CN103518702A - 一种冻存细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞生物技术领域，涉及一种细胞的冻存方法，尤其是一种改良的快速冷冻法，该方法能在保证细胞特性不变的情况下提高细胞的活力。本方法中采用带孔的纱布袋，将冻存管悬吊在液氮的蒸汽层中，能使冻存管内细胞迅速降温，复苏后细胞的活力高达95-99%；采用10%的DMSO+90%的血清作为冻存液，能提高细胞膜对水的通透性，保证细胞外结晶短时间内冻住，避免水分的渗入对细胞造成损伤；本方法适用于对任何细胞系的长期保存，与现有技术比较，省略了步骤，简化了工艺，复苏后的细胞活力高且细胞特性不变，可实现长期保存的目的。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物技术领域，涉及细胞保存方法，具体地说涉及一种细胞的冻存方法。
背景技术
细胞冻存是细胞长期培养技术中的重要环节之一。研究表明，利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，在需要的时候进行复苏细胞后用于实验。实验研究中，适度地保存一定量的细胞，可以防止正在培养的细胞被污染或因其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。目前，涉及细胞保存的实验研究中常用的传统保存方法有：先将放有细胞的冻存管置于4℃环境中保存30分钟；然后再在-20℃环境中保存60分钟；之后再在-80℃环境中过夜；最后将冻存管放入液氮罐中。但是由于上述细胞保种方法中步骤较多，且时间间隔较长，导致很容易遗忘，本领域公知，其中任何一个步骤的拖延都会严重影响细胞存活。
目前的细胞冻存技术还有：中国专利CN1821393公开了细胞冻存的方法，其中：1、先将细胞冻存管放在4℃环境中5分钟；2、然后液氮面上1分钟后，再浸入液氮中保存。这种保存方法，细胞的复苏活力为84.15%；中国专利CN1944636公开了细胞冻存的方法，其中：1、先将细胞冻存管放在18-24℃环境中20-30分钟；2、再放在液氮蒸汽层8-20小时后，最后浸入液氮中；中国专利CN101070534公开了细胞冻存方法是室温15分钟，入程序降温盒，在-85℃环境中保存4小时，再浸入液氮中；中国专利CN101463340公开了组织保存，液氮气化层-80℃，5分钟，进液氮，该专利中组织在气化层放置时间过短，组织还未深冻，组织内易产生冰晶，影响组织将来的复苏，降低细胞活力，并且不能长期保存；中国专利CN101711522公开了组织保存，在液氮液面层5-20分钟，进液氮，该方法中，在操作过程中冻存管很容易碰到液氮，而保存细胞或组织的冻存管刚冻存时，只要碰到少许液氮，复苏后的细胞几乎不可能存活。
上述细胞或组织的保存方法均采用了渐冷的降温方法，实践显示，该些保存方法仍存在如下缺陷：细胞复苏后的细胞活力均＜85%％，细胞不能长期冻存。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种新的冻存细胞的方法，具体的，涉及一种改良的快速冷冻法，该方法能在保证细胞特性不变的情况下提高细胞的活力。
通常有关实验研究中，针对组织的保存一般都只需短期保存，但细胞株的保存，尤其是长期保存比组织的保存难度显著的大。为实现上述目的，本发明提供了一种细胞的冻存方法，其特征在于，其包括如下冻存步骤：
（1）取对数生长期的细胞，放入离心管中，以1500转/分钟的速度离心5分钟，倒弃上清液，沉淀细胞混匀成单个细胞悬液；
（2）配制细胞冻存液：按体积比配制成含血清和二甲基亚砜的细胞冻存液；
（3）在细胞冻存液中加入特定浓度的细胞后，迅速移至冻存管中；
（4）在冻存管外套带孔的罩袋，悬吊在液氮的蒸汽层中；
（5）然后直接浸入液氮中保存。
本发明方法中，按9份血清+1份二甲基亚砜的体积比配制细胞冻存液：
本发明方法中，特定浓度的细胞为在每1ml细胞冻存液中加入细胞0.5-1*107个；
本发明方法中，在冻存管外套带孔的罩袋，本发明的实施例中优选纱布口袋，悬吊在液氮的蒸汽层中3-5小时。
本发明方法中，所述的细胞包括：人和动物的原代细胞株、传代细胞株和单抗细胞株。
结果显示，本发明的细胞的冻存方法，由于在冻存管外加带孔的罩袋，尤其是带有很多小孔的纱布袋，将冻存管悬吊在液氮的蒸汽层中，能使冻存管内细胞迅速降温，显著提高了复苏后细胞的活力，经检测，复苏后细胞的活力高达95-99%；本发明中，采用10%的DMSO+90%的血清作为冻存液，能提高细胞膜对水的通透性，由于采用快速冻存的方法，能保证细胞外结晶在很短的时间内即冻住，避免由于缓慢冻存使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤，从而可保证细胞特性不变，有利于细胞的长期保存。
本发明的方法适用于对任何细胞系的长期保存，与现有技术（中国专利CN1944636）比较，不但省略了步骤，简化了工艺，且经跟踪10多年，结果表明复苏后的细胞活力确实能达到95%-99%，且细胞特性不变，可实现长期保存的目的。
本发明的冻存细胞的方法的优点有：
1、采用带孔的纱布袋，将冻存管悬吊在液氮的蒸汽层中，能使冻存管内细胞迅速降温，复苏后细胞的活力高达95-99%；
2、采用10%的DMSO+90%的血清作为冻存液，能提高细胞膜对水的通透性，保证细胞外结晶短时间内冻住，避免水分的渗入对细胞造成损伤；
3、保证细胞特性不变，利于细胞长期保存。
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明的进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
具体实施方式
实施例1
（1）取对数生长期的人肺腺癌细胞CPA-Yang5细胞（保藏编号：CGMCCNo.3139），放入离心管中，以1500转/分钟的速度离心5分钟，倒弃上清液后，用手指在离心管外轻轻弹击，即可使离心管内的沉淀细胞混匀成单个细胞悬液；（2）配制细胞冻存液：按9份血清+1份二甲基亚砜的体积比配制而成；（3）在每1ml细胞冻存液中加入所述细胞0.5-1*107个，迅速移至冻存管中；（4）在冻存管外套一个纱布口袋，悬吊在液氮的蒸汽层中放置3-5小时；（5）然后直接浸入液氮中保存。
结果显示，本快速冻存的方法能很好的保证细胞存活时间长，细胞活力好，并保持其细胞特性不变，有利于细胞的长期保存，细胞活力可达到95%-99%。而且保存方法简便，避免了因操作不当而破坏保存细胞的情况。与现有技术（中国专利CN1944636）比较，不但省略了步骤，简化了工艺，而且冻存的细胞复苏后的活力更好，可以做到长期保存。
Claims (6)
1.一种细胞的冻存方法，其特征在于，其包括如下步骤：
（1）取对数生长期的细胞，放入离心管中，以1500转/分钟的速度离心5分钟，倒弃上清液，沉淀细胞混匀成单个细胞悬液；
（2）配制细胞冻存液：按体积比配制成含血清和二甲基亚砜的细胞冻存液；
（3）在细胞冻存液中加入特定浓度的细胞后，迅速移至冻存管中；
（4）在冻存管外套带孔的罩袋，悬吊在液氮的蒸汽层中；
（5）然后直接浸入液氮中保存。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，按9份血清加1份二甲基亚砜的体积比配制细胞冻存液。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，特定浓度的细胞为在每1ml细胞冻存液中加入细胞0.5-1*107个。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述的带孔的罩袋为纱布口袋。
5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的纱布口袋悬吊在液氮的蒸汽层中3-5小时。
6.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞包括：人和动物的原代细胞株、传代细胞株和单抗细胞株。
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