepatócitos criopreservados, a 12 descongelação da primeira preparação de hepatócitos criopreservados para obter hepatócitos viáveis misturando os hepatócitos descongelados, fracionamento por gradiente de densidade para separar os hepatócitos viáveis dos hepatócitos não viáveis e a reformulação dos hepatócitos descongelados viáveis para permitir o seu posterior armazenamento e utilização através de criopreservação repetida e descongelação para obter hepatócitos viáveis.
Isolamento De Hepatócitos
Qualquer dos vários métodos pode ser empregue ou adaptado para permitir o isolamento dos hepatócitos primários utilizados na presente invenção. Por exemplo, as técnicas adequadas para o isolamento de hepatócitos são apresentados em Morsiani et al., (1995) "Automated Liver Cell Processing Facilitates Large Scale Isolation And Purification Of Porcine Hepatocytes", ASAIO Journal 41:155-161 e em Seglen, P.O. (1976) "Preparation Of Isolated Rat Liver Cells", Meth. Cell Biol. 13:29-83). A referência especifica é feita ao procedimento da digestão com colagenase em dois passos descritos em Li, A.P. et al. (1992) "Isolation And Culturing Of Hepatocytes From Human Liver", J. Tissue Cult. Meth. 14:139-146.
Os hepatócitos podem ser cultivados em qualquer meio de cultura de hepatócitos adequado. A titulo de ilustração e não por limitação podem ser feita menção aos seguintes meios de cultura de Meios Essenciais de Chee (Hamilton, G.A. et al. (2001) "Effects Of Médium Composition On The Morphology And Function Of Rat Hepatocytes Cultured As Spheroids And
Monolayers", In Vltro Cell Dev Biol Anim. 37 (10) :656-667; Zurlo, 13 J. et al. (1996) "Characterization Of A Primary Hepatocyte Culture System For Toxicological Studies", In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32 (4) :211-220; Arterburn, L.M. et al. (1995) "A Morphological Study Of Differentiated Hepatocytes In Vitro", Hepatology 22 (1) : 175-187), Meio Modificado de Eagle (ou Meio de Eagle Modificado de Dulbecco) (Arikura, J. et al. (2002) "UW Solution: A Promising Tool For Cryopreservation Of Primarily Isolated Rat Hepatocytes", J Hepatobiliary Pancreat Surg. 9 (6):742-749,- Washizu, J. et al. (2000) "Amino Acid Supplementation Improves Cell-Specific Functions Of The Rat Hepatocytes Exposed To Human Plasma", Tissue Eng. 6 (5):497-504,-Iwata, H. et al. (1999) "In Vitro Evaluation Of Metabolic Functions Of A Bioartif icial Liver", ASAIO J. 45 (4):299-306,-Stutenkemper, R. et al. (1992) "The Hepatocyte-Specific Phenotype Of Murine Of Liver Cells Correlates With High Expression Of Connexin32 And Connexin26 But Very Low Expression Of Connexin43", Exp Cell Res. 201 (1):43-54), meio de Leibowitz (Coundouris, J.A. et al. (1993) "Cryopreservation Of Human Adult Hepatocytes For Use In Drug Metabolism And Toxicity Studies", Xenobiotica. 23(12):1399-1409), Waymouth (Vind, C. et al. (1992) "Regulation By Growth Hormone And Glucocorticoid Of Testosterone Metabolism In Long-Term Cultures Of Hepatocytes From Male And Female Rats", Biochem Pharmacol. 44(8):1523-1528,-Nemoto, N. et al. (1991) "Proline Is Required For Transcriptional Control Of The Aromatic Hydrocarbon-Inducible P (1)450 Gene In C57BL/6 Mouse Monolayer-Cultured Hepatocytes", Jpn J Câncer Res. 82 (8): 901-908; Dich, J. et al. (1988) "Long-Term Culture Of Hepatocytes: Effect Of Hormones On Enzyme Activities e Metabolic Capacity", Hepatology. 8(1):39-45,-Goethals, F. et al. (1984) "Criticai Biochemical Functions Of Isolated Hepatocytes As Sensitive Indicators Of Chemical Toxicity", Fundam Appl Toxicol. 4(3 Pt 1):441-450), meio de Kreb 14 (House, J.D. (2001) "Threonine Metabolism In Isolated Rat Hepatocytes", Am J Physiol Endocrinol Metab. 281(6):E1300-1307; Irvine, F. et ai. (1993) "Extracellular Calcium Modulates Insulin's Action On Enzymes Controlling Cyclic AMP Metabolism In Intact Hepatocytes", Biochem J. 293 ( Pt l):249-253; Marsh, D.C. et al. (1991) "Hypothermic Preservation Of Hepatocytes. III Effects Of Resuspension Media On Viability After Up To 7 Days Of Storage", Hepatology 13(3):500-508), etc.
Numa forma de realização preferida, os hepatócitos são criopreservados num meio contendo aproximadamente 10% de DMSO e aproximadamente 90% de soro fetal de bovino (Loretz, LJ. et al. (1989) "Optimization Of Cryopreservation Procedures For Rat And Human Hepatocytes", Xenobiotica 19:489-498; Ruegg, CE. et al (1997) "Cytochrome-P450 Induction And Conjugated Metabolism In Primary Human Hepatocytes After Cryopreservation", In Vitro Toxicol. 10:217-222). A viabilidade dos hepatócitos isolados pode ser determinada utilizando qualquer um de vários métodos. De um modo preferido, esta viabilidade será determinada utilizando o método de exclusão de azul Tripano (ver, e. g., Berry, M.N. et al. (1992) "Techniques For Pharmacological And Toxicological Studies With Isolated Hepatocyte Suspensions", Life Sei. 51(1):1-16). Deste modo, as frases "hepatócitos viáveis" ou "percentagem de viabilidade", como aqui utilizado, refere-se à viabilidade de hepatócitos avaliada utilizando o método de exclusão com Azul Tripano. 15
Criopreservação Dos Hepatócitos Primários Isolados
Os hepatócitos da presente invenção são, de um modo preferido, criopreservados utilizando azoto liquido e, de um modo muito preferido, em 36 horas após o seu isolamento. Considerações sobre a criopreservação de hepatócitos humanos são discutidas em Lloyd, T.D.R. et al. (2003) Cryopreservation Of Hepatocytes: A Review Of Current Methods For Banking", Cell And Tissue Culture Banking 4:3-15. Os procedimentos adequados para a criopreservação de hepatócitos podem também ser encontrados nos seguintes documentos: Adams, R.M. et al. (1995) "Effective Cryopreservation And Long-Term Storage Of Primary Human Hepatocytes With Recovery Of Viability, Differentiation, And Replicative Potential", Cell Transplant. 4 (6 ) : 5 79-586; Chesne, C. et al. (1993) "Viability And Function In Primary Culture Of Adult Hepatocytes From Various Animal Species And Human Beings After Cryopreservation", Hepatology 18(2):406-414; Coundouris, J.A. et al. (1993) "Cryopreservation Of Human Adult Hepatocytes For Use In Drug Metabolism And Toxicity Studies", Xenobiotica. 23(12):1399-1409; Hewitt, N.J. et al. (2004) Cryopreserved Rat, Dog And Monkey Hepatocytes: Measurement Of Drug Metabolizing Enzymes In Suspensions And Cultures", Hum Exp Toxicol. 23(6):307-316; Novicki, D.L. et al. (1982) "Cryopreservation Of Isolated Rat Hepatocytes", In Vitro. 18 ( 4) : 393-399; Shaddock, J,G. et al. (1993) "Cryopreservation And Long-Term Storage Of Primary Rat Hepatocytes: Effects On Substrate-Specific Cytochrome P 450-Dependent Activities And Unscheduled DNA Synthesis", Cell Biol Toxicol. 9 (4) :345-357; Zaleski, J. et al. (1993) "Preservation Of The Rate And Profile Of Xenobiotic Metabolism In Rat Hepatocytes Stored In Liquid Nitrogen", Biochem Pharmacol. 46(1): 111-116. 16
De um modo preferido, hepatócitos isolados são suspensos num meio crioprotector e as células suspensas são dispensadas em recipientes de congelação com segurança. Um meio crioprotector compreende tipicamente um meio de cultura de hepatócitos que contém, pelo menos, um crioprotector que minimiza os feitos prejudiciais da criopreservação, tal como a formação de gelo intracelular durante a congelação. A titulo de ilustração e não limitação, os crioprotectores normalmente utilizados que se seguem são listados: dimetilsulfóxido (DMSO), polietilenoglocol, aminoácidos, propanodiol e glicerol. Um crioprotector preferido da presente invenção é DMSO. Os crioprotectores adequados e métodos para a sua utilização na criopreservação de hepatócitos podem ser encontrados, por exemplo, em: Loretz, L.J. et al. (1989) "Optimization Of Cryopreservation Procedures For Rat And Human Hepatocytes", Xenobiotica. 19(5):489-498; Chesne, C. et al. (1993) "Viability And Function In Primary Culture Of Adult Hepatocytes From Various Animal Species And Human Beings After Cryopreservation", Hepatology 18(2):406-414; Diener, B. et al. (1993) "A Method For The Cryopreservation Of Liver Parenchymal Cells For Studies Of Xenobiotics", Cryobiology 30(2): 116-127; Lawrence, J.N. et al. (1991) "Development Of An Optimal Method For The Cryopreservation Of Hepatocytes And Their Subsequent Monolayer Culture. Toxicology In Vltro", 5(1):39-51,-Houle, R. et al. (2003) "Retention of Transporter Activities in Criopreserved, Isolated Rat Hepatocytes", Drug Metab. Disposit. 31 (4):447-451,- Silva, J.M. et al. (1999) "Induction Of Cytochrome-P450 In Criopreserved Rat And Human Hepatocytes", Chem-Blol Interact 121:49-63.
Os hepatócitos isolados são, de um modo preferido, suspensos num meio crioprotector na preparação para congelação. As células suspensas são, de um modo preferido, distribuídas em recipientes 17 resistentes a congelação numa densidade de células de cerca de 106 células/mL a cerca de 4 x 107 células/mL. Os volumes de congelação preferidos variam desde 0,1-10,0 mL. O volume de congelação preferido é de 1,0 mL.
Os hepatócitos distribuídos são então, de um modo preferido, criopreservados utilizando um processo de congelação a velocidade controlada, de um modo muito preferido , a uma velocidade de congelação entre cerca de -1 °C/min a cerca de -25 °C/min até ser atingida uma temperatura final de cerca de -90 °C. Durante a fase inicial do processo de criopreservação, pode ser empregue a semeadura para induzir a cristalização controlada ou formação de gelo em suspensões de células que foram previamente arrefecidas abaixo do ponto de congelação do meio de cultura. Esta semeadura serve para minimizar os danos relacionados com a formação de gelo e podem, deste modo, ser benéficas para a viabilidade celular. Os métodos de semeadura adequados incluem a inserção de uma barra metálica nos recipientes de congelação, e introdução de uma porção de azoto liquido nos recipientes de congelação.
Uma vez atingida a temperatura final desejada, as amostras de células congeladas podem ser transferidas para congeladores de azoto liquido para armazenamento prolongado. As amostras congeladas podem ser armazenadas na fase de azoto liquido ou na fase gasosa do azoto liquido. De um modo preferido, o armazenamento é conseguido na fase gasosa do azoto líquido. As amostras congeladas podem ser armazenadas deste modo durante dias, meses ou anos, com o comprimento do armazenamento na fase gasosa do azoto líquido possuindo pouco efeito na viabilidade e função pós descongelação. 18 A Descongelação De Hepatócitos Criopreservados
As amostras congeladas podem ser descongeladas para processamento posterior removendo-as da presença de azoto líquido ou vapor de azoto líquido. As amostras congeladas são, de um modo preferido, descongeladas colocando as amostras imediatamente num banho de água pré-aquecida possuindo uma temperatura entre cerca de 37 °C a cerca de 42 °C. De um modo preferido, as células são descongeladas até, pelo menos, o estádio em que os pedaços de gelo podem ser deslocados quando o recipiente da amostra é invertido. As células descongeladas são então, de um modo preferido, rapidamente processadas para remover as células do contacto com DMSO, por exemplo por centrifugação em gradiente de percoll (como descrito a seguir) ou lavagens sequenciais.
Numa forma de realização preferida, as células são descongeladas em Meio Completo InVitroGRO CP {In Vitro Technologies, Baltimore, MD; Roymans, D. et ai. (2004) "Determination Of Cytochrome P450 1A2 And Cytochrome P4503a4 Induction In Criopreserved Human Hepatocytes", Biochem Pharmacol. 67(3):427-437). 0 meio é preparado por descongelação de Torpedo Antibiotic Mix {In Vitro Technologies, Baltimore, MD) a 3 7 °C num banho de água até descongelar e é, depois, removido do banho de água. É então misturado 1,0 mL de Torpedo Antibiotic Mix com 45 mL de meio InVitroGRO CP. Após a adição de Torpedo Antibiotic Mix, o prazo de validade para o meio completo é de 7 dias. Quando se descongela um único frasco, o Meio InVitroGRO CP é pré-aquecido a, aproximadamente, 37 °C. são adicionados 5 mL de Meio InVitroGRO CP a um tubo cónico estéril de 50 mL. O frasco de hepatócitos congelados é cuidadosamente removido do congelador. Se o frasco foi armazenado na fase líquida, a sua 19 tampa é cuidadosamente removida, qualquer azoto liquido presente no frasco é decantado e a tampa é de novo fechada antes de recolocar o frasco no banho de água. É preferido, então, imergir o frasco imediatamente num banho de água a 37 °C e agitar o frasco suavemente até o gelo estar completamente fundido, mas não mais do que o tempo que leva a descongelar completamente o frasco. Pode ser útil remover quaisquer marcações do frasco de modo a ser mais fácil visualizar o conteúdo do frasco. Os conteúdos descongelados são então despejados em Meio InVitroGRO CP pré-aquecido. É então adicionado 1,0 mL de Meio InVitroGRO CP pré-aquecido a cada frasco para ressuspender quaisquer células remanescentes. Os conteúdos dos frascos são então decantados ou pipetados na suspensão de hepatócitos. Os hepatócitos são, de um modo preferido, ressuspensos por inversão suave do recipiente receptor (e. g., frasco, tubo de teste, etc.) várias (e. g., três) vezes.
Quando se descongelam múltiplos frascos, é preferido que todos os frascos sejam descongelados no banho de água simultaneamente. Como anteriormente, o meio (de um modo preferido, Meio InVitroGRO CP) deve ser aquecido a 37 °C. É desejável assegurar que existe meio suficiente para permitir 5 mL de Meio InVitroGRO CP pré-aquecido seja utilizado por cada frasco de hepatócitos criopreservados. Após os frascos terem sido descongelados, as suas tampas devem ser rapidamente removidas e os seus conteúdos vertidos num tubo estéril ou copo que contenha, pelo menos, 5 mL de Meio InVitroGRO CP pré-aquecido por frasco descongelado. Por exemplo, 25 mL de meio são, de um modo preferido, empregues em 5 frascos num recipiente que pode albergar um volume de 50 mL. 20
Se desejado, a contagem de células totais e o número de células viáveis pode ser determinado utilizando o método de exclusão com Azul Tripano. As células podem ser diluídas para 0,70 x 106 células viáveis/mL com Meio InVitroGRO CP. A Reformulação de Hepatócitos Descongelados Para Permitir Criopreservação e Descongelação Posterior
Um aspecto refere-se à capacidade de reformular as células descongeladas de modo a poderem ser recongeladas e redescongeladas em uma ou mais ocasiões subsequentes. Estas preparações de hepatócitos multi-criopreservados têm várias utilizações. Estas podem ser utilizadas em fígados bioartificiais, transplantes de células de fígado, dispositivos de apoio ao fígado, transplantes de hepatócitos e aplicações in vitro. Em particular, as preparações de hepatócitos multi-criopreservados podem ser utilizadas em estudos in vitro de metabolismo de fármacos (por exemplo, na identificação hepatócitos com características únicas (e. g., polimorfismos metabólicos, polimorfismos genéticos, etc.), em estudos sobre o destino metabólico do xenobiótico e estudos no efeito do xenobiótico por alteração do perfil de enzimas dos hepatócitos que metabolizam fármacos, em estudos de inibição para determinar a IC50 de xenobióticos nas enzimas e funções hepáticas (e. g. metabolismo do colesterol), em estudos de indução génica com xenobióticos, em estudos de indução de proteínas com xenobióticos, em avaliação de toxicidade de xenobióticos em hepatócitos, estudos de transporte com xenobióticos (e. g. estudos em sistemas de transporte de P-glicoproteína, transportadores de iões orgânicos, transportadores de catiões orgânicos, etc.), em estudos de eliminação metabólica com 21 xenobióticos e em ensaios de eficácia (e. g. processamento de lipoproteina, gluconeogénese, secreção de proteína etc.)· As preparações de hepatócitos multi-criopreservados podem também ser utilizadas para estudar ou propagar vírus de hepatite e outros vírus e agentes infecciosos. As células recuperadas podem ser reformuladas para utilização em estudos de ADN, ARNm ou proteómicos ou em estudos de polimorfismos metabólicos. As preparações de hepatócitos multi-criopreservados podem ser também utilizadas em estudos de eliminação metabólica e ensaios de eficácia (e. g., processamento de lipoproteina, gluconeogénese, secreção de proteína, etc.). As células podem ser reformuladas para utilização em sementeira em bioreactores para incubações de larga escala ou como modelos para regulação de genes via micro ARN ou para utilização em sistemas de combinação com outros tipos de células (e. g. células não parenquimatras de fígado ou células de outras fontes, e. g. células Caco-2) .
Esta reformulação compreende a separação de células viáveis e não viáveis antes de uma subsequente recongelação. A centrifugação por gradiente de densidade é, de um modo preferido, empregue com este objectivo. Por exemplo, pode ser empregue um procedimento de centrifugação em gradiente com 30% de percoll (Madan, A. et al. (1999) "Effect of Cryopreservation on Cytochrome P-450 Enzyme Induction in Cultured Rat Hepatocytes", Drug Metab. Dispôs. 27 (3) :327-335; Sun, E.L. et al. (1990) "Cryopreservation Of Cynomologus Monkey (Macaca fascicularis) Hepatocytes For Subsequent Culture And Protein Synthesis Studies", In vitro Cell Development And Biology 25:147-150; Lawrence, J.N. et al. (1991) "Development Of An
Optimal Method For The Cryopreservation Of Hepatocytes And Their Subsequent Monolayer Culture. Toxicology In Vitro", 5(1):39-51; 22
Dou, M. et al. (1992) "Thawed Human Hepatocytes In Primary Culture", Cryobiology 29 (4) :454-69; Utesch, D. et al. (1992) "Characterization Of Cryopreserved Rat Liver Parenchymal Cells By Metabolism Of Diagnostic Substrates And Activities Of Related Enzymes", Biochemical Pharmacology 44:309-315. Por exemplo, as células descongeladas podem ser ressuspensas num tampão de fracionamento isotónico de percoll a 30% pré-aquecido (aproximadamente 37 °C) e, depois, centrifugado a 100 x g à temperatura ambiente durante vinte minutos para precipitar células viáveis. O sobrenadante é rejeitado e as células são ressuspensas em meio para um passo subsequente de criopreservação directamente ou para posterior processamento antes da criopreservação.
As preparações criopreservadas que resultam da congelação de uma preparação previamente congelada-descongelada terão, de um modo preferido, uma viabilidade celular pós congelação maior do que 70%. Estas elevadas viabilidades permitem à presente invenção conseguir a repetida congelação e descongelação de hepatócitos sem perdas inaceitáveis de células ou a necessidade para ainda maiores fontes de amostras.
Preparações de hepatócitos misturados A capacidade da presente invenção para permitir a repetida congelação e descongelação de hepatócitos facilita adicionalmente a produção de preparações de hepatócitos misturados, especialmente preparações de hepatócitos humanos misturados. Como discutido acima, as amostras individuais de fígado produzem hepatócitos possuindo diferentes capacidades metabólicas. De modo a facilitar a utilização ou estudo de 23 hepatócitos reprodutíveis, é desejável minimizar as diferenças entre os hepatócitos atribuíveis a esta variação da amostra pela mistura de hepatócitos de diferentes fontes para obter uma preparação de hepatócitos compósita ou "média". Estas preparações de hepatócitos compósitas podem, deste modo ser formuladas, de modo a proporcionar uma preparação possuindo as actividades metabólicas de uma amostra de hepatócitos "média" ou uma preparação cujas funções de enzimas dos hepatócitos aproximam as funções de enzimas dos hepatócitos das dos hepatócitos isolados de fresco. Estas actividades metabólicas podem incluir, por exemplo, algumas ou todas as actividades enzimáticas que se seguem: coumarina 7-hidroxilase (COUM), dextrometorfan O-desmetilase (DEX), 7-etoxicoumarina O-desetilase (ECOD), actividades responsáveis pelo metabolismo fase II de 7-hidroxicoumarina (7-HCG), actividades responsáveis pelo metabolismo de fase II de 7-hidroxicoumarina (7-HCS), mefenitoína 4-hidroxilase (ΜΕΡΗ), testosterona 6(β)-hidroxilase (TEST), tolbutamida 4-hidroxilase (TOLB), fenacetina O-deetilase (PHEN) ou clorozoxazona 6-hidroxilase (CZX). Os substratos, métodos de medições e unidades de ensaio para ensaios destas actividades metabólicas são proporcionados na Tabela I.
Tabela I Actividades Metabólicas de Hepatócitos Abreviatura Substrato/Ensaio Método de Medição Unidades 7-HCG 7-hidroxicoumarin- glucuronideo Metabolismo de Fase II de 7-hidroxicoumarina pmol/min/106 células 7-HCS Sulfato de 7-hidroxicoumarina Metabolismo de Fase II de 7-hidroxicoumarina pmol/min/106 células NAT1 ácido p-aminobenzóico N-acetilação de ácido p-aminobenzóico nmol/mg/min NAT2 Sulfametazina N-acetilação de sulfametazina nmol/mg/min VBTY viabilidade Exclusão com Azul Tripano™ percentagem AP Fosfatase Alcalina Kit Sigma unidades/mg de proteína GGT Gama-glutamil transpeptidase Coloração GGT positiva UGT1 7-hidroxicoumarina Metabolismo de fase II de 7-hidroxicoumarina 169 pmol/mg/min P450 Conteúdo em citocromo P450 Espectro da diferença de monóxido de carbono Não determinado para criohepatócitos nmol/mg de proteína CZX clorzoxazona 6-hidroxilação de clorzoxazona 31,1 pmol/mg/min* COUM coumarina 7-hidroxilação de coumarina 50,0 pmol/mg/min* DEX dextrometorfano O-desmetilação de dextrometorfano 21,4 pmol/mg/min* ΜΕΡΗ mefenitoina 4-hidroxilação de mefenitoina 24,1 pmol/mg/min* PHEN fenacetina O-desetilação de fenacetina 28,9 pmol/mg/min* TEST testosterona 6(beta)-hidroxilação de testosterona 96,8 pmol/mg/min* TOLB tolbutamida 4-hidroxilação de tolbutamida 30,6 pmol/mg/min* PROT conteúdo em proteína Kit de proteína Pierce Não determinado para crio-hepatócitos mg/mL ECOD etoxicoumarina O-desetilação de etoxicoumarina 37,3 pmol/mg/min*
Por exemplo, as preparações preferidas de hepatócitos misturados produzirão valores de ensaio nos intervalos identificados na Tabela II. Alternativamente, as amostras de hepatócitos utilizadas para formar a preparação misturada podem ser selecionados de modo a maximizar, minimizar ou enfatizar certas funções de hepatócito, além de outras funções de modo a produzir uma preparação misturada que exibe um perfil desejado de utilizador das funções das células hepáticas.
As preparações de hepatócitos misturados da presente 25 divulgação compreendem hepatócitos obtidos de diferentes fontes. De um modo preferido, as preparações de hepatócitos misturados resultarão dos hepatócitos misturados obtidos de três, quatro, cinco, seis ou mais diferentes fontes.
De um modo muito preferido, as preparações de hepatócitos misturados compreenderão pelo menos uma população de hepatócitos que foram criopreservados antes da mistura. For exemplo, a preparação de hepatócitos misturados pode compreender um ou mais espécimes de hepatócitos que foram criopreservados antes da mistura com um ou mais espécimes de hepatócitos isolados de fresco. Alternativamente, a preparação de hepatócitos misturados pode compreender apenas espécimes de hepatócitos que foram previamente criopreservados. A Tabela II proporciona o intervalo normal (i. e., o intervalo entre o Ensaio Mínimo e o Ensaio Máximo para cada Ensaio) . Os valores da Tabela II são dados derivados dos últimos 150+ lotes de hepatócitos humanos criopreservados.
Tabela II Ensaios de hepatócitos Ensaio Intervalo normal pmol/min/106 células 7-Hidroxilação de coumarina 1 a 154 O-desmetilação de dextrometorfano 0,5 a 96 O-desetilação de 7- etoxicoumarina 1 a 154 Metabolismo de Fase I de 7-hidroxicoumarina 2 a 545 Metabolismo de Fase II de 7-hidroxicoumarina 0 a 110 4-hidroxilação de mefenitoína 0,2 a 442 6(beta)-hidroxilação de testosterona 2 a 675 4-hidroxilação de tolbutamida 1,8 a 82 O-desetilação de fenacetina 1 a 125 6-hidroxilação de clorzoxazona 2 a 215 26
Em certas formas de realização da divulgação, as preparações de hepatócito terão valores de ensaio nos intervalos acima mencionados para, pelo menos, três de, e, de um modo preferido, para, pelo menos, quatro de, de um modo ainda mais preferido para, pelo menos, seis de, e, de um modo muito preferido, para, pelo menos, oito dos ensaios seguintes: o ensaio COUM; o ensaio DEX; o ensaio ECOD; o ensaio 7-HCG; o ensaio 7-HCS; o ensaio ΜΕΡΗ; o ensaio TEST; o ensaio TOLB; o ensaio PHEN; o ensaio CZX.
Se desejado, os hepatócitos criopreservados podem ser plaqueados em placas de cultura de tecidos revestidas com colagénio ou placas de cultura de tecidos revestidas com outras proteínas da matriz extracelular incluindo, mas não limitado a laminina, fibronectina, entactina, poli-L-lisina, gelatina ou qualquer sua combinação. De um modo preferido, isto é conseguido por diluição num volume apropriado (e. g., 0,2 mL a 2,5 mL) de células diluidas (e. g., células possuindo uma concentração de aproximadamente 0,7 x 106 células/mL) nas placas. Para plaquear numa placa de microtitulação de 96 poços, é desejável diluir, ainda, a suspensão celular para uma concentração de 0, 35 x 106 células/mL com Meio InVitroGRO CP e adicionar 100 pL da suspensão celular a cada poço. É ainda preferido distribuir as células pelos poços. Isto pode ser conseguido por agitação suave das placas de uma forma de frente para trás e lado para lado; a utilização de um movimento circular causará a mistura das células não homogénea no centro dos poços. Os hepatócitos humanos manipulados deste modo ligar-se-ão às placas em 2-4 horas, contudo, se for desejada uma manipulação mínima, as células podem ser deixadas a ligar durante a noite.
Tendo agora descrito de forma geral a invenção, a mesma será 27 mais prontamente compreendida através da referência aos exemplos que se seguem, que são proporcionados por via de ilustração e não pretendem ser limitantes da presente invenção a menos que especificado.
Exemplo 1
Recongelação de Preparações de Hepatócitos Descongeladas
Os hepatócitos criopreservados são descongelados e recongelados como indicado a seguir.
Materiais: seringa de 30 cc, dois acopladores, percoll numa saqueta 1 L, meio InvitroGro CP-2 num saco de 2 L, copo de 1-2 L autoclavado, aquecedor, banho de água, suporte de tubos de centrífuga.
Procedimento: 1) ligar um banho de água recirculante a 37-42 °C. 2) Adicionar aproximadamente 200-400 mL de meio InvitroGro CP-2 a um copo de 1-2 L. Equipar um Câmara de Segurança Biológica com uma pipeta manual ou um robot de manipulação de líquidos. 3) Remover aproximadamente 50 criofrascos do receptáculo dewar e colocá-los rapidamente em dois suportes de tubos de teste. Quando possível, separar os frascos. 4) Submergir as suspensões sólidas de células no banho de 28 água aquecido até os pedaços de gelo poderem ser deslocados quando o frasco é invertido. 5) Verter a suspensão celular de cada frasco no copo. Adicionar 1 mL de meio InvitroGro CP-2 do copo pequeno em cada frasco para lavar e verter o conteúdo no copo. Transferir a suspensão celular descongelada para uma saqueta de 1 L estéril. 6) Ligar a saqueta, meio InvitroGro CP-2 num saco de 2 L e percoll no saco a 30% no processador automático de células COBE e processar de acordo com as práticas convencionais. 7) Realizar uma contagem de células. 8) Criopreservar a suspensão de células. É empregue Percoll/RediGrad™ (Amersham Biosciences) para a centrifugação em densidade com percoll. Percoll é composto por sílica coloidal revestida com polivinilpirrolidona (PVP). A formulação RediGrad™ é também composta por sílica coloidal mas é covalentemente revestida com silano. Pensa-se que estes revestimentos tornam o material não tóxico e ideal para utilização com materiais biológicos (http://www.apczech.cz/pdf/DF_RediGrad.pdf; http://www5.amershambioSciences.com/aptrix/upp00919.nsf/(FileDow nload)?OpenAgent&docid=3139FC720067CA6CC1256F30008566F&file=7150 087AB.pdf). Ambas as partículas possuem uma densidade de 1,13 g/mL. A centrifugação de amostras na presença de Percoll/RediGrad resulta na formação espontânea de um gradiente de densidade devido à heterogeneidade de tamanhos de partículas 29 no meio. 0 Percoll/RediGrad são melhor utilizados em soluções salinas equilibradas, tal como solução salina fisiológica (0,15 M NaCl), embora 0,25 M de sacarose possam ser empregues. A adição de 9 partes (v/v) de Percoll/RediGrad a 1 parte (v/v) de 1,5 M de NaCl, meio de cultura de células concentrado lOx, ou 2,5 M de sacarose resultará numa solução ajustada a cerca de 340 mOs/kg de H20. As soluções de diferente pressão osmótica podem ser produzidas ajustando os volumes relativos de Percoll/RediGrad e solução de sal ou sacarose. (Vincent, R. et al. (1984) "Adjustment Of The Osmolality Of Percoll For The Isopycnic Separation Of Cells And Cell Organelles", Anal Biochem. 141(2):322-328). O ajustamento final para a osmolalidade necessária pode ser efectuado pela adição de sais ou água destilada. As concentrações, além da solução salina fisiológica lOx podem também ser utilizadas satisfatoriamente. O Percoll/RediGrad formará gradientes auto-produzidos por centrifugação em cabeças de rotor de ângulo fixo após 15 minutos. Os hepatócitos podem ser separados por centrifugação a 50-100 gav em cabeças de rotor de ângulo fixo ou basculante após 10-30 minutos.
Exemplo 2
Variação de Amostras de Hepatócitos Primários
Para ilustrar a variação amostra a amostra de diferentes fontes de hepatócitos individuais (não misturados), os hepatócitos são isolados a partir de 82 diferentes dadores e 30 analisados quanto a viabilidade celular e função enzimática. São avaliadas as seguintes actividades metabólicas: COUM, DEX, ECOD, 7-HCG, 7-HCS, ΜΕΡΗ, TEST, TOLB, PHEN e CZX. Os resultados são apresentados na Tabela III.
Variaçao das Tabela III Amostras de Hepatócitos LoteN° Sexo COUM DEX ECOD 7- HCG 7- HCS ΜΕΡΗ TEST TOLB PHEN CZX 067 M 62% 67 1 70 231 24 2 44 35 27 24 086 F 74% 51 23 10 50 9 1 38 13 BQL 18 089 F 77% 25 21 8 23 6 1 11 13 BQL 29 090 F 74% 30 25 7 13 BQL 2 19 15 BQL 16 091 F 73% 13 29 66 44 10 12 252 36 27 36 094 F 67% 41 12 37 24 4 21 126 40 19 87 099 F 86% 21 15 7 4 BQL 1 60 10 BQL 22 104 M 81% 63 21 44 247 25 2 58 37 8 20 105 M 67% 59 15 24 38 14 1 29 27 12 27 110 F 77% 45 24 35 23 4 6 206 11 54 36 111 F 71% 4 10 9 2 3 3 147 2 19 19 114 F 75% 39 23 21 10 5 5 59 TBD 3 45 122 M 79% 26 30 29 80 5 1 42 23 4 25 129 F 90% 4 24 27 67 18 1 16 33 10 51 ACU F 81% 53 8 25 74 18 8 80 16 4 23 AIT F 83% 45 29 13 118 14 BQL 82 15 11 7 AOK M 73% 60 21 58 283 64 5 86 30 24 21 ATR M 73% 7 11 1 39 11 BQL 11 8 3 4 AVF M 70% 59 13 50 210 29 BQL 54 37 11 24 BTP M 88% 66 29 36 214 25 3 50 45 11 12 CEC M 86% 47 26 17 105 27 21 32 57 38 36 CEK F 80% 55 2 39 141 5 16 302 41 7 16 CHD F 77% 30 14 53 471 42 4 28 23 13 26 CPN M 81% 28 6 40 100 13 2 168 14 37 21 ECM M 85% 8 11 10 55 18 6 81 18 21 9 EFA M 69% 9 9 35 47 5 18 66 12 47 67 EHI F 90% 88 3 56 291 45 1 248 21 45 43 EJR F 75% 89 14 32 288 43 8 62 41 1 41 31
Tabela III
Variação das Amostras de Hepatócitos
Lote Nc Sexo %v COUM DEX ECOD 7- HCG 7- HCS ΜΕΡΗ TEST TOLB PHEN CZX ENR M 73% 69 28 27 124 31 107 77 36 38 32 EOB M 88% 14 11 18 65 9 31 49 14 21 35 ETR F 88% 30 1 34 13 13 7 13 13 37 69 EVY M 80% 2 20 23 218 77 33 24 25 17 38 FNL M 85% 17 27 62 282 32 6 6 50 14 24 FRW M 75% 46 22 16 106 17 48 25 54 44 8 GBE F 77% 5 49 31 165 20 2 16 19 5 54 GNG F 74% 57 17 33 54 8 5 95 22 16 22 GTV F 71% 32 6 8 47 7 BQL 40 28 16 11 GUY M 92% 65 12 11 73 12 20 90 13 5 8 HHG M 83% 2 8 14 251 29 BQL 28 12 4 40 HRU M 90% 43 28 39 175 15 4 69 40 57 44 ICJ M 74% 134 20 60 287 17 BQL 129 82 28 7 LEM M 88% 34 17 23 129 34 72 48 23 19 34 IHR F 76% 17 43 8 84 9 9 95 46 41 7 LID M 86% 36 31 50 307 54 1 142 49 21 51 IRX F 73% 57 5 40 172 24 12 113 43 6 18 JUL M 82% 7 11 3 41 9 7 23 12 2 3 KK5 M 83% 1 8 27 319 38 BQL 61 17 17 42 KPT F 83% 9 12 32 248 30 55 65 26 56 32 KRJ F 76% 6 40 76 359 37 1 11 61 23 20 KRM F 78% 126 36 55 83 17 103 98 46 74 44 K5E M 73% 65 27 52 206 74 21 123 42 93 16 KZO F 82% 38 16 38 262 8 6 75 32 30 20 LAE M 76% 58 15 50 294 22 14 67 63 125 21 MOF F 91% 79 17 29 10 12 2 85 5 7 46 MRS M 72% 119 21 110 450 50 2 675 54 68 28 MTR F 69% 2 33 23 218 3 5 38 67 39 8 MYO F 94% 40 24 9 24 BQL BQL 12 7 BQL 11 NPX F 79% 36 32 13 130 6 15 76 25 20 10 NQT M 85% 76 12 39 80 23 2 151 14 20 34 OAU F 81% 47 26 24 86 8 6 85 46 53 13 OZL M 76% 16 15 61 300 109 3 165 29 17 43 PFM F 87% 21 1 11 67 10 3 116 8 15 33 PXK M 80% 86 35 63 433 78 2 109 62 32 60 QWG F 77% 16 32 29 300 21 9 50 10 BQL 15 REL F 77% 40 20 15 109 9 65 100 33 75 10 RFA F 78% 130 42 49 444 52 6 195 30 28 17 RKB F 95% 42 16 16 100 8 3 36 17 20 19 RML F 76% BQL 6 45 129 31 14 152 24 42 29 RNG F 91% 119 14 97 298 27 177 207 34 71 41 ROE F 82% 73 24 36 302 37 2 55 17 2 51 SEO F 72% 36 25 18 106 9 66 102 50 81 11 SQJ F 74% 115 12 100 285 19 175 210 30 81 42 SRA M 79% 50 6 71 409 84 10 23 28 18 44 TPZ F 83% 120 13 101 301 26 171 204 31 82 41 TSR F 62% 47 66 58 175 20 BQL 6 77 16 34 VCM M 82% 42 28 79 415 110 0,2 94 16 4 215 32
Variação de Tabela III Amostras de Hepatócitos Lote N° Sexo %v COUM DEX ECOD 7- HCG 7- HCS ΜΕΡΗ TEST TOLB PHEN CZX VEN F 70% 79 69 89 328 53 2 32 58 48 81 VTA M 78% 32 1 25 84 12 5 120 21 40 15 WM M 84% 42 1 27 127 12 6 58 21 16 37 ZAG M 85% 35 28 39 96 73 1 11 42 17 18 ZCR M 80% 84 11 39 160 22 38 14 57 20 18 ZU M 72% 6 33 31 320 29 13 25 34 3 13 BQL (Abaixo do Limite de Quantificação) TBD (A Ser Determinado)
Exemplo 3
Caracterização de Hepatócitos Misturados
Lotes de hepatócitos misturados criopreservados são preparados e analisados quanto a viabilidade pós descongelação e função enzimática. As actividades metabólicas que se seguem são avaliadas: COUM, DEX, ECOD, 7-HCG, 7-HCS, ΜΕΡΗ, TEST, TOLB, PHEN e CZX.
Seis lotes de hepatócitos misturados, compreendendo misturas de cinco dadores ou misturas de dez dadores, são preparados como descrito acima. Os hepatócitos são recolhidos de dadores individuais e, depois, criopreservados como lotes individuais utilizando azoto líquido como agente de congelação. A criopreservação é conseguida por suspensão dos hepatócitos em frascos de congelação com segurança contendo um meio possuindo aproximadamente 10% de DMSO e aproximadamente 90% de Meio de Criopreservação. Os hepatócitos distribuídos são então congelados num congelador de velocidade controlada até uma temperatura final de aproximadamente -80 °C ser atingida. 33
Para formar as preparações de hepatócitos misturados, os lotes individuais são descongelados e as células viáveis são isoladas por centrifugação em gradiente de percoll. Os frascos dos hepatócitos criopreservados de dador individual foram descongelados num banho de água a 37 °C durante 60-90 segundos. As células descongeladas são decantadas num meio a 37 °C contendo 30% de Percoll Isotónico e 70% de meio CP-2. A suspensão celular é centrifugada a 100 g durante 20 minutos. As células viáveis são recuperadas em meio de criopreservação e contadas. As células viáveis são diluídas para 20 milhões de células por mL. É preparada uma segunda solução contendo 20% de DMSO e 80% de meio de criopreservação (igual volume da suspensão celular listados acima) . Os 20% de DMSO e 80% de meio de criopreservação são lentamente adicionados à mistura de suspensão celular. A adição leva 5-10 minutos. A mistura resultante é 10% de DMSO, 90% de meio de criopreservação com as células a 10 milhões de células por mL. Esta solução é fraccionada em criofrascos a 1,0 mL por frasco. As células são então criopreservadas. As células viáveis dos lotes individuais são então misturados para formar preparações de hepatócitos misturados cujas células possuem valores de ensaio funcional nos intervalos desejados.
Os lotes misturados são depois criopreservados. A Tabela IV a seguir apresenta os resultados da viabilidade pós-congelação ("%V") e análise da função enzimática dos lotes misturados. Como indicado na Tabela III, as misturas têm uma viabilidade média de 79% (D.P. ± 6%). 34
Tabela IV
Sumário dos Dados de Lotes de Hepatócitos Misturados
Mistura %V COUM DEX ECOD 7-HCG 7-HCS ΜΕΡΗ TEST TOLB PHEN CZX MJI1 89 63 28 66 301 44 12 70 61 50 62 YDJ® 72 66 30 80 470 41 1 165 31 27 71 APOb 79 79 21 55 276 43 2 112 22 26 30 HMBb 76 61 18 70 231 46 3 151 23 20 83 IJUb 75 32 19 35 232 44 2 124 32 11 42 RKSb 81 84 20 73 336 53 2 131 28 23 55 alotes de 5 dadores blotes de 10 dadores
Para comparação, a Tabela V a seguir apresenta o sumário dos dados para uma viabilidade pós-congelação e análise da função enzimática de oitenta e um lotes individuais que são criopreservados (i. e., submetidos a um ciclo de criopreservação). Estes dados confirmam que a variabilidade da função das enzimas lote a lote encontrada em fontes individuais de hepatócitos é muito elevada. Os dados confirmam o desejo de empregar preparações de hepatócitos misturados para proporcionar células criopreservadas que aproximam a função enzimática de hepatócitos "média" para uma vasta variedade de enzimas.
Tabela V
Sumário dos Dados de Lotes de Hepatócitos Misturados %v COUM DEX ECOD 7-HCG 7-HCS ΜΕΡΗ TEST TOLB PHEN CZX Média 79 37 17 51 276 27 8 35 35 15 19 Alta 95 134 69 110 471 110 177 675 82 125 215 Baixa 62 6 1 31 231 24 2 25 34 3 13 35
Exemplo 3
Caracterização da Viabilidade de Hepatócitos Misturados Após Descongelação
Uma utilização normal dos hepatócitos criopreservados é a descongelação dos hepatócitos e depois a sua incubação com vários xenobióticos. Para este propósito, é preferido que os hepatócitos mantenham a sua viabilidade para, pelo menos, várias horas. Para examinar a viabilidade pós congelação ao longo do tempo para um lote hepatócitos misturados criopreservados, as células foram descongeladas, fraccionadas pelos poços de uma placa de 12 poços, e incubadas a 37 °C com 5% de CO2. A viabilidade dos hepatócitos é então medida em pontos de tempo até seis horas. A Tabela VI mostra os resultados desta análise, em que, às seis horas, 39% dos hepatócitos permaneceram viáveis.
Tabela VI Análise da Viabilidade Pós Congelação de um Lote de Hepatócitos Misturados Ponto de tempo % de Viabilidade T=0 88% 0,5 horas 79% 1,0 hora 84% 2,0 horas 79% 3,0 horas 73% 4,0 horas 67% 6,0 horas 69%
Viabilidade determinada por Azul de Tripano
Lisboa, 8 de Junho de 2012 36
Claims (5)
- REIVINDICAÇÕES Método de produção de uma preparaçao de hepatócitos multi-criopreservados compreendendo: (A) proporcionar hepatócitos de múltiplas fontes que foram criopreservados e descongelados (B) misturar estes hepatócitos e submetê-los a fraccionamento por gradiente de densidade para separar hepatócitos viáveis de hepatócitos não viáveis, (C) recuperar os hepatócitos viáveis separados, e (D) criopreservar os hepatócitos viáveis recuperados para formar deste modo a referida preparação de hepatócitos em que mais de 70% dos hepatócitos da referida preparação são viáveis. Método da reivindicação 1, em que o fracionamento por gradiente de densidade compreende uma centrifugação em gradiente de Percoll™. Método da reivindicação 1, em que os referidos hepatócitos são selecionados do grupo consistindo em hepatócitos humanos, hepatócitos porcinos, hepatócitos simios, hepatócitos caninos, hepatócitos felinos, hepatócitos bovinos, hepatócitos equinos, hepatócitos ovinos e hepatócitos de roedores. 4. Método da reivindicação 3, em que os referidos hepatócitos são hepatócitos humanos.
- 5. Método de qualquer das reivindicações 1 a 4, em que as referidas fontes múltiplas são do mesmo sexo, raça ou estado de saúde.
- 6. Método de qualquer das reivindicações 1 a 4, em que os hepatócitos da referida preparação de hepatócitos misturados proporcionam a referida preparação misturada com um nível desejado de uma actividade metabólica.
- 7. Método da reivindicação 6, em que a referida actividade metabólica é seleccionada do grupo consistindo em coumarina (COUM), dextrometorfano (DEX), etoxicoumarina (ECOD), 7-hidroxicoumarina glucuronídeo (7-HCG), sulfato de 7-hidroxicoumarina (7-HCS), mefenitoína (ΜΕΡΗ), testosterona (TEST), tolbutamida 4-hidroxilase (TOLB), fenacetina (PHEN) ou clorozoxazona (CZX).
- 8. Método da reivindicação 1, em que mais do que 80% dos hepatócitos da referida preparação são viáveis. Lisboa, 8 de Junho de 2012 2
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