WO2018052279A1 - Protocolo para la criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad - Google Patents

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Karina MORALES UENO
Carmen Guadalupe PANIAGUA CHÁVEZ
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Centro De Investigación Científica Y De Educación Superior De Ensenada, Baja California (Cicese)
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Definitions

  • the present invention relates to a cryopreservation protocol of high viscosity biological samples such as invertebrate sperm samples and more particularly to a novel protocol that allows cryopreservation of very high viscosity sperm samples such as for example crustacean sperm samples , preserving in an integrated way the viability of the cellular package contained in said samples.
  • Cryopreservation of tissue samples and biological fluids is one of the most commonly used preservation techniques in biology to keep cells alive and in good condition for prolonged periods of time, without hardly altering their physiognomy or metabolic activity, stop cryopreservation. tissue and / or fluid in a stasis state in which cellular metabolic activities stop completely preventing enzymatic degradation processes from taking place.
  • tissue samples and / or biological fluids must undergo a previous treatment that decreases the probability of crystal formation due to such a sharp decrease in temperature, this is achieved by the addition of cryoprotective substances, which prevent the formation of crystals during the process of freezing either by decreasing the amount of intracellular water and / or modifying its behavior by modifying attractive forces between water molecules, for example by breaking hydrogen bonds.
  • cryopreservation protocols such as those mentioned in CN Patent 101703039 A, which describes a dilution solution for sperm material of the Charybdis japan crustacean, whose function is to allow tissue homogenization before putting it in contact with the cryoprotective agents to be used for its conservation in liquid nitrogen tanks, this in order for the cell packet to be in direct contact with the solutions used.
  • the cryopreservation protocol described dilutes the sample completely and therefore the physical properties of the sample are lost, which is detrimental to the fertilizing power of the sperm.
  • DMSO as a cryoprotective agent and its combination with another compound that maintains cell osmotic balance is not described.
  • EP 2641966 Al describes a composition for vitrification processes of biological samples, comprising a cryoprotectant compound permeable to the cell membrane and a cryoprotectant compound not permeable to the cell membrane, the content of the cryoprotectant permeable to the cell membrane of the order from 30% to 50% with respect to the total volume of the composition.
  • a cryoprotectant compound permeable to the cell membrane permeable to the cell membrane
  • a cryoprotectant compound not permeable to the cell membrane the content of the cryoprotectant permeable to the cell membrane of the order from 30% to 50% with respect to the total volume of the composition.
  • Patent Application WO 2015057641 Al protects a system for tissue cryopreservation and the method for carrying out the vitrification of biological samples.
  • the vitrification solution used contains a permeable cryoprotectant agent (DMSO) and a non-permeable cryoprotectant agent (Trehalose).
  • DMSO permeable cryoprotectant agent
  • Tehalose non-permeable cryoprotectant agent
  • the treated samples must be completely disintegrated and suspended in order to come into contact with the cryoprotective solution, so the original physical properties of the treated sample would be completely lost. None of the cryopreservation protocols available, allows to treat biological samples of high viscosity without the need for their total disintegration. Also, in all cases it is necessary to completely suspend and homogenize the samples so that they come into close contact with the cryoprotectant agent used, so they would not be susceptible to use when the intention is to preserve the original physical properties of the package mobile.
  • the present invention aims to provide a novel protocol for the cryopreservation of high viscosity biological samples.
  • a further object of the present invention is to provide a protocol for the cryopreservation of high viscosity biological samples that can preserve their cell viability.
  • a further objective of the present invention is to provide a protocol for the cryopreservation of high viscosity biological samples, which allows maintaining high cell viability in invertebrate samples.
  • Another objective of the present invention is to provide a protocol for the cryopreservation of high viscosity biological samples, which allows the initial physical properties of the originally treated samples to be preserved.
  • a further objective of the present invention is to provide a protocol for the cryopreservation of high viscosity biological samples that allows to preserve the fertility of invertebrate sperm such as for example crustacean and insect sperm.
  • Figure 1 shows a histological section of the sperm mass before vitrifying (fresh) showing eosinophilic structures possibly of protein origin (black arrows), included among the sperm (round basophilic structures - white arrows).
  • Figure 2 shows a histological section of the thawed sperm mass (after vitrification) of treatment B, showing few eosinophilic structures (circuits). These structures are lost in the vitrification process possibly because they are of protein origin and are cold denatured, while the sperm remain intact (black arrows). 200 fold increase
  • Figure 3 shows the comparison of a histological section of sperm mass before freezing or fresh sample (a) and a thawed sperm sample from treatment B (b) where intact sperm (arrows) and some eosinophilic structures (in circuits) are observed shown above in figures 1 and 2.
  • the present invention provides a novel protocol for the cryopreservation of high viscosity biological samples, which allows to preserve the original physical properties of the treated samples, without loss of the viability of the cell pack.
  • the present protocol is especially useful for achieving cryopreservation of sperm samples of invertebrates such as crustaceans and insects and has proven to be especially useful for shrimp sperm samples.
  • the protocol of the present invention comprises the steps of: a) placing a sample of high biological material viscosity, loaded in a suitable device, in a tube or cryovial containing an aqueous extender solution preferably consisting of 2,125 g / kg of NaCl, 0.110 g / kg of KC1, 0.052 g / kg of H3B04, 0.019 g / kg of NaOH, 0.484 g / kg of MgS04 «7H20 and 20 ⁇ 1 per 100ml of extender solution of a solution containing 10,000 IU of penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 ⁇ g of amphotericin B, for a period of time between 18 to 22 minutes at a temperature from 21 to 25 ° C without the sample coming into contact with the solution or with the tube walls, using a suitable sampling device;
  • Defrosting of the sample is carried out by extracting the sample from the liquid nitrogen and immersing it in a water bath at a temperature of 35 ° C to 39 ° C for a period of 4 to 9 minutes, to later remove it from the cryovial and place it for a period of 15 to 25 minutes in an equilibrium solution containing 0.25-0.5 M trehalose.
  • the solutions evaluated to cryopreserve the spermatozoa of the white shrimp P. vannamei were trehalose, dimethyl sulfoxide (DMSO) and Polyethylene glycol (PEG).
  • the combination and concentration of the previously mentioned vitrifying agents (trehalose, DMSO and PEG) were assigned to the following treatments: A) 6% PEG and 15% DMSO; B) Trehalosa 0.25-0.5 M and DMSO at 10-15%; and C) Trehalosa 0.25-0.5 M and DMSO at 16-20%.
  • A) 6% PEG and 15% DMSO B
  • C Trehalosa 0.25-0.5 M and DMSO at 16-20%.
  • the sperm samples of each spermatophore were placed in a loading device designed specifically for this type of samples and placed vertically within a 2 milliliter cryovial containing 100 ⁇ of extensor solution. In this process, care was taken that the sample did not make contact with the interior walls of the cryovial or with the solution; The sample was stored for 20 minutes at room temperature (23 ° C). Subsequently, the loading device was introduced in the different treatments leaving only two thirds of the sperm sample in contact with the cryoprotective solutions. This step was crucial in the assessment, since introducing more than 2/3 of the sample into the solution caused its detachment from the loading device, and introducing it less did not allow the correct penetration of the cryoprotective agents into the sample.
  • cryopreservative solutions were added in two steps: for treatment A in step 1, the sperm sample was immersed in a solution containing half of the total concentration of the cryoprotective agent (3% PEG and 7.5% DMSO) for one minute .
  • Step 2 consisted of immersing the sample in the total concentration of the cryoprotectant agent (PEG 6% and DMSO 15%) for 20 seconds;
  • step 1 for treatments B and C consisted of submerging the samples in trehalose for 20 minutes and then, in step 2, immersing only 2/3 in the vitrifying solution B (Trehalosa 0.25-0.5 M and 10-15% DMSO ) or C (Trehalosa 0.25-0.5 M and DMSO at 16-20%).
  • the loading device containing the sperm sample was quickly introduced into liquid nitrogen and placed in a 2 mL cryovial. Subsequently, the cryovial was stored for 24 hours in a liquid nitrogen tank between -196 ° C and -200 ° C.
  • cryovials were extracted from the liquid nitrogen tank and each sample was quickly immersed in a water bath at approximately 37 ° C for 6 seconds. Subsequently, they were placed for 15-25 minutes in the equilibrium solution (0.25-0.5 M trehalose) and stored at room temperature until used in artificial fertilization or viability assessment. Both the fertilization and the light microscope viability evaluation were carried out at Maricultura del Pac ⁇ fico, SA de CV facilities. The viability probes using fluorescent probes and histology were performed at the Aquatic Genetic Resources Subsystem (SUBNARGENA) facilities. located in the CICESE. To carry out the fertilization, the thawed samples were suspended in the extensor solution described in step a) of the protocol of the present invention and its feasibility evaluated. Ten sperm samples per treatment were assigned for artificial insemination of 10 females ready to ovulate. The only treatment that produced nauplii after artificial insemination was treatment B (Trehalosa 0.25-0.5 M and DMSO 10-15%).
  • the samples transferred to CICESE seven of them were used to assess their viability. Thawed samples were transferred to a tube containing 1 mL of extender solution to be disintegrated with a tissue homogenizer for 30 seconds. Once the suspension was made, the cells were stained with the Live / Dead sperm staining kit (Life Technologies, Eugene, OR, USA) as follows: 5 ⁇ L of the SYBR 14 dye was added to one milliliter of the suspension of cells (final concentration 100 nM) and were incubated for 10 minutes in the dark at room temperature (23 ° C); subsequently, 5 ⁇ L of the propidium iodide dye (YP, final concentration 12 ⁇ ) was added and allowed to incubate for another 10 minutes in the dark and at room temperature.
  • the SYBR 14 dye 5 ⁇ L was added to one milliliter of the suspension of cells (final concentration 100 nM) and were incubated for 10 minutes in the dark at room temperature (23 ° C); subsequently, 5 ⁇ L of the propi
  • the sperm samples in the equilibrium solution were homogenized with 1.5 mL of extensor solution.
  • An aliquot of 20 i was examined with an increase of 400X after having stained the aliquots with 10% nigrosine and the morphological changes present were evaluated and recorded.
  • Those sperms that kept the morphological characteristics intact were considered viable as those with irregular cell bodies or deformed or absent spines were considered not viable.
  • 100 sperm were counted, in triplicate, in at least five fields of vision per sheet examined, finding in all cases a percentage of 100% viability.

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Abstract

Un protocolo para la criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad, preferentemente de muestras 5 espermáticas de crustáceos o insectos, que permite mantener intactas las propiedades físicas de la muestra original manteniendo la viabilidad del paquete celular.

Description

PROTOCOLO PARA LA CRIOPRESERVACIÓN DE MUESTRAS BIOLÓGICAS
DE ALTA VISCOSIDAD
Campo de la Invención
La presente invención se refiere a un protocolo de criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad tales como las muestras espermáticas de invertebrados y más particularmente a un novedoso protocolo que permite la criopreservación de muestras espermáticas de muy alta viscosidad tales como por ejemplo las muestras espermáticas de crustáceos, conservando de manera integra la viabilidad del paquete celular contenido en dichas muestras.
Antecedentes de la Invención
La criopreservación de muestras de tejidos y fluidos biológicos, es una de las técnicas de preservación más utilizadas en bilogía para mantener la células vivas y en buen estado durante periodos de tiempo prolongado, sin apenas alterar su fisionomía ni actividad metabólica, pare ello la criopreservación mantiene el tejido y/o fluido en un estado de estasis en el cual las actividades metabólicas celulares se detienen por completo evitando que los procesos degradativos enzimáticos se lleven a cabo.
Para lograr lo anterior las muestras de tejido y/o fluidos biológicos se deben someter a un tratamiento previo que disminuya la probabilidad de formación de cristales debido al descenso tan brusco de temperatura, esto se logra mediante la adición de sustancias crioprotectoras , que evitan la formación de cristales durante el proceso de congelación ya sea disminuyendo la cantidad de agua intracelular y/o modificando el comportamiento de la mismas al modificar las fuerzas atractivas entre las moléculas de agua, por ejemplo al romper los puentes de hidrógeno.
Sin embargo aun cuando en la actualidad, es posible criopreservar diversos tipos de muestras por periodos de tiempo prolongados, es en el campo de la fertilización in- vitro en el que se han tenido más contratiempos, ya que no solo es necesario mantener viables las células, sino que también es importante mantener intacta su morfología celular y propiedades fisiológicas en vista de que en muchas especies animales, la pérdida de por ejemplo el poder adherente de los espermatozoides, evita la fertilización y producción de embriones viables.
Para tratar de superar dichos inconvenientes se han desarrollado diversos protocolos de criopreservación tales como por ejemplo los citados en la patente CN 101703039 A, la cual describe una solución dilutora para material espermático del crustáceo Charybdis japónica, cuya función es la de permitir una homogenización del tejido antes de ponerlo en contacto con los agentes de crioprotección a ser usados para su conservación en tanques de nitrógeno líquido, esto con el fin de que el paquete celular quede en contacto directo con las soluciones utilizadas. Sin embargo, el protocolo de criopreservación descrito diluye por completo la muestra y por lo tanto se pierden las propiedades físicas de la misma, lo que va en detrimento del poder fertilizante de los espermatozoides. Asimismo en dicho protocolo solo se usa DMSO como agente crioprotector y no se describe la combinación del mismo con otro compuesto que mantenga el equilibrio osmótico celular. La patente EP 2641966 Al, describe una composición para procesos de vitrificación de muestras biológicas, que comprende un compuesto crioprotector permeable a la membrana celular y un compuesto crioprotector no permeable a la membrana celular, estando el contenido del crioprotector permeable a la membrana celular del orden del 30% a 50% con respecto al volumen total de la composición. Sin embargo, para usar la solución propuesta es necesario disgregar por completo las muestras celulares y por lo tanto se pierden las propiedades físicas originales de las muestras tratadas.
La Solicitud de Patente WO 2015057641 Al, protege un sistema para la criopreservación de tejidos y el método para llevar acabo la vitrificación de muestras biológicas. Lo relevante de dicha solicitud radica en el hecho de que describe que la solución de vitrificación utilizada contiene un agente crioprotector permeable (DMSO) y un agente crioprotector no permeable (Trehalosa) . Sin embargo, no se menciona el uso de otras soluciones ni se indica de forma directa la concentración en la que son usados los agentes de crioprotección . Asimismo, las muestras tratadas deben ser completamente disgregadas y suspendidas para poder entrar en contacto con la solución crioprotectora, por lo que se perderían por completo las propiedades físicas originales de la muestra tratada. Ninguno de los protocolos de criopreservación disponibles, permite tratar muestras biológicas de alta viscosidad sin que para ello sea necesario la disgregación total de las mismas. Asimismo, en todos los casos es necesario suspender y homogenizar por completo las muestras para que éstas entren en contacto estrecho con el agente crioprotector utilizado, por lo que no serian susceptibles de ser usados cuando lo que se pretende es conservar las propiedades físicas originales del paquete celular.
En vista de la problemática anterior, es necesario proveer un protocolo para la criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad que permita mantener las propiedades físicas originales de las muestras, sin necesidad de diluir las mismas para ser criopreservada y, que además conserve intacta la viabilidad del paquete celular. Aunado a ello, es necesario proveer un protocolo para la criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad que en caso de contener gametos conserve la capacidad fertilizante de los mismos.
Sumario de la Invención
La presente invención tiene como objetivo el proporcionar un novedoso protocolo para la criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad.
Un objeto adicional de la presente invención, es proporcionar un protocolo para la criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad que pueda conservar la viabilidad celular de las mismas.
También es un objeto de la invención el proporcionar un protocolo para la criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad que permita la criopreservación de muestras de esperma de invertebrados en especial muestras de esperma de crustáceos, abejas, mariposas u otro invertebrado cuyo esperma tenga características de alta viscosidad.
Un objetivo más de la presente invención es proporcionar un protocolo para la criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad, que permita mantener una alta viabilidad celular en muestras de invertebrados.
Otro objetivo de la presente invención es brindar un protocolo para la criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad, que permita conservar las propiedades físicas iniciales de las muestras originalmente tratadas.
Un objetivo adicional de la presente invención es el proporcionar un protocolo para la criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad que permita conservar la fertilidad de los espermatozoides de invertebrados tales como por ejemplo de los espermatozoides de crustáceos e insectos .
Los objetivos antes citados, así como otros y las ventajas de la presente invención, vendrán a ser aparentes de la siguiente descripción detallada de la misma.
Descripción de las figuras de la Invención
La Figura 1 muestra un corte histológico de la masa espermática antes de vitrificar (en fresco) mostrando estructuras eosinófilas posiblemente de origen proteico (flechas negras), incluidas entre los espermatozoides (estructuras basófilas redondas -flechas blancas-) . Aumento de 200 veces. La figura 2 muestra un corte histológico de la masa espermática descongelada (después de la vitrificación) del tratamiento B, mostrando pocas estructuras eosinófilas (circuios) . Dichas estructuras se pierden en el proceso de vitrificación posiblemente debido a que son de origen proteico y son desnaturalizadas por frió, mientras que los espermatozoides quedan intactos (flechas negras) . Aumento de 200 veces.
La figura 3 muestra la comparación de un corte histológico de masa espermática antes de congelar o muestra fresca (a) y una muestra espermática descongelada del tratamiento B (b) en donde se observan espermatozoides intactos (flechas) y algunas estructuras eosinófilas (en circuios) mostradas anteriormente en las figuras 1 y 2.
Descripción Detallada de la Invención
La presente invención proporciona un novedoso protocolo para la criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad, que permite conservar las propiedades físicas originales de las muestras tratadas, sin pérdida de la viabilidad del paquete celular. El presente protocolo es especialmente útil para lograr la criopreservación de muestras espermáticas de invertebrados tales como crustáceos e insectos y ha demostrado ser especialmente útil para la muestras de esperma de camarón.
Para lograr lo anterior, el protocolo de la presente invención comprende los pasos de: a) colocar una muestra de material biológico de alta viscosidad, cargada en un dispositivo adecuado, en un tubo o criovial que contiene una solución extensora acuosa constituida preferentemente por 2.125 g/kg de NaCl, 0.110 g/kg de KC1, 0.052 g/kg de H3B04, 0.019 g/kg de NaOH, 0.484 g/kg de MgS04«7H20 y 20μ1 por cada 100ml de solución extensora de una solución que contiene 10000 UI de penicilina, 10 mg de estreptomicina y 25μg de anfotericina B, por un periodo de tiempo de entre 18 a 22 minutos a una temperatura de 21 a 25 °C sin que la muestra entre en contacto con la solución ni con las paredes del tubo, utilizando para ello un dispositivo de toma de muestra adecuado;
b) sumergir la muestra en trehalosa al 0.25-0.5M por un periodo de tiempo de entre 18 a 22 minutos;
c) transferir la muestra a una solución crioprotectora/vitrificarte constituida por 0.25-0.5 M de
Trehalosa y 10-20 % de DMSO en solución extensora, sumergiendo solo 2/3 de la misma por un periodo de tiempo de entra 2 a 4 minutos;
d) sacar la muestra de la solución crioprotectora y colocarla inmediatamente en nitrógeno liquido;
e) colocar la muestra en un criovial y almacenarla definitivamente en nitrógeno liquido entre -196 y -200 °C.
La descongelación de la muestra se lleva a cabo extrayendo la muestra del nitrógeno liquido y sumergiéndola en un baño de agua a una temperatura de 35°C a 39°C por un periodo de tiempo de 4 a 9 minutos, para posteriormente sacarla del criovial y colocarla por un periodo de tiempo de entre 15 a 25 minutos en una solución de equilibrio que contiene 0.25-0.5 M de trehalosa. Con el protocolo antes descrito es posible mantener la consistencia original de la muestra sin apenas perder viabilidad de la masa celular y ha demostrado ser especialmente útil en la criopreservacion de muestras espermáticas de invertebrados tales como crustáceos e insectos, mostrando ser particularmente útil en la criopreservacion de espermatóforos de camarones.
Ejemplo. Criopreservacion de muestras de esperma de camarón.
Para probar el protocolo de vitrificación de la presente invención en comparación con otros protocolos evaluados, se trataron muestras de espermatóforos de camarón obtenidas manualmente presionando suavemente la base del poro genital ubicado entre el quinto par de pereiópodos y el petasma. A dichas muestras se les separo el esperma presionando la región anterior del espermatóforo entre los dedos índice y pulgar .
Las soluciones evaluadas para criopreservar los espermatozoides del camarón blanco P. vannamei fueron trehalosa, sulfóxido de dimetilo (DMSO) y Poliet ilenglicol (PEG) . La combinación y concentración de los agentes vitrificantes previamente mencionados (trehalosa, DMSO y PEG) fueron asignados a los siguientes tratamientos: A) PEG al 6% y DMSO al 15%; B) Trehalosa 0.25-0.5 M y DMSO al 10- 15%; y C) Trehalosa 0.25-0.5 M y DMSO al 16-20%. Una vez preparados los tratamientos, éstos se almacenaron a 5°C hasta su uso. Todas las concentraciones de agentes crioprotectores se prepararon en la solución extensora mencionada en el paso a) del protocolo de la presente invención. Las muestras de esperma de cada espermatóforo se colocaron en un dispositivo de carga diseñado específicamente para este tipo de muestras y se introdujeron en posición vertical dentro de un criovial de 2 mililitros que contenía 100 μΐ de solución extensora. En este proceso se cuidó que la muestra no hiciera contacto con las paredes interiores del criovial ni con la solución; la muestra se almacenó por 20 minutos a temperatura ambiente (23°C) . Posteriormente se procedió a introducir el dispositivo de carga en los diferentes tratamientos dejando que solo dos tercios de la muestra de esperma estuvieran en contacto con las soluciones crioprotectoras . Dicho paso fue crucial en la valoración, ya que al introducir más de 2/3 de la muestra en la solución se causaba su desprendimiento del dispositivo de carga, e introducirla menos no permitía la correcta penetración de los agentes crioprotectores a la muestra.
Las soluciones criopreservadoras se añadieron en dos pasos: para el tratamiento A en el paso 1, la muestra de esperma se sumergió en una solución que contenía la mitad de la concentración total del agente crioprotector (PEG 3% y 7.5% DMSO) por un minuto. El paso 2 consistió en sumergir la muestra en la concentración total del agente crioprotector (PEG 6% y DMSO 15%) por 20 segundos; el paso 1 para los tratamientos B y C consistió en sumergir las muestras en trehalosa por 20 minutos para luego, en el paso 2, sumergir solo 2/3 en la solución vitrificante B (Trehalosa 0.25-0.5 M y DMSO al 10-15%) o C (Trehalosa 0.25-0.5 M y DMSO al 16- 20%) . Luego de la incorporación de los agentes crioprotectores , el dispositivo de carga conteniendo la muestra de esperma, se introdujo rápidamente en nitrógeno liquido y se colocó en un criovial de 2 mL . Posteriormente, el criovial se almacenó por 24 horas en un tanque de nitrógeno liquido entre -196°C y -200 °C.
Para probar la eficiencia de estos protocolos, se realizaron experimentos utilizando 96 espermatóforos provenientes de 48 machos. Los espermatóforos recolectados cada día fueron asignados al azar a los distintos tratamientos. La mitad de las muestras fueron asignadas para fertilizar a las hembras y la otra mitad para su traslado a las instalaciones del CICESE, en Ensenada, Baja California donde se llevaría a cabo la verificación de la calidad de esperma criopreservado .
Para la descongelación, los crioviales fueron extraídos del tanque de nitrógeno líquido y cada muestra fue rápidamente sumergida en un baño de agua a aproximadamente a 37 °C durante 6 segundos. Posteriormente se colocaron por 15-25 minutos en la solución de equilibrio (0.25-0.5 M de trehalosa) y se almacenaron a temperatura ambiente hasta su uso en la fertilización artificial o evaluación de viabilidad. Tanto la fertilización como la evaluación de viabilidad en microscopio de luz fueron llevadas a cabo en instalaciones de Maricultura del Pacífico, S.A. de C.V. La verificación de la viabilidad utilizando sondas fluorescentes e histología fue realizada en las instalaciones del Subsistema de Recursos Genéticos Acuáticos (SUBNARGENA) ubicado en el CICESE. Para llevar a cabo la fertilización, las muestras descongeladas fueron suspendidas en la solución extensora descrita en el paso a) del protocolo de la presente invención y su viabilidad evaluada. Diez muestras de esperma por tratamiento fueron asignadas para la inseminación artificial de 10 hembras listas para ovular. El único tratamiento que produjo nauplios después de la inseminación artificial fue el tratamiento B (Trehalosa 0.25-0.5 M y DMSO al 10-15%) .
Por otra parte, de las muestras trasladadas al CICESE, siete de ellas fueron utilizadas para valorar su viabilidad. Las muestras descongeladas fueron transferidas a un tubo que contenia 1 mL de solución extensora para ser disgregadas con un homogeneizador de tejidos por 30 segundos. Una vez realizada la suspensión, las células fueron teñidas con el kit de tinción para espermatozoides Live/Dead (Life Technologies, Eugene, OR, USA) de la siguiente forma: 5 μL del colorante SYBR 14 fue agregado a un mililitro de la suspensión de células (concentración final 100 nM) y fueron incubadas por 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente (23°C) ; posteriormente, se agregaron 5 μL del colorante yoduro de propidio (YP, concentración final 12μΜ) dejándose incubar por otros 10 minutos en la oscuridad y a temperatura ambiente. Una vez terminada la tinción, una alícuota de 20 μL fue colocada en un porta objetos y las células fueron visualizadas en un microscopio de fluorescencia (Nikon Elipse 80i), con un filtro de excitación azul para fluorescencia verde. Las células teñidas con el colorante SYBR 14 (verde) fueron consideradas como células con membrana celular intacta mientras que las células teñidas con YP (rojo) fueron consideradas células con membrana celular dañada. Se evaluaron un total de 100 células por laminilla y al finalizar se determinó el porcentaje de células con membrana celular intacta, presentando las muestras tratadas un porcentaje de 100% de células con la membrana celular intacta, según la histología.
Tres muestras de esperma descongeladas y equilibradas fueron cuidadosamente envueltas en papel de arroz por separado y cada una colocada dentro de un cásete de histología para ser fijadas por aproximadamente 48 horas en solución Davidson modificada. Posteriormente, las muestras fueron deshidratadas en tren de alcoholes, incluidas en parafina, cortadas (8 mieras de espesor) y teñidas con Hematoxilina/Eosina . Las laminillas fueron observadas en un microscopio de luz y las características morfológicas de los espermatozoides fueron evaluadas. Tras su análisis histológico, no se observaron diferencias en la estructura de los espermatozoides entre las muestras descongeladas provenientes de los tratamientos B, C y las muestras frescas sin tratar (Figuras 1 a 3) . El resto de los tratamientos no mostraron presencia de espermatozoides.
Para la valoración de viabilidad mediante observación con microscopio óptico, las muestras de esperma en la solución de equilibrio (trehalosa 0.25-0.5 M por 15 a 20 min) , fueron homogenizadas con 1.5 mL de solución extensora. Una alícuota de 20 i fue examinada con un aumento de 400X después de haber teñido las alícuotas con nigrosina al 10% y se procedió a evaluar y registrar los cambios morfológicos presentes. Aquellos espermas que mantuvieron las características morfológicas intactas (cuerpos esféricos y espinas completas) fueron considerados viables en tanto que aquellos con cuerpos celulares irregulares o espinas deformes o ausentes fueron considerados no viables. Para determinar el porcentaje de viabilidad se contaron 100 espermatozoides, por triplicado, en por lo menos cinco campos de visión por lámina examinada, encontrándose en todos los casos un porcentaje de 100% de viabilidad.
Los resultados antes mencionados, muestran que con el protocolo de la presente invención se puede mantener la viabilidad de la masa celular de muestras biológicas de alta viscosidad sin afectar sus propiedades morfológicas originales; asimismo, el protocolo de la presente invención permite conservar la funcionalidad de las células criopreservadas .
La presente invención se ha descrito de acuerdo a una modalidad preferida; sin embargo, será aparente para un técnico con conocimientos medios en la materia, que podrán hacerse modificaciones a la invención, sin apartarse de su espíritu y alcance.

Claims

RE IVI DICACIONES
1. - Un protocolo para la criopreservación de muestras biológicas de alta viscosidad caracterizado porque comprende los pasos de:
a) colocar una muestra de material biológico de alta viscosidad, en un tubo o criovial que contiene una solución extensora acuosa por un periodo de tiempo de entre 18 a 22 minutos a una temperatura de 21 a 25 °C sin que la muestra entre en contacto con la solución ni con las paredes del tubo ;
b) sumergir la muestra en trehalosa al 0.25-0.5M por un periodo de tiempo de entre 18 a 22 minutos;
c) transferir la muestra a una solución crioprotectora/vitrificante que comprende 0.25-0.5 M de
Trehalosa y 10-16 % de DMSO en solución extensora, sumergiendo solo 2/3 de la misma por un periodo de tiempo de entre 2 a 4 minutos;
d) sacar la muestra de la solución crioprotectora y sumergirla inmediatamente en nitrógeno liquido y;
e) colocar la muestra en un criovial y almacenarla definitivamente en nitrógeno liquido a una temperatura entre -196 °C a - 200°C.
2. - El protocolo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la solución extensora comprende 2.125 g/kg de NaCl, 0.110 g/kg de KC1, 0.052 g/kg de H3B04, 0.019 g/kg de NaOH, 0.484 g/kg de MgS04*7H20 y 20 μΐ de una solución que contiene 10000 UI de penicilina, 10 mg de estreptomicina y 25μg de anfotericina B.
3.- El protocolo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende descongelar la muestra extrayéndola del nitrógeno liquido y sumergiéndola en un baño de agua a una temperatura de 35°C a 39°C por un periodo de tiempo de 4 a 9 minutos, para posteriormente sacarla del criovial y colocarla por un periodo de tiempo de 15-25 minutos en una solución de equilibrio que contiene 0.25 M de trehalosa .
4. - El protocolo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque las muestras biológicas de alta viscosidad son muestras espermáticas de invertebrados.
5. - El protocolo de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque las muestras espermáticas de invertebrados son de crustáceos o insectos.
6. - El protocolo de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque las muestras espermáticas de crustáceos son espermatóforos de camarón.
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