CN102199622B - 一种将微小核糖核酸簇用于改变细胞命运的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种微小核糖核酸(miRNA)或微小核糖核酸簇(miRNA簇)促进细胞形成诱导性多能干细胞而改变细胞命运的方法。方法包括如下步骤：步骤1、从供体基因组中克隆miRNA或miRNA簇的基因并获取供体细胞；步骤2、利用步骤1中的miRNA或miRNA簇将步骤1中供体细胞的细胞命运改变；步骤3、对步骤2中得到的细胞进行鉴定。与现有技术相比，miRNA或miRNA簇的利用，可以不使用癌基因c-myc来诱导干细胞，降低了潜在的致癌性，可以加速细胞命运的改变，同时获得了极高的诱导效率，并可以得到高质量的具有生殖系传递能力的诱导多能干细胞。

Description

一种将微小核糖核酸簇用于改变细胞命运的方法

技术领域

本发明涉及一种将微小核糖核酸簇用于改变细胞命运的方法。

背景技术

我国是世界人口大国，每年因为创伤、疾病、衰老、以及遗传所导致的器官缺损、衰竭、功能障碍也居世界之首，以药物和手术治疗为基本支柱的经典医学治疗手段已不能满足临床医学的巨大需求，所以对干细胞与再生医学的研究受到了相当多科研单位以及社会各界的普遍重视。

细胞移植治疗是再生医学研究的一个重要方向，特定类型的细胞细胞移植可能能被用来治疗心脏损伤，神经系统退行性疾病，脊髓损伤，肾衰竭、血液系统疾病等等。然而，细胞移植治疗面临着异体排斥、细胞来源有限等很多难以解决的问题。

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。

为了解决细胞移植治疗面临的问题，细胞命运的转化受到越来越多科学家的重视。虽然细胞分化和命运的决定一直认为是发育过程中不可逆转而且是稳定的过程，而在体外，越来越多的证据表明，这一过程是可以被逆转的。

对于细胞命运调节的研究还只是处于实验室研究状态，离临床实验还有很长的距离。这些通过转录因子过表达获得的转化的细胞还存在很多应用上的难题，比如说，病毒插入、潜在致瘤性、获得转分化细胞的纯度、在机体内能否弥补正常细胞发挥应有的功能等等。

2006年，日本京都大学Yamanaka研究小组采用体外基因转染技术，从24个因子中筛选出Oct4、Sox2、C-myc、Klf4等4个转录因子，通过逆转录病毒将上述4个转录因子导入胚胎小鼠成纤维细胞或成年小鼠尾部皮肤成纤维细胞，在小鼠干细胞的培养条件下获得了多能干细胞，该细胞系而在基因表达谱、DNA甲基化方式及形成嵌合体动物方面却不同于小鼠干细胞，故将其命名为诱导多能干细胞；同样的4个转录因子导入到人皮肤成纤维细胞中，也成功获得了人的诱导多能干细胞。

但导入C-myc基因可使嵌合体小鼠的肿瘤发生率高达20％，会阻碍其未来的临床应用。Yamanaka研究小组新近报道，小鼠和人类皮肤成纤维细胞转染C-myc以外的其余3个基因，在调整培养条件后也可得到ips细胞。去除C-myc基因尽管可使未来临床应用的安全性显著提高，但形成ips细胞的效率却明显降低。

miRNA是一类小的非编码RNA，它参与调节细胞的生长、凋亡、个体的发育等生命过程。很多miRNA在干细胞的分化过程中，能够促进干细胞往某个特定的方向分化，比如说神经元、肌肉细胞、脂肪细胞等等。miRNA可以改变小鼠成纤维细胞向诱导多能干细胞重编程的效率，从而参与细胞命运的转化。而对于这类型的细胞命运改变，目前还很少研究。

发明内容

为提高诱导多能干细胞的效率，提高诱导多能干细胞的质量。本发明的目的是提供一种微小核糖核酸(miRNA)或微小核糖核酸簇(miRNA簇)促进细胞形成诱导性多能干细胞而改变细胞命运的方法。

为实现该目的，采用如下技术方案：

一种将微小核糖核酸簇用于改变细胞命运的方法，该方法包含以下步骤：

步骤1：从供体基因组中克隆miRNA或miRNA簇的基因并获取供体细胞，其中从基因组中克隆miRNA或miRNA簇的基因步骤如下：

步骤11：设计特异的miRNA或miRNA簇的引物；

步骤12：通过聚合酶链式反应从供体基因组中扩增miRNA或miRNA簇基因，并通过分子克隆手段克隆到载体；

步骤2：利用步骤1中的miRNA或miRNA簇将步骤1中分离出的供体细胞的细胞命运改变；

步骤21：将miRNA或miRNA簇以及多能干细胞诱导因子导入步骤1中的供体细胞；

步骤22：采用相应的培养基对经过步骤21处理后得到的诱导多能干细胞进行培养；

步骤23：将步骤22中出现的胚胎干细胞样克隆挑选出来，采用干细胞培养基培养。

上述的多能干细胞诱导因子可以是任何来源的，优选小鼠的多能干细胞诱导因子及其变体，其中Oct4，NCBI登录号为NM_013663；Sox2，NCBI登录号为NM_011443；Klf4，NCBI登录号为010637；c-Myc，NCBI登录号为NM_001177353；多能干细胞诱导因子并不限于以上列出的优选的因子，还可以包括现有技术中以及发现的具有诱导多能干细胞作用的任何诱导因子，如Sox1、Klf5、1-Myc或n-Myc、Esrrb、LRH等，也可以是其他具有该功能的编码或非编码RNA(包括micro RNA、长非编码RNA)、蛋白质、肽、化学物、细胞因子以及任何可能的组织培养基或培养环境(如低氧)。

上述多能干细胞诱导因子导入细胞的方法可以是本领域技术人员熟知的多种技术，包括病毒感染、脂质体转染、电穿孔、基因枪等。

优选的，所述将微小核糖核酸簇用于改变细胞命运的方法，其特征在于，所述miRNA或miRNA簇为选自由miR-200b-429，miR-106a-363和miR-302-367组成的组。

优选的，所述miRNA或miRNA簇的基因载体为病毒载体、质粒载体、外随体载体、mRNA载体或直接化学合成。

优选的，所述病毒载体为逆转录病毒。

优选的，步骤21所述的多能干细胞诱导因子包括Oct4、Sox2、Klf4、Sox1、Klf5、1-Myc、n-Myc、Esrrb、LRH中的一种或几种，但不包括c-Myc。与现有技术相比，miRNA或miRNA簇的利用，可以不使用癌基因c-myc来诱导干细胞，降低了潜在的致癌性，可以加速细胞命运的改变，并可以得到高质量的具有生殖系传递能力的诱导多能干细胞。

优选的，步骤21所述的多能干细胞诱导因子包括Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Sox1、Klf5、1-Myc、n-Myc、Esrrb、LRH中的一种或几种。

优选的，所述多能干细胞诱导因子为具有多能干细胞诱导功能的编码或非编码RNA、蛋白质或肽。

优选的，所述非编码RNA为miRNA或长非编码RNA。

优选的，所述述多能干细胞诱导因子导入步骤1中的供体细胞的方法为病毒感染、脂质体转染、电穿孔或基因枪。

优选的，所述多能干细胞诱导因子导入方法为逆转录病毒感染。

优选的，所述逆转录病毒为pMXs载体。

优选的，所述步骤1还包括：

优选的，将步骤12得到的载体测序，验证基因的正确性，如果基因序列正确，进行步骤14，如果基因序列不正确，重新进行步骤11；

步骤14：验证步骤13中载体的基因表达，如果表达正确，进行步骤2，如果表达不正确，重新进行步骤11。

优选的，在步骤2之后进行步骤3：对步骤2中得到的诱导多能干细胞进行鉴定。

优选的，所述供体为小鼠，所述供体细胞为小鼠胚胎纤维原细胞。

优选的，所述供体为人类，所述供体细胞为人类胚胎纤维原细胞。

附图说明

图1a：为miRNA cluster A、miRNA cluster B、miRNA cluster C的信息；

图1b：为miRNA在基因组成簇分布的示意图以及克隆到载体后的表达量图示；

图2a为从小鼠胚胎分离的胚胎纤维原细胞的显微照片；

图2b导入多能性因子以及miRNA或miRNA簇后的细胞命运改变的显微照片；

图2c为最终形成的干细胞的显微照片；

图2a-图2c为细胞命运改变过程不同时间状态发展示意图；

图3a标示了对照组处理之后的显微照片；

图3b标示了miRNA cluster B处理之后的显微照片；

图3c标示了miRNA cluster C处理之后的显微照片；

三张图片显示了对照组、miRNA cluster B、miRNA cluster C处理之后的不同效率；

图4a1标示了有3因子作用诱导多能干细胞的效率数据；

图4a2标示了有3因子和VC作用诱导多能干细胞的效率数据；

图4a3标示了有4因子作用诱导多能干细胞的效率数据；

图4a4标示了有4因子和VC作用诱导多能干细胞的效率数据；

四张图片显示了不同诱导条件下(有无Vc，3因子/4因子)，miRNA clusterB、miRNA cluster C提高了诱导多能干细胞的效率数据；

图4b：miRNA Cluster B中的有效组分作用大小的图示；

图5：为miRNA cluster C促进了上皮状细胞特异蛋白E-cadherin(上皮细胞钙粘蛋白)的表达第六天(3F d6下方横线所示范围)，第八天(3F D8下方横线所示范围)对比示意图；

图6：为诱导多能干细胞的基因表达谱分析，miRNA cluster B、miRNA clusterC各选取2株细胞；

图7：MEF s相对部分的图为小鼠胚胎纤维原细胞的Nanog和Oct4邻近启动子区域里CpGs甲基化实测程度分析图；3F-CB5为由miRNA Cluster B诱导产生的多能干细胞Nanog和Oct4邻近启动子区域里CpGs甲基化实测程度分析图；3F-CC8为由miRNA Cluster B诱导产生的多能干细胞Nanog和Oct4邻近启动子区域里CpGs甲基化实测程度分析图；黑色部分为表示已甲基化；

图8a为miRNA cluster B处理的诱导多能干细胞的核型鉴定照片；

图8b为miRNA cluster C处理的诱导多能干细胞的核型鉴定照片；

图9a为miRNA cluster B处理的诱导多能干细胞注射到囊胚之后发育形成的嵌合体；

图9b为miRNA cluster B处理的诱导多能干细胞注射到囊胚之后发育形成的嵌合体与正常小鼠交配后产生的后代；

图9c为miRNA cluster C处理的诱导多能干细胞注射到囊胚之后发育形成的嵌合体；

图9d为miRNA cluster C处理的诱导多能干细胞注射到囊胚之后发育形成的嵌合体与正常小鼠交配后产生的后代；

图10：为实施例2中有无Cluster C miRNA簇对人类细胞诱导效率的对比图示。

具体实施方式

实施例1

1、miRNA或miRNA簇的载体引物设计；

从http://www.mirbase.org/获取miRN簇信息(如图1a示，miRNA clusterA、miRNA cluster B、miRNA cluster C分别表示miR-200b-429，miR-106a-363和miR-302-367)，miR-200b-429克隆区序列为SEQ ID NO：1，miR-106a-363克隆区序列为SEQ ID NO：2，miR-302-367克隆区序列为SEQ ID NO：3，通过设计特异性的引物扩增miRNA或miRNA簇在基因组上包括上下游各约200个核苷酸的序列。

miR-200b-429上游引物碱基序列如SEQ ID NO：4所示；

miR-200b-429下游引物碱基序列如SEQ ID NO：5所示；

miR-106a-363上游引物碱基序列如SEQ ID NO：6所示；

miR-106a-363下游引物碱基序列如SEQ ID NO：7所示；

miR-302b-367上游引物碱基序列如SEQ ID NO：8所示；

miR-302b-367下游引物碱基序列如SEQ ID NO：9所示；

2、从基因组中扩增miRNA或miRNA簇的方法；

将用常规方法获取的小鼠基因组样品作为模板，使用上述方法设计的引物，采取聚合酶链式反应扩增miRNA或miRNA簇。

如图1b所示，此方法可以有效的表达miRNA或miRNA簇中的miRNA。

3、将包含多能干细胞诱导因子的cDNA、miRNA或miRNA簇导入小鼠胚胎纤维原细胞；

胰酶消化传代培养到第2-4代的细胞，以2万/孔细胞密度种到十二孔板中培养。原代培养基的成分包括DMEM高糖培养基(Gibco)、10％的胎牛血清(FBS，PAA)、非必需氨基酸(NEAA，Gibco)，L-谷氨酰胺(Glutamax，Gibco)。

如图2a所示，细胞此时呈现为典型的纤维状间充质形态。用含有病毒的上清感染细胞，该病毒上清是通过用包含小鼠或人Oct4、Sox2、Klf4(含或不含c-Myc)的cDNA的逆转录病毒载体pMXs(Addgene公司)按常规方法(见分子克隆试验指南，磷酸钙转染)转染Plat-E细胞(一种逆转录病毒包装细胞)获得的。其中Oct4，NCBI登录号为NM_013663；Sox2，NCBI登录号为NM_011443；Klf4，NCBI登录号为010637；c-Myc，NCBI登录号为NM_001177353。病毒上清对细胞的感染重复进行两次，间隔24小时。为了提高感染效率，感染液中加入适量polybrene(Sigma公司)。miRNA病毒采取同样方法包装。

诱导过程使用的诱导培养基成分包括DMEM高糖培养基(Gibco)、15％的胎牛血清(FBS，Gibco)、非必需氨基酸(NEAA，Gibco)，L-谷氨酰胺(Glutamax，Gibco)，丙酮酸钠(sodium pyruvate，Gibco)，β巯基乙醇(β-ME，Gibco)，青霉素(50U/mL)和链霉素(50μg/mL)，白血病抑制因子(LIF，Millipore)。

4、对经过感染后的细胞进行培养直到干细胞克隆形成；

感染后的第2天，将培养体系更换为新鲜的诱导培养基，之后每天更换诱导培养基直到实验完成。感染后第5天，如图2b所示，可以见到细胞发生了明细的命运改变。多边形的形态逐渐收缩，变为典型的联结紧密，梭状上皮细胞形态。感染后第十天，明亮的成团生长的(图2c所示)，激发出了内源干细胞多能因子Oct4(由绿色荧光蛋白表征)的克隆开始大量出现。如图3所示，图3a，图3b，图3c分别标示了对照组、miRNA cluster B、miRNA cluster C处理之后的不同效率的显微图。由图4a 1至4a4数据可见，miRNA cluster B、miRNAcluster C可以明显促进细胞命运的改变。由图4b中miRNA cluster B的有效组分的确定，miR-106a，miR-20b，可以有效的提高诱导效率，但是作为一个整簇的效率还是最高的。图5是通过蛋白印记的方法，显示C miRNA簇可以促进上皮状细胞特异蛋白E-cadherin(上皮细胞钙粘蛋白)的表达，从分子水平证明了miRNA簇加速促进细胞命运的改变(从间充质细胞转变到上皮细胞)。

使用玻璃针将形态隆起，边缘清晰的胚胎干细胞样的单个克隆挑选出来，用0.25％的胰蛋白酶消化10分钟后吹散，转移至提前铺好饲养层细胞(饲养层细胞为处理过的小鼠成纤维细胞)的培养板中培养，培养体系可使用胚胎干细胞培养基。传代方法同普通胚胎干细胞。建系之后的干细胞系使用的干细胞培养基基本成分同上，只需将DMEM高糖培养基换成Knockout-DMEM培养基以及胎牛血清换成血清替代物(KSR，Gibco公司)。

5、对得到的诱导性多能干细胞进行鉴定；

对miRNA簇促进生成的胚胎干细胞样克隆进行一系列鉴定实验，以证明其是否为iPS细胞(诱导性多能干细胞)，鉴定实验包括：碱性磷酸酶染色、定量PCR(聚合酶链反应)、启动子甲基化程度分析、核型鉴定、嵌合体形成等。鉴定实验均采用传统的技术，可以参阅实验手册。

经鉴定，如图6至9所示，图6表示此方法得到的干细胞的内源性胚胎干细胞转录因子，miRNA表达量与胚胎干细胞、之前分离的iPS细胞的表达基本一致；图7表示此法得到的干细胞的Nanog和Oct4的启动子区域的CpG岛去甲基化，而供体细胞的CpG岛未甲基化，说明发生了细胞命运改变；图8说明此法得到的干细胞的核型仍然正常；图9说明此法得到的干细胞可以形成嵌合体，得到的嵌合体具有将原来供体细胞通过生殖系传递到下一代。说明此干细胞可以通过这一高标准的全能性检验，相比之前普通方法得到的干细胞较差的生殖系传递具有良好的质量。

实施例2

Cluster C miRNA簇可以提高人类细胞的诱导效率，一般地，人的多能细胞的诱导效率更低。在不加癌基因c-Myc的条件下，只有约万分之一到十万分之一的效率。同实施例1实验方法，只是把小鼠基因组及小鼠胚胎纤维原细胞用人的基因组及人的成纤维细胞代替。由图10数据可见，Cluster C miRNA簇可以明显促进人类细胞命运的改变。这个技术在不同的物种中具有保守性，ClusterCmiRNA簇也可以提高人类细胞的诱导效率。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种将微小核糖核酸簇用于改变细胞命运的方法，所述微小核糖核酸簇为miRNA簇为miR-106a-363簇或miR-302-367簇，该方法包含以下步骤：

步骤1：从供体基因组中克隆mi RNA簇的基因并获取供体细胞，，所述供体为小鼠或人类，其中从供体基因组中克隆miRNA簇的基因步骤如下：

步骤11：设计特异的miRNA簇的引物：

miR-106a-363簇上游引物碱基序列如SEQ ID NO：6所示；

miR-106a-363簇下游引物碱基序列如SEQ ID NO：7所示；

miR-302b-367簇上游引物碱基序列如SEQ ID NO：8所示；

miR-302b-367簇下游引物碱基序列如SEQ ID NO：9所示；

miR-106a-363簇克隆区序列为SEQ ID NO：2；

miR-302-367簇克隆区序列为SEQ ID NO：3；

步骤12：通过聚合酶链式反应从供体基因组中扩增miRNA簇基因，并通过分子克隆手段克隆到基因载体；

步骤2：利用步骤1中的mi RNA簇将步骤1中分离出的供体细胞的细胞命运改变，所述供体细胞为小鼠胚胎纤维原细胞或人类成纤维细胞;

步骤21：将mi RNA簇以及多能干细胞诱导因子导入步骤1中的供体细胞，所述miRNA簇为步骤12中包含miRNA簇基因的基因载体，所述多能干细胞诱导因子为Oct4、Sox2和Klf4的3因子组合或Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的4因子组合；

步骤22：采用相应的培养基对经过步骤21处理后得到的诱导多能干细胞进行培养，所述相应的培养基为诱导培养基；

步骤23：将步骤22中出现的胚胎干细胞样克隆挑选出来，采用干细胞培养基培养。

2.按照权利要求1所述将微小核糖核酸簇用于改变细胞命运的方法，其特征在于，所述步骤12的miRNA簇的基因载体为病毒载体、质粒载体。

3.按照权利要求2所述将微小核糖核酸簇用于改变细胞命运的方法，其特征在于，所述病毒载体为逆转录病毒。

4.按照权利要求1所述将微小核糖核酸簇用于改变细胞命运的方法，其特征在于，所述多能干细胞诱导因子为具有多能干细胞诱导功能的编码或非编码RNA、蛋白质或肽。

5.按照权利要求4所述将微小核糖核酸簇用于改变细胞命运的方法，其特征在于，所述非编码RNA为miRNA或长非编码RNA。

6.按照权利要求1所述的将微小核糖核酸簇用于改变细胞命运的方法，其特征在于，所述述多能干细胞诱导因子导入步骤1中的供体细胞的方法为病毒感染、脂质体转染、电穿孔或基因枪。

7.按照权利要求6所述将微小核糖核酸簇用于改变细胞命运的方法，其特征在于，所述多能干细胞诱导因子导入方法为逆转录病毒感染。

8.按照权利要求3或7所述将微小核糖核酸簇用于改变细胞命运的方法,其特征在于，所述逆转录病毒为pMXs载体。

9.按照权利要求1所述将微小核糖核酸簇用于改变细胞命运的方法，其特征在于，所述步骤1还包括：

步骤13：将步骤12得到的载体测序，验证基因的正确性，如果基因序列正确，进行步骤14，如果基因序列不正确，重新进行步骤11；

步骤14：验证步骤13中载体的基因表达，如果表达正确，进行步骤2，如果表达不正确，重新进行步骤11。

10.按照权利要求1所述将微小核糖核酸簇用于改变细胞命运的方法，其特征在于，在步骤2之后进行步骤3：对步骤2中得到的胚胎干细胞样克隆进行鉴定。

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