CN101703039A - 日本蟳精子冷冻保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种日本蟳精子冷冻保存方法，其特征在于，它包括取材、精子活力鉴定、降温平衡、第一次预冷、第二次预冷和冻存等步骤。本发明是针对日本蟳精子的生物学特点，筛选出适合日本蟳精子的冷冻保存方法，可以长期有效地保存日本蟳精子。利用本发明将日本蟳精子在液氮中保存一年后，解冻后的精子存活率可达70％以上。本方法无需昂贵的仪器设备，操作简单，成本低廉，效果好，为日本蟳的人工授精工作提供了精子来源保障，并可用于日本蟳的杂交育种、种质优选、雌核发育及物种保护等其他研究领域。

Description

日本蟳精子冷冻保存方法

技术领域

本发明涉及一种动物精子的保存方法，特别是一种日本蟳精子冷冻保存方法。

背景技术

在水产增养殖生产中，随着人工授精技术的发展和种质资源保护的需要，精子体外保存技术研究越来越受到关注。精子的长期保存，可以保证基因长时间的稳定性，同时也避免了饲养亲本所需的花费，大大提高了选育的可行性，也为精子代谢及生理研究提供了技术平台。

日本蟳Charybdis japonica肉味鲜美、营养丰富、价格适中，市场需求量不断增加。由于过度捕捞导致日本蟳的天然资源量锐减，已远远不能满足人类的需求，因此亟待开展日本蟳的人工增养殖。在日本蟳人工繁殖生产中，如何提高亲蟹交配成功率是一个主要问题。

在目前已公开的有关动物精子保存的专利中，多数是针对哺乳动物(牛、山羊、)的精子保存技术，有少数涉及到水生经济动物的精子保存。现有技术中公开的水生经济动物的精子保存方法主要为鲤科鱼类(青鱼、草鱼、鲢、鳙、鲤、鲫、鳊等)、中华鲟等鲟科鱼类和主要海水鱼类(鲈鱼、大菱鲆、大黄鱼、牙鲆、圆斑星鲽和石鲽等)的精子保存方法，迄今尚无关于蟹类精子保存技术的专利。日本蟳(Charybdis japonica A.Milne-Edwards)隶属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、梭子蟹科，由于不同种类动物的精子具有不同的生物学特性，所以现有技术中公开的精子保存方法不适宜用于日本蟳精子的保存。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种方法简单、可操作性强的针对日本蟳精子的生物学特点筛选出适合日本蟳精子的冷冻保存方法，以用于日本蟳的人工繁殖生产，并为日本蟳的种质资源保存、杂交育种等研究提供技术平台。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种日本蟳精子冷冻保存方法，其特点是，其步骤如下：

(1)取材：在3月中旬至8月下旬，取精巢发育成熟期的日本蟳雄体，解剖，取出精巢放入研钵中，加入适量无钙人工海水研磨3-5分钟后，用200目筛绢网过滤去除组织碎片，1000转/min离心5min，取得白色精子沉淀，用稀释剂稀释至10⁶个/ml的精子悬浮液，4℃保存备用；所述的无钙人工海水的配制方法为：NaCl 21.63g，NaOH 0.19g，KCl 1.12g，MgSO₄·7H₂O 4.93g，H₃BO₃ 0.53g，溶于1L蒸馏水中即得；所述的稀释剂制法为：NaCl 25.0g，Na₂SO₄ 3.9g，KCl 0.73g，MgCl₂·6H₂O 10.7g，NaHCO₃ 0.23g，溶于1L蒸馏水中，调整pH至8.0，并加入青链霉素使青链霉素终浓度达到200U/mL；

(2)精子活力鉴定：用滴管取一滴精子悬液于载玻片上，制成涂片；用2％曙红B染色4min后，置于显微镜下观察，随机计数至少200个精子，计算精子活率；鉴别日本蟳精子的死活方法为：活的精子细胞，不着色透明或者部分轻微着色；死的精子细胞大部分着色或者全部着色；当计算所得日本蟳精子活率达到85％以上时，进行下述冷冻步骤；

(3)降温平衡：将精子悬浮液加入抗冻剂15％二甲基亚砜DMSO-V/V分装至1-2ml冻存管中，于4℃冰箱中降温平衡30min；

(4)第一次预冷：在保温瓶中放入冻存管支架，然后向保温瓶中加入液氮，使液氮表面距离冻存管支架表面5cm；将降温平衡处理过的冻存管用纱布包裹后平放于冻存管支架上，盖上保温瓶盖，预冷25min；

(5)第二次预冷：打开保温瓶盖，向保温瓶中添加液氮，使液氮表面距离冻存管支架表面1-5mm，盖上保温瓶盖，预冷5min；

冻存：取出冻存管，分组装入带长线绳的纱布袋中，然后将其置于液氮罐中保存；长线绳端部露出液氮罐外，并贴上用于标注的标签。

当需要使用所保存的精子标本时，可以按以下方法进行解冻：打开液氮罐，捏住露在液氮罐外的长线绳，将装有冻存管的纱布袋拎出，迅速放入40℃水浴中解冻并检测活力后使用。

以下对本发明相关试验进行详细的阐述。

1材料与方法

1.1材料

鲜活雄性日本蟳于2007年4月5日～5月20日购自连云港市新浦区直销农贸市场，共40只，体重为(120.7±18.5)g，平均甲长为(8.2±2.4)cm，平均甲宽为(5.3±1.5)cm。解剖，打开背甲，取出精巢放入研钵中。加入少量无钙离子人工海水(配制方法：NaCl 21.63g，NaOH 0.19g，KCl 1.12g，MgSO₄·7H₂O 4.93g，H₃BO₃ 0.53g，加蒸馏水定容至1000mL)，研磨5分钟后，用200目筛绢网过滤以去除组织碎片。1000转/min离心5min，取得白色精子沉淀，4℃保存备用。

1.2方法

1.2.1精子存活率的检测方法

(1)检测日本蟳精子活力染色方法的筛选。染色剂为用过滤海水配制的曙红B和台盼蓝染色液，浓度设置为0.25％、1％、2％、4％四个梯度，染色时间设置为2min、4min、8min、12min四个梯度，筛选出适用于评价日本蟳精子活力的染色剂及染色方法。

(2)精子存活率评价。每次随机计数200个精子，分4个随机计数点，每个点约计50个精子，统计样品的精子存活率。各实验均重复3次，实验数据用“平均数+标准差”表示。采用SPSS16.0软件进行数据处理，并进行单因子方差分析(One-way ANOVA)，LSD(Least Significant Difference)多重比较和Duncan检验。

1.2.2pH对精子活力的影响

以上述无钙离子人工海水作为基础培养液，用0.1mol/L的NaoH和HCl溶液调节pH至5、6、7、8、9、10、11共7个pH梯度，依次为实验1-7组。取1.1精子沉淀，测初始活力后于各实验组中，用枪头吹打散开，15℃保存(因日本蟳交配产卵盛期在5月中旬至6月下旬，此期间水温变化范围在15.0～26.5℃，本实验取下限低温值)，并分别于1h，4h，24h，48h，72h时测定精子存活率。

1.2.3盐度对精子活力的影响

用NaCl和蒸馏水配制15，20，25，30，35，40，45共7个盐度梯度，依次为实验1-7组，各组pH均调节至8.0.取精子沉淀于各实验组中，用枪头吹打散开，15℃保存，并分别于1h，4h，24h，48h，72h时测定精子存活率.

1.2.4精子保存密度对精子活力的影响

取精子沉淀，分别用无钙离子人工海水调节密度至10⁴，10⁵，10⁶，10⁷，10⁸，10⁹，10¹⁰个/mL共7个梯度，用枪头吹打散开，15℃保存，并分别于1h，4h，24h，48h，72h时测定精子存活率。

1.2.5不同稀释剂对精子冷冻保存的影响

稀释剂采用下列7种，配方是在参考有关文献中应用于鱼类、虾类、贝类等精子稀释剂的基础上，针对日本蟳精子的生物学特点修改而成的。各稀释剂的pH均调节至8.0，并加入10％DMSO和青链霉素(终浓度达到200U/mL)。

稀释剂I：上述无钙离子人工海水；

稀释剂II：NaCl 25.0g，Na₂SO₄ 3.9g，KCl 0.73g，MgCl₂·6H₂O 10.7g，NaHCO₃ 0.23g，加蒸馏水定容至1000mL；

稀释剂III：NaCl 25.3g，NaH₂PO₄ 0.22g，NaHCO₃ 0.25g，KCl 0.39g，CaCl₂ 0.13g，MgCl₂·6H₂O 0.23g，葡萄糖10g，加蒸馏水定容至1000mL；

稀释剂IV：葡萄糖30g，柠檬酸钠14g，卵黄200mL，加蒸馏水定容至1000mL；

稀释剂V：NaCl 25.0g，KCl 0.6g，CaCl₂ 0.25g，MgCl₂ 0.35g，NaHCO₃0.2g，加蒸馏水定容至1000mL；

稀释剂VI：NaCl 8.7g，KCl 7.2g，CaCl₂ 0.23g，MgCl₂ 0.1g，NaHCO₃1.0g，NaH₂PO₄ 0.38g，葡萄糖1g，加蒸馏水定容至1000mL；

稀释剂VII：甲液-NaH₂PO₄·2H₂O 0.06g，KH₂PO₄ 0.06g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，葡萄糖1g，NaCl 8.0g，加蒸馏水定容至750mL；乙液-CaCl₂ 0.14g溶于100mL蒸馏水中；丙液-NaHCO₃ 0.35g溶于100mL37℃蒸馏水中。将乙液缓慢加入甲液，再加入丙液，加蒸馏水定容至1000mL。

将1.1取得的白色精子沉淀分别用7种稀释剂制备成10⁶个/mL的精子悬浮液，于4℃冰箱中降温平衡30min，再经两次预冷：第一次样品距液氮表面5cm处，预冷20min，第二次样品于液氮表面预冷5min。然后将装有样品的冻存管，5个一组，用纱布迅速将其包裹，并系上1m长线绳，放入液氮罐中保存。注意将线绳顶端露在液氮罐外，并贴上标签，注明标本名称及冻存时间。

解冻方法：打开液氮罐，捏住露在液氮罐外的线绳，将包裹有冻存管的纱布团拎出，迅速放入40℃水浴中解冻，检测各组精子存活率。

1.2.6不同冷冻保护剂对精子冷冻保存的影响

在1.2.5所筛选出的最适稀释剂的基础上，以二甲基亚砜DMSO和甘油作为冷冻保护剂，设置10个不同的保护剂浓度和保护剂组合：实验1-4组分别含DMSO(V/V)5％、10％、15％、20％；实验5-8组分别含甘油(V/V)5％、10％、15％、20％；实验9组分别含DMSO和甘油各10％；实验10组分别含DMSO和甘油各20％。对照组不加冷冻保护剂。其余步骤同1.2.5。

1.2.7第一次预冷时间对精子冷冻保存的影响：

将平衡30min后的样品置于液氮表面5cm处，分别以5min，15min，25min，35min，45min 5个时间梯度进行第一次预冷。其余步骤同1.2.5。

2结果

2.1检测日本蟳精子活力的染色方法

经比较，用2％曙红B染色4min后，在显微镜下可以较容易地区分日本蟳精子的死活：活的精子细胞，不着色透明或者部分轻微着色；死的精子细胞大部分着色或者全部着色。台盼蓝没有曙红B染色清晰，表明曙红B适用于评价日本蟳的精子活力。

2.2pH对精子活力的影响

pH对精子活力的影响见图1。从图1中可以看出，日本噚精子对酸性环境的耐受力要低于碱性环境，保存1h后，pH7-10的试验组的精子存活率差异不大，以pH 8组较高。保存24h后，pH 8组的精子存活率为73.5％，而pH5、6、11试验组精子存活率下降迅速，仅为15.7％、19.8％和24.7％，保存至72h时均死亡。

2.3盐度对精子活力的影响

从图2可以看出，在精子保存1h后，盐度为20、25、30的试验组日本蟳精子活力较高，其中以盐度25试验组活力最高，保存72h后，精子存活率可达26.4％。而盐度为40和45的试验组精子活力下降迅速，并分别于保存72h和48h后全部死亡。在精子保存1h时，盐度为15和35的试验组精子活力下降较慢，但保存72h后，精子存活率仅为8.7％和5.6％。

2.4精子保存密度对精子活力的影响

精子保存密度对精子活力的影响见图3。在保存1h后，试验2组、3组和4组的精子存活率没有明显变化，而试验1组和6组精子存活率下降比较明显，分别为66.4％和72.9％。24h后，以试验3组精子存活率最高，为80.4％，试验1组精子存活率下降幅度最大，仅为20.8％。72h后，试验3组和4组的精子存活率较高，分别为24.6％和20.1％，而试验1组和6组的精子存活率仅为2.5％和5.6％。

2.5不同稀释剂对精子冷冻保存效果的影响

不同稀释剂对冷冻保存日本蟳精子存活率的影响见表1。试验前各样品精子初始存活率均为(91.82±1.53)。平衡30min后，各试验组精子存活率即出现差异：稀释剂I、II、V、VI的精子存活率超过80％，其中以稀释剂II组最高，为89.67％，稀释剂VI最低，为80.48％；稀释剂III、IV、VII的精子存活率均低于80％，以稀释剂IV精子存活率最低，仅为70.16％。在冷冻保存24h后解冻的精子存活率检测结果看，以稀释剂II组的解冻后精子存活率最高，达82.49％，其次是稀释剂V和I组，解冻后精子存活率达70％以上，以稀释剂IV精子存活率最低，仅为7.25％，降幅达84.57％。

表1不同稀释剂对冷冻保存日本蟳精子存活率的影响(平均信±标准差)

注：单因子方差分析(One-way ANOVA)和Duncan检验。表中上标不同字母表示有显著差异(P＜0.05)

2.6不同冷冻保护剂对精子冷冻保存效果的影响

从表2可见，对照组因未添加任何抗冻剂直接冷冻，所以冷冻24h后精子存活率仅为10.92％，保存1年后精子全部死亡。各试验组中，以试验3组(DMSO，15％)的精子存活率最高，冷冻24h后精子存活率达83.76％，保存1年后仍能达到73.81％。其次是试验2组和1组，保存1年后的精子存活率分别为60.78％和39.43％。而添加甘油作为冷冻保护剂的各试验组精子存活率均较低，表明DMSO比甘油更用适于日本噚精子的冷冻保存。

从同一保护剂、不同添加浓度之间的比较发现，DMSO浓度从5％-15％之间，随着DMSO添加量的增加，精子存活率呈现升高趋势，但当DMSO浓度达到20％时，精子存活率明显下降。添加甘油各组变化趋势与之相似。以等比例添加DMSO和甘油的试验9组和10组，其精子存活率均较低，尤其试验10组精子存活率降幅最大，达到87.79％。

表2不同冷冻保护剂对冷冻保存日本蟳精子存活率的影响(平均值±标准差)

注：单因子方差分析(One-way ANOVA)和Duncan检验。表中上标不同字母表示有显著差异(P＜0.05)

2.7第一次预冷时间对精子冷冻保存效果的影响

不同预冷时间对精子冷冻保存效果的影响见表3。在5～25min之间，随着第一次预冷时间的增加，精子存活率呈递增的趋势。但当预冷时间达到35min以上，精子存活率反而显著降低。

表3不同预冷时间对日本蟳精子冷冻保存后存活率的影响(平均值±标准差)

注：单因子方差分析(One-way ANOVA)和Duncan检验。表中上标不同字母表示有显著差异(P＜0.05)

与现有技术相比，本发明是针对日本蟳精子的生物学特点，筛选出适合日本蟳精子的冷冻保存方法，可以长期有效地保存日本蟳精子。实验证明，利用本发明将日本蟳精子在液氮中保存一年后，解冻后的精子存活率可达70％以上。本方法无需昂贵的仪器设备，操作简单，成本低廉，效果好，为日本蟳的人工授精工作提供了精子来源保障，并可用于日本蟳的杂交育种、种质优选、雌核发育及物种保护等其他研究领域。

附图说明

图1为pH对日本蟳精子活力的影响图。

图2为盐度对日本蟳精子活力的影响图。

图3为精子保存密度对日本蟳精子活力的影响图。

具体实施方式

以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1。一种日本蟳精子冷冻保存方法，其步骤如下：

(1)取材：在3月中旬至8月下旬，取精巢发育成熟期的日本蟳雄体，解剖，取出精巢放入研钵中，加入适量无钙人工海水研磨3-5分钟后，用200目筛绢网过滤去除组织碎片，1000转/min离心5min，取得白色精子沉淀，用稀释剂稀释至10⁶个/ml的精子悬浮液，4℃保存备用；所述的无钙人工海水的配制方法为：NaCl 21.63g，NaOH 0.19g，KCl 1.12g，MgSO₄·7H₂O 4.93g，H₃BO₃ 0.53g，溶于1L蒸馏水中即得；所述的稀释剂制法为：NaCl 25.0g，Na₂SO₄3.9g，KCl 0.73g，MgCl₂·6H₂O 10.7g，NaHCO₃0.23g，溶于1L蒸馏水中，调整pH至8.0，并加入青链霉素使青链霉素终浓度达到200U/mL；

(2)精子活力鉴定：用滴管取一滴精子悬液于载玻片上，制成涂片；用2％曙红B染色4min后，置于显微镜下观察，随机计数至少200个精子，计算精子活率；鉴别日本蟳精子的死活方法为：活的精子细胞，不着色透明或者部分轻微着色；死的精子细胞大部分着色或者全部着色；当计算所得日本蟳精子活率达到85％以上时，进行下述冷冻步骤；

(3)降温平衡：将精子悬浮液加入抗冻剂15％二甲基亚砜DMSO-V/V分装至1-2ml冻存管中，于4℃冰箱中降温平衡30min；

(4)第一次预冷：在保温瓶中放入冻存管支架，然后向保温瓶中加入液氮，使液氮表面距离冻存管支架表面5cm；将降温平衡处理过的冻存管用纱布包裹后平放于冻存管支架上，盖上保温瓶盖，预冷25min；

(5)第二次预冷：打开保温瓶盖，向保温瓶中添加液氮，使液氮表面距离冻存管支架表面1-5mm，盖上保温瓶盖，预冷5min；

(6)冻存：取出冻存管，分组装入带长线绳的纱布袋中，然后将其置于液氮罐中保存；长线绳端部露出液氮罐外，并贴上用于标注的标签。

实验例。日本蟳精子冷冻实验。

按实施例1所述的日本蟳精子冷冻保存方法所述的步骤进行冷冻保存。12个月后，打开液氮罐，捏住露在液氮罐外的长线绳，将装有冻存管的纱布袋拎出，迅速放40℃水浴中解冻后，按步骤(2)所述的方法进行活力检测，检测精子存活率为75％。24个月后，打开液氮罐，捏住露在液氮罐外的长线绳，将装有冻存管的纱布袋拎出，迅速放入40℃水浴中解冻后，按步骤(2)所述的方法进行活力检测，检测精子存活率为70％。

Claims (1)

1.一种日本蟳精子冷冻保存方法，其特征在于，其步骤如下：

(1)取材：在3月中旬至8月下旬，取精巢发育成熟期的日本蟳雄体，解剖，取出精巢放入研钵中，加入适量无钙人工海水研磨3-5分钟后，用200目筛绢网过滤去除组织碎片，1000转/min离心5min，取得白色精子沉淀，用稀释剂稀释至10⁶个/ml的精子悬浮液，4℃保存备用；所述的无钙人工海水的配制方法为：NaCl 21.63g，NaOH 0.19g，KCl 1.12g，MgSO₄·7H₂O 4.93g，H₃BO₃ 0.53g，溶于1L蒸馏水中即得；所述的稀释剂制法为：NaCl 25.0g，Na₂SO₄3.9g，KCl 0.73g，MgCl₂·6H₂O 10.7g，NaHCO₃0.23g，溶于1L蒸馏水中，调整pH至8.0，并加入青链霉素使青链霉素终浓度达到200U/mL；

(2)精子活力鉴定：用滴管取一滴精子悬液于载玻片上，制成涂片；用2％曙红B染色4min后，置于显微镜下观察，随机计数至少200个精子，计算精子活率；鉴别日本蟳精子的死活方法为：活的精子细胞，不着色透明或者部分轻微着色；死的精子细胞大部分着色或者全部着色；当计算所得日本蟳精子活率达到85％以上时，进行下述冷冻步骤；

(3)降温平衡：将精子悬浮液加入抗冻剂15％二甲基亚砜DMSO-V/V分装至1-2ml冻存管中，于4℃冰箱中降温平衡30min；

(4)第一次预冷：在保温瓶中放入冻存管支架，然后向保温瓶中加入液氮，使液氮表面距离冻存管支架表面5cm；将降温平衡处理过的冻存管用纱布包裹后平放于冻存管支架上，盖上保温瓶盖，预冷25min；

(5)第二次预冷：打开保温瓶盖，向保温瓶中添加液氮，使液氮表面距离冻存管支架表面1-5mm，盖上保温瓶盖，预冷5min；

(6)冻存：取出冻存管，分组装入带长线绳的纱布袋中，然后将其置于液氮罐中保存；长线绳端部露出液氮罐外，并贴上用于标注的标签。

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