KR20040031101A - 테일러-메이드 다관능 줄기세포 및 그의 이용 - Google Patents

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타카시 타다
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Abstract

본 발명은 면역적 거부반응을 야기시키지 않고 난세포를 재료로 사용하지 않으며 질병을 처치하기 위해 도너에 의해 얻어진 세포, 조직 및 장기를 효율적으로 확립하는 것을 과제로 한다. 그 과제는 원하는 게놈을 지닌 다기능성 줄기세포를 제공하는 것에 의해 해결된다. 이 세포는 재프로그램화 인자를 작용하는 것 MHC 결손 줄기세포-체세포 융합 세포를 제조하는 것과 줄기세포-체세포의 융합 세포의 제조 후 레트로바이러스 등에 의해 유전자 조작을 하는 것에 의해 줄기세포 유래 게놈을 제어하는 것이 달성된다.

Description

테일러-메이드 다관능 줄기세포 및 그의 이용{TAILOR-MADE MULTIFUNCTIONAL STEM CELLS AND UTILIZATION THEREOF}
ES세포는 초기의 배아로부터 유도된 신속히 증식하는 미분화 모든 관능성 세포이고, 배아성 종양세포와 유사한 성질을 나타낸다. ES세포는 최초 마우스 배반포의 내부 세포궤(Inner cell mass; ICM)를 마우스 섬유화세포의 피더(feeder)세포층위에서 배양하는 것에 의해 확립되었다. ES세포는 피더 세포층 및/또는 백혈병 저해 인자(LIF)의 존재하에 미분화의 상태를 유지하는 것과 같은 조건하에서 무한의 수명을 지닌다[R. Williams et al., Nature 336:684-687(1988)]. 한편, 높은 인 비트로 분화기능을 지니고 집합궤로써 배양하는 것만에 의해 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 것이 알려져 있다. ES세포는 착상전의 단계의 배아(embryo)에 의해 확립되고 외배엽(ectoderm), 중배엽(mesoderm) 및 내배엽(endoderm)의 3배엽 유래의 여러 종의 세포형으로 분화하는 다분화 기능을 지닌 세포이다[M. J. Evans and M. H. Kaufman. Nature 292:154-156(1981); G. R. Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78:7634-7638(1981)]. 더욱 상세히는 ES세포는 어덜트의 어느 성숙된 세포로 분화하는 능력을 지니고 있으며, 예를 들면 정상적인 초기의 배아중에 도입된 키메라 배아를 형성시키는 것에 의해 키메라 동물의 체세포 및 생식세포의 모두를 분화시키는 것이 가능하다[R. L. Brinster, J. Exp. Med. 140:1949-1956(1974): A. Bradley et al., Nature 309: 255-256(1984)]. 정자 및 난자등의 생식세포에 ES세포 유래의 세포가 도입된 키메라 동물을 서로 교배하는 것에 의해 ES세포 유래의 세포만으로 구성된 자손을 얻는 것이 가능하다. 이것은 유전학적으로 충분히 제어되는 인위적인 소지를 지닌 동물을 획득하는 것이 가능하다는 것이다. 이와 같은 동물에 의해 인 비트로에서 뿐만 아니라 개체 레벨에 있어서도 발생 및 분화의 메카니즘에 관한 연구가 가능한 것이다. ES세포는 배아성 종양세포와는 달리 그의 다수가 이배체의 형태(diploid karyotype)를 보지하는 정상세포이고, 키메라 형성율이 높고 생식계열의 세포에 분화하는 가능성도 높은 것이다[A. Bredley et al.,Nature 309:255-256(1986)]. 발생학 분야 이외에도 ES세포의 이용분야는 넓어지고 있다.
ES세포는 특히 세포 연구 및 세포 분화를 결정하는 유전자 연구에 중요한 역할을 하고 있다. 예를 들면, 서열이 알려진 유전자의 기능해석을 위해 마우스 ES세포는 유전적 변화를 도입시켜 유전자를 파괴시킨 마우스 세포주의 생산에 이용할 수 있는 것이다. 미분화 ES세포의 사용은 인간 게놈 해독후의 기능해석 작업에 있어서 매우 효율적이고 유효한 것이다. 또한, ES세포는 인 비트로에 있어서 넓은 범위로 각종의 세포형으로의 분화시키는 것이 가능하기 때문에 배아 발생의 경우의 세포분화 기구를 연구하기 위하여 사용할 수 있는 것이다. ES세포를 성장인자의 첨가 또는 배양체(germ layer)를 형성하는 것에 의해 조혈세포, 심근 및 여러 종의 뉴론(neuron)등에 임상적으로 유용한 세포로의 분화를 촉진시키는 것도 가능하다[M. Wiles et al., Development 111:259-267(1991); W. Miller-Hance et al., J.Biol. Chem. 268:25244-25252(1993); V.A.Maltsev et al., Mech. Dev. 44:41-50(1993); G. Bain et al., Dev. Biol. 168:342-357(1995)]. 유용한 세포로의 분화시킨 마우스 ES세포에 관한 유도실험은 조혈세포, 심근, 특이적 뉴론 및 혈관의 제조에 있어서 성공하고 있다[T. Nakano et al., Science 265: 1098-1101(1994); R. Pacacios et al., Proc. Nat al. Acad. Sci. USA 92:7530-7534(1995): V. A. Maltsev et al., Mech. Dev. 44:41-50(1993); S. H. Lee et al., Nat. Biotechnol. 18:675-679(1999); H.Kawasaki et al., Neuron 28:31-40(2000); S. -I.Nishikawa, Development 125:1747-1757(1998); M. Hirashima et al., Blood 93:1253-1263(1999)].
현재 햄스터[Doetshman T. et al., Dev. Biol. 127:224-227(1988)], 피그[Evans M. J. et al., Theriogenology 33:125128(1990): Piedrahita J. A. et al., Theriogenology 34: 879-891(1990); Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. 40:51-56(1990); Talbot N. C. et al., Cell. Dev. Biol. 29A:546-554(1993)], 쉬프(sheep)[Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. Suppl. 43:255-260(1991)], 보바인(bovine)[Evans M. J. et al., Theriogenology 33:125-128(1990); Saito S. et al., Roux. Arch. Dev. Biol. 201:134-141(1992)], 밍크[Sukoyan M. A. et al., Mol. Record. Dev. 33:418-431(1993)], 래빗[일본PCT특허공개 2000-508919호] 및 래수스 몽키(rhesus monkey), 마모세트(marmoset)와 같은 영장류[Thomson J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844-7848(1995); Thomson J. A. et al., Biol. Reprod. 55:254-259(1996)]등의 ES세포가 확립되어 있다. 인간 ES세포도 확립되어 있고, 이것은 마우스 ES세포와 유사한 분화능력을 나타낸다[J. A. Thomson et al., Science 282:1145-1147(1998); J. A. Thomson et al., Dev. Biol. 38:133-165(1998); B. E. Reubinoff et al., Nat. Biotechnol. 18:399-404(2000)]. 특히 마우스 ES세포를 사용하여 얻어진 분화유도 조절에 있어서 축적시켜 확대된 지식을 적용하는 것에 의해 인간 ES세포가 심근경색, 파킨슨씨병, 당뇨병 및 백혈병을 포함한 다수의 질병에 있어서 이식 치료용의 각종의 세포조직의 무한 재료로 되고 이식 치료에 있어서 도너 부족 문제를 해소할 수 있는 것으로 기대된다. 2000년 6월 23일 호주, 미국, 독일에 의해 세 개의 연구팀이 국제 줄기세포 생물 심포지움에서 인간 ES세포로부터 신경세포 및 근육세포등을 초기에 만들 수 있는 것이 성공되었다고 보고되었다. 또한 최근 인간 ES세포로부터의 조혈세포를 분화시키는 방법에 있어서도 보고되고 있다. 그러나, 이식 치료에 있어서 ES세포를 사용하는 경우에도 현재의 장기 이식과 동일한 면역적 거부반응이 발생하는 문제가 남아있는 것이다.
살아있는 조직의 이식은 여러 가지 이유로 행하여지고 있다. 장기 이식에 의해 흠결이 있는 기능을 보충하고 예를 들면 신장과 같은 주요 장기에 치명적인 질환을 치료할 수 있다. 동일한 개체에서 다른 부위에 이식하는 경우 이것을 자가 이식이라 칭하고, 자가 이식의 경우 거부반응이 없다. 일란성 쌍둥이 및 가까운 계통의 동물간의 이식을 동계 이식이라고 칭한다. 이 경우에도 이식된 부분은 숙주에서 생존한다. 동종간의 이식을 동종 이식이라 칭하고 거부반응에 대한 특별한 처리를 하지 않는 경우 이식부분은 거부반응을 일으킨다. 또한, 다른 종속간의 이식을 이종 이식이라 하고 이식된 부분은 숙주에 의해 빠르게 파괴된다.
이식부분의 거부반응을 초래하는 인자는 이식항원 또는 조직적합성 항원이라 칭한다. 적혈구를 제외한 체세포는 이식항원을 지니고 있다. 적혈구는 독자의 혈액형(ABO) 항원을 지닌다. 주요한 인간 이식 항원은 주요 조직 적합항원 또는 HLA(인간 백혈구 그룹 A)로 칭한다. 제 6 염색체의 유전자에 의해 지배된다. HLA항원은거부반응의 표적인 클래스 Ⅰ 항원 및 거부반응의 초기에 역할을 하는 클래스 Ⅱ 항원의 두 개의 군으로 분류된다. 클래스Ⅰ항원은 모든 조직에 존재하지만 클래스 Ⅱ 항원은 모든 조직에 존재하지는 않고, 마크로파지와 같은 세포에 존재하는 손가락 모양의 돌기를 지니는 수상세포(dendritic cell)에서 다수 발현되고 있다. 거부 반응이 시작됨에 따라 이와 같은 세포를 장기이식 조직으로부터 제거하는 실험에 있어서는 실험적으로는 성공한 예가 있으나 실용에는 현재까지 임상적으로는 응용되고 있지 않다.
이식 후에 발생되는 거부반응은 초급성 거부반응, 촉진형 급성거부반응, 급성 거부반응, 만성 거부반응으로 분류할 수 있다. 초급성 거부반응은 리시피언트의 혈청중에 도너의 HLA항원에 반응하는 기존 항체가 존재할 때 발생한다. 혈관 결합이 종료되고 장기에의 혈류를 재개시킨 후 수 시간 이내에 발생하는 격렬한 거부반응으로 이식 장기는 직접적으로 손상되는 것이다. 현재 치료법은 없고 이식 전에 임파구 교차 시험을 행하고 리시피언트 혈청 중에 도너 임파구에 반응하는 항체를 지니는 것으로 인정되는 경우 이와 같은 이식을 포기하여 예방함으로써 방지할 수 있다. 촉진형 급성 거부반응은 도너의 HLA항원에 반응성의 T 임파구가 이식 전에 리시피언트의 체내에 존재하는 경우에 발현된다. 이식 후 7일 이내에 증상이 발생하는 경우가 많다. 초급성 거부반응과 같이 격렬한 거부반응이기 때문에 최근에 치료약의 진보에 따라 치료하는 것이 가능할 수 있다. 급성 거부반응은 이식된 장기의 도너HLA 항원에 의해 특히 T 임파구에 의해 세포성 면역반응이 돌기된 결과 나타나는 것이다. 이식 후에 이러한 거부반응은 통상 이식후 2주 내지 1개월 이내에 발생하는 것으로 인지된다. 만성 거부반응은 임상적으로는 치료에 대항하여 서서히 진행되는 장기 기능의 저하를 특징으로 하고, 대부분은 이식 후 6개월 내지 1년을 경과하여 발생한다. 기본적으로는 도너 HLA항원의 침입에 의해 활성화된 리시피언트의 면역반응에 기인하여 이식장기의 조직 장애를 유발하는 것이다. 이것에 대응하는 장기 조직의 반응에 의해 장기간에 걸쳐 진행되어 조직 변성을 유발시키고 있다. 리시피언트와 동일한 MHC 분자구조의 장기를 이식하지 않는 한 이와 같은 거부반응이 야기된다. 현재로서는 이와 같은 거부반응을 컨트롤하는 것이 중대한 과제이다.
상기한 바와 같은 거부반응을 일으키지 않기 위한 면역 억제방법으로는 크게 나누어 면역 억제제에 의한 것, 외과적 수술, 방사선 조사등을 열거할 수 있다. 또한, 면역 억제제로서는 특히 부신피질 스테로이드 약, 싸이클로스포린, FK 506 등이다. 부신피질 스테로이드 약은 순환성 T 세포의 수를 감소시키고 임파구의 핵산 대사, 사이토카인 생산을 저해하는 기능을 억제한다. 마크로파지의 이동 및 대사를 억제시켜 면역 반응을 억제하는 것이다. 싸이클로스포린 및 FK 506 의 작용은 유사하고 T 헬퍼 셀의 표면에 있는 수용체와 결합하여 세포 내에 진입시 DNA에 직접 작용하여 인터루이틴 2의 생산을 저해한다. 최종적으로는 T 킬러 셀이 기능하지 않게 되고 면역 억제 작용이 나타나는 것이다. 이와 같은 면역 억제제의 사용에 있어서는 부작용이 문제가 된다. 스테로이드는 특히 부작용이 많다. 한편, 싸이클로스포린은 간장, 신장에 대한 독성이 있다. 또한, FK 506은 신장에 대한 독성을 지닌다.다음으로 외과적 수술로서는 예를 들면 임파절 적출, 비장 적출, 흉선(thymus)등을 열거할 수 있으나 이러한 수술법은 그 결과가 충분히 입증되고 있지 않다. 외과적 수술중에도 흉관은 순환하고 있는 임파구를 체외에 배출시키는 것으로 그 효과는 입증되었으나 대량의 혈청, 단백질과 지방의 유출을 야기시키고 영양 장애를 일으키는 문제가 있다. 방사선 조사는 전신 조사와 이식편 조사가 있고 효과가 불확실하고 리시피언트에 대한 부담이 크기 때문에 전술한 면역 억제제와의 병용에 의한 이용을 하고 있다. 상술한 어느 방법도 거부 반응의 방지에 이상적인 것은 아니다.
현재, 핵을 제거시킨 난세포 액의 체세포 핵의 도입에 의해 체세포 핵이 모든 기능을 재 프로그램화 시킨 포유동물에서 나타나는 클론 쉬프, 클론 보바인, 클론 마우스 및 클론 피그등이 조작되고 있다. [Wilmut I. et al., Nature 385:810-813(1997); Kato Y. et al., Science 282: 2095-2098(1998); Wakayama T. et al., Nature 394:369-374(1998); Onishi A. et al., Science 289:1188-1190(2000); Polejaeva I. A. et al., Nature 407:86-90(2000)]. 그 기술을 이용하여 이식을 받는 숙주 유래의 채세포의 핵을 난세포를 사용하여 재프로그램화시키고, 모든 기능의 세포를 조작하는 것에 의해 면역적 거부반응을 야기시키지 않는 이식편을 제조하는 것이 가능하다고 여겨진다. 또한 이와 같은 세포 배양방법으로는 도너 부족의 문제도 해결할 수 있는 것으로 사료된다.
그러나 인간 치료용 클로닝은 생물의학적 윤리문제로 불리우는 사회문제를유발하는 것이다(Welssman, I. L., N Engl J Med 346, 1576-1579. (2002)). 상술한 방법에는 난세포를 사용하는 필요에 관한 물리적인 관점에서 문제가 있는 것이다. 또한 인간에 있어서는 ES 세포는 초기 배아의 미분화된 세포에 유래하고 있으며 성인의 초기 배아는 존재하지 않고 있는 현실을 고려하여도 초기 배아에 의해 그 후의 상태 특히 성인인 숙주로부터 ES 세포를 수립할 수 없다는 원리적인 문제가 있다. 따라서 개인에 대응시킨 ES 세포에 의한 다관능 줄기세포를 얻는 것은 달성되기 어렵고 해당분야에서 해결하여야 하는 과제인 것이다.
(발명이 해결하고자 하는 과제)
본 발명은 개인 대응형의 다기능성 줄기세포를 간편하게 입수하는 것을 과제로 한다. 더욱 상세하게는 본 발명은 면역적 거부반응을 야기시키지 않고 ES 세포 등의 줄기세포를 각각 개인으로부터 취출시켜 수립하는 것으로 난세포를 재료로 하지 않고 질병을 치료하기 위하여 도너로부터 얻어진 세포, 조직 및 장기를 효율적으로 확립하는 것을 과제로 한다.
(발명의 요지)
본 발명자는 여러 가지 방법을 사용하여 치료 처치의 대상과 같은 객체가 소망하는 개체유래 게놈을 지닌 면역 거부 반응이 저하된 다관능성을 지닌 줄기세포를 예상외로 조립하는 것을 성공함에 따라 그 과제를 해결한 것이다.
처음에는 본 발명자들은 줄기세포(예를 들면 ES 세포)와 체세포를 융합시킨 4배체 세포를 조립하고 상기 세포가 인 비보 및 인 비트로에서 증식되는 것인가를 밝히고 또한 체세포 핵이 재프로그램화시켜 다분화 기능을 지니는 것을 입증하였다. 본 발명에서는 이와 같은 4배체 세포에 있어서 숙주 중에 면역적 거부 반응을 야기시키는 줄기세포(예를 들면 ES 세포) 유래인자, 즉 줄기세포 유래의 이식 항원의 일부 또는 전부를 발현시키지 않는 줄기세포(예를 들면 ES 세포)를 개인 대응형 다기능성 줄기세포 조립시에 이용하는 것이다.
상기와 같은 줄기세포(예를 들면 ES 세포) 유래의 이식 항원의 일부 또는 전부를 발현시키지 않는 줄기세포를 개인 대응형 다기능성 줄기세포는 예를 들면 이식 항원의 일부 또는 전부(특히 주요 조직 적합성 항원)를 결손시킨 줄기세포(예를 들면 ES 세포)를 체세포와 융합시키는 것에 의해 달성하는 것이다. 이 경우 줄기세포 유래의 이식 항원은 개인 대응형 다기능성 줄기세포로부터 감소 또는 제거되어 이식 거부 반응은 현저하게 감소되는 것이다.
상기 줄기세포(예를 들면 ES 세포) 유래의 이식 항원의 일부 또는 전부를 발현하지 않는 ES 세포를 개인 대응형 다기능성 줄기세포는 예를 들면 줄기세포(예를 들면 ES 세포)와 체세포를 융합시킨 후, 줄기세포(예를 들면 ES 세포) 유래의 게놈을 유전자 조작에 의해 제거하는 것에 의해 달성된다. 이 경우 줄기세포 유래의 게놈이 융합으로부터 완전히 제거되어 얻어지고 거부 반응이 전혀 없는 완전한 개인 대응형 다기능성 줄기세포를 얻을 수 있는 것이다.
더욱이 줄기세포(예를 들면 ES 세포) 유래의 재프로그램화 인자를 예상 밖으로 동정하는 것에 의해 이 재프로그램화 인자를 사용하여 원하는 게놈을 지닌 세포(예를 들면 체세포)에 다기능성을 부여하는 것에 의해 다기능성 줄기세포를 조립하는데 성공한 것이다. 이 경우에도 원하는 게놈 이외의 유전자를 지니지 않고 거부 반응이 없는 완전한 개인 대응형 다기능성 줄기세포를 얻을 수 있다.
이 융합세포 또는 재프로그램화된 체세포 등의 원하는 게놈을 지닌 다기능성 줄기세포로부터 분화된 세포. 조직 및 장기는 리시피언트에 도입하는 경우 줄기세포(예를 들면 ES 세포) 유래의 이식 항원의 전부를 지니는 세포 유래의 것과 비하여 리시피언트에 있어서 얻어진 거부 반응이 감소 또는 완전히 제거되는 것이다. 즉 본 발명의 다기능성 줄기세포는 질병을 지료하기 위해 도너가 되는 세포, 조직 및 장기를 확립하기 위한 이상적인 재료로 간주된다. 이 세포 조직 및 장기는 테일러-메이드형 의료에 있어서 여러 가지로 적용할 수 있고 그 산업상 이용성이 높은 것이다.
본 발명은 구체적으로는 다음과 같은 것을 제공하는 것이다.
1. 원하는 게놈을 지닌 분리된 다기능성 줄기세포
2. ES 세포가 아닌 1항에 기재된 다기능성 줄기세포
3. 이식 항원의 적어도 일부가 결실된 제 1항에 기재된 다기능성 줄기세포
4. 이식 항원의 전부가 결실된 제 1항에 기재된 다기능성 줄기세포
5. 상기 이식 항원의 적어도 주요 조직 적합 항원을 포함하는 제 3항에 기재된 다기능성 줄기세포
6. 상기 주요 조직 적합 항원은 클래스Ⅰ 항원을 포함하는 제 5항에 기재된 다기능성 줄기세포
7. 상기 게놈은 재프로그램화된 것인 제 1항에 기재된 다기능성 줄기세포
8. 세포를 재프로그램화된 것에 의해 제작한 제 1항에 기재된 다기능성 줄기세포
9. 상기 세포는 체세포인 제 8항에 기재된 다기능성 줄기세포
10. 줄기세포와 체세포를 융합하여 제조된 제 1항에 기재된 다기능성 줄기세포
11. 상기 줄기세포는 ES 세포인 제 10항에 기재된 다기능성 줄기세포
12. 상기 줄기세포는 조직 줄기세포인 제 10항에 기재된 다기능성 줄기세포
13. 원하는 개체 유래의 게놈을 지닌 원하는 개체의 ES 세포도 난세포도 아닌 제 1항에 기재된 다기능성 줄기세포
14. 원하는 개체 체세포 유래의 염색체를 지닌 제 1항에 기재된 다기능성 줄기세포
15. 배아에 직접 유래되지 않는 제 1항에 기재된 다기능성 줄기세포
16. 체세포 유래의 제 1항에 기재된 다기능성 줄기세포
17. 원하는 개체 이외의 이식 항원이 감소된 제 1항에 기재된 다기능성 줄기세포
18. 원하는 개체의 난세포 이외의 체세포 유래의 제 1항에 기재된 다기능성 줄기세포
19. 상기 원하는 게놈은 초기 배아 이외의 상태의 개체의 것인 제 1항에 기재된 다기능성 줄기세포
20. 이식 항원의 일부 또는 전부를 결실시킨 ES 세포와 체세포와의 미분화된 체세포 융합 세포인 제 1항에 기재된 다기능성 줄기세포
21. 이식 항원의 전부가 결실된 ES 세포와 체세포와의 미분화한 체세포 융합 세포인 제 1항에 기재된 다기능성 줄기세포
22. 상기 이식 항원은 주요 조직 적합 항원인 제 20항에 기재된 다기능성 줄기세포
23. 상기 주요 조직 적합 항원은 클래스Ⅰ 항원인 제 22항에 기재된 다기능성 줄기세포
24. 상기 체세포는 이식 세포 유래의 임파구, 비장 세포 또는 정소 유래의 세포인 제 20항에 기재된 다기능성 줄기세포
25. 상기 ES 세포 및 상기 체세포의 적어도 하나는 인간 유래 세포인 제 20항에 기재된 다기능성 줄기세포
26. 상기 체세포는 인간 유래 세포인 제 20항에 기재된 다기능성 줄기세포
27. 상기 체세포 및 상기 간세포의 적어도 하나는 유전자 변이시킨 것인 제 20항에 기재된 다기능성 줄기세포
28. 원하는 게놈을 지닌 다기능성 줄기세포를 생산하는 방법에 있어서, ⅰ)상기 줄기세포에 있어서 이식 항원의 일부 또는 전부를 결실시키는 단계; 및 ⅱ) 줄기세포와 상기 원하는 게놈을 지닌 체세포를 융합하는 단계로 구성된 생산방법
29. 상기 줄기세포는 ES 세포인 제 28항에 기재된 방법
30. 상기 ES 세포는 확립된 ES 세포인 제 29항에 기재된 방법
31. 상기 이식 항원은 주요 조직 적합 항원인 제 28항에 기재된 방법
32. 상기 주요 조직 적합 항원은 클래스Ⅰ 항원인 제 31항에 기재된 방법
33. 상기 체세포는 이식 개체 유래의 임파구, 비장세포 또는 정소 유래의 세포인 제 28항에 기재된 방법
34. 상기 줄기세포 및 상기 체세포의 적어도 하나는 인간 유래의 세포인 제 28항에 기재된 방법
35. 상기 이식 항원을 전부 결실시키는 단계를 포함하는 제 28항에 기재된 방법
36. 원하는 게놈을 지니는 다관능성 줄기세포를 생산하는 방법에 있어서, ⅰ) 원하는 게놈을 지니는 세포를 제공하는 단계; 및 ⅱ) 상기 세포를 재프로그램화 인자를 함유하는 조성물에 노출시키는 단계를 포함하는 방법
37. 상기 세포는 체세포인 제 36항에 기재된 방법
38. 상기 재프로그램화 인자는 히스톤 H3 Lys4 메틸화시켜 직접 또는 간접으로 관련된 세포 주기 조절인자, DNA 헬리카제, 히스톤 아세틸레이팅 에이전트 및 전사인자로 구성된 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 인자에 의해 제조되는 제 36항에 기재된 방법
39. 원하는 게놈을 지니는 다기능성 줄기세포로부터 분화된 세포, 조직 또는 장기
40. 상기 세포는 근육세포, 연골세포, 상피세포 또는 신경세포인 제 39항 기재의 세포
41. 상기 조직은 근육, 연골, 상피 또는 신경인 제 39항에 기재된 조직
42. 상기 장기는 뇌, 척수, 심장, 간장, 신장, 위, 장 및 췌장으로부터 구성된 군에서 선택된 것인 제 39항 기재의 장기
43. 상기 세포, 조직 또는 장기는 이식하기 위해 사용되는 것인 제 39항에 기재된 세포, 조직 또는 장기
44. 상기 원하는 게놈은 이식하려는 숙주와 실질적으로 동일한 것인 제 39항에 기재된 세포, 조직 또는 장기
45. 원하는 게놈을 지닌 다기능성 줄기세포로부터 분화된 세포, 조직 또는 장기를 포함하는 의약
46. 피검체에 관한 세포 조직 또는 장기의 손상에 의한 질환 또는 장애를 처치 또는 예방하기 위한 의약에 있어서, 상기 피검체와 실질적으로 동일한 게놈을지닌 다기능성 줄기세포를 포함하는 의약
47. 피검체에 관한 세포 조직 또는 장기의 손상에 의한 질환 또는 장애를 처치 또는 예방하기 위한 방법에 있어서, 상기 피검체와 실질적으로 동일한 게놈을 지니는 다기능성 줄기세포를 제조하는 단계; 상기 다기능성 줄기세포로부터 상기 세포, 조직 또는 장기를 분화하는 단계; 및 상기 세포 조직 또는 장기를 상기 피검체에 투여하는 단계로 구성된 방법
48. 피검체에 관한 세포 조직 또는 장기의 손상에 의한 질환 또는 장애를 처치 또는 예방하기 위한 방법에 있어서, 상기 피검체와 실질적으로 동일한 게놈을 지니는 다관능성 줄기세포를 피검체에 투여하는 공정을 더욱 포함하는 방법
49. 피검체에 관한 세포 조직 또는 장기의 손상에 의한 질환 또는 장애를 처치 또는 예방하기 위한 방법에 있어서, 상기 피검체와 실질적으로 동일한 게놈을 지니는 다관능성 줄기세포로부터 분화된 세포, 조직 또는 장기를 포함하는 의약을 상기 피검체에 투여하는 단계를 더욱 포함하는 방법
50. 피검체에 관한 세포 조직 또는 장기의 손상에 의한 질환 또는 장애를 처치 또는 예방하기 위하여 의약을 제조하기 위해 다기능성 줄기세포의 사용에 있어서, 상기 의약은 상기 피검체와 실질적으로 동일한 게놈을 지니는 다기능성 줄기세포를 포함하는 다기능성 줄기세포의 사용
51. 피검체에 관한 세포 조직 또는 장기의 손상에 의한 질환 또는 장애를 처치 또는 예방하기 위하여 의약을 제조하기 위해 다기능성 줄기세포의 사용에 있어서, 상기 의약은 상기 피검체와 실질적으로 동일한 게놈을 지니는 다기능성 줄기세포로부터 분화된 세포, 조직 또는 장기를 포함하는 다기능성 줄기세포의 사용
52. 원하는 게놈을 지닌 다기능성 줄기세포를 포함하는 의약을 제조하기 위한 다기능성 줄기세포의 사용
53. 원하는 게놈을 지닌 다기능성 줄기세포로부터 분화된 세포, 조직 또는 장기를 포함하는 의약을 제조하기 위한 다기능성 줄기세포의 사용
54. 히스톤 H3 Lys4 메틸화 효소 또는 메틸화에 관련된 인자, 세포 주기 조절인자, DNA 헬리카제, 히스톤 아세틸레이팅 에이전트 및 전사인자로 구성된 군에서 선택된 재프로그램화 인자
55. 상기 인자는 전사인자 Sp1 또는 Sp3 또는 그의 보조인자인 제 54항에 기재된 재프로그램화 인자
본 발명은 개인에 대응하는 테일러-메이드 다관능성 줄기세포에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 ES 세포를 직접 사용하지 않고 다관능성 줄기세포 및 그 이용에 관한 것이다. 본 발명은 배아성 줄기세포(이하 본 발명에서는 ES세포라 칭함) 유래의 이식 항원의 일부 또는 전부를 결실시켜 된 관능성 줄기세포의 제조방법, 상세히는 그의 융합세포로부터 체세포 유래의 주요 조직 적합 항원만을 발현하는 세포, 조직 또는 장기를 분화시키는 것을 포함하는 세포, 조직 또는 장기의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 체세포 유래의 주요 조직 적합 항원만을 발현하는 다관능성 줄기세포, 및 세포, 조직 및 장기에 관한 것이다.
도 1은 ES 융합 세포 중의 흉선 세포유래 Tcr beta , Tcr delta , Tcr gamma 및 IgH 유전자의 DNA 재배열을 나타내는 PCR 분석결과를 나타낸 사진이다. (a)∼(d)의 사진은 각각 다음 영역에 대한 특이적인 프라이머 세트를 사용한 PCR 분석결과이다. (a) Tcr beta 의 D-J역영, (b) IgH의 D-J영역, (c) Tcr delta 의 V-J영역, (d) Tcr gamma 의 V-J영역. 사용된 DNA 재료는 다음을 통한 것이다: T; (Rosa26 X Oct4-GFP) F1 마우스의 흉선세포 유래, ES; ES 세포 유래; lambda /HindIII DNA 및 100bp 래더 DNA의 마커 혼합물, 1∼7; ES 하이브리드 클론 유래
도 2는 ES 융합 세포 중의 흉선세포 유래 X 염색체의 재활성화를 나타낸 사진이다. (a) ES 융합 세포 중의 X 염색체 복제제의 타이밍의 R 분염분석결과를 나타낸 것이다. ES 융합 세포에는 3본의 X 염색체(암컷 흉선세포에 의한 2본의 염색체, 그것의 수컷 ES 세포에 의한 1본의 X 염색체)가 적색 및 녹색으로 검출되고 활성을 나타내었다. (a)에 있어서 동시에 복제하는 3본의 염색체가 (c)에 확대시킨 것을 나타낸 것이다. 암컷 체세포 중의 X 염색체((b)를 화살표시로 나타낸다) 및 Y 염색체((a) 중)는 균일하게 적색으로 염색되고 불활성인 것으로 나타난다. (d) Xist RNA는 수컷 ES 세포의 활성 X 염색체 위에 반점 상의 적색 시그널로써 검출된데 반해 크고 빨간 시그널로써 암컷 흉선세포의 불활성화 X 염색체는 전체적으로 염색된다. 따라서 두 개의 ES 하이브리드 세포 중(ESXT1 및 ESXT2)에 각 핵에 있어서 3개의 반점상의 빨간 시그널이 검출된다.
도 3은 ES 세포 중의 재활성화를 나타낸 현미경 사진이다. ES 융합세포의 제작에 사용된(Rosa26 X Oct4-GFP) F1 마우스 흉선(a, b) 및 난소(c, d)의 GFP 형광상, 및 밝은 시아상이다. (e) 융합 이후의 콜로니의 밝은 시아상이고 화살표시는 (f)에 의해 나타내는 GFP 양성 콜로니를 나타낸다. (f) 융합 이후의 GFP 형광상이다. 작은 GFP 양성 콜로니가 비발현 ES 세포 콜로니의 세로에 출현하고 있다. 양성 콜로니 사진을 상부에 확대하여 나타낸다. (g)(h)에 있어서 밝은 시아상이다. (h) G418 선택 후의 콜로니에 의한 확장된 GFP 양성 세포에 대한 사진이다.
도 4는 인 비보에서 ES 융합세포의 발달능력을 나타낸 도면 및 사진이다. (a) ES 융합세포 및 키메라 배아의 제조방법을 모식적으로 나타낸 도면이다. (b) ES 융합세포의 E7.5 키메라 배아의 beta -갈락토시다제 활성 염색의 결과를 나타낸 사진이다. 융합세포 유래의 세포는 청색으로 나타낸다. (c) E7.5 키메라 배아를 가로 방향으로 절단시킨 절편에 있어서 조직학적 분석을 행한 결과를 나타낸 사진이다. (d, e)에 의해 고배율의 키메라 배아 절편의 사진이다. Ect;외배엽 Mes;중배엽 End;내배엽.
도 5는 ES 하이브리드 및 ES X EG 융합세포 중의 H19 유전자 및 Igf2r 유전자의 메틸화에 의한 분석에 관련된 도면과 또한 그 분석결과의 사진이다. (a)는 H19 유전자, (b) 및 (c)는 Igf2r 유전자에 있어서 분석결과를 나타낸다. 화살표는 메틸화 DNA 단편을 지적하고 Ｏ는 메틸화되지 않은 유전자 단편을 나타낸다. 실험방법의 요약을 (c)에 나타낸다. 각 부호의 표시는 다음과 같다. : T; 흉선세포, ES/T; ES 및 흉선세포 DNA의 1:1 혼합물, ES/EG; ES 및 EG DNA의 1:1 혼합물, ESXT; ES 세포 및 Rosa26 흉선세포의 ES 하이브리드 클론
도 6은 테라토마형성 및 키메라 배아의 제조에 있어서의 모식도이고 또한 키메라 배아 및 테라토마의 현미경 사진이다.
도 7은 ES 세포와 성체 임파구와의 사이에 융합세포의 특징 및 다기능성을 표시한 도면이다. 융합세포 유래 테라토마의 파라핀 절편에 대해 다음과 같이 나타낸다. :(A) domesticus(dom) ES 세포 및 molossinus(mol) 흉선세포와의 사이에 아종간의 융합세포의 분화의 실험 스킴; (B) 4배체 융합세포 클론 HxJ-18의 대표적인 유개분열 중기 모습; (C) Tcr beta 및 IgH 유전자의 D-J DNA 배열예의 게놈 PCR 분석 및 ; (D) 이하의 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 조직 특이적 마커 단백질의 발현: 클래스 III beta 튜블린(TuJ), 뉴로필라멘트M(NF-M), 알부민(Alb) 및 데스민(Des). 절편은 헤모톡실린 및 에오신(HE)에 대비 염색된다.
도 8은 융합 세포의 외배엽, 중배엽 및 내배엽에의 유도물에 대한 체세포 게놈 특이적인 RT-PCR 산물을 나타낸 것이다. (A) 미분화 및 분화된 HxH-17 및 HxJ-18의 융합 클론에 있어서 다음을 사용하여 행한다. : 외배엽성 Pitx3, 중배엽성 MyoD, Myf-5 및 데스민 등에 내배엽성 알부민 및 alpha -페토프로테인 e18.5 배아는 컨트롤로써 사용된다. (B) 재프로그램화된 체세포 게놈으로부터 외배엽성 Pitx3의 전사물: domesticus(dom) ES 게놈에 있어서 mRNA의 구아닌 잔기는 molossinus(mol) 체세포 게놈에 있어서 구아닌 잔기로 치환시킨다. (C) 재프로그램화된 체세포 게놈으로부터 내배엽성 알부민 전사물: domesticus형의 RT-PCR 산물은 단일 NcoI 소화 부위를 지니며, molossinus형의 산물은 두 개의 NcoI 부위를 지닌다. (D) 재프로그램화된 게놈으로부터 중배엽성 MyoD 전사물: domesticus형RT-PCR 산물은 BssHI 소화에 감수성을 지니고 한편 molossinus의 산물은 BssHi소화에 감수성이 없다.
도 9는 PA6 피더 세포에 있어서 인 비트로에서 융합세포의 신경분화 유도를 나타낸 것이다. (A) 숙주 molossinus MP4 ES 세포로부터 분화된 대조군으로써의 신경세포 TuJ(적); 유계분열 후 뉴론 특이적 마커 단백질 및 Ecad(녹색); 줄기세포 특이적 마커. (B) MxR-3 융합세포로부터 분화된 신경세포 대부분의 콜로니는 도파민 생산 뉴론에 특이적인 TH 항체(적) 및 신경세포에 특이적인 마커인 NF-M(녹색)을 사용하여 양성으로 면역반응시킨다. (C) TH 양성 뉴론으로부터 분화유도는 유효한 재현성을 지닌다. (D) 유도 후 11일 경에 융합세포로부터 인 비트로에서 분화시킨 신경세포에 있어서, 신경세포 특이적 유전자의 발현: 네스틴(신경상피 줄기세포 특이적 마커 및 NF-M(유계분열 후의 뉴론 특이적 마커). 도파민 생산 뉴론 특이적 마커로써는Nurr1,TH및Pitx3의 발현은 신경분화 유도 후의 융합세포 유도물 중에 있어서 전사된다. 컨트롤의 PA6에는 시그널이 나타나지 않았다. (E) 재프로그램화된 체세포 게놈으로부터의 Pitx3(TH의 전사 활성화 인자)의 발현. domesticus(dom) 게놈에 있어서 구아닌 잔기는 molossinus(mol) 게놈에 있어서 아데닌 잔기로 변환된다.
도 10은 마우스 뇌에 있어서 융합세포 유래의 TH 양성 뉴런 이식편을 나타낸다. (A) 도 3B, C, D 및 E에서 특징으로 하고 있는 것은 MxR-3 세포유래의 신경세포의 마우스 뇌의 선조체(striatum)에의 이식 (B) 마우스 뇌에 있어서 TH를 발현하는 융합세포 유래의 뉴런 1acZ/neo 레포터 유전자를 지닌 MxR-3 융합세포 유래의 신경세포는 LacZ 항체에 양성으로 검출된다(녹색). lacZ 항체 및 TH 항체에의 이중 염색에 의해 융합세포 유래의 뉴런이 TH(적색)를 발현하는 것을 나타낸다. 확대도에 있어서 lacZ 및 TH의 이중 양성세포는 황색의 세포로써 가시화된다. (C)(B)에 있어서 (C)영역에서의 고해상 도면이다. LacZ 양성의 융합세포 유도체(녹색)는 주사부위에 있어서 TH(적색)를 발현한다. 확대도에 있어서 LacZ 및 TH의 이중 양성세포는 황색의 세포로써 가시화된다.
도 11은 재프로그램화의 모식도를 나타낸 것이다.
도 12는 MHC 결실 ES 세포-체세포 융합세포의 제작을 나타내는 모식도이다.
도 13은 게놈 결실 ES 세포-체세포 융합세포의 제작을 나타내는 모식도이다.
도 14는 도 13의 모식도에 있어서 사용되는 Insulator-PolymeraseII Promotor-GFP-LoxP-Insulator의 구조를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 설명한다. 본 명세서의 전부에서 단수형의 관사(예를 들면 영어의 경우「a」,「an」,「the」등, 독어의 경우「ein」,「der」,「das」,「die」등과 이의 격변화형, 불어의 경우「un」,「une」,「le」,「la」등과 스페인어의 경우「un」,「una」,「el」,「la」등이고 다른 언어에 대해서는 대응하는 관사, 형용사 등)는 특히 언급하지 않은 경우 그 복수형의 개념을 포함하는 것을 이해하면 된다. 한편 본 명세서에 사용되는 용어는 특히 언급하지 않은 경우 해당분야의 통상 사용되고 있는 의미로 사용한 것으로 이해하면 되는 것이다.
(용어의 설명)
이하 본 명세서에 있어서 사용되는 용어를 설명한다.
본 명세서에 있어서 사용하는 '세포'는 해당분야에 있어서 사용하는 가장 넓은 의미의 것과 같은 것으로 정의되고, 다세포 생물의 조직구성 단위이고 외부를 격리하는 막구조를 포함하며 내부에 자기 재생능력을 지니고 유전정보 및 그 발현기구를 지니는 생명체를 칭한다. 본 명세서에 있어서 사용되는 세포는 천연에 존재하는 세포와 인공적으로 변이시킨 세포(예를 들면 융합세포, 유전자 변이세포) 등도 포함한다.
본 명세서에 있어서 '줄기세포'는 자기복제 기능을 지니고 다분화 기능(즉다기능성)(「pluripotency」)을 지니는 세포를 의미한다. 줄기세포는 통상 조직이 손상받을 경우에 그 조직을 재생하는 것이 가능하다. 본 명세서에는 줄기세포는 ES 세포 또는 조직 줄기세포(조직 특이적 줄기세포 또는 체성 줄기세포라 칭함)인 것으로 한정하는 것은 아니다. 한편 앞에서 설명한 능력을 지닌 인공적으로 제조된 세포(예를 들면 본 명세서에 있어서 기재된 융합세포, 재프로그램화된 세포 등)도 줄기세포인 것으로 간주된다. ES 세포는 초기 배아에 유래하는 다기능성 줄기세포를 말한다. ES 세포는 1981년 초에 발견되었고 1989년 이후 녹아웃마우스 제작에도 응용되고 있다. 1998년에는 인간 ES 세포가 확립되었고 재생의학에 이용되고 있다. 조직 줄기세포는 ES 세포와는 다른 것이다. 분화의 방향이 한정되고 있는 세포이고 조직 중의 특정 위치에 존재하며 미분화된 세포내 구조물을 지니고 있다. 따라서 조직 줄기세포는 다기능성의 수준이 낮다. 조직 줄기세포는 핵/세포질 비가 높고, 세포내 소기관이 적다. 조직 줄기세포는 대체로 다분화 기능을 지니고 세포 주기가 길고 개체의 일생 이상에 증식능을 유지한다. 본 명세서에 있어서 사용되는 경우는 줄기세포는 바람직하게는 ES 세포인 것이고 상황에 따라 조직 줄기세포도 사용한다.
유래하는 부위에 의해 분류하면 조직 줄기세포는 예를 들면 피부계, 소화계, 골수계, 신경계 등으로 나눌 수 있다. 피부계의 조직 줄기세포로써는 표피 줄기세포, 모근 줄기세포 등을 들 수 있다. 소화기계의 조직 줄기세포로써는 췌장 줄기세포, 간 줄기세포 등을 들 수 있다. 골수계 조직 줄기세포로써는 조혈 줄기세포, 간엽계 줄기세포 등을 들 수 있다. 신경계의 조직 줄기세포로써는 신경 줄기세포, 망막 줄기세포 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 '체세포'는 난자 정자 등의 생식세포 이외의 세포이다. 그 DNA를 다음 세대에 직접 인도하지 않는 세포를 말한다. 체세포는 통상 다기능성이 한정되어 있거나 소실되어 있다. 본 명세서에 있어서 사용하는 체세포는 천연에 존재하는 것도 좋고 유전자를 변이시킨 것도 가능하다.
세포는 유래에 의해 외배엽, 중배엽 및 내배엽에 유래하는 줄기세포로 분류할 수 있다. 외배엽 유래의 세포는 주로 뇌에 존재하고 신경 줄기세포 등을 포함하고 있다. 중배엽 유래의 세포는 주로 골수에 존재하고 혈관 줄기세포, 조혈 줄기세포 및 간엽계 줄기세포 등을 포함한다. 내배엽 유래의 세포는 주로 장기에 존재하고 간 줄기세포, 췌장 줄기세포 등을 포함한다. 본 명세서에서는 체세포는 배아 유래세포인 것이 좋고 바람직하게는 체세포는 임파구, 췌장 세포 또는 정소 유래의 세포가 사용된다.
본 명세서에 있어서 '분리된'은 통상의 환경에 있어서 천연에 부수된 물질이 적어도 감소하거나 바람직하게는 실질적으로 포함하지 않는 것이다. 따라서 분리된 세포는 천연의 환경에 있어서 부수된 다른 물질(예를 들면 다른 세포, 단백질, 핵산 등)을 실질적으로 포함하지 않는 세포이다. 핵산 또는 폴리펩타이드의 경우'분리된'은 예를 들면 유전자 조작에 따라 DNA를 조립하여 제조한 경우에는 세포물질 또는 배양배지를 실질적으로 포함하지 않는 것이다. 화학 합성된 경우에는 전구체 화학물질 또는 기타 화학물질을 실질적으로 포함하지 않는 핵산 또는 폴리펩타이드를 칭한다. 분리된 핵산은 바람직하게는 상기 핵산 유래의 생물에 있어서 천연의 핵산과 인접하고 있는(flanking) 서열(즉 상기 핵산의 5' 말단 및 3' 말단에 위치하는 서열)을 포함하지 않는다.
본 명세서에 있어서 '수립된' 또는 '확립된' 세포는 특정의 성질(예를 들면 다분화 기능)을 유지하고 또한 세포가 배양조건 하에서 안정하게 증식 유지되는 상태를 말한다. 그러므로 수립된 줄기세포는 다분화 기능을 유지한다. 본 발명에서 수립된 줄기세포를 사용하는 것은 숙주로부터 새로운 줄기세포를 채취하는 단계를 회피하는 것이 바람직하다.
본 명세서에 있어서 '비배아성'은 초기 배아에 직접 유래하지 않는 것을 말한다. 따라서 초기 배아 이외의 신체 부분에 유래하는 세포가 이것에 해당한다. ES 세포의 개변(예를 들면 유전적 개변, 융합 등)을 가하여 얻어지는 세포도 비배아성 세포의 범위 내에 있다.
본 명세서에 있어서 '분화된 세포'는 기능 및 형태가 특수화시킨 세포(예를 들면 근세포, 신경세포 등)를 칭한다. 줄기세포와는 다르게 다기능성은 없거나줄어든 것이다. 분화된 세포로써는 예를 들면 표피세포, 췌장실질세포, 췌관세포, 간세포, 혈액세포, 심근세포, 평활근세포, 골아세포, 골격근아세포, 신경세포, 혈관내피세포, 색소세포, 평활근세포, 지방세포, 골세포, 연골세포 등을 들 수 있다. 따라서 본 발명의 하나의 실시태양에 있어서 이 분화 세포를 본 발명의 재프로그램화 인자로 처리하는 것이 바람직하고 다기능성을 획득하는 것이 가능한 경우 이러한 분화세포 또는 본 발명에 관한 체세포로써 그것에 대해 사용할 수 있다.
본 명세서에 있어서 '분화' 또는 '세포분화'는 한 개의 세포분열에 의해 유래된 자세포 집단 중에 형태적 및/또는 기능적으로 질적인 차이를 지니는 2개 이상 형태의 세포가 생성되는 현상을 말한다. 따라서 원래 특별한 특징을 검출할 수 없는 세포에 유래하는 세포집단(세포계보)이 특정의 단백질을 생산하는 특징을 나타내기까지의 과정도 분화에 포함된다. 현재에는 세포분화를 게놈 중의 특정 유전자군이 발현되는 상태로 간주하는 것이 일반적이다. 이와 같은 유전자 발현 상태를 세포 내에 있거나 세포 외의 인자 또는 조건을 탐색하는 것에 의해 세포분화를 동정하는 것이 가능하다. 세포분화의 결과는 원칙으로써 안정화되고 특히 동물세포는 별개의 종류의 세포로 분화하는 것은 예외적이므로 야기되지 않는다. 따라서 본 발명에 있어서는 후천적으로 생성된 다기능성 세포는 대단한 가치를 지닌 것이다.
본 명세서에 있어서 '다기능성' 또는 '다분화기능'은 호환 가능한 용어이다.세포의 성질을 말하며 하나 이상 바람직하게는 둘 이상의 각종의 조직 또는 장기에 분화시켜 얻어지는 능력을 말한다. 따라서 '다기능성' 및 '다분화기능'은 본 발명에 있어서 특별하게 언급하지 않는 한 '미분화'와 호환 가능하게 사용된다. 통상 세포의 다기능성은 발생이 진전됨에 따라 제한되고 성체에 있어서는 하나의 조직 또는 장기의 구성세포는 그 세포가 변화하는 것은 지극히 적다. 따라서 다기성은 통상 소실된다. 그러나 상피성 세포는 다른 상피성 세포로 변화할 수 있다. 이러한 변형이 발생하는 경우 통상은 병적인 상태이고 생화(metaplasia)로 칭한다. 그러나 간엽계 세포에는 비교적 단순한 자극으로 다른 간엽성 세포로의 생화를 야기하는 것이 가능하고 다기능성의 정도가 높은 것이다. ES 세포는 다기능성을 지닌다. 조직 줄기세포는 다기능성을 지닌다. 본 명세서에 있어서 다기능성의 용어는 수정란과 같이 생체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화하는 능력을 지니는 전기능성으로 칭할 수 있다. 다기능성은 전기능성의 개념을 포함하는 것이다. 이 세포와 다기능성을 지니는 지 여부는 예를 들면 체외 배양계에 있어서 배아양체(Embryoid body)의 형성, 분화 유도 조건 하에서의 배양 등을 열거할 수 있는 것으로 이것에 한정되는 것은 아니다. 한편 생체를 사용한 다기능성의 유무에 관한 에세이법으로써는 면역부전 마우스에의 이식에 의한 기형종(테라토마)의 형성, 배반포에의 주입에 의한 키메라배의 형성, 생체조직에의 이식, 복수에의 주입에 의한 이식 등을 열거할 수 있으며 이들에 한정하는 것은 아니다.
본 발명에서 사용하는 세포는 어느 생물 유래의 세포(예를 들면 임의의 종류의 다세포 생물, 동물(특히 척추동물, 무척추동물), 식물(예를 들면 단자엽식물, 쌍자엽식물 등))도 좋다. 바람직하게는 척추동물(예를 들면 메구라우나기류, 야시메우나기류, 연골어류, 경골어류, 양생류, 파충류, 조류, 포유동물 등) 유래의 세포가 사용되고 더욱 바람직하게는 포유동물(예를 들면 단공류, 유대류, 빈치류, 피익류, 익수류, 식육류, 식충류, 장비류, 기제류, 우제류, 관치류, 유인류, 해우류, 구찌라목, 영장목, 설치류, 우세기목 등) 유래의 세포를 사용한다. 더욱 바람직하게는 영장류(예를 들면 침팬지, 일본 마사크, 인간) 유래의 세포를 사용한다. 가장 바람직하게로는 인간 유래의 세포를 사용하는 것이다.
본 발명의 대상으로써 장기는 어느 장기라도 좋다. 또한 본 발명의 대상으로써 조직 또는 세포는 생물 등의 장기 또는 기관에 유래하는 것이면 된다. 본 명세서에 있어서 '장기' 또는 '기관'은 호환 가능하게 사용하며 생물 개체가 지닌 기능이 개체 내의 특정 부위에 지니는 것을 칭하고 이러한 부위는 형태적으로 독립성을 지닌 구조체를 칭한다. 일반적으로 다세포 생물(동물, 식물)에는 기관은 특정의 공간적 배치를 지니고 있고 조직으로부터 나온다. 조직은 다수의 세포로부터 나온다. 이와 같이 장기 또는 기관으로써는 혈관계에 관련된 장기 또는 기관을 열거할 수 있다. 하나의 실시태양에서 본 발명의 대상이 되는 장기는 피부, 혈관, 각막, 신장, 심장, 간장, 웅비리컬코드, 장, 신경, 폐, 태반, 췌장, 뇌, 사지말초, 망막 등을 열거할 수 있으며 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에 있어서 본 발명의 다기능성 세포로부터 분화된 세포로써는 표피세포, 췌장실질세포, 췌관세포, 간세포, 혈액세포, 심근세포, 골결근세포, 골아세포, 골격근아세포, 신경세포, 혈관내피세포, 색소세포, 평활근세포, 지방세포, 골세포, 연골세포 등을 열거할 수 있으며 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 있어서 '조직'은 다세포생물에 있어서 실질적으로 동일한 기능 및/또는 형태를 지니는 세포집단을 말한다. 통상 '조직'은 동일한 기원을 지니고 서로 다른 기원을 지닌 집단에서도 동일 기능 및/또는 형태를 지닌다면 조직이라 칭한다. 따라서 본 발명의 줄기세포에 사용되는 조직을 재생하는 경우 둘 이상의 다른 기원을 지닌 세포집단이 하나의 조직을 구성하여 얻어진다. 통상 조직은 장기의 일부를 구성한다. 동물 조직은 형태적 기능적 또는 발생적 근거에 기하여 상피조직, 결합조직, 근육조직, 신경조직 등으로 구별된다. 식물에는 구성세포의 발달단계에 따라 분열 조직과 영구조직으로 크게 나누고 구성세포의 종류에 따라 단일 조직과 복합 조직으로 나누고 있으며 이러한 분류가 행해지고 있다.
본 명세서에 있어서 '단백질', '폴리펩타이드' 및 '펩타이드'는 호환적으로 사용하고 일련의 아미노산으로부터 된 고분자를 칭한다.
본 명세서에 있어서 '아미노산'은 천연 또는 비천연의 것도 바람직하다. '유도체 아미노산' 또는 '아미노산'아날로그'는 천연에 존재하는 아미노산과 다른 것으로 아미노산과 동일한 기능을 지닌 것을 말한다. 이와 같은 유도체 아미노산및 아미노산 아날로그는 해당 분야에 있어서 알려져 있다. 용어 '천연 아미노산'은 천연 아미노산의 L- 이성체를 의미한다. 천연의 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 세린, 메티오닌, 트레오닌, 페닐알리닌, 타이로신, 트로프토판, 시스테인, 프롤린, 히스티딘, 아스파트산, 아스파라긴, 글루타민산, 글루타민, 감마-카르복시글루타민산, 아르기닌, 오르니틴 및 리신 등이다. 특별히 한정하지 않는 한 본 명세서에 사용되는 모든 아미노산은 L-이성체이다. 용어 '비천연 아미노산'은 단백질 중에서 통상 천연에 나타나지 않는 아미노산을 의미한다. 비천연 아미노산의 예로써는 노르루신. 파라-니트로페닐알라틴, 호모페닐알라닌, 파라-플루오로페닐알라닌, 3-아미노-2-벤질프로피온산, D 또는 L-호모 아르기닌 및 D-페닐알라닌 등이다. 여기서 사용된 '아미노산 아날로그'는 아미노산은 아니고 아미노산의 물성 및/또는 기능을 지닌 유사한 분자를 말한다. 아미노산 아날로그는 예를 들면 에티오닌, 카나바닌, 2-메틸글루타민 등을 들 수 있다. 아미노산 모방물은 아미노산의 일반적인 화학구조와는 다른 것으로 천연에 존재하는 아미노산과 동일한 양식으로 기능하는 화합물을 칭한다.
본 명세서에 있어서 사용되는 분자생물학적 수법, 생화학적 수법, 미생물학적 수법은 해당 분야에 있어서 이미 알려져 사용되고 있는 것으로 예를 들면 Maniatis, T. et al.(1989). Molecular Clining: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 3rd Ed. (2001); Ausubel, F.M. (1987). Current protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel,F.M. (1989). Short protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub, Associates and Wiley-Interscience; Sambrook, J. et. al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor; Innis, M.A. (1990). PCR protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F.M. (1992). Short Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F.M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M.A. et al. (1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F.M. (1999) Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J.J et al. (1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press 별책 실험의학 '유전자 도입 및 발현 해석 실험법' 요도사(1997) 등에 기재되어 있다. 이러한 본 명세서에 있어서 관련된 부분 또는 전부는 참고하여 원용한 것이다.
본 명세서에 있어서 '생물학적 활성'은 그 인자(예를 들면 폴리펩타이드 또는 단백질)가 생체 내에 있어서 지니는 얻어진 활성을 의미한다. 각각의 기능을 발휘하는 활성을 포함한다. 예를 들면 이 인자가 효소인 경우 그 생물학적 활성은 그 효소활성을 포함한다. 그 인자가 재프로그램화인자인 경우 그 생물학적 활성은 재프로그램화 활성을 포함한다.
본 명세서에 있어서 '개변체'는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 등의 물질에 대해 일부를 변경시킨 것을 말한다. 이와 같은 개변체로써는 치환 개변체, 부가 개변체, 결실 개변체, 단축(truncated) 개별체, 대립(allele) 유전자 변이체 등을 열거할 수 있다. 대립 유전자는 동일 유전자 자리에 속하고 서로 구별되는 유전적 개변체를 말한다. 따라서 '대립 유전자 개변체'는 이 유전자에 대해 대립 유전자에 관련된 개변체를 말한다. '동상동체(homolog)'는 종 속에 있는 유전자와 아미노산 레벨 또는 뉴클레오타이드 레벨에서 상동성(바람직하게는 60% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상의 상동성)을 지니는 것을 말한다. 이와 같은 동상동체를 취득하는 방법은 본 명세서에 기재된 것으로부터 명백히 알 수 있다. 이와 같은 본 발명에 있어서 사용되는 세포는 개변시킨 핵산 또는 폴리펩타이드를 함유하는 것도 바람직하다.
벡터의 도입 방법으로써는 세포에 DNA를 도입하는 방법이라면 사용할 수 있고 예를 들면 트렌스팩션, 형질도입, 형질전환 등을 열거할 수 있다(예를 들면 엘렉트로포레이션법, 파티클건(유전자총)을 사용하는 방법 등).
본 명세서에 있어서 유전자에 관해 언급하는 경우 '벡터' 또는 '조립 벡터'는 목적 폴리뉴클레오타이드 배열을 세포에 도입하기 위한 벡터를 말한다. 이와같은 벡터로써는 원핵세포, 효모, 동물세포, 식물세포, 곤충세포, 동물개체 및 식물개체 등의 숙주세포에 있어서 자기 복제가 가능하거나 염색체 중에 조립 가능한 것으로 본 발명의 폴리뉴틀레오타이드의 전사에 적정한 위치에 프로모터를 함유하는 것도 예시할 수 있다.
원핵세포에 대하여 '조립된 벡터'로써는 pBTrp2, pBTac1, pBTac2(예를 들면 Roche Molecular Biochemicals로 시판), pKK233-2(Pharmacia), pSE280(Invitrogen), pGEMEX-1[Promega], pQE-8(Q1AGEN), pKYP10(일본 특개소58-110600호), pKYP200[Agric. Bio]. Chem., 48,669(1984)], pLSA1[Agric. Bio]. Chem., 53,277(1989)], pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306(1985)], pBluescript II SK+(Stratagene), pBluescript II SK(-)(Stratagene), pTrs30(FERM BP-5407), pTrs32(FERM BP-5408), pGHA2(FERM BP-400), pGKA2(FERM B-6798), pTerm2(일본 특개평3-22979호, USP4,686,191, USP4,939,094, USP5,160,735), pGEX400[J. Bacteriol., 172, 2392(1990)], pGEX(Pharmacia), pET시스템(Novagen), pSupex, pUB110, pTP5, PC194, pTrxFus(Invitrogen), pMal-c2(New England Biolabs), pUC19[Gene, 33, 103(1985)], pSTV28(다카라), pUC118(다카라), pPA1(일본 특개소63-233798호)등에 예시되어 있다.
효모세포에 대해서는 '조립 벡터'로써 YEp13(ATCC-37115), YEp24(ATCC-37051), YCp50(ATCC-37419), pHS19, pHS15 등을 들 수 있다.
동물세포에 관해서는 '조립 벡터'로써 pcDNA I/Amp, pcDNA I, pCDM8(후나고시사에서 시판), pAGE107[일본 특개평3-229호(Invitrogen), pAGE103[J. Biochem., 101, 1307(1987)], pAMo, pAMoA[J. Biol. Chem., 268, 22782-22787(1993)], 마우스 줄기세포 바이러스(Murine Stem Cell Virus)(MSCV)에 의한 레트로 바이러스형 발현 벡터 등을 예시할 수 있다.
본 발명에 관해 사용된 '레트로 바이러스 벡터'로써는 예를 들면 Moloney Murine Leukemia Virus(MMLV), Murine Stem Cell Virus(MSCV) 등과 같은 레트로 바이러스형 벡터 등을 열거할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
식물세포에 관해 '조립 벡터'로써는 Ti 플라스미드, 타바코 모자익 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.
곤충세포에 관한 '조립 벡터'로써는 pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (Invitrogen에서 구입) 등을 예시할 수 있다.
'형질전화체'는 형질전환에 의해 제작된 세포 등의 생명체의 전부 또는 일부를 말한다. 형질전환체로써는 원핵세포, 효모, 동물세포, 식물세포, 곤충세포 등을 예시한다. 형질전환체는 그 대상에 의존하여 형질전환세포, 형질전환조직, 형질전환숙주 등으로 불리운다. 본 발명에 있어서 사용된 세포는 형질전환체가 바람직하다.
본 발명에 관한 유전자 조작 등에 있어서 원핵생물세포가 사용되는 경우 원핵세포로써는 Escherichia속, Serratia속, Bacillus속, Brevibacterium속, Corynebacterium속, Microbacterium속, Pseudomonas속 등의 원핵생물세포, 예를 들면 Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No. 49, Escherichia coli X3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli BL21(DE3), Escherichia coli BL21(DE3) pLysS, Escherichia coli HMS174(DE3), Escherichia coli HMS174(DE3)pLysS, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacterium ammoniahenes, Brevibacterium immariophilum (ATCC-14068), Brevibacterium saccharolyticum(ATCC-14066), Corynebacterium glutamicum(ATCC-13032), Corynebacterium glutamicum(ATCC-14067), Corybebacterium glutamicum(ATCC-13869), Corynebacterium acetoacidophilum (ATCC-13870), Microbacterium ammoniaphilum(ATCC-15354), Pseudomonas sp. D-0110 등을 예시한다.
본 명세서에 있어서 사용되는 경우 동물세포로써는 마우스 마이엘로마세포, 레트 마이엘로마세포, 마우스 하이브라도마세포, 차이니즈 햄스터 난소세포인 CHO세포, BHK세포, 아프리카 그린몽키 신장세포, 인간 백혈병 세포, HBT5637(일본 특개소63-2990호), 인간 결장암 세포주 등을 열거할 수 있다. 마우스 마이엘로마세포로써는 ps20, NSO 등을 레트 마이엘로마세포로써는 YB2/0 등을 인간 태아 신장 세포로써는 HEK293(ATCC: CRL-1573)등을 인간 백혈병 세포로는 BALL-1 등을 아프리카 그린몽키 신장 세포로는 COS-1, COS-7 등을 인간 결장암 세포주로써는 HCT-15 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 사용되는 경우 식물세포로써는 감자, 담배, 옥수수, 쌀, 크루시퍼, 대두, 토마토, 당근, 밀, 보리, 라이, 알팔파, 플렉스 등의 식물세포를 들 수 있다. 조립에 의한 벡터의 도입 방법으로는 식물세포에 DNA를 도입하는 방법이면 사용 가능하다. 예를 들면 Agrobacterium법(일본 특개소59-140885호, 일본 특개소60-70080호, WO94/00977), 엘렉트로포레이션법(일본 특개소60-251887호), 파티클건(유전자총)법을 사용하는 방법(특허 제2,606,856호, 특허 제2,517,813호) 등을 예시한다.
본 발명에 있어서 사용하는 경우 곤충세포로서는 Spodoptera frugiperda 난소세포, Trichoplusia ni 난소세포, 실크웜 난소유래의 배양세포 등을 사용할 수 있다. Spodoptera frugiperda의 난소세포로서는 Sf9, Sf21(Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual)등 이고, Trichoplusia ni 난소세포로서는 High 5, BTI-TN-5B1-4(Invitrogen)등 이고, 실크웜 난소유래의 배양세포로서는 Bombyx mori N4등을 예시할 수 있다.
본 명세서에 있어서 사용하는 경우 조립된 벡터에 도입방법으로서는 DNA를 도입하는 방법을 사용하는 것이라면 어느 것도 사용할 수 있다. 예를 들면, 염화칼슘법, 엘렉트로포레이션법[Methods. Enzymol., 194,182(1990)], 라이포펙션법, 스페로플라스트법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,1929(1978)], 리튬아세테이트법 [J. Bacteriol., 153, 163(1983)] 및 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929(1978)에 기재된 방법등을 예시할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 레트로바이러스의 감염방법은 예를 들면 Current Protocols in Molecular Biology 에 나타난, 특히 유니트 9.9-9.14 등에 기재된 바와 같이 해당 분야에 이미 알려져 있고, 예를 들면 트립신나이즈된 ES세포를 단일세포현탁물(single-cell suspension)로 만든 후, 바이러스 생산세포(packaging cell lines)의 배양 상등액과 함께 1 ~ 2시간 동시배양(co-culture) 하는 것에 의해 충분량의 감염세포를 얻을 수 있다.
본 명세서에 있어서 사용되는 게놈 또는 유전자 자리등을 제거하는 방법으로 사용하는 것으로는, Cre효소의 일시적인 발현, 염색체 상에서의 DNA 매핑등은 세포공학 별책실험 프로토콜 시리즈(FISH 실험 프로토콜 인간 게놈 해석으로부터 염색체 유전자 진단까지) 마쓰바라 겐이치, 요시가와 히로시, 감수 슈준사(도쿄) 등이 기재된 바와 같이 해당분야에 있어서 이미 알려진 것이다.
본 명세서에 있어서, 유전자 발현(예를 들면, mRNA 발현, 폴리펩타이드 발현)의 '검출' 또는 '정량'은 예를 들면, mRNA 측정 및 면역학적 측정 방법을 포함하는 적절한 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 분자생물학적 측정 방법으로는 예를 들면, 노던 블라팅법, 도트 블라팅법 또는 PCR법 등을 예시한다. 면역학적 측정 방법으로는 예를 들면, 마이크로타이터 플레이트를 사용하는 ELISA 법, RIA 법, 형광항체법, 웨스턴 블라팅법, 면역조직염색법등을 들 수 있다. 또한, 정량방법으로는 ELISA법 또는 RIA법 등을 예시한다.
'발현량' 으로는 목적세포등에 있어서 폴리펩타이드 또는 mRNA가 발현되는 양을 칭한다. 이와 같은 발현량으로는 본 발명 항체를 사용하는 ELISA법, RIA법, 형광항체법, 웨스턴 블라팅법, 면역조직염색법등의 면역학적 측정방법을 포함하는 임의의 적절한 방법에 의해 평가된 본 발명 폴리펩타이드의 단백질 수준의 발현량, 또는 노던 블라팅법, 도트 블라팅법, PCR법 등의 분자 생물학적 측정방법을 포함하는 임의의 적절한 방법에 의해 평가된 본 발명의 폴리펩타이드의 mRNA 수준의 발현량을 들 수 있다. '발현량의 변화'로는 상기 면역학적 측정방법 또는 분자생물학적 측정방법을 포함하는 임의의 적절한 방법에 의해 평가된 본 발명의 폴리펩타이드의 단백질 수준 또는 mRNA 수준의 발현량이 증가하거나 감소하는 것을 의미한다.
본 명세서 중에서 '이식항원'은 미분화 체세포 융합세포 또는 상기 융합세포로부터 분화된 세포, 조직 및 장기 등을 특정의 개체에 도입하는 경우 도입된 개체 내에 있어서 이식 면역을 도입시켜 얻어진 항원 물질인 것이다. 이식 항원의 대부분은 공우성(codominant)형질로서 세포막 상에 발현하고 있는 바, 강한 거부반응을 야기한다. 항원 제시 분자에 있어 주요조직 적합항원(MHC)와 만성의 약한 거부반응을 유발시키는 부조직 적합항원의 두 종류로 크게 분류할 수 있다. 주요조직 적합항원계는 장기, 조직 및 세포의 동종이식 경우에 매우 강한 거부 반응을 유발시키는 동종 이계(異界) 항원계이다. 이 주요조직 적합항원을 지배하는 유전자군은 다수의 유전자 자리를 포함하는 복합체이고, 고도의 다형성을 지니고 주요조직 적합유전자복합체(MHC)라 칭한다. 인간에서는 제6염색체 단지 상에 인간백혈구항원(HLA), 마우스에서는 제17번 염색체 위에 H-2 유전자복합체가 이에 해당한다. MHC는 조사된 바에 의하면 모든 포유류, 조류에 한 개 존재하고, 인간 및 마우스 이외에는 레수스 몽키 RhL-A, 개의 DLA, 래트의 RT1 등이 알려져 있다. 인간의 MHC인 HLA항원은 모든 유핵세포에 발현하는 클래스 Ⅰ 항원과 마크로파지, B세포, 활성화 T세포, 수상세포 및 흉선상 P세포 등의 항원 제시 조직에서 발현하는 클래스 Ⅱ 항원이 있다. 클래스 Ⅰ 항원은 세포 내의 항원을 제시하는 것으로CD8 양성세포 장해성 T세포 수용체(CD8 + TCR)에 의해 인식된다. 한편, 클래스 Ⅱ 항원은 외래의 이물 유래의 항원으로 알려져 있고, CD4 양성 T 헬퍼 셀 수용체(CD4 + TCR)에 의해 인식된다. 한편, 부조직적합항원을 지배하는 유전자 자리는 단독의 유전자 자리이고, 다형성의 정도는 낮은 부조직적합유전자 자리(MIH)가 존재한다.
본 발명에 있어서는 다기능성 줄기세포의 제조에 제공되는 줄기세포(예를 들면, ES세포) 중의 이식 항원을 결실시킨 것에 의해 이식 개체에 대응하는 다기능성 줄기세포를 제조할 수 있는 것이다. 여기서 결실시킨 이식항원은 이미 설명한 주요조직적합항원 및 부조직적합항원의 모두를 포함하는 것이고, 그 일부도 전부도 좋다. 즉, 이 결실된 줄기세포(예를 들면, ES세포)를 사용하여 제조된 다기능성 줄기세포 또는 이 다기능성 줄기세포로부터 분화된 세포, 조직 또는 장기를 이식하는 경우에 레시피언트로부터 얻어지는 거부반응의 정도가 결실하는 것에 의해 감소되는 것이라면 특히 한정하지 않는다. 이중에서도 주요조직 적합항원이 본 발명에 있어서, 결실시킨 이식항원으로써 바람직하고 클래스 Ⅰ 항원이 특히 바람직하다. 이식 항원의 결실은 예를 들면, 이식 항원을 코딩하는 유전자를 삭제하는 것에 의해 달성될 수 있다. 유전자를 삭제하는 대표적인 방법으로는 상동 조환을 이용한 유전자 타게팅 [Mansour S.L. et al., Nature 336:348-352(1988); Capecchi M.R., TIG 5:70-76(1989); Valancius and Smithies, Mol. Cell. Biol. 11:1402-1408(1991); Hasty et al., Nature 350(6351)243-246(1991)]등의 기술을 열거할 수있다.
클래스 Ⅰ 및 클래스 Ⅱ MHC 항원은 각각 α 및 β의 두 개의 서브 유니트로부터 된 헤테로다이머이다. 본 발명의 이식 개체에 대응하는 다기능성 줄기세포는 예를 들면, 줄기세포(예를들면 ES세포) 유래의 MHC 항원의 서브 유니트를 적어도 1 카피, 바람직하게는 2 카피를 불활성화시킨 세포이다. 여기서, 불활성화의 대상이 되는 서브 유니트는 그 서브 유니트가 불활성화된 줄기세포(예를 들면 ES세포)를 체세포에 융합시킨 후, 체세포 유래의 서브 유니트에 의해 보충되는 것이 아닌 것, 즉, 융합세포로써 후에도 줄기세포(예를 들면 ES세포) 유래의 이식항원이 발현되지 않는 서브 유니트를 선택하는 필요가 있다.
이 불활성화는, 줄기세포(예를 들면 ES세포)유래의 MHC 항원의 서브 유니트를 코딩하는 유전자 또는 MHC 항원의 발현에 영향을 미치는 별도의 유전자를 삭제하는 것에 의해 얻어진다. MHC 항원의 발현에 영향을 미치는 유전자로서는 MHC 항원 발현을 조절하는 유전자, 예를 들면 MHC 항원에 의존적으로 조절하는 클래스 Ⅱ 형 유전자 위치중에 TAP1 , TAP2, LMP2 및 LMP7 유전자 등을 들 수 있다. 그 예로써, 줄기세포(예를 들면 ES세포)유래의 MHC 항원을 결실시켜 융합세포를 유전자 타게팅에 의해 작성하는 경우 이 줄기세포(예를 들면 ES세포)유래의 MHC 항원을 코딩하는 유전자의 일부가 상동조환(homologous recombination)에 의해 삭제 또는 장해를 주도록 배열하는 것을 포함한 타게팅 벡터를 구축한다. 이 벡터를 융합세포중에 엘렉트로포베이션, 칼슘침강 DNA, 융합, 트랜스펙션, 라이포펙션 등의 방법에 의해 도입하고 포유동물세포를 형질전환 시키는 방법은 예를 들면, Keown 등이 [Methods in Enzymology 185:527-537(1990)]에 의해 보고되고 있다. 형질전환시킨 세포의 선택은 예를 들면 유전자 타게팅을 행할 경우에 통상에 사용하고 있는 neo 또는 puro 등의 선택 마커를 목적 유전자의 결실 영역에 도입하고 유전자 타게팅을 시킨 세포에 그 선택 마커에 특이적인 약제를 선택할 수 있다. neo 또는 puro 등의 선택 마커 유전자 발현이 장래의 유전자 해석 및 의료 응용에 문제가 있는 경우에는 예를 들면 선택 마커 유전자를 Lox-P 배열로 좁힐 수 있고 유전자 타게팅된 세포에 Cre 유전자를 도입함으로써 일시적으로 Cre효소를 발현시키거나 세포공학적으로 선택 마커 유전자를 제거하는 방법을 사용할 수 있다. 이와 같은 방법에는 해당분야에 있어서 이미 알려진 것으로 본 명세서에 있어서 다르게 지적하지 않는 한 본 명세서에 인용된 문헌에 있어서 설명한 것이다. 형질전환시킨 세포는 그 세포가 분화하는 경우에 MHC 항원은 분화된 세포에 있어서 발현하기 때문에 세포의 표면위에 표적 MHC항원의 부재에 의해 선택할 수 있다. 선택방법으로는 예를 들면 보체와 함께 표적 MHC 항원의 에피토프에 대해 모노클로날 항체를 이용하고 이 항원을 지닌 세포를 죽일 수 있는 것이다. 또는 적당한 항체와 라이신 A 사슬, 아브린, 디프테리아 독소 등의 접합체를 사용하고 이 항원을 지닌 세포를 죽이는 것도 가능하다. 한편 보다 간편하게는 어피니티 크로마토그라피에 의해 표적항원을 포함한 세포를 제거하는 것도 바람직하다. 결과로써 얻어지는 세포는 그 표면위에 적어도 하나의 ES세포 유래의 MHC 항원이 제거되어 있다. 이와같은 세포 또는 세포로부터 유도된 세포 조직 또는 장기를 생체 내에 도입하는 경우 원래의 융합세포에 비해 줄기세포(예를 들면 ES세포)유래의 MHC 항원으로부터의 이식거부를 적게 받는 것이다.
본 명세서에 있어서 '재프로그램화'는 세포(예를 들면 체세포)에 작용하는 그 세포를 미분화한 상태에서 다기능성을 증가하거나 획득하는 것을 말한다. 따라서 재프로그램화의 활성은 그 인자를 분화시킨 세포(예를 들면 체세포)에 측정되는 양을 일정시간(예를 들면 수 시간정도) 노출시킨 후 다기능성을 측정한다. 노출전에 그 세포의 다기능성과 비교하여 의미 있는 차이가 발견되는지를 측정한다. 재프로그램화 수준은 여러 종이 존재하고 재프로그램화된 세포의 다기능성 수준에 대응한다. 따라서 전기능성의 줄기세포 유래 재프로그램화 인자를 사용하는 경우에는 재프로그램화는 전기능성에 대응하여 얻어지는 것이다.
본 명세서에 있어서 '재프로그램화 인자' 또는 '재프로그램화 되는 인자'는 세포에 작용하고 그 세포를 미분화세포화 하는 인자이다. 이하 실시예에 있어서 나타난 바와 같이 ES 세포는 체세포 핵의 임프린트를 재프로그램화 할 수 없지만 생식세포의 발달은 가능한 것처럼 체세포 핵의 에피제네틱 상태를 재프로그램화 시킨다. 따라서 ES 세포 중에 그와 같은 재프로그램화 인자를 포함하는 것은 명백하다. 한편 ES 세포 이외의 다른 줄기세포에서도 체세포를 재프로그램화 하는 인자가 있을 가능성은 있다. 본 발명의 재프로그램화 인자는 이와 같은 인자를 포함한다. 체세포에 작용하는 ES 세포 유래의 성분으로는 ES 세포중에 포함된 성분이면 특히 한정하지 않는다. 세포질 성분, 핵 성분등 각각의 RNA 및 단백질 등을 열거할 수 있다. 잡다한 분자를 포함하는 세포질 성분 또는 핵성분을 작용하는 경우 관용적인 수단에 의해(예를 들면 크로마토그라피 등) 그 분획을 취한다. 나누어진 각 획분을 체세포에 대해 작용하여도 좋다. 특정의 획분이 재프로그램화 인자를 포함하는 것으로 판명된 경우에는 획분으로부터 정제하여 최종적으로 하나의 분자로써 특정시키고 그것을 이용할 수도 있다. 선택적으로 재프로그램화 인자를 포함하는 획분을 그 자체로 특별한 정제 없이 체세포의 재프로그램화에 사용하는 것도 가능하다. 이때 재프로그램화 인자는 한 분자 단독으로 그 작용을 나타내는 경우에도 행할 수 있고 복수의 분자가 상호 작용에 의해 체세포를 미분화상태세포에로 변화시키는 것도 가능하다. 따라서 , 본 발명의 재프로그램화 인자는
단일분자인 인자, 복수분자인 인자 및 단일 또는 복수 분자를 포함하는 조성물을 포함하는 것이다.
본 발명의 재프로그램화 인자의 스크리닝 방법으로는 ES 세포 유래의 성분을 체세포에 접촉, 주입등의 수단에 의해 작용시키고 Oct4-GFP 마커 유전자의 발현, X염색체의 활성화등 재프로그램화 지표의 활용에 의해 작용을 검출하고 재프로그램 활성화를 지닌 성분을 선택하는 것을 행할 수 있다.
본 발명의 'ES 세포중에 포함된 재프로그램화 인자' 이미 설명한 스크리닝방법에 의해 스크리닝하고 취득할 수 있다. 재프로그램화 인자는 히스톤 H3-Lys4의 메틸화 효소 또는 메틸화에 관한 인자이다. 또한, 이와 같은 성분이 ES 세포 이외에(예를 들면 조직줄기세포) 에 포함되어 있는 가능성이 있고 한편 ES 세포로부터 전술한 방법에 따라 재프로그램화 인자가 특정되어진다면 이 재프로그램화 인자를 기초로 다른 재료로부터 재프로그램화 인자를 얻는 것도 제조하는 것도 가능하다. 예를 들면, 상기한 방법에 의해 얻어진 재프로그램화 인자가 RNA이면 그 RNA의 서열 결정을 항하고 동일한 서열 RNA를 주지의 방법에 따라 합성하는 것도 가능하다. 또한 재프로그램화 인자가 단백질인 경우에는 이 단백질에 대한 항체를 제작하고 항체에 결합성을 이용하여 기타 그와 같은 인자를 재료로부터 재프로그램화 인자를 취득하는 것도 가능하다. 선택적으로 이 단백질의 부분 아미노산 서열을 결정하고 상기 아미노산을 코딩하는 유전자와 하이브리다이즈 하는 프로브를 제작하고 하이브리다이즈 법에 의해 상기 단백질을 코딩하는 cDNA 및 게놈 DNA를 얻을 수 있다. 또한 프라이머 제조시 PCR법에 의해 그와 같은 유전자를 증폭시켜 취득하는 것도 얻을 수 있다. 이와 같은 방법을 포함하는 각종의 방법으로 얻어진 재프로그램화 인자를 코딩하는 유전자를 사용하여 주지의 유전자 조작수법에 따라 목적하는 재프로그램화 인자를 제조할 수 있다. 따라서 본 발명의 'ES세포'중에 포함된 재프로그램화 인자'는 ES세포로부터 얻어질 필요는 없고 다기능성을 지니는 세포(예를 들면 조직 줄기세포) 등 에서도 얻을 수 있다. 따라서 재프로그램화 인자는 체세포를 재프로그램화 시킬수 있는 모든 인자를 포함하는 것이다.
재프로그램화 인자를 스크리닝하는 방법으로는 적당한 체세포에 대해 ES세포 유래의 성분을 작용시켜 상기 성분이 체세포를 재프로그램화 시키는 활성을 측정하고 이에 따라 재프로그램 활성을 지닌 성분을 선별하는 것에 의해 이루어진다. 본 명세서에 있어서 사용되는 체세포로서는 임파구, 비장세포 또는 정소 유래의 세포 등을 들 수 있다. 특히, 이것들에 한정하는 것은 아니고 정상 염색체를 지닌 체세포이고 안정적으로 증식하는 것이라면 재프로그램화 인자의 작용에 의해 다분화 기능을 지닌 미분화 세포상태에서 변화하는 것이면 특히 한정하는 것은 아니다( 예를 들면 ES 세포 유래의 성분이 인간 유래인 경우 , 인간의 체세포). 이미 확립되어진 세포 주를 사용하는 것도 가능하다.
본 발명의 체세포 또는 줄기세포(예를 들면 ES 세포) 및/또는 다기능성 줄기세포에 의한 세포, 조직 또는 장기를 제조하는 방법에 있어서 세포를 분화시키는 방법은 그 세포의 핵형이 지니고 있는 상태의 세포, 조직 또는 장기가 분화되어 얻어지는 것이면 특별히 한정하는 것은 아니다. 예를 들면 본 실시예에 있어서 배반포에의 도입, 마우스 등의 동물에의 피하주사에 의해 테라토마를 형성하는 등에 의한 세포 조직 및 장기로의 분화하는 것이 가능하다. 원하는 세포, 조직 또는 장기는 그로부터 분화된 배반포 또는 테라토마로부터 분리하는 것이 가능하다. 인비트로에서 원하는 종류의 세포를 얻기 위해서 필요에 따라 세포증식인자 성장인자등을 첨가하고, 세포로부터 원하는 세포 조직 또는 장기를 유도하는 것도 바람직하다. 현재까지는 혈관, 신경세포, 근육세포, 조혈세포, 피부, 골, 간장, 췌장 등에의 ES 세포로부터 유도가 보고되어 있다. 본 발명의 다기능성 줄기세포로부터 이식 개체에 대응하는 세포 조직 또는 장기의 제조에 있어서도 이와 같은 기술을 적용하는 것이 가능하다. (예를 들면 Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., and Thomson, J. A.(2001) Proc Natl Acad Sci USA 98, 10716-21; Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H.T., Anisimov, S. V., and Wobus, A. M.(2002). Circ Res 91, 189-201) 한편 본 발명에 있어서 줄기세포로서는 조직 줄기세포를 사용하여 융합세포를 제조하는 경우에 그 융합세포는 그 줄기세포가 지니는 다기능성에 유사한 다기능성을 지닌다.
본 발명의 다기능성 줄기세포로부터 세포, 조직 또는 장기의 제조방법에 있어서 줄기세포(예를 들면 ES 세포)로서는 적당한 개체로부터 줄기세포(예를 들면 ES 세포)를 확립시켜 사용하는 것도 가능하다. 여태까지 확립된 각종의 생물 유래 조직세포(예를 들면 ES 세포)를 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들면 마우스, 햄스터, 피그, 쉬프, 보바인, 밍크, 래빗, 래수스 몽키 및 마모세트 등의 영장류 및 인간의 줄기세포(예를 들면 ES 세포)를 열거할 수 있다. 바람직하게는 사용하는 체세포와 동일한 종 유래의 줄기세포(예를 들면 ES 세포)를 사용한다.
본 발명의 다기능성 줄기세포로부터 세포, 조직 또는 장기를 제조하는 방법에 사용되는 체세포로서는 임파구, 비장세포 또는 정소세포 유래의 세포를 열거할 수 있다. 특히 이것에 한정하는 것은 아니고 정상의 염색체를 지닌 체세포이고줄기세포(예를 들면 ES 세포) 와 융합시에 융합세포로써 안정하게 증식되고, 다분화 기능을 지닌 미분화 세포 중에서 변화하는 것이면 특히 한정하는 것은 아니다. 이 방법에 의해 제조된 세포, 조직 또는 장기를 이식용으로 하는 경우에는 이식 개체에 의해 얻어진 체세포를 사용하는 것도 바람직하다.
본 명세서 중에 융합세포는 예를 들면 전술한 줄기세포(예를 들면 ES 세포)와 체세포를 융합에 의해 제조한 것으로, 안정적으로 증식하며 다분화기능을 지닌 미분화세포이다. 이와 같은 융합세포로부터 숙주 줄기세포(예를 들면 ES 세포) 유래의 염색체를 제거한 경우 그 융합세포는 체세포 유래의 염색체를 지니는 2배체 미분화세포이기 때문에 이 세포는 이상적으로 각종의 질병을 처리하기 위해 바람직한 도너이다. 줄기세포(예를 들면 ES 세포) 유래의 염색체를 제거하는 방법으로는 방사선 조사, 약제 처리 및 유전자 조작 등을 이용하는 방법을 들 수 있다. 예를 들면 줄기세포(예를 들면 ES 세포)와 체세포와의 융합처리를 행하기 전에 방사선 또는 약제에 의해 처리하는 것에 의해 융합된 후에 줄기세포(예를 들면 ES 세포) 유래의 염색체만이 손상될 수 있는 것이다. 염색체를 제거하는 경우에 사용되는 약제로서는 예를 들면 브로모데옥시유리딘(BrdU)를 들 수 있다. BrdU를 사용한 염색체의 처리 방법은 ES 세포를 그 약제에 의해 처리하고, 체세포와 융합시킨 후에 자외선을 조사한다. 이 조사에 의해 BrdU 처리된 줄기세포 (예를 들면 ES 세포) 유래의 염색체만이 제거된다. 한편 유전자 조작에 의해 융합세포중에 줄기세포(예를 들면 ES 세포) 유래의 염색체를 제거하는 방법으로는 다음과 같은방법을 들 수 있다. 아들의 줄기세포(예를 들면 ES 세포)의 게놈 중에 랜덤한 LoxP 서열을 도입한다. 체세포와 융합 후에 강제적으로 Cre 단백질을 발현하는 것에 의해 줄기세포(예를 들면 ES 세포) 유래의 염색체만이 제거된다. 따라서 이와 같은 방법을 사용하는 것에 의해 줄기세포(예를 들면 ES 세포) 유래의 게놈을 일부 또는 전부를 제거하는 것이 가능하다.
본 명세서에 있어서 세포의 '융합' 또는 '세포 융합'은 호환 가능하게 사용가능하며 복수의 세포가 융합시켜 세포의 다핵화가 되는 현상을 말한다. 생식세포의 수정 시 등과 같은 자연에 있어서의 것과 세포공학 상의 수단을 하나 이상 사용한 것이다. 2종의 상이한 세포를 화학적 또는 물리적으로 융합시켜 융합세포를 증식시키기 위한 선택 배지를 사용하여 배양한다. 예를 들면 자외선으로 감염력을 실활시킨 바이러스(예를 들면 HVJ (센다이 바이러스) 파라인플루엔자 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스와 같은 파라믹소 바이러스)를 사용하고 세포 융합을 유도한다. 화학물질에 의하여도 세포 융합은 가능하고 예를 들면 라이소레시틴, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 6000, 글리세롤올레이트 등을 사용한다. 물리적 수단으로는 전기 자극을 이용하여 세포융합(전기 융합)을 행하고 있다. 화학 물질에 의한 세포 융합은 바이러스에 대해 특이적인 비의존성을 지니는 것이 바람직하다.
따라서 본 발명에 있어서 다기능성 줄기세포로부터 세포, 조직 또는 장기를 제조할 때 줄기세포(예를 들면 ES 세포)와 체세포를 융합시키는 방법은 줄기세포와체세포를 접촉하여 융합시키고, 융합세포를 형성하는 방법은 특히 한정되지 않는다. 예를 들면 실시예에 기재된 것과 같은 ES 세포와 체세포를 일정의 비율, 예를 들면 ES 세포와 흉선세포의 융합세포를 제조할 때에 1:5의 비율로 혼합시키고 세정한다. 세포를 만니톨 완충액 등의 적당한 완충액 주위에서 현탁시켜 전기 융합시키는 것에 의해 제조하는 것도 가능하다. 이와 같은 전기 자극에 의해 세포막의 구조 변화를 이용하는 고전압펄스 세포융합법(엘렉트로포레이션)[예를 들면 EMBO J. 1: 841-845(1982)] 외에도 센다이 바이러스, 라이소레시틴, 글리세롤, 올레인산에스테르, 폴리에틸렌글리콜 등의 화학적인 세포융합 촉진물질을 사용하는 세포융합법도 사용할 수 있다. 이와 같은 융합 방법은 줄기세포와 체세포와의 융합에 의해 형성된 세포가 융합세포로서 안정하게 증식할 수 있고 체세포 유래의 핵이 다기능성을 지니는 미분화세포로 변화하는 것이면 특히 한정하지 않는다.
본 발명의 세포, 조직 또는 장기를 이식에 사용하는 경우에는 단독으로 사용하는 것도 가능하고 기존의 면역억제법을 조합시켜 사용하는 것도 가능하다. 예를 들면 면역억제제, 외과적 수술, 방사선 조사 등을 열거할 수 있다. 또한 면역억제제로서는 주로 부신피질, 스테로이드약, 싸이클로스포린, FK 506 등이다. 이에 외과적 수술로서는 예를 들면 임파구 적출, 비장 적출, 흉선제거, 흉관 드레이너지 등을 들 수 있다. 방사선 조사는 전신 조사와 이식편 조사가 있다. 이것을 적절하게 조합하여 레시피언트에 있어서 이식편에 대한 거부반응을 보다 효율적으로 억제하는 것이 가능하다.
따라서 본 발명의 방법의 하나의 실시태양에서 본 발명의 처치 방법은 거부 반응을 회피하는 공정을 더욱 포함하는 것이 좋다. 거부반응을 회피하는 수단은 해당분야에 있어 공지되어 있다. 예를 들면 신외과학대계, 장기이식(1992) 등에 기재되어 있다. 이와 같은 방법으로는 예를 들면 면역 억제제, 스테로이드제의 사용 등의 방법을 들 수 있다. 거부반응을 예방하는 면역 억제제는 현재 '싸이클로스포린(센드이뮨/네오랄), 타크로리머스(프로그라프), 아자티오프린(이뮤란), 스테로이드 호르몬(프레드닌, 메틸 프레드닌)과 T 세포 항체(OKT3, ATG 등)이 있다. 예방적 면역억제제로서는 세계의 다수에 사용되고 있는 방법은 '싸이클로스포린,아자티오프린, 스테로이드 호르몬'의 세 종의 병용이다. 면역 억제제는 본 발명과 동 시기에 투여하는 것이 바람직하고 필요에 따라서는 필요하지 않을 수도 있다. 따라서 면역 억제 효과를 달성하는 한 면역 억제제는 본 발명의 의약 투여 전 또는 후에 투여할 수 있는 것이다.
'원하는 개체 유래' 는 치료 또는 예방 등의 처치를 행하는 것이 소망되는 개체에 유래하는 것을 말한다. 따라서 이 표적 개체가 결정되면 그 개체가 지닌 유전자 정보 등의 정보(예를 들면 게놈 정보) 형질(표현 형질 등) 또는 기능등과 실질적으로 동일한 것을 지니는 것을 원하는 개체 유래라 칭한다.
이 기원에 '직접 유래하지 않는 '은 이 기원에 유래하지 않지만 그 기원으로부터 취할 수 있는 인공적 조작(예를 들면 세포융합)을 적어도 1회 행하는 것을 의미한다. 따라서 ES 세포에 '직접 유래하지 않는' 줄기세포는 ES 세포 자체는 아닌 세포를 포함하는 것이다.
'체세포 유래' 는 이 체세포로부터 지닌 유전자 정보 등의 정보(예를 들면 게놈정보) 형질(표현 형질등) 또는 기능 등의 실질적으로 동일한 것을 지니는 것을 칭한다.
' 클론기술' 에는 유전자 조작에 사용하는 '클론' 이 지닌 유전적으로 동일한 개체를 제조하는 기술을 칭한다.
본 명세서에 있어서 '이식편' '그라프트' 및 '조직 그라프트' 는 서로 교환 사용할 수 있고 신체의 특정부위에 삽입할 수 있는 동종 또는 이종의 조직 또는 세포군에 있어서, 신체에의 삽입후에 그 일부가 되는 것이다. 이식편으로는 예를 들면 장기 또는 장기의 일부, 혈관, 혈관양조직, 피부조각, 심장변, 심막, 경막, 각막골편, 치, 골, 뇌 또는 뇌의 일부 등을 열거할 수 있으며 특별히 한정되는 것은 아니다. 따라서 이식편에는 이 부분의 결손부에 결손을 보충하기 위하여 사용하는 것을 포함한다. 이식편으로는 도너의 종류에 따라 자기(자가)이식편(autograft) 동종이식편(동종 이계 이식편)(allograft), 이종이식편 등을 열거할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 통상은 본 발명의 장기,조직 및 세포는 자기이식편으로써 사용되지만 동종이식편, 이종이식편으로 사용하는 것도 좋다.
본 발명에 있어서 자기이식편 또는 자가이식편은 이 개체에 있어서 그 개체 유래하는 이식편을 칭한다. 본 명세서에 있어서 자기이식편이라 칭하는 것은 광의로는 유전적으로 동일한 타 개체(예를 들면 일란성 쌍생아)로부터 이식편도 포함한다. 본 발명의 세포로부터 분화된 분화세포, 조직 또는 장기를 이식하기 위해 자기이식편의 개념을 포함하는 것이다.
본 명세서에 있어서 동종이식편(동종이계이식편)은 동종으로써 유전적으로 상이한 개체로부터 이식되는 이식편을 말한다. 유전적으로 다르기 때문에 동종이계이식편은 이식된 개체(레시피언트)에 있어서 면역반응을 야기한다. 이와 같은 이식편의 예로는 부모 유래 이식편을 열거할 수 있고 특별히 한정하는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서 이종이식편으로는 이종개체로부터 이식된 이식편을 뜻한다. 따라서 예를 들면 사람이 레시피언트인 경우 포르신으로부터 이식편은 이종이식편이다.
본 발명의 개인 대응 테일러-메이드 기술을 사용한다면, 거부반응을 실질적으로 발생하지 않는 이식편을 제작할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법에 따라 제작된 이식편(예를 들면 조직, 장기 등)은 치료목적에 적합하고 면역반응을 야기하는 등의 부작용이 현저히 억제된 것이다. 따라서 종래의 자기이식편이 사용되지 않는 경우에 자기이식편을 얻는 것이 곤란한 상황에서 이식치료를 행할 수 있으며, 종래 기술에는 달성할 수 없었던 것이 본 발명의 현격한 효과이다. 또한 본 발명의 개인대응 테일러-메이드 기술에 의해 얻어진 다기능성 세포는 그 다기능성 세포의 게놈 유래하는 환자 및 그 환자 이외에도 사용할 수 있다. 이러한 경우에는 바람직하게는 상기 거부반응을 회피하는 방법이 요구된다.
본 발명에 있어서 '피험체' 또는 '피검체'는 처치(예를들면 치료, 예방, 예후의 조치)가 적용되는 생물이다. '환자'로 칭한다. '환자''피험체' 또는 '피검체'는 본 발명이 적용되는 생물이면 되고 바람직하게는 환자''피험체' 또는 '피검체'는 인간이다.
본 발명의 줄기세포(예를 들면 ES 세포)로서는 이식 개체로부터 줄기세포를 확립하여 사용하는 것도 가능하고 이미 확립된 것도 있다. 각종의 생물 유래의 줄기세포를 이용하는 것도 바람직하다. 예를 들면 마우스, 햄스터, 피그, 쉬프, 보바인, 밍크, 래빗, 래수스 몽키 및 마모세트 등의 영장류 및 인간의 줄기세포 등을 열거할 수 있다. 바람직하게는 사용하는 체세포와 동일한 종 유래의 줄기세포를 사용한다.
본 발명의 체세포로서는 어느 세포도 사용할 수 있으나, 임파구, 비장세포 또는 정소 유래의 세포 등을 예시할 수 있다. 인간을 포함하는 포유동물 및 여러 종 유래의 체세포를 사용하는 것도 가능하다. 특히 한정하는 것은 아니고 정상적인 염색체를 지닌 체세포이고 ES 세포와 같은 줄기세포와 융합하는 때에 융합세포로서 안정하게 증식하는 것이고 다분화기능을 지닌 미분화세포로 변화할 수 있는 것이면 특히 한정하는 것은 아니다. 바람직하게는 이식개체에 의해 얻어진 체세포를 사용하는 것이 레시피언트에 있어서 거부반응을 감소시킨 미분화한 체세포 융합세포를 얻는 것이 요망된다.
본 발명에 미분화한 체세포 융합세포는 이미 설명한 ES 세포와 같은 줄기세포와 체세포 융합에 의해 얻어지는 것이고 안정적으로 증식되고 다분화기능을 지니며 미분화인 세포이다.
본 발명의 ES 세포와 같은 줄기세포와 체세포를 융합하는 방법은 ES 세포와 같은 줄기세포와 체세포를 융합시키고, 융합세포를 형성하는 방법이면 특히 한정하는 것은 아니다. 예를 들면 실시예에 기재된 것처럼 ES 세포와 체세포를 일정의 비율로 예를 들면 ES 세포와 흉선세포와의 융합세포를 제조하는 경우에 1:5의 비율로 혼합하고 세정한다. 세포를 만니톨 완충액 등의 적당한 완충액 중에 현탁시키고 전기융합에 의해 제작할 수도 있다. 이와 같은 전기 자극에 의한 세포막의 구조변화를 이용한 고전압펄스 세포융합법(엘렉트로포레이션)[예를 들면, EMBO J. 1:841-845(1982)] 기타 센다이 바이러스, 라이소레시틴, 글리세롤, 올레인산에스테르, 폴리에틸렌글리콜 등의 화학적인 세포융합 촉진물질을 사용하는 세포융합법도 공지되어 있다. 이와 같은 융합 방법은 줄기세포와 체세포와의 융합에 의해 형성된 세포가 융합세포로서 안정하게 증식할 수 있고 체세포 유래의 핵이 다기능성을 지니는 미분화세포이고, 변화하는 것이면 본 발명의 다기능성 줄기세포의 제조에 이용할 수 있다.
본 발명의 ES 세포 유래의 이식항원의 일부 또는 전부가 결실된 세포, 조직 또는 장기의 제조방법에 있어서, 다기능성 줄기세포를 분화하는 방법은 그 다기능성 줄기세포의 핵형이 보지되고 있는 상태의 세포, 조직 또는 장기가 분화되는 것이면 특히 한정하지 않는다. 예를 들면 본 실시예에 있어서 나타나는 것처럼 배반포에의 도입, 마우스 등의 동물에의 피하주사에 의한 테라토마를 형성하는 것 등에 의한 세포, 조직 및 장기로의 분화하는 것은 가능하다. 원하는 세포, 조직 또는 장기는 그것으로부터 분화된 배반포 또는 테라토마로부터 분리할 수 있다. 인비트로에서 목적하는 종류의 세포를 얻기 위해서 필요에 따라 세포 증식인자, 성장인자 등을 첨가하고 세포로부터 원하는 세포, 조직 또는 장기를 획득하는 것도 바람직하다. 현재까지 혈관, 신경세포, 근육세포, 조혈세포, 피부, 골, 간장, 췌장등의 ES 세포로부터 유도된 것이 보고되고 있다. 본 발명의 융합세포로부터 이식개체에 대응하는 세포, 조직 또는 장기의 제조방법에 있어서도 이와 같은 기술을적용하는 것을 고려한다.
(바람직한 실시태양의 설명)
하나의 국면에 있어서 본 발명은 원하는 게놈을 지닌 분리된 다기능성 줄기세포를 제공하는 것이다. 바람직하게는 이 다기능성 줄기세포는 ES 세포가 아닌 것이다. 원하는 게놈을 지닌 ES 세포가 아닌 다기능성 줄기세포는 ES 세포를 새롭게 수립하는 것도 난세포를 채취하는 필요도 없이 여러 종의 재생치료를 행할 수 있는 것이다.
이 다기능성 줄기세포는 바람직하게는 이식항원의 적어도 일부가 결실된 것으로 더욱 바람직하게는 이식항원의 전부가 결실된 것이다. 이식항원이 감소되기 때문에 본 발명의 다기능성 줄기세포는 원하는 게놈을 지닌 숙주에 대해 감소된 면역거부반응을 나타내는 효과를 지닌다. 바람직하게는 결실된 이식항원은 적어도 주요조직 적합항원을 포함한다. 더욱 바람직하게는 이 주요조직 적합항원은 클래스 Ⅰ 항원을 포함한다. 이러한 특정항원이 결실되어있는 것이기 때문에 면역거부반응의 주요한 부분이 감소되고 부작용도 경감되는 것이다.
본 발명의 다기능성 줄기세포는 바람직하게는 그 게놈이 재프로그램화 된 것이다. 본 발명의 다기능성 줄기세포는 하나의 실시태양에 있어서 공급원으로써별개의 세포를 사용하고 그것을 재프로그램화 하는 것에 의해 제작되는 것이다. 이러한 별개의 세포는 체세포이다. 이 체세포는 바람직하게는 흉선세포, 임파구, 골수세포 등이며 이에 한정되지 않는다.
별도의 실시태양에 있어서 본 발명의 다기능성 줄기세포는 공급원으로써 줄기세포 및 체세포를 사용하고 줄기세포와 체세포의 융합에 의해 얻어지는 것이다. 이 공급원으로서 사용되는 줄기세포는 ES 세포도 가능하고 조직 줄기세포도 가능하다. 특히 ES 세포가 바람직하다. ES 세포의 모든 기능이 본 발명의 다기능성 줄기세포에 연계되어 얻어지는 것이다.
본 발명의 다기능성 줄기세포는 원하는 개체(예를 들면 치료, 예방, 처치의 대상) 유래의 게놈을 지니고, 이 원하는 개체의 ES 세포도 난 세포도 아닌 것이 바람직하다. 원하는 개체의 ES 세포나 난 세포를 사용할 필요가 없기 때문에 본 발명은 그 실시태양에 있어서 윤리적 문제를 극복한 것으로 특별한 효과를 지닌다. 바람직하게는 실시태양에 있어서 본 발명의 다기능성 줄기세포는 원하는 개체의 체세포 유래 염색체를 지닌 것이다.
바람직한 실시태양에 있어서 본 발명의 다기능성 줄기세포는 배아에 직접 유래하지 않는다. 그러므로 숙주로부터 배아를 취출하는 사회윤리상 문제 행위를 회피할 수 있다. 바람직하게는 다기능성 줄기세포는 체세포에 유래하여 얻는다.체세포 유래되는 다기능성을 지닌 것이기 때문에 입수가 간단하고 응용에 폭이 넓으며 효과가 큰 것이다.
바람직한 실시태양에 있어서 본 발명의 다기능성 줄기세포는 원하는 개체 이외의 이식항원이 감소된 것이다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 다기능성 줄기세포에는 원하는 개체 이와의 이식항원은 존재하지 않는다. 하나의 실시태양에 있어서 본 발명의 다기능성 줄기세포는 원하는 개체의 난세포 이외의 세포에서 유래한 것이다.
하나의 실시태양에 있어서 본 발명의 다기능성 줄기세포는 천연에 존재하지 않는 것도 바람직하다. 바람직하게는 본 발명의 다기능성 줄기세포에 있어서 원하는 게놈은 초기 배아 이외의 개체의 것이다. 테일러-메이드 다기능성 줄기세포는 목적하는 개체의 체세포와 게놈은 동일한 것이고 다기능성 (바람직하게는 전기능성)을 지니고 있기 때문에 이와 같은 성질의 모든 면을 구비한 세포는 천연에 존재하지 않는다. ES 세포는 초기 배아의 미분화된 세포에 유래하는 것이기 때문에 초기 배아 이외의 상태인(예를 들면 성체) 숙주로부터 ES 세포는 원칙적으로 확립할 수 없다. 따라서 성체의 초기배아는 존재하지 않기 때문에 본발명의 테일러-메이드 다기능성 줄기세포는 종래 기술로는 달성할 수 없는 것이다.
본 발명의 다기능성 줄기세포는 바람직하게는 실시태양에 있어서 이식항원의일부 또는 전부를 결실시킨 ES 세포와 체세포와의 미분화한 체세포 융합세포이다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 다기능성 줄기세포는 이식항원의 전부가 결실된 ES 세포와 체세포와의 미분화한 체세포 융합세포이다. 더욱 바람직하게는 이 이식항원은 주요조직 적합항원이다. 여기서 그 주요조직 적합항원은 클래스 Ⅰ 항원이다. 바람직한 실시태양에서 이 체세포는 이식 개체 유래의 임파구, 비장세포 또는 정소 유래의 세포로 얻어진 것으로 한정하는 것은 아니다. 여기서 바람직하게는 그 ES 세포 및 그 체세포의 적어도 하나는 인간 유래의 세포이다. 체세포는 대상이 되는 숙주와 동일한 종(이것은 동일한 라인)인 것이 바람직하다. 따라서 예를 들면 인간을 치료대상으로 하는 경우 체세포는 인간세포인 것이 바람직하고 더욱 바람직하게는 그 치료대상으로서의 인간 개체의 체세포인 것이다. 여기서 ES 세포는 바람직하게는 체세포와 동일한 종(바람직하게는 동일한 라인)의 것이다. 그러므로 인간을 치료대상으로 하는 경우에 체세포가 인간세포일 때 ES 세포도 인간세포인 것이 바람직하다. 그 경우 ES 세포는 계통이 다를 수 있기 때문에 이미 확립된 ES 세포(또는 다른 다기능성 줄기세포)를 사용할 수도 있다. 따라서 본 발명의 다기능성 줄기세포도 공급원으로써 줄기세포로 사용할 수 있다.
어느 실시태양에 있어서 상기 체세포 및 상기 줄기세포의 적어도 하나는 유전자 개변시킨 것이다. 유전자 개변은 본 명세서에 있어서 기재되어 있는 바와 같이 행하여 얻어진다. 그러므로 본 발명의 다기능성 줄기세포는 유전자 치료와 병용하여 사용할 수 있다. 유전자 치료 또는 예방 대상 환자의 상태에 따라 알려진 것을 편의에 따라 사용한다.
(게놈 재프로그램화 인자)
본 발명의 바람직한 실시태양에 있어서 게놈 재프로그램화 인자에 의해 체세포의 처리를 행한다. 본 발명자들은 체세포 게놈이 ES 세포와의 융합세포에 의해 에피제네틱스의 변화를 얻는 것이 명백하며 재프로그램화 인자 및 기구 해석의 실마리가 얻어진다. 최종적으로는 체세포에 재프로그램화 인자를 강제 발현하는 것에 의해 직접 다기능성 줄기세포화 할 수 있다.
본 발명자들은 ES 세포와 세포 융합에 의해 체세포 게놈의 크로마틴 구조가 극적으로 변화하는 것인가를 추측하고 아종간 융합세포(domesticus ×molossinus)에의 체세포 핵 히스톤 아세틸화의 상태를 해석하였다.
항아세틸화 히스톤 H3 항체, 항아세틸화 히스톤 H4 항체, 항메틸화 히스톤 H3-Lys4 항체, 항메틸화 히스톤 H3-Lys9 항체를 이용하여 체세포, ES 세포 융합세포의 핵 히스톤의 모디피케이션을 파악한다. 그리고 히스톤과 DNA의 상호작용을 해석하기 위해 그것으로부터 4종류의 항체를 사용하여 크로마틴 면역침강 에세이를 행한다. DNA 히스톤 단백질 복합체를 그 항체에 면역반응시켜 회수한다. 회수된 DNA-히스톤 단백질 복합체에 함유된 DNA의 PCR 증폭에 의해 어느 DNA 영역의 히스톤이 모디파이 됐는지 알게 되었다. 아종간 게놈 DNA의 염기서열 폴리모르피즘에 의해 체세포 유래 게놈이 모디파이 됐는지 여부를 결정할 수 있게 되었다. 그 결과 융합세포에 의해 체세포 게놈이 전체적으로 아세틸화에 의해 완만한 크로마틴 구조를 지니는 것이 밝혀졌다. 주목할 점은 재프로그램화된 게놈에는 히스톤 H3-Lys4 가 특이적으로 메틸화 된 것이다. 히스톤 H3-Lys4의 메틸화는 히스톤 3의 아세틸화와 연동하는 것으로 알려져 있다. 메틸화는 아세틸화보다 더 안정한 에피제네틱스이기 때문에 히스톤 H3-Lys4의 메틸화는 재프로그램화된 게놈의 특징적 모디피케이션으로 언급된 것이다. 히스톤 H3-Lys4의 메틸화 효소 또는 메틸화에 관한 인자가 재프로그램화 인자의 하나인 것으로 여겨진다.(도 11)
재프로그램화 인자를 인식하는 방법으로는 다음과 같은 방법을 예시할 수 있다.
1. 체세포와 체세포 게놈을 구별하는 목적으로 범용되는 Mus musculus domesticus(dom) 마우스와 비교한 DNA 염기서열이 높은 폴리모르피즘을 지닌 아종m, molossinus(mol)로부터 ES 세포를 수립하였다. ES 세포(dom)×체세포(mol) 또는 ES 세포 (mol)×체세포(dom)의 아종간 융합세포를 제조한다.
2. 체세포, ES 세포 및 융합세포를 1% 포름알데히드 용액에서 10분간 고정시켜 히스톤 단백질과 DNA를 가교(히스톤-DNA 복합체)시킨 후에 핵단백질을 추출한다. 이 핵단백질과 항아세틸화 H3항체, 항아세틸화 히스톤 H4항체, 항메틸화 히스톤 H3-Lys4 항체 및 항메틸화 히스톤 H3-Lys9 항체를 하룻밤 반응시킨다.
3. 반응액을 프로테인 A 컬럼으로 통과시키고, 항체와 반응된 히스톤-DNA 복합체를 분리한다. 이와같이 항체와 반응된 히스톤-DNA 복합체로부터 DNA를 추출한다.
4. 추출된 DNA를 멤브레인에 블라팅 흡착한다. 이 DNA 게놈 위에 산재하는 반복서열 B2 리피트, IAP 및 마우스 게놈 DNA를 프로브로 하여 반응시킨다. 그 결과 전부의 프로브 DNA가 체세포 게놈은 아세틸화 히스톤 H3-Lys9과 반응한데 비해, ES 세포 및 융합세포 게놈은 아세틸화 히스톤 H3-Lys4, 아세틸화 히스톤 H3 및 아세틸화 히스톤 H4와 반응하였다.
5. 추출된 DNA를 체세포에서 발현되지 않고 미분화 세포에서 발현되는 Oct4 유전자, 체세포에도 미분화세포에도 발현되지 않는 Neurofilament-M 및 -L 유전자,
체세포에서 발현되고 미분화세포에서 발현되지 않는 Thy-1 유전자 각각에 특이적인 게놈 PCR- 프라이머 세트로 DNA를 증폭하였다. DNA의 염기서열 폴리모르픽 부위의 제한효소 인식의 다른점을 이용하여 융합세포로 증식된 DNA가 ES 세포 게놈 유래인가 체세포 게놈 유래인가를 결정하였다. 그 결과 유전자의 체세포에의 발현유무에 관계없이 또한 융합세포에의 발현 유무에 관계없이 융합세포에는 체세포 유래 게놈이 아세틸화 히스톤 H3-Lys4, 아세틸화 히스톤 H3 및 아세틸화 히스톤 H4와 반응하였다. 이와 같은 설명은 줄기세포의 예시로 ES 세포를 열거하지만 다기능성을 나타내는 줄기세포라면 이러한 세포에도 상기 설명에 의해 재프로그램화 인자를 확인하는 것이 가능하다.
아세틸화 히스톤은 완만한 크로마틴 구조를 형성하는 것으로 알려져 있다. 한편, 히스톤 H3-Lys4 와 히스톤 H3-Lys9의 메틸화는 상보적으로 모디피케이션되고 견고한 크로마틴 속에는 히스톤 H3-Lys9이 메틸화되고, 완만한 크로마틴 속에는 히스톤 H3-Lys4가 메틸화되는 것이 알려져 있다. 게놈 전체에 산재하는 반복 배열 및 유전자의 융합세포로의 해석은 재프로그램화 세포 게놈이 완만한 크로마틴 구조를 형성하는 것을 제시하고 있다. 특히 히스톤 H3-Lys4의 메틸화가 재프로그램화에 중요한 역할을 하는 것으로 간주된다.
그러므로 본 발명의 또 다른 측면에서는 본 발명은 원하는 게놈을 지닌 다기능성 줄기세포를 생산하는 방법에 있어서 1) 그 원하는 게놈을 지닌 세포를 제공하는 단계; 및 2) 그 세포를 재프로그램화 인자를 포함하는 조성물에 노출시키는 단계를 포함하는 방법을 제공하는 것이다. 여기서 바람직하게는 상기 세포는 체세포이고 프로그램화 인자는 다기능성 줄기세포의 세포질 내 또는 핵내인자로서 제조하여 얻어지는 것이다. 재프로그램화 인자는 히스톤 H3-Lys4 의 메틸화효소 또는메틸화에 관한 인자, 세포주기 조절인자, DNA 헬리카제, 히스톤 아세틸화 인자, 전사인자등을 열거할 수 있으며 특히 한정하지 않는다.
(이식항원 (예를들면 MHC) 결실 ES세포와 체세포와의 융합세포)
본 발명의 하나의 실시태양에 있어서 본 발명은 원하는 게놈을 지닌 다기능성 줄기세포를 생산하는 방법이다. 1) 상기 줄기세포에 있어서 이식항원의 일부 또는 전부를 결실하는 단계; 및 2) 줄기세포와 상기 원하는 게놈을 지닌 체세포를 융합하는 단계를 포함하는 방법을 제공하는 것이다. 바람직하게는 이 줄기세포는 ES 세포이고 더욱 바람직하게는 이미 확립된 ES 세포이다.
바람직한 실시태양에 있어서 상기 이식항원은 주요조직 적합항원이다. 더욱 바람직하게는 주요조직 적합항원은 클래스Ⅰ 항원이다. 상기 체세포는 이식개체 유래의 임파구, 비장세포 또는 정소 유래의 세포이다.
본 발명의 다기능성 줄기세포를 제조하는 방법에 있어서 공급원으로서는 이식항원의 일부 또는 전부를 결실시킨 줄기세포(예를 들면 ES세포) 와 체세포와의 미분화된 체세포융합세포가 사용된다. 더욱 바람직하게는 공급원으로서 이식항원의 전부가 결실된 (예를 들면 ES 세포)와 체세포와의 미분화된 체세포융합세포가 사용된다.
바람직하게는 실시태양에 있어서 그 체세포는 이식개체 유래의 임파구, 비장세포, 또는 정소 유래의 세포이며 특히 한정하지는 않는다. 여기서 바람직하게는 이 ES 세포 및 이 체세포의 적어도 하나는 인간 유래의 세포인 것이다. 체세포는 대상으로의 숙주와 동일한 종 (바람직하게는 라인)인 것이고, 따라서 예를 들면 인간을 치료대상으로 하는 경우, 체세포는 인간세포인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 그 치료대상으로하는 인간 개체의 체세포이다. 여기에서 ES 세포는 바람직하게는 체세포와 동일한 종 (더욱 바람직하게는 라인)의 것이며 따라서 인간을 치료대상으로 하는 경우 체세포가 인간 세포일 때 ES 세포도 인간 세포인 것이 바람직하다. 이 경우 ES 세포는 어느 라인인 경우도 관계없고 이미 확립된 ES 세포 (또는 다른 다기능성 줄기세포)을 사용할 수도 있다. 본 발명의 다기능성 줄기세포도 공급원으로서의 줄기세포로서 사용하는 것이다.
바람직한 실시태양에 있어서, 본 발명의 다기능성 줄기세포를 제작하는 방법은 이식항원을 전부 결실시키는 단계를 포함하여 얻는다. 이식항원을 전부 결실시키는 방법으로는 예를 들면, 방사선 조사, 약제 처리 및 유전자 조작 등을 이용한 방법을 들 수 있다. 예를 들면 줄기세포(예를 들면 ES 세포) 와 체세포와의 융합처리를 행하기 전에 방사선 또는 약제에 의한 처리를 하는 것에 의해 융합된 후에 줄기세포(예를 들면 ES 세포) 유래의 염색체만을 파괴시킬 수 있는 것이다. 염색체를 제거하는 경우 사용되는 약제의 예로서는 BrdU를 들 수 있고, BrdU를 사용한 염색체 처리방법에는 먼저 ES 세포를 그 약제에 의해 처리하고, 체세포와 융합시킨 후 자외선 조사를 행한다. 이 조사에 의해 BrdU 처리된 줄기세포(예를 들면 ES 세포) 유래의 염색체 만이 제거된다. 한편, 유전자조작에 의해 융합세포중의 줄기세포(예를 들면 ES 세포) 유래의 염색체를 제거하는 방법도 가능하고 다음과 같은 방법을 고려할 수 있다. 먼저 줄기세포(예를 들면 ES 세포)의 게놈 중에 랜덤하게 LoxP 서열을 도입한다. 체세포와의 융합후에 강제적으로 Cre 단백질을 발현시키는 것에 의해 줄기세포(예를 들면 ES 세포) 유래의 염색체만을 제거시킨다. 그리고 이와 같은 방법을 사용하는 것에 의해 줄기세포(예를 들면 ES 세포) 유래의 게놈을 일부 또는 전부(이식 항원을 포함)를 제거하는 것이 가능하다.
본 명세서의 하나의 바람직한 실시태양에 있어서 주요조직 적합성항원유전자
복합체(MHC) 결손된 ES 세포와 체세포와의 융합세포를 제작하는 것이 시도된다. 같은 종으로 다른 개체의 이식 조직의 거부반응에 관한 분자로써 주요조직 적합성항원유전자복합체(MHC) 가 알려져 있고, 마우스에 있는 H-2 항원에 상당한다. MHC는 세 개의 클라스 classⅠ, classⅡ, classⅢ 로 분류된다. CD4 T세포의 항원 프레젠테이션을 행한 classⅠ유전자 군과 CD8 T세포에의 항원 프레젠테이션을 행한 classⅡ 유전자 군이 자기이식세포가 아닌 곳에서 발생하는 거부반응에 관련된 것으로 알려져 있다. 여기서 본 발명자들은 MHC의 클래스Ⅰ 및 클래스Ⅱ 유전자 군을 유전자 조작에 의해 제거시킨 ES 세포를 제작하고, 개체의 체세포와 세포융합시켰다. 이 체세포-ES (MHC-)융합세포에서는 체세포 게놈 유래의 자기 MHC클래스Ⅰ 및 클래스Ⅱ 항원만이 세포 표면에 나타났다. 따라서 이 융합세포는 자기자신이 아닌 것으로 인식되지 않는다. 자기인식을 위한 항원을 체세포 게놈으로부터, 그 재프로그램화 활성을 ES (MHC-) 세포로부터 얻은 체세포-ES(MHC-) 융합세포는 MHC 테일러-메이드 융합세포라 칭한다. 이 MHC 테일러-메이드 ES 세포에는 체세포 유래의 MHC가 발현하기 때문에 내추럴 킬러세포에 공격을 받지 않는다. MHC 클래스Ⅰ 결손 마우스와 MHC 클래스Ⅱ 결손 마우스는 이렇게 제작될 수 있다. 이들의 교배에 의해 클래스Ⅰ/클래스Ⅱ 결손 마우스를 제작하는 어프로치는 MHC 클래스Ⅱ 결손마우스 유래의 ES 세포를 수립하고 클래스Ⅰ 유전자 군을 호모로고스 조환시키는 것에 의해 결손시킨다. ES(MHC-) 세포가 얻어진다. 다른 마우스 라인으로부터 체세포와 융합시키고, 체세포-ES(MHC-) 융합세포를 제작한다. ES세포 유래 마우스와 체세포 유래 마우스에 이식하는 것으로 거부반응 유무를 검토할 수 있다.
이와 같은 방법으로써 다음의 것을 열거한다.(도 12)
1. H-2 클래스Ⅰ 결실마우스와 H-2 클래스Ⅱ 결실마우스를 사용하여 H-2 클래스Ⅰ과Ⅱ 결실 마우스를 제작한다. 제작에는 다음의 세 개의 어프로치를 고려할 수 있다. 1) H-2 클래스Ⅰ 결실마우스와 H-2 클래스Ⅱ 결실마우스를 교배시키고 클래스Ⅰ과 클래스Ⅱ를 모두 결실시킨 마우스를 제작한다. 2) H-2 클래스Ⅱ 결실마우스로부터 H-2 클래스Ⅱ(-/-) ES 세포를 생산하고 여기에서 H-2 클래스Ⅰ을유전자 조작에 의해 제거시킨 ES 세포로부터 클래스Ⅰ과 클래스Ⅱ를 모두 결실시킨 마우스를 제작한다. 3) H-2 클래스Ⅱ 결손마우스 체세포 유래 배양세포로부터 H-2 클래스Ⅰ을 유전자 조작에 의해 제거시키고 체세포 핵이식에 의해 클래스Ⅰ과 클래스Ⅱ를 모두 결실시킨 마우스를 제작한다.
2. H-2 클래스Ⅰ (-/-) 클래스Ⅱ(-/-) ES 세포와 체세포 또는 조직성 줄기세포를 세포융합시킨 MHC 테일러-메이드 ES 세포를 제작한다.
3. MHC 테일러-메이드 ES 세포 또는 이로부터 분화된 조직세포를 체세포의 공여체의 이식한다. 거부반응의 유무를 확인한다.
4. H-2 클래스Ⅰ(-/-) 클래스Ⅱ(-/-) ES 세포 마스터 세포가 얻어진다면 조합시킨 체세포를 변화시키는 것에 의해 개인에 대응하는 MHC 테일러-메이드 ES 세포를 간단히 제조할 수 있다.
(체세포- ES 융합세포로부터 ES 세포 게놈의 제거)
본 명세서에 있어서 거부반응을 유인하는 인자를 완전히 회피하는 것이 바람직하다. 거부반응을 완전히 회피하기 위해서는 목적 개체의 체세포에 유래하는 테일러-메이드 줄기세포를 제작하는 것이 필요하다. 체세포-줄기세포(예를 들면ES 세포)의 융합세포에서 재프로그램화된 체세포 게놈이 그 줄기세포(예를 들면 ES세포) 게놈과 동일한 분화능력을 지니기 때문에 융합세포로부터 줄기세포(예를 들면 ES 세포) 게놈만을 유전자 조작에 의해 제거함으로써 테일러-메이드 ES 세포를 얻을 수 있다. 본 발명자들의 세포융합에 있어서 체세포 유래 Oct4 유전자의 재활성화 실험(Tada et al., Curr. Biol., 2001)으로부터 체세포 게놈이 재프로그램화되는 것은 융합 후 약 2일간을 요구하는 것이 알려졌다. 그러므로 ES 세포 게놈을 세포 융합 후 선택적으로 제거해야 하는 것이다.
본 발명자들은 ES 세포의 각 염색체에 최소한 하나의 LoxP 서열을 도입시킨 트랜스제닉 ES 세포의 제작을 행하였다.(도 13) 이 제작은 다음의 방법에 의한다. Insulator-Polymerase Ⅱ promoter-GFP-LoxP-Insulator의 컨스트럭트는 레트로바이러스 벡터를 이용하여 제조된다.(도 14) ES 세포에 레트로바이러스를 감염시키고 GFP를 마커로써 이용하여 셀 솔터와 함께 솔팅하고, 트랜스제닉 ES 세포를 농축한다. 삽입부위는 DNA FISH에 의해 검출한다. 이 트랜스제닉 ES 세포와 체세포의 융합세포에 Cre 효소를 트랜지언트하게 발현하는 플라스미드를 도입한다. Cre 효소의 운동에 의해 LoxP 서열이 호모로고스 재조합을 야기시키고, ES 세포 게놈에 유래하는 염색체만이 디센트릭(dicentric) 또는 아센트릭(acentric) 염색체로 모디파이된다. 세포주기를 초과하는 세포는 세포분열을 통해 제거시킨 후, 남은 것은 재프로그램화된 체세포 유래의 2배체 게놈 뿐이다. 그리하여 개인 체세포 유래의 테일러-메이드 ES 세포를 얻는다. 트랜스제닉 ES 세포가 수립된다면 각 환자 개인 유래의 체세포를 융합에 사용하는 것에 의해 테일러-메이드 ES 세포가 용이하게 수립가능하다. 이 마우스 모델 실험의 성공결과는 인간 ES 세포에 응용하여 개인 체세포에 유래하는 인간 테일러-메이드 ES 세포의 제조를 가능케 한다. 핵 이식 클론과 다른 인간 미수정란을 필요로 하지 않는 세포 융합에 의한 체세포 게놈의 재프로그램화는 가이드라인에 적합한 ES 세포응용 범주이고 윤리적인 문제를 최소화하며 재생의류의 최대한 효과를 나타낼 수 있는 새로운 게놈 공학 기술이다.
이와같은 방법으로서는 다음에 열거하는 것을 들 수 있다.
1. 유전자 도입효율을 높이기 위해서 레트로바이러스를 사용하는 유전자 도입을 행한다. Insulator-Polymerase Ⅱ 프로모터- GFP-LoxP-Insulator의 컨스트럭트를 레트로바이러스 벡터로 제작한다.(도 14) 인슐레이터를 주위의 유전자 영향으로부터 격리하기 위해서 사용되었으며, 폴리머라제 Ⅱ 프로모터는 GFP의 발현이 적절하게 발현되어 그 카피의 수를 셀 솔터를 사용하여 선형적으로 확인할 수 있도록 사용되었다. GFP는 현재로서는 가장 독성이 적은 물질이고 유전자를 도입시킨 ES 세포를 선별하는데 사용된다. LoxP서열의 카피 수는 GFP 발현량과 상관관계를 지닌다.
2. Insulator-Polymerase Ⅱ 프로모터- GFP-LoxP-Insulator 유전자를 ES 세포에 도입시킨 후 GFP 유전자 발현 강도를 기준으로 셀 솔터(cell sorter)를 사용하여 트랜스제닉 ES 세포를 분취하였다. 그 조작을 수 회 반복한다.
3. 유전자 도입을 수 회 반복시킨 ES 세포를 클로닝한 후 Insulator -Polymerase Ⅱ 프로모터-GFP-LoxP-Insulator를 프로브로 이용하여 염색체 위에 매핑한다. 적어도 하나의 염색체의 한 개의 유전자가 도입된 트랜스제닉 ES 세포를 선별한다.
4. 트랜스제닉 ES 세포와 체세포의 융합에 의해 얻어진 융합세포에 Cre 효소를 발현한 후 플라스미드를 도입시키고, Cre 효소를 일시적으로 발현시킨다. Cre 효소의 행동에 의해 LoxP 서열을 호모로고스 재조합시킨 후 ES 세포 유래의 염색체만을 디센트릭 또는 어센트릭 염색체로 모디파이시키고 세포분열에 의해 제거시킨다.
5. 수회 세포분열 후에는 재프로그램화된 체세포 게놈만이 잔존하게 되고 테일러-메이드 ES 세포가 완성된다.
본 발명의 세포, 조직 또는 장기를 이식에 사용하는 경우에는 단독으로 사용하는 것도 가능하고 기존의 면역억제법과 조합하여 사용할 수도 있다. 예를 들면, 면역억제법, 외과적 수술, 방사선 조사 등을 열거할 수 있다. 또한 면역억제제로서는 바람직하게는 부신피질 스테로이드약, 싸이클로스포린, FK 506 등이다.이외에 외과적 수술로서는 예를 들면 임파절 적출, 비장 적출, 흉선 제거, 흉관 드레이너지 등이다. 방사선 조사로는 전신 조사와 이식편 조사가 있다. 이들을 편의에 따라 조합하여 사용하고 레시피언트에 있어 이식편에 대한 거부반응을 효율적으로 억제하는 것이 가능하다.
또 다른 측면에 있어서 본 발명은 원하는 게놈을 지니는 다기능성 줄기세포로부터 분화시킨 세포, 조직 또는 장기를 제공하는 것이다. 이와 같은 세포는 표피세포, 췌장실질세포, 췌관세포, 간세포, 혈액세포, 심근세포, 평활근세포, 골아세포, 골격근아세포, 신경세포, 혈관내피세포, 색소세포, 평활근세포, 지방세포, 골세포, 연골세포 등을 들 수 있다. 더욱 바람직하게는 이 세포는 근육세포, 연골세포, 상피세포 또는 신경세포이다. 분화시키는 방법은 해당분야에 있어서 이미 알려진 것이고 본 명세서의 실시예 또는 본 명세서에 있어서 인용된 문헌에도 충분히 기재되어 있는 것이다.
더욱 바람직한 실시태양에 있어서 상기 조직은 근육, 연골, 상피 또는 신경의 것에서 얻어지는 것이라면 특별히 한정하는 것은 아니다. 더욱 바람직한 실시태양에서 상기 장기는 뇌, 척수, 심장, 간장, 신장, 위, 장 및 췌장으로 구성된 군에서 선택된 것이다. 조직 및 장기의 분화시키는 방법은 해당분야에 있어서 이미 알려진 것이고 본 명세서의 실시예 또는 본 명세서에 있어서 인용된 문헌에도 충분히 기재되어 있는 것이다.
바람직한 실시태양에 있어서 본 발명의 세포, 조직 또는 장기는 이식에 사용하는 것이다. 더욱 바람직하게는 상기 원하는 게놈은 이식되어진 숙주와 실질적으로 동일한 것이다. 본 발명의 세포, 조직 또는 장기를 이식하는 경우에 사용하는 것도 원하는 게놈을 지닌 것이기 때문에 원하는 효과를 달성할 수 있고 따라서 면역거부 반응이 감소되거나 전혀 없어 바람직한 효과를 나타낸다.
(의학, 그것을 사용하는 치료, 예방등)
또 다른 실시태양에서 본 발명은 원하는 게놈을 지닌 다기능성 세포로부터 분화된 세포, 조직 또는 장기를 포함하는 의약을 제공하는 것이다. 이 의약은 이와 같은 세포(더욱 바람직하게는 분화세포), 조직 또는 장기를 필요로 하는 질환, 장애 또는 상태를 지닌 환자에 대하여 사용할 수 있는 것이다. 이와 같은 질환, 장애 또는 상태로서는 세포, 조직 또는 장기의 결함/손상이 있는 경우를 들 수 있다.
또 다른 실시태양에서 피험체에 있어서 세포, 조직 또는 장기의 결함에 의한 질환 또는 장애를 처치 또는 예방하기 위한 의약에 있어서 상기 피험체와 실질적으로 동일한 게놈을 지니고, 다기능성 줄기세포를 포함하는 의약이 본 발명에 따라 제공된다. 이 경우에는 다기능성 줄기세포 자체가 의약으로 사용되는 것에 의해투여된 환경에 대응하여 이 다기능성 줄기세포가 원하는 분화를 행하고, 그 결과 치료가 촉진되는 것이다. 원하는 분화를 투여되는 부위에 있어서 성취하기 위해서 분화에 관련된 인자(예를 들면 SCF) 등을 투여전 또는 투여와 동시에 투여하는 것도 바람직하다.
상술한 의약은 본 발명에 기재된 캐리어 등을 포함할 수도 있다.
또 다른 측면에서 본 발명은 피험체에 있어서 세포, 조직 또는 장기의 손상에 의한 질환 또는 장애를 처치하거나 예방하는 방법에 있어서, 상기 피험자가 실질적으로 동일한 게놈을 지닌 다기능성 줄기세포를 제조하는 공정; 다기능성 줄기세포로부터 상기세포, 조직 또는 장기를 분화하는 공정; 및 상기 세포, 조직 또는 장기를 상기 피험자에 투여하는 공정을 포함하는 방법을 제공하는 것이다. 여기서 환자 또는 장애는 신선한 분화세포, 조직 또는 장기가 필요한 것을 의미하며 구체적으로는 이하에 상술한다. 여기서 실질적으로 동일한 게놈은 동일성을 손상하지 않는 정도(즉, 면역반응을 야기시키지 않는 정도) 수준의 상동성을 지닌 게놈을 칭한다. 또한 거부반응을 회피하는 공정을 사용하는 경우에는 게놈은 피험체의 것이 반드시 필요한 것은 아니다.
또 다른 측면에서 본 발명은 피험체에 있어서 세포, 조직 또는 장기의 손실에 의한 질환 또는 장애를 처치하거나 예방하는 방법에 있어서, 상기 피험체와 실질적으로 동일한 게놈을 지닌 다기능성 줄기세포를 상기 피험체에 투여하는 공정을 포함하는 방법을 제공한다. 여기서 다기능성 줄기세포를 투여하는 방법은 해당분야에 있어서 이미 알려진 방법을 사용하고 투여방법에는 경구투여, 비경구투여(예를 들면 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 점막 투여, 직장내 투여, 질내 투여, 환부에의 국소투여, 피부 투여 등)이 있다. 이와 같은 투여를 위한 처방물은 임의의 제제형태로 제공되는 것이다. 이와 같은 제제형태로서는 예를 들면 액제, 주사제, 서방제 등을 들 수 있다.
한편의 실시태양에 있어서 본 발명은 피험체에 있어서 세포, 조직 또는 장기의 손상에 의한 질환 또는 장애를 처치 또는 예방하는 방법에 있어서, 상기 피험체와 실질적으로 동일한 게놈을 지닌 다기능성 줄기세포로부터 분화된 세포, 조직 또는 장기를 포함하는 의약을 상기 피험체에 투여하는 공정을 포함하는 방법을 제공하는 것이다. 여기서 이 의약을 투여하는 방법은 해당분야에 있어서 이미 알려진 방법을 사용하고 투여방법에는 경구투여, 비경구투여(예를 들면 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 점막 투여, 직장내 투여, 질내 투여, 환부에의 국소투여, 피부 투여 등)이 있다. 이와 같은 투여를 위해 처방물은 임의의 제제형태로 제공된다. 이와 같은 제제 형태로서는 예를 들면 액제, 주사제, 서방제등을 들 수 있다. 또한 의약이 장기인 경우에는 이식에 의해 투여하는 것도 가능하다.
또 다른 측면에 있어서 본 발명은 피험체에 있어서 세포, 조직 또는 장기의 손실에 의한 질환 또는 장애를 처치 또는 예방하기 위해 의약을 제조하기 위한 다기능성 줄기세포의 사용에 있어서, 상기 의약은 상기 피험자와 실질적으로 동일한 게놈을 지니는 다기능성 줄기세포로부터 분화된 세포, 조직 또는 장기를 포함한다. 다기능성 줄기세포의 사용에 관한 것이다.
또 다른 측면에 있어서 본 발명은 원하는 게놈을 지닌 다기능성 줄기세포를 포함하고 의약을 제조하기 위해 다기능성 줄기세포의 사용에 관한 것이다. 의약(예를 들면 바이오테크놀로지 제제)의 제조방법은 해당분야에 있어서 이미 알려진 것이고 당업자는 당국의 규제에 따라서 이것을 제조하는 것이 가능하다.
또 다른 측면에 있어서 본 발명은 원하는 게놈을 지닌 다기능성 줄기세포로부터 분화된 세포, 조직 또는 장기를 포함하고 의약을 제조하기 위해 다기능성 줄기세포의 사용에 관한 것이다.
본 발명에 의해 처치할 수 있는 질환 또는 장애는 본 발명의 줄기세포의 분화에 의한 분화세포, 조직 또는 장기의 장애에 관련된 질환 또는 장애인 것이다. 예를 들면 다음에 열거하는 것으로 이에 한정되는 것은 아니다. 빈혈(예를 들면 재생불량성 빈혈(특히 중증 재생불량성 빈혈), 신장성 빈혈, 암성 빈혈, 이차성 빈혈, 불응성 빈혈 등), 암 또는 종양(예를 들면 백혈병) 및 그의 화학요법 처치 후의 조혈 부전, 혈소판 감소증, 급성 골수성 백혈병(특히 제1관해기(고위험군), 제2관해기 이후의 관해기), 급성 임파성 백혈병(특히 제1관해기, 제2관해기 이후의 관해기), 만성골수성 백혈병(특히 만성기, 이행기), 악성 임파종(특히 제1관해기(고위험군), 제2관해기 이후의 관해기), 다발성 골수종(특히 발증후 조기) 등이다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 있어서 상기 분화세포, 조직 또는 장기는 신경계의 것이다. 이와 같은 질환 또는 장애로서는 예를 들면 치매증, 뇌졸중 및 그의 휴유증, 뇌종양, 척수손상 등을 들 수 있고 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 있어서 상기 분화세포, 조직 또는 장기는 면역계에 있는 것이다. 이와 같은 질환 또는 장애로서는 T 세포 결손증, 백혈병등을 들 수 있고 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 있어서 상기 분화세포, 조직 또는 장기는 운동 골격계에 있는 것이다. 이와 같은 질환 또는 장애로서는 예를 들면 골절, 골다공증, 관절의 탈리, 아탈리(subluxation), 염좌, 혁대 손상, 변형성 관절증, 골육종, 어윈육종, 골형성 부전증, 골연골이형성증(osteochondrodysplasia)을 들 수 있고 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 있어서 상기 분화세포, 조직 또는 장기는 피부계에 있는 것이다. 이와 같은 질환 또는 장애로서는 예를 들면 무모증, 흑색종, 피부 악성임파종, 혈관육종, 조직구증, 수포증, 농포증, 피부염, 습진을 들 수있고 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 있어서 상기 분화세포, 조직 또는 장기는 내분비계에 있는 것이다. 이와 같은 질환 또는 장애로서는 예를 들면 시상하부 하습체질환, 갑상선질환, 부갑상선(상피소체)질환, 부신피질 수질질환, 당대사이상, 근대사이상, 단백질대사이상, 핵산대사이상, 선천성 대사이상(페닐케톤 요증, 갈락토세미아, 호모시스틴유리아, 마플시럽 유린증), 무알부민 혈증, 아스콜빈산 합성능력결여, 고빌리루빈 혈증, 고빌리루빈 요증, 칼리크레인 결손증, 비만세포 결손증, 다이아비츠 인시피더스, 바소프레신 분비이상, 드와르피즘(dwarfism), 울만씨병(애씨드 리파제 결손증), 뮤코 다당증 Ⅵ형 등을 들 수 있고 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 있어서 상기 분화세포, 조직 또는 장기는 호흡계에 있는 것이다. 이와 같은 질환 또는 장애로서는 예를 들면 폐질환(예를 들면 폐렴, 폐암등), 기관지 질환을 들 수 있고 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 있어서 상기 분화세포, 조직 또는 장기는 소화기계에 있는 것이다. 이와 같은 질환 또는 장애로서는 예를 들면 식도질환(예를 들면 식도암), 위 십이지장 질환(예를 들면 위암, 십이지장암), 소장질환, 대장질환(예를 들면 대장 폴립스, 결장암, 직장암등), 담도질환, 간장질환(예를 들면,간경변, 간염(A형, B형, C형, D형, E형등), 급성간염, 만성간염, 원발성간염, 알콜성 간 장애, 약물성 간 장애), 췌장 질환(급성췌장염, 만성췌장염, 췌장암), 복막 복벽 횡경막 질환(헤르니아 등), 힐즈스프렁(Hirschsprung) 병을 들 수 있고 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 있어서 상기 분화세포, 조직 또는 장기는 비뇨기계에 있는 것이다. 이와 같은 질환 또는 장애로서는 예를 들면 신질환(신부전, 원발성 사구체질환, 신혈관장애, 요세관 기능이상, 간질성 신질환, 전신성 질환에 의한 신장애, 신암 등), 방광질환(방광염, 방광암 등)을 들 수 있고 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 있어서 상기 분화세포, 조직 또는 장기는 생식기계에 있는 것이다. 이와 같은 질환 또는 장애로서는 예를 들면 남성 생식기 질환(남성 불임, 전립선 비대증, 전립선 암, 정소암 등), 여성 생식기 질환(여성 불임, 난소 기능 장애, 자궁 근종, 자궁 선근증, 자궁암, 자궁내막증, 난소암 등)을 들 수 있고 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 있어서 상기 분화세포, 조직 또는 장기는 순환기계에 있는 것이다. 이와 같은 질환 또는 장애로서는 예를 들면 심부전, 협심증, 심근경색, 판막증, 심근 심막질환, 선천성 심장질환(예를 들면, 심방 중격 결손, 심실 중격 결손, 동맥관 폐존, 펠로트 사징), 혈관질환(예를 들면, 동맥경화, 동맥류), 정맥질환(예를 들면, 정맥류), 임파관 질환(예를 들면, 임파부종)을 들 수 있고 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 줄기세포로 인한 상기한 바와 같은 질환의 처치에 있어서 종래의 천연물 유래의 줄기세포 이식치료법에 수반하는 부작용(특히 이물 이종세포에 수반하는 예를 들면 감염, 이식편 대숙주병 등)을 피할 수 있다. 그 결과 개인 대응용 테일러-메이드 기술이 본 발명에 의해 최초로 효율적으로 달성하게 되었으며 종래 기술에서는 불가능하거나 곤란하였던 현격한 효과를 지닌 것이다.
본 발명의 또 다른 실시태양은 본 발명의 다기능성 줄기세포는 유전자 개변 된 것인바 이를 본 발명의 다기능성 줄기세포 또는 그 유래의 세포, 조직 또는 장기에 사용하는 경우에 유전자 치료법을 병용할 수 있다. 유전자 치료법은 당해 기술에 있어서 주지되어 있는 바 그 예로는 Curr Gene Ther. 2002 May;2 (2)에 있어서 복수의 리뷰에 기재되어 있다. 이와 같은 유전자 치료의 예로서는 아데노 수반 바이러스, 센다이 바이러스, 애브스테인-바르 바이러스(EBV), 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV), 알파 바이러스(Alphavirus), 렌티 바이러스(Lentivirus)등을 사용하는 것을 열거할 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서 본 발명의 처치 방법은 더욱이 다른 약제와도 투여하는 공정을 포함한다. 이와 같은 약제는 해당 분야에 있어서 공지된 의약품으로 예를 들면 약학에 있어서 공지된 임의의 약제(예를 들면 항생물질 등)이다. 당연히 이러한 약제는 2종 이상의 다른 약제를 포함할 수 있다. 이와 같은 약제로서는 예를 들면 일본 약국방 최신판, 미국 약국방 최신판, 다른 나라의 약국방의 최신판에 있어서 기재된 것을 열거할 수 있다. 이와 같은 약제는 바람직하게는 대상인 질환 또는 처치에 대해 효과를 지니는 것이면 좋고 각각의 질환 또는 처치에 대해 효과를 지니는 것도 바람직하다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 있어서, 본 명세서에 사용되는 체세포는 2종 이상의 세포를 포함한다. 2종 이상의 세포를 사용하는 경우 유사한 성질 또는 유래의 세포를 사용하는 것이 바람직하고 다른 성질 또는 유래의 세포도 사용할 수 있다.
본 발명의 처치방법에 있어서 사용되는 세포 양은 사용 목적, 대상 질환(종류, 중증도 등), 환자의 연령, 체중, 성별, 거주력, 세포의 형태 또는 종류를 고려하여야 한다. 당업자가 결정할 수 있다.
본 발명의 처치방법을 피검체(또는 환자)에 대해 사용하는 빈도는 사용 목적, 대상 질환(종류, 중증도 등), 환자의 연령, 체중, 성별, 거주력 및 치료 경과 등을 고려하여 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들면 매일 몇 회부터 몇개월에 1회(예를 들면 1주일에 1회, 1개월에 1회)로 투여할 수 있다. 1주일-1개월에 1회의 투여를 경과시킨 후 관찰하여 결정하는 것이 바람직하다.
본 발명의 의약에 포함되는 약학적으로 수용 가능한 캐리어는 당해 분야에 있어서 공지의 임의 물질을 사용한다.
이와 같은 적절한 처방재료 또는 약학적으로 수용 가능한 인자로서는 이하 열거한 것을 들 수 있고 이에 한정하지 않는다. 항산화제, 보존제, 착색료, 풍미료 및 희석제, 유화제, 현탁화제, 용매, 필러, 증량제, 완충제, 송달 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 약학적 애쥬번트 등이다. 대표적으로는 본 발명의 의약은 분리시킨 다기능성 줄기세포, 또는 그 개변체로서의 유도체를 한 개 이상의 생리학적으로 수용 가능한 캐리어, 부형제 또는 희석제 등을 함유한 조성물의 형태로 투여한다. 예를 들면 적절한 비히클은 주사용 증류수, 생리 식염수, 또는 인공 척수액 등이고 이것들은 비경구 송달을 위하여 조성물에 일반적으로 다른 물질을 보충하는 것도 가능하다.
예시에 적절한 캐리어로는 중성 완충화 생리식염수, 또는 혈청 알부민 혼합된 생리식염수 등을 열거할 수 있다. 바람직하게는 이 생성물은 적절한 부형제(예를 들면 슈크로오즈)를 사용하여 동결건조시켜 처방한다. 다른 표준적인 캐리어, 희석제 및 부형제는 필요시 포함할 수 있다. 다른 예시적 조성물은 pH 7.0-8.5의 트리스 완충액 또는 pH 4.0-5.0의 초산 완충액을 포함하는 것으로 이것은 더욱 솔비톨 등의 적절한 대체물을 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 의약은 비경구적으로 투여한다. 또는 본 발명의 의약은 정맥내 또는 피하로 투여한다. 전신 투여할 때에는 본 발명에 있어서 사용되는 의약은 발열물질을 포함하지 않는다. 약학적으로 수용 가능한 수용액 형태로 얻어진다. 이와 같은 약학적으로 수용 가능한 조성물의 조제는 세포, 조직 또는 장기의 생존, pH, 등장성, 안정성 등에 상당한 주의를 기울여야 하며 당업자의 기술범위 내에 있다.
본 발명의 의약은 필요에 따라 생리학적으로 수용가능한 캐리어, 부형제 또는 안정화제(일본 약국방 제14판 또는 그의 최신판, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990 등을 참조)와 원하는 정도의 순도를 지닌 세포조성물을 포함하는 것에 의해 동결건조시킨 케이크 또는 수용액의 형태로 제조되어 보존되는 것이다.
본 명세서에 사용하는 수용가능한 캐리어, 부형제 또는 안정화제는 레시피언트에 대해 비독성이다. 더욱 바람직하게는 사용되는 투약량 및 농도에 있어서 불활성인 것으로 다음을 열거할 수 있다. 인산염, 시트르산염 또는 기타의 유기산; 항산화제(예를 들면, 아스콜빈산); 저분자량 폴리펩타이드; 단백질(예를 들면 혈청알부민, 세럼 또는 면역 글로브린); 친수성 폴리머(예를 들면 폴리비닐피롤리돈); 아미노산(예를 들면 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신); 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타의 탄수화물(포도당, 만노오즈, 또는 덱스트린 포함); 킬레이트제(예를 들면 EDTA); 당알코올(예를 들면 만니톨 또는 솔비톨); 염형성이온(예를 들면 나트륨); 및/또는 비이온성 계면활성제(예를 들면 Tween,플루로닉스, 폴리에틸렌글리콜(PEG))등이다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에 있어서 후천적으로 재프로그램화 인자에 원하는 게놈(예를 들면 치료 대상 개체와 실질적으로 동일한 게놈)을 지닌 세포(예를 들면 체세포)를 노출하는 것에 의해 원하는 게놈을 지닌 다기능성 줄기세포를 얻을 수 있다.
본 발명의 제조방법에 따라 얻어지는 미분화된 체세포 융합세포, 상세히는, 상기 융합세포 유래의 세포, 조직 또는 장기는 ES 세포 유래의 이식항원의 일부 또는 전부를 지니지 않는 이식용으로 사용하는 경우 레시피언트에 있어서 거부반응이 종래의 ES세포만으로부터 유래의 세포, 조직-장기에 비해 감소된 것이기 때문에 심근경색, 파킨슨씨병, 당뇨병 및 백혈병을 포함하는 다수의 질병에 있어서 이식치료용의 무한한 재료가 된다. 또한, ES 세포의 무한 증식성 및 다분화 기능 성질을 유지하고 있기 때문에 의약품, 화장품 등의 시험 및 제조에 이용할 수 있다. 게놈 계획등에 따라 서열이 알려진 유전자 등의 기능 분석에도 유효하다. 또한 본발명의 다기능성 줄기세포는 특정의 세포, 조직 또는 장기에 분화 유도하기 위해서 필요로 하는 세포증식인자, 성장인자 등의 스크리닝에 사용할 수도 있다.
더욱이, 본 발명에 의한 재프로그램화에 관련된 분자구조에 관한 연구 조작이 가능한 실험계를 제공하는 것이다. 이것은 ES 세포와 체세포와의 융합세포를 제작하는 것에 의해 최초로 관찰 할 수 있게 되었다. 인비트로에 있어서, ES 세포의 체세포 핵의 적어도 일부를 재프로그램화 하는 기능을 이용한 것이다. 흉선세포와 ES 세포를 융합시킨 후에도 H19 및 Igf2r 의 체세포 특이한 메틸화 패턴은 변화하지 않았다. 통상 이 대립 유전자 특유적 메틸화는 수정후의 발달에는 유지되지만 생식세포의 발달에는 보지되지 않는다 [Tremblay K. D. et al., Nature Ganer. 9: 407-413(1995); Stroger R. et al., Cell 73:61-71(1993)]. 실제로 EG-흉선세포 융합세포에는 Igf2r을 포함하는 임프린트 유전자 각개의 메틸화 패턴은 방해되고 양방의 대립 유전자가 모두 메틸화 되지 않는다[Tada M. et al., EMBO J. 16:6510-6520(1997)]. 이 사실로부터 ES 세포 및 EG 세포 모두가 생식세포의 발달을 가능케 하는 체세포 핵의 에피제네틱 상태를 재프로그램화 할 수 있는 유사한 세포성 인자를 보유하고 있는 것으로 여겨진다. EG 세포와 달리 ES 세포는 임프린트는 재프로그램화 되지 않는다. ES ×EG 융합세포중에 Igf2r의 메틸화 분석에 의해 EG 세포가 보다 강력한 에피제네틱스의 재프로그램화에 관여하여 부가적인 우성인자를 지니고 있는 것이 시사되었다. 실제에 있어서 ES 세포 및 EG 세포는 각각의 세포 기원의 특성을 반영하고 있는 것이다. 따라서 ES 세포 및 EG 세포의모두가 에피제네틱스의 재프로그램화 및 초기 생식세포 및 생식선 PGC 중의 탈 메틸화에 관여하는 인자를 동정하기 위한 유용한 재료인 것이다.
체세포 핵을 사용하는 동물 클론의 제작에는 성체의 것을 사용하는 경우 클론의 생존율은 매우 낮아진다. 이식 전에 야기된 배아의 상실은 부분적으로는 핵-세포질 상호작용의 상실의 결과이다[Kato Y. et al., Science 282:2095-2098(1998); Wakayama T. et al., Nature 394: 369-374(1998)]. 더욱이 임신 중 및 탄생 직후에 다수의 클론화된 형태가 없어지며 이 발전단게에 있어서 실패의 이유의 하나는 체세포 핵의 유효한 재프로그램화 인자의 결여로 인지된다. 실험을 통해 ES 하이브리드 클론에서 안정하게 GFP 발현이 관측되면 이 계에 있어서의 핵의 재프로그램화가 정상인 것을 나타낸다. H19 및 IGF2r유전자에 있어서 체세포로부터의 시원 메틸화 임프린트는 ES 하이브리드를 유지하며 세포의 또는 종의 에피제네틱스 프로파일은 세포 융합에 의해 영향받지 않는 것임을 나타낸다. 이것은 체세포 유래의 불활성 X 염색체가 그 기원을 '메모라이즈드' 하고 클론화 배의 영양외배엽세포 중의 불활성화에 랜덤하지 않게 선택되는 것이다.[Eggan K. et al., Science 290:1578-1581(2000)]의 발견에 의해서도 지지되는 것이다.
정상적인 배발달을 위한 능력을 도입하고 체세포 핵의 에피제네틱스의 재프로그램화에 관한 기구는 아직 충분히 밝혀지지 않았다. 최근 SW12/SNF2 헬리카제/ATP아제 패밀리-의 멤버인 ATRX 유전자에 있어 변이가 포유동물중의 어느정도 반복된 배열의 메틸화 프로파일을 변화시키는 것이 알려졌다[Gibbons R. J. et al., Nat. Genet. 24:368-371(2000)]. 그 결과 탈메틸화, 염색체 재구축의 결과로써 야기되는 가능성이 시사된다. ATPase 의존성의 DNA 헬리카제에 있는 ISWI의 모계 활성이 카에루의 클론화된 체세포에 있어서 핵의 재프로그램화의 과정에서 염색체 리모델러로써 기능하는지 여부도 보고되어 있다.[Kikyo N. et al., Science 289 :2360-2362(2000)]. 제노푸스의 난중에서 단시간에 인큐베이트된 Xenpus XTC-2 상피세포로부터 추출된 핵은 재구축시켜 기초전사복합체의 주요 성분인 TBP를 실활시킨다. 따라서 ES 세포의 재프로그램화 활성은 체세포의 에피제네틱스의 기억의 상실을 야기하는 것이고 느슨한 구조의 염색체 형성을 용이하게 하는 것이다. 본 발명의 미분화 체세포 융합세포에 있어서는 체세포 유래의 임프린트가 보지되어 있는 정상적인 재프로그램화를 행하고 EG 세포를 사용하는 경우에 비해서도 동물 클론의 제작에 있어서뿐만 아니라 이식용의 세포, 조직 또는 장기의 제작에 있어서도 유리한 것이다. 마우스 ES 세포중에 임프린트되어 있는 몇 개의 유전자의 에피제네틱스의 불안정성 때문에 인간 ES 세포를 임상적으로 적용하기 전에 그 에피제네틱스의 상태를 평가할 필요가 있는 것을 시사하고 있다[Humpherys D. et al., Science 293:95-87(2000)]. 숙주 ES 세포의 염색체를 제거한 경우 ES 융합세포는 특히 유용한 치료수단이다. 또한 재프로그램화 인자가 동정되어지면 그 인자를 이용하는 것에 의해 에피제네틱스를 조작할 수 있는 것으로 사료된다. 이와 같은 인자의 동정에 의해 포유동물의 배아를 사용하는 것도 좋고 성인 체세포로부터의 클론화 또는 조직 특이적인 줄기세포를 생산할 수 있다. 이와 같은 기술은 세포 또는 조직의 이식을 필요로 하는 다수의 임상적용에 있어서 도너 세포의 생산을 가능케 하는 것이다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 설명한다. 이하의 실시예는 예시의 목적으로만 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 상기 발명의 상세한 설명에도 이하 실시예에도 한정하는 것은 아니고 청구범위에 의해서만 한정된다.
이하, 본 발명은 실시예를 통해 더욱 상세히 설명한다. 본 발명은 실시예에 한정적인 것은 아니다.
(실시예 1) 체세포의 융합 세포의 제조
1. 키메라 배아의 제조
(1) ES 세포주 및 EG 세포주의 수립
ES 세포주로서, E3.5 수컷 129/Sv 배반포로부터 수립된, ES 세포주 TMAS-5[Isolation, Culture, and Manipulation of embryonic stem cells (pp. 254-290) in "Manipulation the mouse embryo: A Laboratory Manual 2nd Edition" edited by Hogen, Beddington, Castantini and Lacy(Cold Spring Harbor Laboratory Press,USA(1994)] 및 neo/lacZ 수용체 유전자를 운반하는 Rosa26 배반포유래 G418-저항성 ES 세포주 NR-2[Friedrin G and Soriano P., GenESDev. 5:1513-1523(1991)]가 사용되었다. EG 세포주로서, E12.5 암컷 PGC로부터 수립된 EG 세포주 TMA-58G[Tada M. et al., EMBO J., 16:6510-6520(1997)] 및 약물-저항성 유전자 pSV2bsr을 TMA-58G 세포 내로 트랜스펙트시킴으로서 생성된 블라스토이딘 하이드로클로라이드(BS)-저항성 EG 세포주(TMA-58Gbsr)가 사용되었다. 이들 세포는 마우스 G418-저항성 최초 배아 섬유아세포(PEF) 피더(feeder) 세포(Rosa26의 12.5 일령 배아 내 초기 배양된 섬유아세포로부터 일반 기술을 이용하여 제조됨) 상에 서 유지되었고, 이들은 ES 배지(15% 태아 소혈청, 10-4Ms-멀캅토에탄올 및 1000 유니트/mL 재조합 백혈병 억제자(LIF; ESGRO))로 보충된 Dulbecco's Modified Eagle's 배지(DMEM) 내 마이토마이신 C로 불활성화되었다. TMA-58Gbsr세포는 3∼4 μG/mL BS를 함유한 ES 배지 내에서 배양되었다. 하기 세포 융합 실험에 사용된 ES 세포주 및 EG 세포주는 10 세대수 내에 있다.
(2) 세포 융합에 의한 하이브리드 클론의 제조
(2)-1. ES 융합 세포
6∼8 주령 흉선 세포의 하기 3가지 타입으로부터 유래된 흉선 세포 :
(A) 신체 전체 세포 내에서 neo/lacZ 수용체 유전자를 발현하는 129/Sv-TgR(Rosa26) 26Sor(Rosa26으로 표기됨)[Friedrin G and Soriano P., GenESDev. 5:1513-1523(1991)]
(B) 분화전능성 및 다기능성 세포가 특이적으로 GFP를 발현하는 GOF-18/GFP(Oct4-GFP)로 표기됨)[Yoshimizu T. et al., Develp. Growth Differ., 41:657-684(1999)]
(C) neo/lacZ 수용체 유전자오 Oct4-GFP 모두를 포함하는 (Rosa26 ×Oct4-GFP) F1 형질전환 마우스(암컷 Rosa26 마우스를 수컷 Oct4-GFP와 교미시킴으로서 수득된 하이브리드 마우스)[Yoshimizu T. et al., Develp. Growth Differ., 41:657-684(1999)]
Rosa26 마우스는 그의 꼬리 끝을 X-gal 염색함으로서 확인되었다. Oct4-GFP 마우스는 하기 프라이머를 이용하여 그의 꼬리로부터의 DNA의 PCR 분석함으로서 확인되었다 : OCGOFU35, 5'-CTAGGTGAGCCGTCTTTCCA-3'(서열번호: 1) 및 EGFPUS23, 5'-TTCAGGGTCA GCTTGCC GTA-3'(서열번호: 2). 형질전환 마우스로부터 수득된 흉선은 18-게이지 바늘을 통해 여러 번 통과되어 단일 세포의 현탁액을 수득하였다 ES 세포로서 TMA-5 세포가 사용되었고 상술된 3가지 타입의 흉선세포와 1 : 5(ES 세포 : 흉선세포)의 비율로 혼합되었고 PBS로 3회 세척되었다. 세포는 1 ×106세포/mL의 농도로 0.3 M 만니톨 완충액 내에 현탁되었다. 1-mm 전극 갭을 지닌 유리 슬라이드와 Electro Cell Manipulator 2000(BTX)가 전기 융합(E =2.5∼3.0 KV/cm)을 수행하는데 사용되어 융합 세포가 제조되었다. 융합 세포는 하루 동안 ES 배지 내에서 배양되었다. 불활성화된 G418-저항성 PEF가 250 ㎍/mL의 G418을 함유한 ES 배지 내에서 7∼10일 내에 선택되었다. 융합 세포 클론이 수집되었고 G418로 보충된 ES 배지 내에 도포되었고(세대 1) 3∼4일간 배양되었다. ES 하이브리드 클론은 2일 마다 새로운 배지에 이차배양되었다.
(2)-2. ES ×EG 융합 세포
ES ×EG 융합 세포는 하기와 같이 생성되었다. NR2 ES 세포와 TMA-58GbsrEG 세포가 1 : 1의 비율로 혼합되었고 1 ×106세포/mL의 농도로0.3 M 만니톨 완충액 내에 현탁되었다. ES ×EG 융합 세포는 250 ㎍/mL G418 및 3∼4 ㎍/mL BS를 함유한 ES 배지 내에서 7∼10일 내에 선택되었다.
ES 하이브리드 클론은 이전 연구에서 본 발명자에 의해 생성된 EG 하이브리드 클론과 유사한 비율(2.8 ×10-4)로 유지될 수 있다[Tada M. et al., EMBO J. 16:6510-6520(1997)]. 모든 타입의 융합 세포는 부계 ES 세포와 유사하고 어떠한 형태학적 변화도 나타나지 않았다. G-밴딩을 이용한 세포유전학적 분석은 실험에 사용된 모든 13 ES 융합 세포 및 2 ES ×EG 하이브리드 클론 내에 3개의 X 염색체와 1개의 Y 염색체를 포함한 완전한 염색체 세트를 증명하였다. 또한 2∼4 세대의 ES 하이브리드 및 ES ×EG 하이브리드 세포주가 분자 분석에 사용되었다.
(3) 융합의 확인
ES 세포와 분화된 세포 사이의 융합을 확인하기 위해 각각 T 세포 수용체(Tcr) β의 D-J 구역, 면역글로블린(Ig) H의 D-J 구역 및 Tcrδ 및 Tcrγ의 V-J 구역에 특이적인 4개의 프라이머가 주형으로서 흉선세포 및 ES 융합 세포로부터 추출된 DNA를 이용한 PCR 증폭을 수행하는데 사용되었다. 성체 흉선, ES 세포 및 ES 하이브리드 클론으로부터의 게놈 DNA(0.5 ㎍)에 있어서, 하기 프라이머 세트를 이용하여 각 유전자의 재배열을 검출하기 위해 PCR 증폭이 수행되었다 :
(A) Tcrβ유전자의 Dβ2-Jβ2 재배열 : Dβ2, 5'-GTAGGCACCTGTGGGGAAGA AACT-3'(서열번호: 3); Jβ2, 5'-TGAGAGCTGTCTCCTACTATCGATT-3'(서열번호: 4) [Levin S. D. et al., EMBO J. 12:1671-1680(1993)];
(B) IgH 유전자의 D-J 재배열 : Dμ, 5'-ACAAGCTTCAAAGCACAATGCCTGGCT-3'(서열번호: 5); Jμ, 5'-GGGTCTAGACTCTCAGCCGGCTCCCTCAGG-3'(서열번호: 6)[Gu H. et al., Cell 65:47-54(1991)];
(C) Tcrγ유전자의 Vγ7-Jγ1 재배열 : Vγ7, 5'-CTCGGATCCTACTTCTAGCT TTCT-3'(서열번호: 7); Jγ1, 5'-AAATACCTTGTGAAAACCTG-3'(서열번호: 8)[Livak F. et al., J. Immunol. 162:2575-2580(1999)]; 및
(D) Tcrδ 유전자의 Vδ5-Jδ1 재배열 : Vδ5, 5'-CAGATCCTTGCAGTTCATCC-3'(서열번호: 9); Jδ1, 5'-TCCACAGTCACTTGGGTTCC-3'(서열번호: 10)[Wilson A. et al., Immunity 4:37-45(1996)].
PCR 생성물은 1.2% 아가로스 겔 상에서 전기영동되었고 에티듐 브로마이드로 염색되었다. PCR 생성물의 특이성이 : Tcrβ에 대해 비오틴처리된 Jβ2-특이적 올리고프로브(5'-TTTCCCTCCCGGAGATTCCCTAA-3'(서열번호: 11)[Levin S.D. et al., EMBO J. 12:1671-1680(1993)]); 및 IgH에 대해 비오틴처리된 JH4 올리고프로브(5'-CCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTG-3'(서열번호: 12)[Ehlich A. et al., Cell 72:695-704(1993)])를 이용한 서던 하이브리디제이션에 의해 확인되었다.
DNA의 재배열은 흉선세포가 임파세포로 분화되었음을 나타내는 뚜렷한 증거이다[Fowlkes, B.J. and Pardoll D.M., Adv. Immunol. 44:207-264(1989)]. TcrβD-Jβ2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5 또는 2.6에 대한 특이적 재배열은 45%의 하이브리드 클론에서 관찰되었다(도 1a). 또한 여러 클론에서 유사한 재배열이 IgH의 D-J 국역(도 1b) 및 Tcrδ 및 Tcrγ의 V-J 구역(각각 도 1c 및 1d)에서 관찰되었다. 연구된 31 ES 하이브리드 클론 중에서 적어도 연구되었던 총 17 클론(55%)이 재배열을 겪었다. 이들 경우 ES 세포가 흉선세포 핵의 분화 후 임파세포로 융합된 것으로 여겨진다.
(4) X 염색체 활성
암컷 체세포에서 2개의 X 염색체 중의 하나는 X-링크된 유전자의 용량 보상작용에 의해 무작위로 불활성화된다. X 염색체의 불활성화는 초기 세포 분열에서 발생하여 DNA 복제의 후기 S기로의 변환의 지연을 유도하고, DNA의 과메틸화 및 히스티딘 H4의 낮은 아세틸화를 포함한 에피유전자 변화가 발생하는 것으로 알려져 있다. 체세포 핵의 난모세포로의 핵 이식에 의해 수득된 클론된 배아에서 암컷 체세포의 불활성화된 X 염색체가 재활성화된다[Eggan K. et al., Science 290:1578-1581(20000)]. 따라서 X 염색체 둘 모두의 활성화는 핵의 재프로그램화 발생의 지표로서 작용한다. X 염색체의 활성을 분석하기 위해 본 발명자는 복제 분화 염색 방법을 이용하여 연구하였다[Sugawara O. et al., Chromosoma 88:133-138(1983)](도 2a).
(4)-1. X 염색체의 복제 타이밍
상술된 섹션 (2)에서 기술된 ES 융합 세포 및 ES ×EG 융합 세포의 염색체 제조가 150 ㎍/mL의 5-브로모-2-디옥시 우리딘(BrdU)에 7시간 도안 세포를 배양하고, 마지막 1시간 동안에는 0.3 ㎍/mL의 콜세마이드(colcemide)의 존재 하에 세포를 배양함으로서 생성되었다. 이후 세포는 상온에서 8시간 동안 0.075 M KCl로 저삼투 처리되었다. 이후 세포는 메탄올 : 아세트산 (3 : 1) 용액에 침수됨으로서 고정되었고 공기 건조되었다. 세포는 신선하게 제조된 아크리딘 오렌지 용액으로 염색되었다. 슬라이드는 표준 B 필터로 형광현미경 하에서 관찰되었다. S기의 마지막 단계에서 BrdU의 연속된 통합 및 아크리딘 오렌지 염색 후 활성 X 염색체 및 상염색체는 복제의 지연에 의해 암컷 체세포 내에서 균일하게 어두운-적색 염색되었다(도 2b). 핵형이 결정된 모든 32 세포 (4n=80) 중에서 XY 암컷 EX 세포 및 XX 암컷 흉선세포의 6 융합 세포 클론은 동시에 복제되는 3개의 X 염색체를 운반하였다(도 2c).
(4)-2. Xist RNA FISH
cy3-dUTP(Amersham Pharmacia)를 이용하여[Sado T. et al., Development 128:1275-1286(2001)] 엑손 1∼7의 시리즈를 포함한, Xist cDNA 클론 혼합물의 니크(nick) 번역에 의해 제조된 프로브가 사용되었고 4-1에서 수득된 염색체와 하이브리다이즈되었다. 하이브리디제이션 및 세척은 앞서 기술된 바와 같이 수행되었다[Lawrence J.B. et al., Cell 57:493-502(1989)]. 결과는 (4)-1에서 수득된 결과 즉, Xist(inactive X specific transcript) RNA가 RNA FISH(fluorescence in situ hybridization)에 의해 시험된 2개의 ES 하이브리드 세포주 내에서 3개의 X 염색체 상에 안정하게 축적되지 않았다는 사실과 일치하였다(도 2d). Xist 축적은 또한 수컷 ES 세포의 활성 X 염색체 상에서도 불안정하였고, 암컷 흉선세포(채색된 시그날)의 불활성 X 염색체 상에서 안정하였다. 체세포 핵-유래 불활성 X 염색체는 하이브리디제이션 후 활성 X 염색체의 일부 특성을 획득하였고 비분화된세포에서 관찰된 것과 유사한 복제 및 Xist 발현 패턴을 지녔다. 상술된 (4)-1 및 (4)-2에 나타난 ES 융합 세포 내 복제 타이밍 변화 및 체세포의 X 염색체의 Xist RNA 축적은 체세포 핵이 세포 융합 후 재프로그램됨을 나타낸다.
(5) 체세포 핵의 재프로그램화
Oct4-GFP 트랜스유전자를 지닌 마우스 세포주가 체세포 핵의 재프로그램화를 시각화하는데 사용되었다(도 3). Oct4의 발현은 생식세포, 이식 전 배아 및 이식 전 초기 배아의 외배엽에서 특이적으로 관찰되었다. 따라서 Oct4의 활성은 분화전능성 및/또는 다기능성 세포의 확인을 위한 이상적 마커로서 사용될 수 있다. Oct4-GFP의 발현 패턴은 내생적 Oct4의 발현 패턴과 비교가능한 것으로 알려져 있다[Yoshimizu T. et al., Develop Growth Differ. 41:675-684(1999)]. Oct4-GFP의 발현은 Oct4-GFP 형질전환 마우스의 흉선 및 난소에 대해 조사되었다. GFP는 성장 난소에서 조사되었으나 흉선에서는 조사되지 않았다(도 3a∼d).
Oct4-GFP 형질전환 마우스의 흉선 세포는 ES 세포와 융합되었고 스크리닝 없이 배양되었다. GFP의 발현은 12시간마다 조사되었다. 배양 디쉬 상의 살아있는 ES 융합 세포 내 GFP의 발현은 GFP 여기 소스 및 GFP 필터를 지닌 해부현미경(Leica)으로 조사되었다. 48시간 후 16개 세포로 구성된 GFP 양성 콜로니가 더 큰 비-발현 콜로니의 주변에서 관찰되었다(도 3e, f). 또한 일부 다른GFP 양성 콜로니가 융합에 도달하기 전 동일한 배양 플레이트 상에서 관찰되었다. 동일한 조건 하에서 배양된 비-융합 흉선세포 중 어떠한 GFP 양성 세포도 관찰되지 않았다. 체세포 핵이 모든 ES 융합 세포 내에서 재프로그램되는지 여부를 조사하기 위해 G419 선택-저항성 F1 마우스의 흉선세포가 사용되었다. 스크리닝 후 36개의 수득된 37 클론이 GFP를 발현하였다(97%). 일부 세대에 걸친 이차배양 후에도 발현은 안정하게 유지되었고(도 3g, h) 이는 흉선세포의 핵이 대부분의 ES 융합 세포에서 재프로그램되었음을 나타낸다. 세포 융합 전 흉선세포 내에서 억제된 Oct4-GFP 트랜스유전자는 ES 융합 세포 내에서 재활성화되었다. 이는 세포 융합 후 체세포 핵이 재프로그램된다는 (4)의 결과를 지지한다.
(6) 배반포 내로의 도입
정상 2배체 배반포가 ES 융합 세포를 지닌 키메라 배아를 생성하는데 사용되었다. 2배체 배반포는 ICR 수컷과 교미된 3.5일 임신 ICR 암컷의 자궁으로부터 수득되었다. F1 마우스-유래(분화된) 흉선세포를 지닌 상술된 하이브리드 클론(Rosa26 ×GFP) 및 Rosa26 마우스-유래 흉선세포를 지닌 하이브리드 클론이 4배체 융합 세포로서 사용되었다. 4배체 융합 세포는 잘 확장된 배반포의 할강 구멍 내로 미세주사되었다(또 4a). 이들 배반포는 가상임신 ICR 암컷의 자궁 내로 트랜스펙트되었다. 키메라 배아는 E7.5 자궁으로부터 제거되었고 Reichert 멤브레인이 제거되었고 β-갈락토시다제 염색되었고 조직화학적 분석되었다.
(6)-1. β-갈락토시다제 활성 염색
β-갈락토시다제 활성 염색에 의해 각 키메라에 대한 융합 세포의 상대 분포가 확인되었다. 배양된 세포는 PBS로 세척되었고, 4℃에서 5분간 1% 포름알데하이드, 0.2% 글루타르알데하이드, 0.02% NP40 및 1 mM MgCl2를 포함한 PBS로 고정되었다. 동일한 고정용액은 4℃에서 3∼4시간 동안 배아 및 마우스 꼬리를 고정하는데 사용되었다. 표본은 PBS로 세척되었고, PBS 내 디메틸포름아마이드를 지닌 1 mg/mL의 4-Cl-5-Br-인돌릴-β-갈락토시다제(X-gal), 5 mM 페리시안화칼륨, 5 mM 페리시안화칼륨 및 2 mM MaCl2를 포함한 반응 혼합물로 상온에서 24∼48시간 동안 염색되었다.
(6)-2. 조직화학적 분석
X-gal로 염색된 E7.5 배아는 상승 알코올 시리즈로 탈수되었고, JB-4 플라스틱 수지(polyscience, Warrington, PA) 내에 고정되었다. 극박막 단편(2∼4 ㎛ 두께)이 0.25% 에오신 Y로 음성 염색되었다. 파라핀 내에 고정된 4 주령 테라토마(teratoma)는 8-㎛ 두께 단편으로 절단되었다. 연속적 단편이 헤마톡실린과 에오신으로 염색되었다.
그 결과로서 20개 E7.5 배아 중 8개가 양성이었고 이는 융합 세포의 제한된 분포를 나타내었다(도 4b, c). 상세한 분석은 배아 외배엽, 배아 중배엽 및 내부 기관 내배엽 내 융합 세포로부터의 유도체를 나타내었다(도 4d, e). 상기 기술된 바와 같이 ES 융합 세포는 이식 전 초기 배아 내에서 최초 발아층(외배엽, 중배엽 및 내배엽) 내로의 분화의 발달 능력을 지녔다.
(7) DNA의 메틸화
다음으로, 흉선세포 핵의 재프로그램화가 이식된 유전자 위치의 메틸화에 영향을 미치는지 여부에 대해 흉선세포의 DNA, ES 세포 및 제조된 하이브리드 클론이 서던 블럿 하이브리디제이션에 의해 조사되었다. 서던 블럿 하이브리디제이션은 제한효소로 분해된 게놈 DNA를 0.8% 아가로스를 이용하여 분획 내로 분리하고, 알칼리 블럿팅에 의해 분획을 Hybond N+멤브레인(Amersham) 상으로 전이시키고,32P-dCTP-표지된 프로브로 하이브리다이즈함으로서 수행되었다.
(7)-1. H19 유전자 위치
부계 메틸화된 구역이 발현되는 모계 H19 게놈 위치의 통합된 업스트림이어서 최초 메틸화 각인이 유지되는 것으로 여겨진다[Tremblay K.D. et al., Nature Genet. 9:407-413(1995)]. 흉선세포, ES 세포 및 제조된 하이브리드 클론의 DNA 표본은 BamHI 및 메틸화 민감성 제한효소 HhaI로 분해되었다. 3.8-kb SacI 프로브 및 2.7-kb BamHI 프로브가 흉선세포와 ES 세포 둘 모두로부터의 DNA 내에서 10-kb와 2.7-kb 부계 메틸화 단편 및 7.0-kb와 1.8-kb 모계 비메틸화 단편을 검출하는데 사용되었다. 동일한 패턴이 하이브리드 클론에서 발견되었다. 메틸화 단편 밴드(RI=0.60)와 비메틸화 단편 밴드(RI=0.40) 사이에 어떠한 차이도 없었다(도 5a). 유사한 결과가 2.7-kb 부계 메틸화된 단편 및 1.8-kb와 0.8-kb 모계 비메틸화 단편이 확인된 BamHI 프로브 내에서 관찰되었다. 모든 표본에 있어서 메틸화 밴드 (RI=0.55) 및 비메틸화 밴드(RI=0.45)가 유사하게 검출되었다(도 5a).
(7)-2. Igf2r 유전자 위치
Igf2r 구역 2의 메틸화의 분석용 프로브는 하기 프라이머를 이용한 PCR에 의해 생성되었다 : 5'-AATCGCATTAAAACCCTCCGAACCT-3'(서열번호: 13) 및 5'-TAGCA CAAGTGGAATTGTGCTGCG-3'(서열번호: 14)[Stoger R. et al., Cell 73:61-71(1993)]. Ifg2r 유전자의 인트론이고 메틸화에 의해 각인되는 것으로 알려진 CpG 아일랜드가 대립유전자 상에서만 메틸화된다[Stoger R. et al., Cell 73:61-71(1993)]. 상술된 섹션 (7)-1에서와 같이 각 DNA 표본은 PvuII 및 메틸화 민감성 제한효소 MluI로 분해되었다. 2.9-kb 모계 메틸화 단편 및 2.0-kb 부계 비메틸화 단편이 흉선세포와 ES 세포 둘 모두로부터의 DNA 내에서 330-bp Igf2r CpG 아일랜드 프로브로 검출되었다(도 5b). 동일한 패턴이 하이브리드 클론에서도 발견되었다. 메틸화 밴드 (RI=0.55)와 비메틸화 밴드(RI=0.45) 사이에 어떠한 차이도 없었다(도 5a).
섹션 (7)-1 및 (7)-2에 따라서 흉선세포 게놈의 H19 업스트림 구역 및 Igf2r 인트론 구역의 최초 메틸화는 ES 세포와의 융합에 의해 영향 받지 않음이 증명되었다. 이러한 결과는Igf2r의 모계 특이적 메틸화가 사라진 E12.5 마우스의 생식세포 PGC로부터 유래된 EG 세포와 흉선세포의 하이브리드 클론에서 앞서 관찰된 것과는 다르다[Tada M. et al., EMBO J. 16:6510-6520(1997)]. ES 융합 세포 내에서의 체세포 메틸화 패턴의 유지는 ES 세포와 EG 세포가 각인된 유전자의 DNA 메틸화를 조절하는 다른 조절 메카니즘을 지님을 나타낸다. Igf2r의 모계 대립유전자 특이적 메틸화가 ES 세포에서 관찰된 반면 EG 세포 및 약 1 : 3 비율의 ES 세포 DNA와 EG 세포 DNA의 혼합물과 대조군 1 : 1에서는 관찰되지 않았다(메틸화/RI=0.27, 비메틸화/RI=0.73). ES ×EG 하이브리드에서 메틸화 밴드가 사라졌고(도 5c), 이는 EG 세포 내 탈메틸화 활성이 ES 세포 내 메틸화 각인의 유지보다 우세함을 나타낸다.
2. 테라토마의 제작
섹션 1에서의 키메라 배아의 생성방법과 유사한 방법으로 생성된 TMAS-5ES세포의 융합 세포 및 Rosa26-유래 흉선세포가 4배체 융합 세포로서 사용되었다. 약 1억 내지 5억개의 4배체 융합 세포가 SCID 마우스(CLEA Japan KK)의 뒷다리 서혜부로 피하주사되었다. 피하주사 4주 후 테라토마가 수집되었다. X-gal 염색에 의해 테라토마가 융합 세포로부터 유래되었음이 결정되었다. 이후 테라토마는 Bouin 고정제 내에 고정되었고 핵과 세포질 모두를 염색하기 위해 헤마톡실린-에오신(HE) 염색되었다. HE 염색 결과 근육, 연골, 상피세포 및 뉴런이 관찰되었다(도 6).
(실시예 2) 재프로그램화 인자의 확인 및 이용
(융합 세포)
전기 융합, ES 세포 및 융합 세포의 배양 및 염색체의 분석은 특히 하기와 같이 당분야에 잘 알려진 표준절차에 따라 수행되었다[Tada, M., Tada, T., Lefbvre, L., Barton, S.C. & Surani, M.A., EMBO J., 16:6510-6520(1997)].
2가지 타입의 융합 세포를 만들기 위해 본 발명자는 2가지 타입의 ES 세포주인 X 염색체 상의 Hprt 유전자 결함성 도메스티커스(domesticus) XY ES 세포주 및 MP4 결함성 몰로시너스(molosinus) XY ES 세포주를 사용하였고, 이들 세포주는 "Manipulating the Mouse Embryo : A Laboratory Manual 2nd Edition" edited by Hogen, Beddington, Castantini and Lacy(Cold Spring Harbor Laboratory Press,USA(1994)에 따라 수립되었다. 특히, 배반포는 교미 후 3.5 일령 암컷 자궁으로부터 세척되었다. 수득된 배반포는 마이토마이신 C로 불활성화된 마우스 초기 섬유아세포(PEF) 상에서 배양되었다. 15% 태아 소혈청, 항생제, L-글루타민, 중탄산나트륨, 피루부산나트륨, 멀캅토에탄올, 백혈병 억제자(LIF)로 보충된 MEM+F12 배지(Sigma)인 ES 배양 배지가 사용되었다("Manipulating the Mouse Embryo : A Laboratory Manual 2nd Edition" edited by Hogen, Beddington, Castantini and Lacy(Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA). 배양 5일 후 배반포의 내부 세포 집단으로부터 유래된 증식세포가 티로신 처리에 의해 분리되었고 새로운 PEF 상에 배양되어 ES 세포가 정제되었다.
융합 세포주, HxJ-17 및 18이 하기와 같이 도메스티커스 Hm1 ES 세포와 몰로시너스 JF 마우스로부터의 흉선세포 사이의 전기 융합에 의해 수득되었다. ES 세포와 체세포를 포함한 만니톨(0.3 M) 완충 현탁액이 제조되었다. 현탁액은 1 mm의 전극 갭을 지닌 융합 슬라이드 상에 놓였다. 60초간 10 V로 교류전류가 현탁액에 가해졌고, 10 마이크로초 동안 250 V로 직류전류가 가해졌다. 이후 처리된 혼합물은 ES 배지 내에서 PEF 피더 세포 상에서 배양되었다("Takinokansaibo no Saipuroguramukakassei, In Jikken Igaku Bessatsu Posutogenomujidai no Jikkenkoza 4; Kansaibo Kuron Kenkyu Purotokoru [Reprogramming Activity of Pluripotent Stem Cell, In Experimental Medicine, Special Clone ResearchProtocol]", pp 191-198, Yodo-sho(Tokyo) 등). 상술된 ES 배양 배지는 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT) 선택적 시약으로 보충되어 HAT 선택적 배양 배지를 수득하였다. 상술된 융합 세포는 HAT 선택적 배양 8일 후 수득되었다.
다른 융합 세포주, MxR-2 및 Mxr-3은 하기와 같이 모노시너스 MP4 ES 세포와 도메스티커스 129/Sv-Rosa26 형질전환 마우스(lacZ/neo가 마우스 내에서 전체적으로 발현됨)로부터의 흉선세포의 전기 융합에 의해 수득되었다. ES 세포와 체세포를 포함한 만니톨(0.3 M) 완충 현탁액이 제조되었다. 현탁액은 1 mm의 전극 갭을 지닌 융합 슬라이드 상에 놓였다. 60초간 10 V로 교류전류가 현탁액에 가해졌고, 10 마이크로초 동안 250 V로 직류전류가 가해졌다. 이후 처리된 혼합물은 ES 배지 내에서 PEF 피더 세포 상에서 배양되었다("Takinokansaibo no Saipuroguramukakassei, In Jikken Igaku Bessatsu Posutogenomujidai no Jikkenkoza 4; Kansaibo Kuron Kenkyu Purotokoru [Reprogramming Activity of Pluripotent Stem Cell, In Experimental Medicine, Special Clone Research Protocol]", pp 191-198, Yodo-놈(Tokyo) 등). 상술된 ES 배양 배지는 세포가 결국 배양되는, G418 선택적 배양 배지를 수득하도록 Geneticin(Sigma) 선택적 시약으로 보충되었다. 상술된 융합 세포는 G418 선택적 배양 8일 후 수득되었다(Tada, M., Takahama, Y., Abe, K., Nakatsuji, N., and Tada, T. (2001), Curr. Biol., 11:1553-1558).
(면역조직화학)
세포 및 조직의 X-gal 염색은 하기와 같이 표준절차에 의해 수행되었다(Tada, M., Tada, T., Lefbvre, L., Barton, S.C. & Surani, M.A., EMBO J., 16:6510-6520(1997)).
4개의 융합 세포 클론(HxJ-17, HxJ-18, MxJ-2 및 MxJ-3)으로부터 테라토마를 형성하기 위해 각 클론의 약 1 ×106세포가 면역결핍성 SCID 마우스의 서혜부로 피하주사되었다. 테라토마 형성은 주사 후 4-5주의 모든 사이트에서 관찰되었다. 4% PFA로 고정된 테라토마, 배양 세포 및 마우스 뇌의 이식세포가 하기의 항체로의 면역반응을 위해 사용되었다 : 토끼항-TuJ(Babco), 마우스항-Nestin(BD PharMingen), 토끼항-TH(CHEMICON), 마우스항-NF-M(CHEMICON), 토끼항-Ecad(TAKARA), 염소항-β-Gal(Biogeneisi) 및 마우스항-Desmin(DACO). 세포 및 조직의 X-gal 염색이 표준절차에 의해 수행되었다.
(게놈 PCR, RT-PCR 및 서열결정)
융합 클론 내 Tcrβ 및 IgH의 D-J DNA 재배열을 검출하기 위해 게놈 DNA가 하기 기술된 프라이머 세트로의 30 사이클 PCR 반응으로 65℃ 어닐링 온도에서 증폭되었다. 하나의 사이클은 : 30초간 95℃(변성); 30초간 65℃(프라이머 어닐링); 및 30초간 72℃(Taq 효소를 이용한 신장)를 포함한다. DNA PCR 증폭의 30 사이클이 수행되었다.
Tcrβ, Dβ2(5'-GTAGGCACCTGTGGGGAAGAAACT)(서열번호: 15) 및 Jβ2(5'-TGAGA GCTGTCTCCTACTATCGATT)(서열번호: 16);
IgH, Dμ(5'-ACAAGCTTCAAAGCACAATGCCTGGCT)(서열번호: 17) 및 Jμ(5'-GGGTC TAGACTCTCAGCCGGCTCCCTCAGGG)(서열번호: 18).
유전자 발현을 분석하기 위해 cDNA가 총 RNA로부터 올리고-dT 프라이머로 합성되었다. Pitx 및 Nestin cDNA 검출의 경우, GC 완충액 2(TAKARA) 내 LA Taq 중합효소가 높은 GC 함량을 계산하는데 사용되었다. 프라이머 서열, 30 사이클의 PCR 반응의 어닐링 온도 및 증폭된 생성물의 길이는 하기와 같다 :
알부민, 55℃, 567 bp, 5'-AAGGAGTGCTGCCATGGTGA(서열번호: 19), 5'-CCTAG GTTTCTTGCAGCCTC(서열번호: 20);
α-페토프로테인, 55℃, 342 bp, 5'-TCGTATTCCAACAGGAGG(서열번호: 21), 5'-CACTCTTCCTTCTGGAGATG(서열번호: 22);
데스민, 55℃, 361 bp, 5'-TTGGGGTCGCTGCGGTCTAGCC(서열번호: 23), 5'-GGTCGTCTATCAGGTTGTCACG(서열번호: 24);
TH, 60℃, 412 bp, 5'-TGTCAGAGGAGCCCGAGGTC(서열번호: 25), 5'-CCAAGAGC AGCCCATCAAAG(서열번호: 26);
Nestin, 55℃, 327 bp, 5'-GGAGTGTCGCTTAGAGGTGC(서열번호: 27), 5'-TCCAG AAAGCCAAGAGAAGC(서열번호: 28);
Nurri, 55℃, 253 bp, 5'-TGAAGAGAGCGGACAAGGAGATC(서열번호: 29), 5'-TCTGGAGTTAAGAAATCGGAGCTG(서열번호: 30);
NF-M, 55℃, 186 bp, 5'-GCCGAGCAGACCAAGGAGGCCATT(서열번호: 31), 5'-CTGGA TGGTGTCCTGGTAGCTGCT(서열번호: 32);
Pitx3, 55℃, 373 bp, 5'-AGGACGGCTCTCTGAAGAA(서열번호: 33), 5'-TTGAC CGAGTTGAAGGCGAA(서열번호: 34);
G3pdh, 55℃, 983 bp, 5'-TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC(서열번호: 35), 5'-CATGTAGGCCATGAGGTCCAC(서열번호: 36);
MyoD, 60℃, 397 bp, 5'-GCCCGCGCTCCAACTGCTCTGAT(서열번호: 37), 5'-CCTAC GGTGGTGCGCCCTCTGC(서열번호: 38);
Myf-5, 60℃, 353 bp, 5'-TGCCATCCGCTACATTGAGAG(서열번호: 39), 5'-CCGGG TAGCAGGCTGTGAGTTG(서열번호: 40).
플라스미드 벡터 내로의 PCR 생성물의 직접적인 클로닝을 위해 TA 클로닝 키트(Invitrogen)가 사용되었다. 단일 플라스미드 클론의 cDNA 서열이 M13 역방향 및 전방향 프라이머를 이용하여 독립적으로 분석되었다.
(신경세포 분화 및 세포 이식)
높은 효율로 TH-양성 신경세포를 제작하기 위해 ES 및 융합 세포가 PA6 간질세포 상에서 8∼11일간 배양되었고(Kawasaki, H., Mizuseki, K., Nishikawa, S., Kaneko, S., Kuawana, Y., Nakanishi, S., Nishikawa, S.I. and Sasai, Y.(2000), Neuron, 28:31-40), 이후 세포는 혈청과 LIF를 제거하기 위해 MEM 배지로 3회 세척되었다. 분화된 TH-양성 콜로니의 이식을 위해 PA6 피더 층이 파파인의 처리에 의해 분리된 후 블런트-말단 26G Hamilton 주사기를 이용하여 마우스 선조체 내로 천천히 주사되었다(Kawasaki, H., Mizuseki, K., Nishikawa, S., Kaneko, S., Kuawana, Y., Nakanishi, S., Nishikawa, S.I. and Sasai, Y.(2000), Neuron, 28:31-40). 약 5 ×105융합 세포-유래 TH-양성 세포 현탁액이 각 주사된 사이트로 이식되었다. 2주 후 전체 뇌가 4% PFA 고정 후 동결 단편을 제작하기 위해 동결되었다.
(결과)
세포 융합에 의한 체세포 핵을 재프로그램화하는 획득된 능력은 다기능성 ES 세포에 의해 소유된 유의적 특징이다(Tada, M., Takahama, Y., Abe, K.,Nakatsuji, N., and Tada, T.(2001), "Nuclear reprogramming of somatic cells by in vivo hybridization with ES cells", Curr. Biol., 11:1553-1558). 신경 스페로사이트(spherocyte)와 골수세포는 동시에 배양함으로서 자발적으로 세포 융합이 되어 그의 핵이 재프로그램된다. 다기능성 세포-특이적 마커 유전자 Oct4-GFP 및 불활성 X 염색체의 재활성화는 융합 세포의 체세포가 비분화된 상태로 재프로그램됨을 적어도 부분적으로 나타내는 지표이다.
테라토마스 및 키메라가 성공적으로 형성되었다는 결과는 융합 세포가 다기능성(pluripotency)을 지님을 증명하였다. 재프로그램된 체세포 게놈은 다기능성을 지니거나 재분화의 과정에서 유전적으로 우세하다.
재프로그램된 체세포 게톰이 ES 세포 게놈 내에서 다기능성을 획득하면 개체에 적당한 테일러-메이드 ES 세포가 치료 클로닝 없이 세포 융합에 의해 수득될 수 있다.
Mus 무수쿨러스(musuculus) 도메스티커스 Hm1 ES 세포와 M.m.몰로시너스 JP1 흉성세포(HxJ) 및 몰로시너스 MP4 ES 세포와 도메스티커스 Rosa26 흉선세포(MxR)의아종간 융합 세포가 하기 실험을 위해 제작되었다(도 7A). Rosa26 형질전환 마우스 유래의 체세포 내 수용체 유전자, lacZ/neo이 편재하게 발현된다(Friedrich, G. & Soriano, P., GenES & Dev., 5:1513-1523(1991)). X 염색체-링크된 Hprt 유전자 결함성 Hm1 ES 세포 및 MP4 ES 세포가 몰로시너스 배반포로부터 새롭게 수립되었다. DNA 서열 다형성은 도메스티커스 게놈(ref5)과 비교되었을 때 몰로시너스 게놈 내에서 용이하게 발견되었다. 도메스티커스 및 몰로시너스-유래 염색체 전체 세트는 본 발명자의 융합 클론 내에서 유지되었다(도 7B). 성체 흉선세포를 지닌 ES 융합 세포의 분화 능력을 시험하기 위해 HxJ 및 MxR 융합 세포가 면역결핍성 SCID 마우스의 서혜부에 피하주사되었다. MxR-2 및 3 융합 세포주의 4∼5주 후 lacz/neo가 편재하게 발현되는 테라토마 반조각이 X-gal 염색에 양성이었다. 따라서 테라토마를 포함한 조직은 융합 세포의 유도체이었다. 단편의 면역화학적 분석은 클래스 Ⅲ β-튜블린(TuJ), 뉴로필라멘트-M(NF-M), 데스민 및 알부민 단백질의 발현을 나타내었고(도 7D), 이는 체세포가 중배엽성 자손(progeny)이더라도 생체 내에서 융합 세포가 외배엽성, 중배엽성 및 내배엽성 계통으로 분화하는 능력을 보유함을 나타낸다. 본 발명자가 사용한 모든 융합 세포 내 임파성 세포에 특이적인 T 세포 수용체 및/또는 면역글로블린 H 유전자는 체세포가 중배엽성 유도체임을 나타내었다(도 7C). 또한 헤모톡실린-에오신 염색으로의 조직화하적 분석은 테라토마가 연골, 섬모성 상피 및 선(gland)를 포함한 다른 조직을 포함함을 나타내었다. 이러한 융합 세포의 다수-계통 분화는 페어드(paired)-유사 호메오도메인 전사인자 2(Pitx3), 알부민, α-페토프로테인, MyoD, Myf-5 및 데스민 유전자의 조직-특이적 mRNA에 의해 확인되었다(도 8A). 비분화된 ES 세포 및 융합 세포 내에서의 이들 유전자 발현의 부재는 이들 발현이 테라토마 내 세포 타입-특이적 분화에 의해 유도되었음을 나타낸다.
조직-특이적 유전자의 mRNA가 조직 내 재프로그램된 체세포 게놈으로부터 전사되는지 여부를 조사하기 위해 도메스티커스 및 몰로시너스 세포 및 이들의 아종간 융합 세포-유래 테라토마 cDNA로 증폭된 Pitx3, 알부민 및 MyoD 증폭된 RT-PCR 생성물이 서열결정되었고 비교되었다. Pitx3에서 도메스티커스 게놈 내 구아니딘(G) 잔기의 몰로시너스 게놈 내 아데닌(A) 잔기로의 단일 염기 대치가 mRNA의 포지션 322에서 발견되었다(접근번호 008852). 서열결정된 12 클론 중 5 및 7이 각각 도메스티커스 및 몰로시너스 타입 서열이었다. 대략 동일한 양의 생성물이 체세포 게놈 RNA로부터 증폭되었다(도 8B). 유사한 패턴이 내배엽 세포-특이적 유전자, 알부민의 전사에서 검출되었다. 도메스티커스 mRNA로부터의 567 bp의 RT-PCR 생성물이 제한효소 NcoI로 분해되었고 554 bp 및 13 bp에서 검출된 반면 몰로시너스 mRNA로부터의 RT-PCR 생성물은 NcoI로의 분해 후 381, 173 및 13 bp의 3개 밴드에서 검출되었다(도 8C). ES 게놈 및 체세포 게놈으로부터의 동일 수준의 알부민 발현이 HxJ 및 MxR 아종간 융합 세포로부터 분화된 테라토마 내 유사한 밴드 강도에 의해 인식되었다. 근육-특이적 조절 인자 MyoD에서 ES 게놈 및 체세포 게놈으로부터의 전사체는 BssHI 분해에 민감한 서열 다형성에 의해 구별되었다. 도메스티커스 mRNA로부터의 395 bp의 RT-PCR 생성물이 293 및 102 bp의 2개의 밴드로 분리된 반면 몰로시너스 mRNA로부터의 것은 분해에 저항성이고 완전한 395 bp 밴드로서 검출되었다(도 8D). HxJ-17 및 18과 MxR-2 및 3 아종간 융합 세포주에서 체세포 게놈-유래 전사체는 ES 게놈-유래 전사체와 유사한 것으로 나타났다. 이들 데이터는 ES 유사성, 재프로그램된 체세포 게놈은 생체 내에서 분화된 테라토마 내 조직-특이적 mRNA를 전사할 수 있는 핵 능력을 획득하였음 나타내었다.
다음의 의문은 융합 세포 내 체세포 게놈이 생체 내 분화-유도 조건 하에서 특이적인 세포 타입으로 분화할 수 있는지 여부이다. 이를 수행하기 위해 본 발명자는 무혈청 조건의 PA6 간질세포 상의 동시배양에 의해 유도된 신경세포 분화 시스템을 이용하였다(Kawasaki, H. et al., Neuron, 28:31040(2000)). 숙주 MP4 ES 세포 및 MxR-3 융합 세포 클론이 배양되어 8∼11일간 신경세포 분화를 증진시켰다. 이러한 유도에 의해 융합 세포 및 숙주 ES 세포로부터의 대부분의 클론은 신경상피세포성 줄기세포-특이적 Nestin 및 후유사분열 신경세포-특이적 TuJ에 대해 양성적으로 면역반응적이었다. 줄기세포-특이적 E-Cadherin에 대한 양성 콜로니는 거의 발견되지 않았다. 이들 데이터는 융합 세포의 다기능성이 반복되었고 융합 세포가 신경세포 계통으로 효과적으로 분화되도록 조절되었음을 나타낸다. 따라서 도파민 민감성 신경세포를 생성하는 효율을 증가시키기 위해 유도 배양의 기간이 11일로 연장되었다. 대부분의 세포는 TuJ 및 NF-M에 대한 항체로 양성적으로 염색되었다. 카테콜아민 신경세포 트랜스미터의 생성에 요구되는 티로신 하이드록실라제(TH)에 면역반응적인 세포가 모든 생존 콜로니 내에서 주로 검출되었다. 대략 콜로니 당 20∼50%의 세포가 TH-양성으로 검출되었다(도 9C). 유사한 패턴이 숙주 ES 세포가 사용될 때도 나타났다. 이러한 효과적인 신경세포 분화가 5반복된 실험에서 계속되었다. 시험관 내에서 중뇌 도파민 민감성 신경세포의 생성은 분화 유도 11일 후 융합 세포로부터 추출된 mRNA로의 RT-PCR에 의해 TH, Nurri 및 Pitx3 증폭된 전사에 의해 재확인되었다(도 9D). ES 게놈과 유사하게 조직-특이적 유전자가 재프로그램된 체세포 게놈으로부터 발현되는지 여부를 조사하기 위해 TH의 전사 활성자인 Pitx3의 RT-PCR 생성물로 서열결정이 수행되었다. 도메스티커스 구아니딘(G) 잔기의 몰로시너스 아데닌(A) 잔기로의 단일 염기 대치에서 MxR 아종간 융합 클론으로부터 분화된 도파민 민감성 신경세포 내에서 서열결정된 12개 클론 중 8개 클론이 몰로시너스 타입으로 나타난 반면 4개 클론이 도메스티커스 타입인 것으로 나타났다.(도 9E) 유사한 결과가 HxJ 융합 클론으로부터 분화된 도파민 민감성 신경세포으로부터 수득되었다. 따라서 융합 세포 내에서 재프로그램된 체세포 게놈은 생체 내 분화에 의해 중뇌 도파민 민감성 신경세포-특이적 전사체를 발현할 수 있는 다기능성 능력을 획득하였다.
본 발명자는 다음으로 시험관 내에서 11일간 분화되도록 유도된 융합 세포-유래 도파민 민감성 신경세포가 이식 후 마우스 뇌의 선조체 통합되는 잠재력을 지니는지 여부를 조사하였다. 이러한 실험에서 몰로시너스 ES 세포와 도메스티커스 체세포 사이의 MxR-3 융합 세포가 lacZ/neo를 운반하는 Rosa26으로부터 수득되었다. 융합 세포-유도체의 사이트 상 약 5 ×105세포가 2개 마우스 뇌에 참조로서 봉합점까지 A=+1.0 mm, L=+2.0 mm, V=+3.0에서 선조체에 주사되었다(도 10A). 이식조직 내 생존 세포는 주사 15일 후 청색-양성 세포로서 X-gal 염색에 의해 검출되었다. 이식조직의 동결된 단편의 TH 및 LacZ에 대한 항체로의 면역조직화학적 이중 염색 분석은 융합 세포-유래 신경세포가 주사 사이트에서 도파민 민감성 신경세포-특이적 TH 단백질을 발현하고 있음을 분명하게 증명하였다(도 10B 및 C). 따라서 융합 세포가 시험관 내에서 특이적 타입 세포로 분화되도록 유도된 후에라도 체세포 게놈은 신경세포-특이적 유전자를 발현할 수 있었다. 이들 데이터는 융합 세포가 질병 및 노화에 대한 치료적 적용에서 대체 조직을 생성하는데 사용될 수 있는 가능성을 나타낸다.
ES 세포는 자가-재생 및 다기능성 세포이고, 리시피언트(recipient)로의 도입이 뒤따르는 생식세포를 포함한 다양한 조직으로 분화할 수 있다. 따라서 이들의 다기능성 특성은 시험관 내에서의 분화 유도에 의한 많은 타입의 대체 조직을 제작하는 세포 원료로서 적당하다. 그러나 ES 세포 원료로부터 제공된 조직은 대부분의 리시피언트에 미스매치되어 비-자가 이식 거부를 초래한다. 따라서 치료적 이식의 중요한 쟁점은 어떻게 ES-유래 이식에 대한 면역 거부를 감소시키는가 하는 것이다. 자가조직성 이식자를 생성하기 위해 개인적 테일러드 ES 세포 또는 개인적 성체 조직 줄기세포가 세포 원료로서 적당하다. 개인적 성체 조직 줄기세포는 세포 원료의 강한 후보이다(Jiang, Y., Jahagirdar, B.N., Reinhardt, R.L., Schwartz, R.E., Keene, C.D., Ortiz-Gonzalez, X.R., Reyes, M., Lenvik, T., Lund, T., Blackstad, M., Du, J., Aldrich, S, Lisberg, A., Low, W.C.,Largaespada, D.A., and Verfaillie, C.M.(2002) "Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow", Nature, 418:41-49). 개인적 테일러드 ES 세포는 적출된 비수정란으로의 체세포 핵 이식에 의해 제작된 클론된 배반포로 제조된다(Rideout, W.M., 3rd, Hochedlinger, K., Kyba, M., Daley, G.Q. & Jaenisch, R., Cell, 109:17-27(2002)). 그러나 인간 치료적 클로닝은 생물의학적 윤리학의 사회적 쟁점에 부딪힌다(Weissman, I.L., N. Engl. J. Med., 346:1576-1579(2002)). 윤리적 쟁점을 회피하기 위해 재프로그램된 체세포 게놈의 다기능성은 적어도 3가지 가능성을 제공한다 : 1) MHC 클래스 Ⅰ 및 클래스 Ⅱ 결함성 ES 게놈 및 개인적 체세포 게놈을 지닌 융합 세포가 개인 환자에 세미-매치될 수 있고; 2) 유전적 테일러드 ES-유사 세포(다기능성 세포)가 개인적 체세포와의 세포 융합이 뒤따르는 ES 게놈의 타겐된 제거에 의해 제조되고; 3) 개인 체세포는 ES 세포로부터 확인된 재프로그램화 인자의 유전적 조작에 의해 재프로그램될 수 있다. 세포 융합 기술은 클로닝에서 발행한 사회적 문제점을 야기하지 않고 개인적 치료적 적용에 중요한 공헌을 하는 잠재력을 지닌다.
(실시예 3) 재프로그램화 인자의 확인
실시예 3에서 본 발명자는 ES 세포와 융합될 때 어떻게 체세포 게놈이 에피유전적으로 변형되는지에 대해 조사하였고, 재프로그래화 인자 및 그의 메카니즘을 분석하였다. 본 발명자는 ES 세포와의 세포 융합이 체세포 게놈의 염색질 구조내 극적 변화를 유발함을 예측하였고, 아종간 융합 세포 내 체세포 핵의 히스톤 아세틸화를 분석하였다(도메스티커스 x 몰로니커스). 하기 실험은 Forberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:14494-99(2000)에 따라 수행되었다. 실질적인 프로토콜은 항체가 수득된 Upstate biotechnology, Chromatin immunoprecipitation protocol에 따랐다.
(핵 히스톤에 대한 변형 에세이)
항-아세틸화 히스톤 H3 항체, 항-아세틸화 히스톤 H4 항체, 항-메틸화 히스톤 H3-Lys4 항체 및 항-메틸화 히스톤 H3-Lys9 항체가 체세포, ES 세포 및 융합 세포이 핵 히스톤 변형을 파악하는데 사용되었다. 다음으로 이들 4개 항체가 히스톤과 DNA 사이의 상호작용을 분석하기 위해 염색질 면역침전을 수행하는데 사용되었다.
DNA-히스톤 단백질 복합체가 각 항체로의 반응에 의해 회수되었다. 회수된 DNA-히스톤 단백질 복합체 내 포함된 DNA의 PCR 증폭에 의해 어떤 DNA 구역 내에서 어떻게 히스톤이 변형되는지 나타났다.
에세이 당 2 ×107내지 108세포가 배양되었다.
1일에 270 ㎕의 37% 포름알데하이드가 1%의 최종 농도로 배양 배지 내에 직접 첨가되었다. 이후 혼합물은 60 스트로크/분의 속도로 37℃에서 10분간 교반되었다.
다음으로, 글리신이 0.125 M의 최종 농도로 첨가되어 교차-결합 반응을 중지시켰고, 상온에서 5분간 정치되었다.
점착성 세포의 경우 배지가 제거되었고 플레이트는 얼음-냉각된 PBS(8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4및 0.24 g KH2PO4/ 리터 (pH 7.4) 및 1 mM PMSF를 함유)로 세척되었다. 디쉬 당 2 mL의 트립신이 첨가되었다. 이후 트립신은 디쉬로부터 흡출되었다. 디쉬는 37℃에서 10분간 인큐베이트되었다. 트립신처리는 1% FCS-PBS를 첨가함으로서 중지되었다. 세포는 원심분리되었고 수득된 세포 펠렛은 얼음-냉각된 PBS로 2회 세척되었다. 현탁 세포의 경우 세포는 원심분리되었고 수득된 세포 펠렛은 얼음-냉각된 PBS로 2회 세척되었다.
다음으로 세포 펠렛은 100 mL의 세포 용해 완충액(10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 0.2% Nonidet P-40, 10 mM 유산나트륨(탈아세틸화 방지를 위해) 및 프로테아제 억제자(완전한 프로테아제 억제자 1정(Roche; Cat No. 1697498)이 1 mL의멸균수에 용해되었고, 사용될 때는 1/100로 희석되었음) 내에 재현탁되었다. 어떤 세포 덩어리도 확인되지 않았고 10분간 얼음 상에서 인큐베이션되었다. 현탁액은 4℃에서 5분간 5000 rpm으로 원심분리되었다.
핵 펠렛은 핵 용해 완충액(50 mM Tris-HCl (pH 8.1), 10 mM EDTA, 1% SDS, 10 mM 유사나트륨 및 프로테아제 억제자(완전한 프로테아제 억제자 1정(Roche; Cat No. 1697498)이 1 mL의 멸균수에 용해되었고, 사용될 때는 1/100로 희석되었음) 내에 재현탁되었고 10분간 얼음 상에서 인큐베이션되었다.
다음으로 표본이 초음파처리되어 염색질의 길이가 500 bp로 평균화되었다. 이러한 단계에서 파워는 최대의 10∼15%, 8회 40초이었다. 표본은 4℃에서 5분간 15000 rpm으로 원심분리되었다. 상청액(200 ㎕)은 새로운 튜브에 옮겨졌다. 이러한 포인트에서 초음파처리된 염색질은 -70℃에서 선택적으로 보관되었다.
수득된 표본은 ChIP 희석 완충액(16.7 mM Tris-HCl (pH 8.1), 167 mM NaCl, 1.2 mM EDTA, 0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 10 mM 유산나트륨 및 프로테아제 억제자(Roche; Cat No. 1697498)가 1 mL의 멸균수에 용해되었고, 사용될 때는 1/100로 희석되었음)으로 10배 희석되었다.
비-특이적 백그라운드를 감소시키기 위해 염색질 표본은 80 ㎕의살몬(Sarmon) 정자 DNA/단백질 A 아가로스를 첨가시킴으로서 명료화되었다. 표본은 회전되면서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이트되었다. 이후 표본은 4℃에서 1분간 1000 rpm으로 원심분리되었다. 수득된 상청액은 새로운 튜브로 옮겨졌다.
다음으로, 다양한 항체가 수득된 상청액에 첨가되었다(항-아세틸화 히스톤 H3 항체(K9&14, Upstate biotechnology, New York, USA; Cat No. #06-599) 10 ㎕ (5 ㎕의 항체 용액이 2 mL의 반응용액에 사용되었음); 항-아세틸화 히스톤 H4 항체 (Upstate biotechnology, New York, USA; Cat No. #06-598) 5 ㎕ (5 ㎕의 항체 용액이 2 mL의 반응용액에 사용되었음); 항-디메틸화 히스톤 H3(K4 또는 K9) 5 ㎕ (5 ㎕의 항체 용액이 2 mL의 반응용액에 사용되었음)(Upstate biotechnology, New York, USA; 각각 Cat No. #07-030 또는 #07-212). 일반적으로 각 항체의 필요량은 1 ㎍이다. 음성 대조군으로서 어떠한 항체도 없는 표본이 시험되었다.
수득된 표본은 4℃에서 밤새 보관되었다.
2일에 60 ㎕의 살몬(Sarmon) 정자 DNA/단백질 A 아가로스(Upstate biotechnology (Cat No. 16-157), (60 ML의 살몬 정자 DNA/단백질 A 아가로스가 2 mL의 반응용액에 사용되었음)가 표본에 첨가되었다. 표본은 4℃에서 1시간 동안 회전되었고 4℃에서 1분간 1000 rpm으로 원심분리되었다. 상청액은 새로운 튜브로 옮겨졌다. "항체-없는" 표본으로부터의 상청액은 "총 투입 염색질"로서 보관되었다.
다음으로, 펠렛은 1 mL의 저염 세척 완충액(20 mM Tris-HCl (pH 8.1), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.1% SDS, 1% Triton X-100)으로 2회 세척되었고 상온에서 5분간 회전되었다. 이후 펠렛은 1 mL의 고염 세척 완충액(20 mM Tris-HCl (pH 8.1), 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.1% SDS, 1% Triton X-100)으로 세척되었고 상온에서 5분간 회전되었다. 이후 펠렛은 1 mL의 LiCl 세척 완충액(10 mM Tris-HCl (pH 8.1), 0.25 M LiCl, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 1% 디옥시 소듐 콜레이트)으로 세척되었고 상온에서 5분간 회전되었다. 마지막으로 펠렛은 1 ×TE(10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA)로 2회 세척되었고, 상온에서 5분간 회전되었다.
다음으로 항체/단백질/DNA 복합체는 150 ㎕의 용출 완충액(0.1 M NaHCO3, 1% SDS)으로 2회 세척되었다. 표본은 짧게 볼텍스되었고 상온에서 15분간 교반되었다. 상청액은 새로운 튜브로 옮겨졌다. 이때 표본의 총 부피는 300 ㎕이었다.
이후 18 ㎕의 5 M NaCl 및 1 ㎕의 10 mg/mL RNase A가 용출액에 첨가되었다. 역 교차결합이 65℃에서 4∼5시간 동안 가열함으로서 수행되었다.
DNA는 페놀 : 클로로포름 추출에 의해 회수되었고 에탄올 침전되었다. 글리코겐(20 ㎍)이 첨가되었다. 표본은 -20℃에서 밤새 보관되었다.
3일에 보관된 표본은 DNA가 회수되도록 원심분리되었다. 펠렛은 1 mL의 70% 에탄올로 세척되었다. DNA는 건조된 후 30 ㎕의 1 ×TE 내에 재현탁되었다. "총 투입" 표본은 870 ㎕의 1 ×TE를 첨가함으로서 더욱 희석되었다. 다음으로 2∼3 ㎕의 표본이 PCR 반응에 사용되었다.
(재프로그램화 인자의 확인)
재프로그램화 인자를 확인하는 방법으로서 하기 절차가 수행되었다 :
1. 체세포 게놈으로부터 ES 세포의 게놈을 구별하기 위해 ES 세포는 Mus musculus domesticus(dom) 마우스와 비교시 더 높은 정도의 다형성을 지닌 DNA 염기 서열을 지닌 아종 M.m.molossinus(mol)로부터 실시예 1에 기술된 바와 같이 수립되었다. ES 세포(dom) ×체세포(mol) 또는 ES 세포(mol) ×체세포(dom)의 아종간 융합 세포가 제작되었다. 융합 세포 및 대조군으로서의 체세포 및 ES 세포가 상술된 핵 히스톤 변형 에세이되었다.
2. 체세포, ES 세포 및 융합 세포는 히스톤 단백질과 DNA를 교차결합시키기 위해(히스톤-DNA 복합체) 10분간 1%의 포름알데하이드 용액으로 고정되었다. 이후 핵 단백질이 상기 기술된 바와 같이 추출되었다. 핵 단백질은 상기 기술된 바와 같이 항-아세틸화 히스톤 H3 항체, 항-아세틸화 히스톤 H4 항체, 항-메틸화 히스톤 H3-Lys4 항체 및 항-메틸화 히스톤 H3-Lys9 항체와 반응되었다.
3. 반응용액은 상기 기술된 바와 같이 항체와 반응된 히스톤-DNA 복합체를 분리하도록 단백질 A 컬럼에 통과되었다. DNA는 상기 기술된 바와 같이 각 항체와 반응된 히스톤-DNA 복합체로부터 추출되었다.
4. 추출된 DNA는 멤브레인 상에 블럿되었고 흡착되었다. DNA, 게놈 상에 산재된 반복서열 B2 리피트, IAP 및 마우스 게놈 DNA가 하이브리디제이션을 수행하는 프로브로서 사용되었다. 프로브의 서열은 하기와 같다 :
B2 리피트 :
GCAAAGCCAGGTTCCTTCCTTCTTCCAAATATTTTCATATTTTTTTTAAAGATTT
ATTTATTCATTATATGTAAGTACACTGTAGCTGTCTTCAGACACTCCAGAAGAGG
GCGTCAGATCTTGTTACGTATGGTTGTGAGCCACCATGTGGTTGCTGGGATTTGA
ACTCCTGACCTTCGGAAGAGCAGTCGGGTGCTCTTATCCACTGAGCCATCTCACC
AGCCCCTGGTTTATTTTTTTAATTATTATTTGCTTTTTGTTTATCAAGACAGGGT
TTCTCTGCATAGCTCTAATTGT (서열번호: 41); 및
IAP :
GAATTCGATTGGTGGCCTATTTGCTCTTATTAAAAGAAAAAGGGGGAGATGTTGG
GAGCCGCCCCCACATTCGCCGTTACAAGATGGCGCTGACATCCTGTGTTCTATGT
GGTAAACAAATAATCTGCGCATGTGCCAAGGGTATCTTATGACTACTTGTGCTCT
GCCTTCCCCGTGACGTCAACTCGGCCGATGGGCTGCAGCCAATCAGGGAGTGACA
CGTCCGAGGCGAAGGAGAATGCTCCTTAAGAGGGACGGGGTTTCGTTCTCTCTCT
CTCTTGCTTTTCTCTCTCTCTTGCTTTTCTCTCTCTCTTGCTTCTTGCTCTCTTG
CTTCTTGCACTCTGTTCCTGAAGATGTAAGAATAAAGCTTTGTCGAATCACTAGT
GAATTC (서열번호: 42)
(반복 서열은 밑줄 쳐있음)
그 결과로서 사용된 모든 프로브 DNA가 체세포 상의 게놈 상에서 아세틸화 히스톤 H3-Lys9과 반응하였고 이들은 ES 세포 및 융합 세포의 게놈 상에서 아세틸화 히스톤 H3-Lys4, 아세틸화 히스톤 H3 및 아세틸화 히스톤 H4와 반응하였다.
5. 추출된 DNA는 각각 비분화된 세포에서는 발현되나 체세포에서는 발현되지 않는 Oct4 유전자, 체세포 또는 비분화된 세포에서 발현되지 않는 뉴로필라멘트-M 및 -L 유전자, 체세포에서 발현되나 비분화된 세포에서는 발현되지 않는 Thy-1 유전자에 특이적인 게놈 PCR-프라이머 세트를 이용하여 증폭되었다. 사용된 프라이머 서열은 하기에 기술된다.
Oct4 : 전방향 CTAGACGGGTGGGTAAGCAA (서열번호: 43)
역방향 CAGGAGGCCTTCATTTTCAA (서열번호: 44)
Oct4 Sp1 : 전방향 CGCCTCAGTTTCTCCCACC (서열번호: 45)
역방향 AGCCTTGACCTCTGGCCC (서열번호: 46)
Thy-1 : 전방향 CTCCAAAGCCAAAACCTGTC(서열번호: 47)
역방향 GCTGACTGGAGGTGTTCCAT (서열번호: 48)
NF-M : 전방향 GGGTGACAAGAGGTCTGGAA (서열번호: 49)
역방향 CAGCGTGTAGCTCATCTTGG (서열번호: 50)
NF-L : 전방향 CAGGGAAGTTATGGGGGTCT (서열번호: 51)
역방향 AGAAGAACGGGGGAGAAGAG (서열번호: 52)
다음으로, DNA 염기 서열의 다형성 사이트에 대한 제한효소 인식의 차이는 융합 세포 내에서 증폭된 DNA가 ES 세포 게놈으로부터 유래되었는지 또는 체세포 게놈으로부터 유래되었는지를 결정하는데 이용되었다. 그 결과로서 체세포-유래 게놈은 체세포 내 유전자의 존재 유무에 관계없이 또는 융합 세포 내 유전자의 존재 유무에 관계없이 융합 세포 내에서 아세틸화 히스톤 H3-Lys4, 아세틸화 히스톤 H3 및 아세틸화 히스톤 H4과 반응되었다.
아세틸화된 히스톤은 느슨한 염색질 구조를 형성하는 것으로 알려져 있다. 반대로 히스톤 H3-Lys4 및 히스톤 H3-Lys9의 메틸화는 보완적 변형이고 히스톤 H3-Lys9이 단단한 염색질로 메틸화되는 반면 히스톤 H3-Lys4는 느슨한 염색질로 메틸화되는 것으로 알려져 있다. 융합 세포 내 게놈 및 각 유전자에 걸쳐 산재된 반복서열의 분석은 프로그램화된 체세포 게놈이 느슨한 염색질 구조를 형성함을 나타내었다. 특히 히스톤 H3-Lys4의 메틸화는 재프로그램화에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다.
(결과)
아종간 게놈 DNA의 염기 서열의 다형성에 기초하여 체세포 핵으로부터 유래된 게놈이 변형되는지 여부를 결정하는 것이 가능하다. 이러한 실시예의 결과로서 체세포 게놈은 세포 융합에 의해 전체적으로 아세틸화되어 느슨한 염색질 구조를 지닌다. 중요하게는 히스톤 H3-Lys4는 프로그램화된 게놈 내에서 특이적으로 메틸화된다. 히스톤 H3-Lys4의 메틸화는 히스톤 H3의 아세틸화와 관련된다고 알려져 있다. 메틸화는 아세틸화보다 더 안정한 에피유전적이다. 따라서 히스톤 H3-Lys4의 메틸화는 재프로그램화된 게놈의 변형 특성인 것으로 추정된다. 메틸호에 관련된 히스톤 H3-Lys4을 메틸화하는 효소 또는 인자는 재프로그램화 인자 중의 하나로 여겨진다(도 11).
(실시예 4) MHC 결함 ES 세포-체세포의 융합 세포의 제작
실시예 4에서 MHC(H-2) MHC(H-2) 클래스 Ⅰ 결함 마우스 클래스 Ⅰ 결함 마우스 및 MHC(H-2) 클래스 Ⅰ 및 Ⅱ 결함 마우스를 생성하는데 사용되었다. 수득된 마우스로부터 수득된 H-2 클래스 Ⅰ(-/-) 클래스 Ⅱ(-/-) ES 세포가 융합 세포를 생성하는데 사용되었다. 특정한 절차는 하기에 기술된다(도 12).
MHC 클래스 Ⅰ KbDb-/- 마우스는 Vugmeyster Y. et al.(Vugmeyster Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:12492-12497(1998)에 의해 제공되었다.
이들 2가지 주(line)의 마우스가 사육되었고 일반적 번식 조건 하에서 교미되었다. 번식 조건은 Kyoto University에 의해 정의된 동물 실험에 대한 필요조건에 따랐다. 교미시킴으로서 이중 넉아웃(knockout) 마우스가 생성되었다. 클래스 Ⅰ 및 클래스 Ⅱ 유전자는 동일한 염색체 상에서 0.3 cM의 근접도로 위치되었다. 따라서 이 둘 유전자 결함의 마우스가 수득되는 가능성은 1,000 마우스 내 3 마리이다. 결함 구역에 특이적인 PCR 프라이머 또는 프로브(클래스 Ⅰ 및 클래스 Ⅱ 유전자 내의 생리적 결함 때문에 유전자 게놈이 프로브로서 사용되었음)가 게놈PCR 또는 서던 블럿 분석에 의한 스크리닝을 수행하는데 사용되었다. 실질적으로 2마리 마우스가 교미에 의해 수득된 500-남짓의 마우스 중에서 수득되었다.
MHC 클래스 Ⅱ KO 마우스는 5개 유전자를 포함한 약 80-kb 구역에 결함이 있다. 이러한 마우스의 배아로부터 ES 세포가 수립되었다. 수립된 ES 세포는 MHC 클래스 Ⅰ KbDb를 넉아웃하는데 사용되었다. 넉아웃 방법은 Vugmeyster et al.(상동)에 따라 수행되었다. 수득된 이중 넉아웃 ES 세포가 배반포에 주사되어 키메라 마우스를 생성하였다. 키메라 마우스의 생성은 "Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual" 2nd, Hogan B. et al., CSHL Press USA에 따라 수행되었다. 이중 넉아웃 ES 세포는 키메라 마우스를 교미시킴으로서 수득된 이중 넉아웃 개체로부터 수립되었다.
다음으로, 이중 넉아웃 ES 세포는 흉선세포와 융합되어 융합 세포를 생성하였다. 세포 융합 방법은 실시예 2에 기술된 바와 같이 Tada, M., Tada, T., Lefbvre, L., Barton, S.C. & Surani, M.A., EMBO J., 16:6510-6520(1997)에 따라 수행되었다.
세포 융합에 의해 수득된 융합 세포의 게놈은 융합 세포 내 체세포 게놈이 시험관 내 분화 유도 조건 하에서 특이적 세포 타입으로 분화될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 실시예 2에 기술된 방법으로 조사되었다. 본 에세이는 실시예 2에기술된 방법에 따라 수행되었다. 에세이 방법은 하기에 기술된다.
2배체 세포는 1 유전자에 대해 2개 유전자 위치(부계 및 모계)를 지닌다. 각 위치는 상동적 재조합에 의해 제거되었다. 이러한 절차는 제거된 유전자 ×2 약물 선택가능성 마커를 이용하여 수행되었다. 클래스 Ⅰ 및 클래스 Ⅱ 유전자를 제거하기 위해 neo 유전자가 먼저 제거된 유전자 위치에 사용되었고 puro 유전자는 대립유전자 제거에 대한 또다른 선택가능성 마커로서 사용되었다. 이에 따라 클래스 Ⅰ 및 클래스 Ⅱ 유전자는 배양 조건 하에서 완전히 제거될 수 있었다. 따라서 이중 넉아웃이 다른 선택가능성 마커를 이용하여 일반적 넉아웃을 2회 실시함으로서 생성될 수 있었다.
이러한 실시예에서 융합 세포 클론은 신경세포으로의 분화를 증진시키기도록 8∼11일간 배양되었다. 이러한 유도에 의해 융합 세포 및 숙주 ES 세포로부터의 대부분의 클론이 뉴런상피 줄기세포-특이적 Nestin 및 후유사분열 신경세포-특이적 TuJ에 대해 양성적으로 면역반응성이 되었다. 줄기세포-특이적 E-Cadherin에 대한 양성 콜로니는 거의 발견되지 않았다. 이들 데이터는 융합 세포의 다기능성이 반복되었고 융합 세포가 신경세포 계통으로 효과적으로 분화하도록 조절되었음을 나타낸다. 따라서 도파민 민감성 신경세포를 생성하는 효율을 증가시키기 위해 유도 배양의 기간이 11일로 연장되었다. 대부분의 세포는 TuJ 및 NF-M에 대한 항체로 양성적으로 염색되었다. 카테콜아민 신경세포 트랜스미터의 생성에 요구되는 티로신 하이드록실라제(TH)에 면역반응성인 세포가 모든 생존 콜로니 내에서 주로 검출되었다. 대략 콜로니 당 20∼50%의 세포가 TH-양성으로 검출되었다. 유사한 패턴이 숙주 ES 세포가 사용될 때도 나타났다. 이러한 효과적인 신경세포 분화가 5 반복된 실험에서 계속되었다. 시험관 내에서 중뇌 도파민 민감성 신경세포의 생성은 분화 유도 11일 후 융합 세포로부터 추출된 mRNA로의 RT-PCR에 의해 TH, Nurri 및 Pitx3 증폭된 전사에 의해 재확인되었다. ES 게놈과 유사하게 조직-특이적 유전자가 재프로그램된 체세포 게놈으로부터 발현되는지 여부를 조사하기 위해 회수된 RNA로부터 수득된 RT-PCR 생성물로 서열결정이 수행되었다. 서열결정된 12개 클론 중 7개 클론이 체세포 게놈으로부터 유래된 것으로 나타났다. 유사한 결과가 HxJ 융합 클론으로부터 분화된 도파민 민감성 신경세포로부터 수득되었다. 따라서 MHC 결함 ES 세포 및 체세포의 융합 세포에 있어서 항상 MHC 생성물이 체세포로부터 유래되었는지 또는 ES 세포로부터 유도되었는지를 결정할 필요는 없다. 이는 MHC 유전자가 ES 세포로부터 물리적으로 제거되어 유전자가 발현될 수 없기 때문이다.
본 발명자는 실시예 2에서와 같이 시험관 내에서 11일간 분화 유도된 융합 세포-유래 도파민 민감성 신경세포가 이식 후 마우스 뇌의 선조체 내로 통합될 수 있는지 여부를 조사하였다. 이식조직 내 세포 생존은 주사 15일 후 X-gal 염색(청색-양성 세포)에 의해 검출되었다. 이식조직의 동결된 단편의 TH 및 LacZ에 대한 항체로의 면역조직화학적 이중 염색 분석은 융합 세포-유래 신경세포가 주사 사이트에서 도파민 민감성 신경세포-특이적 TH 단백질을 발현하고 있음을 분명하게 증명하였다. 따라서 융합 세포가 시험관 내에서 특이적 타입 세포로 분화되도록 유도된 후에라도 체세포 게놈은 신경세포-특이적 유전자를 발현할 수 있었다. 이들 데이터는 MHC 결함 융합 세포가 질병 및 노화에 대한 치료적 적용에서 대체 조직을 생성하는데 사용될 수 있는 가능성을 나타낸다.
(인간으로의 적용)
인간 세포가 사용될 때 숙주로서 인간을 이용한 결함성 세포의 생성은 윤리적 문제점을 야기할 것이다. 따라서 모든 조작은 배양 조건 하에서 수행되었다. 2배체 세포는 1 유전자에 대해 2개 유전자 위치(부계 및 모계)를 지닌다. 각 위치는 상동적 재조합에 의해 제거되었다. 특히, 이러한 절차는 제거된 유전자 ×2 약물 선택가능성 마커를 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어 클래스 Ⅰ 및 클래스 Ⅱ 유전자를 제거하기 위해 neo 유전자가 먼저 제거된 유전자 위치에 사용되었고 puro 유전자는 대립유전자 제거에 대한 또다른 선택가능성 마커로서 사용되었다. 이에 따라 클래스 Ⅰ 및 클래스 Ⅱ 유전자는 배양 조건 하에서 완전히 제거될 수 있었다. 또한 neo 유전자가 먼저 제거된 유전자 위치로 도입되고 스크리닝이 고농도 G418을 이용하여 수행될 때 대립유전자가 neo 유전자로 대치될 수 있는 것으로 나타났다.
상기-수득된 세포는 ES-유래 MHC 결함 융합 세포를 생성하는데 사용되었다. ES 게놈과 유사하게 조직-특이적 유전자가 재프로그램된 체세포 게놈으로부터 발현되는지 여부를 조사하기 위해 회수된 RNA로부터 수득된 RT-PCR 생성물로 서열결정이 수행되었다. 서열결정된 12개 클론 중 7개 클론이 체세포 게놈으로부터 유래된 것으로 나타났다.
재프로그램화된 인간-유래 다기능성 줄기세포가 다양한 분화 실험을 예비적으로 수행하는데 사용되었다. 재프로그램화된 세포는 혈관, 신경세포, 근육세포, 조혈세포, 피부, 골, 간, 췌장 등으로 분화된 것으로 나타났다.
상기-수득된 세포는 ES-유래 MHC 결함 융합 세포를 생성하는데 사용되었다. 조직-특이적 유전자가 재프로그램된 체세포 게놈으로부터 발현되었는지 여부를 조사하기 위해 서열결정이 회수된 RNA로부터 수득된 RT-PCR 생성물로 수행되었다. 서열결정된 12개 클론 중에서 7개 클론이 체세포 게놈으로부터 유래된 것으로 나타났다.
재프로그램된 인간-유래 다기능성 줄기세포는 다양한 분화 실험을 예비적으로 수행하는데 사용되었다. 재프로그램된 세포는 혈관, 신경세포, 근육세포, 조혈세포, 피부, 골, 간, 췌장 등으로 분화된 것으로 나타났다.
(실시예 5) 개체용 게놈-제거된 테일러-메이드 ES 세포의 제작
거부반응을 완전하게 회피하기 위해 개체의 체세포로부터 유래된 테일러-메이트 다기능성 줄기세포를 제작할 필요가 있다. 다음으로, 전체 ES 세포-유래 게놈이 완전하게 제거된 융합 세포가 제작되었다.
체세포-ES 융합 세포에서 재프로그램된 체세포 게놈은 ES 세포 게놈과 유사한 다기능성 분화 능력을 지닌다. 따라서 유전자 조작에 의해 융합 세포로부터 ES 세포 게놈만을 제거함으로서 테일러-메이드 다기능성 줄기세포가 달성될 수 있다. 융합 세포 내 체세포-유래 Oct4 유전자에 대한 본 발명자의 재활성화 실험(Tada et al., Curr. Biol., 2001)은 체세포 게놈이 융합 후 재프로그램되는데 약 2일이 소요되는 것으로 나타났다. 즉, ES 세포 게놈은 세포 융합 후 선택적으로 제거되어야 한다.
이에 대해 본 발명자는 적어도 하나 이상의 LoxP 서열이 각 염색체 내로 도입된 형질전환 ES 세포를 제작하였다. 인슐레이터(Insulator)-중합효소 Ⅱ 프로모터-GFP-LoxP-인슐레이터의 컨스트럭트가 레트로바이러스 벡터(설치류 백혈병 바이러스(MMLV) 또는 설치류 줄기세포 바이러스(MSCV)에 기초한 레트로바이러스 발현 벡터)를 이용하여 제작되었다(도 14). 인슐레이터는 주변 세포의 영향으로부터 LoxP를 분리하는데 사용되었고, 중합효소 Ⅱ 프로모터는 GFP가 적당히 발현되어 많은 유전자 복제가 세포 분류기(sorter)를 이용하여 직선적으로 확인될 수 있도록 하는데 사용되었다. 현재 최저 독성을 지닌 GFP(hGFP(Clonetech))가 도입된 유전자를 지닌 ES 세포를 스크리닝하는데 사용되었다. 많은 LoxP 서열 복제가 GFP의 발현 수준과 연관되었다. 제작은 Chung, J.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:575-580(1997)에 따라 수행되었다. 컨스트럭트는 LTR-pol Ⅱ 프로모터-hGFP-LoxP-LTR(인슐레이터)의 구조를 지녔다(도 14).
먼저, ES 세포는 상기 실시예에 기술된 바와 같이 제작되었다. 레트로바이러스를 지닌 ES 세포가 트립신처리되어 단일-세포 현탁액이 제조되었고, 1∼2시간 동안 세포를 생성하는(세포주를 팩키지하는) 바이러스의 배양 상청액과 동시-배양되어 레트로바이러스로 ES 세포를 감염시켰다. GFP는 마커로서 사용되었다. 형질전환 ES 세포는 세포 분류기(FACS Vantage(BD Biosciences))로 세포를 분류함으로서 농축되었다. 분류는 하기와 같이 수행되었다. 인슐레이터-중합효소 Ⅱ 프로모터-GFP-LoxP-인슐레이터 유전자가 ES 세포 내로 도입되었다. 이후 형질전환 ES 세포가 GFP 유전자의 발현 수준이 참고로서 사용되는 세포 분류기를 이용하여 수집되었다. 이러한 조작은 여러 번 수행되었다.
삽입 사이트는 DNA FISH에 의해 검출되었다. DNA FISH는 Kenichi Matsubara and Hiroshi Yoshikawa, editors, Saibo-Kogaku[Cell Engineering], special issue, Jiken Purotokoru Shirizu[Experiment Protocol Series], "FISHJiken Purotokoru Hito ·Genomu Kaiseki kara Senshokutai ·Idenshishindan made[FISH Experimental Protocol From Human Genome Analysis to Chromosoe/Gene diagnosis]", Shujun-sha(Tokyo)에 따라 수행되었다.
유전자 도입이 여러번 수행된 ES 세포가 클론되었다. 인슐레이터-중합효소 Ⅱ 프로모터-GFP-LoxP-인슐레이터가 프로브로서 사용되었고 염색체 상에서 지도화 되었다. 염색체 당 적어도 하나 이상의 유전자를 지닌 형질전환 ES 세포가 선택되었다.
다음으로 체세포가 상술된 실시예와 같이 수득되었다. 형질전환 ES 세포와 체세포의 융합 세포가 상술된 실시예와 유사한 조건 하에서 제작되었다. Cre 효소를 일시적으로 발현하는 플라스미드(Cre 효소 유전자가 P하1 또는 CAG 프로모터의 조절 내에 연결된 환형 플라스미드)가 일렉트로포레이션 또는 리포렉틴에 의해 융합 세포 내로 도입되었다. 플라스미드는 Cre 효소를 발현하였고(도입 3∼5일 후), 이후 분해되었다. Cre 효소의 작용에 의해 LoxP 서열이 상종적 재조합을 겪게되어 ES 세포 게놈으로부터 유래된 염색체만이 2동원체성 및 무동원체성 염색체로 변형되었고 세포 주기에 걸쳐 세포 분열에 의해 제거되었다. 제거는 상기 기술된 바와 같으 각 세포에 특이적인 프라이머 및 프로브를 이용하여 확인되었다. 수회의 세포 분열 후 재프로그램된 체세포로부터 유래된 2배체 게놈만이 잔존하였다. 따라서 재프로그램된 체세포 게놈만이 잔존하였다. 따라서 개체 체세포-유래 테일러-메이드 다기능성 줄기세포가 제작되었다.
형질전환 ES 세포가 수립되면 개체 환자로부터 유래된 체세포를 이용한 융합에 의해 테일러-메이드 ES 세포를 용이하게 수립하는 것이 가능하다. 따라서 본 실시예에서 테일러-메이드 ES 세포는 마우스 모델 실험 시스템 내에서 성공적으로 수립되었다. 이러한 기술은 마우스뿐만 아니라 다른 생물체(특히 인간을 포함한 포유류)에도 적용될 수 있다. 따라서 기술은 개체 인간의 체세포로부터 유래된 인간 테일러-메이드 다기능성 줄기세포를 제작하도록 인간 ES 세포에 적용될 수 있다.
핵 이식 클론과 다르게 인간 비수정란의 이용 없이 세포 융합에 의한 체세포 게놈의 재프로그램화는 ES 세포 적용의 범위 내에 있고 가이드라인을 따른다. 이는 재생 의학에 최대한의 효과를 제공하는 반면 윤리적 문제점을 최소하는 혁신적인 게놈 공학 기술이다.
(실시예 6) 조혈세포, 조직 및 기관으로의 분화
다음으로 상술된 실시예 내에서 제작된 다기능성 줄기세포가 조혈 줄기세포로 분화되거나 정제될 수 있는지 확인되었다. 유사한 실험이 Kaufman D.S., Hanson, E.T., Lewis, R.L., Auerbach, R., and Thomson, J.A.(2001),"Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryotic stem cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:10761-21에 따라 수행되었다. 그 결과로서 조혈 줄기세포로 분화된 세포가 분화된 세포 중에 존재하는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 다기능성 줄기세포는 조혈 줄기세포로 분화하는 능력을 보유한 것으로 나타났다. 조혈 줄기세포는 실질적인 임상 적용에 유용하다.
(실시예 7) 근육세포, 조직 및 기간으로의 분화
다음으로 상술된 실시예에서 제작된 다기능성 줄기세포가 근육세포로 분화되거나 정제될 수 있는지 확인되었다. 유사한 실험이 Boheler, K.R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H.T., Anisimov, S.V., and Wobus, A.M.(2002), "Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes", Circ. Res., 91:189-201에 따라 수행되었다. 그 결과로서 근육세포로 분화된 세포가 분화된 세포 중에 존재하는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 다기능성 줄기세포는 근육세포로 분화하는 능력을 보유한 것으로 나타났다. 근육세포는 실질적인 임삼 적용에 유용하다.
특정한 바람직한 실시태양이 여기에 기술되었더라도 이러한 실시태양은 추가된 청구항에 나타난 것을 제외하고 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 여기서 인용된 모든 특허, 공보된 특허 출원 및 공보는 참고문헌으로 통합되어 있다.
본 발명은 면역 거부반응의 유도 없이, 난세포로의 시작 없이 질병을 치료하기 위해 도너로서 작용할 수 있는 세포, 조직 및 기관을 효과적으로 수립하는데 획기적인 유용성을 지닌다. 본 발명은 통상의 기술에 의해 달성될 수 없는, 성인 개체와 동일한 게놈을 지닌 다기능성 줄기세포를 제공할 수 있다. 따라서 본 발명은 면역 거부반응 뿐만 아니라 통상 관련된 고유의 윤리적 문제점을 회피할 수 있고 간단한 방식으로 개체에 테일러-메이드 줄기세포를 제공할 수 있다. 따라서 본 발명은 산업적으로 매우 유용하다.

Claims (55)

  1. 원하는 게놈을 지닌 분리된 다기능성 줄기세포
  2. 제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 ES 세포가 아님을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  3. 제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 이식 항원의 적어도 일부가 결실됨을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  4. 제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 이식 항원의 전부가 결실됨을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  5. 제 3항에 있어서, 상기 결실된 이식 항원은 적어도 주요 조직 적합 항원을 포함함을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  6. 제 5항에 있어서, 상기 주요 조직 적합 항원은 클래스Ⅰ 항원을 포함함을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  7. 제 1항에 있어서, 상기 게놈은 재프로그램화된 것임을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  8. 제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 세포를 재프로그램화된 것에 의해 제작됨을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  9. 제 8항에 있어서, 상기 세포는 체세포임을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  10. 제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 줄기세포와 체세포를 융합하여 제조됨을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  11. 제 10항에 있어서, 상기 줄기세포는 ES 세포임을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  12. 제 10항에 있어서, 상기 줄기세포는 조직 줄기세포임을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  13. 제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 원하는 개체 유래의 게놈을 지닌 원하는 개체의 ES 세포도 난세포도 아님을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  14. 제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 원하는 개체 체세포 유래의 염색체를 지님을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  15. 제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아에 직접 유래되지 않음을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  16. 제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 체세포 유래임을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  17. 제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 원하는 개체 이외의 이식 항원이 감소된 것임을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  18. 제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 원하는 개체의 난세포 이외의 체세포 유래임을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  19. 제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 원하는 게놈이 초기 배아 이외의 상태의 개체의 것임을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  20. 제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 이식 항원의 일부 또는 전부를 결실시킨 ES 세포와 체세포와의 미분화된 체세포 융합 세포임을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  21. 제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 이식 항원의 전부가 결실된 ES 세포와 체세포와의 미분화한 체세포 융합 세포임을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  22. 제 20항에 있어서, 상기 이식 항원은 주요 조직 적합 항원임을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  23. 제 22항에 있어서, 상기 주요 조직 적합 항원은 클래스Ⅰ 항원임을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  24. 제 20항에 있어서, 상기 체세포는 이식 세포 유래의 임파구, 비장 세포 또는 정소 유래의 세포임을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  25. 제 20항에 있어서, 상기 ES 세포 및 상기 체세포의 적어도 하나는 인간 유래 세포임을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  26. 제 20항에 있어서, 상기 체세포는 인간 유래 세포임을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  27. 제 20항에 있어서, 상기 체세포 및 상기 간세포의 적어도 하나는 유전자 변이시킨 것임을 특징으로 하는 다기능성 줄기세포
  28. 원하는 게놈을 지닌 다기능성 줄기세포를 생산하는 방법에 있어서,
    ⅰ)상기 줄기세포에 있어서 이식 항원의 일부 또는 전부를 결실시키는 단계; 및
    ⅱ) 줄기세포와 상기 원하는 게놈을 지닌 체세포를 융합하는 단계로 구성된 생산방법
  29. 제 28항에 있어서, 기 줄기세포는 ES 세포임을 특징으로 하는 생산방법
  30. 제 29항에 있어서, 상기 ES 세포는 확립된 ES 세포임을 특징으로 하는 생산방법
  31. 제 28항에 있어서, 상기 이식 항원은 주요 조직 적합 항원임을 특징으로 하는 생산방법
  32. 제 31항에 있어서, 상기 주요 조직 적합 항원은 클래스Ⅰ 항원임을 특징으로 하는 생산방법
  33. 제 28항에 있어서, 상기 체세포는 이식 개체 유래의 임파구, 비장세포 또는 정소 유래의 세포임을 특징으로 하는 생산방법
  34. 제 28항에 있어서, 상기 줄기세포 및 상기 체세포의 적어도 하나는 인간 유래의 세포임을 특징으로 하는 생산방법
  35. 제 28항에 있어서, 상기 이식 항원을 전부 결실시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 생산방법
  36. 원하는 게놈을 지니는 다관능성 줄기세포를 생산하는 방법에 있어서,
    ⅰ) 원하는 게놈을 지니는 세포를 제공하는 단계; 및
    ⅱ) 상기 세포를 재프로그램화 인자를 함유하는 조성물에 노출시키는 단계를 포함하는 방법
  37. 제 36항에 있어서, 상기 세포는 체세포임을 특징으로 하는 방법
  38. 제 36항에 있어서, 상기 재프로그램화 인자는 히스톤 H3 Lys4 메틸화시켜 직접 또는 간접으로 관련된 세포 주기 조절인자, DNA 헬리카제, 히스톤 아세틸레이팅 에이전트 및 전사인자로 구성된 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 인자에 의해 제조됨을 특징으로 하는 방법
  39. 원하는 게놈을 지니는 다기능성 줄기세포로부터 분화된 세포, 조직 또는 장기
  40. 제 39항에 있어서, 상기 세포는 근육세포, 연골세포, 상피세포 또는 신경세포임을 특징으로 하는 세포
  41. 제 39항에 있어서, 상기 조직은 근육, 연골, 상피 또는 신경임을 특징으로 하는 조직
  42. 제 39항에 있어서, 상기 장기는 뇌, 척수, 심장, 간장, 신장, 위, 장 및 췌장으로부터 구성된 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 장기
  43. 제 39항에 있어서, 상기 세포, 조직 또는 장기는 이식하기 위해 사용되는 것임을 특징으로 하는 세포, 조직 또는 장기
  44. 제 39항에 있어서, 상기 원하는 게놈은 이식하려는 숙주와 실질적으로 동일함을 특징으로 하는 세포, 조직 또는 장기
  45. 원하는 게놈을 지닌 다기능성 줄기세포로부터 분화된 세포, 조직 또는 장기를 포함하는 의약
  46. 피검체에 관한 세포 조직 또는 장기의 손상에 의한 질환 또는 장애를 처치 또는 예방하기 위한 의약에 있어서, 상기 피검체와 실질적으로 동일한 게놈을 지닌 다기능성 줄기세포를 포함하는 의약
  47. 피검체에 관한 세포 조직 또는 장기의 손상에 의한 질환 또는 장애를 처치 또는 예방하기 위한 방법에 있어서, 상기 피검체와 실질적으로 동일한 게놈을 지니는 다기능성 줄기세포를 제조하는 단계; 상기 다기능성 줄기세포로부터 상기 세포, 조직 또는 장기를 분화하는 단계; 및 상기 세포 조직 또는 장기를 상기 피검체에 투여하는 단계로 구성된 방법
  48. 피검체에 관한 세포 조직 또는 장기의 손상에 의한 질환 또는 장애를 처치 또는 예방하기 위한 방법에 있어서, 상기 피검체와 실질적으로 동일한 게놈을 지니는 다관능성 줄기세포를 피검체에 투여하는 공정을 더욱 포함하는 방법
  49. 피검체에 관한 세포 조직 또는 장기의 손상에 의한 질환 또는 장애를 처치 또는 예방하기 위한 방법에 있어서, 상기 피검체와 실질적으로 동일한 게놈을 지니는 다관능성 줄기세포로부터 분화된 세포, 조직 또는 장기를 포함하는 의약을 상기 피검체에 투여하는 단계를 더욱 포함하는 방법
  50. 피검체에 관한 세포 조직 또는 장기의 손상에 의한 질환 또는 장애를 처치 또는 예방하기 위하여 의약을 제조하기 위해 다기능성 줄기세포의 사용에 있어서, 상기 의약은 상기 피검체와 실질적으로 동일한 게놈을 지니는 다기능성 줄기세포를 포함하는 다기능성 줄기세포의 사용
  51. 피검체에 관한 세포 조직 또는 장기의 손상에 의한 질환 또는 장애를 처치 또는 예방하기 위하여 의약을 제조하기 위해 다기능성 줄기세포의 사용에 있어서, 상기 의약은 상기 피검체와 실질적으로 동일한 게놈을 지니는 다기능성 줄기세포로부터 분화된 세포, 조직 또는 장기를 포함하는 다기능성 줄기세포의 사용
  52. 원하는 게놈을 지닌 다기능성 줄기세포를 포함하는 의약을 제조하기 위한 다기능성 줄기세포의 사용
  53. 원하는 게놈을 지닌 다기능성 줄기세포로부터 분화된 세포, 조직 또는 장기를 포함하는 의약을 제조하기 위한 다기능성 줄기세포의 사용
  54. 히스톤 H3 Lys4 메틸화 효소 또는 메틸화에 관련된 인자, 세포 주기 조절인자, DNA 헬리카제, 히스톤 아세틸레이팅 에이전트 및 전사인자로 구성된 군에서 선택된 재프로그램화 인자
  55. 제 54항에 있어서, 상기 인자는 전사인자 Sp1 또는 Sp3 또는 그의 보조인자임을 특징으로 하는 재프로그램화 인자
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