CN103285404A - miR-290家族在小鼠胚胎干细胞中的调控作用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种miR-290家族在小鼠胚胎干细胞中的调控作用。本发明通过生物信息学分析，荧光素酶报告实验以及westernblotting等实验证明，Ccnd1为miR-290家族共同的靶基因。本发明首次证实Ccnd1是miR-290家族的共同靶基因，该发现为进一步调控胚胎干细胞细胞周期，促进其自我更新能力提供了可能，为进一步维持胚胎干细胞全能性，从而为再生医学的发展提供了技术上的保障。
Description
技术领域
本发明涉及一种miR-290家族在小鼠胚胎干细胞中的调控作用。
背景技术
微RNA( microRNA , miRNA )功能调控是当前生命科学的重要前沿。微RNA (microRNA, miRNA)是一类约22 nt的非编码小分子RNA，广泛存在于较高等的真核生物中，大多具有较高的保守性。miRNA作用于特异的mRNA，多使其降解或抑制其翻译，在转录后水平负调控基因表达，而有些miRNA则可以激活靶基因的转录。成熟的miRNA的5′端第2~7位碱基被称为“种子序列”，是有效调控mRNA的关键，miRNA的结合位点不仅可以是靶基因的3′-UTR，也可以是靶基因的5′-UTR或者CDS区域。在哺乳动物中，约30%的蛋白质编码基因受到miRNA的调控。
miRNA在ESC自我更新、多向分化潜能、以及早期分化中起到的重要作用受到了广泛关注。胚胎干细胞是来自于囊胚期胚胎内细胞团，具有无限的自我更新能力和分化成各种细胞类型的潜能，简称为“干性”。基于其独特的生物学特性，胚胎干细胞不仅能够作为体外研究生物发育机制、体细胞重编程、癌症永生化的模型，而且可以分化成特异细胞以代替受伤细胞或生成再生组织，具有极高的医学研究价值。近年来，在小鼠胚胎干细胞(mouse Embryonic Stem Cell, mESC)中特异且高表达的miR-290家簇成为研究的焦点。miR-290家簇在mESC的细胞周期，甲基化过程以及抗凋亡机制中起到重要的调控作用，并且参与到多功能转录因子调控网络中，成为mESC自我更新和分化潜能维持的重要的调控因子。开展miR-290家簇研究不仅有助于了解mESC早期发育机制，促进其在医疗领域的应用，而且也有助于iPS机制研究和技术应用，以及癌症调控机制等方面的发展。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种miR-290家族在促进小鼠胚胎干细胞增殖中的应用。
本发明的目的之二在于提供一种miR-290家族在促进小鼠胚胎干细胞G1/S转化中的应用。
本发明的目的之三在于提供一种miR-290家族在调控小鼠胚胎干细胞细胞周期和自我更新能力维持中的应用。
本发明通过qRT-PCR手段，在不同多功能分化潜能的细胞系（CGR8>P19>N2A）中，检测miR-290家族的表达量变化。发现，miR-290家族在mESCCGR8中的表达量最高，在多能性细胞P19中次之，而在已分化的神经母细胞N2A中没有表达。该结果说明miR-290家族的表达量与细胞的多功能性成正相关性。
将miR-290家族过表达或下调后，检测CGR8、P19、N2A细胞增殖和细胞周期的变化。在N2A细胞中转染miR-290家族的mimics，通过CCK8和流式细胞周期分析手段发现，miR-290家族促进N2A的细胞增殖，并加快G1/S转化。此外，在另两株miR-290家族高表达的细胞系中转染miR-290家族的inhibitor，通过同样的实验方法发现，miR-290的inhibitor能够抑制细胞增殖并增加G1阻滞。上述结果说明在小鼠胚胎干细胞中miR-290家族能促进细胞增殖和细胞周期，有助于胚胎干细胞自我更新和分化潜能维持。
通过TargetScan预测，Ccnd1的3′-UTR中有miR-290家族种子序列的结合位点。将Ccnd1野生型3′-UTR以及含有种子序列突变的3′-UTR构建到pGL-3报告基因的下游，通过双荧光素酶报告分析，发现带有Ccnd1野生型3′-UTR报告基因受到miR-290家族调控，而突变型不受miR-290家族调节。此外，在N2A和 P19细胞分别过表达和抑制miR-290家族，western blotting结果证明Ccnd1受到miR-290家族下调。上述结果证实，Ccnd1是miR-290家族的靶基因。
综上所述，miR-290家族在mESC（CGR8）以及多能性细胞(P19)中特异高表达，在分化的细胞，如小鼠神经母细胞（N2A）中不表达。通过实验证明，过表达miR-290家族能够促进细胞增殖，并促进细胞周期中G1/S期转化。同时，下调miR-290家族抑制细胞增殖，阻止G1/S转化。本实验通过生物信息学分析，荧光素酶报告实验以及western blotting等实验验证，确定Ccnd1基因为miR-290家族共同的靶基因。本实验首次证实Ccnd1是miR-290家族的共同靶基因，该发现对胚胎干细胞机制研究及发展做出一定贡献。
附图说明
图1 CGR8、P19、N
2
A细胞中miR-290家族与Ccnd1的表达量
· 在CGR8、P19、N2A细胞中miR-290家族表达量。**，P<0.01。
· 在CGR8、P19、N2A细胞中Ccnd1mRNA表达量。**，P<0.01。
上述结果显示miR-290家族表达与细胞干性正相关；Ccnd1mRNA的表达量与miR-290家族成负相关。
图2 miR-290家族对CGR8细胞增殖影响
(A), (B), (C), (D) 在CGR8细胞中转染miR-290家族的各成员抑制物（miR-291a-3pi，miR-294-3pi，miR-295-3pi）或混合抑制物（Mixi）以及抑制物阴性对照（NCi），连续检测4天，细胞的生长速度较对照减慢。**，P<0.01。
(E) 第4天各实验组CGR8细胞数量。**，P<0.01。
上述结果表明，CGR8中抑制miR-290家族能够抑制增殖。
图3 miR-290家族对P19细胞增殖影响
(A), (B), (C), (D) 在P19细胞中转染miR-290家族的各成员抑制物（miR-291a-3pi，miR-294-3pi，miR-295-3pi）或混合抑制物（Mixi）以及抑制物阴性对照（NCi），连续检测4天，细胞的生长速度较对照减慢。**，P<0.01。
(E) 第4天各实验组P19细胞数量。**，P<0.01。
上述结果表明，P19中抑制miR-290家族能够抑制增殖。
图4 miR-290家族对N
2
A细胞增殖影响
(A), (B), (C), (D) 在N2A细胞中转染miR-290家族的个家族成员化学模拟物（miR-291a-3p，miR-294-3p，miR-295-3p）或混合物（Mix）以及阴性对照（NC），连续检测4天，细胞的生长速度较对照增快。**，P<0.01。
(E) 第4天各实验组N2A细胞数量。**，P<0.01。
上述结果表明，N2A中过表达miR-290家族能够促进增殖。
图5 miR-290家族对CGR8细胞周期影响
(A) 在CGR8细胞中分别转染miR-290家族各成员抑制物的混合物（inhibitor Mix）以及阴性对照（NC），检测细胞周期变化。发现抑制miR-290家族阻滞G1/S期转化。
(B) 为(A)中G1、S、G2/M比例的量化图。*，P<0.05。
上述结果表明， 下调miR-290家族能够抑制CGR8细胞周期G1/S期转化。
图6 miR-290家族对P19细胞周期影响
(A) 在P19细胞中分别转染miR-290家族各成员抑制物的混合物（Inhibitor Mix）以及阴性对照（NC），检测细胞周期变化。发现抑制miR-290家族阻滞G1/S期转化。
(B) 为(A)中G1、S、G2/M比例的量化图。*，P<0.05。
上述结果表明，下调miR-290家族能够抑制P19细胞周期G1/S转化。
图7 miR-290家族对N
2
A细胞周期影响
(A) 在N2A细胞中分别转染miR-290家族各成员的混合物（Mix）以及阴性对照（NC），检测细胞周期变化。发现miR-290家族促进G1/S期转化。
(B) 为(A)中G1、S、G2/M比例的量化图。*，P<0.05。
上述结果表明，过表达miR-290家族能够促进N2A细胞周期G1/S期转化。
图8 miR-290家族靶向作用于Ccnd1的3’-UTR
(A) miR-290家族的种子序列结合位点；Ccnd1野生型和突变型3′-UTR序列示意图。
(B) 双荧光报告分析。miR-290家族下调含有野生型3′-UTR的报告基因表达，而对含有突变型3′-UTR的报告基因表达没有影响。**，P<0.01。
上述结果表明，Ccnd1是miR-290家族的直接靶基因。
图9 Western blot检测miR-290家族对Ccnd1蛋白调控作用
(A) 过表达miR-290家族下调N2A中Ccnd1的蛋白水平。转染miR-290的化学模拟物（mimics），通过western blotting检测Ccnd1的蛋白含量。发现miR-290家族可下调Ccnd1的蛋白含量。
(B) 为(A)的灰度扫描结果。**，P<0.01。
(C) 抑制miR-290家族上调P19中Ccnd1的蛋白水平。转染miR-290的抑制物（inhibitor），通过western blotting检测Ccnd1的蛋白含量。发现miR-290家族的inhibitor可上调Ccnd1的蛋白含量。
(D) 为(C)的灰度扫描结果。**，P<0.01。
上述结果表明，Ccnd1蛋白水平受到miR-290家族的特异调控。
具体实施方式
实施例一：miR-290家族和Ccnd1在不同干性细胞中的表达
本实验以小鼠胚胎干细胞CGR8，畸胎瘤细胞P19，以及神经瘤母细胞N2A为实验材料，分析三种不同干性细胞中miR-290家族和Ccnd1的表达情况。
用来检测的仪器为Bio-Rad公司的iQ5系统，试剂为TaKaRa公司的SYBR Green Mix。这种试剂里面含有Taq DNA聚合酶，dNTP mix，SYBR Green dye。对miRNA的检测以U6作为内参基因，对基因检测以18s为内参。本实验所用到的qRT-PCR引物为：
miR-291a-3p，Forward：5′-AAAGTGCTTCCACTTTGTGTGC-3′；
miR-294，Forward：5′-AAAGTGCTTCCCTTTGTGTGT-3′；
miR-295，Forward：5′--AAAGTGCTACTACTTTTGAGTCT-3′；
Reverse： Uni-miR qPCR primer (TaKaRa公司提供)；
U6，Forward：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA- 3′；
Reverse： 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；
Ccnd1， Forward：5′-GCGTACCCTGACACCAATCTC- 3′
Reverse：5′-CTCCTCTTCGCACTTCTGCTC-3′
Oct4，Forward：5′-GGCTTCAGACTTCGCCTCC-3′
Reverse：5′-AACCTGAGGTCCACAGTATGC-3′
细胞总RNA的提取采用生工生物公司的Trizol试剂。具体提取步骤如下：
①直接在培养板中加入Total RNA Extractor裂解细胞，每10cm2面积加1ml TotalRNA Extractor，用移液器吹打混匀。
②将裂解后样品或匀浆液室温放置 5-10min，使得核蛋白与核酸完全分离。
③加入0.2ml 氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置3min。12,000rpm 4℃离心10min。
④吸取水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20min。
⑤12,000 rpm 4℃ 离心10 min，弃上清。
⑥加入1ml 75%乙醇洗涤沉淀。12,000 rpm 4℃ 离心3min，弃上清。室温干燥5-10 min。
⑦加入30-50 ??l RNase-free ddH2O，充分溶解RNA。将所得到的RNA溶液置于-70℃保存或用于后续试验。
反转录PCR采用Takara公司 One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit。由于miRNA与mRNA不同，miRNA不具有Poly(A)结构，但在本转录试剂盒中可以同时对样品中的miRNA以及它的small noncoding RNA进行Poly(A)加尾反应，然后利用Universal Adaptor Primer将经过加尾的RNA以及mRNA进行反转录反应得到的cDNA，并引入了Uni-miR qPCR Primer的结合位点，利用这一位置可以对样品中任何cDNA进行定量PCR反应。
结果发现，miR-290家族的相对表达水平在CGR8细胞中最高；在P19细胞中，miR-290家族相对表达量低于CGR8细胞；而在N2A细胞中则没有检测到miR-290家族的表达。而Ccnd1在CGR8和P19细胞中的表达量较低，在N2A中表达量较高。（图1）可看出miR-290家族与Ccnd1的表达呈反向关系。
实施例二： miR-290家族促进细胞增殖
通过lipo2000试剂在CGR8和P19细胞中转染200 nM的miR-290家族抑制剂（inhibitor）。其中miR-290家族inhibitor的混合物Mixi为，miR-291a-3p inhibitor、miR-294-3p inhibitor和miR-295-3p inhibitor各66 nM的混合物。
通过Lipo2000向N2A细胞中转染100 nM的miR-290家族，其中miR-290家族的混合物Mix为， miR-291a-3p、miR-294-3p和miR-295-3p各33 nM的混合物。
转染步骤如下：
①转染前一天，接种适当数量的细胞至培养板中，每孔加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到50%。②准备mimic-lipo2000混合液：a.稀释miRNA mimic：用50??l不含血清培养基Opti-MEM稀释miRNA mimics，使加入细胞中的终浓度为60nmol/L轻轻混匀，室温孵育5min;b.稀释lipo2000：用50??l不含血清的Opti-MEM稀释1??l lipo2000，轻轻混匀并室温孵育5min；c.将a与b轻轻混匀，室温孵育20min。
③将miRNA-mimics-lipo2000混合液加入含有细胞及培养液的培养孔中，轻轻混匀；
④将培养板置于37℃的CO2培养箱中。培养4h后，将孔里含有mimics-lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜培养基。
之后，用CCK-8试剂盒测定细胞活性，读取OD450数值，每24 h测定一次，根据连续4 d（day）的数据绘制细胞的生长曲线（图2-4）。
通过实验发现：（1）过表达miR-290家族能够促进N2A细胞增殖，而抑制miR-290家族的表达能够减缓CGR8和P19细胞的增殖；（2）miR-290家族各成员或其对应抑制物共同作用时，其对细胞增殖或抑制的作用大于单个miR-290家族成员，提示miR-290家族成员之间存在协同效应，从而更好的发挥功能。
实施例三：miR-290家族促进细胞周期的G1/S转化。
将CGR8、P19、N2A细胞分别均匀地铺在6孔板中，每个样品三次重复。24h后转染miR-290家族的mimics或inhibitor。转染步骤参考实施例二中相应内容。48h后收集细胞。用PBS洗两次，70%乙醇固定4℃过夜。PBS洗一次，50mg/ml的RNase消化1h，室温。50mg/ml PI 染色30min，4℃。上机检测。
通过实验发现，miR-290家族促进细胞G1/S转化（图5-7），从中可以得出以下结论：（1）过表达miR-290家族促进N2A细胞G1/S转化，而下调miR-290家族的表达能够降低CGR8和P19细胞G1/S转化。（2）miR-290家族各成员或其对应的抑制物共同作用时，其对细胞G1/S转化或抑制作用大于单个miR-290家族成员，提示miR-290家族成员之间存在协同效应，从而更好的发挥其功能。
实施例四：双荧光素酶报告分析证明miR-290家族特异下调Ccnd1
通过查找NCBI数据库，查找到Ccnd1基因的mRNA序列，进而查找到该mRNA的3′-UTR序列。查找TargetScan数据库，发现在该mRNA的3′-UTR序列含有miR-290家族种子序列的结合位点。设计引物，进行PCR，将该位点包含在内。引物为：Forward： 5′- ATTGATATCGCCCTGTTACCTGATACCTGTG-3′；Reverse：5′- CCGGAATTCTTGCCCAATGAAAGACCAAT-3′。该引物引入了EcoRV和EcoR I两个酶切位点。产物的退火温度为55℃，长度为860bp。
本实验对pGL3载体上链接的预测靶基因3′-UTR中miR-290家族的结合位点进行点突变，以验证miR-290家族对预测靶基因的特异结合性。点突变的主要方法参照Stratagene定点突变原理。以已经构建完成的pGL3-3′-UTR为模板，设计相应含有点突变位点的一对互补引物约50 nt（表14），Tm值78 ℃。在PrimeSTAR?? GXL DNA Polymerase聚合酶的作用下，可以合成整个含有突变位点的质粒。在反应液中加入，DpnⅠ1 μl，37 ℃ 1 h。DpnⅠ只能切断腺嘌呤甲基化的DNA， 能将含有甲基化的原始模板消化，只留下没有甲基修饰的突变质粒。将反应液转化入感受态大肠杆菌。PCR所得的突变质粒的缺口能做大肠杆菌中得到修复，所获得的菌落即含有突变质粒。测序验证。
将含有Ccnd1野生型3′-UTR或突变型3′-UTR的pGL-3质粒，miR-290家族的mimics共转入HEK-293T细胞中，并同时转入pRL-SV40质粒作为背景信号，在转染6h后更换培养液为新鲜培养液，转染48h后，用Promega公司的双荧光素酶报告基因分析试剂盒检测pGL-3和pRL-SV40的荧光表达。转染的质粒的终浓度为400nmol/L，mimics的终浓度为60nmol/L。
结果发现，转染了miR-290家族的HEK-293T细胞中双荧光素酶的表达显著低于对照组，而miR-290家族对结合位点突变的pGL-3质粒荧光素表达无影响，说明Ccnd1是miR-290家族的靶基因，且通过Ccnd1的3′-UTR特异调控（图8）。
实施例五：Western blotting测定miR-290家族抑制Ccnd1蛋白表达
将P19、N2A细胞分别均匀地铺在6孔板中，每个样品三次重复。24h后转染miR-290家族的mimics或inhibitor。48h后收集、裂解细胞，并定量各样品中的蛋白含量。定量蛋白采用Lowry法。用Ccnd1的多抗进行检测。该抗体为Cell Singal公司生产。本实验采用12%SDS-PAGE胶进行蛋白电泳后，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。转膜缓冲液和膜清洗液的配制均参照分子克隆。Ccnd1蛋白的抗体按照1:800稀释，Gapdh蛋白的抗体按照1:1000稀释。所采用的二抗带有HRP标记，按照1:10000稀释。用Milipore的化学发光剂显色。
实验结果表明，miR-290家族能够下调Ccnd1的蛋白表达（图9）。在N2A细胞中过表达miR-290家族后，Ccnd1的蛋白水平显著下调。其中，miR-291a-3p和miR-294-3p可下调50%的Ccnd1蛋白表达量，miR-295-3p可下调40%的Ccnd1蛋白表达量。相反，在P19细胞中下调miR-290家族后，Ccnd1的蛋白水平显著上调。其中，转染miR-291a-3p的inhibitor后，Ccnd1的表达量上调为对照的1.8倍；miR-294-3p为对照的2.5倍；miR-295-3p为对照的1.4倍，可以看出，miR-294-3p的inhibitor作用效果最为明显。
尽管本发明描述了具体的实验方案，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
Claims (3)
1.一种miR-290家族在促进小鼠胚胎干细胞增殖中的应用。
2.一种miR-290家族在促进小鼠胚胎干细胞G1/S转化中的应用。
3.一种miR-290家族在调控小鼠胚胎干细胞细胞周期和自我更新能力维持中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130911 |