JP2009131269A - 内皮細胞の分化増殖方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】胚性幹細胞より分化させた血管内皮増殖因子受容体Flk-1陽性細胞において、cAMPアナログ、ホスホジエステラーゼ阻害薬、およびプロスタン酸誘導体等を用いて細胞内cAMP濃度を上昇させることで、内皮細胞、とくに動脈系内皮細胞の分化増殖を効果的に行う方法。
【選択図】なし
Description
特に本発明は、胚性幹細胞から得られる血管前駆細胞から内皮細胞への分化を有効に誘導しかつ増殖を促進することを目的とし、細胞内cAMP濃度を上昇させるため、cAMPアナログおよびアドレノメジュリン等を使用することに関する。
しかしながら、今日まで、胚性幹細胞へのAMの作用は報告されていない。また、VPCでの細胞内cAMP濃度上昇の効果に関する報告もない。
胚性幹細胞から内皮細胞を大量に分化増殖させるため、培地中のcAMP濃度を上昇させるための工程を包含する、血管再生医療の方法を提供する。
培地中のcAMP濃度を上昇させるために、cAMPアナログおよびホスホジエステラーゼ阻害薬、またはプロスタン酸誘導体であるプロスタグランジンI2誘導体ベラプロスト又はその塩を用いる工程を包含する、血管再生医療の方法を提供する。
また、培地中のcAMP濃度を上昇させる別の方法として、AMおよびその誘導体の投与あるいはAM遺伝子を組み込んだ発現プラスミドの投与、さらにAM受容体を活性化させる工程を包含する、血管再生医療の方法を提供する。
(1) 血管前駆細胞、具体的には胚性幹細胞由来の血管前駆細胞、さらに具体的には単離された血管前駆細胞を細胞内cAMP濃度上昇物質の存在下に分化増殖させることを特徴とする、血管前駆細胞から内皮細胞、特に動脈系内皮細胞を分化増殖させる方法;
(2) 本発明の方法により調製される単離された内皮細胞;
(3) 本発明の単離された内皮細胞を3次元様式で培養することを特徴とする、インビトロにおいて血管構造組織を調製する方法;
(4) 本発明の単離された内皮細胞を生体に移植することを特徴とする、移植部位において血管を形成させ、血流を増加させる方法;
(5) 本発明の単離された内皮細胞を生体に移植することを特徴とする、血管閉塞性疾患を処置する方法;
(6) 細胞内cAMP濃度上昇物質を含有する、血管前駆細胞から内皮細胞または動脈系内皮細胞を分化増殖させるための組成物;
(7) 細胞内cAMP濃度上昇物質を含有する、血管構造組織を形成するための組成物;
(8) 細胞内cAMP濃度上昇物質を含有する、血管閉塞性疾患を処置するための医薬組成物;
(9) 細胞内cAMP濃度上昇物質を含有する、血管形成誘導因子における分化増殖能を促進させるための組成物;に関する。
細胞内cAMP濃度を上昇させることにより、従来の内皮細胞誘導方法にくらべてはるかに大量に内皮細胞を誘導できる。
細胞内cAMP濃度を上昇させることにより分化増殖される内皮細胞は、EphrinB2などのマーカーを有した動脈系内皮細胞が主体であり、これは本発明の方法により胚性幹細胞から分化増殖される内皮細胞が動脈系内皮細胞としての性質を持つことを意味する。
細胞内cAMP濃度を上昇させることにより分化増殖される内皮細胞により、インビトロで有効に3次元様式で培養することにより血管構造を構築できること、および生体に移植することで、血管を形成し移植部の血流を増加し得ること。
本発明により、血管再生が可能となり、血管閉塞性疾患すなわち、閉塞性動脈硬化症(Aterosclerosis Obliterans; ASO)、虚血性心疾患、脳血管障害(脳梗塞、痴呆を含む)などに対して、血管を再生し、血流を再開、増加させるという根本的な治療が可能となり、血管再生医療の開発にもつながる。
出発原料としての「血管前駆細胞」は例えば、Yamasita J.等、Nature. 2000, 408(6808): 92-96に記載のようにして、胚性幹細胞から分化させ、入手することができる。胚性幹細胞(embryonic stem cell)は胚幹細胞あるいはES細胞とも呼ばれ、胚盤胞の内部に存在する未分化幹細胞である内部細胞塊を構成している細胞を培養に移し、頻繁に細胞塊の解離と継代を繰り返すことで樹立できる。この細胞は正常核型を維持しながらほぼ無限に増殖と継代を繰り返すことができ、内部細胞塊と同じようにあらゆる種類の細胞に分化することができる多分化能を保つことが知られている。
また、血管前駆細胞は、胚性幹細胞のほか、胎仔および骨髄由来細胞などの自己複製可能な他の多能性幹細胞からも調製できる。本発明においては、ヒト、サル、マウスなどの多様な動物に由来する多能性幹細胞を使用できる。
「cAMPアナログ」とは、細胞に接触させると細胞内cAMP濃度を上昇させる、cAMPに類似した構造を有する化合物であり、これには例えば8-ブロモアデノシン-3': 5'-サイクリック一リン酸ナトリウム塩(8-br-cAMPナトリウム塩)、ジブチリル-cAMPが含まれる。
「アドレノメジュリン」または「AM」は、正常な副腎髄質および心臓、血管(内皮細胞、血管平滑筋細胞)、肺、脳、腎臓など多くの組織に含有されている52アミノ酸のペプチドである(Kitamura K.等,Biochem. Biophys. Res. Commun (192: 553-560 (1993))。AMは特開平7-196693に記載の方法により容易に調製できる。
AMはその受容体であるカルシトニン受容体様受容体(calcitonin-receptor-like receptor (CRLR))と受容体活性改変プロテイン−2(receptor-activity-modifying protein-2 (RAMP-2))あるいは受容体活性改変プロテイン−3(receptor-activity-modifying protein-3 (RAMP-3))との複合体に結合し、細胞内cAMP濃度を上昇させることによりその生物学的活性を発揮することが知られている。よって、「アドレノメジュリン誘導体」とは、胚性幹細胞上に局在するアドレノメジュリン受容体を活性化させるあらゆる物質を意味し、例えば、アドレノメジュリンを構成する52アミノ酸残基の1または数個のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有し、かつアドレノメジュリンが有する活性を保持したペプチドが挙げられ、例えばAM(22-52)やCGRP(8-37)が例示される。
本発明において使用される「プロスタン酸誘導体」とはプロスタン酸を基本骨格とし、これに二重結合やヒドロキシ基等が加わった数多くの不飽和脂肪酸を意味し、これにはプロスタグランジン類、トロンボキサン類、ロイコトリエン類が含まれる。本発明においては特に、プロスタグランジンI2誘導体が好ましく、ベラプロストまたはその塩が特に好ましい。ここに、「塩」とはイオン化合物を意味する。
本発明は別の態様として、本発明の方法により調製される単離された内皮細胞を提供する。
本発明において、「単離された」とは、生体から物理的に分離された状態、または他の種類の細胞の混入がない状態を表す。
本発明において単離される内皮細胞の多くは上記のとおり、Flk-1陽性、PECAM-1陽性、EphB4結合分子陽性かつE-カドヘリン陰性であり、それは動脈系内皮細胞である。
「3次元様式での培養」とは、例えばゲルの中に細胞を埋め込んで培養する立体的培養を意味し、本発明ではこれにより血管構造組織の構築を促すことができる。「血管構造組織」とは、動脈、静脈、リンパ管等の脈管を構成する組織を意味する。
移植の方法としては、局所注入、血管内注入(動脈内、静脈内)を挙げることができる。
本発明において、「血管閉塞性疾患」とは閉塞性動脈硬化症、虚血性心疾患、脳血管障害、例えば脳梗塞、痴呆である。
この態様において、本発明は、本発明の単離された動脈系内皮細胞または内皮細胞における血管閉塞性疾患を処置する使用に関する。
本発明は別の態様として、血管前駆細胞から内皮細胞または動脈系内皮細胞を分化増殖させるために用いられる、細胞内cAMP濃度上昇物質を含有する組成物に関する。
「細胞内cAMP濃度上昇物質」は上記のとおりである。かかる組成物は通常、胚性幹細胞由来血管前駆細胞に対し、ex vivoで細胞内cAMP濃度を上昇させる目的で細胞内cAMP濃度上昇物質を添加するのに用いられる。
この態様において、本発明は、血管前駆細胞から内皮細胞または動脈系内皮細胞を分化増殖するための組成物を調製するための、細胞内cAMP濃度上昇物質の使用に関する。
この態様における組成物は典型的には、細胞内cAMP濃度上昇物質を含有する、細胞培養培地である。
この態様の発明は、血管構造組織を形成するための試薬として利用される。
この態様の発明は通常、注射により生体に投与される。投与部位は目的とする疾患により異なり、通常、静脈内投与である。用量は適宜医師により決定されるが、通常、0.05μg/分/kg体重である。
本発明は別の態様として、血管形成誘導因子が有する血管形成を促進、増大、増進させるために用いられる、細胞内cAMP濃度上昇物質を含有する組成物に関する。
本発明において、血管形成誘導因子とは、破壊局所からの血管内皮細胞の発芽、血管外への遊走・増殖、管腔形成の諸過程を促進し、新たな毛細血管の形成を促す活性を有する因子を意味する。これには例えば、血管内皮増殖因子(VEGF)、繊維芽細胞増殖因子−2、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)等が挙げられる。本発明に用いられる血管形成誘導因子は天然由来のものあるいは遺伝子操作により調製されたものいずれも使用することができる。
本発明は別の態様として、細胞内cAMP濃度上昇物質を含有する、血管構造組織を形成する、または血管閉塞性疾患を処置する組成物を調製するための、本発明の方法による胚性幹細胞から内皮細胞ないし動脈系内皮細胞にいたるインビトロの分化培養系の使用を提供する。また、本発明の方法による胚性幹細胞から内皮細胞ないし動脈系内皮細胞にいたるインビトロの分化培養系における分化過程の細胞での遺伝子発現を網羅的に解析する方法(例えば、PNAマイクロアレイ法など)を提供する。さらに、遺伝子発現のデータベース開発により、そのデータベースから新しい血管形成誘導遺伝子を見つけることが可能となる。
参考例
胚性幹細胞からのFlk-1陽性細胞への分化増殖
本発明者らが以前に報告した方法(Yamashita J等、Nature 408: 92-96 (2000)により、Flk-1陽性細胞を分化増殖させた。すなわち、マウス胚性幹細胞(Department of Molecular Embryology, Max-Planck-Institute fur Immunobiology, Freiburg, GermanyのBM I Evans博士より供与)を10%胎児ウシ血清(FCS)および5×10-5M 2-メルカプトエタノール含有アルファー最小必須培地(分化メデイウム)にて、タイプIVコラーゲンにてコートした培養皿(ベクトンデイキンソン社)上で、5%CO2および95%空気の環境下37℃で4日間培養した。
分化増殖させたFlk-1陽性細胞を、既報の方法に従い(Nishikawa SI 等、Development 125: 1747-1457 (1998))、FACSヴァンテージ(ベクトンデイキンソン社)にて97%以上の純度で単離した。
Flk-1陽性細胞からの内皮細胞への分化増殖に対する種々の添加剤の効果
内皮細胞の単離では、APC結合抗-Flk-1モノクローナル抗体(AVAIS12 (Dev.Growth Differ. 39, 729-740 (1997)))およびFITC結合抗-E-カドヘリンモノクローナル抗体(ECCD2 (Cell Struct.Funct. 11, 245-252(1986)))を用い、Flk-1陽性かつE-カドヘリン陰性細胞分画を採取した。
内皮細胞の分化および分化した内皮細胞の性状の検討は、APC結合VE-カドヘリン抗体(VECD1 (Proc.Assoc.Am.Physicians 109, 362-371 (1997)))、FITC結合PECAM-1抗体(Mec13.3 (Pharmigen))、およびFITC結合CD34抗体(RAM34 (Pharmigen))を用いて、FACSセルソーターにて行った。
10%FCSおよびVEGF (50ng/ml)含有分化メデイウム(この培養メデイウムを以下メデイウムAと称する)に添加剤として、ラットAMおよびAM誘導体であるヒトAM-(22-52)-アミド(ともにペプチド研究所)、8-ブロモアデノシン-3': 5'-サイクリック一リン酸ナトリウム塩(8-br-cyclic AMP)、IBMX、およびプロスタグランジンI2誘導体であるベラプロストを加える以外は、同様に培養し、Flk-1陽性細胞からの内皮細胞への分化増殖に対する種々の添加剤の効果を調べた。
メデイウムAに8-br-cAMPを添加し、胚性幹細胞由来VPCをコラーゲンIVコート培養皿上にて4日間培養し内皮細胞マーカ一であるPECAM-1および壁細胞マーカーであるSMAによる免疫学的二重染色をおこなった。得られた結果を図1に示す(PECAM-1(一部を矢印にて図中に示す)、SMA(一部を矢印にて図中に示す)、40倍)。図1は、8-br-cAMP 0.1mM〜0.5mMの濃度において濃度依存性に内皮細胞への分化を促進していることを示している。また、0.5mMの8-br-cAMP添加にて内皮細胞に分化した細胞は全体の約70%に達していることが判明した。なお、VEGF非存在下では、8-brc-AMPの内皮細胞分化促進作用は認められなかった。
メデイウムAにアドレノメジュリン(AM)を添加し、同様に培養した結果を図3に示す。AM(10-9〜10-6M)の添加は、メディウムA単独の培養と比較し、濃度依存的に胚性幹細胞由来VPCからPECAM-1陽性内皮細胞の分化増殖を促進した(内皮細胞への分化を示す細胞数が増加)(図3、PECAM-1(一部を矢印にて図中に示す)、SMA(一部を矢印にて図中に示す)、200倍)。AM10-6M添加により内皮細胞に分化した細胞は全体の細胞の50%に達した。AM(10-7M)添加時に認められる胚性幹細胞由来VPCからのPECAM-1陽性内皮細胞(青)分化の促進効果は、AM誘導体であるAM(22−52)(10-4M)の添加によりメディウムA単独培養条件と同程度に阻害された(図4参照、PECAM-1(一部を矢印にて図中に示す)、SMA(一部を矢印にて図中に示す)、100倍))。このことから、AMの分化促進効果はAM受容体を介した作用であると考えられた。同様の作用は、プロスタグランジンI2誘導体であるベラプロスト(10nM)添加においても認められた。
胚性幹細胞より分化した内皮細胞の性状検討
EphrinB2は動脈系内皮細胞に発現し、その受容体であるEphB4は静脈系内皮細胞に発現することが知られている(Adams, R et al Genes Dev. 13: 295-306 (1999))。
そこで、既に報告している免疫組織化学的手法 (Hirashima等、Blood 93: 1253-1263 (1999))により、実施例1にて分化増殖した細胞をメタノール固定後、Mec 13.3や抗アルファ平滑筋アクチン(SMA)抗体(1A4 (SIGMA社))にて処理し、アルカリフォスファターゼ結合抗ラットIgG抗体(EphB4-Feキメラ (ZYMED社))、あるいは西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗マウスIgG抗体(ZYMED社)等を用いて染色した。
さらに、EphrinB2発現の検討には、EphrinB2が特異的に結合するEphB4とヒトIgGのキメラタンパクとペルオシダーゼ結合抗ヒトIgGFcヤギIgG(ICN/CAPPEL社)を用いた。この際、EphB4-ヒトIgGキメラタンパクとEphrinB2の結合の検出感度を上げるため、Tyramid Signal Amplication Biotinシステム(Perkin Elmerライフサイエンス社)を用いた。
これは、AMあるいは8-br-cAMPが胚性幹細胞由来の血管前駆細胞から動脈系内皮細胞を分化させたことを示している。
マウス胚性幹細胞におけるAMの発現はすでに本発明者らが開発したマウス抗AMモノクローナル抗体(Michibata H等、Kidney Int 53: 979-985 (1998))を用いて、本発明者らの既報の方法に準じて(Naruko T等、Circulation 94: 3103-3108 (1996))行った。
胚性幹細胞由来VPCより分化した血管細胞におけるAMおよびその受容体の発現を検討したところ、胚性幹細胞由来VPCより分化した壁細胞においてAMの発現を認め、一方、内皮細胞においてAM受容体の発現を認めた。
これは、胚性幹細胞由来の内皮細胞にAMが作用できること、および同時に分化する壁細胞から分泌されるAMが内皮細胞に作用する可能性を示している。
結果はさらに上記添加剤により、血管新生において重要な動脈系の内皮細胞への分化増殖を促進されたことを示している。
これらのAMの胚性幹細胞への作用は、AM受容体の媒介を通して発現すると考えられる。従って、本発明は、胚性幹細胞を用いた血管再生医療の開発に新しい方法を提供する。つまり、胚性幹細胞を虚血部に移植することで生体内で血管を形成し局所の血流を回復させる際、胚性幹細胞由来移植内皮細胞の量的確保および質的な変化調整をめざす新規のセルプロセシング方法を提供する。
また、胚性幹細胞から内皮細胞ないし動脈系内皮細胞にいたるインビトロの分化培養系における分化過程の細胞群の遺伝子発現をDNAマイクロアレイ法などを用いて、網羅的に解析する方法も新規の血管再生誘導遺伝子の探索、血管再生医薬の開発に有用であると考えられる。
Claims (21)
- 生体外において、血管前駆細胞をcAMPアナログ、ホスホジエステラーゼ阻害薬、およびプロスタン酸誘導体からなる群の中から選択される細胞内cAMP濃度上昇物質の存在下に分化増殖させることを特徴とする、血管前駆細胞から内皮細胞を分化増殖させる方法により調製される単離された内皮細胞。
- 血管前駆細胞が胚性幹細胞から分化増殖されたものである、請求項1記載の内皮細胞。
- 単離された血管前駆細胞を増殖させる、請求項1または2記載の内皮細胞。
- 細胞内cAMP濃度上昇物質が、8-ブロモアデノシン-3': 5'-サイクリック一リン酸ナトリウム塩、3-イソブチルメチルキサンチン(IBMX)、およびベラプロスト又はその塩からなる群の中から選択される、請求項1から3までのいずれか記載の内皮細胞。
- 血管前駆細胞から動脈系内皮細胞を分化増殖させる、請求項1から4までのいずれか記載の内皮細胞。
- 動脈系内皮細胞が、Flk-1陽性、PECAM-1陽性、EphB4結合分子陽性、かつE-カドヘリン陰性である、請求項5記載の内皮細胞。
- 血管形成誘導因子の存在下に増殖させる、請求項1から6までのいずれか記載の内皮細胞。
- 血管内皮増殖因子(VEGF)ならびにcAMPアナログ、ホスホジエステラーゼ阻害薬、およびプロスタン酸誘導体からなる群の中から選択される細胞内cAMP濃度上昇物質の存在下に増殖させる、血管前駆細胞から内皮細胞を分化増殖させる請求項7記載の内皮細胞。
- 請求項1から8までのいずれか記載の内皮細胞を3次元様式で培養することを特徴とする、インビトロにおいて血管構造組織を調製する方法。
- 移植部位において血管を形成させ、血流を増加させるための、請求項1から8のいずれか記載の内皮細胞を含有する医薬組成物。
- 血管閉塞性疾患を処置するための、請求項1から8のいずれか記載の内皮細胞を含有する医薬組成物。
- 血管閉塞性疾患が、閉塞性動脈硬化症、虚血性心疾患、脳血管障害である請求項11記載の医薬組成物。
- cAMPアナログ、ホスホジエステラーゼ阻害薬、およびプロスタン酸誘導体からなる群の中から選択される細胞内cAMP濃度上昇物質を含有する、血管前駆細胞から内皮細胞を分化増殖させるための組成物。
- cAMPアナログ、ホスホジエステラーゼ阻害薬、およびプロスタン酸誘導体からなる群の中から選択される細胞内cAMP濃度上昇物質を含有する、血管前駆細胞から動脈系内皮細胞を分化増殖させるための組成物。
- 胚性幹細胞由来の血管前駆細胞から内皮細胞を分化増殖させるための、請求項13または14記載の組成物。
- 細胞内cAMP濃度上昇物質が、8-ブロモアデノシン-3': 5'-サイクリック一リン酸ナトリウム塩、3-イソブチルメチルキサンチン(IBMX)、およびベラプロスト又はその塩からなる群の中から選択される、請求項13から15までのいずれか記載の組成物。
- 血管形成誘導因子をさらに含む、請求項13から16までのいずれか記載の組成物。
- 血管内皮増殖因子(VEGF)ならびにcAMPアナログ、ホスホジエステラーゼ阻害薬、およびプロスタン酸誘導体からなる群の中から選択される細胞内cAMP濃度上昇物質を含有する、請求項17記載の組成物。
- 細胞培養培地である請求項13から18までのいずれか記載の組成物。
- cAMPアナログ、ホスホジエステラーゼ阻害薬、およびプロスタン酸誘導体からなる群の中から選択される細胞内cAMP濃度上昇物質を含有する、血管構造組織を形成するための組成物。
- cAMPアナログ、ホスホジエステラーゼ阻害薬、およびプロスタン酸誘導体からなる群の中から選択される細胞内cAMP濃度上昇物質を含有する、血管形成誘導因子における分化増殖能を促進させるための組成物。
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