WO2012141181A1 - 核初期化物質 - Google Patents

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WO2012141181A1
WO2012141181A1 PCT/JP2012/059817 JP2012059817W WO2012141181A1 WO 2012141181 A1 WO2012141181 A1 WO 2012141181A1 JP 2012059817 W JP2012059817 W JP 2012059817W WO 2012141181 A1 WO2012141181 A1 WO 2012141181A1
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伸弥 山中
直樹 五島
桃子 前川
義史 河村
望月　宏美
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国立大学法人京都大学
独立行政法人産業技術総合研究所
一般社団法人バイオ産業情報化コンソーシアム
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/604—Klf-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a novel nuclear reprogramming substance and its use. More specifically, the present invention relates to a novel nuclear reprogramming substance that can be substituted for Klf4, and a method for establishing an induced pluripotent stem (hereinafter referred to as iPS) cell using the same.
  • iPS induced pluripotent stem
  • iPS cells have been established one after another. Yamanaka et al. Identified genes that are specifically expressed in pluripotent cells such as ES cells and germ cells by analyzing the EST database, analyzed their functions using knockout mouse technology, and other studies. Together with group reports, 24 genes were selected as candidates for substances that induce pluripotency (reprogramming nuclei) in somatic cells (1, 2). These 24 genes were introduced into a fibroblast (MEF) derived from a reporter mouse in which a neomycin resistance gene was knocked in at the Fbx15 locus by using a retrovirus to induce iPS cells.
  • MEF fibroblast
  • Yamanaka et al. Produced a transgenic mouse in which a green fluorescent protein (GFP) and a puromycin resistance gene were incorporated into the locus of Nanog whose expression was more restricted to pluripotent cells than Fbx15.
  • GFP green fluorescent protein
  • iPS cells whose gene expression and epigenetic modification are almost the same as embryonic stem (ES) cells can be obtained.
  • ES embryonic stem
  • Oct3 / 4 and Sox2 are said to be essential for maintaining the self-renewal ability and pluripotency of ES cells. It has been reported that cells are involved in self-renewal and pluripotency maintenance.
  • Klf4 belongs to the Kruppel-like factor (Klf) family, which is a transcription factor that controls various biological processes such as proliferation, differentiation, development, and apoptosis (6), but its detailed function is not well understood.
  • Epiblast stem cell established from epiblasts of post-implantation embryos, unlike ES cells, cannot form chimeric embryos when injected into host blastocysts, but with EpiSCs Oct3 / 4 and Sox2 Is expressed in the same manner as ES cells, whereas the expression of the Klf4 gene is significantly reduced. Recently, it has been reported that by introducing only Klf4 gene into EpiSC, properties similar to those of ES cells can be obtained (7).
  • an object of the present invention is to identify a novel nuclear reprogramming substance, particularly a novel nuclear reprogramming substance that can be substituted for Klf4, and to provide a novel method for establishing iPS cells using the same.
  • the present inventors have widely used Klf4 from gene libraries such as transcription factors or receptors or enzymes, regardless of genes specifically expressed in pluripotent cells such as ES cells. We searched exhaustively for genes that can establish iPS cells as alternative factors.
  • the present invention is as follows.
  • (1) and (2) (1) OVOL family members, ZBTB8 family members, ZBTB43 family members, ZNF202 family members, ZNF383 family members, NR5A family members, ZSCAN4 family members, ZNF768 family members, PRPF4B family members, NHLH family Members, GRHL family members, OTX family members, PRRX family members, OTP family members, DACH family members, C2orf50 family members, PIH1D family members, KLF family members (Klf1, Klf2, Klf4 And one or more substances selected from the group consisting of HOX family members, BTG family members and HLF family members, and nucleic acids encoding them, (2) A method for producing iPS cells, comprising a step of introducing a substance capable of inducing iPS cells from somatic cells in combination with Klf4 into somatic cells.
  • the substance of (1) is ovo-like 2 (OVOL2), zinc finger and BTB domain containing 8A (ZBTB8A), zinc finger and BTB domain containing 43 (ZBTB43), zinc finger protein 202 (ZNF202), zinc finger protein 383 (ZNF383), nuclear receptor subfamily 5, group A, member 1 (NR5A1), zinc finger and SCAN domain containing 4 (ZSCAN4), zinc finger protein 768 (ZNF768), PRP4 pre-mRNA processing factor 4 homolog B ( PRPF4B), nescient helix loop helix 1 (NHLH1), grainyhead-like 1 (GRHL1), orthodenticle homeobox 2 (OTX2), paired related homeobox 2 (PRRX2), orthopedia homeobox (OTP), dachshund homolog 2 (DACH2), chromosome 2 open reading frame 50 (C2orf50), PIH1 domain containing 1 (PIH1D1), Kruppel-like factor 15 (KLF15), homeo
  • the substance of (2) is selected from the group consisting of Oct family members, Sox family members, Myc family members, Nanog and Lin family members, and nucleic acids encoding them [1] The method described. [4] The method according to [1] above, wherein the substance of (2) is Oct3 / 4. [5] The method described in [1] above, wherein the substance (2) is Oct3 / 4 and Sox2. [6] The method according to [1] above, wherein the substance (2) is Oct3 / 4 and c-Myc or L-Myc. [7] The method according to [1] above, wherein the substance (2) is Oct3 / 4, Sox2 and c-Myc or L-Myc.
  • the substance (1) is OVOL2, ZBTB8A, ZBTB43, ZNF202, ZNF383, NR5A1, ZSCAN4, ZNF768, PRPF4B, NHLH1, GRHL1, OTX2, PRRX2, OTP, DACH2, C2orf50, PIH1D1, KLF15, HOXB5
  • the agent according to [9] above comprising at least one substance selected from the group consisting of HLF and nucleic acids encoding them.
  • OVOL family members [11] OVOL family members, ZBTB8 family members, ZBTB43 family members, ZNF202 family members, ZNF383 family members, NR5A family members, ZSCAN4 family members, ZNF768 family members, PRPF4B family members, NHLH family Members, GRHL family members, OTX family members, PRRX family members, OTP family members, DACH family members, C2orf50 family members, PIH1D family members, KLF family members (Klf1, Klf2, Klf4 And excluding Klf5), an iPS cell comprising an exogenous nucleic acid encoding one or more factors selected from the group consisting of members of the HOX family, members of the BTG family, and members of the HLF family.
  • OVOL2, ZBTB8A, ZBTB43, ZNF202, ZNF383, NR5A1, ZSCAN4, ZNF768, PRPF4B, NHLH1, GRHL1, OTX2, PRRX2, OTP, DACH2, C2orf50, PIH1D1, KLF15, HOXB5, BTG1 and HLF The iPS cell according to [11] above, which comprises an exogenous nucleic acid encoding one or more factors.
  • a method for producing a somatic cell comprising subjecting the iPS cell according to [11] above to differentiation induction treatment to differentiate it into a somatic cell.
  • OVOL family members [16] OVOL family members, ZBTB8 family members, ZBTB43 family members, ZNF202 family members, ZNF383 family members, NR5A family members, ZSCAN4 family members, ZNF768 family members for the production of iPS cells , PRPF4B family member, NHLH family member, GRHL family member, OTX family member, PRRX family member, OTP family member, DACH family member, C2orf50 family member, PIH1D family member, KLF family member (Excluding Klf1, Klf2, Klf4 and Klf5), the use of one or more substances selected from the group consisting of HOX family members, BTG family members and HLF family members, and nucleic acids encoding them.
  • OVOL family members, ZBTB8 family members, ZBTB43 family members, ZNF202 family members, ZNF383 family members, NR5A family members, ZSCAN4 family members as inducers of iPS cells from somatic cells, ZNF768 family member, PRPF4B family member, NHLH family member, GRHL family member, OTX family member, PRRX family member, OTP family member, DACH family member, C2orf50 family member, PIH1D family member, A substance selected from the group consisting of KLF family members (excluding Klf1, Klf2, Klf4 and Klf5), HOX family members, BTG family members and HLF family members, and nucleic acids encoding them.
  • KLF family members excluding Klf1, Klf2, Klf4 and Klf5
  • OVOL family members OVOL family members, ZBTB8 family members, ZBTB43 family members, ZNF202 family members, ZNF383 family members, NR5A family members, ZSCAN4 family members, ZNF768 family members, PRPF4B family members, NHLH Family members, GRHL family members, OTX family members, PRRX family members, OTP family members, DACH family members, C2orf50 family members, PIH1D family members, KLF family members, HOX family members, BTG It became clear that members of the family and members of the HLF family could replace the function of Klf4 in nuclear reprogramming.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram showing steps from a human Gateway (registered trademark) entry clone (N. Goshima et al., Nature methods, 2008) to narrowing down entry clones by function.
  • FIG. 2 is a diagram showing a procedure for preparing a transcription factor library for screening somatic cell reprogramming factors from entry clones of transcription factors.
  • FIG. 3 is obtained by introducing a total of 4 genes, 3 genes (Oct3 / 4, Sox2, c-Myc) and each gene shown in Table 2, into skin-derived fibroblasts of Nanog-GFP mice. It is the photograph which shows the form of the obtained GFP positive colony (1st screening).
  • the left is a GFP positive colony image
  • the center is a phase contrast image
  • the right is a photograph in which a GFP positive colony image and a phase contrast image are superimposed.
  • 4 and 5 are photographs showing the morphology of GFP-positive colonies obtained by performing the same experiment as FIG. 3 again (2nd screening).
  • the left is a GFP positive colony image
  • the center is a phase contrast image
  • the right is a photograph in which a GFP positive colony image and a phase contrast image are superimposed.
  • P0 represents the colony established
  • P1 represents the first passage (24 wells)
  • P2 represents the second passage (6 wells).
  • Y007-F4, Y010-A1, Y010-C3, Y010-D4 and Y010-G3 were not passaged.
  • 4 and 5 are photographs showing the morphology of GFP-positive colonies obtained by performing the same experiment as FIG. 3 again (2nd screening). Of the three photographs for each colony, the left is a GFP positive colony image, the center is a phase contrast image, and the right is a photograph in which a GFP positive colony image and a phase contrast image are superimposed.
  • P0 represents the colony established
  • P1 represents the first passage (24 wells)
  • P2 represents the second passage (6 wells).
  • Y007-F4, Y010-A1, Y010-C3, Y010-D4 and Y010-G3 were not passaged.
  • Fig. 6 shows the retroviral introduction of 3 genes (Oct3 / 4, Sox2, c-Myc) and each gene shown in Table 3 and Table 4 into the skin-derived fibroblasts of Nanog-GFP mice. It is the photograph which shows the form of the GFP positive colony obtained by doing. Of the three photographs for each colony, the left is a GFP positive colony image, the center is a phase contrast image, and the right is a photograph in which a GFP positive colony image and a phase contrast image are superimposed. P0 represents the colony established, P1 represents the first passage (24 wells), and P2 represents the second passage (6 wells). C2orf50, PIH1D1, KLF15 and HLF were not passaged.
  • the present invention introduces into a somatic cell a novel nuclear reprogramming substance that can replace Klf4, and a nuclear reprogramming substance that can induce iPS cells from somatic cells in combination with this substance.
  • a method for producing iPS cells is provided.
  • the “nuclear reprogramming substance” is a substance (group) capable of inducing iPS cells from somatic cells, and is a proteinous factor or a nucleic acid encoding the same (including forms incorporated in a vector) Alternatively, it may be composed of any substance such as a low molecular compound.
  • Nuclear reprogramming substances that can replace Klf4 identified by the present invention are members of the OVOL family, members of the ZBTB8 family, members of the ZBTB43 family, members of the ZNF202 family, members of the ZNF383 family, members of the NR5A family, members of the ZSCAN4 family Member, ZNF768 family member, PRPF4B family member, NHLH family member, GRHL family member, OTX family member, PRRX family member, OTP family member, DACH family member, C2orf50 family member, PIH1D family member A member, a KLF family member (except Klf1, Klf2, Klf4 and Klf5), a HOX family member, a BTG family member or a HLF family member protein or nucleic acid encoding it is there.
  • the OVOL (ovo-like) family is a gene family that encodes proteins that are very similar to Drosophila and mouse-derived proteins.
  • the Drosophila ovo protein has a crucial role in Drosophila oogenesis and cuticle formation.
  • mice ovo protein is involved in hair formation and spermatogenesis, but its role in humans is not clear.
  • Members of this gene family include OVOL1, OVOL2, and OVOL3.
  • OVOL2 is exemplified, but not limited thereto.
  • the ZBTB8 (zinc finger and BTB domain containing protein 8) family consists of a 441-amino acid nuclear protein with one broad-complex, tramtrack and bric a brac region, and two C2H2-type incZinc finger regions. It is a gene family that encodes. BTB is sometimes called POZ (poxvirus and zinc finger), but proteins containing these regions are thought to be involved in transcriptional regulation by controlling the structure and function of chromatin. Examples of members of this gene family include ZBTB8A and ZBTB8B. Preferably, ZBTB8A is exemplified, but not limited thereto.
  • ZBTB43 (zinc finger and BTB domain containing protein 43) belongs to a protein family having a Kruppel C2H2-type Zinc finger region. It contains one BTB (POZ) region and three C2H2-type Zinc finger regions and is thought to be involved in transcriptional regulation in the same way as the ZBTB8 family.
  • ZBTB43 Other members of the ZBTB43 family include, for example, ZBTB9 based on sequence similarity, but contain one BTB (POZ) region and about 3 C2H2-type Zinc finger regions and interact with ZBTB43 or ZBTB43
  • POZ BTB
  • the present invention is not limited to this as long as it is a gene encoding a protein that recognizes a cis-factor recognized by the transcriptional regulatory factor and exhibits the same transcriptional control activity as ZBTB43.
  • homogeneous transcription control activity means that the direction of transcription control (upward control or downward control) is the same, and the degree is preferably the same, but may be different (for example, , About 0.5-about 2 times).
  • ZNF202 (zinc protein 202) is a transcriptional repressor that binds to cis factors found in many genes involved in lipid metabolism.
  • Other members of the ZNF202 family include, for example, ZNF496, ZNF446, etc., based on sequence similarity, but include a SCAN box and 3-8 C2H2-type Zinc finger regions, and transcription that interacts with ZNF202 or ZNF202 Any gene may be used as long as it recognizes a cis-factor recognized by the regulator and encodes a protein exhibiting the same transcriptional control activity as ZNF202.
  • “same quality transcription control activity” has the same meaning as described above.
  • ZNF383 (zinc finger protein 383) is a protein with a C2H2-type Zinc finger region, and overexpression of ZNF383 in cells suppresses transcriptional activation by AP-1 (activator protein 1) and SRE (serum response element) Thus, ZNF383 is considered to be a repressor factor in the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway.
  • Other members of the ZNF383 family include, for example, ZNF582, ZNF613, ZNF345, ZNF135, ZNF30, ZFP14, etc., based on sequence similarity, including 10-18 C2H2-type Zinc finger regions and the above transcription The gene is not limited to these as long as it encodes a protein exhibiting inhibitory activity.
  • the NR5A (nuclear receptor subfamily 5) family is a gene family that encodes a protein that acts as a transcription activator that controls gender. Specifically, it is involved in the production of a transcription factor called Steroidogenic factor-1 (SF-1) that regulates the activity of genes involved in the growth of the adrenal glands surrounding the gonads (ovary and testis) and kidneys. Examples of members of this gene family include NR5A1 and NR5A2. Preferably, NR5A1 is exemplified, but not limited thereto.
  • ZSCAN4 Zinc finger and SCAN domain containing 4
  • ES cells are known to have stable genomes and remain immortal without losing their normal karyotype, but the ZSCAN4 protein is involved in maintaining telomere and genome stability in these cells (Nature, 7290, 858-863 (2010)).
  • Other members of the ZSCAN4 family include any gene that contains a SCAN box and about 4 C2H2-type Zinc finger regions and encodes a protein involved in maintaining telomere and genomic stability.
  • ZNF768 (zinc protein 768) is a member of a protein family having a Kruppel C2H2 type Zinc finger region and is thought to be involved in transcriptional control.
  • Other members of the ZNF768 family include, for example, ZNF648 based on sequence similarity, but it contains about 10 C2H2-type Zinc finger regions and recognizes the cis-factor recognized by ZNF768 and is homogeneous to ZNF768. It is not limited to this as long as it is a gene encoding a protein exhibiting transcriptional control activity.
  • “same quality transcription control activity” has the same meaning as described above.
  • PRPF4B PRP4 pre-mRNA processing factor 4 homolog B
  • PRPF4B is a protein belonging to the kinase family including serine / arginine rich protein kinase and cyclin dependent kinase (CDK).
  • PRPF4B is thought to be a CDK-like kinase (Clk) with homology to MAPK and is involved in pre-mRNA splicing.
  • Other members of the PRPF4B family include any gene that includes a kinase domain and an ATP binding region and that encodes a protein that recognizes and phosphorylates a protein that PRPF4B phosphorylates.
  • the NHLH (nescient helix loop helix) family is a gene family that encodes proteins belonging to the transcription factor family that play an important role in the generation and growth of numerous tissues and species. Of these families, MYC (MIM 0080 190080), LYL1 (MIM 151440), E2A (MIM 147141), and SCL (MIM 187040) are clearly involved in tumor formation through chromosome translocation. ing. Members of this gene family include NHLH1 and NHLH2. NHLH1 is preferably exemplified, but is not limited thereto.
  • the GRHL (grainyhead-like) family is a gene family that encodes proteins that constitute grainyhead, which is a homodimer or heterodimer transcription factor.
  • Members of this gene family include GRHL1, GRHL2, and GRHL3.
  • GRHL1 is exemplified, but not limited thereto.
  • the OTX (orthodenticle homeobox) family is a gene family that encodes proteins of the bicoid subfamily of transcription factors that have homeodomains and are involved in brain and sensory organ growth. Examples of members of this gene family include OTX1 and OTX2. Preferably, OTX2 is exemplified, but not limited thereto.
  • the PRRX (paired related homeobox) family is a gene family that encodes a DNA binding protein that is part of a homeobox. Expression is observed in rapidly proliferating fetal fibroblasts, growing in the dermis layer and decreasing in adult skin cells. From these change patterns of expression level, it is considered that PRRX may be deeply involved in repair processes such as dermal cell regeneration at the time of skin damage and cell proliferation. Examples of members of this gene family include PPRX1 and PPRX2. Preferably, PPRX2 is exemplified, but not limited thereto.
  • OTP (orthopedia homeobox) is a gene encoding a homeodomain family protein that is a transcription factor having a helix-turn-helix structure that plays an important role in determining cell fate. The protein is thought to be involved in brain growth.
  • Other members of the OTP family include any gene that encodes a protein that contains a homeobox domain and an OAR motif and that recognizes a cis-factor recognized by OTP and exhibits a transcriptional control activity equivalent to OTP.
  • “same quality transcription control activity” has the same meaning as described above.
  • the DACH (dachshund homolog) family is a gene family that encodes a protein similar to the dachshund protein, which is a transcription factor involved in cell fate determination to the eye, limb, and genital tract in Drosophila. These proteins have an N-terminal region necessary for binding to DNA and a C-terminal region necessary for protein-protein interaction, which are characteristic of the dachshund protein.
  • the protein is contained in the X chromosome and loses its activity with DNA methylation.
  • the protein is also involved in the control of organogenesis and myogenesis, and is thought to be related to premature ovarian failure. Examples of members of this gene family include DACH1 and DACH2.
  • DACH2 is exemplified, but not limited thereto.
  • C2orf50 chromosome 2 open reading frame 50
  • Other members of the C2orf50 family have 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more similarity to the C2orf50 amino acid sequence shown in Table 1, and have the same physiological activity as C2orf50.
  • the “same physiological activity” means the same activity qualitatively or physiologically and preferably has the same degree of activity, but may be different (for example, about 0.5 -About twice).
  • the “similarity” of amino acid sequences means an optimal alignment when two amino acid sequences are aligned using a mathematical algorithm known in the art (preferably, the algorithm is an optimal alignment). % Of the same and similar amino acid residues relative to all overlapping amino acid residues, in which one may consider the introduction of gaps into one or both of the sequences.
  • Similar amino acids means amino acids that are similar in physicochemical properties, such as aromatic amino acids (Phe, Trp, Tyr), aliphatic amino acids (Ala, Leu, Ile, Val), polar amino acids (Gln, Asn) ), Basic amino acids (Lys, Arg, His), acidic amino acids (Glu, Asp), amino acids with hydroxyl groups (Ser, Thr), amino acids with small side chains (Gly, Ala, Ser, Thr, Met), etc. Examples include amino acids classified into groups. It is expected that substitution with such similar amino acids will not change the phenotype of the protein (ie, is a conservative amino acid substitution).
  • the PIH1D (PIH1 domain-containing) family is a gene family that is thought to be involved in regulatory mechanisms in the apoptotic pathway. Members of this gene family include PIH1D1 and PIH1D2. Preferably, PIH1D1 is exemplified, but not limited thereto.
  • the KLF (Kruppel-like factor) family is a transcription factor that controls various biological processes such as proliferation, differentiation, development, and apoptosis (McConnell, BB et al., Bioassays, 29: 549-557 (2007) ), I don't know the details.
  • the KLF family has three C2H2-type Zinc finger regions.
  • Members of this gene family include KLF6, KLF7, KLF8, KLF9, KLF10, KLF11, KLF12, KLF13, KLF14, KLF15, KLF16, KLF17, SP1, SP2, SP3, SP4, SP5, SP6, SP7, SP8 and SP 9, etc. Is mentioned.
  • KLF15 is exemplified, but not limited thereto.
  • the HOX (homeobox) family is a part of a homeobox containing the Antennapedia homeotic gene, and is a gene family that encodes a nuclear protein having a DNA binding region. It is contained in a cluster within the homeobox B gene located on chromosome 17, and the proteins encoded by them function as sequence-specific transcription factors involved in lung and intestinal development. Increased expression of the gene is thought to be involved in acute myeloid leukemia (AML), bronchopulmonary sequestration (BPS), and congenital cystoid adenomatous dysplasia (CCAM).
  • AML acute myeloid leukemia
  • BPS bronchopulmonary sequestration
  • CCAM congenital cystoid adenomatous dysplasia
  • Members of this gene family include HOXA5, HOXB5 and HOXC5.
  • HOXB5 is exemplified, but not limited thereto.
  • the BTG (B-cell translocation gene, anti-proliferative) family is a type of anti-proliferative gene involved in cell growth and differentiation.
  • the expression level of the gene is highest in the G0 / G1 phase of the cell cycle, and is suppressed after the G1 phase.
  • the protein encoded by the gene reacts with various nuclear receptors and acts as a co-activator during cell differentiation.
  • a t (8; 14) (q24; q32) translocation is observed.
  • Members of this gene family include BTG1, BTG2, BTG3, TOB1 and TOB2.
  • BTG1 is exemplified, but not limited thereto.
  • the HLF (hepatic leukemia factor) family belongs to a gene family that encodes a proline rich (PAR) protein that constitutes a part of a bZIP (basic region leucine-zipper) type transcription factor.
  • the protein encoded by the gene exists in the form of a homodimer or a heterodimer with another PAR family, and binds to a sequence-specific promoter factor to initiate transcription.
  • An E2A-HLF fusion transcription factor derived from a chromosomal translocation is the causative agent of childhood leukemia.
  • Members of this gene family include HLF, TEF and DBP.
  • HLF is exemplified, but not limited thereto.
  • OVOL family member, ZBTB8 family member, ZBTB43 family member, ZNF202 family member, ZNF383 family member, NR5A family member, ZSCAN4 family member, ZNF768 family member, PRPF4B family member, NHLH family member, GRHL family members, OTX family members, PRRX family members, OTP family members, DACH family members, C2orf50 family members, PIH1D family members, KLF family members (Klf1, Klf2, Klf4 and Klf5 Except), HOX family members, BTG family members and HLF family members may be any mammal (eg, human, mouse, rat, monkey, cow, horse, pig, dog, marmoset, horse) Can be used nucleic acid protein or encoding the same formic etc.) derived is preferably derived from human or mouse.
  • amino acid sequence and cDNA sequence information of the above-mentioned nuclear reprogramming substances derived from humans and mice can be obtained by referring to NCBI accession numbers described in Table 1, and those skilled in the art can obtain information based on the cDNA sequence information.
  • a nucleic acid encoding each protein can be easily isolated, and a recombinant protein can be produced as necessary.
  • a natural or artificial mutant protein having nuclear reprogramming ability and a nucleic acid encoding the same can also be used as a nuclear reprogramming substance that substitutes for Klf4 of the present invention.
  • Nuclear reprogramming substance capable of inducing iPS cells by combining with Klf4 include the following combinations: It is known (in the following, only the name of the protein factor is described). (1) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc (2) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2 (where Sox2 can be replaced with Sox1, Sox3, Sox15, Sox17 or Sox18.
  • C-Myc is T58A (active mutant), N Can be replaced with -Myc, L-Myc.) (3) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, ⁇ -catenin (active mutant S33Y) (4) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T (5) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6 (6) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7 (7) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7 (8) Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmil (See WO 2007/069666 for the above (for the substitution of Sox2 to Sox18 in the combination of (2)
  • a nuclear reprogramming substance that can induce iPS cells by combining with Klf4 a combination of substances excluding Klf4 from the combination of (1)-(14) above, that is, (i) Oct3 / 4, c-Myc (ii) Oct3 / 4, c-Myc, Sox2 (Sox2 can be replaced with Sox1, Sox3, Sox15, Sox17 or Sox18.
  • c-Myc can be replaced with T58A (active mutant), N-Myc, L-Myc.
  • Oct family members such as Oct1A and Oct6 can be used instead of Oct3 / 4.
  • Sox family members such as Sox7 can be used instead of Sox2 (or Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18).
  • L-Myc is used instead of c-Myc.
  • Lin28B is used instead of Lin28.
  • nuclear reprogramming substances that can induce iPS cells by combining with Klf4 are preferably Oct family members (eg, Oct3 / 4, Oct1A, Oct6), Sox family members (eg, Sox2, Sox1, Sox3, Sox7, Sox15, Sox17, Sox18), Myc family members (eg c-Myc, n-Myc, L-Myc), Nanog and Lin family members (eg Lin28, Lin28b) .
  • Oct family members eg, Oct3 / 4, Oct1A, Oct6
  • Sox family members eg, Sox2, Sox1, Sox3, Sox7, Sox15, Sox17, Sox18
  • Myc family members eg c-Myc, n-Myc, L-Myc
  • Nanog and Lin family members eg Lin28, Lin28b
  • a combination comprising at least Oct3 / 4 and optionally Sox2 and / or c-Myc or L-Myc (ie (a) Oct3 / 4, (b) Oct3 / 4 + Sox2 (C) Oct3 / 4 + c-Myc or L-Myc, (d) Oct3 / 4 + Sox2 + c-Myc or L-Myc), and Nanog and / or Lin28 or Lin28B May be used in combination.
  • combinations that do not fall under the above (i)-(xiv) but include all of the components in any of them and further include any other substance are also included in the category of “nuclear reprogramming substance” in the present invention.
  • Klf family members other than Klf4 and the Klf family member of the present invention eg, Klf1, Klf2, Klf5 or known substitutes thereof (eg, Esrr family members such as Esrrb, Esrrg) May be combined.
  • somatic cells subject to nuclear reprogramming are partially expressing the components in any of the above (i)-(xiv) under conditions that are endogenously expressed at a sufficient level for nuclear reprogramming.
  • combinations of only the remaining components excluding the component may also be included in the category of “nuclear reprogramming substance capable of inducing iPS cells by combining with Klf4” in the present invention.
  • iPS cells when the obtained iPS cells are used for therapeutic purposes, a combination of two factors of Oct3 / 4 and Sox2 (ie, (ix) above), or Oct3 / 4, Sox2 and L A combination of three factors of -Myc (that is, the above (ii)) is preferable.
  • iPS cells are not used for therapeutic purposes (for example, as a research tool for drug discovery screening)
  • Sox2 and Lin28 (Or Lin28B) 4 factors or 5 factors obtained by adding Nanog thereto (that is, the above (x)) is preferable.
  • the drug may cause tumor formation such as c-Myc if the decrease in the reliability of test data due to contamination with tumorigenic cells is taken into consideration It is desirable to avoid the use of nuclear reprogramming materials.
  • Mouse and human cDNA sequence information for each of the above protein factors can be obtained by referring to NCBI accession numbers described in WO 2007/069666 (Nanog is described as “ECAT4” in the publication)
  • mouse and human cDNA sequence information of Lin28, Lin28B, Esrrb, Esrrg, L-Myc and Tbx3 can be obtained by referring to the following NCBI accession numbers, respectively), and those skilled in the art can easily obtain these.
  • cDNA can be isolated.
  • the obtained cDNA is inserted into an appropriate expression vector, introduced into a host cell, and cultured from the resulting culture. Can be prepared by recovering.
  • the obtained cDNA is inserted into a viral vector or a plasmid vector to construct an expression vector, which is then subjected to a nuclear reprogramming step.
  • the above-mentioned conventionally known protein factors or It includes not only combinations of nucleic acids that encode them, but also newly found protein factors or combinations of nucleic acids that encode them, and may also include combinations that include non-protein factors such as low molecular weight compounds. .
  • Somatic cell source Somatic cells that can be used as a starting material for producing iPS cells in the present invention are any cells other than germ cells derived from mammals (eg, humans, mice, monkeys, pigs, rats, etc.).
  • keratinized epithelial cells eg, keratinized epidermal cells
  • mucosal epithelial cells eg, epithelial cells of the tongue surface layer
  • exocrine glandular epithelial cells eg, mammary cells
  • hormone secreting cells Eg, adrenal medullary cells
  • cells for metabolism / storage eg, hepatocytes
  • luminal epithelial cells that make up the interface eg, type I alveolar cells
  • luminal epithelial cells in the inner chain eg, Vascular endothelial cells
  • cilia cells with transport ability eg, airway epithelial cells
  • cells for extracellular matrix secretion eg, fibroblasts
  • contractile cells e
  • undifferentiated progenitor cells including somatic stem cells
  • final differentiated mature cells It can be used as the source of somatic cells in the invention.
  • tissue stem cells such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells.
  • somatic cells there are no particular restrictions on the mammalian individual from which somatic cells are collected, but when the resulting iPS cells are used for human regenerative medicine, the patient or the type of HLA is used from the viewpoint that rejection does not occur. It is particularly preferred to collect somatic cells from others who are identical or substantially identical.
  • the type of HLA is “substantially the same” means that when the cells obtained by inducing differentiation from iPS cells derived from the somatic cells are transplanted into a patient by using an immunosuppressant or the like, the transplanted cells are This means that the HLA types match to the extent that they can be engrafted.
  • the main HLA for example, 3 loci of HLA-A, HLA-B and HLA-DR, or 4 loci with further addition of the HLA-C locus
  • the main HLA is the same (hereinafter the same).
  • iPS cells when not being administered (transplanted) to humans, for example, when iPS cells are used as a source of screening cells for evaluating the patient's drug sensitivity and the presence or absence of side effects, It is desirable to collect somatic cells from others who have the same genetic polymorphism that correlates with side effects.
  • Somatic cells isolated from mammals can be pre-cultured in a medium known per se suitable for culturing according to the type of cells prior to being subjected to the nuclear reprogramming step.
  • a medium known per se suitable for culturing according to the type of cells prior to being subjected to the nuclear reprogramming step.
  • Examples of such a medium include a minimum essential medium (MEM), Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium, and F12 medium containing about 5 to 20% fetal calf serum. It is not limited to.
  • Protein introduction reagents include cationic lipid-based BioPOTER Protein Delivery Reagent (Gene Therapy Systmes), Pro-Ject TM Protein Transfection Reagent (PIERCE) and ProVectin (IMGENEX), and lipid-based Profect-1 (Targeting Systems) ), Penetrain Peptide (Q biogene) and Chariot Kit (Active Motif) based on a membrane-permeable peptide, GenomONE (Ishihara Sangyo) using HVJ envelope (inactivated Sendai virus), and the like are commercially available.
  • the introduction can be carried out according to the protocol attached to these reagents, but the general procedure is as follows.
  • Dilute the nuclear reprogramming substance in an appropriate solvent for example, buffer solution such as PBS, HEPES, etc.
  • an appropriate solvent for example, buffer solution such as PBS, HEPES, etc.
  • CPP derived from PTD include polyarginine such as 11R (Cell Stem Cell, 4: 381-384 (2009)) and 9R (Cell Stem Cell, 4: 472-476 (2009)).
  • a fusion protein expression vector incorporating a nuclear reprogramming substance cDNA and a PTD sequence or CPP sequence is prepared and recombinantly expressed, and the fusion protein is recovered and used for introduction. Introduction can be performed in the same manner as described above except that no protein introduction reagent is added.
  • Microinjection is a method in which a protein solution is placed in a glass needle having a tip diameter of about 1 ⁇ m and puncture is introduced into a cell, and the protein can be reliably introduced into the cell.
  • electroporation method semi-intact cell method (Kano, F. et al. Methods in Molecular Biology, Vol. 322, 357-365 (2006)), introduction method using Wr-t peptide (Kondo, E. et al. , Mol. Cancer Ther. 3 (12), 1623-1630 (2004)).
  • the protein introduction operation can be performed any number of times of 1 or more (for example, 1 to 10 times, or 1 to 5 times, etc.), and preferably the introduction operation is performed 2 times or more (for example, 3 or 4 times). ) Can be done repeatedly.
  • the interval when the introduction operation is repeated includes, for example, 6 hours to 7 days, preferably 12 to 48 hours or 7 days.
  • the nuclear reprogramming substance in the form of a nucleic acid that encodes it rather than as a protein factor itself.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA, or may be a DNA / RNA chimera, and the nucleic acid may be double-stranded or single-stranded.
  • the nucleic acid is double stranded DNA, in particular cDNA.
  • the cDNA of the nuclear reprogramming substance is inserted into an appropriate expression vector containing a promoter that can function in somatic cells as a host.
  • expression vectors include retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses, Sendai virus and other viral vectors, animal cell expression plasmids (eg, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV). , PcDNAI / Neo) or the like.
  • the type of vector to be used can be appropriately selected according to the intended use of the iPS cells obtained.
  • adenovirus vectors plasmid vectors, adeno-associated virus vectors, retrovirus vectors, lentivirus vectors, Sendai virus vectors and the like can be used.
  • Examples of the promoter used in the expression vector include EF1 ⁇ promoter, CAG promoter, SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (rous sarcoma virus) promoter, MoMuLV (Molone murine leukemia virus) LTR. HSV-TK (herpes simplex virus thymidine kinase) promoter and the like are used. Of these, EF1 ⁇ promoter, CAG promoter, MoMuLV LTR, CMV promoter, SR ⁇ promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may contain an enhancer, a poly A addition signal, a selection marker gene, an SV40 replication origin, and the like as desired.
  • the selection marker gene include a dihydrofolate reductase gene, a neomycin resistance gene, a puromycin resistance gene, and the like.
  • Nucleic acid that is a nuclear reprogramming substance may be incorporated on separate expression vectors, or two or more, preferably 2-3 types of genes may be incorporated into one expression vector. It is preferable to select the former when using a retrovirus or lentiviral vector with high gene transfer efficiency, and the latter when using a plasmid, adenovirus, episomal vector, or the like. Furthermore, an expression vector incorporating two or more types of genes and an expression vector incorporating only one gene can be used in combination.
  • sequences enabling polycistronic expression include 2A sequences of foot-and-mouth disease virus (PLoS ONE3, e2532, 2008, Stem Cells 25, 1707, 2007), IRES sequences (US Patent No. 4,937,190), preferably 2A An array can be used.
  • An expression vector containing a nucleic acid that is a nuclear reprogramming substance can be introduced into a cell by a method known per se according to the type of the vector.
  • a virus produced in the culture supernatant by introducing a plasmid containing the nucleic acid into an appropriate packaging cell (eg, Plat-E cell) or a complementary cell line (eg, 293 cell) The vector is collected and cells are infected with the vector by an appropriate method according to each viral vector.
  • an appropriate packaging cell eg, Plat-E cell
  • a complementary cell line eg, 293 cell
  • the vector is collected and cells are infected with the vector by an appropriate method according to each viral vector.
  • specific means using a retroviral vector as a vector are disclosed in WO2007 / 69666, Cell, 126, 663-676 (2006) and Cell, 131, 861-872 (2007).
  • reprogramming genes may increase the risk of carcinogenesis in tissues regenerated from differentiated cells derived from iPS cells. It is preferable that the gene is transiently expressed without being integrated into the cell chromosome. From this point of view, it is preferable to use an adenovirus vector that rarely integrates into the chromosome. Specific means using an adenoviral vector is described in Science, 322, 945-949 (2008).
  • adeno-associated virus also has a low frequency of integration into chromosomes, and has lower cytotoxicity and inflammation-inducing action than adenovirus vectors, and thus can be mentioned as another preferred vector.
  • the Sendai virus vector can exist stably outside the chromosome, and can be preferably used in the same manner because it can be decomposed and removed by siRNA as necessary.
  • the Sendai virus vector those described in J. Biol. Chem., 282, 27383-27391 (2007) and Japanese Patent No. 3602058 can be used.
  • a method of excising a nucleic acid encoding a nuclear reprogramming substance at a time point can be preferably used. That is, loxP sequences are arranged at both ends of the nucleic acid, and after iPS cells are induced, Cre recombinase is allowed to act on the cells using a plasmid vector or an adenovirus vector to cut out the region sandwiched between the loxP sequences. be able to.
  • the enhancer-promoter sequence in the LTR ⁇ U3 region may up-regulate nearby host genes by insertion mutation, so the 3′-self is deleted or replaced with a polyadenylation sequence such as SV40.
  • an inactivated (SIN) LTR is used to avoid expression control of the endogenous gene by an LTR outside the loxP sequence that is not excised and remains in the genome. Specific means using the Cre-loxP system and SIN LTR are disclosed in Chang et al., Stem Cells, 27: 1042-1049 (2009).
  • plasmid vector which is a non-viral vector
  • the vector is transferred to cells using lipofection method, liposome method, electroporation method, calcium phosphate coprecipitation method, DEAE dextran method, microinjection method, gene gun method, etc.
  • lipofection method liposome method
  • electroporation method calcium phosphate coprecipitation method
  • DEAE dextran method microinjection method
  • gene gun method etc.
  • Specific means using a plasmid as a vector are described in, for example, Science, 322, 949-953 (2008).
  • gene transfer can be performed any number of times of 1 or more (for example, 1 to 10 times, or 1 to 5 times).
  • gene transfer can be performed any number of times of 1 or more (for example, 1 to 10 times, or 1 to 5 times).
  • two or more types of expression vectors are introduced into a somatic cell, it is preferable to introduce all these types of expression vectors into the somatic cell at the same time.
  • the number of times (for example, 1 or more and 10 or less, or 1 or more and 5 or less, etc.) can be performed, and the introduction operation can be preferably repeated by 2 or more times (for example, 3 or 4 times).
  • transgene may be integrated into the chromosome, it is necessary to finally confirm that there is no gene insertion into the chromosome by Southern blotting or PCR. Therefore, it may be advantageous to use a means for removing the gene after the transgene has been once integrated into the chromosome, as in the Cre-loxP system.
  • there is a method for completely removing a transgene from a chromosome by incorporating a transgene into a chromosome using a transposon and then allowing a transferase to act on the cell using a plasmid vector or an adenovirus vector. Can be used.
  • Preferred transposons include, for example, piggyBac, which is a transposon derived from a lepidopteran insect. Specific means using the piggyBac transposon are disclosed in Kaji, K. et al., Nature, 458: 771-775 (2009), Woltjen et al., Nature, 458: 766-770 (2009).
  • Another preferred non-integrated vector is an episomal vector capable of autonomous replication outside the chromosome. Specific means using an episomal vector is disclosed in Yu et al., Science, 324, 797-801 (2009). If necessary, construct an expression vector with the reprogramming gene inserted into the episomal vector in which the loxP sequences are placed in the same direction on the 5 'and 3' sides of the vector elements required for episomal vector replication. It can also be introduced into somatic cells.
  • the episomal vector examples include a vector containing a sequence necessary for autonomous replication derived from EBV, SV40 or the like as a vector element.
  • vector elements necessary for autonomous replication include a replication origin and a gene encoding a protein that binds to the replication origin and controls replication.
  • the replication origin oriP And EBNA-1 gene SV40 includes the replication origin ori and SV40 large T antigen gene.
  • the episomal expression vector also contains a promoter that controls transcription of the reprogramming gene. As the promoter, the same promoter as described above can be used.
  • the episomal expression vector may further contain an enhancer, a poly A addition signal, a selection marker gene, and the like as desired, as described above. Examples of the selection marker gene include a dihydrofolate reductase gene and a neomycin resistance gene.
  • the loxP sequence used in the present invention includes a wild type loxP sequence derived from bacteriophage P1 and recombination when placed in the same direction at a position sandwiching a vector element required for replication of the reprogramming gene. And any mutated loxP sequence that can delete sequences between loxP sequences. Examples of the mutant loxP sequence include lox71 having a mutation in the 5 'repeat, lox66 having a mutation in the 3' repeat, lox2272 and lox511 having a mutation in the spacer portion, and the like.
  • the two loxP sequences arranged on the 5 ′ side and 3 ′ side of the vector element may be the same or different, but in the case of a mutant loxP sequence having a mutation in the spacer portion (for example, , Lox2272 and lox511) are used.
  • a mutant loxP sequence eg, lox71
  • a mutant loxP sequence eg, lox66
  • the loxP sequence remaining on the chromosome as a result of recombination has double mutations in the 5 'and 3' repeats, making it difficult to recognize by Cre recombinase, and chromosomal deletion mutations due to unnecessary recombination. The risk of causing this is reduced.
  • any of the mutant loxP sequences may be arranged on the 5 ′ side and 3 ′ side of the vector element, but the mutation site is mutated so that the mutation site is located at the outer end of the loxP sequence. It is necessary to insert the loxP sequence.
  • the two loxP sequences are the 5 'and 3' sides of the vector elements necessary for replication of the reprogramming gene (ie, the gene sequence encoding the replication origin or a protein that binds to the replication origin and controls replication). Are arranged in the same direction.
  • the vector element sandwiched by the loxP sequence may be either one of the replication origin, the gene sequence encoding the protein that binds to the replication origin and controls replication, or both.
  • Episomal vectors can be introduced into cells using, for example, lipofection method, liposome method, electroporation method, calcium phosphate coprecipitation method, DEAE dextran method, microinjection method, gene gun method and the like. Specifically, for example, the method described in Science, 324: 797-801 (2009) can be used.
  • Whether or not the vector element necessary for replication of the reprogramming gene has been removed from the iPS cell is determined by using a nucleic acid containing a base sequence in the vector element and / or in the vicinity of the loxP sequence as a probe or primer. Southern blot analysis or PCR analysis is performed using the isolated episomal fraction as a template, and the presence or absence of a band or the length of a detection band can be examined.
  • the episomal fraction may be prepared by a method well known in the art, for example, the method described in Science, 324: 797-801 (2009) or the like.
  • the nuclear reprogramming substance capable of inducing iPS cells by combining with Klf4 is a low molecular weight compound
  • the substance is introduced into somatic cells by dissolving the substance in an appropriate concentration in an aqueous or non-aqueous solvent, Or a medium suitable for culturing somatic cells isolated from mice (eg, minimal essential medium (MEM) containing about 5-20% fetal calf serum, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium, F12 Medium) and the like so that the concentration of the nuclear reprogramming substance is sufficient to cause nuclear reprogramming in somatic cells and does not cause cytotoxicity, and the cells are cultured for a certain period of time.
  • MEM minimal essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • RPMI1640 medium 199 medium, F12 Medium
  • the concentration of the nuclear reprogramming substance varies depending on the type of the nuclear reprogramming substance used, but is appropriately selected within the range of about 0.1 nM to about 100 nM.
  • the contact period is not particularly limited as long as it is a time sufficient for the nuclear reprogramming of the cells to be achieved, but it is usually sufficient that the contact period coexists in the medium until a positive colony appears.
  • HDAC histone deacetylase
  • VPA valproate
  • trichostatin Nucleic acids such as A, sodium butyrate
  • small molecule inhibitors such as MC 1293, M344, siRNA and shRNA against HDAC
  • HDAC1 siRNA Smartpool (registered trademark) (Millipore), HuSH 29mer struct Constructs construct HDAC1 (OriGene), etc.
  • Expression inhibitors etc. DNA methyltransferase inhibitors (eg 5'-azacytidine) (Nat.
  • G9a histone methyltransferase inhibitors eg BIX-01294 (eg Cell inhibitors such as Cell Stem Cell, 2: 525-528 ⁇ (2008)), nucleic acid expression inhibitors such as siRNA and shRNA against G9a (eg, G9a siRNA (human) (Santa Cruz Biotechnology) etc.), L-channel calcium agonist (e.g.
  • Bayk8644 864 (Cell Stem Cell, 3, 568-574 ( 2008)), p53 inhibitors (eg siRNA and shRNA for p53 (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008)), UTF1 (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008)), Wnt Signaling (eg soluble Wnt3a) (Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)), 2i / LIF (2i is an inhibitor of mitogen-activated protein kinase signalling and glycogen synthase kinase-3, PloS Biology, 6 (10), 2237-2247 (2008)), ES cell-specific miRNAs (eg, miR-302-367 clusters (Mol. Cell. Biol.
  • the nucleic acid expression inhibitor may be in the form of an expression vector containing DNA encoding siRNA or shRNA.
  • SV40 large T is not an essential factor for somatic cell nuclear reprogramming, but is an auxiliary factor. It can also be included in a category.
  • auxiliary factors other than those essential for nuclear reprogramming are positioned as nuclear reprogramming substances or substances that improve the establishment efficiency of iPS cells. It may be convenient.
  • the nuclear reprogramming process of somatic cells is regarded as an overall event caused by the contact of somatic cells with the nuclear reprogramming substance and the substance that improves the establishment efficiency of iPS cells. There will be no gender.
  • Contact of the iPS cell establishment efficiency improving substance with the somatic cell may be carried out when the substance is (a) a protein factor, (b) a nucleic acid encoding the protein factor, or (c) a low molecular weight compound.
  • the nuclear initialization material can be carried out by the same method as described above.
  • the iPS cell establishment efficiency improving substance may be brought into contact with the somatic cells simultaneously with the nuclear reprogramming substance. Alternatively, either one may be contacted first.
  • the nuclear reprogramming substance is a nucleic acid encoding a proteinous factor
  • the substance that improves the establishment efficiency of iPS cells is a chemical inhibitor
  • the former removes the proteinous factor from the gene transfer treatment.
  • a substance that improves the establishment efficiency of iPS cells is added to the medium can do.
  • both a nuclear reprogramming substance and an iPS cell establishment efficiency improving substance are used in the form of a viral vector or a plasmid vector, both may be introduced into a cell simultaneously.
  • the iPS cell establishment efficiency can be further improved by culturing cells under hypoxic conditions in the somatic cell nuclear reprogramming step.
  • the “hypoxic condition” means that the oxygen concentration in the atmosphere when cells are cultured is significantly lower than that in the air. Specifically, the oxygen concentration condition is lower than the oxygen concentration in the atmosphere of 5-10% CO 2 / 95-90% air generally used in normal cell culture. For example, oxygen in the atmosphere Conditions with a concentration of 18% or less apply.
  • the oxygen concentration in the atmosphere is 15% or less (eg, 14% or less, 13% or less, 12% or less, 11% or less, etc.), 10% or less (eg, 9% or less, 8% or less, 7% or less) 6% or less), or 5% or less (eg, 4% or less, 3% or less, 2% or less, etc.).
  • the oxygen concentration in the atmosphere is preferably 0.1% or more (eg, 0.2% or more, 0.3% or more, 0.4% or more), 0.5% or more (eg, 0.6% or more, 0.7% or more, 0.8% or more, 0.95 Or 1% or more (eg, 1.1% or more, 1.2% or more, 1.3% or more, 1.4% or more, etc.).
  • a method for creating a hypoxic state in the cell environment is not particularly limited, but a method of culturing the cells in a CO 2 incubator in which the oxygen concentration can be adjusted is the easiest and is a preferable example.
  • CO 2 incubators with adjustable oxygen concentration are sold by various equipment manufacturers (for example, CO for low oxygen culture by manufacturers such as Thermo scientific, Ikemoto Rika Kogyo, Toji Field, and Waken Pharmaceutical Co., Ltd.) 2 incubators can be used).
  • the time when cell culture is started under hypoxic conditions is not particularly limited as long as it does not prevent the establishment efficiency of iPS cells from being improved compared to the case of normal oxygen concentration (20%).
  • the contact may be before the contact with the reprogramming substance, at the same time as the contact, or after the contact. For example, immediately after the somatic cell is contacted with the nuclear reprogramming substance, or the contact It is preferable to culture under hypoxic conditions after a certain period of time (for example, 1 to 10 (eg, 2,3,4,5,6,7,8 or 9) days).
  • the period for culturing cells under hypoxic conditions is not particularly limited as long as it does not prevent the establishment efficiency of iPS cells from being improved compared to the case of normal oxygen concentration (20%). Examples include, but are not limited to, a period of 7 days or more, 10 days or more, 50 days or less, 40 days or less, 35 days or less, or 30 days or less.
  • a preferable culture period under low oxygen conditions varies depending on the oxygen concentration in the atmosphere, and those skilled in the art can appropriately adjust the culture period according to the oxygen concentration used.
  • when selection of iPS cell candidate colonies is performed using drug resistance as an index, it is preferable to return from a low oxygen condition to a normal oxygen concentration before drug selection is started.
  • the preferred timing and preferred culture period for starting cell culture under hypoxic conditions vary depending on the type of nuclear reprogramming substance used, iPS cell establishment efficiency under normoxic conditions, and the like.
  • the cells After contacting with a nuclear reprogramming substance (and a substance that improves iPS cell establishment efficiency), the cells can be cultured under conditions suitable for culturing ES cells, for example.
  • Leukemia® Inhibitory® Factor LIF
  • LIF Leukemia® Inhibitory® Factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • SCF stem cell factor
  • STO cells are usually used as MEFs, but SNL cells (McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)) are often used to induce iPS cells. ing.
  • the co-culture with feeder cells may be started before the contact with the nuclear reprogramming substance, or may be started at the time of the contact or after the contact (for example, after 1-10 days).
  • the selection of iPS cell candidate colonies includes a method using drug resistance and reporter activity as indicators and a method using visual morphological observation.
  • the former include a drug resistance gene and / or a gene locus that is specifically highly expressed in differentiated pluripotent cells (for example, Fbx15, Nanog, Oct3 / 4, etc., preferably Nanog or Oct3 / 4).
  • a recombinant cell targeted with a reporter gene is used to select colonies that are drug resistant and / or reporter activity positive.
  • Such recombinant cells include, for example, MEF (Takahashi & Yamanaka, Cell, 126, 663) derived from a mouse in which a ⁇ geo (encoding a fusion protein of ⁇ -galactosidase and neomycin phosphotransferase) gene is knocked in at the Fbx15 locus. -676 (2006)), or MEFs derived from transgenic mice incorporating the green fluorescent protein (GFP) gene and puromycin resistance gene at the Nanog locus (Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007)) Etc.
  • MEF green fluorescent protein
  • examples of a method for selecting candidate colonies by visual morphological observation include the methods described in Takahashi et al., Cell, 131, 861-872-8 (2007).
  • a method using a reporter cell is simple and efficient, when iPS cells are produced for the purpose of human therapeutic use, visual colony selection is desirable from the viewpoint of safety.
  • two factors, Oct3 / 4 and Sox2 are used as nuclear reprogramming substances that can induce iPS cells by combining with Klf4
  • the number of established clones is reduced, but most of the resulting colonies are comparable to ES cells. Since iPS cells are of high quality, it is possible to establish iPS cells efficiently without using reporter cells.
  • Nuclear reprogramming substances that can replace Klf4 are OVOL family members, ZBTB8 family members, ZBTB43 family members, ZNF202 family members, ZNF383 family members, NR5A family members, ZSCAN4 family members, ZNF768 family members , PRPF4B family member, NHLH family member, GRHL family member, OTX family member, PRRX family member, OTP family member, DACH family member, C2orf50 family member, PIH1D family member, KLF family member
  • the resulting iPS cells contain the exogenous nucleic acid.
  • the exogenous nucleic acid is introduced into a somatic cell using a retrovirus, a lentivirus or the like, the exogenous nucleic acid is usually incorporated into the genome of the resulting iPS cell, and therefore contains the exogenous nucleic acid. This trait is stably maintained.
  • the iPS cells thus established can be used for various purposes.
  • the differentiation induction method reported for ES cells is used to induce differentiation of iPS cells into various cells (eg, cardiomyocytes, blood cells, nerve cells, vascular endothelial cells, insulin secreting cells, etc.). be able to. Therefore, if iPS cells are induced using somatic cells collected from the patient or another person who has the same or substantially the same type of HLA, the desired cells (ie, the organ in which the patient is affected) Stem cell therapy by autotransplantation is possible, in which cells and cells that exhibit therapeutic effects on diseases are differentiated and transplanted into the patient.
  • the desired cells ie, the organ in which the patient is affected
  • Stem cell therapy by autotransplantation is possible, in which cells and cells that exhibit therapeutic effects on diseases are differentiated and transplanted into the patient.
  • Example 1 Screening of novel reprogramming factor (1)
  • Human Gateway (registered trademark) entry clone created by Goshima et al. Using the library described in N. Goshima et al., Nature methods, 2008. Database published in Y. Maruyama et al., Nucleic Acid Res., 2009) Based on the method described in FIG. 1, about 20000 human comprehensive genes were aligned. That is, about 50,000 clones including full length ORF in human Gateway (registered trademark) entry clones were subjected to a blastp search based on NCBI RefSeq 37900 sequences (24200 genes) with a coverage of 80% or more and amino acid identity of 95% or more.
  • a sub-library consisting of approximately 20000 entry clones was constructed with no sequence duplication within each type of N-type having a stop codon at the 3 ′ end of ORF and F-type having no stop codon.
  • This aligned 20,000-entry clone is classified into protein kinase, protein phosphatase, transcription factor, GPCR, and other clones by bioinformatics method, and a sub-library consisting of entry clones of transcription factors (all human transcription factors) (Over 50% of the cover) was constructed (Fig. 1). From this transcription factor sub-library, for each entry clone, an expression clone DNA is prepared by LR reaction with the pMXs-GW destination vector as shown in FIG.
  • MSTO method a retrovirus infection system (hereinafter referred to as MSTO method, Cell, 126, 663-676 (2006)) on MSTO (SNL cells treated with mitomycin C to stop cell division) feeder cells, Infection is not used for feeder cells.
  • MSTO SNL cells treated with mitomycin C to stop cell division
  • MSTO Reseed method, Nature Biotech., 26, p101-106 (2008)
  • iPS cell induction was performed in a 24-well plate. Skin-derived fibroblasts of Nanog-GFP mice were seeded on MSTO (MSTO method), and the next day, they were infected with retroviruses prepared from various plasmids (Day 0).
  • FIG. 4 and FIG. 5 show GFP positive colony images and phase contrast images of the first and second passages when colonies of each iPS cell obtained by the Reseed method are formed. The above results revealed that these 14 types of factors are novel reprogramming factors that can substitute for Klf4.
  • Example 2 Screening of novel reprogramming factor (2)
  • the “transcription factor expression library for reprogramming factor screening” prepared in Example 1 was divided into pools of about 1000 genes.
  • transcription factors not only transcription factors but also about 20,000 entry clones including protein kinases, protein phosphatases, GPCRs and other clones (hereinafter referred to as “all factor expression library for reprogramming factor screening”) Divided into pools of approximately 1000 genes.
  • All factor expression library for reprogramming factor screening Divided into pools of approximately 1000 genes.
  • the same iPS cell induction experiment as Example 1 was performed using these gene pools. As the first screening, iPS cell induction was performed in a 10 cm dish.
  • Gelatin (Reseed method) was seeded with Nanog-GFP mouse skin-derived fibroblasts, and the next day, the first plate was infected with 3 genes of Oct3 / 4, Sox2 and c-Myc at a ratio of 1: 1: 1. The second plate was infected with the aforementioned pool of every 1000 genes (first infection). As a negative control, three genes Oct3 / 4, Sox2 and c-Myc were infected at a ratio of 1: 1: 1. In addition, four genes Oct3 / 4, Sox2, Klf4 and c-Myc were infected at a ratio of 1: 1: 1: 1 as a positive control. On the second day after the first infection, the seedlings were reseeded on Gelatin.
  • the first plate is infected with the pool of every 1000 genes mentioned above, and the second plate is a 1: 1: 1 ratio of 3 genes of Oct3 / 4, Sox2 and c-Myc.
  • the cells were cultured in 10% FBS / DMEM from the second infection to the second day, and in ES medium (Cell, 126, 663-676 (2006)) from the third day.
  • ES medium Cell, 126, 663-676 (2006)
  • the medium was changed every two days, puromycin was selected from the 21st day, and cells were observed on the 28th day.
  • GFP-positive colonies are collected, genomic DNA is extracted by a conventional method, and primers derived from the pMXs vector (forward primer: GAC GGC ATC GCA GCT TGG ATA CAC (SEQ ID NO: 43), reverse primer: TTA TCG TCG ACC ACT GTG CTG CTG (SEQ ID NO: 44)) was used to identify foreign genes inserted into the genome (genes derived from the library).
  • a 2nd screening was performed by introducing the identified gene and three genes of Oct3 / 4, Sox2 and c-Myc into the skin-derived fibroblasts of Nanog-GFP mice.

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Abstract

　本発明は、OVOLファミリー、ZBTB8ファミリー、ZBTB43ファミリー、ZNF202ファミリー、ZNF383ファミリー、NR5Aファミリー、ZSCAN4ファミリー、ZNF768ファミリー、PRPF4Bファミリー、NHLHファミリー、GRHLファミリー、OTXファミリー、PRRXファミリー、OTPファミリー、DACHファミリー、C2orf50ファミリー、PIH1Dファミリー、KLFファミリー（但し、Klf1、Klf2、Klf4およびKlf5を除く）、HOXファミリー、BTGファミリー及びHLFファミリーのメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される、Klf4を代替し得る各初期化物質を提供する。本発明はまた、上記核初期化物質の1種以上と、Klf4と組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる物質とを、体細胞に導入する工程を含む、iPS細胞の製造方法を提供する。さらに、該方法により得られうる、上記核初期化物質のいずれかをコードする外来性核酸を含むiPS細胞、該iPS細胞に分化を誘導することによる体細胞の製造方法も提供される。

Description

核初期化物質
　本発明は、新規核初期化物質及びその用途に関する。より詳細には、本発明は、Klf4の代替となり得る新規核初期化物質、並びにそれを用いた人工多能性幹（以下、iPSという）細胞の樹立方法に関する。
発明の背景
　近年、マウスおよびヒトのiPS細胞が相次いで樹立された。Yamanakaらは、ESTデータベースの解析により、ES細胞や生殖細胞などの多能性細胞で特異的に発現する遺伝子を同定し、ノックアウトマウス技術等を用いてそれらの機能解析を行い、さらに他の研究グループの報告を合わせて、24遺伝子を、体細胞に多能性を誘導する（核を初期化する）物質の候補として選択した（1, 2）。この24遺伝子を、Fbx15遺伝子座にネオマイシン耐性遺伝子をノックインしたレポーターマウス由来の線維芽細胞（MEF）に、レトロウイルスを用いて導入し強制発現させることによって、iPS細胞を誘導した。次に1遺伝子を差し引いた23遺伝子を導入することにより核初期化に最重要な遺伝子の絞込みを行い、最終的にOct3/4, Sox2, Klf4及びc-Myc遺伝子の4遺伝子を、体細胞の核初期化に必要な因子として同定した（1, 2）。
　また、Yamanakaらは、Fbx15よりも多能性細胞に発現が限局しているNanogの遺伝子座に緑色蛍光タンパク質（GFP）及びピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウスを作製し、該マウス由来のMEFで上記4遺伝子を強制発現させ、ピューロマイシン耐性かつGFP陽性の細胞を選別することにより、遺伝子発現やエピジェネティック修飾が胚性幹（ES）細胞とほぼ同等のiPS細胞（Nanog iPS細胞）を樹立し、キメラマウスを作製することに成功した（3）。その後、c-Myc遺伝子を除いた3因子によってもiPS細胞を作製でき、キメラマウスの生殖系列にも寄与することが明らかとなった（4）。
　さらに、Yamanakaらは、ヒトの皮膚由来線維芽細胞にマウスと同様の4遺伝子もしくは3遺伝子を導入することにより、iPS細胞を樹立することに成功した（1, 5）。このように、体細胞に特定因子を導入することにより、ヒト及びマウスで、分化多能性においてES細胞と遜色のないiPS細胞を作製できることが示された。
　Oct3/4, Sox2, Klf4及びc-Mycの4遺伝子のうち、Oct3/4及びSox2はES細胞の自己複製能と多能性の維持に必須であるといわれており、c-MycもまたES細胞の自己複製能及び多能性維持への関与が報告されている。一方、Klf4は、増殖、分化、発生、アポトーシス等の種々の生物学的プロセスを制御する転写因子であるKruppel-like factor（Klf）ファミリーに属するが(6)、詳しい働きはよくわかっていない。着床後胚のエピブラストから樹立されるepiblast stem cell（EpiSC）は、ES細胞と異なり、宿主胚盤胞に注入してもキメラ胚を形成することができないが、EpiSCではOct3/4やSox2はES細胞と同等に発現しているのに対し、Klf4遺伝子の発現が顕著に低下している。また最近、EpiSCにKlf4遺伝子のみを導入することにより、ES細胞に近い性質を獲得させることができることが報告された（7）。
　しかし、Klf4をRNAiによりノックダウンしても、ES細胞の形態学的変化は認められないことから（8）、Klf4はES細胞の未分化状態維持に必須でないことが示唆されている。Yamanakaらは、4遺伝子はそれぞれ同一ファミリーに属する他の遺伝子によって代替できると考え、Klf4をKlf1、Klf2もしくはKlf5に代えてもiPS細胞を樹立できることを示している（1, 4）。また、Thomsonらのグループは、Klf4とc-Mycの代わりにNanogとLin28を使用してヒトiPS細胞を作製できることを報告しており（9, 10）、Klf4の機能はNanogと共通点が多いとも考えられる。
　Jiangらのグループは、ES細胞にレチノイン酸による分化誘導処理を施すと、Klf4だけでなくKlf2やKlf5の発現も低下することに着目し、Klf2、Klf4及びKlf5を同時にノックダウンしたところ、ES細胞の分化が誘導されることを見出し、Klf2やKlf5等のKlfファミリーの少なくとも一部は、ES細胞におけるKlf4の機能を代替し得る可能性を示した（11）。彼らはさらに、Oct3/4, Sox2及びc-Mycの3遺伝子とともに、Klf2もしくはKlf5遺伝子、あるいは他の転写因子やエピジェネティック調節因子をMEFに導入し、Klf2やKlf5がKlf4を代替し得ることを確認するとともに、エストロゲン受容体に類似するオーファン核内受容体であるEsrrbもまた、Klf4を代替し得ることを見出した（12）。
　さらに、Klf4の代替因子として、本発明者らはIRXファミリーのメンバー、GLISファミリーのメンバー、PTXファミリーのメンバー及びDMRTB1を見出している（13）。
引用文献：
1. WO 2007/069666 A1
2. Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006)
3. Okita, K. et al., Nature, 448: 313-317 (2007)
4. Nakagawa, M. et al., Nat. Biotethnol., 26: 101-106 (2008)
5. Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007)
6. McConnell, B.B. et al., Bioassays, 29: 549-557 (2007)
7. Guo, G. et al., Development, 136: 1063-1069 (2009)
8. Nakatake, Y. et al., Mol. Cell. Biol., 26: 7772-7782 (2006)
9. WO 2008/118820 A2
10. Yu, J. et al., Science, 318: 1917-1920 (2007)
11. Jiang, J. et al., Nat. Cell Biol., 10: 353-360 (2008)
12. Feng, B. et al., Nat. Cell Biol., 11: 197-203 (2009)
13. WO 2010/098419 A1
発明の要約
　iPS細胞の臨床応用を目指す上で、核初期化メカニズムの全貌を解明することは極めて重要である。従来公知の核初期化物質を代替し得る未知の核初期化物質を同定することは、核初期化メカニズムの解明の一助となるのみならず、臨床応用に最適なiPS細胞の樹立プロセスを確立する意味でもその意義は大きい。したがって、本発明の目的は、新規核初期化物質、特にKlf4の代替となり得る新規核初期化物質を同定し、それを用いた新規なiPS細胞の樹立方法を提供することである。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく、ES細胞等の多能性細胞で特異的に発現する遺伝子に拘らず、広く転写因子または受容体または酵素等の遺伝子ライブラリーの中から、Klf4の代替因子としてiPS細胞を樹立することができる遺伝子を網羅的に探索した。その結果、OVOLファミリーに属する遺伝子、ZBTB8ファミリーに属する遺伝子、ZBTB43ファミリーに属する遺伝子、ZNF202ファミリーに属する遺伝子、ZNF383ファミリーに属する遺伝子、NR5Aファミリーに属する遺伝子、ZSCAN4ファミリーに属する遺伝子、ZNF768ファミリーに属する遺伝子、PRPF4Bファミリーに属する遺伝子、NHLHファミリーに属する遺伝子、GRHLファミリーに属する遺伝子、OTXファミリーに属する遺伝子、PRRXファミリーに属する遺伝子、OTPファミリーに属する遺伝子、DACHファミリーに属する遺伝子、C2orf50ファミリーに属する遺伝子、PIH1Dファミリーに属する遺伝子、KLFファミリーに属する遺伝子、HOXファミリーに属する遺伝子、BTGファミリーに属する遺伝子またはHLFファミリーに属する遺伝子を、Oct3/4, Sox2及びc-Mycの3遺伝子とともにアダルトマウスの皮膚由来線維芽細胞に導入した場合に、iPS細胞を効率よく樹立することができ、これらの転写因子を、Klf4の機能を代替し得る新規核初期化物質として同定して、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りのものである。
[1] 以下の(1)及び(2):
(1) OVOLファミリーのメンバー、ZBTB8ファミリーのメンバー、ZBTB43ファミリーのメンバー、ZNF202ファミリーのメンバー、ZNF383ファミリーのメンバー、NR5Aファミリーのメンバー、ZSCAN4ファミリーのメンバー、ZNF768ファミリーのメンバー、PRPF4Bファミリーのメンバー、NHLHファミリーのメンバー、GRHLファミリーのメンバー、OTXファミリーのメンバー、PRRXファミリーのメンバー、OTPファミリーのメンバー、DACHファミリーのメンバー、C2orf50ファミリーのメンバー、PIH1Dファミリーのメンバー、KLFファミリーのメンバー（但し、Klf1、Klf2、Klf4およびKlf5を除く）、HOXファミリーのメンバー、BTGファミリーのメンバー及びHLFファミリーのメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1種以上の物質、
(2) Klf4と組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる物質
を体細胞に導入する工程を含む、iPS細胞の製造方法。
[2] 前記(1)の物質が、ovo-like 2（OVOL2）、zinc finger and BTB domain containing 8A（ZBTB8A）、zinc finger and BTB domain containing 43（ZBTB43）、zinc finger protein 202（ZNF202）、zinc finger protein 383（ZNF383）、nuclear receptor subfamily 5, group A, member 1（NR5A1）、zinc finger and SCAN domain containing 4（ZSCAN4）、zinc finger protein 768（ZNF768）、PRP4 pre-mRNA processing factor 4 homolog B（PRPF4B）、nescient helix loop helix 1（NHLH1）、grainyhead-like 1 (GRHL1)、orthodenticle homeobox 2（OTX2）、paired related homeobox 2（PRRX2）、orthopedia homeobox（OTP）、dachshund homolog 2（DACH2）、chromosome 2 open reading frame 50（C2orf50）、PIH1 domain containing 1（PIH1D1）、Kruppel-like factor 15（KLF15）、homeobox B5（HOXB5）、B-cell translocation gene 1, anti-proliferative（BTG1）及びhepatic leukemia factor（HLF）並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される少なくとも1種の物質を含む、上記[1]記載の方法。
[3] 前記(2)の物質が、Octファミリーのメンバー、Soxファミリーのメンバー、Mycファミリーのメンバー、Nanog及びLinファミリーのメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される、上記[1]記載の方法。
[4] 前記(2)の物質がOct3/4である、上記[1]記載の方法。
[5] 前記(2)の物質がOct3/4及びSox2である、上記[1]記載の方法。
[6] 前記(2)の物質がOct3/4及びc-MycもしくはL-Mycである、上記[1]記載の方法。
[7] 前記(2)の物質がOct3/4、Sox2及びc-MycもしくはL-Mycである、上記[1]記載の方法。
[8] 前記(2)の物質がOct3/4、Sox2、c-MycもしくはL-Myc、並びにNanogおよび／またはLin28もしくはLin28Bである、上記[1]記載の方法。
[9] 以下の(1)及び(2):
(1) OVOLファミリーのメンバー、ZBTB8ファミリーのメンバー、ZBTB43ファミリーのメンバー、ZNF202ファミリーのメンバー、ZNF383ファミリーのメンバー、NR5Aファミリーのメンバー、ZSCAN4ファミリーのメンバー、ZNF768ファミリーのメンバー、PRPF4Bファミリーのメンバー、NHLHファミリーのメンバー、GRHLファミリーのメンバー、OTXファミリーのメンバー、PRRXファミリーのメンバー、OTPファミリーのメンバー、DACHファミリーのメンバー、C2orf50ファミリーのメンバー、PIH1Dファミリーのメンバー、KLFファミリーのメンバー（但し、Klf1、Klf2、Klf4およびKlf5を除く）、HOXファミリーのメンバー、BTGファミリーのメンバー及びHLFファミリーのメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1種以上の物質、
(2) Klf4と組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる物質
を含有してなる、体細胞からiPS細胞への誘導剤。
[10] 前記(1)の物質が、OVOL2、ZBTB8A、ZBTB43、ZNF202、ZNF383、NR5A1、ZSCAN4、ZNF768、PRPF4B、NHLH1、GRHL1、OTX2、PRRX2、OTP、DACH2、C2orf50、PIH1D1、KLF15、HOXB5、BTG1及びHLF並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される少なくとも1種の物質を含む、上記[9]記載の剤。
[11] OVOLファミリーのメンバー、ZBTB8ファミリーのメンバー、ZBTB43ファミリーのメンバー、ZNF202ファミリーのメンバー、ZNF383ファミリーのメンバー、NR5Aファミリーのメンバー、ZSCAN4ファミリーのメンバー、ZNF768ファミリーのメンバー、PRPF4Bファミリーのメンバー、NHLHファミリーのメンバー、GRHLファミリーのメンバー、OTXファミリーのメンバー、PRRXファミリーのメンバー、OTPファミリーのメンバー、DACHファミリーのメンバー、C2orf50ファミリーのメンバー、PIH1Dファミリーのメンバー、KLFファミリーのメンバー（但し、Klf1、Klf2、Klf4およびKlf5を除く）、HOXファミリーのメンバー、BTGファミリーのメンバー及びHLFファミリーのメンバーからなる群より選択される１種以上の因子をコードする外来性核酸を含む、iPS細胞。
[12] OVOL2、ZBTB8A、ZBTB43、ZNF202、ZNF383、NR5A1、ZSCAN4、ZNF768、PRPF4B、NHLH1、GRHL1、OTX2、PRRX2、OTP、DACH2、C2orf50、PIH1D1、KLF15、HOXB5、BTG1及びHLFからなる群より選択される１種以上の因子をコードする外来性核酸を含む、上記[11]記載のiPS細胞。
[13] 少なくとも１種の外来性核酸がゲノムに組み込まれている、上記[11]記載のiPS細胞。
[14] 上記[11]記載のiPS細胞に分化誘導処理を行い、体細胞に分化させることを含む、体細胞の製造方法。
[15] OVOLファミリーのメンバー、ZBTB8ファミリーのメンバー、ZBTB43ファミリーのメンバー、ZNF202ファミリーのメンバー、ZNF383ファミリーのメンバー、NR5Aファミリーのメンバー、ZSCAN4ファミリーのメンバー、ZNF768ファミリーのメンバー、PRPF4Bファミリーのメンバー、NHLHファミリーのメンバー、GRHLファミリーのメンバー、OTXファミリーのメンバー、PRRXファミリーのメンバー、OTPファミリーのメンバー、DACHファミリーのメンバー、C2orf50ファミリーのメンバー、PIH1Dファミリーのメンバー、KLFファミリーのメンバー（但し、Klf1、Klf2、Klf4およびKlf5を除く）、HOXファミリーのメンバー、BTGファミリーのメンバー及びHLFファミリーのメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1種以上の物質を含有してなる、体細胞からiPS細胞への誘導剤であって、Klf4と組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる物質とともに体細胞に導入されることを特徴とする、剤。
[16] iPS細胞の製造のための、OVOLファミリーのメンバー、ZBTB8ファミリーのメンバー、ZBTB43ファミリーのメンバー、ZNF202ファミリーのメンバー、ZNF383ファミリーのメンバー、NR5Aファミリーのメンバー、ZSCAN4ファミリーのメンバー、ZNF768ファミリーのメンバー、PRPF4Bファミリーのメンバー、NHLHファミリーのメンバー、GRHLファミリーのメンバー、OTXファミリーのメンバー、PRRXファミリーのメンバー、OTPファミリーのメンバー、DACHファミリーのメンバー、C2orf50ファミリーのメンバー、PIH1Dファミリーのメンバー、KLFファミリーのメンバー（但し、Klf1、Klf2、Klf4およびKlf5を除く）、HOXファミリーのメンバー、BTGファミリーのメンバー及びHLFファミリーのメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1種以上の物質の使用であって、該物質が、Klf4と組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる物質とともに体細胞に導入されることを特徴とする、使用。
[17] 体細胞からのiPS細胞の誘導剤としての、OVOLファミリーのメンバー、ZBTB8ファミリーのメンバー、ZBTB43ファミリーのメンバー、ZNF202ファミリーのメンバー、ZNF383ファミリーのメンバー、NR5Aファミリーのメンバー、ZSCAN4ファミリーのメンバー、ZNF768ファミリーのメンバー、PRPF4Bファミリーのメンバー、NHLHファミリーのメンバー、GRHLファミリーのメンバー、OTXファミリーのメンバー、PRRXファミリーのメンバー、OTPファミリーのメンバー、DACHファミリーのメンバー、C2orf50ファミリーのメンバー、PIH1Dファミリーのメンバー、KLFファミリーのメンバー（但し、Klf1、Klf2、Klf4およびKlf5を除く）、HOXファミリーのメンバー、BTGファミリーのメンバー及びHLFファミリーのメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される物質であって、Klf4と組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる物質とともに体細胞に導入されることを特徴とする、物質。
[18] 体細胞の製造における、上記[11]記載のiPS細胞の使用。
[19] 体細胞の製造における細胞ソースとしての、上記[11]記載のiPS細胞。
　本発明により、OVOLファミリーのメンバー、ZBTB8ファミリーのメンバー、ZBTB43ファミリーのメンバー、ZNF202ファミリーのメンバー、ZNF383ファミリーのメンバー、NR5Aファミリーのメンバー、ZSCAN4ファミリーのメンバー、ZNF768ファミリーのメンバー、PRPF4Bファミリーのメンバー、NHLHファミリーのメンバー、GRHLファミリーのメンバー、OTXファミリーのメンバー、PRRXファミリーのメンバー、OTPファミリーのメンバー、DACHファミリーのメンバー、C2orf50ファミリーのメンバー、PIH1Dファミリーのメンバー、KLFファミリーのメンバー、HOXファミリーのメンバー、BTGファミリーのメンバー及びHLFファミリーのメンバーが、核初期化におけるKlf4の機能を代替し得ることが明らかになった。これらの核初期化物質の作用機序を研究することにより、核初期化メカニズムの解明がさらに進むことが期待される。また、ES細胞で特異的に発現している遺伝子以外の遺伝子が、本発明により新たに核初期化物質として同定されたことは、未知の核初期化物質が今後もさらに見出される可能性を示唆している。
図１は、ヒトGateway(登録商標)エントリークローン（N. Goshima et al., Nature methods, 2008）から機能別エントリークローンを絞り込むまでのステップを示した概念図である。 図２は、転写因子のエントリークローンから体細胞初期化因子スクリーニング用の転写因子ライブラリーを作製した手順を示す図である。 図３は、3遺伝子（Oct3/4, Sox2, c-Myc）と表2に示す各遺伝子との計4種の遺伝子をレトロウイルスでNanog-GFPマウスの皮膚由来線維芽細胞に導入して得られたGFP陽性コロニーの形態を示す写真である（1stスクリーニング）。各コロニーにつき3枚ずつの写真のうち、左はGFP陽性コロニー像、中央は位相差像、右はGFP陽性コロニー像と位相差像とを重ね合わせた写真を示す。 図４および図５は、図３と同じ実験を再度行って得られたGFP陽性コロニーの形態を示す写真である（2ndスクリーニング）。各コロニーにつき3枚ずつの写真のうち、左はGFP陽性コロニー像、中央は位相差像、右はGFP陽性コロニー像と位相差像とを重ね合わせた写真を示す。P0はコロニー樹立時、P1は1継代目（24ウエル）、P2は2継代目（6ウエル）を示す。Y007-F4、Y010-A1、Y010-C3、Y010-D4およびY010-G3については継代実験を行わなかった。 図４および図５は、図３と同じ実験を再度行って得られたGFP陽性コロニーの形態を示す写真である（2ndスクリーニング）。各コロニーにつき3枚ずつの写真のうち、左はGFP陽性コロニー像、中央は位相差像、右はGFP陽性コロニー像と位相差像とを重ね合わせた写真を示す。P0はコロニー樹立時、P1は1継代目（24ウエル）、P2は2継代目（6ウエル）を示す。Y007-F4、Y010-A1、Y010-C3、Y010-D4およびY010-G3については継代実験を行わなかった。 図６は、3遺伝子（Oct3/4, Sox2, c-Myc）と表3および表4に示す各遺伝子との計4種の遺伝子をレトロウイルスでNanog-GFPマウスの皮膚由来線維芽細胞に導入して得られたGFP陽性コロニーの形態を示す写真である。各コロニーにつき3枚ずつの写真のうち、左はGFP陽性コロニー像、中央は位相差像、右はGFP陽性コロニー像と位相差像とを重ね合わせた写真を示す。P0はコロニー樹立時、P1は1継代目（24ウエル）、P2は2継代目（6ウエル）を示す。C2orf50、PIH1D1、KLF15およびHLFについては継代実験を行わなかった。
発明の詳細な説明
　本発明は、Klf4の代替となり得る新規核初期化物質、並びに該物質と、Klf4と組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる核初期化物質とを体細胞に導入することによる、iPS細胞の製造方法を提供する。
(a) 新規核初期化物質（Klf4の代替因子）
　本発明において「核初期化物質」とは、体細胞からiPS細胞を誘導することができる物質（群）であれば、タンパク性因子またはそれをコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。本発明により同定されたKlf4を代替し得る核初期化物質は、OVOLファミリーのメンバー、ZBTB8ファミリーのメンバー、ZBTB43ファミリーのメンバー、ZNF202ファミリーのメンバー、ZNF383ファミリーのメンバー、NR5Aファミリーのメンバー、ZSCAN4ファミリーのメンバー、ZNF768ファミリーのメンバー、PRPF4Bファミリーのメンバー、NHLHファミリーのメンバー、GRHLファミリーのメンバー、OTXファミリーのメンバー、PRRXファミリーのメンバー、OTPファミリーのメンバー、DACHファミリーのメンバー、C2orf50ファミリーのメンバー、PIH1Dファミリーのメンバー、KLFファミリーのメンバー（但し、Klf1、Klf2、Klf4およびKlf5を除く）、HOXファミリーのメンバー、BTGファミリーのメンバーまたはHLFファミリーのメンバーのいずれかのタンパク質またはそれをコードする核酸である。
　OVOL（ovo-like）ファミリーは、ショウジョウバエならびにマウス由来タンパク質に極めて類似したタンパク質をコードする遺伝子ファミリーである。ショウジョウバエのovoタンパク質は、ショウジョウバエの卵形成およびクチクラ形成において極めて重要な役割を有する。一方マウスにおいては、ovoタンパク質は毛形成と精子形成への関与が認められるが、ヒトにおける役割は明らかとはなっていない。この遺伝子ファミリーのメンバーとして、OVOL1、OVOL2、OVOL3などが挙げられる。好ましくはOVOL2が例示されるが、これに限定されない。
　ZBTB8（zinc finger and BTB domain containing protein 8）ファミリーは、1つのBTB (broad-complex, tramtrack and bric a brac) 領域と2つのC2H2型 Zincフィンガー領域とを有する、441個のアミノ酸からなる核タンパク質をコードする遺伝子ファミリーである。BTBはPOZ (poxvirus and zinc finger)と呼ばれることもあるが、これら領域を含むタンパク質はクロマチンの構造と機能を制御することによって、転写制御に関与しているものと考えられている。この遺伝子ファミリーのメンバーとして、ZBTB8A、ZBTB8Bなどが挙げられる。好ましくはZBTB8Aが例示されるが、これに限定されない。
　ZBTB43（zinc finger and BTB domain containing protein 43）は、クルッペルC2H2型 Zincフィンガー領域を有するタンパク質ファミリーに属している。1つのBTB（POZ）領域および3つのC2H2型 Zincフィンガー領域を含み、ZBTB8ファミリーと同様に転写制御に関与するものと考えられている。ZBTB43ファミリーの他のメンバーとしては、例えば配列類似性に基づいてZBTB9等が挙げられるが、1つのBTB（POZ）領域および約3個のC2H2型 Zincフィンガー領域を含み、かつZBTB43もしくはZBTB43と相互作用する転写調節因子が認識するシス因子を認識してZBTB43と同質の転写制御活性を示すタンパク質をコードする遺伝子であればこれに限定されない。ここで「同質の転写制御活性」とは転写制御の方向性（上方制御または下方制御）が同一であることを意味し、その程度は同等であることが好ましいが、異なっていてもよい（例えば、約0.5-約2倍）。
　ZNF202（zinc finger protein 202）は脂質代謝に関与する遺伝子に数多く見られるシス因子に結合する転写リプレッサーである。ZNF202ファミリーの他のメンバーとしては、例えば配列類似性に基づいてZNF496、ZNF446等が挙げられるが、SCANボックスおよび3-8個のC2H2型 Zincフィンガー領域を含み、かつZNF202もしくはZNF202と相互作用する転写調節因子が認識するシス因子を認識してZNF202と同質の転写制御活性を示すタンパク質をコードする遺伝子であればこれらに限定されない。ここで「同質の転写制御活性」とは前記と同義である。
　ZNF383（zinc finger protein 383）は、C2H2型 Zincフィンガー領域を有するタンパク質であり、細胞中における当該ZNF383の過剰発現がAP-1（activator protein 1）およびSRE（serum response element）による転写活性化を抑制することから、ZNF383はマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）シグナル伝達経路におけるリプレッサー因子であると考えられている。ZNF383ファミリーの他のメンバーとしては、例えば配列類似性に基づいてZNF582、ZNF613、ZNF345、ZNF135、ZNF30、ZFP14等が挙げられるが、10-18個のC2H2型 Zincフィンガー領域を含み、かつ上記の転写抑制活性を示すタンパク質をコードする遺伝子であればこれらに限定されない。
　NR5A（nuclear receptor subfamily 5）ファミリーは、性別を司る転写アクティベーターとなるタンパク質をコードする遺伝子ファミリーである。詳しくは、生殖腺（卵巣及び精巣）や腎臓を取り巻く副腎の成長に関わる遺伝子の活動を制御するSteroidogenic factor-1（SF-1）と呼ばれる転写因子の産生に関わる。この遺伝子ファミリーのメンバーとして、NR5A1およびNR5A2などが挙げられる。好ましくはNR5A1が例示されるが、これに限定されない。
　ZSCAN4（zinc finger and SCAN domain containing 4）は、テロメアに含まれるタンパク質をコードする遺伝子である。ES細胞はゲノムが安定であることが知られており、正常な核型を失わずに不死性が維持されるが、ZSCAN4タンパク質がこうした細胞でのテロメアとゲノムの安定性維持にかかわっていることがこれまでに明らかにされている（Nature, 7290, 858-863 (2010)）。ZSCAN4ファミリーの他のメンバーとしては、SCANボックスおよび約4個のC2H2型 Zincフィンガー領域を含み、かつテロメアとゲノムの安定性維持に関わるタンパク質をコードする任意の遺伝子が挙げられる。
　ZNF768（zinc finger protein 768）はクルッペルC2H2型 Zincフィンガー領域を有するタンパク質ファミリーの一種であり、転写制御に関わると考えられている。ZNF768ファミリーの他のメンバーとしては、例えば配列類似性に基づいてZNF648等が挙げられるが、約10個のC2H2型 Zincフィンガー領域を含み、かつZNF768が認識するシス因子を認識してZNF768と同質の転写制御活性を示すタンパク質をコードする遺伝子であればこれに限定されない。ここで「同質の転写制御活性」とは前記と同義である。
　PRPF4B（PRP4 pre-mRNA processing factor 4 homolog B）は、セリン/アルギニンリッチタンパク質キナーゼおよびサイクリン依存性キナーゼ（CDK）を含むキナーゼファミリーに属しているタンパク質である。PRPF4BはMAPKとのホモロジーを有するCDK様キナーゼ（Clk）であると考えられており、プレmRNAスプライシングに関与する。PRPF4Bファミリーの他のメンバーとしては、キナーゼドメインおよびATP結合領域を含み、かつPRPF4Bがリン酸化するタンパク質を認識してリン酸化するタンパク質をコードする任意の遺伝子が挙げられる。
　NHLH（nescient helix loop helix ）ファミリーは、数多くの組織および種の生成と成長において重要な役割を果たす転写因子ファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子ファミリーである。これらファミリーの内、MYC (MIM 190080)、LYL1 (MIM 151440)、 E2A (MIM 147141)、 SCL (MIM 187040)の4種類については、染色体の転座を通じての腫瘍形成への明らかな関与が認められている。この遺伝子ファミリーのメンバーとして、NHLH1およびNHLH2などが挙げられる。好ましくはNHLH1が例示されるが、これに限定されない。
　GRHL(grainyhead-like)ファミリーは、ホモ二量体もしくはヘテロ二量体転写因子であるgrainyheadを構成するタンパク質をコードする遺伝子ファミリーである。この遺伝子ファミリーのメンバーとして、GRHL1、GRHL2およびGRHL3などが挙げられる。好ましくはGRHL1が例示されるが、これに限定されない。
　OTX（orthodenticle homeobox）ファミリーは、ホメオドメインを有し、脳および感覚器官の成長に関与する転写因子のbicoidサブファミリーのタンパク質をコードする遺伝子ファミリーである。この遺伝子ファミリーのメンバーとして、OTX1およびOTX2などが挙げられる。好ましくはOTX2が例示されるが、これに限定されない。
　PRRX（paired related homeobox）ファミリーは、ホメオボックスの一部となるDNA結合タンパク質をコードする遺伝子ファミリーである。急速に増殖した胎児線維芽細胞において発現が認められ、真皮層において成長すると共に、成人の皮膚細胞においては発現量が低下する。これらの発現量の変化パターンから、PRRXは皮膚損傷時における真皮細胞の再生等の修復工程、ならびに、細胞増殖に深く関与している可能性があると考えられている。この遺伝子ファミリーのメンバーとして、PPRX1およびPPRX2などが挙げられる。好ましくはPPRX2が例示されるが、これに限定されない。
　OTP（orthopedia homeobox）は、細胞の運命を決定する上で重要な役割を果たすへリックス・ターン・へリックス構造を有する転写因子であるホメオドメインファミリータンパク質をコードする遺伝子である。当該タンパク質は脳の成長に関与すると考えられている。OTPファミリーの他のメンバーとしては、ホメオボックスドメインおよびOARモチーフを含み、かつOTPが認識するシス因子を認識してOTPと同質の転写制御活性を示すタンパク質をコードする任意の遺伝子が挙げられる。ここで「同質の転写制御活性」とは前記と同義である。
　DACH（dachshund homolog）ファミリーは、ショウジョウバエにおける眼、肢、生殖盤への細胞運命決定に関わる転写因子であるdachshundタンパク質に類似のタンパク質をコードする遺伝子ファミリーである。これらのタンパク質は、dachshundタンパク質に特徴的な、DNAとの結合において必要なN末端領域と、タンパク質―タンパク質間相互作用に必要なC末端領域とを有する。当該タンパク質はX染色体中に含まれており、DNAのメチル化に伴い活性を失う。また、当該タンパク質は器官形成と筋形成の制御にも関与し、早発卵巣不全にも関係があると考えられている。この遺伝子ファミリーのメンバーとして、DACH1およびDACH2などが挙げられる。好ましくはDACH2が例示されるが、これに限定されない。
　C2orf50（chromosome 2 open reading frame 50）にコードされるタンパク質の詳しい機能については明らかとなってはいないが、例えばWO2010/074924においてその開示がある。C2orf50ファミリーの他のメンバーとしては、表１に示されるC2orf50のアミノ酸配列と60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上の類似性を有し、かつC2orf50と同質の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。ここで「同質の生理活性」とは、生理学上もしくは薬理学上、定性的に同一の活性を意味し、活性の程度は同等であることが好ましいが、異なっていてもよい（例えば、約0.5-約2倍）。また、ここでアミノ酸配列の「類似性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて2つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（%）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はタンパク質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science, 247：1306-1310 (1990)を参照）。本明細書におけるアミノ酸配列の類似性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。
　PIH1D（PIH1 domain containing）ファミリーは、アポトーシス経路において調整機序に関わると考えられている遺伝子ファミリーである。この遺伝子ファミリーのメンバーとして、PIH1D1およびPIH1D2などが挙げられる。好ましくはPIH1D1が例示されるが、これに限定されない。
　KLF（Kruppel-like factor）ファミリーは増殖、分化、発生、アポトーシス等の種々の生物学的プロセスを制御する転写因子であるが(McConnell, B.B. et al., Bioassays, 29: 549-557 (2007))、詳しい働きはよくわかっていない。KLFファミリーは3つのC2H2型 Zincフィンガー領域を有している。この遺伝子ファミリーのメンバーとして、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16、KLF17、SP1、SP2、SP3、SP4、SP5、SP6、SP7、SP8およびSP 9などが挙げられる。好ましくはKLF15が例示されるが、これに限定されない。
　HOX（homeobox）ファミリーは、アンテナペディアホメオティック遺伝子を含むホメオボックスの一部であり、DNA結合領域を有する核タンパク質をコードする遺伝子ファミリーである。17番染色体に位置するホメオボックスB遺伝子内のクラスターに含まれており、それらがコードするタンパク質は肺および腸の発育に関わる配列特異的転写因子として機能する。当該遺伝子の発現増加は、急性骨髄性白血病（AML）、気管支肺分離片形成症（BPS）、先天性嚢胞状腺腫様形成異常（CCAM）に関与すると考えられている。この遺伝子ファミリーのメンバーとして、HOXA5、HOXB5およびHOXC5などが挙げられる。好ましくはHOXB5が例示されるが、これに限定されない。
　BTG（B-cell translocation gene, anti-proliferative）ファミリーは、細胞の成長と分化に関わる抗増殖性遺伝子の一種である。細胞周期のG0/G1期において当該遺伝子の発現量が最も高まり、G1期を過ぎてからは抑制される。当該遺伝子にコードされたタンパク質は様々な核内受容体と反応し、細胞分化時には補助活性因子として作用する。B細胞性慢性リンパ性白血病においては、t（8；14）（q24；q32）転座が認められる。この遺伝子ファミリーのメンバーとして、BTG1、BTG2、BTG3、TOB1およびTOB2などが挙げられる。好ましくはBTG1が例示されるが、これに限定されない。
　HLF（hepatic leukemia factor）ファミリーは、bZIP（basic region leucine-zipper）型転写因子の一部分を構成するプロリンリッチ（PAR）タンパク質をコードする遺伝子ファミリーに属する。当該遺伝子にコードされたタンパク質はホモ二量体もしくは他のPARファミリーとのヘテロ二量体の形態で存在し、配列特異的プロモーター因子と結合して転写を開始する。染色体の転座に由来するE2A-HLF融合転写因子は、小児白血病の原因子である。この遺伝子ファミリーのメンバーとして、HLF、TEFおよびDBPなどが挙げられる。好ましくはHLFが例示されるが、これに限定されない。
　OVOLファミリーのメンバー、ZBTB8ファミリーのメンバー、ZBTB43ファミリーのメンバー、ZNF202ファミリーのメンバー、ZNF383ファミリーのメンバー、NR5Aファミリーのメンバー、ZSCAN4ファミリーのメンバー、ZNF768ファミリーのメンバー、PRPF4Bファミリーのメンバー、NHLHファミリーのメンバー、GRHLファミリーのメンバー、OTXファミリーのメンバー、PRRXファミリーのメンバー、OTPファミリーのメンバー、DACHファミリーのメンバー、C2orf50ファミリーのメンバー、PIH1Dファミリーのメンバー、KLFファミリーのメンバー（但し、Klf1、Klf2、Klf4およびKlf5を除く）、HOXファミリーのメンバー、BTGファミリーのメンバー及びHLFファミリーのメンバーとしては、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、マーモセット、ウサギ等）由来のタンパク質またはそれをコードする核酸を用いることができるが、ヒト又はマウス由来のものが好ましい。ヒト及びマウス由来の上記核初期化物質のアミノ酸配列およびcDNA配列情報は、表1に記載されるNCBI accession numbersを参照することにより取得することができ、当業者は、該cDNA配列情報に基づいて容易に各タンパク質をコードする核酸を単離し、また必要に応じて、組換えタンパク質を製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　また、上記の各アミノ酸配列と90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有し、且つKlf4の代替因子として野生型タンパク質と同等の核初期化能力を有する天然もしくは人工の変異タンパク質及びそれをコードする核酸も、本発明のKlf4を代替する核初期化物質として利用することができる。
　OVOLファミリーのメンバー、ZBTB8ファミリーのメンバー、ZBTB43ファミリーのメンバー、ZNF202ファミリーのメンバー、ZNF383ファミリーのメンバー、NR5Aファミリーのメンバー、ZSCAN4ファミリーのメンバー、ZNF768ファミリーのメンバー、PRPF4Bファミリーのメンバー、NHLHファミリーのメンバー、GRHLファミリーのメンバー、OTXファミリーのメンバー、PRRXファミリーのメンバー、OTPファミリーのメンバー、DACHファミリーのメンバー、C2orf50ファミリーのメンバー、PIH1Dファミリーのメンバー、KLFファミリーのメンバー（但し、Klf1、Klf2、Klf4およびKlf5を除く）、HOXファミリーのメンバー、BTGファミリーのメンバー及びHLFファミリーのメンバー（それらをコードする核酸を含む）は、いずれか1種のみを用いてもよいし、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
(b) Klf4と組み合わせることによりiPS細胞を誘導しうる核初期化物質
　これまで、体細胞からiPS細胞を誘導し得る核初期化物質の組み合わせの中でKlf4を含むものとしては、以下の組み合わせが知られている（以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する）。
(1) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(2) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2（ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、c-MycはT58A（活性型変異体）, N-Myc, L-Mycで置換可能である。）
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, β-catenin (活性型変異体S33Y)
(4) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6
(6) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7
(7) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmil
（以上、WO 2007/069666を参照（但し、上記(2)の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Cell,126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007) 等も参照。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40 Large T」の組み合わせについては、Nature, 451, 141-146 (2008)も参照）
(9) Oct3/4, Klf4, Sox2（Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）
(10) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28（Cell Research (2008) 600-603を参照）
(11) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SV40 Large T（Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)も参照）
(12) Oct3/4, Klf4（Nature, 454, 646-650 (2008)、Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008）を参照）
(13) Oct3/4, Klf4, L-Myc
(14) Oct3/4, Sox2, Klf4, Tbx3 (Nature. 463:1096-100 (2010)を参照)
　したがって、Klf4と組み合わせることによりiPS細胞を誘導しうる核初期化物質としては、上記(1)-(14)の組み合わせからKlf4を除いた物質の組み合わせ、即ち、
(i) Oct3/4, c-Myc
(ii) Oct3/4, c-Myc, Sox2（Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能。c-MycはT58A（活性型変異体）, N-Myc, L-Mycで置換可能。）
(iii) Oct3/4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, β-catenin (活性型変異体S33Y)
(iv) Oct3/4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T
(v) Oct3/4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6
(vi) Oct3/4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7
(vii) Oct3/4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7
(viii) Oct3/4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmil
(ix) Oct3/4, Sox2
(x) Oct3/4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28
(xi) Oct3/4, c-Myc, Sox2, SV40 Large T
(xii) Oct3/4
(xiii) Oct3/4, L-Myc、並びに
(xiv) Oct3/4, Sox2, Tbx3
が好ましく例示される。また、上記(i)-(xiv)において、Oct3/4に代えて他のOctファミリーのメンバー、例えばOct1A、Oct6などを用いることもできる。さらに、Sox2（またはSox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18）に代えて他のSoxファミリーのメンバー、例えばSox7などを用いることもできる。さらに、好ましい一実施態様においては、c-Mycに代えてL-Mycが用いられる。別の好ましい一実施態様においては、Lin28に代えてLin28Bが用いられる。
　以上を総合すると、Klf4と組み合わせることによりiPS細胞を誘導しうる核初期化物質は、好ましくは、Octファミリーのメンバー（例: Oct3/4、Oct1A、Oct6）、Soxファミリーのメンバー（例: Sox2、Sox1、Sox3、Sox7、Sox15、Sox17、Sox18）、Mycファミリーのメンバー（例: c-Myc、n-Myc、L-Myc）、Nanog及びLinファミリーのメンバー（例: Lin28、Lin28b）から選択される。より好ましくは、少なくともOct3/4を含み、かつ任意でSox2及び/又はc-MycもしくはL-Mycを含んでいてもよい組み合わせ（即ち、(a) Oct3/4、(b) Oct3/4+Sox2、(c) Oct3/4+c-MycもしくはL-Myc、(d) Oct3/4+Sox2+c-MycもしくはL-Mycのいずれか）が挙げられ、これにさらにNanog及び/又はLin28もしくはLin28Bを組み合わせて用いてもよい。
　さらに、上記(i)-(xiv)には該当しないが、それらのいずれかにおける構成要素をすべて含み、且つ任意の他の物質をさらに含む組み合わせも、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。例えば、他の物質として、Klf4および本発明のKlfファミリーのメンバー以外のKlfファミリーメンバー（例: Klf1、Klf2、Klf5）もしくは公知のその代替因子（例: Esrrb、EsrrgなどのEsrrファミリーのメンバー）等を組み合わせてもよい。また、核初期化の対象となる体細胞が上記(i)-(xiv)のいずれかにおける構成要素の一部を、核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該構成要素を除いた残りの構成要素のみの組み合わせもまた、本発明における「Klf4と組み合わせることによりiPS細胞を誘導しうる核初期化物質」の範疇に含まれ得る。
　これらの組み合わせの中で、得られるiPS細胞を治療用途に用いることを念頭においた場合、Oct3/4及びSox2の2因子の組み合わせ（即ち、上記(ix)）、またはOct3/4、Sox2及びL-Mycの3因子の組み合わせ（即ち、上記(ii))が好ましい。一方、iPS細胞を治療用途に用いることを念頭に置かない場合（例えば、創薬スクリーニング等の研究ツールとして用いる場合など)は、Oct3/4、c-Myc（またはL-Myc)、Sox2及びLin28（またはLin28B）の4因子か、それにNanogを加えた5因子（即ち、上記(x)）が好ましい。但し、薬剤の薬効および／または毒性評価系としての使用を目的とする場合でも、腫瘍化細胞の混入による試験データの信頼性の低下を考慮すれば、c-Myc等の腫瘍化の原因となり得る核初期化物質の使用を避けることが望ましい。
　上記の各タンパク性因子のマウス及びヒトcDNA配列情報は、WO 2007/069666に記載のNCBI accession numbersを参照することにより取得することができ（Nanogは当該公報中では「ECAT4」との名称で記載されている。尚、Lin28、Lin28B、Esrrb、Esrrg、L-MycおよびTbx3のマウス及びヒトcDNA配列情報は、それぞれ下記NCBI accession numbersを参照することにより取得できる。）、当業者は容易にこれらのcDNAを単離することができる。
遺伝子名　　マウス　　　　　ヒト　　　
Lin28　　　 NM_145833　　　 NM_024674
Lin28b　　　NM_001031772　　NM_001004317
Esrrb　　　 NM_011934　　　 NM_004452
Esrrg　　　 NM_011935　　　 NM_001438
L-Myc　　　 NM_008506　　　 NM_001033081
Tbx3 　　　 NM_011535　　　 NM_005996
　核初期化物質としてタンパク性因子自体を用いる場合には、得られたcDNAを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入し、該細胞を培養して得られる培養物から組換えタンパク性因子を回収することにより調製することができる。一方、核初期化物質としてタンパク性因子をコードする核酸を用いる場合、得られたcDNAを、ウイルスベクターもしくはプラスミドベクターに挿入して発現ベクターを構築し、核初期化工程に供される。
　尚、Klf4と組み合わせることによりiPS細胞を誘導しうる核初期化物質としては、Klf4とともに体細胞に導入した場合に該体細胞をiPS細胞に変換し得る限り、上記した従来公知のタンパク性因子もしくはそれをコードする核酸の組み合わせのみならず、新たに見出されるタンパク性因子もしくはそれをコードする核酸の組み合わせをも包含し、さらには、低分子化合物等の非タンパク性因子を含む組み合わせも包含し得る。
(c) 体細胞ソース
　本発明においてiPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット等）由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞(体性幹細胞も含む)であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
　体細胞を採取するソースとなる哺乳動物個体は特に制限されないが、得られるiPS細胞がヒトの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、患者本人またはHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から体細胞を採取することが特に好ましい。ここでHLAの型が「実質的に同一」とは、免疫抑制剤などの使用により、該体細胞由来のiPS細胞から分化誘導することにより得られた細胞を患者に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にHLAの型が一致していることをいう。たとえば主たるHLA(例えばHLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座、あるいはさらにHLA-C遺伝子座を加えた4遺伝子座）が同一である場合などが挙げられる（以下同じ）。また、ヒトに投与（移植）しない場合、例えば、患者の薬剤感受性や副作用の有無を評価するためのスクリーニング用の細胞のソースとしてiPS細胞を使用する場合には、同様に患者本人または薬剤感受性や副作用と相関する遺伝子多型が同一である他人から体細胞を採取することが望ましい。
　哺乳動物から分離した体細胞は、核初期化工程に供するに先立って、細胞の種類に応じてその培養に適した自体公知の培地で前培養することができる。そのような培地としては、例えば、約5～20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地などが挙げられるが、それらに限定されない。核初期化物質（さらに必要に応じて、後述するiPS細胞の樹立効率改善物質）との接触に際し、例えば、カチオニックリポソームなど導入試薬を用いる場合には、導入効率の低下を防ぐため、無血清培地に交換しておくことが好ましい場合がある。
(d) 核初期化物質の体細胞への導入方法
　前記(a)の「Klf4を代替し得る核初期化物質」及び前記(b)の「Klf4と組み合わせることによりiPS細胞を誘導しうる核初期化物質」の体細胞への導入は、該物質がタンパク性因子である場合、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（PTD）もしくは細胞透過性ペプチド（CPP）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent（Gene Therapy Systmes）、Pro-JectTM Protein Transfection Reagent（PIERCE）及びProVectin（IMGENEX）、脂質をベースとしたProfect-1（Targeting Systems）、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrain Peptide（Q biogene）及びChariot Kit（Active Motif）、HVJエンベロープ（不活化センダイウイルス）を利用したGenomONE（石原産業）等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。核初期化物質を適当な溶媒（例えば、PBS、HEPES等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて室温で5-15分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して37℃で１ないし数時間インキュベートする。その後培地を除去して血清含有培地に交換する。
　PTDとしては、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT(Frankel, A. et al, Cell 55, 1189-93 (1988); Green, M. & Loewenstein, P.M. Cell 55, 1179-88 (1988))、Penetratin (Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50 (1994))、Buforin II (Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50 (2000))、Transportan (Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67-77 (1998))、MAP (model amphipathic peptide) (Oehlke, J. et al. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39 (1998))、K-FGF (Lin, Y. Z. et al. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258 (1995))、Ku70 (Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003))、Prion (Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90 (2002))、pVEC (Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44 (2001))、Pep-1 (Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-6 (2001))、Pep-7 (Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65 (2002))、SynBl (Rousselle, C. et al. MoI. Pharmacol. 57, 679-86 (2000))、HN-I (Hong, F. D. & Clayman, G L. Cancer Res. 60, 6551-6 (2000))、HSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。PTD由来のCPPとしては、11R (Cell Stem Cell, 4:381-384(2009)) や9R (Cell Stem Cell, 4:472-476(2009))等のポリアルギニンが挙げられる。
　核初期化物質のcDNAとPTD配列もしくはCPP配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して組換え発現させ、融合タンパク質を回収して導入に用いる。導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。
　マイクロインジェクションは、先端径1μm程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。
　その他、エレクトロポレーション法、セミインタクトセル法（Kano, F. et al. Methods in Molecular Biology, Vol. 322, 357-365(2006))、Wr-t ペプチドによる導入法（Kondo, E. et al., Mol. Cancer Ther. 3(12), 1623-1630(2004))などのタンパク質導入法も用いることができる。
　タンパク質導入操作は1回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、又は1回以上5回以下等）行うことができ、好ましくは導入操作を2回以上（たとえば3回又は4回）繰り返して行うことができる。導入操作を繰り返し行う場合の間隔としては、例えば6時間～7日間、好ましくは12～48時間もしくは7日間が挙げられる。
　iPS細胞の樹立効率を重視するのであれば、核初期化物質を、タンパク性因子自体としてではなく、それをコードする核酸の形態で用いることがむしろ好ましい。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。好ましくは該核酸は二本鎖DNA、特にcDNAである。
　核初期化物質のcDNAは、宿主となる体細胞で機能し得るプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド（例、pA1-11，pXT1，pRc/CMV，pRc/RSV，pcDNAI/Neo）などが用いられ得る。
　用いるベクターの種類は、得られるiPS細胞の用途に応じて適宜選択することができる。例えば、アデノウイルスベクター、プラスミドベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが使用され得る。
　発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばEF1αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、EF1αプロモーター、CAGプロモーター、MoMuLV LTR、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
　発現ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子、SV40複製起点などを含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
　核初期化物質である核酸（初期化遺伝子）は、各々別個の発現ベクター上に組み込んでもよいし、1つの発現ベクターに2種類以上、好ましくは2～3種類の遺伝子を組み込んでもよい。遺伝子導入効率の高いレトロウイルスやレンチウイルスベクターを用いる場合は前者が、プラスミド、アデノウイルス、エピソーマルベクターなどを用いる場合は後者を選択することが好ましい。さらに、2種類以上の遺伝子を組み込んだ発現ベクターと、1遺伝子のみを組み込んだ発現ベクターとを併用することもできる。
　上記において複数の初期化遺伝子を1つの発現ベクターに組み込む場合、これら複数の遺伝子は、好ましくはポリシストロニック発現を可能にする配列を介して発現ベクターに組み込むことができる。ポリシストロニック発現を可能にする配列を用いることにより、1種類の発現ベクターに組み込まれている複数の遺伝子をより効率的に発現させることが可能になる。ポリシストロニック発現を可能にする配列としては、例えば、口蹄疫ウイルスの2A配列（PLoS ONE3, e2532, 2008、Stem Cells 25, 1707, 2007）、IRES配列（U.S. Patent No. 4,937,190）など、好ましくは2A配列を用いることができる。
　核初期化物質である核酸を含む発現ベクターは、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターの場合、該核酸を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞（例、Plat-E細胞）や相補細胞株（例、293細胞）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させる。例えば、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる具体的手段が WO2007/69666、Cell, 126, 663-676 (2006) 及び Cell, 131, 861-872 (2007) に開示されており、ベクターとしてレンチウイルスベクターを用いる場合については、Science, 318, 1917-1920 (2007) に開示がある。iPS細胞を再生医療のための細胞ソースとして利用する場合、初期化遺伝子の発現（再活性化）は、iPS細胞由来の分化細胞から再生された組織における発癌リスクを高める可能性があるので、初期化遺伝子は細胞の染色体に組み込まれず、一過的に発現することが好ましい。かかる観点からは、染色体への組込みが稀なアデノウイルスベクターの使用が好ましい。アデノウイルスベクターを用いる具体的手段は、Science, 322, 945-949 (2008) に記載されている。また、アデノ随伴ウイルスも染色体への組込み頻度が低く、アデノウイルスベクターと比べて細胞毒性や炎症惹起作用が低いので、別の好ましいベクターとして挙げられる。センダイウイルスベクターは染色体外で安定に存在することができ、必要に応じてsiRNAにより分解除去することができるので、同様に好ましく利用され得る。センダイウイルスベクターについては、J. Biol. Chem., 282, 27383-27391 (2007) や特許第3602058号に記載のものを用いることができる。
　レトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターを用いる場合は、いったん導入遺伝子のサイレンシングが起こったとしても、後に再活性化される可能性があるので、例えば、Cre/loxPシステムを用いて、不要となった時点で核初期化物質をコードする核酸を切り出す方法が好ましく用いられ得る。即ち、該核酸の両端にloxP配列を配置しておき、iPS細胞が誘導された後で、プラスミドベクターもしくはアデノウイルスベクターを用いて細胞にCreリコンビナーゼを作用させ、loxP配列に挟まれた領域を切り出すことができる。また、LTR U3領域のエンハンサー－プロモーター配列は、挿入突然変異によって近傍の宿主遺伝子を上方制御する可能性があるので、当該配列を欠失、もしくはSV40などのポリアデニル化配列で置換した3’-自己不活性化（SIN）LTRを使用して、切り出されずゲノム中に残存するloxP配列より外側のLTRによる内因性遺伝子の発現制御を回避することがより好ましい。Cre-loxPシステムおよびSIN LTRを用いる具体的手段は、Chang et al., Stem Cells, 27: 1042-1049 (2009) に開示されている。
　一方、非ウイルスベクターであるプラスミドベクターの場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。ベクターとしてプラスミドを用いる具体的手段は、例えばScience, 322, 949-953 (2008) 等に記載されている。
　プラスミドベクターやアデノウイルスベクター等を用いる場合、遺伝子導入は1回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、又は1回以上5回以下など）行うことができる。2種以上の発現ベクターを体細胞に導入する場合には、これらの全ての種類の発現ベクターを同時に体細胞に導入することが好ましいが、この場合においても、導入操作は１回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、又は1回以上5回以下など）行うことができ、好ましくは導入操作を2回以上(たとえば3回又は4回)繰り返して行うことができる。
　尚、アデノウイルスやプラスミドを用いる場合でも、導入遺伝子が染色体に組み込まれることがあるので、結局はサザンブロットやPCRにより染色体への遺伝子挿入がないことを確認する必要がある。そのため、上記Cre-loxPシステムのように、いったん染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、該遺伝子を除去する手段を用いることは好都合であり得る。別の好ましい一実施態様においては、トランスポゾンを用いて染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、プラスミドベクターもしくはアデノウイルスベクターを用いて細胞に転移酵素を作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるpiggyBac等が挙げられる。piggyBacトランスポゾンを用いる具体的手段は、Kaji, K. et al., Nature, 458: 771-775 (2009)、Woltjen et al., Nature, 458: 766-770 (2009) に開示されている。
　別の好ましい非組込み型ベクターとして、染色体外で自律複製可能なエピゾーマルベクターが挙げられる。エピゾーマルベクターを用いる具体的手段は、Yu et al., Science, 324, 797-801 (2009)に開示されている。必要に応じて、エピソーマルベクターの複製に必要なベクター要素の5’側および3’側にloxP配列を同方向に配置したエピソーマルベクターに初期化遺伝子を挿入した発現ベクターを構築し、これを体細胞に導入することもできる。
　該エピゾーマルベクターとしては、例えば、EBV、SV40等に由来する自律複製に必要な配列をベクター要素として含むベクターが挙げられる。自律複製に必要なベクター要素としては、具体的には、複製開始点と、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子であり、例えば、EBVにあっては複製開始点oriPとEBNA-1遺伝子、SV40にあっては複製開始点oriとSV40 large T antigen遺伝子が挙げられる。
　また、エピゾーマル発現ベクターは、初期化遺伝子の転写を制御するプロモーターを含む。該プロモーターとしては、前記と同様のプロモーターが用いられ得る。また、エピゾーマル発現ベクターは、前記と同様に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子などをさらに含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
　本発明で使用されるloxP配列としては、バクテリオファージP1由来の野生型loxP配列の他、初期化遺伝子の複製に必要なベクター要素を挟む位置に同方向で配置された場合に、組換えを起こしてloxP配列間の配列を欠失させ得る任意の変異loxP配列が挙げられる。変異loxP配列としては、例えば、5’側反復配列に変異のあるlox71、3’側反復配列に変異のあるlox66、スペーサー部分に変異のあるlox2272やlox511などが挙げられる。該ベクター要素の5’側および3’側に配置される2つのloxP配列は、同一であっても異なっていてもよいが、スペーサー部分に変異のある変異loxP配列の場合は同一のもの（例、lox2272同士、lox511同士）が用いられる。好ましくは、5’側反復配列に変異のある変異loxP配列（例、lox71）と3’側反復配列に変異のある変異loxP配列（例、lox66）との組合せが挙げられる。この場合、組換えの結果染色体上に残るloxP配列は5’側および3’側の反復配列に二重変異を有するため、Creリコンビナーゼに認識されにくく、不必要な組換えにより染色体の欠失変異を起こすリスクが低減される。lox71とlox66とを用いる場合、前記ベクター要素の5’側および3’側にいずれの変異loxP配列を配置してもよいが、変異部位がloxP配列の外端に配置されるような向きで変異loxP配列を挿入する必要がある。
　2つのloxP配列は、初期化遺伝子の複製に必要なベクター要素（即ち、複製開始点、または複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子配列）の5’側および3’側に、同方向に配置される。loxP配列が挟むベクター要素は、複製開始点、または複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子配列のいずれか一方だけであってもよいし、両方であってもよい。
　エピソーマルベクターは、例えばリポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。具体的には、例えばScience, 324: 797-801 (2009)等に記載される方法を用いることができる。
　iPS細胞から初期化遺伝子の複製に必要なベクター要素が除去されたか否かの確認は、該ベクター要素内部および／またはloxP配列近傍の塩基配列を含む核酸をプローブまたはプライマーとして用い、該iPS細胞から単離したエピソーム画分を鋳型としてサザンブロット分析またはPCR分析を行い、バンドの有無または検出バンドの長さを調べることにより実施することができる。エピソーム画分の調製は当該分野で周知の方法と用いて行えばよく、例えば、Science, 324: 797-801 (2009)等に記載される方法を用いることができる。
　Klf4と組み合わせることによりiPS細胞を誘導しうる核初期化物質が低分子化合物である場合、該物質の体細胞への導入は、該物質を適当な濃度で水性もしくは非水性溶媒に溶解し、ヒトまたはマウスより単離した体細胞の培養に適した培地（例えば、約5～20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地など）中に、核初期化物質濃度が体細胞において核初期化が起こるのに十分で且つ細胞毒性がみられない範囲となるように該物質溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。核初期化物質濃度は用いる核初期化物質の種類によって異なるが、約0.1nM～約100nMの範囲で適宜選択される。接触期間は細胞の核初期化が達成されるのに十分な時間であれば特に制限はないが、通常は陽性コロニーが出現するまで培地に共存させておけばよい。
(e) iPS細胞の樹立効率改善物質
　従来iPS細胞の樹立効率が低いために、近年、その効率を改善する物質が種々提案されている。よって前記核初期化物質に加え、これら樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をより高めることが期待できる。
　iPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool(登録商標) (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば5’-azacytidine）（Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA（例、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等）等の核酸性発現阻害剤など］、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、UTF1(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）（Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)）、2i/LIF (2iはmitogen-activated protein kinase signallingおよびglycogen synthase kinase-3の阻害剤、PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))、ES細胞特異的miRNA（例えば、miR-302-367クラスター (Mol. Cell. Biol. doi:10.1128/MCB.00398-08)、miR-302 (RNA (2008) 14: 1-10)、miR-291-3p, miR-294およびmiR-295 (以上、Nat. Biotechnol. 27: 459-461 (2009))）、3’-phosphoinositide-dependent kinase-1 (PDK1) acitvator（例、PS48 (Cell Stem Cell, 7: 651-655 (2010)) など）、神経ペプチドY（WO 2010/147395）、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）（WO 2010/068955）等が挙げられるが、それらに限定されない。前記で核酸性の発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
　尚、前記核初期化物質の構成要素のうち、例えばSV40 large T等は、体細胞の核初期化のために必須ではなく補助的な因子であるという点において、iPS細胞の樹立効率改善物質の範疇にも含まれ得る。核初期化の機序が明らかでない現状においては、核初期化に必須の因子以外の補助的な因子について、それらを核初期化物質として位置づけるか、あるいはiPS細胞の樹立効率改善物質として位置づけるかは便宜的であってもよい。即ち、体細胞の核初期化プロセスは、体細胞への核初期化物質およびiPS細胞の樹立効率改善物質の接触によって生じる全体的事象として捉えられるので、当業者にとって両者を必ずしも明確に区別する必要性はないであろう。
　iPS細胞の樹立効率改善物質の体細胞への接触は、該物質が(a) タンパク性因子である場合、(b) 該タンパク性因子をコードする核酸である場合、あるいは(c) 低分子化合物である場合に応じて、核初期化物質についてそれぞれ上記したと同様の方法により、実施することができる。
　iPS細胞の樹立効率改善物質は、該物質の非存在下と比較して体細胞からのiPS細胞樹立効率が有意に改善される限り、核初期化物質と同時に体細胞に接触させてもよいし、また、どちらかを先に接触させてもよい。一実施態様において、例えば、核初期化物質がタンパク性因子をコードする核酸であり、iPS細胞の樹立効率改善物質が化学的阻害物質である場合には、前者は遺伝子導入処理からタンパク性因子を大量発現するまでに一定期間のラグがあるのに対し、後者は速やかに細胞に作用しうることから、遺伝子導入処理から一定期間細胞を培養した後に、iPS細胞の樹立効率改善物質を培地に添加することができる。別の実施態様において、例えば、核初期化物質とiPS細胞の樹立効率改善物質とがいずれもウイルスベクターやプラスミドベクターの形態で用いられる場合には、両者を同時に細胞に導入してもよい。
(f) 培養条件による樹立効率の改善
　体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することにより、iPS細胞の樹立効率をさらに改善することができる。本明細書において「低酸素条件」とは、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、大気中のそれよりも有意に低いことを意味する。具体的には、通常の細胞培養で一般的に使用される5-10% CO2/95-90%大気の雰囲気中の酸素濃度よりも低い酸素濃度の条件が挙げられ、例えば雰囲気中の酸素濃度が18%以下の条件が該当する。好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は15%以下（例、14%以下、13%以下、12%以下、11%以下など）、10%以下（例、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下など）、または5%以下（例、4%以下、3%以下、2%以下など）である。また、雰囲気中の酸素濃度は、好ましくは0.1%以上（例、0.2%以上、0.3%以上、0.4%以上など）、0.5%以上（例、0.6%以上、0.7%以上、0.8%以上、0.95以上など）、または1%以上（例、1.1%以上、1.2%以上、1.3%以上、1.4%以上など）である。
　細胞の環境において低酸素状態を創出する手法は特に制限されないが、酸素濃度の調節可能なCO2インキュベーター内で細胞を培養する方法が最も容易であり、好適な例として挙げられる。酸素濃度の調節可能なCO2インキュベーターは、種々の機器メーカーから販売されている（例えば、Thermo scientific社、池本理化学工業、十慈フィールド、和研薬株式会社などのメーカー製の低酸素培養用CO2インキュベーターを用いることができる）。
　低酸素条件下で細胞培養を開始する時期は、iPS細胞の樹立効率が正常酸素濃度（20％）の場合に比して改善されることを妨げない限り特に限定されず、体細胞への核初期化物質の接触より前であっても、該接触と同時であっても、該接触より後であってもよいが、例えば、体細胞に核初期化物質を接触させた直後から、あるいは接触後一定期間（例えば、1ないし10（例、2,3,4,5,6,7,8または9）日）おいた後に低酸素条件下で培養することが好ましい。
　低酸素条件下で細胞を培養する期間も、iPS細胞の樹立効率が正常酸素濃度（20％）の場合に比して改善されることを妨げない限り特に限定されず、例えば3日以上、5日以上、7日以上または10日以上で、50日以下、40日以下、35日以下または30日以下の期間等が挙げられるが、それらに限定されない。低酸素条件下での好ましい培養期間は、雰囲気中の酸素濃度によっても変動し、当業者は用いる酸素濃度に応じて適宜当該培養期間を調整することができる。また、一実施態様において、iPS細胞の候補コロニーの選択を、薬剤耐性を指標にして行う場合には、薬剤選択を開始する迄に低酸素条件から正常酸素濃度に戻すことが好ましい。
　さらに、低酸素条件下で細胞培養を開始する好ましい時期および好ましい培養期間は、用いられる核初期化物質の種類、正常酸素濃度条件下でのiPS細胞樹立効率などによっても変動する。
　核初期化物質（及びiPS細胞の樹立効率改善物質）を接触させた後、細胞を、例えばES細胞の培養に適した条件下で培養することができる。マウス細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子としてLeukemia Inhibitory Factor（LIF）を添加して培養を行う。一方、ヒト細胞の場合には、LIFの代わりに塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）および／または幹細胞因子（SCF）を添加することが望ましい。また通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞（MEF）の共存下で培養される。MEFとしては、通常STO細胞等がよく使われるが、iPS細胞の誘導には、SNL細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)）等がよく使われている。フィーダー細胞との共培養は、核初期化物質の接触より前から開始してもよいし、該接触時から、あるいは該接触より後（例えば1-10日後）から開始してもよい。
　iPS細胞の候補コロニーの選択は、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法と目視による形態観察による方法とが挙げられる。前者としては、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例えば、Fbx15、Nanog、Oct3/4など、好ましくはNanog又はOct3/4）の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子をターゲッティングした組換え体細胞を用い、薬剤耐性及び／又はレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。そのような組換え体細胞としては、例えばFbx15遺伝子座にβgeo（β-ガラクトシダーゼとネオマイシンホスホトランスフェラーゼとの融合タンパク質をコードする）遺伝子をノックインしたマウス由来のMEF（Takahashi & Yamanaka, Cell, 126, 663-676 (2006)）、あるいはNanog遺伝子座に緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウス由来のMEF（Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007)）等が挙げられる。一方、目視による形態観察で候補コロニーを選択する方法としては、例えばTakahashi et al., Cell, 131, 861-872 (2007)に記載の方法が挙げられる。レポーター細胞を用いる方法は簡便で効率的ではあるが、iPS細胞がヒトの治療用途を目的として作製される場合、安全性の観点から目視によるコロニー選択が望ましい。Klf4と組み合わせることによりiPS細胞を誘導しうる核初期化物質としてOct3/4及びSox2の2因子を用いた場合、樹立クローン数は減少するものの生じるコロニーのほとんどがES細胞と比較して遜色のない高品質のiPS細胞であることから、レポーター細胞を用いなくとも効率よくiPS細胞を樹立することが可能である。
　選択されたコロニーの細胞がiPS細胞であることの確認は、上記したNanog（もしくはOct3/4）レポーター陽性（ピューロマイシン耐性、GFP陽性など）および目視によるES細胞様コロニーの形成によっても行い得るが、より正確を期すために、アルカリフォスファターゼ染色や、各種ES細胞特異的遺伝子の発現を解析したり、選択された細胞をマウスに移植してテラトーマ形成を確認する等の試験を実施することもできる。
　Klf4を代替し得る核初期化物質が、OVOLファミリーのメンバー、ZBTB8ファミリーのメンバー、ZBTB43ファミリーのメンバー、ZNF202ファミリーのメンバー、ZNF383ファミリーのメンバー、NR5Aファミリーのメンバー、ZSCAN4ファミリーのメンバー、ZNF768ファミリーのメンバー、PRPF4Bファミリーのメンバー、NHLHファミリーのメンバー、GRHLファミリーのメンバー、OTXファミリーのメンバー、PRRXファミリーのメンバー、OTPファミリーのメンバー、DACHファミリーのメンバー、C2orf50ファミリーのメンバー、PIH1Dファミリーのメンバー、KLFファミリーのメンバー、HOXファミリーのメンバー、BTGファミリーのメンバー及びHLFファミリーのメンバーから選ばれるタンパク質をコードする核酸の形態で体細胞に導入された場合、得られるiPS細胞は、当該外来性核酸を含む点で、従来公知のiPS細胞とは異なる新規細胞である。特に、当該外来性核酸がレトロウイルスやレンチウイルス等を用いて体細胞に導入された場合、当該外来性核酸は通常、得られるiPS細胞のゲノム中に組み込まれているので、外来性核酸を含むという形質は安定に保持される。
　このようにして樹立されたiPS細胞は、種々の目的で使用することができる。例えば、ES細胞で報告されている分化誘導法を利用して、iPS細胞から種々の細胞（例、心筋細胞、血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、インスリン分泌細胞等）への分化を誘導することができる。したがって、患者本人やHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から採取した体細胞を用いてiPS細胞を誘導すれば、そこから所望の細胞（即ち、該患者が罹病している臓器の細胞や疾患に対する治療効果を発揮する細胞など）に分化させて該患者に移植するという、自家移植による幹細胞療法が可能となる。さらに、iPS細胞から分化させた機能細胞（例、肝細胞）は、対応する既存の細胞株よりも実際の生体内での該機能細胞の状態をより反映していると考えられるので、医薬候補化合物の薬効や毒性のin vitroスクリーニングや疾患メカニズムの解明等にも好適に用いることができる。
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
実施例
［実施例1: 新規初期化因子のスクリーニング（1）］
　Goshimaらが作製したヒトGateway(登録商標)エントリークローン（N. Goshima et al., Nature methods, 2008記載のライブラリーを用いる。Y. Maruyama et al., Nucleic Acid Res., 2009でデータベース公開）をもとに、図１に記載の方法で、ヒトの網羅的遺伝子約20000クローンを整列化した。即ち、ヒトGateway(登録商標)エントリークローン中全長ORFを含む約50000クローンを、NCBI RefSeqの37900配列（24200遺伝子）に対してcoverage 80%以上、アミノ酸同一性95%以上の基準でblastp検索をかけ、ORFの3’末端に終止コドンを持つN-typeと、終止コドンを持たないF-typeの各type内で配列に重複のない、約20000エントリークローンからなるサブライブラリーを構築した。この整列化した約20000エントリークローンを、バイオインフォマティクス手法によりタンパク質キナーゼ、タンパク質フォスファターゼ、転写因子、GPCR、及びその他のクローン群に分類し、転写因子のエントリークローンからなるサブライブラリー（ヒトの全転写因子の50%以上をカバー）を構築した(図１）。この転写因子のサブライブラリーから、エントリークローンごとに、図２に示すようにpMXs-GWデスティネーションベクターとのLR反応により発現クローンDNAを作製し、この反応液を大腸菌DH5αに導入し、クローン化して転写因子発現ライブラリーを構築した（初期化因子スクリーニング用転写因子発現ライブラリー）。また、ヒトOct3/4, Sox2, Klf4, c-Mycの各遺伝子も同じpMXs-GWに組み込み、各発現クローンを構築した。このDNAよりリコンビナントレトロウィルスを作製し、以下の実験に用いた。
　iPS細胞誘導実験は、Nanog-GFPマウス（Okita et al., Nature,448, 313-317(2007)）の皮膚由来線維芽細胞を用いて行った。その際、フィーダー細胞であるMSTO(マイトマイシンCで処理して細胞分裂を止めたSNL細胞)上でレトロウイルスの感染を行う系（以下MSTO法、Cell, 126, 663-676 (2006)）と、感染時はフィーダー細胞を用いず、感染後、細胞を播き直した後にMSTO上で培養を行う系（以下Reseed法、Nature Biotech., 26, p101-106(2008)）の両方の系で実験を行った。
　1stスクリーニングとして24-well plateでiPS細胞誘導を行った。MSTO上（MSTO法）にNanog-GFPマウスの皮膚由来線維芽細胞を播き、翌日、各種プラスミドから作製したレトロウイルスを感染させた(Day0)。具体的にはOct3/4、Sox2およびc-Mycの3遺伝子と前述の転写因子ライブラリーからの１遺伝子とを、1:1:1:1の割合で感染させた。ネガティブコントロールとしてOct3/4、Sox2およびc-Mycの3遺伝子を1:1:1の割合で感染させた。またポジティブコントロールとしてOct3/4、Sox2、Klf4 およびc-Mycの4遺伝子を1:1:1:1の割合で感染させた。
　感染から2日目までは10%FBS/DMEMで、3日目からはES培地（Cell, 126, 663-676 (2006)）で培養した。以後2日ごとに培地の交換を行い、21日目からはピューロマイシン選択を行い、28日目に細胞の観察を行った。その結果、3遺伝子と共に、以下の表2に示す各サンプルの遺伝子を導入したウエルにおいて、GFP陽性のコロニーが現われ、マウスのiPS細胞が樹立されたことが確認された。各iPS細胞のGFP陽性コロニー像および位相差像を、図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　次に、これら14種類の遺伝子について、6-well plateで再度同じiPS細胞誘導を行ったところ（2ndスクリーニング)、同様にGFP陽性コロニーが現われ、再現性が得られた。2ndスクリーニングにおいては、Reseed法、MSTO法の両方を試し、共に再現性が得られた。Reseed法で得られた各iPS細胞のコロニー形成時、1継代目および2継代目のGFP陽性コロニー像および位相差像を、図４および図５に示す。
　以上の結果より、これら14種類の因子はKlf4の代替えとなる新規初期化因子であることが明らかとなった。
［実施例2: 新規初期化因子のスクリーニング（2）］
　実施例1で作製した「初期化因子スクリーニング用転写因子発現ライブラリー」を約1000遺伝子ずつのプールに分けた。また、転写因子のみならず、タンパク質キナーゼ、タンパク質フォスファターゼ、GPCR及びその他のクローン群を含む約20000エントリークローンについても同様のライブラリー（以下「初期化因子スクリーニング用全因子発現ライブラリー」）を作製し、約1000遺伝子ごとのプールに分けた。これらの遺伝子プールを用いて実施例１と同じiPS細胞誘導実験を行った。
　1stスクリーニングとして10cm dishでiPS細胞誘導を行った。Gelatin（Reseed法）にNanog-GFPマウスの皮膚由来線維芽細胞を播き、翌日、1枚目のプレートにはOct3/4、Sox2およびc-Mycの3遺伝子を1:1:1の割合で感染、2枚目のプレートには前述の1000遺伝子ごとのプールを感染させた（1回目の感染）。ネガティブコントロールとしてOct3/4、Sox2およびc-Mycの3遺伝子を1:1:1の割合で感染させた。またポジティブコントロールとしてOct3/4、Sox2、Klf4 およびc-Mycの4遺伝子を1:1:1:1の割合で感染させた。1回目の感染から2日目に再度Gelatin上に播き直した。翌日、2回目の感染を行った。2回目の感染では、1枚目のプレートには前述の1000遺伝子ごとのプールを感染、2枚目のプレートにはOct3/4、Sox2およびc-Mycの3遺伝子を1:1:1の割合で感染させた(Day0）。
　2回目の感染から2日目までは10%FBS/DMEMで、3日目からはES培地（Cell, 126, 663-676 (2006)）で培養した。3日目にMSTO上に播き直した。以後2日ごとに培地の交換を行い、21日目からはピューロマイシン選択を行い、28日目に細胞の観察を行った。GFP陽性のコロニーを回収し、常法によりゲノムDNAの抽出を行い、pMXsベクターに由来するプライマー（forward primer：GAC GGC ATC GCA GCT TGG ATA CAC (SEQ ID NO:43), reverse primer:TTA TCG TCG ACC ACT GTG CTG CTG (SEQ ID NO:44)）でPCRを行うことにより、ゲノム中に挿入された外来遺伝子（ライブラリー由来の遺伝子）を同定した。その同定した遺伝子とOct3/4、Sox2およびc-Mycの3遺伝子とをNanog-GFPマウスの皮膚由来線維芽細胞に導入することにより、2ndスクリーニングを行った。その結果、3遺伝子と共に、以下の表3（初期化因子スクリーニング用全因子発現ライブラリーからのヒット）および表4（初期化因子スクリーニング用転写因子発現ライブラリーからのヒット）に示す各サンプルの遺伝子を導入したウエルにおいて、GFP陽性のコロニーが現われ、マウスのiPS細胞が樹立されたことが確認された。Reseed法で得られた各iPS細胞のGFP陽性コロニー像および位相差像を、図６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　以上の結果より、これら7種類の因子も、Klf4の代替えとなる新規初期化因子であることが明らかとなった。
　本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
　ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　本出願は、2011年4月11日付で出願された米国仮特許出願第61/474,058号を基礎としており、ここで言及することにより、その内容は全て本明細書に包含される。

Claims (19)

  1. 　以下の(1)及び(2):
    (1) OVOLファミリーのメンバー、ZBTB8ファミリーのメンバー、ZBTB43ファミリーのメンバー、ZNF202ファミリーのメンバー、ZNF383ファミリーのメンバー、NR5Aファミリーのメンバー、ZSCAN4ファミリーのメンバー、ZNF768ファミリーのメンバー、PRPF4Bファミリーのメンバー、NHLHファミリーのメンバー、GRHLファミリーのメンバー、OTXファミリーのメンバー、PRRXファミリーのメンバー、OTPファミリーのメンバー、DACHファミリーのメンバー、C2orf50ファミリーのメンバー、PIH1Dファミリーのメンバー、KLFファミリーのメンバー（但し、Klf1、Klf2、Klf4およびKlf5を除く）、HOXファミリーのメンバー、BTGファミリーのメンバー及びHLFファミリーのメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1種以上の物質、
    (2) Klf4と組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる物質
    を体細胞に導入する工程を含む、iPS細胞の製造方法。
  2. 　前記(1)の物質が、ovo-like 2（OVOL2）、zinc finger and BTB domain containing 8A（ZBTB8A）、zinc finger and BTB domain containing 43（ZBTB43）、zinc finger protein 202（ZNF202）、zinc finger protein 383（ZNF383）、nuclear receptor subfamily 5, group A, member 1（NR5A1）、zinc finger and SCAN domain containing 4（ZSCAN4）、zinc finger protein 768（ZNF768）、PRP4 pre-mRNA processing factor 4 homolog B（PRPF4B）、nescient helix loop helix 1（NHLH1）、grainyhead-like 1 (GRHL1)、orthodenticle homeobox 2（OTX2）、paired related homeobox 2（PRRX2）、orthopedia homeobox（OTP）、dachshund homolog 2（DACH2）、chromosome 2 open reading frame 50（C2orf50）、PIH1 domain containing 1（PIH1D1）、Kruppel-like factor 15（KLF15）、homeobox B5（HOXB5）、B-cell translocation gene 1, anti-proliferative（BTG1）及びhepatic leukemia factor（HLF）並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される少なくとも1種の物質を含む、請求項１記載の方法。
  3. 　前記(2)の物質が、Octファミリーのメンバー、Soxファミリーのメンバー、Mycファミリーのメンバー、Nanog及びLinファミリーのメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
  4. 　前記(2)の物質がOct3/4である、請求項１記載の方法。
  5. 　前記(2)の物質がOct3/4及びSox2である、請求項１記載の方法。
  6. 　前記(2)の物質がOct3/4及びc-MycもしくはL-Mycである、請求項１記載の方法。
  7. 　前記(2)の物質がOct3/4、Sox2及びc-MycもしくはL-Mycである、請求項１記載の方法。
  8. 　前記(2)の物質がOct3/4、Sox2及びc-MycもしくはL-Myc、並びにNanogおよび／またはLin28もしくはLin28Bである、請求項１記載の方法。
  9. 　以下の(1)及び(2):
    (1) OVOLファミリーのメンバー、ZBTB8ファミリーのメンバー、ZBTB43ファミリーのメンバー、ZNF202ファミリーのメンバー、ZNF383ファミリーのメンバー、NR5Aファミリーのメンバー、ZSCAN4ファミリーのメンバー、ZNF768ファミリーのメンバー、PRPF4Bファミリーのメンバー、NHLHファミリーのメンバー、GRHLファミリーのメンバー、OTXファミリーのメンバー、PRRXファミリーのメンバー、OTPファミリーのメンバー、DACHファミリーのメンバー、C2orf50ファミリーのメンバー、PIH1Dファミリーのメンバー、KLFファミリーのメンバー（但し、Klf1、Klf2、Klf4およびKlf5を除く）、HOXファミリーのメンバー、BTGファミリーのメンバー及びHLFファミリーのメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1種以上の物質、
    (2) Klf4と組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる物質
    を含有してなる、体細胞からiPS細胞への誘導剤。
  10. 　前記(1)の物質が、OVOL2、ZBTB8A、ZBTB43、ZNF202、ZNF383、NR5A1、ZSCAN4、ZNF768、PRPF4B、NHLH1、GRHL1、OTX2、PRRX2、OTP、DACH2、C2orf50、PIH1D1、KLF15、HOXB5、BTG1及びHLF並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される少なくとも1種の物質を含む、請求項９記載の剤。
  11. 　OVOLファミリーのメンバー、ZBTB8ファミリーのメンバー、ZBTB43ファミリーのメンバー、ZNF202ファミリーのメンバー、ZNF383ファミリーのメンバー、NR5Aファミリーのメンバー、ZSCAN4ファミリーのメンバー、ZNF768ファミリーのメンバー、PRPF4Bファミリーのメンバー、NHLHファミリーのメンバー、GRHLファミリーのメンバー、OTXファミリーのメンバー、PRRXファミリーのメンバー、OTPファミリーのメンバー、DACHファミリーのメンバー、C2orf50ファミリーのメンバー、PIH1Dファミリーのメンバー、KLFファミリーのメンバー（但し、Klf1、Klf2、Klf4およびKlf5を除く）、HOXファミリーのメンバー、BTGファミリーのメンバー及びHLFファミリーのメンバーからなる群より選択される１種以上の因子をコードする外来性核酸を含む、iPS細胞。
  12. 　OVOL2、ZBTB8A、ZBTB43、ZNF202、ZNF383、NR5A1、ZSCAN4、ZNF768、PRPF4B、NHLH1、GRHL1、OTX2、PRRX2、OTP、DACH2、C2orf50、PIH1D1、KLF15、HOXB5、BTG1及びHLFからなる群より選択される１種以上の因子をコードする外来性核酸を含む、請求項１１記載のiPS細胞。
  13. 　少なくとも１種の外来性核酸がゲノムに組み込まれている、請求項１１記載のiPS細胞。
  14. 　請求項１１記載のiPS細胞に分化誘導処理を行い、体細胞に分化させることを含む、体細胞の製造方法。
  15. 　OVOLファミリーのメンバー、ZBTB8ファミリーのメンバー、ZBTB43ファミリーのメンバー、ZNF202ファミリーのメンバー、ZNF383ファミリーのメンバー、NR5Aファミリーのメンバー、ZSCAN4ファミリーのメンバー、ZNF768ファミリーのメンバー、PRPF4Bファミリーのメンバー、NHLHファミリーのメンバー、GRHLファミリーのメンバー、OTXファミリーのメンバー、PRRXファミリーのメンバー、OTPファミリーのメンバー、DACHファミリーのメンバー、C2orf50ファミリーのメンバー、PIH1Dファミリーのメンバー、KLFファミリーのメンバー（但し、Klf1、Klf2、Klf4およびKlf5を除く）、HOXファミリーのメンバー、BTGファミリーのメンバー及びHLFファミリーのメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1種以上の物質を含有してなる、体細胞からiPS細胞への誘導剤であって、Klf4と組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる物質とともに体細胞に導入されることを特徴とする、剤。
  16. 　iPS細胞の製造のための、OVOLファミリーのメンバー、ZBTB8ファミリーのメンバー、ZBTB43ファミリーのメンバー、ZNF202ファミリーのメンバー、ZNF383ファミリーのメンバー、NR5Aファミリーのメンバー、ZSCAN4ファミリーのメンバー、ZNF768ファミリーのメンバー、PRPF4Bファミリーのメンバー、NHLHファミリーのメンバー、GRHLファミリーのメンバー、OTXファミリーのメンバー、PRRXファミリーのメンバー、OTPファミリーのメンバー、DACHファミリーのメンバー、C2orf50ファミリーのメンバー、PIH1Dファミリーのメンバー、KLFファミリーのメンバー（但し、Klf1、Klf2、Klf4およびKlf5を除く）、HOXファミリーのメンバー、BTGファミリーのメンバー及びHLFファミリーのメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1種以上の物質の使用であって、該物質が、Klf4と組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる物質とともに体細胞に導入されることを特徴とする、使用。
  17. 　体細胞からのiPS細胞の誘導剤としての、OVOLファミリーのメンバー、ZBTB8ファミリーのメンバー、ZBTB43ファミリーのメンバー、ZNF202ファミリーのメンバー、ZNF383ファミリーのメンバー、NR5Aファミリーのメンバー、ZSCAN4ファミリーのメンバー、ZNF768ファミリーのメンバー、PRPF4Bファミリーのメンバー、NHLHファミリーのメンバー、GRHLファミリーのメンバー、OTXファミリーのメンバー、PRRXファミリーのメンバー、OTPファミリーのメンバー、DACHファミリーのメンバー、C2orf50ファミリーのメンバー、PIH1Dファミリーのメンバー、KLFファミリーのメンバー（但し、Klf1、Klf2、Klf4およびKlf5を除く）、HOXファミリーのメンバー、BTGファミリーのメンバー及びHLFファミリーのメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される物質であって、Klf4と組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる物質とともに体細胞に導入されることを特徴とする、物質。
  18. 　体細胞の製造における、請求項１１記載のiPS細胞の使用。
  19. 　体細胞の製造における細胞ソースとしての、請求項１１記載のiPS細胞。
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