CN117106714A - 一种制备b细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备B细胞的方法。所述方法包括（a）在补充了CHIR 99021的培养基中悬浮培养EB，和（c1）使用FcVCAM‑1包被细胞培养板并孵育。本发明的方法缩短了iPSC向HSPC分化、HSPC向B细胞分化所需的时间，效率更高，易于规模化扩大生产。

Description

一种制备B细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别是涉及一种制备B细胞的方法，具体涉及一种诱导iPSC来源的造血干细胞分化为B细胞的方法。
背景技术
免疫系统的B细胞，也称为B淋巴细胞，具有产生免疫球蛋白（抗体）的能力，有可能识别所有可能感染的微生物和肿瘤特异性抗原。B细胞由骨髓中的造血干细胞（HSC）发育而来，在骨髓中发育的第一阶段后在次级淋巴器官中扩增和进一步分化，B细胞从中获得抗原特异性和分泌针对所选靶点的抗体的能力。
在这个阶段，未成熟的B细胞离开骨髓小生境，进入次级淋巴器官，如脾脏和淋巴结。在这些区域内，CD4+T辅助细胞将抗原呈递给幼稚的B细胞，然后B细胞在称为生发中心（GC）的微观解剖结构中激活并开始一轮又一轮的增殖、选择和亲和力成熟。一旦选择过程完成，B细胞离开GC，然后分化为高亲和力抗体分泌细胞（ASC）/浆细胞或记忆B细胞，用于抗原特异性的终身存储。
抗体的主要功能是识别并锁住抗原，以便将其从体内清除。这一重要功能已在现代医学中被用于开发预防性疫苗，通过刺激免疫系统攻击和消除特定有害物质，从而对其产生积极免疫力。然而，在最近几十年中，也开发了用于治疗其他疾病（治疗性疫苗）的疫苗，如实体和血液癌症。医学领域的另一个重要应用是单克隆抗体的使用。这些是通过基因工程人工产生的，因为它们能够识别几乎任何分子上的单个抗原位点，从药物和激素到微生物抗原和细胞受体。
即使最近的技术进步，疫苗和单克隆疗法仍有许多局限性，主要包括效率和可负担性。疫苗依赖于接受者的免疫系统发挥作用，通常需要几剂（加强针）来训练身体自卫，免疫反应可能在几个月内减弱。另一方面，单克隆抗体的被动免疫具有高的生产成本，因为它需要使用非常大的哺乳动物细胞培养物，然后进行广泛的纯化步骤；在设计足够的药代动力学和组织渗透方面存在困难；在体外可以有各种作用模式，并且一旦在患者体内注射，实际的作用模式并不总是清楚的。
一些研究报道了从供体纯化的CD34+细胞体外高效分化为B细胞，具有与人类循环B细胞相同的功能、形态和基因表达谱。通过利用新的遗传技术，重新编程的人类B细胞可以充当细胞工厂，能够输送通过基因编辑引入的持续、高剂量的治疗蛋白。此外，工程B细胞可以为包括感染、癌症和自身免疫性疾病在内的多种疾病提供长期治疗。
发明内容
发明要解决的问题
本发明旨在提供一种从iPSC衍生的造血干细胞（CD34+细胞）分化几种B细胞亚群的方法。本发明的目的将提供一种用于无限期产生B细胞的平台，该平台可以进行基因修饰，目的是实现用于治疗多种疾病的确定的单克隆抗体的体内表达。
用于解决问题的方案
本发明提供了一种制备B细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
a. 在补充了CHIR 99021的培养基中，诱导多能干细胞（iPSC）分化成胚状体（EB）；
b. 诱导步骤a中形成的EB分化成造血干细胞和祖细胞（HSPC）；
c. 诱导步骤b中形成的HSPC分化为B细胞；
其中，所述步骤a包括：
（a1）在CHIR 99021和Rki的存在下，在第0天进行诱导；
（a2）在CHIR 99021的存在下，在第1天再次进行诱导。
优选地，所述步骤b包括：
（b1）在补充了BMP4、FGF2、VEGF的造血分化培养基中悬浮培养EB；
（b2）在补充了BMP4、SCF、FGF2、VEGF和SB431542的造血干细胞扩增培养基中继续悬浮培养；
（b3）在补充了SCF、FGF2和VEGF的造血干细胞扩增培养基中进一步悬浮培养，形成HSPC。
优选地，所述步骤（a）是在第0-1天进行，所述步骤（b1）是在第2-3天进行，所述步骤（b2）是在第4-5天进行，所述步骤（b3）是在第6-7天进行。
优选地，所述HSPC具有CD34+表型。
优选地，所述步骤c包括：
（c1）使用FcVCAM-1包被细胞培养板并孵育。
优选地，所述FcVCAM-1的浓度为2.5 µg/mL。
优选地，所述步骤c还包括：
（c2）分离纯化HSPC，并在含有MEMα的培养液中培养；
（c3）使用FcVCAM-1包被细胞培养板并孵育；
（c4）收获悬浮细胞，将其在含有MEMα的培养液中重新接种到包被有FcVCAM-1的板中，并在培养箱中再次培养；
（c5）将培养物重悬于含有MEMα的培养液中；
（c6）将培养物重悬于含有Iscove改良杜氏培养液的培养液中并活化3天；
（c7）将培养物重悬于含有Iscove改良杜氏培养液的培养液中。
优选地，所述步骤（c1）是在步骤b所述HSPC形成前1天进行，所述步骤（c2）是在步骤b所述HSPC形成后第0天进行，所述步骤（c3）是在步骤b所述HSPC形成后第3天进行，所述步骤（c4）是在步骤b所述HSPC形成后第4天进行，所述步骤（c5）是在步骤b所述HSPC形成后第8天进行，所述步骤（c6）是在步骤b所述HSPC形成后第9天进行，所述步骤（c7）是在步骤b所述HSPC形成后第13天进行。
优选地，所述培养液中补充有热灭活FBS、胰岛素转铁蛋白硒G、P/S、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、抗坏血酸、rhSCF、rhTPO、rhIL-4、rhIL-6、rhIL-7、rhIL-12、rhIL-15、rhIL-21、FLT3配体、rhSDF-1a、rhCD40L、rhIFNα和BAFF中的一种或多种。
本发明还提供了一种药物制剂，所述药物制剂包含治疗或预防有效量的根据所述方法制备得到的B细胞、药学上可接受的载体或稀释剂，以及任选地一种或多种其他活性剂。
发明的效果
本发明提供了一种从iPSC诱导分化B细胞的方法，所述方法包括几种试剂和细胞因子的组合，对B细胞发育的早期阶段至关重要，缩短了实现B细胞的完全分化所需的时间。
本发明还通过在合适的条件下进行分步体外培养iPSC，成功地实现了向HSPC的高效分化，所获得的培养产品不含异源物质，符合GMP标准，并且易于规模化扩大生产；同时，还具有分化时间更短、效率更高的优势。
附图说明
图1为使用iPSC生产HSPC的流程图，在分化的第8天，收获EB上清液，并通过免疫磁性细胞分离（MACS）富集CD34+HSPC。
图2为使用iPSC生产HSPC的分化方案示意图，利用细胞因子和添加时间的变化从iPSC产生HSPC。
图3为HSPC分化过程中的代表性明场图像。箭头表示悬浮液中CD34+造血干细胞的出现。
图4为HSPC标志物的流式细胞术分析。A） 用于流式细胞术分析的HSPC细胞门控的代表，HSPC细胞在条件6的第8天被鉴定为CD235a-CD14-CD43+CD34+；B）用于流式细胞术分析的HSPC细胞门控的代表，HSPC细胞在条件6的第10天被鉴定为CD235a-CD14-CD43+CD34+。
图5为从iPSC生产的CD34+CD43+HSPC。两个独立的iPSC系（IBX和CNTB）在各种条件下分化，在第8天收获EB外源性的非粘附细胞，并通过流式细胞术测定CD34+CD43+HSPC的比例。A）第8天的IBX iPSC；B）第8天的CNTB iPSC。
图6为iB细胞分化过程中的代表性明场图像。在第8天从IBX细胞系获得CD34+细胞，并在早期B细胞分化培养基中铺板以诱导B细胞分化；作为对照，从人PBMC中分选CD34+。图像放大4倍，比例尺=200µm。
图7为条件6诱导后第7天的iB细胞标志物流式细胞术分析。A）用于流式细胞术分析的iB前体细胞门控的代表；B）用于流式细胞术分析的Pre-B细胞门控的代表（CD34-CD117-CD24+CD10+CD38+）；C）用于流式细胞术分析的Pro-B细胞门控的代表（CD34+CD117+CD24+CD10+CD38+CD19+CD20+）。
图8为条件4和条件6诱导后第7天的B细胞标志物流式细胞术分析。A）活细胞；B）Pre-B细胞（CD24+CD10+CD38+）；C）Pro-B细胞前体（CD34+CD117+）；D）Pro-B细胞（CD117+CD34+CD24+CD10+CD38+CD19+CD20+）。
图9为iB细胞分化示意图，从iPSC来源的造血干细胞生产iB细胞。
图10为iB细胞分化过程中的代表性明场图像。箭头表示CD34+造血干细胞向Pro-B细胞的形态变化，显示细胞大小增加，比例尺=200µm。
图11为iB细胞标志物的流式细胞术分析。A）用于流式细胞术分析的iB细胞门控的代表，iB细胞被鉴定为CD24+CD10+CD38+CD19+CD20+；B）流式细胞术分析中使用的每个标记物的同型对照。浅灰色直方图=iB细胞同种型；深灰色直方图＝iB细胞。
图12为iB细胞群活细胞频率的流式细胞术代表性直方图。N=2；数据表示平均值± s.e.m。
图13为iB细胞在诱导后不同时间点的受体特征。A）人B细胞发育必需受体表达；B）用于流式细胞术分析的iB细胞受体门控的代表，受体由CD19+CD20+iB细胞门控；C）流式细胞术分析中使用的每个标记物的同型对照， D）诱导后不同时间点表达的iB细胞受体的流式细胞术分析。浅灰色直方图=iB细胞同种型，深灰色直方图＝iB细胞；N=2；数据表示平均值 ± s.e.m，*P < 0.05（Mann–Whitney U检验，双尾P值）。
图14为iB细胞在诱导后不同时间点的转录因子特征。A）人B细胞发育所必需转录因子表达；B）通过RT-qPCR（相对于内源性基因b-actin的2-ΔΔCt方法）评估从诱导后不同时间点分离的iB细胞（D0-7-14-21）中转录因子的表达。n = 每组4只小鼠，N=2，数据表示平均值 ± s.e.m，*P < 0.05（Mann–Whitney U检验，双尾P值）。
图15为iB细胞分化示意图，使用缩短的分化方案从IPSC来源的造血干细胞生产iB细胞。
图16为iB细胞分化过程中的代表性明场图像。箭头表示CD34+造血干细胞向Pro-B细胞和浆母细胞的形态变化，显示细胞大小增加，比例尺=200µm。
图17为用于鉴定从iPSC分化的iB细胞的人B细胞标记物。Ig：免疫球蛋白；Pax5，配对盒基因5；EBF：早期B细胞因子1；OCT2：八聚体转录因子2；FOXO1：叉头框蛋白O1。
图18为iB细胞标志物的流式细胞术分析。A）多能祖细胞的门控策略；B）早期Pro-B细胞和晚期Pro-B细胞的门控战略；C）Pre-B细胞的门控策略。
图19为iB细胞标志物的流式细胞术分析。A）iB细胞流式细胞术分析的预门控；B）未成熟B细胞的门控策略；C）浆母细胞和浆细胞的门控策略。
图20为iB细胞群活细胞频率的流式细胞术代表性直方图。A）第4天的iB细胞群；B）第8天的iB细胞群；C）第13天作为亲本频率的浆细胞（PC）群体（CD38+CD27+CD138+CD20-）；D）第8天未成熟B细胞亚群上IgM表达的流式细胞术分析。
图21为诱导后第8天iB细胞的受体特征。A）人类B细胞发育必需受体表达；B）用于流式细胞术分析的iB未成熟B细胞门控；C）iB细胞受体表达的流式细胞术分析。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和有益效果能够更加明显易懂，下面通过列举具体实施例的方式进行详细说明。其中，附图不一定是按比例绘制的，局部特征可以被放大或缩小，以更加清楚的显示局部特征的细节；除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语与本申请所属的技术领域中的技术和科学术语的含义相同。
除非另有说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。除非另有说明，本发明所述的室温为20℃～30℃。除非另有说明，本发明所使用的各种材料和试剂，可以使用本领域常规的方法获得，也可以通过商业渠道获得，具体如下所示：
血管细胞粘附分子1（VCAM-1）：R&D systems, Cat # 643VM200，
MEMa：Gibco, Cat # 12571-063，
Iscove改良杜氏培养液（IMDM）：Gibco, Cat # 12440-053，
Stemscale：Gibco, Cat # A4965001，
Stempro：Gibco, Cat # 10639011，
胎牛血清（FBS）：Gibco, Cat # 10099141，
胰岛素-转铁蛋白-硒G（ITS-G）：Gibco, Cat # 41400-045，
青霉素-链霉素（P/S）：Gibco, Cat # 15140122，
B-巯基乙醇：Gibco, Cat # 21985023，
L-抗坏血酸：Sigma-Aldrich, Cat # A4544，
GlutaMAX补充剂：Gibco, Cat # 35050061，
Y27632：Tocris, Cat # 1254，
CHIR99021：Miltenyi Biotec, Cat # 130-103-926，
骨形态发生蛋白4（BMP4）：Miltenyi Biotec, Cat # 130-111-067，
成纤维细胞生长因子（FGF2）：Miltenyi Biotec, Cat # 130-093-564，
血管内皮生长因子（VEGF）：Miltenyi Biotec, Cat # 130-109-396，
SB431542：Tocris, Cat # 1614，
TrypLE Express：Gibco, Cat # 12604-021，
Stempro Accutase：Gibco, Cat # A1110501，
Dexamethosone：Sigma, Cat # D4902，
干细胞因子（SCF）：Miltenyi Biotec, Cat # 130-096-695，
血小板生成素（TPO）：Miltenyi Biotec, Cat # 130-095-752，
白介素2（IL-2）：Miltenyi Biotec, Cat # 130-097-748，
白介素4（IL-4）：Miltenyi Biotec, Cat # 130-093-922，
白介素5（IL-5）：Miltenyi Biotec, Cat # 130-093-927，
白介素6（IL-6）：Miltenyi Biotec, Cat # 130-093-931，
白介素7（IL-7）：Miltenyi Biotec, Cat # 130-095-362，
白介素10（IL-10）：Miltenyi Biotec, Cat # 130-093-948，
白介素12（IL-12）：Miltenyi Biotec, Cat # 130-096-705，
白介素15（IL-15）：Miltenyi Biotec, Cat # 130-095-764，
白介素21（IL-21）：Miltenyi Biotec, Cat # 130-095-768，
干扰素α（IFNα）：Miltenyi Biotec, Cat # 130-093-874，
MegaCD40L：Enzo Lifesciences, Cat # ALX-522-110-C010，
FLT3配体（FLT3）：Miltenyi Biotec, Cat # 130-096-477，
基质细胞衍生因子1（SDF-1α）：PeproTech, Cat # 300-28A，
B细胞活化因子（BAFF）：Miltenyi Biotec, Cat # 130-093-807，
Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）：Gibco, Cat # 14190-144。
在本发明的上下文中，有关术语按照本领域中的常规定义。并且具体地，一些术语的含义如下。
如本文所用，术语“多能干细胞”是指具有发育分化成多种组织或细胞类型的细胞，其保留了干细胞的潜能，即发育分化成三种胚层的潜能。多能干细胞能够在体外长期增殖，同时保留分化成机体所有细胞类型、包括例如本发明的造血干细胞和前体细胞的潜能。在本发明中，多能干细胞包括例如胚胎干细胞、诱导的多能干细胞等。
如本文所用，术语“诱导的多能干细胞”或“iPSC”是指通过表达或诱导表达细胞因子而从体细胞生成的、具有分化成各种胚层的细胞。本发明中使用的iPSC可以是多种动物来源，包括人，以及小鼠、猪、非人灵长类等能够获得iPSC物种。其他动物来源也是合适的，只要其iPSC能够供使用即可。本发明中通过在适当的培养条件下对iPSC进行体外培养，低成本、高效率地提供了造血干细胞和前体细胞，为一些血液病或肿瘤的预防和治疗打下了坚实的基础。
本领域中知晓如何产生诱导的多能干细胞。多能性的诱导最初是在2006年使用小鼠细胞（Yamanaka等，2006）和2007年使用人细胞（Yu等，2007；Takahashi等，2007）通过引入与多能性有关的转录因子重编程体细胞实现的。使用iPSC可以避免与大规模临床使用ES细胞相关的大多数伦理和实际问题，而具有iPSC衍生的自体移植的患者可能不需要终身免疫抑制治疗来预防移植排斥反应。可以使用本领域技术人员已知的方法将体细胞重编程以产生诱导的多能干细胞（iPSC）。本领域技术人员可以容易地产生诱导的多能干细胞，参见例如公开的美国专利申请号20090246875，公开的美国专利申请号2010/0210014；公布的美国专利申请号20120276636；美国专利号8,058,065；美国专利8,129,187；美国专利号8,268,620；PCT公开号WO 2007/069666 A1和美国专利8,268,620，其通过引用并入本文。通常，核重编程因子用于从体细胞产生多能干细胞。将体细胞重编程为去分化或多能状态通常涉及重编程因子（包括转录因子）的表达。相关的转录因子可以包含以下一种或多种，或由以下一种或多种因子组成或基本上由其组成：OCT4、SOX2、KLF4和MYC（OSKM）；SOX2、KLF4和OCT4（SKO）；OCT4、SOX2、KLF4和GLIS1（OSKG）；OCT4、SOX2、NANOG和LIN28（OSNL）；或OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、NANOG和LIN28（OKSMNL）。
在某些实施方案中，使用Klf4、c-Myc、Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28中的至少三种或至少四种。
在某些实施方案中，使用Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4。
这些核重编程物质的小鼠和人cDNA序列可参考WO 2007/069666和美国专利8,183,038中提及的NCBI登录号，其通过引用并入本文。用于引入一种或多种重编程物质或编码这些重编程物质的核酸的方法是本领域已知的，并且公开于例如美国专利号8,268,620、8,691,574、8,741,648、8,546,140，公开的美国专利号8,900,871和美国专利号8,071,369，这两个专利都通过引用并入本文。它们可以以整合型（例如慢病毒）或非整合型（例如仙台病毒）病毒、mRNA（非修饰或修饰的mRNA、自我复制的mRNA）、游离型质粒或蛋白质的形式递送。生成iPSC的另一种方法涉及使用体细胞核移植技术（SCNT）。
如本文所用，术语“造血干细胞和祖细胞”或“HSPC”是指骨髓（BM）细胞的一个亚群，具有自我更新能力，并且能够产生造血谱系的所有细胞类型。通过细胞表面标记CD34和CD43的表达水平可以鉴定造血干细胞和祖细胞。
待分化为造血细胞及其前体的多能干细胞可以在足以维持多能性的培养基中培养，例如可以使用开发用于培养灵长类多能干细胞更特别是胚胎干细胞的各种培养基和技术，如美国专利申请20070238170和美国专利申请20030211603中描述的。
如本领域中已知的，多能干细胞可以在饲养层细胞上维持培养。或者，多能干细胞也可以在无饲养层的系统上维持，因此增殖。优选地在基质上进行。合适的基质包括、但不限于层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、胶原蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、胶原蛋白VIII、硫酸乙酰肝素、MatrigelTM或它们的任意组合。MatrigelTM可得自市售来源，例如BD Biosciences。层粘连蛋白（包括重组人类层粘连蛋白）可以用作MatrigelTM的备选物。
例如，多能干细胞可以在无饲养层的条件下在它们的未分化状态下维持在MatrigelTM或层粘连蛋白上。当汇集达到大约80-90%时，细胞通常被传代或冷冻。可以使用酶（例如分散酶）或非酶（例如基于PBS的解离缓冲剂，Invitrogen）手段进行传代。在一些实施方案中，可以在无异物的条件下培养多能干细胞，并且在一些情况下，可以在血清补充剂（例如但不限于N2血清补充剂）存在下培养。
用于多能干细胞的维持培养的培养基是本领域中已知的。例如，可以将多能干细胞维持在80％DMEM/F12（Gibco#11330032或#11320082）、20％KnockOut血清替代物、1％非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇和bFGF（4-100ng/mL，PCT申请WO99/20741）。或者，可将人多能干细胞维持在化学成分确定的无血清培养基如mTeSR1中。在某些实施方案中，可以在Essential 8TM培养基中对本发明的多能干细胞进行培养。在某些实施方案中，可以在选自下述的培养基中培养本发明的多能干细胞：StemFit、NutriStem®、mTeSR™l、mTeSR™2、TeSR™-E8™、mTeSR™PLUS、PluriSTEM™、ExCellerate™ iPSC扩展培养基、StemScale PSC悬浮培养基、StemFlex™培养基、mTeSR™3D培养基或StemMACS™PSC-Brew XF培养基。
在某些实施方案中，在培养基中添加合适的细胞因子以进行PSC细胞的培养，以维持其多能性。可以添加合适的细胞因子包括例如白细胞抑制因子。或者，可以在胚胎成纤维细胞饲养层上进行PSC细胞的维持培养。这样的胚胎成纤维细胞可以是来自小鼠的原代或穿戴成纤维细胞，或者是已建立的胚胎成纤维细胞系，它们已经被吹用于多能干细胞例如胚胎干细胞的培养中。
为了维持多能干细胞的培养，还可以在培养基中添加各种合适的辅助成分，例如血清白蛋白、谷氨酰胺、抗生素等，其范围和用量水平是本领域中公知的。在本发明中，除了作为单层培养物进行培养之外，多能干细胞还可以三维培养物的形式进行培养。用于三维培养的设备包括例如旋转瓶、摇动生物反应器或细胞培养袋。
如本文所用，术语“CHIR 99021” 是指一种有效且高度选择性的糖原合酶激酶3（GSK-3）抑制剂，可作为Wnt信号通路激活剂。
如本文所用，术语“胰岛素-转铁蛋白-硒G”或“ITS-G”是一种基础培养基补充剂，用以减少培养细胞所需的胎牛血清（FBS）的量。胰岛素能够促进葡萄糖和氨基酸摄取、脂肪生成、细胞内转运以及蛋白质和核酸合成。转铁蛋白是一种铁载体，也有助于降低氧自由基和过氧化物的毒性水平。硒（以亚硒酸钠的形式提供）是谷胱甘肽过氧化物酶和其他蛋白质的辅助因子，在培养基中用作抗氧化剂。
如本文所用，术语“SB431542”是一种有效的转化生长因子β（TGFβ）信号传导的小分子抑制剂。
如本文所用，术语“骨形态发生蛋白4”或“BMP4”是指骨形态发生蛋白家族的成员，该家族是转化生长因子β超家族的一部分。
如本文所用，术语“成纤维细胞生长因子2”或“FGF2”是指由FGF2基因编码的生长因子和信号蛋白，也称为碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和FGF-β，通过特定的成纤维细胞生长因子受体（FGFR）蛋白结合并发挥作用，FGFR蛋白本身是一个密切相关的分子家族。
如本文所用，术语“血管内皮生长因子”或“VEGF”是一种参与血管生成和血管生成的重要信号蛋白。
如本文所用，术语“干细胞因子”或“SCF”是一种与c-KIT受体（CD117）结合的细胞因子，在造血、精子发生和黑色素生成中起重要作用。
如本文所用，术语“FMS样酪氨酸激酶3配体”或“FLT3L”是一种内源性小分子，可作为细胞因子和生长因子通过激活造血祖细胞来增加免疫细胞的数量，结合并激活FLT3（CD135）发挥作用。
如本文所用，术语“血小板生成素”或“TPO”是一种巨核细胞生成和血小板生成的关键细胞因子，也是维持造血干细胞的关键。
如本文所用，术语“白细胞介素3”或“IL-3”是一种具有广泛生物活性的造血生长因子。这些包括刺激未成熟多能造血干细胞和各种谱系定向祖细胞的增殖和分化，导致大多数主要血细胞类型的产生。
如本文所用，术语“白细胞介素6”或“IL-6”是一种多功能细胞因子，可调节免疫反应、造血、急性期反应和炎症反应。
如本文所用，术语“白细胞介素11”或“IL-11”是一种对造血很重要的细胞因子，通过与其跨膜IL-11Rα受体结合。
如本文所用，术语“胰岛素样生长因子1”或“IGF-1”是一种分子结构与胰岛素相似的激素，也称为生长素C。IGF-1是一种蛋白质，可刺激包括肌肉、骨骼和软骨组织在内的各种细胞类型的增殖和存活体外。它在儿童成长中发挥重要作用，并继续对成人产生合成代谢作用。IGF-1属于胰岛素样生长因子家族，与IGF-1受体结合，激活PI3K/AKT通路以及ERK1/2通路。它主要在肝脏中产生，并与IL-3一起刺激骨髓细胞的分化和增殖。
本发明提供了一种制备B细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
a. 在补充了CHIR 99021的培养基中，诱导多能干细胞（iPSC）分化成胚状体（EB）；
b. 诱导步骤a中形成的EB分化成造血干细胞和祖细胞（HSPC）；
c. 诱导步骤b中形成的HSPC分化为B细胞；
其中，所述步骤a包括：
（a1）在CHIR 99021和Rki的存在下，在第0天进行诱导；
（a2）在CHIR 99021的存在下，在第1天再次进行诱导。
在某些实施方式中，所述步骤b包括：
（b1）在补充了BMP4、FGF2、VEGF的造血分化培养基中悬浮培养EB；
（b2）在补充了BMP4、SCF、FGF2、VEGF和SB431542的造血干细胞扩增培养基中继续悬浮培养；
（b3）在补充了SCF、FGF2和VEGF的造血干细胞扩增培养基中进一步悬浮培养，形成HSPC。
在某些实施方式中，所述BMP4的使用浓度可以是0.1-2000ng/ml、0.2-1000ng/ml、0.5-500ng/ml、1-200ng/ml、1-100ng/ml、2-50ng/ml或者5-20ng/ml。
在某些实施方式中，所述BMP4的使用浓度为50 ng/ml。
在某些实施方式中，所述FGF2的使用浓度可以是0.1-2000ng/ml、0.2-1000ng/ml、0.5-500ng/ml、1-200ng/ml、1-100ng/ml、2-50ng/ml或者5-20ng/ml。
在某些实施方式中，所述FGF2的使用浓度为50 ng/ml。
在某些实施方式中，所述VEGF的使用浓度可以是0.1-2000ng/ml、0.2-1000ng/ml、0.5-500ng/ml、1-200ng/ml、1-100ng/ml、2-50ng/ml或者5-20ng/ml。
在某些实施方式中，所述VEGF的使用浓度为50 ng/ml。
在某些实施方式中，所述SCF的使用浓度可以是0.1-500ng/ml、0.2-250ng/ml、0.5-200ng/ml、1-100ng/ml、2-50ng/ml、5-20ng/ml或者10ng/ml
在某些实施方式中，所述SCF的使用浓度为50 ng/ml。
在某些实施方式中，所述SB431542的使用浓度可以是0.1-200µM、0.2-100µM、0.5-50µM、1-20µM、2-10µM或5µM。
在某些实施方式中，所述SB431542的使用浓度为6µM。
在某些实施方案中，所述细胞因子可以直接外源性地添加到培养基中，以促进多能干细胞的定向分化。
在某些实施方案中，可以通过转基因的方式提高所述细胞因子在当细胞内的表达。
在某些实施方式中，所述步骤（a）是在第0-1天进行，所述步骤（b1）是在第2-3天进行，所述步骤（b2）是在第4-5天进行，所述步骤（b3）是在第6-7天进行。
在某些实施方式中，所述CHIR 99021的使用浓度为10 µM。
在某些实施方式中，所述Rki的使用浓度为10 µM。
在某些实施方式中，所述HSPC具有CD34+表型。
在某些实施方案中，所述HSPC具有CD34+CD43+表型。
在某些实施方案中，所述HSPC具有CD235a-CD14-CD43+CD34+表型。
在某些实施方式中，所述步骤a是在StemScale PSC悬浮完全培养基中培养iPSC，以形成EB。
在某些实施方式中，所述步骤c包括：
（c1）使用FcVCAM-1包被细胞培养板并孵育。
在某些实施方式中，所述FcVCAM-1的浓度为2.5 µg/mL。
在某些实施方式中，所述步骤（c1）是使用2.5µg/mL FcVCAM-1包被48孔板，并在4℃下孵育过夜。
在某些实施方式中，所述步骤c还包括：
（c2）分离纯化HSPC，并在含有MEMα的培养液中培养；
（c3）使用FcVCAM-1包被细胞培养板并孵育；
（c4）收获悬浮细胞，将其在含有MEMα的培养液中重新接种到包被有FcVCAM-1的板中，并在培养箱中再次培养；
（c5）将培养物重悬于含有MEMα的培养液中；
（c6）将培养物重悬于含有Iscove改良杜氏培养液的培养液中并活化3天；
（c7）将培养物重悬于含有Iscove改良杜氏培养液的培养液中。
在某些实施方式中，所述步骤（c1）是在步骤b所述HSPC形成前1天进行，所述步骤（c2）是在步骤b所述HSPC形成后第0天进行，所述步骤（c3）是在步骤b所述HSPC形成后第3天进行，所述步骤（c4）是在步骤b所述HSPC形成后第4天进行，所述步骤（c5）是在步骤b所述HSPC形成后第8天进行，所述步骤（c6）是在步骤b所述HSPC形成后第9天进行，所述步骤（c7）是在步骤b所述HSPC形成后第13天进行。
在某些实施方式中，所述培养液中补充有热灭活FBS、胰岛素转铁蛋白硒G、P/S、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、抗坏血酸、rhSCF、rhTPO、rhIL-4、rhIL-6、rhIL-7、rhIL-12、rhIL-15、rhIL-21、FLT3配体、rhSDF-1a、rhCD40L、rhIFNα和BAFF中的一种或多种。
在某些实施方式中，所述步骤（c2）的培养液为早期B细胞分化培养液，补充有15%热灭活FBS、1%胰岛素转铁蛋白硒G、1% P/S、2mM L-谷氨酰胺、55μM β-巯基乙醇、50µG/mL抗坏血酸、50 ng/mL rhSCF、100 ng/mL rhTPO、50 ng/mL rhIL-6、50 ng/ml FLT3配体（FLT3L）和30 nM rhSDF-1a。
在某些实施方式中，所述步骤（c3）是使用2.5µg/mL FcVCAM-1包被48孔板，并在4℃下孵育过夜。
在某些实施方式中，所述步骤（c4）的培养液为晚期B细胞分化培养液，补充有15%热灭活FBS、1%胰岛素转铁蛋白硒G、1% P/S、2mM L-谷氨酰胺、55μM β-巯基乙醇、50µG/mL抗坏血酸、50 ng/mL rhSCF、100 ng/mL rhTPO、50 ng/mL rhIL-7、50 ng/ml FLT3配体（FLT3L）和30 nM rhSDF-1a。
在某些实施方式中，所述步骤（c5）的培养液为B细胞成熟培养液，补充有15%热灭活FBS、1%胰岛素转铁蛋白硒G、1% P/S、2mM L-谷氨酰胺、55μM β-巯基乙醇、50µG/mL抗坏血酸、50 ng/mL rhSCF、50 ng/mL rhIL-6、50 ng/mL rhIL-7、50 ng/mL rhIL-4和100 ng/mLBAFF。
在某些实施方式中，所述步骤（c6）的培养液为B细胞成熟/扩增培养液，补充有10%热灭活FBS、1%胰岛素转铁蛋白硒G、1% P/S、55μM β-巯基乙醇、25ng/mL rhIL-4、5ng/mLrhIL-15、2ng/mL rhIL-12、50ng/mL rhIL-21和50ng/mL rhCD40L。
在某些实施方式中，所述步骤（c7）的培养液为B细胞成熟/扩增培养液，补充有10%热灭活FBS、1%胰岛素转铁蛋白硒G、1% P/S、55μM β-巯基乙醇、50 ng/mL rhIL-6、10 ng/mLrhIL-15、50 ng/mL rhIL-21和500 U/mL rhIFNα。
本发明还提供了一种药物制剂，所述药物制剂包含治疗或预防有效量的根据所述方法制备得到的B细胞、药学上可接受的载体或稀释剂，以及任选地一种或多种其他活性剂。
本发明还提供了一种根据所述方法制备得到的B细胞、或所述药物制剂在制备用于免疫治疗的制剂中的用途。
实施例1：使用iPSC制备HPC（条件#8）
将iPSC维持在含有补充剂的E8培养基中，在37℃下使用accuatse在70%融合度下收获5分钟，并通过400G离心3分钟沉淀。去除上清液，将细胞沉淀重悬于1mL中胚层诱导培养基（Stemscale培养基加补充剂（10X）、1%P/S和10µM Y27632）。对细胞进行计数，并将3 x106个细胞接种到20mL锥形烧瓶（125mL）中的20mL中胚层诱导培养基中。烧瓶在37℃、5%CO2常氧培养箱中，在连续旋转（70rpm）的摇壶上培养。
24小时后（D1），使用包含20µM CHIR99021、无Y27632的新鲜中胚层诱导培养基替换一半培养基。旋转时将烧瓶返回培养箱。
24小时后（D2），将EB收集到50mL falcon管中并静置沉淀，去除上清液并用20mL造血分化培养基1（Stempro培养基加补充剂（13X）、1%P/S、2mM GlutaMax、50µg/mL抗坏血酸、1%胰岛素转铁蛋白硒G、50ng/mL BMP4、50ng/mL FGF2和50ng/mL VEGF）代替。将EB重新分配回锥形烧瓶中，并在37℃、5%CO2的摇床上重新孵育。
24小时后（D3），将EB收集到50mL falcon管中并静置沉淀，去除上清液并用20mL造血分化培养基2（Stempro培养基加补充剂（13X）、1%P/S、2mM GlutaMax、50µg/mL抗坏血酸、1%胰岛素转铁蛋白硒G、50 ng/mL BMP4、50 ng/mL FGF2、50 ng/ml VEGF、50 ng/mL SCF和6µM SB431542）代替。将EB重新分配回锥形烧瓶中，并在37℃、5%CO2的摇床上重新孵育。
48小时后（D5），将EB收集到50mL falcon管中并静置沉淀，去除上清液并用20mL造血分化培养基3（Stempro培养基加补充剂（13X）、1%P/S、2mM GlutaMax、50µg/mL抗坏血酸、1%胰岛素转铁蛋白硒G、50ng/mL FGF2、50ng/mL VEGF和50ng/mL SCF）代替。将EB重新分配回锥形烧瓶中，并在37℃、5%CO2的摇床上重新孵育。
48小时后（D7）收获烧瓶进行纯化或重悬于膨胀培养基中。对于纯化烧瓶，收集烧瓶中的内容物，放入50mL falcon管中，并在400G下离心5分钟。去除上清液，将细胞沉淀重悬于1mL TryPLE Express中，并在37˚C水浴中孵育10分钟，使EB解离。用PBS洗涤细胞并计数。使用CD34+MAC磁性纯化系统纯化细胞。然后将纯化的CD34+细胞冷冻保存在CryoStorCST10中，浓度为0.5mL中的1 x 106个细胞。
小瓶在-80℃的温度下在超低温冰箱中冷冻至少24小时，然后转移到液氮储存中。对于膨胀烧瓶，将EB收集到50mL falcon管中并静置沉淀，取出上清液并放入单独的50mLFacon管中，在室温下以400g离心5min。在10mL扩增培养基（Stempro培养基加补充剂（13X）、1%P/S、2mM GlutaMax、50µg/mL抗坏血酸、1%胰岛素转铁蛋白硒G、50ng/mL FGF2、50ng/mLVEGF、50ng/ml SCF、IL-6、IL-11、TPO和IGF-1）中再悬浮EB。将细胞沉淀重新悬浮在10mL的扩增培养基中，将EB和悬浮细胞合并到锥形烧瓶中，并在37℃、5%CO2的摇床上重新孵育。
48小时后（D9）收获扩增瓶，并如上所述在D8纯化CD34+细胞。
实施例2：使用iPSC制备HPC（条件#6）
将iPSC维持在含有补充剂的E8培养基中，在37℃下使用accuatse在70%融合度下收获5分钟，并通过400G离心3分钟沉淀。去除上清液，将细胞沉淀重悬于1mL中胚层诱导培养基（Stemscale培养基加补充剂（10X）、1%P/S、10µM Y27632和10µM CHIR99021）。对细胞进行计数，并将3 x 106个细胞接种到20mL锥形烧瓶（125mL）中的20mL中胚层诱导培养基中。烧瓶在37℃、5%CO2常氧培养箱中，在连续旋转（70rpm）的摇壶上培养。
24小时后（D1），使用包含10µM CHIR99021\不含Y27632的新鲜中胚层诱导培养基替换一半培养基。旋转时将烧瓶返回培养箱。
24小时后（D2），将EB收集到50mL falcon管中并静置沉淀，去除上清液并用20mL造血分化培养基1（Stempro培养基加补充剂（13X）、1%P/S、2mM GlutaMax、50µg/mL抗坏血酸、1%胰岛素转铁蛋白硒G、50ng/mL BMP4、50ng/mL FGF2和50ng/mL VEGF）代替。将EB重新分配回锥形烧瓶中，并在37℃、5%CO2的摇床上重新孵育。
48小时后（D4），将EB收集到50mL falcon管中并静置沉淀，去除上清液并用20mL造血分化培养基2（Stempro培养基加补充剂（13X）、1%P/S、2mM GlutaMax、50µg/mL抗坏血酸、1%胰岛素转铁蛋白硒G、50 ng/mL BMP4、50 ng/mL FGF2、50 ng/ml VEGF、50 ng/mL SCF和6µM SB431542）代替。将EB重新分配回锥形烧瓶中，并在37℃、5%CO2的摇床上重新孵育。
48小时后（D6），将EB收集到50mL falcon管中并静置沉淀，去除上清液并用20mL造血分化培养基3（Stempro培养基加补充剂（13X）、1%P/S、2mM GlutaMax、50µg/mL抗坏血酸、1%胰岛素转铁蛋白硒G、50ng/mL FGF2、50ng/mL VEGF和50ng/mL SCF）代替。将EB重新分配回锥形烧瓶中，并在37℃、5%CO2的摇床上重新孵育。
48小时后（D8）收获烧瓶进行纯化或重悬于膨胀培养基中。对于纯化烧瓶，收集烧瓶中的内容物，放入50mL falcon管中，并在400G下离心5分钟。去除上清液，将细胞沉淀重悬于1mL TryPLE Express中，并在37˚C水浴中孵育10分钟，使EB解离。用PBS洗涤细胞并计数，使用CD34+MAC磁性纯化系统纯化细胞。然后将纯化的CD34+细胞冷冻保存在CryoStorCST10中，浓度为1 x 106个细胞（0.5mL）。
小瓶在-80℃的温度下在超低温冰箱中冷冻至少24小时，然后转移到液氮储存中。对于膨胀烧瓶，将EB收集到50mL falcon管中并静置沉淀，取出上清液并放入单独的50mLFacon管中，在室温下以400g离心5min。在10mL扩增培养基（Stempro培养基加补充剂（13X）、1%P/S、2mM GlutaMax、50µg/mL抗坏血酸、1%胰岛素转铁蛋白硒G、50ng/mL FGF2、50ng/mLVEGF、50ng/ml SCF、IL-6、IL-11、TPO和IGF-1）中再悬浮EB。将细胞沉淀重新悬浮在10mL的扩增培养基中，将EB和悬浮细胞合并到锥形烧瓶中，并在37℃、5%CO2的摇床上重新孵育。
48小时后（D10），收获扩增瓶，并如上所述在D8纯化CD34+细胞。
实施例3-8：使用iPSC制备HPC（条件#1-5、7）
实施例3-8（条件#1-5、7）的培养方式与实施例1基本相同，具体条件参见图2。
实施例9：使用iPSC来源的HPC制备B细胞
在第-1天用2.5µg/mL FcVCAM-1包被96孔板，并在4℃下孵育过夜。在使用之前，用DPBS将板洗涤3次。
在第0天（D0），从EB培养物中纯化CD34+造血干细胞，并将10000个细胞每孔接种在含有MEMα的早期B细胞分化培养液中，所述培养液补充有15%热灭活FBS、1%P/S、2mM L-谷氨酰胺、55μMβ-巯基乙醇、50µg/mL抗坏血酸、1%胰岛素转铁蛋白硒G、50ng/mL rhSCF、100ng/mL rhTPO、50ng/mL rhIL-6，50ng/mL FLT3配体（FLT3L）和30nM rhSDF-1a。使用新的早期B细胞分化培养液，在D1、3和5每两天更换一次培养液。
在第6天（D6），用2.5µg/mL FcVCAM-1包被新的96孔板，并在4℃下孵育过夜。在使用之前，用DPBS将板洗涤3次。
在第7天（D7），收获悬浮细胞，并在新的早期B细胞分化培养液中将其重新接种到新的包被有FcVCAM-1的板中，并将该板在37℃、5%CO2、5%O2的缺氧培养箱中再次孵育。使用新的早期B细胞分化培养液，在D8、10和12每两天更换一次培养基。
在第13天（D13），用2.5µg/mL FcVCAM-1包被新的96孔板，并在4℃下孵育过夜。在使用之前，用DPBS将板洗涤3次。
在第14天（D14），收获悬浮细胞，并在含有MEMα的新的晚期B细胞分化培养液中将其重新接种到新的包被有FcVCAM-1的板中，所述培养液补充有15%热灭活FBS、1%P/S、2mML-谷氨酰胺、55μM β-巯基乙醇、50µg/mL抗坏血酸、1%胰岛素转铁蛋白硒G、50ng/mL rhSCF、100ng/mL rhTPO、50ng/mL rhIL-7，50 ng/mL FLT3配体（FLT3L）和30 nM rhSDF-1a。将板在37℃、5%CO2、5%O2的缺氧培养箱中重新培养。
3天后，在第17天（D17）更换培养液，使用新的晚期B细胞分化培养液。
在第20天（D20），用2.5µg/mL FcVCAM-1包被新的96孔板，并在4℃下孵育过夜。在使用之前，用DPBS将板洗涤3次。
在第21天（D21），收获悬浮细胞，并在含有MEMα的新的晚期B细胞分化培养液中将其重新接种到新的包被有FcVCAM-1板中，所述培养液补充有15%热灭活FBS、1%P/S、2mM L-谷氨酰胺、55μMβ-巯基乙醇、50µg/mL抗坏血酸、1%胰岛素转铁蛋白硒G、50 ng/mL rhIL-6、50 ng/mL rhIL-7、25 ng/mL rhIL-4、10 nM地塞米松和100 ng/mL BAFF。将板在37℃、5%CO2的常氧培养箱中再次培养。使用新的晚期B细胞成熟培养液BD24培养3天后，更换培养液。
实施例10：使用iPSC来源的HPC制备B细胞
在第-1天用2.5µg/mL FcVCAM-1包被48孔板，并在4℃下孵育过夜。在使用之前，用DPBS将板洗涤3次。
在第0天（D0），从EB培养物中纯化CD34+造血干细胞，每个孔接种20000个细胞，并在含有MEMα的早期B细胞分化培养液中包被有FcVCAM-1的板中维持3.5天。培养液补充有15%热灭活FBS、1%胰岛素转铁蛋白硒G、1% P/S、2mM L-谷氨酰胺、55μM β-巯基乙醇、50µG/mL抗坏血酸、50 ng/mL rhSCF、100 ng/mL rhTPO、50 ng/mL rhIL-6、50 ng/ml FLT3配体（FLT3L）和30 nM rhSDF-1a。
在第3天（D3），使用2.5µg/mL FcVCAM-1包被新的48孔板，并在4℃下孵育过夜。在使用之前，用DPBS将板洗涤3次。
在第4天（D4），收获悬浮细胞，并在含有MEMα的新的晚期B细胞分化培养液中将其重新接种到新的包被有FcVCAM-1的板中。培养液补充有15%热灭活FBS、1%胰岛素转铁蛋白硒G、1% P/S、2mM L-谷氨酰胺、55μM β-巯基乙醇、50µG/mL抗坏血酸、50 ng/mL rhSCF、100ng/mL rhTPO、50 ng/mL rhIL-7、50 ng/ml FLT3配体（FLT3L）和30 nM rhSDF-1a。将板在37℃、5%CO2、5%O2的缺氧培养箱中再次培养。分化后4天后，预计Pro-B细胞的出现频率为总培养物的20-40%。Pro-B细胞随后将分化为Pre-B和未成熟B细胞，在分化后第8天达到高频率。
在B细胞分化第8天（D8），将培养物重悬于含有MEMα的B细胞成熟培养液中，所述培养液补充有15%热灭活FBS、1%胰岛素转铁蛋白硒G、1% P/S、2mM L-谷氨酰胺、55μM β-巯基乙醇、50µG/mL抗坏血酸、50 ng/mL rhSCF、50 ng/mL rhIL-6、50 ng/mL rhIL-7、50 ng/mLrhIL-4和100 ng/mL BAFF。
在B细胞分化第9天（D9），将培养物重悬于含有Iscove改良杜氏培养液的B细胞成熟/扩增培养液中。所述B细胞成熟/扩增培养液补充有10%热灭活FBS、1%胰岛素转铁蛋白硒G、1% P/S、55μM β-巯基乙醇、25ng/mL rhIL-4、5ng/mL rhIL-15、2ng/mL rhIL-12、50ng/mLrhIL-21和50ng/mL rhCD40L。活化3天后，预计质粒和浆细胞的出现频率为总培养物的10%。
在B细胞分化第13天（D13），将培养物重悬于含有Iscove改良杜氏培养液的B细胞成熟/扩增培养液中。所述B细胞成熟/扩增培养液补充有10%热灭活FBS、1%胰岛素转铁蛋白硒G、1% P/S、55μM β-巯基乙醇、50 ng/mL rhIL-6、10 ng/mL rhIL-15、50 ng/mL rhIL-21和500 U/mL rhIFNα。
实施例11：使用iPSC来源的HPC制备B细胞
培养方式与实施例10基本相同，但不使用FcVCAM-1包被细胞培养板，细胞全部死亡。
实施例12：iB细胞属性
测试了从iPSC诱导CD34+HSPC的不同8种方法（如图1-5所示），并使用方法4和6测试了B细胞分化，确定使用方法6产生的CD34+细胞在B细胞分化方面优于使用方法4产生的CD34+HSP细胞，图6展示了通过明场图像鉴定的细胞形态结果，图7-8通过流式细胞术检测B细胞标志物，从而准确定义了发明所产生的iB细胞属性。
实施例13：21天方案的iB细胞检测
测试了实施例9的21天B细胞分化方案，使用条件6生产的CD34+细胞分化得到的B细胞（如图9-14所示），其中，图9为分化流程图，图10为通过形态学显微观察获得的B细胞形态图，图11-12为通过流式细胞术界定的细胞标志物及活细胞状态图，图13-14展示了受体及转录因子特征。该方案结合了带有基质配体FcVCAM-1的板涂层。该方案是一个为期3周的方案，基于使用基质饲养物的类似方案（如图9所示）。在该实验过程中，注意到iPSC衍生的B原细胞的发育速度快于预期，其数量在诱导后7天达到峰值（如图12所示）。因此，在实现B细胞的完全分化前提下，通过缩短实际诱导时间从而更快速获得满足质量需求的iB细胞分化方法成为可能，在此基础上设计以下一种分化方案。
实施例13：13天方案的iB细胞检测
使用加速方案（实施例10，即13天方案）测试CD34+细胞向浆细胞的完全分化（如图15-21所示）。其中，图15为分化流程图，图16为通过形态学显微观察获得的B细胞形态图，图18-20为通过流式细胞术界定的B细胞、pro-B细胞、pre-B细胞等标志物及活细胞状态图，图21展示了受体特征。可以发现，在采用特定iPSC-HPC诱导分化工艺，并结合FcVCAM-1的使用实际上能够大幅缩短iB细胞的获取，且获得与人源B细胞的属性及功能性相近的iB细胞。
应当理解，以上实施例均为示例性的，不用于包含权利要求所包含的所有可能的实施方式。在不脱离本公开的范围的情况下，还可以在以上实施例的基础上做出各种变形和改变。同样的，也可以对以上实施例的各个技术特征进行任意组合，以形成可能没有被明确描述的本发明的另外的实施例。因此，上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，不对本发明专利的保护范围进行限制。

Claims (10)

1.一种制备B细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a. 在补充了CHIR 99021的培养基中，诱导多能干细胞（iPSC）分化成胚状体（EB）；
b. 诱导步骤a中形成的EB分化成造血干细胞和祖细胞（HSPC）；
c. 诱导步骤b中形成的HSPC分化为B细胞；
其中，所述步骤a包括：
（a1）在CHIR 99021和Rki的存在下，在第0天进行诱导；
（a2）在CHIR 99021的存在下，在第1天再次进行诱导。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b包括：
（b1）在补充了BMP4、FGF2、VEGF的造血分化培养基中悬浮培养EB；
（b2）在补充了BMP4、SCF、FGF2、VEGF和SB431542的造血干细胞扩增培养基中继续悬浮培养；
（b3）在补充了SCF、FGF2和VEGF的造血干细胞扩增培养基中进一步悬浮培养，形成HSPC。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（a）是在第0-1天进行，所述步骤（b1）是在第2-3天进行，所述步骤（b2）是在第4-5天进行，所述步骤（b3）是在第6-7天进行。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HSPC具有CD34+表型。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c包括：
（c1）使用FcVCAM-1包被细胞培养板并孵育。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述FcVCAM-1的浓度为2.5 µg/mL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤c还包括：
（c2）分离纯化HSPC，并在含有MEMα的培养液中培养；
（c3）使用FcVCAM-1包被细胞培养板并孵育；
（c4）收获悬浮细胞，将其在含有MEMα的培养液中重新接种到包被有FcVCAM-1的板中，并在培养箱中再次培养；
（c5）将培养物重悬于含有MEMα的培养液中；
（c6）将培养物重悬于含有Iscove改良杜氏培养液的培养液中并活化3天；
（c7）将培养物重悬于含有Iscove改良杜氏培养液的培养液中。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
所述步骤（c1）是在步骤b所述HSPC形成前1天进行，所述步骤（c2）是在步骤b所述HSPC形成后第0天进行，所述步骤（c3）是在步骤b所述HSPC形成后第3天进行，所述步骤（c4）是在步骤b所述HSPC形成后第4天进行，所述步骤（c5）是在步骤b所述HSPC形成后第8天进行，所述步骤（c6）是在步骤b所述HSPC形成后第9天进行，所述步骤（c7）是在步骤b所述HSPC形成后第13天进行。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述培养液中补充有热灭活FBS、胰岛素转铁蛋白硒G、P/S、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、抗坏血酸、rhSCF、rhTPO、rhIL-4、rhIL-6、rhIL-7、rhIL-12、rhIL-15、rhIL-21、FLT3配体、rhSDF-1a、rhCD40L、rhIFNα和BAFF中的一种或多种。
10.一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包含治疗或预防有效量的根据权利要求1-9所述方法制备得到的B细胞、药学上可接受的载体或稀释剂，以及任选地一种或多种其他活性剂。
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