CN1335891A - 纯合成载体、质粒、包含它们的转基因植物和植物部分,以及获得它们的方法 - Google Patents

纯合成载体、质粒、包含它们的转基因植物和植物部分,以及获得它们的方法 Download PDF

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CN1335891A CN00802418.9A CN00802418A CN1335891A CN 1335891 A CN1335891 A CN 1335891A CN 00802418 A CN00802418 A CN 00802418A CN 1335891 A CN1335891 A CN 1335891A
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V·格鲁伯
D·科梅奥
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Abstract

本发明涉及用以促进或改进一个或多个目的基因插入真核细胞(尤其是植物细胞)的纯合成载体。本发明还涉及获得这些载体以及包含它们的转基因植物的方法。

Description

纯合成载体、质粒、包含它们的转基因植物和植物部分， 以及获得它们的方法
本发明涉及纯的合成载体，特别是准备将其用于植物生物技术领域中的遗传转化。
一般而言，生物技术和遗传操作领域的载体是已知的。然而，目前最常用于遗传转化(尤其是在植物生物技术领域的遗传转化)的载体，在其应用上存在几个缺点。实际上，通常使用的特别用于植物转基因发生(transgenesis)的载体叫做pBin19(Frisch等，1995)。该双元质粒pBin19的核苷酸序列完全已知。然而，问题在于该质粒大小较大(11.8kbp)并含有无用元件(超过pBin19的一半)，所述无用元件从调控观点来看是无法接受的，甚至对良性复制有害。而且，该质粒的选择性表达盒位于T-DNA的右边界附近。因此，当所述T-DNA在所述选择性表达盒后断裂时，它将不可能产生任何选择性，所述选择性是为了仅保留具有目的基因表达盒的植物。
用于本说明书和权利要求书的表述具有以下含义：
-“载体”是指一种表达系统，例如包被DNA的发射物、核酸基转运载体、适于运送核酸的核酸分子和自主自我复制的环状DNA，例如质粒、粘粒、噬菌粒等。如果将微生物或重组细胞培养物称为“表达载体”的宿主，则所述载体还可以包括染色体外环状DNA(例如线粒体或叶绿体DNA)、已经整合到宿主染色体中的DNA，在所述宿主中所述载体或者作为自主结构复制以有丝分裂细胞的稳定方式复制、或者整合到所述宿主的基因组中、或者保持在所述宿主的细胞核或细胞质中。
-通常用于遗传转化的载体以质粒形式存在。在此情况下，“质粒”是能够在细胞中自主复制的环状DNA分子。如果将微生物或重组细胞培养物称为“表达”质粒的宿主，则所述质粒既包含染色体外环状DNA分子，也包含已经整合到宿主染色体中的DNA。如果所述质粒由宿主细胞保持，则所述质粒或者作为自主结构复制以有丝分裂细胞稳定的方式复制，或者整合到所述宿主的基因组中；
-“纯的”是指所述载体仅含有其功能性必需的序列，并携有仅包含所述宿主细胞表达必需的元件的核酸序列；
-“核酸”是指DNA或RNA；
-“核酸序列”是指由5′末端至3′末端阅读的单链或双链核苷酸碱基寡聚体或多聚体，包括自我复制的质粒、基因、可以为感染性或非感染性的DNA或RNA聚合体，以及或者功能性或者非功能性的DNA或RNA。在用于本申请的核苷酸符号中，除非另有说明，否则单链核苷酸序列的左端为5′末端；
-“衍生的核酸序列”是指例如通过一个或几个核苷酸的置换、缺失、添加、突变、断裂和/或合成，直接或间接衍生自所指序列的序列；
-“启动子”是指转录起始密码子上游的核酸区，该区涉及RNA聚合酶和其它转录蛋白的识别和结合；
-“植物启动子”是能够在植物细胞中启动转录的启动子；
-“组成型启动子”是指能够在宿主生物的整个发育过程中，在所述生物的全部或几乎全部组织中表达核酸序列的启动子，所述核酸序列操作性地结合至所述启动子；
-“组织特异性启动子”是指能够在所述宿主生物的某些特定组织中选择性表达核酸序列的启动子，所述核酸序列操作性地结合至所述启动子；
-“操作性结合”是指功能或调节元件(例如启动子)与要表达的核酸序列或基因结合，其结合方式使得该元件影响所结合的核酸序列的转录，所述核酸序列或基因编码需要产生的蛋白；
-“表达盒”是指能够控制核酸序列或基因表达的核苷酸序列，所述核酸序列或基因编码需要在与所述核苷酸序列匹配的宿主生物体中产生的多肽。这种表达盒包含至少一个启动子和转录终止信号，以及任选地包含对表达必需或有用的其它因子；
-“异源序列”或“异源核酸序列”是指其环境以外的来源或物种的序列，或者在源自同一环境的情况下，其已经相对于其原来形式被修饰的序列。可以通过例如用限制酶处理所述核酸，以产生能够操作性结合至启动子的核酸片段，对所述核酸序列进行修饰。还可以利用例如定向诱变的技术进行所述修饰；
-“盒”是指负责调节功能的核酸序列；
-“类似”是指此术语涉及的所述盒和/或核酸序列，与称为参比序列的盒和/或已知核酸序列具有一定序列同一性或共有区，优选与所述参比序列具有至少50％的序列同一性，更优选具有至少75％的序列同一性，更特别具有至少90％的序列同一性。序列同一性的百分比以至少6个核苷酸碱基的参比窗为基础进行计算。可以使用测定与参比序列同源性的序列对比算法确定参比窗，所述算法例如局部同源性算法、同源性对比算法和相似性检索算法，这些算法还以计算机化形式存在，称为GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。通过比较参比序列和所述盒和/或所述核酸序列获得序列同一性的百分比；
-“位于”是指在已鉴定元件(例如“盒”、限制位点或具有特别功能的密码子)的核酸序列中的位置。图中给出的位置是指在核苷酸序列的阅读方向，即5′→3′方向，在所述核酸序列中的元件起始位置；
-“转基因植物”是指通过遗传操作技术获得的植物，并包括通过这些技术所获得的整株植物、其后代以及植物器官，例如根、茎和叶。按照本发明的转基因植物可以具有不同水平的倍数性，特别可以是多倍体、二倍体和单倍体；
-“繁殖体”是指植物细胞的聚集簇或联合体，它可以具有或没有一定的结构，它可再生完整植株，例如外植体、愈伤组织、茎、叶、根、插条甚至种子。
令人惊奇的是，本发明的申请人已经成功制得核苷酸序列完全已知的、较小的纯合成载体，尤其是双元质粒，使得可以消除前述的缺点，尤其提供的复制率高于最通常使用的现有载体。而且，与此同时本申请人已经成功制得一系列载体，其生产方式使得能够选择适宜于本申请设想用途的载体及其使用环境，并因此使得能够更好地控制要表达的、编码需要产生的多肽的基因的表达率。
另外，在一些按照本发明的载体中，每个功能元件或组件都可以通过单纯酶消化分离。
因此，本发明的一个目的是一种纯合成载体，它仅含有其功能性和细胞(特别是植物细胞)转基因发生必需的元件。
按照一个优选实施方案，所述载体包含以下操作性地结合的其功能性和细胞转基因发生必需的元件：
-至少一个核酸序列，它编码至少一个第一复制起点，优选oriRK2，更优选至少一个具有广泛宿主范围的大肠杆菌pRK2 ori V；
-至少一个核酸序列，它编码选择剂，优选抗生素抗性基因，更优选赋予细菌对卡那霉素抗性的nptIII基因；
-编码至少一种蛋白的trfA基因座，使得可以增加所述质粒的复制率，所述trfA基因座优选来自pRK2，更优选编码蛋白P285和P382。
按照一个更优选的实施方案，所述载体包含鉴定编号为SEQ.ID01的核酸序列。再更优选所述载体由其核酸序列鉴定编号为SEQ.ID01的单一质粒pMRT1105组成。
按照另一个优选的实施方案，所述载体包括至少一个编码第二复制起点的核酸序列，所述复制起点优选大肠杆菌ori，更优选oriColEI。所述载体更优选包含鉴定编号为SEQ.ID02的核酸序列，再更优选所述载体由其核酸序列鉴定编号为SEQ.ID02的单一质粒pMRT1106组成。
按照本发明的合成载体优选包含由至少一个核酸序列构成的区，所述核酸序列含有几个独特的酶促限制位点，总称为《多克隆位点》(MCS)。
按照一个优选的实施方案，所述载体还包括编码T-DNA的核酸序列，所述T-DNA包含右边界RB和左边界LB，使得所述载体可以起双元质粒的作用。
最好是，所述MCS位于所述T-DNA的右边界RB附近。
按照另一个优选实施方案，所述载体还包括编码至少一个表达启动子和至少一个位于所述T-DNA的左边界LB和右边界RB之间的转录终止子的核酸序列。更优选，所述表达启动子选自组成型启动子、诱导型启动子、特异性启动子，最好选自植物表达启动子。再更优选，所述表达启动子选自35SCaMV启动子、CaMV的ep35S、豌豆质体蓝素基因启动子、其“增强子”区和衍生物、小麦“高分子量麦谷蛋白”(HMWG)启动子、“木薯叶脉花叶病毒”CsVMV启动子、“鸭跖草黄色斑点病毒(commelina yellow mottle virus)”CoYMV启动子、CsVMV和CoYMV启动子的嵌合启动子，以及它们的衍生物。
所述表达终止子最好是选自植物细胞中的功能性终止子，优选35S或nos终止子。
按照再另一个优选实施方案，所述载体包含至少一个编码在植物细胞中有功能的选择剂的核酸序列，优选包含至少一个编码抗生素抗性基因和/或除草剂抗性基因的核酸序列。
所述编码选择剂的序列优选是编码bar(《bialaphos抗性》)抗性基因或pat(《膦丝菌素乙酰转移酶》)基因的序列，要不就是编码突变或野生型抗性基因nptII的序列。再更优选，编码所述选择剂的核酸序列位于所述T-DNA的左边界附近。
按照本发明的另一优选实施方案，所述载体包括至少一个含启动表达的核酸序列的表达盒，所述核酸序列操作性结合至要表达的、编码需要产生的多肽的核酸序列，其自身结合至转录终止核酸序列。需要产生的多肽优选是在体外和/或人类和或动物中具有活性的酶或蛋白或蛋白衍生物，所述活性包括消化、胰腺、胆汁、抗病毒、抗炎症、肺、抗微生物、营养、化妆、结构、血液、心血管、眼、抗原、免疫刺激和大脑活性。所述蛋白的实例例如为胰岛素、干扰素、胃、胰腺或胆汁脂肪酶、弹性蛋白酶、诸如α-1抗胰蛋白酶的抗蛋白酶、诸如胶原蛋白的结构蛋白、诸如乳铁传递蛋白的运铁蛋白、衍生自血液的蛋白，诸如血红蛋白、人白蛋白和血液辅因子，以及诸如超氧化物歧化酶的抗氧化剂。
按照本发明的一个特别优选的实施方案，所述载体以双元、线性或环状质粒形式存在，选自鉴定编号为SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID14、SEQ．ID15、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.ID19、SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22的核酸序列。
按照一个特别有利的实施方案，所述载体的每个功能元件都可以独立于其它元件被切割。最好是，每个功能元件都可以独立于其它元件，在存在于同一载体中的第一独特限制位点和第二独特限制位点的水平上通过酶促消化进行切割。
本发明的另一个目的是分离的核酸序列，其特征在于它相当于选自以下的核酸序列：鉴定编号为SEQ.ID01、SEQ.ID02、SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID14、SEQ.ID15、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.1D19、SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22的核酸序列。
本发明的再另一目的是包含如较早所述的载体或核酸序列的细胞。所述细胞优选是植物细胞。
本发明的再另一目的是如较早所述的载体或核酸序列稳定整合入其基因组的转基因植物。所述植物优选选自双子叶物种，例如马铃薯、烟草、棉花、莴苣、番茄、甜瓜、黄瓜、豌豆、油菜、甜菜根或向日葵，或选自单子叶植物，例如小麦、大麦、燕麦、稻或玉米。
本发明的再另一目的是如较早所述的转基因植物的繁殖体。所述繁殖体优选是种子。
本发明的再另一目的是一种方法，用于在细胞中表达核酸序列或基因，所述核酸序列或基因编码需要产生的多肽，所述方法的特征在于包含以下的几个阶段：
-用如较早所述的载体或核酸序列转化所述细胞；
-在允许核酸序列或基因表达的条件下，制备所述细胞的培养物，其中所述核酸序列或基因编码需要产生的多肽。所述细胞优选是原核或真核细胞。所述细胞更优选选自微生物细胞、真菌细胞、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞。所述细胞再更优选为植物细胞。
本发明的再另一目的是一种获得如较早所述的转基因植物或繁殖体的方法，其特征在于包含以下的几个阶段：
-用权利要求1-24中任一项的核酸序列或包含其的载体转化植物细胞；
-选择所述载体或核酸序列整合入其中的植物细胞；
-或者通过培养或者通过再生嵌合型全株或转基因全株，繁殖转化并选择的植物细胞。
因此，按照本发明的新合成载体，优选为双元质粒，仅含有所述载体的功能性和转基因发生必需的区。本申请人发现它们具有高复制率。另外，它们可以在左边界附近含有一个选择性表达盒，以及在其《多接头》(多克隆位点)中含有稀有限制位点。
附图描述
根据下文以实施例形式给出的不同实施方案的详细描述并参照附图，可更好地理解本发明，所述实施例不是限制性的，其中：
-图1图解示意按照本发明的优选基本载体，为pMRT1105参考标识的质粒形式，长度为3508个碱基对；
-图2表示图1载体变体的示意图，为pMRT1106参考标识的质粒形式，长度为4098个碱基对；
-图3表示按照本发明的优选载体的示意图，为pMRT1118参考标识的双元质粒形式，长度为5971个碱基对，并包括含编码对抗生素抗性的选择性表达盒和多克隆位点(MCS)的T-DNA；
-图4表示按照图3的载体的优选实施方案，所述多克隆位点(MCS)还包括其它的独特位点，所述载体为pMRT1119参考标识的双元质粒形式，长度为6016个碱基对；
-图5-22代表按照本发明的载体的其它优选实施方案，为双元质粒形式，参考标识为pMRT1121(6017个碱基对)、pMRT1122(6016个碱基对)、pMRT1155(6017个碱基对)、pMRT1175(6767个碱基对)、pMRT1176(6767个碱基对)、pMRT1191(4805个碱基对)、pMRT1192(8654个碱基对)、pMRT1193(9143个碱基对)、pMRT1195(6865个碱基对)、pMRT1196(8654个碱基对)、pMRT1201(7943个碱基对)、pMRT1202(5614个碱基对)、pMRT1203(7503个碱基对)、pMRT1204(9390个碱基对)、pMRT1205(7503个碱基对)、pMRT1206(9390个碱基对)、pMRT1210(10003个碱基对)和pMRT1212(8987个碱基对)；
-图23图示按照本发明的合成载体和已知载体系统之间的蛋白表达能力的对比；
图24-28表示按照本发明的载体的其它实施方案，为双元质粒形式，参考标识为pMRT1334(9688bp)、pMRT1335(15208bp)、pMRT1336(9285bp)、pMRT1337(8289bp)、pMRT1341(14108bp)、pMRT1342(15077bp)。
在所述图中，缩写具有以下含义：
-ori RK2：具有产生低数目拷贝的广泛宿主范围不稳定RK2复制子的大肠杆菌pRK2的ori V；
-ori ColEI：大肠杆菌的复制起点ColE1；
-nptIII基因；编码赋予对卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶；
-nptII基因：编码赋予对卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶；
-trfA：来自pRK2、允许产生P285和P382两种蛋白的trfA基因座(1481bp)，它通过结合复制起点增强所述质粒的复制；
-Tnos：nos(胭脂碱合成酶)终止子；
-Pnos：nos(胭脂碱合成酶)启动子；
-LB：T-DNA的左边界；
-RB：T-DNA的右边界；
-MCS；多克隆位点，S：XXX表示MCS起始碱基的序数，E：XXX表示MCS末端碱基的序数，列表框以5′→3′方向由顶部的第一限制位点开始，并于底部的最后一个限制位点终止；
-polyA35S：转录终止(聚腺苷酸化)信号；
-gus基因：编码β-葡糖醛酸酶的基因；
-IA：水稻肌动蛋白内含子；
-PA：水稻肌动蛋白启动子；
-Phmwg：小麦《高分子量麦谷蛋白》启动子；
-bar(《bialaphos抗性》)基因：编码赋予对glufosinate抗性的膦丝菌素乙酰转移酶基因；
-ep35S：35S核糖体的《增强启动子》。
实施例
在下文的详述中，所有的限制酶酶促消化都按照供应商NewEngland Biolabs的建议进行。借助于《Qiaquick凝胶提取》试剂盒和《Qiaquick PCR纯化》试剂盒，按照供应商QIAGEN的建议进行纯化。按照供应商GIBCO BRL Life Technologies的说明书使用《协同快速PCR纯化系统》试剂盒。所使用的《GeneAmp PCR系统9700》热循环仪购自Perkin Elmer Applied Biosystems。实施例1
1.合成pMRT1105
按照本发明的纯合成载体优选以基本质粒pMRT1105(3508bp)的形式存在，并由以下元件组成：
-ori RK2：具有产生小数目拷贝的广泛宿主范围不稳定RK2复制子的大肠杆菌pRK2的ori V(643bp)。
-nptIII基因：赋予对卡那霉素抗性(细菌选择标记，1337bp)。
-TrfA：来自pRK2、允许产生P285和P382两种蛋白的trfA基因座(1481bp)，它通过结合至所述复制起点增强所述质粒的复制。
组装通过剪接重叠延伸《ori RK2》和《部分nptIII》获得的片段，组装对应于通过PCR(《聚合酶链式反应》)扩增产生的《部分tffA》的片段和组装通过酶促消化分离的《部分tffA和nptIII》的片段，产生质粒pMRT1105。
1.1.合成具有《ori RK2和部分nptHI》的片段
利用各20pmol的以下2种寡脱氧核苷酸：含AvrII限制位点的5′AACCTAGGAAAAGACCGAGCGCCTTTGC3′(SEQ.ID23)和具有StuI限制位点的5′CGGATTAATGGTAGAAGGCCTTTCACGGGAGGGTTCGAGAAGG3′(SEQ.ID24)，在50μl终反应介质中的各200μM的dNTP、60mMTris-SO4pH9.1、18mM(NH4)2SO4、1.8mM MgSO4和2UELONGASE酶(GIBCO BRL Life Technologies)存在下，通过PCR由5ng pBin19基质(matrix)DNA扩增具有《ori RK2》(643bp)的AvrII-StuI片段(654bp)。在《GeneAmp PCR系统9700》热循环仪中进行所述PCR扩增反应。在于94℃变性3分钟后，对所述DNA进行15个循环，每个循环由以下阶段组成：94℃30秒的变性期、55℃30秒的杂交期和68℃45秒的伸长期。然后在最后一个循环中，所述伸长于68℃持续3分钟。然后，在各2μl的10mM dNTP存在下，使40μl的PCR反应介质经受12.5U Klenow片段(New England Biolabs)的作用。反应于37℃进行10分钟。然后通过在TBE缓冲液(90mM Tris-HCl、2mMNa2-EDTA、90mM硼酸，pH8.0)中的2％琼脂糖凝胶电泳分离如此处理的PCR产物，并利用《QIAquick凝胶提取》试剂盒纯化。在30μl水中回收所述DNA。
扩增具有《部分nptIII》(344bp)的StuI-BstXI片段(363 bp)，并以和《ori RK2》片段相同的方式处理，例外的是所使用的2个寡脱氧核苷酸为含StuI限制位点的5′TGAAAGGCCTTCTACCATTAATCCGCGATAAACCCAGCGAACC3′(SEQ.ID25)和具有BstXI限制位点的5′ATGCATCCAAAATTTTGGTAGAATTTACAAGCTATAAGGTTATTGTCCTGGG 3′(SEQ.ID26)。
然后为了获得片段《ori RK2和部分nptIII》，通过剪接重叠延伸装配具有《ori RK2》和《部分nptIII》的2个片段。为此，利用各20pmol的寡脱氧核苷酸：5′AACCTAGGAAAAGACCGAGCGCCTTTGC3′(SEQ.ID23)和5′ATGCATCCAAAATTTTGGTAGAATTTACAAGCTATAAGGTTATTGTCCTGGG 3′(SEQ.ID26)，在50μl终反应介质中的各200μM dNTP、60mM Tris-SO4pH9.1、18mM(NH4)2SO4、1.8mM MgSO4和2UELONGASE酶存在下，由各7.5μl的对应于《ori RK2》和《部分nptIII》的处理的PCR产物进行PCR扩增。在《GeneAmp PCR系统9700》热循环仪中进行所述PCR扩增反应。于94℃变性3分钟后，对所述DNA进行15个循环，每个循环由以下阶段组成：94℃30秒的变性期、62℃30秒的杂交期和68℃45秒的伸长期。然后在最后一个循环中，所述伸长于68℃持续3分钟。然后，使40μl的PCR反应介质进行TBE缓冲液中的1.5％琼脂糖凝胶电泳，并利用《QIAquick凝胶提取》试剂盒纯化。在30μl水中回收对应于具有《ori RK2》和《部分nptIII》的片段的DNA。接着，用BstXI继之以AvrII水解27μl的该DNA，然后利用《QIAquick PCR纯化》试剂盒纯化，并在30μl水中回收。
1.2.合成具有《部分trfA》的片段
扩增具有《部分trfA》(295bp)的NdeI-AvrII片段(295bp)，并以和片段《ori RK2》同样的方式处理，例外的是所用的两个寡脱氧核苷酸为位于NdeI位点上游的5′ATCGACGAGGAAATCGTCGTGCTGTTTGC3′(SEQ.ID27)和具有AvrII限制位点的5′AAACCTAGGAAATGCCAGTAAAGCGCTGGC3′(SEQ.ID28)。然后利用《QIAquick PCR纯化》试剂盒纯化对应于由PCR扩增产生的《部分trfA》的DNA片段，回收在30μl水中，用AvrII和NdeI水解，利用《QIAquick PCR纯化》试剂盒再纯化并回收在30μl水中。
1.3.合成具有《部分trfA和nptIII》的片段
通过用BstXI酶促消化，由9μg pBin19 DNA中分离具有《部分trfA和nptIII》(2196bp)的BstXI-NdeI片段(2196bp)，利用《QIAquickPCR纯化》试剂盒纯化，然后用NdeI水解。再后通过在TBE缓冲液中的0.9％琼脂糖凝胶电泳分离所述DNA片段，利用《QIAquick凝胶提取》试剂盒纯化并回收在30μl水中。
1.4.获得pMRT1105
连接以下3个片段：《ori RK2和部分nptIII》、《部分trfA和nptIII》和《部分trfA》。为此，用SpeedVac AES1000(SAVANT)浓缩包含7.5μl对应于《ori RK2和部分nptIII》和《部分tffA和nptIII》的消化片段和11μl对应于《部分trfA》的消化片段的反应混合物，以便达到8μl的体积。此后，加入1μlT4DNA连接酶×10缓冲液(NewEngland Biolabs)和400单位T4 DNA连接酶(New England Biolabs)。通过由200个循环组成的PCR反应在《GeneAmp PCR System 9700》热循环仪中进行连接，每个循环包括2个阶段，一个阶段为30℃30秒，另一个阶段为10℃30秒。转化先前已被制成感受态的细菌—大肠杆菌DH5α(Hanaban，1983)。通过在补加卡那霉素(50mg/l)的Luria-Bertani培养基(LB，细菌用胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、NaCl10g/l、琼脂15g/l，pH7.5)上选择获得克隆，通过碱裂解法(Bimboim和Doly，1979)提取所述克隆的质粒DNA，通过酶促消化和测序核实。产生的选择质粒叫做pMRT1105(3508bp)并示于图1。在序列表中给出了其全序列SEQ.ID01。
2.合成pMRT1106
质粒pMRT1106(4098bp)和质粒pMRT1105的区别在于其加入了大肠杆菌ColE1复制起点(《ori ColE1》)。
由购自New England Biolabs的质粒pBR322分离具有《oriColE1》(590bp)的片段。用NdeI消化所述质粒(5μg)，利用《QIAquickPCR纯化》试剂盒纯化并回收在30μlTE缓冲液(10mM Tris-HCl、1mM Na2-EDTA，pH8.0)中。因此线性化的所述质粒在12μl 500mMTris-HCl，pH7.5-500mM MgCl2、6μl1M二硫苏糖醇、各6μl的10mM dNTP存在下，在120μl反应体积中于37℃经受20单位的Klenow片段(New England Biolabs)作用30分钟。利用《QIAquick PCR纯化》试剂盒纯化如此处理的线性化质粒，并回收在30μl水中。然后用AlwNI消化，以便分离具有《ori ColEl》的片段，利用《QIAquickPCR纯化》试剂盒纯化，并在12μlT4DNA聚合酶×10缓冲液、4μl10mM dNTP和6μlBSA 1mg/ml存在下于120μl反应介质中经受6单位T4DNA聚合酶(New England Biolabs)的作用。所述反应于37℃进行30分钟。然后通过在TBE缓冲液中的1.2％琼脂糖凝胶电泳分离所述DNA片段，利用《QIAquick凝胶提取》试剂盒纯化，并回收在50μl水中。然后将该DNA片段插入到StuI消化的质粒pMRT1105(2μg)中，利用《QIAquick PCR纯化》试剂盒纯化，在120μl的终反应介质中，在12μl3×10缓冲液(New England Biolabs)存在下利用50单位的牛小肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃去磷酸化1小时，并用《QIAquick PCR纯化》试剂盒纯化。在10μl的反应介质中，在1μlT4DNA连接酶×10缓冲液(New England Biolabs)和400单位T4DNA连接酶(New England Biolabs)存在下，通过pCR反应对10ng消化的去磷酸化pMRT1105质粒和100ng具有《ori ColE1》的DNA片段进行连接。所述反应在《GeneAmp PCR System 9700》热循环仪中进行180个循环，每个循环包括2个阶段，一个阶段为10℃30秒，另一个阶段为30℃30秒。转化先前已被制成感受态的细菌—大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。使用各10pmol的两个寡脱氧核苷酸：5′AACCTAGGAAAAGACCGAGCGCCTTTGC3′(SEQ.ID23)和5′ATGCATCCAAAATTTTGGTAGAATTTACAAGCTATAAGGTTATTGTCCTGGG 3′(SEQ.ID26)，在24μl的反应介质中在22μl的SuperMixPCR(GIBCO BRL Life Technologies)存在下，通过对细菌菌落进行PCR测试，核实所获得的克隆的有效性。所述PCR扩增反应在《GeneAmpPCR System 9700》热循环仪中进行。于94℃变性5分钟后，所述DNA进行30个循环的反应，每个循环包括94℃30秒的变性期、60℃30秒的杂交期和72℃30秒的伸长期。然后，在最后一个循环中，所述伸长于72℃持续7分钟。然后所述PCR反应介质经受在TBE缓冲液中的1％琼脂糖凝胶电泳。对插入的《ori ColE1》序列显色，显示存在约1.6Kbp的片段。通过在补加卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择获得克隆，通过碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所述克隆的质粒DNA，通过酶促消化和测序核实。产生的选择质粒叫做pMRT1106(4098bp)并示于图2。在序列表中给出了其全序列SEQ.ID02.
3.合成pMRT1118
质粒pMRT1118(5971bp)与pMRT1106的不同之处在于在pMRT1106中引入了纯转移DNA(T-DNA)。该纯T-DNA由处于根癌农杆菌胭脂碱合酶基因(nos，Depicker等，1982)的启动子和终止子控制下的突变nptII基因(Frisch等，1995)表达盒组成，该表达盒位于根癌农杆菌胭脂碱菌株的质粒pTiT37的右边界(RB)和左边界(LB)之间。
3.1.合成具有《末端nptII-Tnos-LB》的片段
3.1.1.获得具有LB的片段
用各20pmol的两个寡脱氧核苷酸：含AvrII和AatII限制位点的5′TTCCTAGGTTGACGTCTTCTGATGGGCTGCCTGTATCG 3′(SEQ.ID29)和具有SmaI限制位点的5′CCTATGGATATCCCCCGGGGGATAGCCCCAGTACATTAAAAACGTCC 3′(SEQ.ID30)，在各200μM的dNTP、60mM Tris-SO4pH9.1、18mM(NH4)2SO4、1.8mM MgSO4和2UELONGASE酶(GIBCO BRLufe Technologies)存在下，在50μl终反应介质中通过PCR由5ngpBin19基质DNA扩增具有LB(151bp)的AvrII-SmaI片段(173bp)。在《GeneAmp PCR系统9700》热循环仪中进行所述PCR扩增反应。在于94℃变性3分钟后，对所述DNA进行15个循环的反应，每个循环由以下阶段组成：94℃30秒的变性期、55℃30秒的杂交期和68℃45秒的伸长期。然后在最后一个循环中，所述伸长于68℃持续3分钟。然后，在各2μl的10mM dNTP存在下，使40μl的所述PCR反应介质经受12.5U Klenow片段(New England Biolabs)的作用。所述反应于37℃进行10分钟。然后通过在TBE缓冲液中的2％琼脂糖凝胶电泳分离如此处理的PCR产物，并利用《QIAquick凝胶提取》试剂盒纯化。在50μl水中回收所述DNA。
3.1.2.获得具有nos终止子(Tnos)的片段
扩增具有nos终止子(256bp)的SmaI-BspEI片段(288bp)，并以和具有LB的片段相同的方式进行处理，例外的是所使用的两个寡脱氧核苷酸为含SmaI限制位点的5′CTATCCCCCGGGGGATATCCATAGGCCCGATCTAGTAACATAGATGAC3′(SEQ.ID31)和具有Bsp120I限制位点的5′GCGCACTTGGGCCCATAGCTCGACGAACGATCGTTCAAACATTTGGC 3′(SEQ.ID32)。
3.1.3.获得具有《nptII末端》基因(《末端nptII》)的片段
扩增具有《末端nptII》(221bp)的片段(221bp)，并以和具有LB的片段相同的方式进行处理，例外的是所使用的两个寡脱氧核苷酸为含Bsp120I限制位点的5′TTCGTCGAGCTATGGGCCCAAGTGCGCATCCCGTGGGCGAAGAACTC3′(SEQ.ID33)和BstBI下游的5′TTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGG 3′(SEQ.ID34)。
3.1.4.获得片段《末端nptII-Tnos-LB》
通过剪接重叠延伸，以两个阶段装配片段《LB》、《Tnos》和《末端nptII》：
-装配片段《LB》和《Tnos》，产生片段《Tnos-LB》，
-装配片段《Tnos-LB》和片段《末端nptII》，产生片段《末端nptII-Tnos-LB》。
为此，用各20pmol的寡脱氧核苷酸：5′TTCCTAGGTTGACGTCTTCTGATGGGCTGCCTGTATCG3′(SEQ.ID29)和5′GCGCACTTGGGCCCATAGCTCGACGAACGATCGTTCAAACATTTGGC 3′(SEQ.ID32)，在各200μM的dNTP、60mM Tris-SO4pH9.1、18mM(NH4)2SO4、1.8mM MgSO4和2UELONGASE酶(GIBCOBRLLife Technologies)存在下，在50μl终反应介质中由对应于《LB》和《Tnos》的各10μl处理的PCR产物进行第一个PCR扩增。在《GeneAmp PCR系统9700》热循环仪中进行所述PCR扩增反应。在于94℃变性3分钟后，对所述DNA进行15个循环的反应，每个循环由以下阶段组成：94℃45秒的变性期、62℃45秒的杂交期和68℃1分钟的伸长期。然后在最后一个循环中，所述伸长于68℃持续3分钟。然后，在各2μl的10mM dNTP存在下，使40μl的所述PCR反应介质经受12.5U Klenow片段(New England Biolabs)的作用。所述反应于37℃进行10分钟。然后通过在TBE缓冲液中的2％琼脂糖凝胶电泳分离如此处理的对应于片段《Tnos-LB》(477bp)的PCR产物，并利用《QIAquick凝胶提取》试剂盒纯化。在30μl水中回收所述DNA。
用各20pmol的寡脱氧核苷酸：5′TTCCTAGGTTGACGTCTTCTGATGGGCTGCCTGTATCG3′(SEQ.ID29)和5′TTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGG 3′(SEQ.ID34)，在各200μM的dNTP、60mM Tris-SO4pH9.1、18mM(NH4)2SO4、1.8mM MgSO4和2U ELONGAsE酶(GIBCO BRL Life Technologies)存在下，在50μl终反应介质中由对应于《末端nptII》和《Tnos-LB》的各7μl处理的PCR产物进行第二个PCR扩增。在《GeneAmp PCR系统9700》热循环仪中进行所述PCR扩增反应。在于94℃变性3分钟后，对所述DNA进行15个循环的反应，每个循环由以下阶段组成：94℃45秒的变性期、60℃45秒的杂交期和68℃1分钟的伸长期。然后在最后一个循环中，所述伸长于68℃持续3分钟。使对应于《末端nptII》和《Tnos-LB》的处理的PCR产物重复该反应3次。然后使所述PCR反应介质经受在TBE缓冲液中的2％琼脂糖凝胶电泳，并利用《QIAquick凝胶提取》试剂盒纯化。在100μl水中回收对应于《末端nptII-Tnos-LB》的DNA片段(672bp)。接着，用AvrII水解95μl该DNA，用《QIAquickPCR纯化》试剂盒纯化，用BstBI消化，用《QIAquickPCR纯化》试剂盒纯化，并在50μl水中回收。631bp的AvrII-BstBI片段具有序列《末端nptII-Tnos-LB》。
3.2.合成具有《nos启动子(Pnos)末端和nptII基因起始端》(末端Pnos-起始端nptII)的片段
扩增具有《末端Pnos-起始端nptII》的片段(1023bp)，并和具有LB的片段相同的方式进行处理，例外的是所使用的两个寡脱氧核苷酸为  5′GGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGG3′(SEQ.ID39)和5′ATTATTGCGCGTTCAAAAGTCGCC 3′(SEQ.ID40)，以及所述DNA进行15个循环的反应，每个循环由94℃45秒的变性期、55℃45秒的杂交期和68℃1分钟的伸长期组成。对两个pBin19 DNA样品重复所述扩增。
3.3.合成片段《末端Pnos-nptII-Tnos-LB》
通过剪接重叠延伸装配片段《末端Pnos-起始端nptII》和《末端nptII-Tnos-LB》，以产生片段《末端Pnos-nptII-Tnos-LB》。
为此，用各20pmol的寡脱氧核苷酸：5′TTCCTAGGTTGACGTCTTCTGATGGCCTGCCTGTATCG 3′(SEQ.ID29)和5′ATTATTGCGCGTTCAAAAGTCGCC 3′(SEQ.ID40)，在各200μM的dNTP、60mM Tris-SO4pH9.1、18mM(NH4)2SO4、1.8mM MgSO4和2UELONGASE酶(GIBCOBRL Life Technologies)存在下，在50μl终反应介质中由对应于《末端Pnos-起始端nptII》和《末端nptII-Tnos-LB》的各5μl处理的PCR产物进行PCR扩增。在《GeneAmp PCR系统9700》热循环仪中进行所述PCR扩增反应。在于94℃变性3分钟后，对所述DNA进行15个循环的反应，每个循环由以下阶段组成：94℃45秒的变性期、55℃45秒的杂交期和68℃1分钟的伸长期。然后在最后一个循环中，所述伸长于68℃持续3分钟。对每种对应于《末端Pnos-起始端nptII》和《末端nptII-Tnos-LB》的处理的PCR产物重复该反应5次。然后使所述PCR反应介质经受在TBE缓冲液中的0.7％琼脂糖凝胶电泳，并利用《QIAquick凝胶提取》试剂盒纯化。在50μ1水中回收对应于《末端Pnos-nptII-Tnos-LB》的DNA片段(1608bp)。接着，在15μl Klenow片段×10缓冲液(NewEng1and Biolabs)和各10μl的10mM dNTP存在下，使该DNA经受62.5U Klenow片段(New England Biolabs)的作用。所述反应于37℃进行10分钟。然后利用《QIAquick PCR纯化》试剂盒纯化如此处理的DNA，并在50μl水中回收。
3.4.合成具有《RB-MCS-Pnos起始端》的片段
3.4.1.获得具有《RB和多克隆位点(MCS)》(《RB-MCS》)的片段
扩增具有《RB-MCS》的片段(210bp)，并以和具有LB的片段相同的方式进行处理，例外的是所使用的两个寡脱氧核苷酸为具有限制位点KpnI、HindIII、EcoRI和XhoI的5′CGGTACCGAAGCTTTGAATTCACTCGAGCAGATTGTCGTTTCCCGCC3′(SEQ.ID35)和具有限制位点AvrII和AgeI的5′TATCCTAGGAACCGGTAAACCCTGTGGTTGGCATGC 3′(SEQ.ID36)。
3.4.2.获得具有《多克隆位点(MCS)和nos启动子(Pnos)起始端》(《MCS-Pnos起始端》)的片段
扩增具有《MCS-Pnos起始端》的片段(209bp)，并以和具有LB的片段相同的方式进行处理，例外的是所使用的两个寡脱氧核苷酸为5′ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG 3′(SEQ.ID37)和具有限制位点XhoI、EcoRI、HindIII和KpnI的5′GCTCGAGTGAATTCAAAGCTTCGGTACCGTTGAAGGAGCCACTCAGCCG 3′(SEQ.ID38)。
3.4.3.获得具有《RB-MCS-Pnos起始端》的片段
通过剪接重叠延伸装配片段《RB-MCS》和《MCS-Pnos起始端》，以产生片段《RB-MCS-Pnos起始端》。
为此，用各20pmol的寡脱氧核苷酸：5′ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG 3′(SEQ.ID37)和5′TATCCTAGGAACCGGTAAACCCTGTGGTTGGCATGC 3′(SEQ.ID36)，在各200μM的dNTP、60mM Tris-SO4pH9.1、18mM(NH4)2SO4、1.8mM MgSO4和2U ELONGASE酶(GIBCO BRL LifeTechnologies)存在下，在50μl终反应介质中由对应于《RB-MCS》和《MCS-Pnos起始端》的各12μl处理的PCR产物进行PCR扩增。在《GeneAmp PCR系统9700》热循环仪中进行所述PCR扩增反应。在于94℃变性3分钟后，对所述DNA进行15个循环的反应，每个循环由以下阶段组成：94℃30秒的变性期、60℃30秒的杂交期和68℃45秒的伸长期。然后在最后一个循环中，所述伸长于68℃持续3分钟。对每种剩余3×12μl的对应于《RB-MCS》和《MCS-Pnos起始端》的处理的PCR产物重复该反应。然后使所述PCR反应介质进行在TBE缓冲液中的2％琼脂糖凝胶电泳，并利用《QIAquick凝胶提取》试剂盒(QIAGEN)纯化。在100μl水中回收对应于《RB-MCS-Pnos起始端》的DNA片段(390bp)。接着，用AvrII水解95μl该DNA，用《QIAquick PCR纯化》试剂盒纯化，用Bsu36I消化，用《QIAquickPCR纯化》试剂盒纯化，并在50μl水中回收。295bp的AvrII-Bsu36I片段具有序列《RB-MCS-Pnos起始端》。
3.5.合成T-DNA
通过剪接重叠延伸装配片段《RB-MCS-Pnos起始端》和《末端Pnos-nptII-Tnos-LB》，以产生对应于T-DNA(1883bp)的片段《RB-MCS-Pnos-nptII-Tnos-LB》。
为此，用各20pmol的寡脱氧核苷酸：5′TTCCTAGGTTGACGTCTTCTGATGGGCTGCCTGTATCG 3′(SEQ.ID29)和5′TATCCTAGGAACCGGTAAACCCTGTGGTTGGCATGC3′(SEQ.ID36)，在各200μM的dNTP、60mM Tris-SO4pH9.1、18mM(NH4)2SO4、1.8mM MgSO4和2UELONGAsE酶(GIBCO BRL LifeTechnologies)存在下，在50μl终反应介质中由4μl对应于《RB-MCS-Pnos起始端》的处理PCR产物和5μl对应于《末端Pnos-nptII-Tnos-LB》的处理PCR产物进行PCR扩增。在《GeneAmpPCR系统9700》热循环仪中进行所述PCR扩增反应。在于94℃变性3分钟后，对所述DNA进行15个循环的反应，每个循环由以下阶段组成：94℃45秒的变性期、55℃45秒的杂交期和68℃1分钟的伸长期。然后在最后一个循环中，所述伸长于68℃持续3分钟。对每种对应于《RB-MCS-Pnos起始端》和《末端Pnos-nptII-Tnos-LB》的处理的PCR产物重复该反应10次。然后使所述PCR反应介质进行在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖凝胶电泳，并利用《QIAquick凝胶提取》试剂盒纯化。在100μl水中回收对应于T-DNA的DNA片段(1883bp)。接着，用AvrII水解该T-DNA(1873bp片段)，用《QIAquick PCR纯化》试剂盒纯化，并在100μl水中回收。
3.6.获得pMRT1118
将AvrII消化的T-DNA质粒引入去磷酸化的pMRT1106质粒的AvrII位点中，产生双元质粒pMRT1118(5971bp)。
为此，用AvrII消化pMRT1106质粒(5μg)，利用《QIAquickPCR纯化》试剂盒纯化，然后在120μl的终反应介质中，在12μl3×10缓冲液(New England Biolabs)存在下利用50单位的牛小肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃去磷酸化1小时，通过在TBE缓冲液中的0.6％琼脂糖凝胶电泳分离，利用《QIAquick凝胶提取》试剂盒纯化，在前述条件下用牛小肠碱性磷酸酶第二次去磷酸化，最后用《QIAquick PCR纯化》试剂盒纯化，回收在50μl水中。
在10μl的反应介质中，在1μlT4DNA连接酶×10缓冲液(NewEngland Biolabs)和400单位T4 DNA连接酶(New Englandd Biolabs)存在下，通过PCR反应对32.5ng消化的去磷酸化pMRT1106质粒和50ng消化的T-DNA片段进行连接。所述反应在《GeneAmp PCR System9700》热循环仪中进行180个循环，每个循环包括2个阶段，一个阶段为10℃30秒，另一个阶段为30℃30秒。
转化先前已被制成感受态的细菌—大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。通过在补加卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择获得克隆，通过碱裂解法(Bimboim和Doly，1979)提取所述克隆的质粒DNA，通过酶促消化和测序核实。产生的选择质粒叫做pMRT1118(图3)。在序列表中给出了其全序列SEQ.ID03。
4.合成pMRT1119
质粒pMRT1119(6016bp)与pMRT1118的不同之处在于在pMRT1118的多克隆位点MCS中加入了额外的独特限制位点。
4.1.获得额外的独特限制位点
通过杂交两个寡脱氧核苷酸：5′AGCTTGGCCGGCCGTTAACACGCGTGGATCCTTAATTAAGTCGACTCTAGAG3′(SEQ.ID41)和5′AATTCTCTAGAGTCGACTTAATTAAGGATCCACGCGTGTTAACGGCCGGCCA 3′(SEQ.ID42)，产生额外的独特限制位点(XbaI、SaII、PacI、BamHI、MluI、HipaI和FseI)。为此，混合各5μg的所述两个寡脱氧核苷酸，并于85℃保持1分钟，接着温度在5分钟内逐渐下降至80℃，然后在水浴中温度缓慢下降至60℃，最后在水浴外温度迅速下降至室温。
4.2.获得pMRT1119
将具有所述独特限制位点的序列引入到pMRT1118质粒的HindIII和EcoRI位点中，产生双元质粒pMRT1119(6016bp)。
为此，用HindIII和EcoRI双重消化pMRT1118质粒DNA(5μg)，利用《QIAquick PCR纯化》试剂盒纯化，并回收在50μl水中。
在10μl的反应介质中，在1μlT4 DNA连接酶×10缓冲液(NewEngland Biolabs)和400单位T4 DNA连接酶(New England Biolabs)存在下，通过PCR反应对75ng消化的pMRT1118质粒和500ng具有所述独特限制位点(描述于4.1.)的片段进行连接。所述反应在《GeneAmpPCR System 9700》热循环仪中进行180个循环，每个循环包括2个阶段，一个阶段为10℃30秒，另一个阶段为30℃30秒。
转化先前已被制成感受态的细菌—大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。通过在补加卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择获得克隆，通过碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所述克隆的质粒DNA，通过酶促消化和测序核实。产生的选择质粒叫做pMRT1119(图4)。在序列表中给出了其全序列SEQ.ID04。
5.合成pMRT1121
将在根癌农杆菌的胭脂碱合酶启动子(Pnos)和突变nptII基因之间的独特限制位点BspEI插入到pMRT1119中，产生质粒pMRT1121(6017bp)。
通过剪接重叠延伸装配两个PCR扩增获得的片段，从而插入BspEI位点。
5.1.合成具有“部分nptII和BspEI位点”的片段
用各20pmol的两个寡脱氧核苷酸：5′GGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGG 3′(SEQ.ID39)和具有BspEI位点的5′TAATCTGCATCCGGATCTGGATCGTTTCGC 3′(SEQ.ID43)，在各200μM的dNTP、60mM Tris-SO4pH9.1、18mM(NH4)2SO4、1.8mM MgSO4和2U ELONGASE酶(GIBCO BRL LifeTechnologies)存在下，在50μl终反应介质中由5ng pBin19基质DNA通过PCR扩增具有“部分nptII和BspEI位点”的892bp片段。重复该反应。在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中进行所述PCR扩增反应。在于94℃变性3分钟后，对所述DNA进行15个循环的反应，每个循环由以下阶段组成：94℃45秒的变性期、55℃45秒的杂交期和68℃1分钟的伸长期。然后在最后一个循环中，所述伸长于68℃持续3分钟。通过在TBE缓冲液中的2％琼脂糖凝胶电泳分离如此获得的PCR产物，并利用《QIAquick凝胶提取》试剂盒纯化。在50μl水中回收所述DNA。
5.2.合成具有“BspEI位点-MCS”的片段
用各20pmol的两个寡脱氧核苷酸：5′GCTCGAGTGAATTCAAAGCTTCGGTACCGTTGAAGGAGCCACTCAGCCG3′(SEQ.ID38)和具有BspEI位点的5′ACGATCCAGATCCGGATGCAGATTATTTGG 3′(SEQ.ID44)，用5ngpMRT1118基质DNA通过PCR扩增具有“BspEI位点-MCS”的片段(250 bp)。PCR扩增和处理所获得的PCR片段的条件和在5.1.中描述的一样。
5.3.合成具有“部分nptII-MCS”的片段
通过剪接重叠延伸装配两个PCR片段“部分nptII-BspEI位点”和“BspEI位点-MCS”，产生具有“部分nptII-MCS”的1117bp的片段。
为此，用各20pmol的两个寡脱氧核苷酸：5′GGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGG3′(SEQ.ID39)和 5′GCTCGAGTGAATTCAAAGCTTCGGTACCGTTGAAGGAGCCACTCAGCCG 3′(SEQ.ID38)，在各200μM的dNTP、60mM Tris-SO4pH9.1、18mM(NH4)2SO4、1.8mM MgSO4和2UELONGASE酶(GIBCOBRL Life Technologies)存在下，在50μl终反应介质中由各7.5μl的对应于“部分nptII-BspEI位点”和“BspEI位点-MCS”的处理的PCR产物进行PCR扩增。重复该反应4次。在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中进行所述PCR扩增反应。在于94℃变性3分钟后，对所述DNA进行15个循环的反应，每个循环由以下阶段组成：94℃45秒的变性期、62℃45秒的杂交期和68℃1分钟的伸长期。然后在最后一个循环中，所述伸长于68℃持续7分钟。通过在TBE缓冲液中的1％琼脂糖凝胶电泳分离如此获得的PCR产物，并利用“QIAquick凝胶提取”试剂盒纯化。在50μl水中回收所述DNA，用Bsu36I和PstI消化，并经受在TEB缓冲液中的2％琼脂糖凝胶电泳。分离315bp的DNA片段，并利用“QIAquick凝胶提取”试剂盒纯化。
5.4.获得pMRT1121
将具有BspEI位点的315bp的DNA片段Bsu36I-PstI连接至双元质粒pMRT1119的Bsu36I和PstI位点。
预先用Bsu36I和PstI消化质粒pMRT1119，使其经受在TEB缓冲液中的1％琼脂糖凝胶电泳，并利用《QIAquick凝胶提取》试剂盒纯化。在50μl水中回收所述DNA，在120μl的终反应介质中，在12μl3×10缓冲液(New England Biolabs)存在下利用50单位的牛小肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃去磷酸化1小时，利用“QIAquick PCR纯化”试剂盒纯化。
在10μl的反应介质中，在1μlT4DNA连接酶×10缓冲液(NewEngland Biolabs)和400单位T4DNA连接酶(New England Biolabs)存在下，通过PCR反应对100ng消化的去磷酸化pMRT1119质粒和30ng消化的DNA片段(315bp)进行连接。所述反应在“GeneAmp PCRSystem 9700”热循环仪中进行180个循环，每个循环包括2个阶段，一个阶段为10℃30秒，另一个阶段为30℃30秒。转化先前已被制成感受态的细菌—大肠杆菌DH5α或SCS110(Dam和Dcm甲基化酶缺陷)(hanahan，1983)。通过在补加卡那霉素(50mhg/l)的LB培养基上选择获得克隆，通过碱裂解法提取所述克隆的质粒DNA，通过酶促消化和测序核实。产生的质粒叫做pMRT1121(图5)。在序列表中给出了其全序列SEQ.ID05。
6.合成pMRT1122
将突变nptII基因中的点突变引入pMRT1119中，以便恢复BglII限制位点，并因此导致获得野生型nptII基因，从而产生质粒pMRT1122(6016bp)。
为此，按照Michael法(1994)通过定向诱变，恢复pMRT1119的突变nptII基因中的BglII限制位点。
在300μl的终反应介质中，在30μlT4激酶×10缓冲液(Amersham)和3μl 100mMATP存在下，通过使600pmol的寡脱氧核苷酸5′ATGGGTCACGACGAGATCTTCGCCGTCGGG 3′(SEQ.ID45)经受90单位的T4激酶(Amersham)的作用，预先使所述寡脱氧核苷酸磷酸化。利用《Qiaquick去除核苷酸》(QIAGEN)试剂盒，按照供应商的建议纯化如此处理的所述寡脱氧核苷酸。
然后利用各200pmol的寡脱氧核苷酸：5′GGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGG 3′(SEQ.ID39)、含BglII限制位点的磷酸化的5′ATGGGTCACGACGAGATCTTCGCCGTCGGG3′(SEQ.ID45)和5′ATTATTGCGCGTTCAAAAGTCGCC3′(SEQ.ID40)，在各400μM的dNTP、10μlTaqDNA连接酶×10缓冲液(NewEngland Biolabs)、5单位Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)和40单位Taq DNA连接酶(New England Biolabs)存在下，在100μl终反应介质中通过PCR对10ng pBIN19基质进行连接。在《GeneAmp PCR系统9700》热循环仪中通过执行以下三个连续阶段进行所述PCR连接反应：第一个阶段包括94℃5分钟的变性期、50℃1分钟的杂交期和65℃4分钟的伸长期组成的一个循环；第二个阶段由28个循环组成，每个循环包括94℃30秒的变性期、50℃1分钟的杂交期和65℃4分钟的伸长期；最后，最后一个阶段包括由94℃30秒的变性期、50℃1分钟的杂交期和65℃15分钟的伸长期组成的一个循环。然后使所述PCR反应介质经受在TBE缓冲液中的0.8％琼脂糖凝胶电泳，并利用《QIAquick凝胶提取》试剂盒纯化。用NcoI和PstI水解如此处理的所述DNA片段(1023bp)，并进行2％琼脂糖凝胶电泳。分离383bp的DNA片段，并利用《QIAquick凝胶提取》试剂盒纯化，在50μl水中回收，并连接至pMRT1119质粒的NcoI和PstI位点。为此，利用NcoI和PstI消化pMRT1119质粒DNA，在0.8％琼脂糖凝胶上纯化。分离对应于所述质粒的片段，利用《QIAquick凝胶提取》试剂盒纯化，然后，在120μl的终反应介质中，在12μl 3×10缓冲液(NewEnglandBiolabs)存在下利用50单位的牛小肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃去磷酸化l小时，最后在50μ1水中回收。
在10μl的反应介质中，在1μl T4 DNA连接酶×10缓冲液(NewEngland Biolabs)和400单位T4DNA连接酶(New England Biolabs)存在下，通过PCR对50ng消化的去磷酸化pMRT1119质粒和所有消化并处理的DNA片段进行连接。所述反应在《GeneAmp PCR System9700》热循环仪中进行180个循环，每个循环包括2个阶段，一个阶段为10℃30秒，另一个阶段为30℃30秒。
转化先前已被制成感受态的细菌—大肠杆菌DH5α(hanahan，1983)。通过在补加卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择获得克隆，通过碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所述克隆的质粒DNA，并通过用BglII消化进行筛选。通过酶促消化和测序核实所选择克隆的质粒DNA。产生的选择质粒叫做pMRT1122(6016bp)。该质粒示于图6，在序列表中给出了其全序列SEQ.ID06。7.合成pMRT1155
质粒pMRT1155(6017bp)与pMRT1122的不同之处在于其存在BspEI位点。
为此，通过用Bsu36I和PstI消化pMRT1121，在TEB缓冲液中的1.2％琼脂糖凝胶电泳，利用“QIAquick凝胶提取”试剂盒纯化，以及在50μl水中回收，获得含BspEI位点的315bp的插入片段。
通过用Bsu36I和PstI消化pMRT1122，在TEB缓冲液中的1.2％琼脂糖凝胶电泳，利用“QIAquick凝胶提取”试剂盒纯化，以及在50μl水中回收，获得pMRT1122载体质粒。此后，在120μl的终反应介质中，在12μl 3×10缓冲液(New England Biolabs)存在下利用50单位的牛小肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃对消化的pMRT1122去磷酸化1小时，并用“QIAquick PCR纯化”试剂盒纯化。
在10μl的反应介质中，在1μl T4 DNA连接酶×10缓冲液(NewEngland Biolabs)和400单位T4 DNA连接酶(New England Biolabs)存在下，通过PCR反应对100ng去磷酸化的消化的pMRT1122质粒和50ng消化的DNA片段(315bp)进行连接。所述反应在“GeneAmp PCRSystem 9700”热循环仪中进行180个循环，每个循环包括2个阶段，一个阶段为10℃30秒，另一个阶段为30℃30秒。转化先前已被制成感受态的细菌—大肠杆菌DH5α或SCS110(Dam和Dcm甲基化酶缺陷)(hanahan，1983)。通过在补加卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择获得克隆，通过碱裂解法提取所述克隆的质粒DNA，并通过酶促消化和测序核实。产生的质粒叫做pMRT1155(图7)。在序列表中给出了其全序列SEQ.ID07。8.获得含序列“eP35S-T35S”的基本双元质粒8.1.获得pMRT1205
质粒pMRT1205(7503bp)包括突变nptII基因的表达盒和用于克隆目的基因的“双35S启动子-35S终止子”序列(eP35S-T35S)。该质粒通过将花椰菜花叶病毒(CaMV)的eP35S启动子克隆入pMRT1175中产生。所述CaMVeP35S启动子对应于位于所述35S启动子的TATA元件上游的重复的转录激活序列(Kay等，1987)。至于质粒pMRT1175(6767bp)，通过将花椰菜花叶病毒的T35S克隆入pMRT1121中产生。转录终止序列CaMVT35S对应于产生35S转录物的花椰菜花叶病毒的环状双链DNA序列的3′端的非编码区(Franck等，1980)。8.1.1.获得pMRT1175
通过将对应于T35S的EcoRI-XhoI插入DNA片段克隆入大肠杆菌菌株SCS110产生的载体pMRT1121的EcoRI和XhoI位点中，产生质粒pMRT1175。
通过用EcoRI和XhoI消化7μg的pMRT1121，利用“QIAquickPCR纯化”试剂盒纯化，以及在50μl水中回收，获得pMRT1121载体片段。此后，在120μl的终反应介质中，在12μl3×10缓冲液(NewEngland Biolabs)存在下利用50单位的牛小肠碱性磷酸酶(New EnglandBiolabs)于37℃对消化的pMRT1121去磷酸化1小时，并用“QIAquickPCR纯化”试剂盒纯化，在50μl水中回收。
通过用EcoRI和XhoI消化衍生自质粒pJIT60(Guerineau和Mullineaux，1993)的质粒pJIT163，获得对应于所述T35S(750bp)的EcoRI-XhoI插入DNA片段(757bp)。然后使它们经受在TEB缓冲液中的1％琼脂糖凝胶电泳，用《QIAquick凝胶提取》试剂盒纯化，并在30μl水中回收。
如先前在7中所述，通过PCR反应对80ng去磷酸化的消化的pMRT1121质粒和80ng消化的插入DNA片段进行连接。转化先前已被制成感受态的细菌—大肠杆菌DH5α。通过在补加卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择获得克隆，通过碱裂解法提取所述克隆的质粒DNA，并通过酶促消化和测序核实。产生的质粒叫做pMRT1175(6767bp)。该质粒示于图8，在序列表中给出了其全序列SEQ.ID08。8.1.2.获得pMRT1205
通过将对应于eP35S的KpnI-HindIII插入DNA片段克隆入载体pMRT1175的KpnI和HindIII位点中，产生质粒pMRT1205。
通过用KpnI和HindIII消化4.1μg的pMRT1175，利用《协同快速PCR纯化系统》试剂盒纯化，以及在100μl水中回收，获得pMRT1175载体片段。此后，在120μl的终反应介质中，在12μl3×10缓冲液(New England Biolabs)存在下利用50单位的牛小肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃对消化的pMRT1175去磷酸化1小时，并用《协同快速PCR纯化系统》试剂盒纯化，在50μl水中回收。
通过用KpnI和HindIII消化衍生自质粒pJIT60(Guerineau和Mullineaux，1993)的质粒pJIT163，获得对应于eP35S(735bp)的KpnI和HindIII插入DNA片段(743bp)。然后使它们经受在TEB缓冲液中的1％琼脂糖凝胶电泳，用“QIAquick凝胶提取”试剂盒纯化，并在30μl水中回收。
如先前在7中所述，通过PCR反应对48ng去磷酸化的消化的pMRT1175质粒和30ng消化的插入DNA片段进行连接。转化先前已被制成感受态的细菌—大肠杆菌DH5α。通过在补加卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择获得克隆，通过碱裂解法提取所述克隆的质粒DNA，并通过酶促消化和测序核实。产生的质粒叫做pMRT1205(7503bp)。该质粒示于图19，在序列表中给出了其全序列SEQ.ID19。8.2.获得pMRT1203
质粒pMRT1203(7503bp)包括野生型nptII基因的表达盒和用于克隆目的基因的“双35S启动子-35S终止子”序列(eP35S-T35S)。该质粒通过将花椰菜花叶病毒(CaMV)的eP35S启动子克隆入pMRT1176中产生。至于质粒pMRT1176(6767bp)，通过将花椰菜花叶病毒的T35S克隆入pMRT1155中产生。eP35S启动子和T35S终止子如8.1.所述。8.2.1.获得pMRT1176
通过将对应于T35S(750bp)的EcoRI-XhoI插入DNA片段(757bp)克隆入大肠杆菌菌株SCS110产生的载体pMRT1155的EcoRI和XhoI位点中，产生质粒pMRT1176。
按照8.1.1.中描述的方法学获得质粒pMRT1176，例外的是消化和处理6.3μg的构成所述克隆载体的载体pMRT1155。所述质粒pMRT1176(6767bp)示于图9，在序列表中给出了其全序列SEQ.ID09。8.2.2.获得pMRT1203
通过将对应于eP35S(735bp)的KpnI-HindIII插入DNA片段(743bp)克隆入载体pMRT1176的KpnI和HindIII位点中，产生质粒pMRT1203。
按照8.1.2.中描述的方法学获得质粒pMRT1203，例外的是消化和处理3.9μg的构成所述克隆载体的载体pMRT1176。所述质粒pMRT1203(7503bp)示于图17。在序列表中给出了其全序列SEQ.ID17。9.获得含序列“eP35S-uidA-T35S”的双元质粒
使用这些载体转化烟草，以便评价它们和测定nptII基因的突变发生率。9.1.获得pMRT1206
质粒pMRT1206(9390bp)包括突变nptII基因的表达盒和uidA基因(gus)的表达盒。该质粒通过将花椰菜花叶病毒的eP35S启动子克隆入pMRT1196中产生。至于质粒pMRT1196(8654bp)，通过将uidA基因(Jefferson RA等，1986)克隆入pMRT1175中产生。9.1.1.获得pMRT1196
通过将对应于uidA基因的插入DNA片段(SmaI-“SacI＋T4DNA聚合酶”)克隆入载体pMRT1175的“XbaI＋Klenow”位点中，产生质粒pMRT1196。
通过用XbaI消化10μg的pMRT1175，利用“QIAquick PCR纯化”试剂盒纯化，在50μl水中回收，  以及在120μl反应体积中，在12μl500mM Tris-HCl，pH7.5、500mM MgCl2、6μl1M二硫苏糖醇、各6μl的10mM dNTP存在下，于37℃经受20单位的Klenow片段(New England Biolabs)作用30分钟，获得pMRT1175载体片段。然后利用“QIAquick PCR纯化”试剂盒纯化，并在50μl水中回收。在120μl终反应介质中，在12μl3×10缓冲液(New England Biolabs)存在下利用50单位的牛小肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃对如此消化和处理的质粒pMRT1175去磷酸化1小时，并用“QIAquick PCR纯化”试剂盒纯化，在50μl水中回收。
通过用SacI消化pBI221(购自Clontech)，用“QIAquick PCR纯化”试剂盒纯化，以及在50μl水中回收，获得对应于uidA基因(1.8kbp)的插入DNA片段(2μg)。此后，在120μl反应介质中，在12μl T4 DNA聚合酶×10缓冲液、 4μl10mM dNTP和6μlBSA1mg/ml存在下，使消化的pBI221经受6单位T4 DNA聚合酶(New England Biolabs)的作用。所述反应于37℃进行30分钟。用“QIAquick PCR纯化”试剂盒纯化如此处理的质粒pBI221，并回收在50μl水中。最后，用SmaI消化如此处理的pBI221。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离《[SacI＋T4DNA聚合酶]-SmaI》片段(1882bp)，用“QIAquick凝胶提取”试剂盒纯化，并在50μl水中回收。
按照在7中所述的方法学，通过PCR反应对15ng去磷酸化的消化的pMRT1175质粒和100ng消化的插入DNA片段进行连接。转化先前已被制成感受态的细菌—大肠杆菌DH5α。通过在补加卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择获得克隆，通过碱裂解法提取所述克隆的质粒DNA，并通过酶促消化和测序核实。产生的质粒叫做pMRT1196(8654bp)。该质粒示于图14，在序列表中给出了其全序列SEQ.ID14。9.1.2.获得pMRT1206
将对应于eP35S(735bp)的Kpnd-HindIII插入DNA片段(743bp)克隆入载体pMRT1196的KpnI和HindIII位点，产生质粒pMRT1206(9390bp)。
按照8.1.2.中描述的方法学获得质粒pMRT1206，例外的是消化和处理2μg的构成所述克隆载体的载体pMRT1196。该质粒示于图24，在序列表中给出了其全序列SEQ.ID24。
按照Holsters等(1978)的方法，通过直接转化将质粒pMRT1206引入到根癌农杆菌菌株LBA4404中。9.2.获得pMRT1204
质粒pMRT1204(9390bp)包括野生型nptII基因的表达盒和uidA基因的表达盒。该质粒通过将花椰菜花叶病毒的eP35S启动子克隆入pMRT1192中产生。至于质粒pMRT1192(8654bp)，通过将uidA基因克隆入pMRT1176中产生。9.2.1.获得pMRT1192
通过将对应于uidA基因的插入DNA片段(SmaI-“SacI＋T4 DNA聚合酶”)克隆入载体pMRT1176的“XbaI＋Klenow”位点中，产生质粒pMRT1192。
按照9.1.2.中描述的方法学获得质粒pMRT1192(8654bp)，例外的是所述克隆载体为pMRT1176。该质粒示于图11，在序列表中给出了其全序列SEQ.ID11。9.2.2.获得pMRT1204
将对应于eP35S(735bp)的KpnI-HindIII插入DNA片段(743bp)克隆入载体pMRT1192的KpnI和HindIII位点，产生质粒pMRT1204(9390bp)。
按照8.1.2.中描述的方法学获得质粒pMRT1204，例外的是消化和处理2μg的构成所述克隆载体的载体pMRT1192。该质粒示于图18，在序列表中给出了其全序列SEQ.ID18。
按照Holsters等(1978)的方法，通过直接转化将质粒pMRT1204引入到根癌农杆菌菌株LBA4404中。10.获得含bar基因的双元质粒
为了评价最后的质粒，使用它们转化玉米和/或烟草。10.1.产生pMRT1210
质粒pMRT1210(10003bp)包括bar基因的表达盒和uidA基因的表达盒。该质粒通过将uidA基因的表达盒克隆入pMRT1195中产生。至于质粒pMRT1195(6865bp)，通过将序列“水稻肌动蛋白基因内含子1之前的启动子”(McElroy D等，1991)克隆入pMRT1191中产生。质粒pMRT1191(4805bp)衍生自pMRT1119。10.1.1.获得pMRT1191
质粒pMRT1191(4805bp)与pMRT1119的不同之处在于其缺失nos启动子和突变nptII序列。
通过用Bsp120I消化10μgpMRT1119，然后利用“QIAquick PCR纯化”试剂盒纯化，以及在50μ1水中回收，获得所述质粒pMRT1191。此后，用KpnI水解消化的pMRT1119和[sic]，利用“QIAquick PCR纯化”试剂盒纯化，在50μl水中回收，并在120μl反应介质中，在12μlT4DNA聚合酶×10缓冲液、4μl10mMdNTP和6μl1mg/mlBSA存在下，接受6单位T4DNA聚合酶(New England Biolabs)的作用。所述反应于37℃进行30分钟。然后通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离所述载体片段，利用“QIAquick凝胶提取”试剂盒纯化，并回收在50μl水中。
通过PCR反应(方法描述于7)连接，对30ng如此处理的所述质粒进行再连接。
产生的质粒叫做pMRT1191。该质粒示于图10，在序列表中给出了其全序列SEQ.ID10。10.1.2.获得pMRT1201
质粒pMRT1201(7943bp)与pMRT1191的不同之处在于其插入了分离自质粒pUC19-Phmwg-IA-uidA-Tnos的uidA基因表达盒，所述质粒pUC19-Phmwg-IA-uidA-Tnos包含插入到pUC19(购自New EnglandBiolabs)的EcoRI和HindIII位点中的uidA基因表达盒。通过连续克隆获得该质粒。通过连续用《EcoRI继之以Klenow片段的作用》和pBI221ΔSacI(＝通过SacI消化继之以T4DNA聚合酶作用接着连接消除了其ScaI位点的pBI221(Clontech))的SmaI消化，分离对应于序列《uidA基因-nos终止子》的片段。将分离纯化的片段插入pUC19(Clontech)的《SmaI-[SphI＋T4DNA聚合酶]》位点，以便获得质粒pUC19-uidA-Tnos。此后，利用两个寡脱氧核苷酸：含BstBI位点的5′AGGCATTGGTTTCGAAGCG3′(SEQ.ID46)和5′TACGCCAAGCTTGGCAATTCC 3′(SEQ.ID47)，通过PCR由pUC19-uidA-Tnos基质扩增片段(1054bp)，通过用消化该片段获得的BstBI-HindIII片段替换pUC19-uida-Tnos的BstBI-HindIII片段，消除在Tnos的3′侧重新产生的EcoRI位点。产生的质粒叫做pUC19-uidA-TnosΔEcoRI。然后，为了在uidA基因的起始密码子水平上引入NcoI位点，用两个寡脱氧核苷酸：含NcoI和SmaI位点的5′AATACCCGGGACCATGGTCCGTCCTGTAG3′(SEQ.ID48)和位于SnabI下游的5′ATAGTCTGCCAGTTCAGTTCGTTG 3′(SEQ.ID49)，通过PCR由pUC19-uidA-TnosΔEcoRI基质扩增440bp的片段。然后将用SmaI和SnaBI消化的PCR片段插入pUC19-uidA-TnosΔEcoRI中，以便替换原有的SmaI-SnaBI片段。产生的质粒叫做pUC19-NcoI-uidA-Tnos。此后，将EcoRI-SmaI片段具有的Phmwg启动子[高分子量麦谷蛋白，Anderson等，(1989)]引入pUC19-NcoI-uidA-Tnos的EcoRI和SmaI位点中，以便产生质粒pUC19-Phmwg-uidA-Tnos。最后，水稻肌动蛋白基因的内含子1(IA，EcoRV-SmaI片段)来自质粒pActl-F6(McElroy D等，1991)，该质粒特别通过在含IA的EcoRV-SmaI片段两侧加入限制位点而自身修饰。由修饰的pActl-F6分离具有IA的SmaI-NcoI片段，将其插入pUC19-Phmwg-uidA-Tnos的SmaI和NcoI位点中，以便产生质粒pUC19-Phmwg-IA-uidA-Tnos。所用的技术是已经在本专利中描述的技术。
通过用EcoRI消化2μg的pMRT1191，利用《协同快速PCR纯化系统》试剂盒纯化，接着在120μl反应体积中，在12μl 500mMTris-HCl，pH7.5、500mM MgCl2、6μl1M二硫苏糖醇、各6μl的10mM dNTP存在下，于37℃经受20单位的Klenow片段(NewEngland Biolabs)作用30分钟，利用《协同快速PCR纯化系统》试剂盒纯化，以及在50μl水中回收，获得pMRT1191载体片段。此后，在120μl终反应介质中，在12μl3×10缓冲液(New England Biolabs)存在下用50单位牛小肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃对消化和处理的pMRT1191去磷酸化1小时，用《协同快速PCR纯化系统》试剂盒纯化，并在50μl水中回收。
通过用ScaI(pUC19中存在的位点)消化pUC19-Phmwg-IA-uidA-Tnos，用“QIAquick PCR纯化”试剂盒纯化，在50μl水中回收，用HindIII消化，用“QIAquickPCR纯化”试剂盒纯化，在50μl水中回收，在120μl反应体积中，在12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5、500mMMgCl2、6μl1M二硫苏糖醇、各6μl的10mM dNTP存在下，于37℃用20单位的Klenow片段(New England Biolabs)处理30分钟，用“QIAquick PCR纯化”试剂盒纯化，在50μl水中回收，以及用EcoRI消化，获得对应于uidA基因表达盒(3kbp)的插入DNA片段(2μg)，即处于水稻肌动蛋白基因内含子1之前的小麦“高分子量麦谷蛋白”启动子和根癌农杆菌胭脂碱合酶终止子控制下的uidA基因。此后，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离所述插入的DNA片段，用“QIAquick凝胶提取”试剂盒纯化，如上所述经受Klenow片段的作用，并在50μl水中回收。
如先前在7中所述，通过PCR反应对10ng去磷酸化的消化的pMRT1191质粒和100ng消化和处理的插入DNA片段进行连接。转化先前已被制成感受态的细菌—大肠杆菌DH5α。通过在补加卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择获得克隆，通过碱裂解法提取所述克隆的质粒DNA，并通过酶促消化和测序核实。产生的质粒叫做pMRT1201(7943bp)。该质粒示于图15，在序列表中给出了其全序列SEQ.ID15。10.1.3.获得pMRT1210
质粒pMRT1210(10003bp)与pMRT1201的不同之处在于其插入了分离自pSB12-Pact-IA-bar-Tnos的序列“水稻肌动蛋白基因内含子1之前的启动子-bar基因”(Pact-IA-bar)，所述pSB12-Pact-IA-bar-Tnos衍生自Komari等(1996)所述的pSB12。通过将分离自pDM302的表达盒《Pact-IA-bar-Tnos》(BspDI-《XhoI＋Klenow》片段)克隆到其LB侧的XhoI位点缺失的pSB12的SmaI和BspDI位点中，产生质粒pSB12-Pact-IA-bar-Tnos。在Wu R.的实验室构建的质粒pDM302包含购自Promega的质粒pSP72中的表达盒《Pact-IA-bar-Tnos》。
通过用HpaI消化2μg的pMRT1201，利用《协同快速PCR纯化系统》试剂盒纯化，以及在98μl水中回收，获得pMRT1201载体片段。此后，在120μl的终反应介质中，在12μl3×10缓冲液(New EnglandBiolabs)存在下用50单位的牛小肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃对消化的pMRT1201去磷酸化1小时，用《协同快速PCR纯化系统》试剂盒纯化，并在50μl水中回收。
通过用XbaI消化pBIOS273，用“QIAquick PCR纯化”试剂盒纯化，在50μl水中回收，在120μl反应体积中，在12μl500mMTris-HCl，pH7.5-500mM MgCl2、6μl1M二硫苏糖醇和各6μl的10mM dNTP存在下，于37℃用20单位的Klenow片段(New EnglandBiolabs)处理30分钟，获得对应于“Pact-IA-bar”(2.1kbp)的插入DNA片段(2μg)。然后通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离如此处理的所述插入DNA片段，用“QIAquickPCR纯化”试剂盒纯化并在50μl水中回收。
如先前在7中所述，通过PCR反应对60ng去磷酸化的消化的pMRT1201质粒和100ng消化和处理的插入DNA片段进行连接。转化先前已被制成感受态的细菌—大肠杆菌DH5α。通过在补加卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择获得克隆，通过碱裂解法提取所述克隆的质粒DNA，并通过酶促消化和测序核实。产生的质粒叫做pMRT1210。该质粒示于图21，在序列表中给出了其全序列SEQ.ID21。
然后按照Holsters等(1978)的方法，通过直接转化将该质粒pMRT1210引入到根癌农杆菌菌株LBA4404(pSBl)[KomariT等，1996]和菌株LBA4404中。10.1.4.获得pMRT1193
通过将具有分离自10.1.2.所述的pUC19-Phmwg-IA-uidA-Tnos的序列《Phmwg-IA-uidA-Tnos》的《EcoRI-[HindIII＋Klenow片段作用]》片段克隆入pMRT1119的EcoRI和[XhoI＋Klenow片段作用]位点，获得双元质粒pMRT1193。
为此，通过用XhoI消化10μg的pMRT1119，利用“QIAquick PCR纯化”试剂盒纯化，在50μl水中回收，在120μl反应体积中，在12μl500mM Tris-HCI，pH7.5-500mM MgCl2、6μl1M二硫苏糖醇和各6μl的10mM dNTP存在下，于37℃用20单位的Klenow片段(NewEngland Biolabs)处理30分钟，获得pMRT1119载体片段。然后用“QIAquickPCR纯化”试剂盒纯化并用EcoRI消化。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离处理的载体片段，用“QIAquickPCR纯化”试剂盒纯化并在50μl水中回收。此后，在120μl终反应介质中，在12μl3×10缓冲液(New England Biolabs)存在下用50单位的牛小肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃对消化的pMRT1119去磷酸化1小时，用“QIAquickPCR纯化”试剂盒纯化，并在50μl水中回收。
通过用ScaI(pUC19中存在的位点)消化pUC19-Phmwg-IA-uidA-Tnos，用“QIAquick PCR纯化”试剂盒纯化，在50μl水中回收，用HindIII消化，用“QIAquickPCR纯化”试剂盒纯化，在50μl水中回收，在120μl反应体积中，在12μl500mM Tris-HCl，pH7.5，500mMMgCl2、6μl1M二硫苏糖醇、各6μl的10mM dNTP存在下，于37℃用20单位的Klenow片段(New England Biolabs)处理30分钟，用“QIAquick PCR纯化”试剂盒纯化，在50μl水中回收，以及用EeoRI消化，获得对应于uidA基因表达盒(3kbp)的插入DNA片段(2μg)，即处于水稻肌动蛋白基因内含子1之前的小麦“高分子量麦谷蛋白”启动子和根癌农杆菌胭脂碱合酶终止子控制下的uidA基因。然后，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离所述插入的DNA片段，用“QIAquick凝胶提取”试剂盒纯化，并在50μl水中回收。
如先前在7中所述，通过PCR反应对20ng去磷酸化的消化的pMRT1119质粒和100ng消化和处理的插入DNA片段进行连接。转化先前已被制成感受态的细菌—大肠杆菌DH5α。通过在补加卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择获得克隆，通过碱裂解法提取所述克隆的质粒DNA，并通过酶促消化和测序核实。产生的质粒叫做pMRT1193(9143bp)。该质粒示于图12，在序列表中给出了其全序列SEQ.ID12。10.2.获得pMRT1195
质粒pMRT1195(6857bp)与pMRT1191的不同之处在于其插入了序列“水稻肌动蛋白基因内含子1之前的启动子-bar基因”(Pact-IA-bar)。如10.1.1所述，通过用Bsp120I和KpnI消化载体pMRT1191，接着用酶T4DNA聚合酶作用并去磷酸化，但不重新连接，获得所述质粒pMRT1195。
如10.1.3.所述，获得对应于“Pact-IA-bar”(2.1kbp)的插入DNA片段。
如先前在7中所述，通过PCR反应对20ng去磷酸化的消化的pMRT1191质粒和100ng消化和处理的插入DNA片段进行连接。转化先前已被制成感受态的细菌—大肠杆菌DH5α。通过在补加卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择获得克隆，通过碱裂解法提取所述克隆的质粒DNA，并通过酶促消化和测序核实。产生的质粒叫做pMRT1195。该质粒示于图13，在序列表中给出了其全序列SEQ.ID13。10.3.获得pMRT1202
质粒pMRT1202(5614bp)与pMRT1195的不同之处在于其用分离自大肠杆菌菌株SCS110产生的pMRT1121的根癌农杆菌胭脂碱合酶(Pnos)启动子替换序列“Pact-IA”。
用PstI消化2μg的pMRT1195载体片段，利用《协同快速PCR纯化系统》试剂盒纯化，在98μl水中回收，在120μl反应介质中，在12μlT4DNA聚合酶×10缓冲液、4μl10mMdNTP和6μlBSA1mg/ml存在下，通过6单位T4DNA聚合酶(New England Biolabs)的作用进行处理。所述反应于37℃进行30分钟。然后利用《协同快速PCR纯化系统》试剂盒纯化所述载体片段，在50μl水中回收，用HindIII消化，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，利用《协同快速PCR纯化系统》试剂盒纯化，并在98μl水中回收。此后，在120μl终反应介质中，在12μl3×10缓冲液(New England Biolabs)存在下，用50单位的牛小肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃对消化和处理的pMRT1195去磷酸化1小时，用《协同快速PCR纯化系统》试剂盒纯化，并在50μl水中回收。
通过用BspEI消化pMRT1121，利用《协同快速PCR纯化系统》试剂盒纯化，在98μl水中回收，在120μl反应体积中，在12μl500mMTris-HCl，pH7.5-500mMMgCl2、6μl1M二硫苏糖醇和各6μl的10mM dNTP存在下，于37℃用20单位的klenow片段(New EnglandBiolabs)处理30分钟，利用《协同快速PCR纯化系统》试剂盒纯化，在50μl水中回收，并用HindIII消化，获得对应于“Pnos”的插入DNA片段。然后通过2％琼脂糖凝胶电泳分离具有Pnos(209 bp)的插入DNA片段(219bp)，用《协同快速PCR纯化系统》试剂盒纯化，并在50μl水中回收。
如先前在7中所述，通过PCR反应对48ng去磷酸化的消化的pMRT1195质粒和56ng消化和处理的插入DNA片段进行连接。转化先前已被制成感受态的细菌—大肠杆菌DH5α。通过在补加卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择获得克隆，通过碱裂解法提取所述克隆的质粒DNA，并通过酶促消化和测序核实。产生的质粒叫做pMRT1202。该质粒示于图16，在序列表中给出了其全序列SEQ.ID16。10.4.获得pMRT1212
质粒pMRT1212(8987bp)与pMRT1206的不同之处在于其用bar基因替换了nptII基因。
为此，通过用Bsu36I消化2μg的pMRT1206，利用《协同快速PCR纯化系统》试剂盒纯化，在50μl水中回收并用AatII消化，获得pMRT1206载体片段。通过用Bsu36I和AatII消化使得所述载体缺失对应于《部分Pnos nptII Tnos LB》的片段。然后对所述消化的载体片段进行1％琼脂糖凝胶电泳分离，利用《协同快速PCR纯化系统》试剂盒纯化，并在98μl水中回收。然后在120μl终反应介质中，在12μl3×10缓冲液(New England Biolabs)存在下，用50单位的牛小肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃对此消化和处理的载体片段去磷酸化1小时，用《协同快速PCR纯化系统》试剂盒纯化，并在50μl水中回收。
通过用Bsu36I消化2μg的pMRT1202，利用协同快速PCR纯化系统试剂盒纯化，在40μl水中回收，用AatII消化，通过1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，利用协同快速PCR纯化系统试剂盒纯化，并在50μl水中回收，获得对应于《部分Pnos npuI Tnos LB》(1.2kbp)的插入DNA片段。
如先前在7中所述，通过PCR反应对100ng去磷酸化的消化的pMRT1206质粒和50ng消化的插入DNA片段进行连接。转化先前已被制成感受态的细菌—大肠杆菌DH5α。通过在补加卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择获得克隆，通过碱裂解法提取所述克隆的质粒DNA，并通过酶促消化和测序核实。产生的质粒叫做pMRT1212。该质粒示于图22，在序列表中给出了其全序列SEQ.ID22.11.评价在细菌中产生的合成载体
测定得自细菌大肠杆菌菌株DH5α的质粒的产量。I.非双元合成质粒
在10ml补加50mg/l卡那霉素的LB培养基中，于37℃由各500ml的质粒pMRT1105、pMRT1106或pMRT1105-ori ColE1的“甘油原液”连续16小时制备具有所述各个质粒的重组细菌的原始培养物。此后，在100ml补加50mg/l卡那霉素的LB中，于37℃培养各500ml的所述原始培养物23小时。对于pMRT1106，制备两种培养物，一种没有加入氯霉素，而另一种在培养7小时后加入了40mg/l的氯霉素。然后以5000g离心所述培养物10分钟。采用“QIAFilter质粒Midi试剂盒”(QIAGEN)，按照生产商的建议提取所述质粒DNA，并用分光光度计定量测定。测定所获得的质粒的量，pMRT1105、pMRT1106、用氯霉素处理的pMRT1106和pMRT1105-ori ColE1(其中在pMRT1106的反方向插入ori ColE1的质粒pMRT1105)分别为10mg、50.6mg、86.2mg和9.8mg。这些结果表明，所述合成质粒在大肠杆菌中复制，在右方存在的复制起点“ori ColE1”(“ori RK2”附近的“ori ColE1”的NdeI位点)使得产量增加5倍，而反向的“ori ColE1”显示没有影响，用氯霉素处理额外增加了1.6倍。11.2.合成双元质粒
相对于对照pBin19和pBIOC4，评价合成双元质粒pMRT1118和pMRT1119。质粒pBIOC4与pGA492(An，1986)的不同之处在于其实际上缺失了所有的pGA492 cat基因编码序列，以及其HindIII位点转变为EcoRI位点。通过用SacI和ScaI双重消化pGA492，接着经受酶T4 DNA聚合酶(New England Biolabs)的作用，并在10μl反应介质中，在1μlT4 DNA连接酶×10缓冲液(Amersham)和2.5单位的T4DNA连接酶(Amersham)存在下，于14℃连接修饰的质粒(20ng)16小时，获得所述质粒pBIOC4。转化先前已被制成感受态的细菌—大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。通过在四环素(12mg/l)上选择获得克隆，通过碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所述克隆的质粒DNA，并通过酶促消化分析。然后用磷酸化的HindIII-EcoRI连接物(Stratagene)，将所选择的克隆的质粒DNA的HindIII位点修饰为EcoRI位点。为此，用HindIII消化500ng的所选择克隆的质粒DNA，用酶牛小肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)按照生产商的建议去磷酸化，并在1500ng的HindIII-EcoRI连接DNA、0.1体积的3M乙酸钠，pH4.8和2.5体积的无水乙醇存在下，于-80℃共沉淀30分钟。以12000g离心30分钟后，用70％乙醇洗涤沉淀的DNA，干燥、在8μl水中回收、于65℃保持10分钟，然后如前所述连接。在T4 DNA连接酶于65℃失活10分钟后，用EcoRI消化连接反应混合物、通过0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化、电洗脱、用无水乙醇沉淀、以12000g离心30分钟、用70％乙醇洗涤、干燥，然后连接并引入到大肠杆菌菌株DH5α中，并如前所述处理。
在10ml补加50mg/l卡那霉素的LB培养基中，于37℃由各500ml的上述各个质粒的“甘油原液”连续16小时制备具有所述各个质粒的重组细菌的原始培养物，pBIOC4除外，它在12mg/l的四环素上选择。此后，在100ml补加相应抗生素的LB中，于37℃培养各250ml的所述原始培养物23小时。然后以5000g离心所述培养物10分钟。采用“QIAFilter质粒Midi试剂盒”(QIAGEN)，按照生产商的建议提取所述质粒DNA，并用分光光度计定量测定。测定所获得的质粒的量，pMRT1118、pMRT1119、pBin19和pBIOC4分别为94.2mg、113mg、37.2mg和45.6mg。
这些结果表明，所述合成双元质粒在大肠杆菌中复制，pMRT1119的产量相对于pBinl9和pBIOC4对照，分别增加3倍和2.5倍。
而且，这些合成质粒在根癌农杆菌菌株LBA4404中复制。12.通过转基因生成评价所述合成质粒12.1.转化烟草12.1.1.稳定转化烟草
按照Horsch等(1985)所述的方法，通过用重组农杆菌体外感染分离自6周龄的烟草幼苗的叶盘，对烟草(烟草属PBD6变种(NicotianatabacumL.var.PBD6))进行转化。
在控制的环境舱中制备所有的体外培养物，在所述环境舱中，光强度为200μE.m-2.s-1，光周期为16小时光照/8小时黑暗，温度为25℃。
除了开始的共培养阶段，再生期、发育期和生根期在补加抑菌剂(即400mg/l的复方羟氨苄青霉素)和选择剂(即200或100mg/l的卡那霉素)的不同选择培养基上进行。
不同的阶段和使用的培养基如下：
在补加终浓度为6mM的CaCl2和合适抗生素的5ml2YT培养基(细菌用胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、NaCl5g/l，pH7.2)中，于28℃原代培养农杆菌48小时后，在补加CaCl2和抗生素的10ml 2YT培养基中于28℃进行一夜的培养。然后以3000g离心所述培养物10分钟，并在10ml液体MS30(4.4g/l的M0404，购自SIGMA，补加30g/l的蔗糖，pH5.7)中重悬浮所述细菌。
通过使约1cm2的切自所述幼苗叶片的叶外植体体外接触在液体MS30中稀释10倍的农杆菌悬浮液20分钟，进行共培养。然后将如此处理的所述外植体在滤纸上快速干燥，并在控制的环境舱中置于固体共培养培养基(CM)(MS30、苄氨基嘌呤(BAP)1mg/l、0.1mg/l的吲哚-3乙酸(ANA)、8g/l的琼脂)上培养48小时。
然后将所述处理的外植体置于固体再生培养基上(固体CM、复方氨苄青霉素400mg/l、卡那霉素200mg/l)。两周后将所述外植体移植到相同培养基上。
两周后将苗条移植到固体发育培养基上(M04044.4g/l，购自SIGMA，补加蔗糖20g/l，pH5.7(液体MS20)、复方氨苄青霉素400mg/l、卡那霉素100mg/l、琼脂8g/l)。
两周后，将转化的幼苗移植到与所述发育培养基相同的固体生根培养基上。需要2-3周生根，此后将幼苗移至Giffy箱(pot)的生长室中达10天(光周期为16小时光照/8小时黑暗，23℃，70％相对湿度)，然后置于温室中。12.1.2.评价用于转化烟草的合成质粒
使用含所述合成双元质粒pMRT1118或对照双元质粒pBin19的重组农杆菌(根癌农杆菌菌株LBA4404)转化烟草(烟草属PBD6变种)。
结果显示，两种受试双元质粒在选择剂(卡那霉素)存在下发育的幼苗的数目和生长情况相似。这些观察结果表明，所述合成双元质粒对于转化烟草完全有效。12.2.转化玉米12.2.1.遗传转化玉米愈伤组织
无论使用何种方法(电穿孔、农杆菌、微丝(microfibres)、基因枪)，遗传转化玉米通常都需要使用快速分裂的未分化细胞，所述细胞保有再生为全株的能力。这种类型的细胞组成了玉米的松散胚发生愈伤组织(称为II型)。
这些愈伤组织按照Armstrong(Maize handbook，1994，Freeling M和Walbot V(编辑)，665-671页)描述的方法，并在Armstrong所述的培养基上，由基因型HI、II或(A188×B73)的未成熟胚获得。繁殖如此获得的愈伤组织，并通过每2周1次的在起始培养基(starting medium)上的连续传代培养来保持。
按照Vain等(1989)描述的方法，通过改变所述细胞的激素平衡和渗透平衡，由这些愈伤组织再生幼苗。然后在温室中使这些植株茁壮，在所述温室中所述植株可以杂交或自交。12.2.2.用基因枪遗传转化玉米
在12.2.1.中描述了需要转化的细胞系的产生和再生。
Finer等(1992)描述了使用基因枪进行遗传转化的方法。靶细胞为表面积10-20mm2的愈伤组织碎片。将这些碎片置于补加0.2M甘露醇和0.2M山梨醇的起始培养基上4小时，然后轰击。
按照Klein(1987)所述的方法，共沉淀钨粒(M10)和转化质粒。按照Finer等(1992)的方法，利用基因枪让如此包被的颗粒射向所述靶细胞。
将受轰击的愈伤组织于27℃置于黑暗中。24小时后，第一次传代培养，接着在3个月内在起始培养基上每2周传代培养1次，所述起始培养基已经加入了仅选择所述转化的愈伤组织的合适的选择剂。然后如12.2.1.所述在所述选择剂存在下培养这些愈伤组织，以便再生为转化幼苗。使获得的幼苗茁壮，并转移到它们可以杂交或自交的温室中。12.2.3.用根癌农杆菌遗传转化玉米
所使用的技术描述于Ishida等(1996)。在LS-inf培养基中洗涤长度为1.0-1.2mm(授粉后9-14天)的未成熟胚，然后在农杆菌悬浮液中浸渍，如Ishida等(1996)所述制备，涡旋30秒，并于室温下温育5分钟。在黑暗中于25℃将如此处理的所述未成熟胚在LS-AS培养基上培养3天，然后转移至补加5mg/l膦丝菌素和250mg/l头孢噻肟的LSD1.5培养基，在黑暗中于25℃两周，最后置于补加10mg/l膦丝菌素和250mg/l头孢噻肟的LSD1.5培养基上，在黑暗中于25℃三周。分离由此再生的I型愈伤组织，粉碎并转移至补加10mg/l膦丝菌素和250mg/l头孢噻肟的LSD1.5培养基上，在黑暗中于25℃三周。然后分离增殖的所述I型愈伤组织，并将其置于补加5mg/l膦丝菌素和250mg/l头孢噻肟的LSZ培养基上，于25℃经受16小时光照/8小时黑暗的光周期2-3周。然后将再生的幼苗转移至1/2LSF培养基，于25℃经受16小时光照/8小时黑暗的光周期1-2周，然后转移至生长室和温室。13.载体主链对基因表达的影响
获得用具有野生型nptII基因的合成双元质粒pMRT1204(16株植株)和具有突变nptII基因的pMRT1206(12株植株)稳定转化的烟草植株，还获得用对照载体pBI21(Clontech销售，对应于具有野生型nptII基因并含有表达盒“P35S-A-polyAnos”的质粒pBIN19)稳定转化的烟草植株(11株植株)。
使用5Prime→3Prime出售的NPTII ELISA试剂盒，通过对蛋白提取物进行ELISA分析，评价所述合成载体主链和所述对照的影响。所述分析能够定量所产生的相对于可溶性提取蛋白量(ng)的NPTII蛋白量(μg)。
在“Tris-HCl 25mM pH7.8；苯基甲磺酰氟1mM”缓冲液中，由液氮中磨碎的烟草叶片中提取所述蛋白。以10000g和4℃离心10分钟后，按照Bradford法(利用蛋白-染料结合原理快速且敏感地检测微克量蛋白的方法，Anal.Biochem.(1976)72，248-254)检测包含在上清液中的提取出的可溶性蛋白。
用于ELISA定量的抗体为特异性识别包被的NPTII蛋白的兔多克隆抗体和用于检测NPTII蛋白的生物素酰化的抗-NPTII抗体。
分析结果示于图23，它表明：
·对于野生型nptII基因盒和不同的质粒主链，用所述合成双元质
粒pMRT1204获得的NPTII量比用最初的pBIN19双元质粒获
得的NPTII量高6.7倍，这证实了所述合成载体的功效。
·对于具有不同nptII基因(即野生型nptII基因和突变nptII基因)
的相同质粒主链，即合成双元质粒pMRT1204和pMRT1206，
所述野生型基因获得的NPTII量与突变nptII基因获得的NPTII
量相差1.2倍。14.合成pMRT1334
通过用pBIN19的nptII表达盒替换pMRT1206的nptII表达盒，获得质粒pMRT1334(9688bp)。
通过用KpnI消化10μg的pMRT1206，利用“协同快速PCR纯化系统”试剂盒纯化，并在50μl水中回收，获得衍生自pMRT1206的载体片段。然后在120μl反应混合物中，在12μlT410×DNA聚合酶缓冲液、4μl10 mMdNTP和6μl1mg/mlBSA存在下，使消化的pMRT1206经受6单位T4DNA聚合酶(New England Biolabs)的作用。所述反应于37℃进行30分钟。利用“协同快速PCR纯化系统”纯化消化并如此处理的pMRT1206载体，在50μl水中回收，然后用AflII消化。通过在1％琼脂糖凝胶上电泳分离衍生自pMRT1206的载体片段，利用“协同快速PCR纯化系统”试剂盒纯化，并在50μl水中回收。
通过用DraI和AflII消化9μgp BIN19质粒，获得对应于nptII表达盒的DNA插入片段DraI-AflII(1.5kbp)。然后，使所述片段在TEB缓冲液中的1％琼脂糖凝胶上进行电泳，利用“协同快速PCR纯化系统”纯化，并在50μl水中回收。
在20μl反应混合物中，在2μlT410×DNA连接酶缓冲液(Epicentre Technologies)、2μl2.5mM ATP和4单位T4 DNA连接酶(Epicentre Technologies)存在下，使用100ng衍生自pMRT1206的质粒片段和100ng所述DNA插入片段DraI-AflII进行PCR连接反应。所述反应在“GeneAmp PCR System 9700”热循环仪中进行180个循环，每个循环包括2个步骤，第一个步骤为10℃30秒，第二个步骤为30℃30秒。
转化先前已被制成感受态的大肠杆菌DH5α细菌(Hanahan，1983)。通过在补加卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择获得克隆，按照碱裂解法提取所述克隆的质粒DNA，通过酶促消化和测序核实。产生的质粒叫做pMRT1334(图24)。在序列表中给出了其全序列SEQ.ID50。15.合成pMRT1335
质粒pMRT1335(15208bp)是对照载体，通过将分离自pMRT1206的表达盒“ep35S-gus(uidA)-polyA35S”插入到pBIN19中产生。
用EcoRI消化13μg的pBIN19质粒，利用“协同快速PCR纯化系统”纯化，并在50μl水中回收。然后在120μl反应体积中，在12μl500mM pH7.5 Tris-HCl500mMMgCl2、6μl1M二硫苏糖醇、各6μl的10mM dNTP存在下，使先前消化的pBIN19于37℃经受20单位的-enow片段(New England Biolabs)作用60分钟。利用“协同快速PCR纯化系统”纯化消化的pBIN19载体，在50μl水中回收，然后用KpnI消化。通过在1％琼脂糖凝胶上电泳分离如此产生的所述载体片段，利用“协同快速PCR纯化系统”纯化，并在50μl水中回收。
通过用XhoI消化10μg的质粒pMRT1206，利用“协同快速PCR纯化系统”纯化，并在50μl水中回收，接着在120μl反应体积中，在12μl500mM pH7.5 Tris-HCl500mM MgCl2、6μl1M二硫苏糖醇、各6μl的10mM dNTP存在下，于37℃经受20单位的Klenow片段(NewEngland Biolabs)作用60分钟，然后利用“协同快速PCR纯化系统”纯化，在50μl水中回收，最后用KpnI消化，获得对应于“ep35S-gus(uidA)-polyA35S”(3.5kbp)表达盒的DNA插入片段。通过在TEB缓冲液中的1％琼脂糖凝胶上进行电泳分离如此产生的所述DNA插入片段，利用“协同快速PCR纯化系统”纯化，并在50μl水中回收。
在20μl反应体积中，在2μlT410×DNA连接酶缓冲液(EpicentreTechnologies)、2μl2.5mM ATP和4单位T4 DNA连接酶(EpicentreTechnologies)存在下，使用100ng处理的pBIN19和100gn先前制备的DNA插入片段进行PCR连接反应。所述反应在“GeneAmp PCRSystem 9700”热循环仪中进行180个循环，每个循环包括2个步骤，第一个步骤为10℃30秒，第二个步骤为30℃30秒。
转化先前已被制成感受态的大肠杆菌DH5α细菌(Hanahan，1983)。通过在补加卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择获得克隆，按照碱裂解法提取所述克隆的质粒DNA，通过酶促消化和测序核实。产生的质粒叫做pMRT1335(图25)。在序列表中给出了其全序列SEQ.ID51。16.合成pMRT1336
通过将分离自质粒pMRT1322的启动子MPr1165(610bp)插入到pMRT1196中，产生质粒pMRT1336(9285bp)，所述质粒pMRT1322描述于PCT专利申请号PCT/IB00/00370，该专利申请通过引用其相关部分结合到本说明书中。
用KpnI消化10μg的pMRT1196质粒，利用“协同快速PCR纯化系统”纯化，在50μl水中回收，并用HpaI再消化。使如此处理的载体片段在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，并利用“协同快速PCR纯化系统”纯化，然后在50μl水中回收。
用KpnI消化10μgpMRT1322质粒，利用“协同快速PCR纯化系统”纯化，在50μl水中回收，然后用HpaI再消化，获得具有所述启动子MPr1165(0.5kbp)的DNA插入片段。使如此产生的所述DNA插入片段在TEB缓冲液中的1％琼脂糖凝胶上进行电泳，利用“协同快速PCR纯化系统”纯化，并在50μl水中回收。
在20μl反应体积中，在2μ1 T410×DNA连接酶缓冲液(EicentreTechnologies)、2μl2.5mM ATP和4单位T4 DNA连接酶(EpicentreTechnologies)存在下，使用100ng载体片段和100ng具有如上所述制备的启动子MPr1165的DNA插入片段进行PCR连接反应。所述反应在“GeneAmp PCRSystem 9700”热循环仪中进行180个循环，每个循环包括2个步骤，第一个步骤为10℃30秒，第二个步骤为30℃30秒。
转化先前制备的感受态大肠杆菌DH5α细菌(Hanahan，1983)。通过在补加卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择获得克隆，按照碱裂解法提取所述克隆的质粒DNA，通过酶促消化和测序核实。产生的质粒叫做pMRT1336(图26)。在序列表中给出了其全序列SEQ.ID52。
通过将启动子MPrn165插入pMRT1176中，获得质粒pMRT1322。用XbaI和EcoRI消化10μg的pMRT1176质粒，利用“协同快速PCR纯化系统”试剂盒纯化，在50μl水中回收，在120μl终反应体积中，在12μl3×10缓冲液(New England Biolabs)存在下，利用50单位牛小肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃去磷酸化1小时，并利用“协同快速PCR纯化系统”试剂盒纯化，然后在50μl水中回收。使用各20pmol的两个寡脱氧核苷酸：具有位点XbaI的5′AGCTCTAGAGCTGCCTGCAGCACTAGTATCC 3′(SEQ.ID53)和具有位点EcoRI的5′CGGAATTCGGCCTCTAGGTTGTTGTGTTG 3′(SEQ.ID54)，利用酶高保真性铂Taq聚合酶(GIBCO BRL Life Technologies)并按照供应商的说明书，通过PCR扩增由10ngpMRT1240基质DNA获得对应于启动子MPr1165的DNA插入片段。在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中进行所述PCR扩增反应。在于94℃变性2分钟后，对所述DNA进行25个循环的反应，每个循环包括94℃45秒的变性步骤、55℃45秒的杂交期和68℃45秒的伸长期。在最后一个循环所述伸长于68℃持续3分钟。通过在TEB缓冲液中的1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离所获得的PCR产物，并利用“协同快速PCR纯化系统”试剂盒纯化，然后在50μl水中回收。然后用XbaI和EcoRI消化所述PCR产物，利用“协同快速PCR纯化系统”试剂盒纯化，并在50μl水中回收。使用80ng pMRT1176载体片段和具有所述MPr1165启动子的110ng DNA插入片段如先前所述进行PCR连接反应。转化先前制备的感受态大肠杆菌DH5α细菌(Hanahan，1983)。通过在补加卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择获得克隆，按照碱裂解法提取所述克隆的质粒DNA，通过酶促消化和测序核实。产生的质粒称为pMRT1322。
通过将DNA片段插入质粒pMRT1234中，按照供应商对HindIII位点和BamHI的说明用Klenow片段(New England Biolabs)处理，获得质粒pMRT1240。通过用PstI和BamHI双重消化质粒pMRT1165，接着按照供应商的说明书，经受T4DNA聚合酶(New England Biolabs)的作用，获得为L5启动子片段的DNA插入片段，所述质粒pMRT1165描述于PCT专利申请号PCT/IB00/00370，该专利申请通过引用其相关部分结合到本说明书中。
通过在pMRT1175的EcoRI位点插入对应于编码人乳铁蛋白的cDNA的DNA插入片段EcoRI，获得质粒pMRT1234，所述DNA插入片段EcoRI分离自如先前公开的专利申请WO98/50543所述的质粒pHMWG-IA-PSSp-Lf。17.合成pMRT1337
将分离自pBINm-gfp5-ER的gfp基因插入到pMRT1205中，获得质粒pMRT1337(8289bp)，该质粒描述于Haseloff J和Siemering KR.1998，“绿色荧光蛋白在植物中的应用”，载于Green fluorescent protein：Strategies，applications and protocols(Chalfie M和Kain S编辑，Wiley，191-220页)。
用EcoRI消化10μg的质粒pMRT1205，利用“协同快速PCR纯化系统》试剂盒纯化，在50μl水中回收，在120μl反应体积中，在12μl 500mM pH7.5Tris-HCl 500mM MgCl2、6μl1M二硫苏糖醇、各6μl的10mM dNTP存在下，于37℃经受20单位的Klenow片段(NewEngland Biolabs)作用60分钟，利用“协同快速PCR纯化系统”试剂盒纯化，在50μl水中回收，然后用BamHI消化。使如此处理的载体片段在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，利用“协同快速PCR纯化系统”试剂盒纯化，并在50μl水中回收。
用SacI消化10μg的质粒pBINm-gfp5-ER，利用“协同快速PCR纯化系统》试剂盒纯化，在50μl水中回收，并在120μl反应体积中，在12μlT4 10×DNA聚合酶缓冲液、4μl10mM dNTP和6μl1mg/mlBSA存在下，经受6单位T4DNA聚合酶(New England Biolabs)的作用，获得具有gfp基因的DNA插入片段(0.7kbp)。所述反应于37℃进行30分钟。然后利用“协同快速PCR纯化系统”试剂盒纯化如此处理的质粒pBINm-gfp5-ER，在50μl水中回收并用BamHI消化。使如此产生的DNA插入片段在TEB缓冲液中的1％琼脂糖凝胶上进行电泳，利用“协同快速PCR纯化系统”试剂盒纯化，并在50μl水中回收。
在20μl反应体积中，在2μlT410×DNA连接酶缓冲液(EpicentreTechnologies)、2μl2.5mM ATP和4单位T4DNA连接酶(EpicentreTechnologies)存在下，使用100ng的pMRT1205载体片段和100ng以上制备的具有gfp基因的DNA插入片段进行PCR连接反应。所述反应在“GeneAmp PCR System 9700”热循环仪中进行180个循环，每个循环包括2个步骤，第一个步骤为10℃30秒，第二个步骤为30℃30秒。
转化先前制备的感受态大肠杆菌DH5α细菌(Hanahan，1983)。通过在补加卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择获得克隆，按照碱裂解法提取所述克隆的质粒DNA，通过酶促消化和测序核实。产生的质粒叫做pMRT1337(图27)。在序列表中给出了其全序列SEQ.ID55。18.合成pMRT1341
用分离自pMRT1337的表达盒“ep35S-gfp-poIyA35S”替换pMRT1335的“ep35S-gus-polyA35S”表达盒，获得质粒pMRT1341(14108bp)。
用AgeI和KpnI消化10μg的质粒pMRT1335。通过在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离如此消化的载体片段，利用“协同快速PCR纯化系统”试剂盒纯化，然后在50μl水中回收。
用XhoI消化10μg的质粒pMRT1337，利用“协同快速PCR纯化系统》试剂盒纯化，在50μl水中回收，在120μl反应体积中，在12μl500mM pH7.5 Tris-HCl500mM MgCl2、6μl1M二硫苏糖醇、各6μl的10mM dNTP存在下，于37℃经受20单位的Klenow片段(NewEngand Biolabs)作用30分钟，然后利用“协同快速PCR纯化系统”试剂盒纯化，在50μl水中回收，最后用KprI消化，获得对应于表达盒“ep35S-gfp-polyA35S”的DNA插入片段(2.4kbp)。通过在TEB缓冲液中的0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离如此制备的DNA插入片段，利用“协同快速PCR纯化系统”试剂盒纯化，在50μl水中回收，用AgeI消化，利用“协同快速PCR纯化系统”试剂盒纯化，并在50μl水中再回收。
在20μl反应体积中，在2μlT410×DNA连接酶缓冲液(EpicentreTechnologies)、2μl2.5mM ATP和4单位T4DNA连接酶(EpicentreTechnologies)存在下，使用100ng的衍生自pMRT1335的载体片段和100ng如上产生的DNA插入片段进行PCR连接反应。所述反应在“GeneAmp PCR System 9700”热循环仪中进行180个循环，每个循环包括2个步骤，第一个步骤为10℃30秒，第二个步骤为30℃30秒。
转化先前制备的感受态大肠杆菌DH5α细菌(Hanaban，1983)。通过在补加卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择获得克隆，按照碱裂解法提取所述克隆的质粒DNA，通过酶促消化和测序核实。产生的质粒叫做pMRT1341(图28)。在序列表中给出了其全序列SEQ.ID56。19.合成pMRT1342
用分离自pMRT1336的表达盒“L5-gus-polyA35S”替换pMRT1335的表达盒“ep35S-gus-polyA35S”，获得质粒pMRT1342(15077bp)。
用AgeI和KprI消化10μg的质粒pMRT1335。通过在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离如此消化的载体片段，利用“协同快速PCR纯化系统”试剂盒纯化，并在50μl水中回收。
用XhoI消化10μg的质粒pMRT1336，利用“协同快速PCR纯化系统”试剂盒纯化，在50μl水中回收，在120μl反应体积中，在12μl500mM pH7.5Tris-HCl 500mM MgCl2、6μl1M二硫苏糖醇、各6μl的10mM dNTP存在下，于37℃经受20单位的Klenow片段(NewEngland Biolabs)作用30分钟，然后利用“协同快速PCR纯化系统”试剂盒纯化，并在50μl水中回收，最后用KpnI消化，获得对应于表达盒“L5-gus-polyA35S”的DNA插入片段(3.4kbp)。通过在TEB缓冲液中的0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离如此制备的DNA插入片段，利用“协同快速PCR纯化系统”试剂盒纯化，在50μl水中回收，用AgeI消化，利用如上所述的试剂盒纯化，并在50μl水中再回收。
在20μl反应混合物中，在2μlT410×DNA连接酶缓冲液(Epicentre Technologies)、2μl2.5mM ATP和4单位T4DNA连接酶(Epicentre Technologies)存在下，使用100ng的衍生自pMRT1335的载体片段和100ng以上制备的DNA插入片段进行PCR连接反应。所述反应在“GeneAmp PCRSystem 9700”热循环仪中进行180个循环，每个循环包括2个步骤，第一个步骤为10℃30秒，第二个步骤为30℃30秒。
转化先前制备的感受态大肠杆菌DH5α细菌(Hanahan，1983)。通过在补加卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择获得克隆，按照碱裂解法提取所述克隆的质粒DNA，通过酶促消化和测序核实。产生的质粒叫做pMRT1342(图29)。在序列表中给出了其全序列SEQ.ID57。20.产生重组农杆菌
按照Holsters等[Holsters M.，Dewaele D.，Depicker A，Messenf E.，Van Montagu M.和Schell J.(1978)，转染和转化根癌农杆菌，Mol.Gen.Genet.136，181-187]描述的技术，将所述双元质粒转移至根癌农杆菌LBA4404菌株中。通过在补加利福平(50mg/l)的LB培养基上选择获得克隆，按照在细胞重悬浮缓冲液中加入溶菌酶(25mg/ml)进行改良的碱裂解法提取所述克隆的质粒DNA。通过酶促消化对所获得的质粒DNA进行分析。将所获得的农杆菌克隆用于植物遗传转化。
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                           序列表<110>    MERISTE THERAPEUTICS<120>    纯合成载体、质粒、包含所述载体的特基因植物或植物部分，以及生产它们的方法<130>    synVecl<140><141><160>    57<170>    Patentln版本2.1<210>    1<211>    3508<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：质粒pMRT1105<220><221>    复制起点<222>    (1)..(654)<223>    复制起点ori RK2<220><221>    基因<222>    (655)..(2013)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>    misc特征<222>    (2014)..(3508)<223>    编码能够增加复制率的两个蛋白P285和P382的pRK2TrfA基因座<400>    1
Figure A0080241800651
<210>    2<211>    4098<212>    DNA<213>    人工序列<210><223>    人工序列的描述：质粒pMRT1106<220><221>    复制起点<222>    (1)..(654)<223>    复制起点ori RK2<220><221>    复制起点<222>    (655)..(1263)<223>    复制起点ori ColEI<220><221>    基因<222>    (1264)..(2603)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>    misc特征<222>    (2604)..(4098)<223>    编码能够增加复制率的两个蛋白P285和P382的pRK2 TrfA基因座<400>    2
Figure A0080241800671
<210>    3<211>    5971<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：质粒pMRT1118<220><221>    复制起点<222>    (1)..(654)<223>    复制起点ori RK2<220><221>    复制起点<222>    (655)..(1263)<223>    复制起点ori ColEI<220><221>    基因<222>    (1264)..(2603)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>    misc特征<222>    (2604)..(4098)<223>    编码能够增加复制率的两个蛋白P285和P382的pRK2 TrfA基因座<220><221>    misc特征<222>    (4106)..(4271)<223>    T-DNA左边界<220><221>    终止子<222>    (4272)..(4559)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    基因<222>    (4560)..(5556)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTII基因<220><221>    启动子<222>    (5557)..(5770)<223>    胭脂碱合成酶启动子<220><221>    misc特征<222>    (5791)..(5964)<223>    T-DNA右边界<220><221>    misc特征<222>    (5770)..(5791)<223>    MCS多克隆位点<400>    3
Figure A0080241800691
Figure A0080241800701
<210>    4<21l>    60l6<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：质粒pMRT1119<220><221>    复制起点<222>    (1)..(654)<223>    复制起点ori RK2<220><221>    复制起点<222>    (655)..(1263)<223>    复制起点ori ColEI<220><221>    基因<222>    (1264)..(2603)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>    misc特征<222>    (2604)..(4098)<223>    编码能够增加复制率的两个蛋白P285和P382的pRK2 TrfA基因座<220><221>    misc特征<222>    (4106)..(4271)<223>    T-DNA左边界<220><221>    终止子<222>    (4272)..(4559)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    基因<222>    (4560)..(5556)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NFTII基因<220><21>     启动子<222>    (5557)..(5770)<223>    胭脂碱合成酶启动子<220><221>    misc特征<222>    (5836)..(6009)<223>    T-DNA右边界<220><221>    misc特征<222>    (5770)..(5836)<223>    MCS多克隆位点<400>    4
Figure A0080241800711
Figure A0080241800721
Figure A0080241800731
<210>    5<211>    6017<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：质粒pMRTll21<220><221>    复制起点<222>    (1)..(654)<223>    复制起点ori RK2<220><221>    复制起点<222>    (655)..(1263)<223>    复制起点ori ColEI<220><221>    基因<222>    (1264)..(2603)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>    misc特征<222>    (2604)..(4098)<223>    编码能够增加复制率的两个蛋白P285和P382的pRK2TrfA基因座<220><221>    misc特征<222>    (4106)..(4271)<223>    T-DNA左边界<220><221>    终止子<222>    (4272)..(4559)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    基因<222>    (4560)..(5556)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTII基因<220><221>    mist差异<222>    (5559)<223>    相对于pMRT1ll9引入BspEI限制位点<220><221>    启动子<222>    (5557)..(5771)<223>    胭脂碱合成酶启动子<220><221>    misc特征<222>    (5771)..(5837)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    misc特征<222>    (5837)..(6010)<223>    T-DNA右边界<400>    5 <210>    6<211>    6016<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：质粒PMRT1122<220><221>    复制起点<222>    (1)..(654)<223>    复制起点ori RK2<220><221>    复制起点<222>    (655)..(1263)<223>    复制起点ori ColEI<220><221>    基因<222>    (1264)..(2603)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>    misc特征<222>    (2604)..(4098)<223>    编码能够增加复制率的两个蛋白P285和P382的pRK2TrfA基因座<220><221>    misc特征<222>    (4106)..(4271)<223>    T-DNA左边界<220><221>    终止子<222>    (4272)..(4559)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    基因<222>    (4560)..(5556)<223>    编码新霉紊磷酸转移酶和卡那霉素抗性的野生型NPTII基因<220><221>    启动子<222>    (5557)..(5770)<223>    胭脂碱合成酶启动子<220><221>    misc特征<222>    (5770)..(5836)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    misc特征<222>    (5836)..(6009<223>    T-DNA右边界<400>    6
Figure A0080241800761
Figure A0080241800781
<210>    7<211>    6017<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：质粒pMRT1155<220><221>    复制起点<222>    (1)..(654)<223>    复制起点ori RK2<220><221>    复制起点<222>    (655)..(1263)<223>    复制起点ori ColEI<220><221>    基因<222>    (1264)..(2603)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>    misc特征<222>    (2604)..(4098)<223>    编码能够增加复制率的两个蛋白P285和P382的pRK2 TrfA基因座<220><221>    misc特征<222>    (4106)..(4271)<223>    T-DNA左边界<220><221>    终止子<222>    (4272)..(4559)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    基因<222>    (4560)..(5556)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的野生型NPTII基因<220><221>    启动子<222>    (5557)..(5771)<223>    胭脂碱合成酶启动子<220><221>    misc特征<222>    (5771)..(5837)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    misc特征<222>    (5837)..(6010)<223>    T-DNA右边界<400>    7
Figure A0080241800791
Figure A0080241800801
(210>    8<211>    6767<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：质粒pMRTll75<220><221>    复制起点<222>    (1)..(654)<223>    复制起点oriRK2<220><221>    复制起点<222>    (655)..(1263)<223>    复制起点ori ColEI<220><221>    基因<222>    (1264)..(2603)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>    misc特征<222>    (2604)..(4098)<223>    编码能够增加复制率的两个蛋白P285和P382的pRK2 TrfA基因座<220><221>    misc特征<222>    (4106)..(4271)<223>    T-DNA左边界<220><221>    终止子<222>    (4272)..(4559)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    基因<222>    (4559)..(5556)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTII基因<220><221>    启动子<222>    (5557)..(5771)<223>    胭脂碱合成酶启动子<220><221>    misc特征<222>    (5771)..(5830)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    polyA信号<222>    (5830)..(6560)<223>    35S核糖体的polyA<220><221>    misc特征<222>    (6560)..(6587)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    misc特征<222>    (6587)..(6760)<223>    T-DNA右边界<400>    8ccgggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag 60aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccgccg gcgttgtgga tacctcgcgg 120
Figure A0080241800831
<210>    9<211>    6767<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：质粒pMRT1176<220><221>    复制起点<222>    (1)..(654)<223>    复制起点ori RK2<220><221>    复制起点<222>    (655)..(1263)<223>    复制起点ori ColEI<220><221>    基因<222>    (1264)..(2603)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>    misc特征<222>    (2604)..(4098)<223>    编码能够增加复制率的两个蛋白P285和P382的pRK2TrfA基因座<220><221>    misc特征<222>    (4106)..(4271)<223>    T-DNA左边界<220><221>    终止子<222>    (4272)..(4559)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    基因<222>    (4559)..(5556)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的野生型NPTII基因<220><221>    启动子<222>    (5557)..(5771)<223>    胭脂碱合成酶启动子<220><221>    misc特征<222>    (5771)..(5830)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    polyA信号<222>    (5830)..(6560)<223>    35S核糖体的polyA<220><221>    misc特征<222>    (6560)..(6587)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    misc特征<222>    (6587)..(6760)<223>    T-DNA右边界<400>    9ccgggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag 60aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccgccg gcgttgtgga tacctcgcgg 120aaaacttggc cctcactgac agatgagggg cggacgttga cacttgaggg gccgactcac 180ccggcgcggc gttgacagat gaggggcagg ctcgatttcg gccggcgacg tggagctggc 240cagcctcgca aatcggcgaa aacgcctgat tttacgcgag tttcccacag atgatgtgga 300caagcctggg gataagtgcc ctgcggtatt gacacttgag gggcgcgact actgacagat 360gaggggcgcg atccttgaca cttgaggggc agagtgctga cagatgaggg gcgcacctat 420tgacatttga ggggctgtcc acaggcagaa aatccagcat ttgcaagggt ttccgcccgt 480ttttcggcca ccgctaacct gtcttttaac ctgcttttaa accaatattt ataaaccttg 540tttttaacca gggctgcgcc ctgtgcgcgt gaccgcgcac gccgaagggg ggtgcccccc 600cttctcgaac cctcccggaa aggtatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 660 <210>    10<211>    4805<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：质粒pMRT1191<220><221>    复制起点<222>    (1)..(654)<223>    复制起点ori RK2<220><221>    复制起点<222>    (655)..(1263)<223>    复制起点ori ColEI<220><221>    基因<222>    (1264)..(2603)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>    misc特征<222>    (2604)..(4098)<223>    编码能够增加复制率的两个蛋白P285和P382的pKK2 TrfA基因座<220><221>    misc特征<222>    (4106)..(4271)<223>    T-DNA左边界<220><221>    终止子<222>    (4272)..(4559)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    misc特征<222>    (4566)..(4625)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    misc特征<222>    (4625)..(4798)<223>    T-DNA右边界<400>    10
Figure A0080241800871
<210>    11<211>    8654<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：质粒pMRT1192<220><221>    复制起点<222>    (1)..(654)<223>    复制起点ori RK2<220><221>    复制起点<222>    (655)..(1263)<223>    复制起点ori ColEI<220><221>    基因<222>    (1264)..(2603)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>    misc特征<222)    (2604)..(4098)<223>    编码能够增加复制率的两个蛋白P285和P382的pRK2TrfA基因座<220><221>    misc特征<222>    (4106)..(4271)<223>    7-DNA左边界<220><22l>    终止子<222>    (4272)..(4559)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    基因<222>    (4560)..(5556)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的野生型NPTII基因<220><221>    启动子<222>    (5557)..(5771)<223>    胭脂碱合成酶启动子<220><221>    misc特征<222>    (5771)..(5818)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    基因<222>    (5818)..(7717)<223>    编码β-葡糖醛酸酶的GUS基因<220><221>    polyA信号<222>    (7718)..(8474)<223>    35S柱糖体的polyA<220><221>    misc特征<222>    (8447)..(8474)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    misc特征<222>    (8474)..(8647)<223>    7-DNA右边界<400>    11
Figure A0080241800891
Figure A0080241800911
Figure A0080241800921
<210>    12<211>    9143<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：质粒pMRT1193<120><221>    复制起点<222>    (1)..(654)<223>    复制起点ori RK2<220><221>    复制起点<222>    (655)..(1263)<223>    复制起点ori ColEI<220><221>    基因<222>    (1264)..(2603)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>    misc特征<222>    (2604)..(4098)<223>    编码能够增加复制率的两个蛋白P285和P382的pRK2TrfA基因座<220><221>    misc特征<222>    (4106)..(4271)<223>    T-DNA左边界<220><221>    终止子<222>    (4272)..(4559)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    基因<222>    (4560)..(5556)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTII基因<220><221>    启动子<222>    (5557)..(5770)<223>    胭脂碱合成酶启动子<220><221>    misc特征<222>    (5770)..(5829)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    启动子<222>    (5829)..(6254)<223>    小麦高分子量麦谷蛋白启动子<220><221>    misc特征<222>    (6154)..(6301)<223>    MCS多克隆位点<220><22l>    内含子<222>    (6301)..(6833)<223>    水稻肌动蛋白内含子<220><221>    基因<222>    (6834)..(8643)<223>    编码β-葡糖醛酸酶的GUS基因<220><221>    终止子<222>    (8644)..(8959)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    misc特征<222>    (8959)..(9136)<223>    T-DNA右边界<400>    12
Figure A0080241800931
Figure A0080241800941
Figure A0080241800951
<210>    13<2ll>    6865<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：质粒pMRT1195<220><221>    复制起点<222>    (1)..(654)<223>    复制起点ori RK2<220><221>    复制起点<222>    (655)..(1263)<223>    复制起点ori ColEI<220><221>    基因<222>    (1264)..(2603)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>    misc特征<222>    (2604)..(4098)<223>    编码能够增加复制率的两个蛋白P285和P382的pRK2TrfA基因座<220><221>    misc特征<222>    (4106)..(4271)<223>    T-DNA左边界<220><221>    终止子<222>    (4272)..(4559)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    基因<222>    (4575)..(5150)<223>    编码膦丝菌素乙酰转移酶和glufosinate抗性的Bar基因<220><221>    内含子<222>    (5174)..(5685)<223>    水稻肌动蛋白内含子<220><221>    启动子<222>    (5686)..(6626)<223>    水稻肌动蛋白启动子<220><221>    misc特征<222>    (6626)..(6685)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    misc特征<222>    (6685)..(6858)<223>    T-DNA右边界<400>    13
Figure A0080241800971
Figure A0080241800981
<210>     14<211>    8654<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：质粒pMRT1196<220><221>    复制起点<222>    (1)..(654)<223>    复制起点ori RK2<220><221>    复制起点<222>    (655)..(1263)<223>    复制起点ori ColEI<220><221>    基因<222>    (1264)..(2603)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>    misc特征<222>    (2604)..(4098)<223>    编码能够增加复制率的两个蛋白P285和P3s2的pRK2 TrfA基因座<220><221>    misc特征<222>    (4106)..(4271)<223>    T-DNA左边界<220><221>    终止子<222>    (4272)..(4559)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    基因<222>    (4560)..(5556)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTII基因<220><221>    启动子<222>    (5557)..(5771)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    misc特征<222>    (5771)..(5818)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    基因<222>    (5818)..(7717)<223>    编码β葡糖醛酸酶的GUS基因<220><221>    聚腺苷酸信号<222>    (7718)..(8447)<223>    35S核糖体的聚腺苷酸<220><221>    misc特征<222>    (8447)..(8474)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    misc特征<222>    (8474)..(8647)<223>    T-DNA右边界<400>    14
Figure A0080241801001
<210>    15<211>    7943<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：质粒pMRT1201<220><221>    复制起点<222>    (1)..(654)<223>    复制起点offRK2<220><221>    复制起点<222>    (655)..(1263)<223>    复制起点ori ColEI<220><221>    基因<222>    (1264)..(2603)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>    misc特征<222>    (2604)..(4098)<223>    编码能够增加复制率的两个蛋白P285和P382的pPK2 TrfA基因座<220><221>    misc特征<222>    (4106)..(4271)<223>    T-DNA左边界<220><221>    终止子<222>    (4272)..(4559)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    misc特征<222>    (4559)..(4612)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    启动子<222>    (4612)..(5047)<223>    高分子量小麦麦谷蛋白启动子<220><221>    misc特征<222>    (5047)..(5096)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    内含子<222>    (5096)..(5627)<223>    水稻肌动蛋白内含子<220><221>    基因<222>    (5628)..(7436)<223>    编码β葡糖醛酸酶的GUS基因<220><221>    终止子<222>    (7437)..(7763)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    misc特征<222>    (7763)..(7936)<223>    T-DNA右边界<400>    15
Figure A0080241801041
Figure A0080241801051
<210>    16<211>    5614<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：质粒pMRT1202<220><221>    复制起点<222>    (1)..(654)<223>    复制起点ori RK2<220><221>    复制起点<222>    (655)..(1263)<223>    复制起点ori ColEI<220><221>    基因<222>    (1264)..(2603)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>    misc特征<222>    (2604)..(4098)<223>    编码能够增加复制率的两个蛋白P285和P382的pRK2 TrfA基因座<220><221>    misc特征<222>    (4106)..(4271)<223>    T-DNA左边界<220><221>    终止子<222>    (4272)..(4559)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    基因<222>    (4575)..(5150)<223>    编码膦丝菌素乙酰转移酶和除草剂抗性的Bar基因<220><221>    启动子<222>    (5150)..(5368)<223>    胭脂碱合成酶启动子<220><221>    misc特征<222>    (5368)..(5434)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    misc特征<222>    (5434)..(5607)<223>    T-DNA右边界<400>    16 <210>    17<211>    7503<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：质粒pMRT1203<220><221>    复制起点<222>    (1)..(654)<223>    复制起点ori RK2<220><22l>    复制起点<222>    (655)..(1263)<223>    复制起点ori ColEI<220><221>    基因<222>    (1264)..(2603)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>    misc特征<222>    (2604)..(4098)<223>    编码能够增加复制率的两个蛋白P285和P382的pRK2 TrfA基因座<220><221>    misc特征<222>    (4106)..(4271)<223>    T-DNA左边界<220><221>    终止子<222>    (4272)..(4559)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    基因<222>    (4560)..(5559)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的野生型NPTII基因<220><221>    启动子<222>    (5560)..(5771)<223>    胭脂碱合成酶启动子<220><221>    启动子<222>    (5772)..(6514)<223>    增强的35S核糖体启动子<220><221>    misc特征<222>    (6514)..(6566)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    聚腺苷酸信号<222>    (6566)..(7296)<223>    35S核糖体的聚腺苷酸<220><221>    misc特征<222>    (7296)..(7323)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    misc特征<222>    (7323)..(7496)<223>    T-DNA右边界<400>    17
Figure A0080241801081
Figure A0080241801091
Figure A0080241801101
<210>    18<211>    9390<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：质粒pMRT1204(220><221>    复制起点<222>    (1)..(654)<223>    复制起点ori RK2<220><221>    复制起点<222>    (655)..(1263)<223>    复制起点ori ColEI<220><221>    基因<222>    (1264)..(2603)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>    misc特征<222>    (2604)..(4098)<223>    编码能够增加复制率的两个蛋白P285和P382的pRK2 TrfA基因座<220><221>    misc特征<222>    (4106)..(4271)<223>    T-DNA左边界<220><221>    终止子<222>    (4272)..(4559)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    基因<222>    (4560)..(5559)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的野生型NPTII基因<220><221>    启动子<222>    (5560)..(5771)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    启动子<222>    (5772)..(6514)<223>    增强的35S核糖体启动子<220><221>    misc特征<222>    (6514)..(6554)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    基因<222>    (6554)..(8453)<223>    编码β葡糖醛酸酶的GUS基因<220><221>    聚腺苷酸信号<222>    (8454)..(9183)<223>    35S核糖体的聚腺苷酸<220><221>    misc特征<222>    (9183)..(9210)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    misc特征<222>    (9210)..(9383)<223>    T-DNA右边界<400>    18
Figure A0080241801131
<210>    19<211>    7503<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：质拉pMRT1205<220><221>    复制起点<222>    (1)..(654)<223>    复制起点ori RK2<220><221>    复制起点<222>    (655)..(1263)<223>    复制起点ori ColEI<220><221>    基因<222>    (1264)..(2603)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>    misc特征<222>    (2604)..(4098)<223>    编码能够增加复制率的两个蛋白P285和P382的PRK2 TrfA基因座<220><221>    misc特征<222>    (4106)..(4271)<223>    T-DNA左边界<220><221>    终止子<222>    (4272)..(4559)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    基因<222>    (4560)..(5559)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTII基因<220><221>    启动子<222>    (5560)..(5771)<223>    胭脂碱合成酶启动子<220><221>    启动子<222>    (5772)..(6514)<223>    增强的35S核糖体启动子<220><221>    misc特征<222>    (6514)..(6566)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    聚腺苷酸信号<222>    (6566)..(7296)<223>    35S核糖体的聚腺苷酸<220><221>    misc特征<222>    (7296)..(7323)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    misc特征<222>    (7323)..(7496)<223>    T-DNA右边界<400>    19
Figure A0080241801161
Figure A0080241801171
<210>    20<211>    9390<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：质粒pMRT1206<220><221>    复制起点<222>    (1)..(654)<223>    复制起点ori RK2<220><221>    复制起点<222>    (655)..(1263)<223>    复制起点ori ColEI<220><221>    基因<222>    (1264)..(2603)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NFTIII基因<220><221>    misc特征<222>    (2604)..(4098)<223>    编码能够增加复制率的两个蛋白P285和P382的pRK2 TrfA基因座<220><221>    misc特征<222>    (4106)..(4271)<223>    T-DNA左边界<220><221>    终止子<222>    (4272)..(4559)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    基因<222>    (4560)..(5559)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTII基因<220><211>    启动子<222>    (5560)..(5771)<223>    胭脂碱合成酶启动子<220><221>    启动子<222>    (5772)..(6514)<223>    增强的35S核糖体启动子<220><221>    misc特征<222>    (6514)..(6554)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    基因<222>    (6554)..(8453)<223>    编码β葡糖醛酸酶的GUS基因<220><221>    聚腺苷酸信号<222>    (8454)..(9183)<223>    35S核糖体的聚腺苷酸<220><221>    misc特征<222>    (9183)..(9210)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    misc特征<222>    (9210)..(9383)<223>    T-DNA右边界<400>    20
Figure A0080241801181
Figure A0080241801191
Figure A0080241801201
<210>    21<211>    10003<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：质粒pMRT1210<220><221>    复制起点<222>    (1)..(654)<223>    复制起点ori RK2<220><221>    复制起点<222>    (655)..(1263)<223>    复制起点ori ColEI<220><221>    基因<222>    (1264)..(2603)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素杭性的NPTIII基因<220><221>    misc特征<222>    (2604)..(4098)<223>    编码能够增加复制率的两个蛋白P285和P382的pRK2 TrfA基因座<220><221>    misc特征<222>    (4106)..(4271)<223>    T-DNA左边界<220><221>    终止子<222>    (4272)..(4559)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    misc特征<222>    (4559)..(4572)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    基因<222>    (4594)..(5169)<223>    编码膦丝茼素乙酰转移酶和glufosinate抗性的Bar基因<220><221>    内含子<222>    (5170)...(5704)<223>    水稻肌动蛋白内含子<220><221>    启动子<222>    (5705)..(6638)<223>    水稻肌动蛋白启动子<220><221>    misc特征<222>    (6646)..(6672)<223>    MES多克隆位点<220><221>    启动子<222>    (6672)..(7107)<223>    小麦高分子量麦谷蛋白启动子<220><221>    misc特征<222>    (7107)..(7169)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    内含子<222>    (7169)..(7687)<223>    水稻肌动蛋白内含子<220><221>    基因<222>    (7688)..(9496)<223>    编码β葡糖醛酸酶的GUS基因<220><221>    终止子<222>    (9497)..(9823)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    misc特征<222>    (9823)..(9996)<223>    T-DNA右边界<400>    21
Figure A0080241801241
gatgaaactg ctgctgtcgg ctttaacctc tctttaggca ttggtttcga agcgggcaac 8760aagccgaaag aactgtacag cgaagaggca gtcaacgggg aaactcagca agcgcactta 8820caggcgatta aagagctgat agcgcgtgac aaaaaccacc caagcgtggt gatgtggagt 8880attgccaacg aaccggatac ccgtccgcaa gtgcacggga atatttcgcc actggcggaa 8940gcaacgcgta aactcgaccc gacgcgtccg atcacctgcg tcaatgtaat gttctgcgac 9000gctcacaccg ataccatcag cgatctcttt gatgtgctgt gcctgaaccg ttattacgga 9060tggtatgtcc aaagcggcga tttggaaacg gcagagaagg tactggaaaa agaacttctg 9120gcctggcagg agaaactgca tcagccgatt atcatcaccg aatacggcgt ggatacgtta 9180gccgggctgc actcaatgta caccgacatg tggagtgaag agtatcagtg tgcatggctg 9240gatatgtatc accgcgtctt tgatcgcgtc agcgccgtcg tcggtgaaca ggtatggaat 9300ttcgccgatt ttgcgacctc gcaaggcata ttgcgcgttg gcggtaacaa gaaagggatc 9360ttcactcgcg accgcaaacc gaagtcggcg gcttttctgc tgcaaaaacg ctggactggc 9420atgaacttcg gtgaaaaacc gcagcaggga ggcaaacaat gaatcaacaa ctctcctggc 9480gcaccatcgt cggctacagc ctcgggaatt tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa 9540gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga 9600attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt 9660ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg 9720caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg gaattgccaa 9780gctaattcac tcgagcagat tgtcgtttcc cgccttcagt ttaaactatc agtgtttgac 9840aggatatatt ggcgggtaaa cctaagagaa aagagcgttt attagaataa tcggatattt 9900aaaagggcgt gaaaaggttt atccgttcgt ccatttgtat gtgcatgcca accacagggt 9960ttaccggttc ctaggaaaag accgagcgcc tttgcgacgc tca                   10003<210>    22<211>    8987<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：质粒pMRT1212<220><221>    复制起点<222>    (1)..(654)<223>    复制起点ori RK2<220><221>    复制起点<222>    (655)..(1263)<223>    复制起点ori ColEI<220><221>    基因<222>    (1264)..(2603)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>    misc特征<222>    (2604)..(4098)<223>    编码能够增加复制率的两个蛋白P285和P382的pRK2TffA基因座<220><221>    基因<222>    (1264)..(2603)<223>    编码新霉素磷酸转移酶和卡那霉素抗性的NPTIII基因<220><221>    终止子<22>     (4272)..(4559)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    基因<222>    (4575)..(5150)<223>    编码膦丝菌素乙酰转移酶和glufosinate抗性的Bar基因<220><221>    启动子<222>    (5151)..(5368)<223>    胭脂碱合成酶终止子<220><221>    启动子<222>    (5369)..(6111)<223>    增强的35S核糖体启动子<220><221>    misc特征<222>    (6111)..(6159)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    基因<222>    (6159)..(8050)<223>    编码β葡糖醛酸酶的GUS基因<220><221>    聚腺苷酸信号<222>    (8051)..(8780)<223>    来自35S核糖体的聚腺苷酸<220><221>    misc特征<222>    (8780)..(8807)<223>    MCS多克隆位点<220><221>    misc特征<222>    (8807)..(8980)<223>    T-DNA右边界<400>    22ccgggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag 60aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccgccg gcgttgtgga tacctcgcgg 120aaaacttggc cctcactgac agatgagggg cggacgttga cacttgaggg gccgactcac 180ccggcgcggc gttgacagat gaggggcagg ctcgatttcg gccggcgacg tggagctggc 240cagcctcgca aatcggcgaa aacgcctgat tttacgcgag tttcccacag atgatgtgga 300caagcctggg gataagtgcc ctgcggtatt gacacttgag gggcgcgact actgacagat 360gaggggcgcg atccttgaca cttgaggggc agagtgctga cagatgaggg gcgcacctat 420tgacatttga ggggctgtcc acaggcagaa aatccagcat ttgcaagggt ttccgcccgt 480ttttcggcca ccgctaacct gtcttttaac ctgcttttaa accaatattt ataaaccttg 540tttttaacca gggctgcgcc ctgtgcgcgt gaccgcgcac gccgaagggg ggtgcccccc 600cttctcgaac cctcccggaa aggtatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 660aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 720cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 780ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 840aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 900cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 960cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 1020gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 1080tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 1140cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 1200ccactggcag cagccttcta ccataatccg cgataaaccc agcgaaccat ttgaggtgat 1260aggtaagatt ataccgaggt atgaaaacga gaattggacc tttacagaat tactctatga 1320agcgccatat ttaaaaagct accaagacga agaggatgaa gaggatgagg aggcagattg 1380ccttgaatat attgacaata ctgataagat aatacatctt ttatatagaa gatatcgccg 1440tatgtaagga tttcaggggg caaggcatag gcagcgcgct tatcaatata tctatagaat 1500gggcaaagca taaaaacttg catggactaa tgcttgaaac ccaggacaat aaccttatag 1560cttgtaaatt ctaccaaaat tgtggtttca aaatcggctc cgtcgatact atgttatacg 1620ccaactttga aaacaacttt gaaaaagctg ttttctggta tttaaggttt tagaatgcaa 1680ggaacagtga attggagttc gtcttgttat aattagcttc ttggggtatc tttaaatact 1740gtagaaaaga ggaaggaaat aataaatggc taaaatgaga atatcaccgg aattgaaaaa 1800actgatcgaa aaataccgct gcgtaaaaga tacggaagga atgtctcctg ctaaggtata 1860taagctggtg ggagaaaatg aaaacctata tttaaaaatg acggacagcc ggtataaagg 1920gaccacctat gatgtggaac gggaaaagga catgatgcta tggctggaag gaaagctgcc 1980tgttccaaag gtcctgcact ttgaacggca tgatggctgg agcaatctgc tcatgagtga 2040ggccgatggc gtcctttgct cggaagagta tgaagatgaa caaagccctg aaaagattat 2100cgagctgtat gcggag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NA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：包含KpnI、Hind、EcoRI和XhoI限制位点的寡脱氧核苷酸<400>    35cggtaccgaa gctttgaatt cactcgagca gattgtcgtt tcccgcc         47<210>    36<211>    36<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：包含AvrII和AgcI限制位点的寡脱氧核苷酸<400>    36tatcctagga accggtaaac cctgtggttg gcatgc                     36<210>    37<211>    29<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：用于合成片段“MCs-beg.Pnos”的寡脱氧核苷酸<400>    37atatgagact ctaattggat accgagggg                               29<210>    38<211>    49<212>    DNA<213>    人工序列<220><23>    人工序列的描述：包含XhoI、EcoRI、HindIII和KpnI限制位点的寡脱氧核苷酸<400>    38gctcgagtga attcaaagct tcggtaccgt tgaaggagcc actcagccg         49<210>    39<211>    25<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：用于合成部分nptII和BspEI位点的寡脱氧核苷酸<400>    39ggaatcgaaa tctcgtgatg gcagg                                   25<210>    40<211>    24<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：用于合成部分Pnos和nptII的寡脱氧核苷酸<400>    40attattgcgc  gttcaaaagt  cgcc                                  24<210>    41<211>    52<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：用于合成MCS的XbaI、SalI、PacI、BamHI、MluI、HpaI和FseI限制
     位点的寡脱氧核苷酸<400>    41agcttggccg gccgttaaca cgcgtggatc cttaattaag tcgactctag ag     52<210>    42<211>    52<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：用于合成MCS的XbaI、SaII、PacI、BamHI、MluI、HpaI和FseI限制
     位点的寡脱氧核苷酸<400>    42aattctctag agtcgactta attaaggatc cacgcgtgtt aacggccggc ca    52<210>    43<211>    30<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：包含BspEI限制位点的寡脱氧核苷酸<400>    43taatctgcat ccggatctgg atcgtttcgc                             30<210>    44<211>    30<212>    DNA<213>    人工序列<220><23>    人工序列的描述：包含BspEI限制位点的寡脱氧核苷酸<400>    44acgatccaga tccggatgca gattatttgg                             30<210>    45<211>    30<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：包含BglII限制位点的寡脱氧核苷酸<400>    45atgggtcacg acgagatctt cgccgtcggg                             30<210>    46<211>    19<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：包含BstBI限制位点的寡脱氧核苷酸<400>    46aggcattggt ttcgaagcg                               19<210>    47<211>    21<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：用于合成质粒pUC19-uidA-TnosΔEcoRI的寡脱氧核苷酸<400>    47tacgccaagc ttggcaattcc                             21<210>    48<211>    29<212>    DNA<213>    人工序列<220><23>     人工序列的描述：包含NcoI和SmaI限制位点的寡脱氧核苷酸<400>    48aatacccggg accatggtcc gtcctgtag                    29<210>    49<211>    24<212>    DNA<13>     人工序列<220><23>     人工序列的描述：位于SnaBI限制位点上游的寡脱氧核苷酸<400>    49atagtctgcc agttcagttc gttg                         24<210>    50<211>    9688<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人工序列的描述：pMRT1334<220><221>    misc特征<22>     (1)<23>     通过用pBIN19的nptII表达盒替换pMRT1206的nptII表达盒，获得pMRT1334<400>    50ccgggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag 60aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccgccg gcgttgtgga tacctcgcgg 120aaaacttggc cctcactgac agatgagggg cggacgttga cacttgaggg gccgactcac 180ccggcgcggc gttgacagat gaggggcagg ctcgatttcg gccggcgacg tggagctggc 240cagcctcgca aatcggcgaa aacgcctgat tttacgcgag tttcccacag atgatgtgga 300caagcctggg gataagtgcc ctgcggtatt gacacttgag gggcgcgact actgacagat 360gaggggcgcg atccttgaca cttgaggggc agagtgctga cagatgaggg gcgcacctat 420tgacatttga ggggctgtcc acaggcagaa aatccagcat ttgcaagggt ttccgcccgt 480ttttcggcca ccgctaacct gtcttttaac ctgcttttaa accaatattt ataaaccttg 540tttttaacca gggctgcgcc ctgtgcgcgt gaccgcgcac gccgaagggg ggtgcccccc 600cttctcgaac cctcccggaa aggtatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 660aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 720cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 780ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 840aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 900cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 960cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 1020gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 1080tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 1140cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 1200ccactggcag cagccttcta ccataatccg cgataaaccc agcgaaccat ttgaggtgat 1260aggtaagatt ataccgaggt atgaaaacga gaattggacc tttacagaat tactctatga 1320agcgccatat ttaaaaagct accaagacga agaggatgaa gaggatgagg aggcagattg 1380ccttgaatat attgacaata ctgataagat aatacatctt ttatatagaa gatatcgccg 1440tatgtaagga tttcaggggg caaggcatag gcagcgcgct tatcaatata tctatagaat 1500gggcaaagca taaaaacttg catggactaa tgcttgaaac ccaggacaat aaccttatag 1560cttgtaaatt ctaccaaaat tgtggtttca aaatcggctc cgtcgatact atgttatacg 1620ccaactttga aaacaacttt gaaaaagctg ttttctggta tttaaggttt tagaatgcaa 1680ggaacagtga attggagttc gtcttgttat aattagcttc ttggggtatc tttaaatact 1740gtagaaaaga ggaaggaaat aataaatggc taaaatgaga atatcaccgg aattgaaaaa 1800actgatcgaa aaataccgct gcgtaaaaga tacggaagga atgtctcctg ctaaggtata 1860taagctggtg ggagaaaatg aaaacctata tttaaaaatg acggacagcc ggtataaagg 1920gaccacctat gatgtggaac gggaaaagga catgatgcta tggctggaag gaaagctgcc 1980tgttccaaag gtcctgcact ttgaacggca tgatggctgg agcaatctgc tcatgagtga 2040ggccgatggc gtcctttgct cggaagagta tgaagatgaa caaagccctg aaaagattat 2100cgagctgtat gcggagtgca tcaggctctt tcactccatc gacatatcgg attgtcccta 2160tacgaatagc ttagacagcc gcttagccga attggattac ttactgaata acgatctggc 2220cgatgtggat tgcgaaaact gggaagaaga cactccattt aaagatccgc gcgagctgta 2280tgatttttta aagacggaaa agcccgaaga ggaacttgtc ttttcccacg gcgacctggg 2340agacagcaac atctttgtga aagatggcaa agtaagtggc tttattgatc ttgggagaag 2400cggcagggcg gacaagtggt atgacattgc cttctgcgtc cggtcgatca gggaggatat 2460cggggaagaa cagtatgtcg agctattttt tgacttactg gggatcaagc ctgattggga 2520gaaaataaaa tattatattt tactggatga attgttttag tacctagatg tggcgcaacg 2580atgccggcga caagcaggag cgcaccgact tcttccgcat caagtgtttt ggctctcagg 2640ccgaggccca cggcaagtat ttgggcaagg ggtcgctggt attcgtgcag ggcaagattc 2700ggaataccaa gtacgagaag gacggccaga cggtctacgg gaccgacttc attgccgata 2760aggtggatta tctggacacc aaggcaccag gcgggtcaaa tcaggaataa gggcacattg 2820ccccggcgtg agtcggggca atcccgcaag gagggtgaat gaatcggacg tttgaccgga 2880aggcatacag gcaagaactg atcgacgcgg ggttttccgc cgaggatgcc gaaaccatcg 2940caagccgcac cgtcatgcgt gcgccccgcg aaaccttcca gtccgtcggc tcgatggtcc 3000agcaagctac ggccaagatc gagcgcgaca gcgtgcaact ggctccccct gccctgcccg 3060cgccatcggc cgccgtggag cgttcgcgtc gtctcgaaca ggaggcggca ggtttggcga 3120ag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     pMRT1196中，获得pMRT1336<400>    52ccgggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag 60aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccgccg gcgttgtgga tacctcgcgg 120aaaacttggc cctcactgac agatgagggg cggacgttga cacttgaggg gccgactcac 180ccggcgcggc gttgacagat gaggggcagg ctcgatttcg gccggcgacg tggagctggc 240cagcctcgca aatcggcgaa aacgcctgat tttacgcgag tttcccacag atgatgtgga 300caagcctggg gataagtgcc ctgcggtatt gacacttgag gggcgcgact actgacagat 360gaggggcgcg atccttgaca cttgaggggc agagtgctga cagatgaggg gcgcacctat 420tgacatttga ggggctgtcc acacgcagaa aatccagcat ttgcaagggt ttccgcccgt 480ttttcggcca ccgctaacct gtcttttaac ctgcttttaa accaatattt ataaaccttg 540tttttaacca gggctgcgcc ctgtgcgcgt gaccgcgcac gccgaagggg ggtgcccccc 600cttctcgaac cctcccggaa aggtatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 660aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 720cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 780ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 840aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 900cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 960cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 1020gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 1080tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 1140cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 1200ccactggcag cagccttcta ccataatccg cgataaaccc agcgaaccat ttgaggtgat 1260aggtaagatt ataccgaggt atgaaaacga gaattggacc tttacagaat tactctatga 1320agcgccatat ttaaaaagct accaagacga agaggatgaa gaggatgagg aggcagattg 1380ccttgaatat attgacaata ctgataagat aatacatctt ttatatagaa gatatcgccg 1440tatgtaagga tttcaggggg caaggcatag gcagcgcgct tatcaatata tctatagaat 1500gggcaaagca taaaaacttg catggactaa tgcttgaaac ccaggacaat aaccttatag 1560cttgtaaatt ctaccaaaat tgtggtttca aaatcggctc cgtcgatact atgttatacg 1620ccaactttga aaacaacttt gaaaaagctg ttttctggta tttaaggttt tagaatgcaa 1680ggaacagtga attggagttc gtcttgttat aattagcttc ttggggtatc tttaaatact 1740gtagaaaaga ggaaggaaat aataaatggc taaaatgaga atatcaccgg aattgaaaaa 1800actgatcgaa aaataccgct gcgtaaaaga tacggaagga atgtctcctg ctaaggtata 1860taagctggtg ggagaaaatg aaaacctata tttaaaaatg acggacagcc ggtataaagg 1920gaccacctat gatgtggaac gggaaaagga catgatgcta tggctggaag gaaagctgcc 1980tgttccaaag gtcctgcact ttgaacggca tgatggctgg agcaatctgc tcatgagtga 2040ggccgatggc gtcctttgct cggaagagta tgaagatgaa caaagccctg aaaagattat 2100cgagctgtat gcggagtgca tcaggctctt tcactccatc gacatatcgg attgtcccta 2160tacgaatagc ttagacagcc gcttagccga attggattac ttactgaata acgatctggc 2220cgatgtggat tgcgaaaact gggaagaaga cactccattt aaagatccgc gcgagctgta 2280tgatttttta aagacggaaa agcccgaaga ggaacttgtc ttttcccacg gcgacctggg 2340agacagcaac atctttgtga aagatggcaa agtaagtggc tttattgatc ttgggagaag 2400cggcagggcg gacaagtggt atgacattgc cttctgcgtc cggtcgatca gggaggatat 2460cggggaagaa cagtatgtcg agctattttt tgacttactg gggatcaagc ctgattggga 2520gaaaataaaa tattatattt tactggatga attgttttag tacctagatg tggcgcaacg 2580atgccggcga caagcaggag cgcaccgact tcttccgcat caagtgtttt ggctctcagg 2640ccgaggccca cggcaagtat ttgggcaagg ggtcgctggt attcgtgcag ggcaagattc 2700ggaataccaa gtacgagaag gacggccaga cggtctacgg gaccgacttc attgccgata 2760aggtggatta tctggacacc aaggcaccag gcgggtcaaa tcaggaataa gggcacattg 2820ccccggcgtg agtcggggca atcccgcaag gagggtgaat gaatcggacg tttgaccgga 2880aggcatacag gcaagaactg atcgacgcgg ggttttccgc cgaggatgcc gaaaccatcg 2940caagccgcac cgtcatgcgt gcgccccgcg aaaccttcca gtccgtcggc tcgatggtcc 3000agcaagctac ggccaagatc gagcgcgaca gcgtgcaact ggctccccct gccctgcccg 3060cgccatcggc cgccgtggag cgttcgcgtc gtctcgaaca ggaggcggca ggtttggcga 3120agtcgatgac catcgacacg cgaggaacta tgacgaccaa gaagcgaaaa accgccggcg 3180aggacctggc aaaacaggtc agcgaggcca agcaggccgc gttgctgaaa cacacgaagc 3240agcagatcaa ggaaatgcag ctttccttgt tcgatattgc gccgtggccg gacacgatgc 3300gagcgatgcc aaacgacacg gcccgctctg ccctgttcac cacgcgcaac aagaaaatcc 3360cgcgcgaggc gctgcaaaac aaggtcattt tccacgtcaa caaggacgtg aagatcacct 3420acaccggcgt cgagctgcgg gccgacgatg acgaactggt gtggcagcag gtgttggagt 3480acgcgaagcg cacccctatc ggcgagccga tcaccttcac gttctacgag ctttgccagg 3540acctgggctg gtcgatcaat ggccggtatt acacgaaggc cgaggaatgc ctgtcgcgcc 3600tacaggcgac ggcgatgggc ttcacgtccg accgcgttgg gcacctggaa tcggtgtcgc 3660tgctgcaccg cttccgcgtc ctggaccgtg gcaagaaaac gtcccgttgc caggtcctga 3720tcgacgagga aatcgtcgtg ctgtttgctg gcgaccacta cacgaaattc atatgggaga 3780agtaccgcaa gctgtcgccg acggcccgac ggatgttcga ctatttcagc tcgcaccggg 3840agccgtaccc gctcaagctg gaaaccttcc gcctcatgtg cggatcggat tccacccgcg 3900tgaagaagtg gcgcgagcag gtcggcgaag cctgcgaaga gttgcgaggc agcggcctgg 3960tggaacacgc ctgggtcaat gatgacctgg tgcattgcaa acgctagggc cttgtggggt 4020cagttccggc tgggggttca gcagccagcg ctttactggc atttcctagg ttgacgtctt 4080ctgatgggct gcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg gggagctgtt 4140ggctggctgg tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata 4200acacattgcg gacgttttta atgtactggg gctatccccc gggggatatc cataggcccg 4260atctagtaac 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    polyA35S”表达盒，获得pMRT1341<400>    56ccgggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag 60aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccgccg gcgttgtgga tacctcgcgg 120aaaacttggc cctcactgac agatgagggg cggacgttga cacttgaggg gccgactcac 180ccggcgcggc gttgacagat gaggggcagg ctcgatttcg gccggcgacg tggagctggc 240cagcctcgca aatcggcgaa aacgcctgat tttacgcgag tttcccacag atgatgtgga 300caagcctggg gataagtgcc ctgcggtatt gacacttgag gggcgcgact actgacagat 360gaggggcgcg atccttgaca cttgaggggc agagtgctga cagatgaggg gcgcacctat 420tgacatttga ggggctgtcc acaggcagaa aatccagcat ttgcaagggt ttccgcccgt 480ttttcggcca ccgctaacct gtcttttaac ctgcttttaa accaatattt ataaaccttg 540tttttaacca gggctgcgcc ctgtgcgcgt gaccgcgcac gccgaagggg ggtgcccccc 600cttctcgaac cctcccggcc cgctaacgcg ggcctcccat ccccccaggg gctgcgcccc 660tcggccgcga acggcctcac cccaaaaatg gcagcgctgg cagtccttgc cattgccggg 720atcggggcag taacgggatg ggcgatcagc ccgagcgcga cgcccggaag cattgacgtg 780ccgcaggtgc tggcatcgac attcagcgac caggtgccgg gcagtgaggg cggcggcctg 840ggtggcggcc tgcccttcac ttcggccgtc ggggcattca cggacttcat ggcggggccg 900gcaattttta ccttgggcat tcttggcata gtggtcgcgg gtgccgtgct cgtgttcggg 960ggtgcgataa acccagcgaa ccatttgagg tgataggtaa gattataccg aggtatgaaa 1020acgagaattg gacctttaca gaattactct atgaagcgcc atatttaaaa agctaccaag 1080acgaagagga tgaagaggat gaggaggcag attgccttga atatattgac aatactgata 1140agataatata tcttttatat agaagatatc gccgtatgta aggatttcag ggggcaaggc 1200ataggcagcg cgcttatcaa tatatctata gaatgggcaa agcataaaaa cttgcatgga 1260ctaatgcttg aaacccagga caataacctt atagcttgta aattctatca taattgggta 1320atgactccaa cttattgata gtgttttatg ttcagataat gcccgatgac tttgtcatgc 1380agctccaccg attttgagaa cgacagcgac ttccgtccca gccgtgccag gtgctgcctc 1440agattcaggt tatgccgctc aattcgctgc gtatatcgct tgctgattac gtgcagcttt 1500cccttcaggc gggattcata cagcggccag ccatccgtca tgcatatcac cacgtcaaag 1560ggtgacagca ggctcataag acgccccagc gtcgccatag tgcgttcacc gaatacgtgc 1620gcaacaaccg tcttccggag actgtcatac gcgtaaaaca gccagcgctg gcgcgattta 1680gccccgacat agccccactg ttcgtccatt tccgcgcaga cgatgacgtc actgcccggc 1740tgtatgcgcg aggttaccga ctgcggcctg agttttttaa gtgacgtaaa atcgtgttga 1800ggccaacgcc cataatgcgg gctgttgccc ggcatccaac gccattcatg gccatatcaa 1860tgattttctg gtgcgtaccg ggttgagaag cggtgtaagt gaactgcagt tgccatgttt 1920tacggcagtg agagcagaga tagcgctgat gtccggcggt gcttttgccg ttacgcacca 1980ccccgtcagt agctgaacag gagggacagc tgatagacac agaagccact ggagcacctc 2040aaaaacacca tcatacacta aatcagtaag ttggcagcat cacccataat tgtggtttca 2100aaatcggctc cgtcgatact atgttatacg ccaactttga aaacaacttt gaaaaagctg 2160ttttctggta tttaaggttt tagaatgcaa ggaacagtga attggagttc gtcttgttat 2220aattagcttc ttggggtatc tttaaatact gtagaaaaga ggaaggaaat aataaatggc 2280taaaatgaga atatcaccgg aattgaaaaa actgatcgaa aaataccgct gcgtaaaaga 2340tacggaagga atgtctcctg ctaaggtata taagctggtg ggagaaaatg aaaacctata 2400tttaaaaatg acggacagcc ggtataaagg gaccacctat gatgtggaac gggaaaagga 2460catgatgcta tggctggaag gaaagctgcc tgttccaaag gtcctgcact ttgaacggca 2520tgatggctgg agcaatctgc tcatgagtga ggccgatggc gtcctttgct cggaagagta 2580tgaagatgaa caaagccctg aaaagattat cgagctgtat gcggagtgca tcaggctctt 2640tcactccatc gacatatcgg attgtcccta tacgaatagc ttagacagcc gcttagccga 2700attggattac ttactgaata acgatctggc cgatgtggat tgcgaaaact gggaagaaga 2760cactccattt aaagatccgc gcgagctgta tgatttttta aagacggaaa agcccgaaga 2820ggaacttgtc ttttcccacg gcgacctggg agacagcaac atctttgtga aagatggcaa 2880agtaagtggc tttattgatc ttgggagaag cggcagggcg gacaagtggt atgacattgc 2940cttctgcgtc cggtcgatca gggaggatat cggggaagaa cagtatgtcg agctattttt 3000tgacttactg gggatcaagc ctgattggga gaaaataaaa tattatattt tactggatga 3060attgttttag tacctagatg tggcgcaacg atgccggcga caagcaggag cgcaccgact 3120tcttccgcat caagtgtttt ggctctcagg ccgaggccca cggcaagtat ttgggcaagg 3180ggtcgctggt attcgtgcag ggcaagattc ggaataccaa gtacgagaag gacggccaga 3240cggtctacgg gaccgacttc attgccgata aggtggatta tctggacacc aaggcaccag 3300gcgggtcaaa tcaggaataa gggcacattg ccccggcgtg agtcggggca atcccgcaag 3360gagggtgaat gaatcggacg tttgaccgga aggcatacag gcaagaactg atcgacgcgg 3420ggttttccgc cgaggatgcc gaaaccatcg caagccgcac cgtcatgcgt gcgccccgcg 3480aaaccttcca gtccgtcggc tcgatggtcc agcaagctac ggccaagatc gagcgcgaca 3540gcgtgcaact ggctccccct gccctgcccg cgccatcggc cgccgtggag cgttcgcgtc 3600gtctcgaaca ggaggcggca ggtttggcga agtcgatgac catcgacacg cgaggaacta 3660tgacgaccaa gaagcgaaaa accgccggcg aggacctggc aaaacaggtc agcgaggcca 3720agcaggccgc gttgctgaaa cacacgaagc agcagatcaa ggaaatgcag ctttccttgt 3780tcgatattgc gccgtggccg gacacgatgc gagcgatgcc aaacgacacg gcccgctctg 3840ccctgttcac cacgcgcaac aagaaaatcc cgcgcgaggc gctgcaaaac aaggtcattt 3900tccacgtcaa caaggacgtg aagatcacct acaccggcgt cgagctgcgg gccgacgatg 3960acgaactggt gtggcagcag gtgttggagt acgcgaagcg cacccctatc ggcgagccga 4020tcaccttcac gttctacgag ctttgccagg acctgggctg gtcgatcaat ggccggtatt 4080acacgaaggc cgaggaatgc ctgtcgcgcc tacaggcgac ggcgatgggc ttcacgtccg 4140accgcgttgg gcacctggaa tcggtgtcgc tgctgcaccg cttccgcgtc ctggaccgtg 4200gcaagaaaac gtcccgttgc caggtcctga tcgacgagga aatcgtcgtg ctgtttgctg 4260gcgaccact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     polyA35S”表达盒，获得pMRT1342<400>   57ccgggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag 60aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccgccg gcgttgtgga tacctcgcgg 120aaaacttggc cctcactgac agatgagggg cggacgttga cacttgaggg gccgactcac 180ccggcgcggc gttgacagat gaggggcagg ctcgatttcg gccggcgacg tggagctggc 240cagcctcgca aatcggcgaa aacgcctgat tttacgcgag tttcccacag atgatgtgga 300caagcctggg gataagtgcc ctgcggtatt gacacttgag gggcgcgact actgacagat 360gaggggcgcg atccttgaca cttgaggggc agagtgctga cagatgaggg gcgcacctat 420tgacatttga ggggctgtcc acaggcagaa aatccagcat ttgcaagggt ttccgcccgt 480ttttcggcca ccgctaacct gtcttttaac ctgcttttaa accaatattt ataaaccttg 540tttttaacca gggctgcgcc ctgtgcgcgt gaccgcgcac gccgaagggg ggtgcccccc 600cttctcgaac cctcccggcc cgctaacgcg ggcctcccat ccccccaggg gctgcgcccc 660tcggccgcga acggcctcac cccaaaaatg gcagcgctgg cagtccttgc cattgccggg 720atcggggcag taacgggatg ggcgatcagc ccgagcgcga cgcccggaag cattgacgtg 780ccgcaggtgc tggcatcgac attcagcgac caggtgccgg gcagtgaggg cggcggcctg 840ggtggcggcc tgcccttcac ttcggccgtc ggggcattca cggacttcat ggcggggccg 900gcaattttta ccttgggcat tcttggcata gtggtcgcgg gtgccgtgct cgtgttcggg 960ggtgcgataa acccagcgaa ccatttgagg tgataggtaa gattataccg aggtatgaaa 1020acgagaattg gacctttaca gaattactct atgaagcgcc atatttaaaa agctaccaag 1080acgaagagga tgaagaggat gaggaggcag attgccttga atatattgac aatactgata 1140agataatata tcttttatat agaagatatc gccgtatgta aggatttcag ggggcaaggc 1200ataggcagcg cgcttatcaa tatatctata gaatgggcaa agcataaaaa cttgcatgga 1260ctaatgcttg aaacccagga caataacctt atagcttgta aattctatca taattgggta 1320atgactccaa cttattgata gtgttttatg ttcagataat gcccgatgac tttgtcatgc 1380agctccaccg attttgagaa cgacagcgac ttccgtccca gccgtgccag gtgctgcctc 1440agattcaggt tatgccgctc aattcgctgc gtatatcgct tgctgattac gtgcagcttt 1500cccttcaggc gggattcata cagcggccag ccatccgtca tccatatcac cacgtcaaag 1560ggtgacagca ggctcataag acgccccagc gtcgccatag tgcgttcacc gaatacgtgc 1620gcaacaaccg tcttccggag actgtcatac gcgtaaaaca gccagcgctg gcgcgattta 1680gccccgacat agccccactg ttcgtccatt tccgcgcaga cgatgacgtc actgcccggc 1740tgtatgcgcg aggttaccga ctgcggcctg agttttttaa gtgacgtaaa atcgtgttga 1800ggccaacgcc cataatgcgg gctgttgccc ggcatccaac gccattcatg gccatatcaa 1860tgattttctg gtgcgtaccg ggttgagaag cggtgtaagt gaactgcagt tgccatgttt 1920tacggcagtg agagcagaga tagcgctgat gtccggcggt gcttttgccg ttacgcacca 1980ccccgtcagt agctgaacag gagggacagc tgatagacac agaagccact ggagcacctc 2040aaaaacacca tcatacacta aatcagtaag ttggcagcat cacccataat tgtggtttca 2100aaatcggctc cgtcgatact atgttatacg ccaactttga aaacaacttt gaaaaagctg 2160ttttctggta tttaaggttt tagaatgcaa ggaacagtga attggagttc gtcttgttat 2220aattagcttc ttggggtatc tttaaatact gtagaaaaga ggaaggaaat aataaatggc 2280taaaatgaga atatcaccgg aattgaaaaa actgatcgaa aaataccgct gcgtaaaaga 2340tacggaagga atgtctcctg ctaaggtata taagctggtg ggagaaaatg aaaacctata 2400tttaaaaatg acggacagcc ggtataaagg gaccacctat gatgtggaac gggaaaagga 2460catgatgcta tggctggaag gaaagctgcc tgttccaaag gtcctgcact ttgaacggca 2520tgatggctgg agcaatctgc tcatgagtga ggccgatggc gtcctttgct cggaagagta 2580tgaagatgaa caaagccctg aaaagattat cgagctgtat gcggagtgca tcaggctctt 2640tcactccatc gacatatcgg attgtcccta tacgaatagc ttagacagcc gcttagccga 2700attggattac ttactgaata acgatctggc cgatgtggat tgcgaaaact gggaagaaga 2760cactccattt aaagatccgc gcgagctgta tgatttttta aagacggaaa agcccgaaga 2820ggaacttgtc ttttcccacg gcgacctggg agacagcaac atctttgtga aagatggcaa 2880agtaagtggc tttattgatc ttgggagaag cggcagggcg gacaagtggt atgacattgc 2940cttctgcgtc cggtcgatca gggaggatat cggggaagaa cagtatgtcg agctattttt 3000tgacttactg gggatcaagc ctgattggga gaaaataaaa tattatattt tactggatga 3060attgttttag tacctagatg tggcgcaacg atgccggcga caagcaggag cgcaccgact 3120tcttccgcat caagtgtttt ggctctcagg ccgaggccca cggcaagtat ttgggcaagg 3180ggtcgctggt attcgtgcag ggcaagattc ggaataccaa gtacgagaag gacggccaga 3240cggtctacgg gaccgacttc attgccgata aggtggatta tctggacacc aaggcaccag 3300gcgggtcaaa tcaggaataa gggcacattg ccccggcgtg agtcggggca atcccgcaag 3360gagggtgaat gaatcggacg tttgaccgga aggcatacag gcaagaactg atcgacgcgg 3420ggttttccgc cgaggatgcc gaaaccatcg caagccgcac cgtcatgcgt gcgccccgcg 3480aaaccttcca gtccgtcggc tcgatggtcc agcaagctac ggccaagatc gagcgcgaca 3540gcgtgcaact ggctccccct gccctgcccg cgccatcggc cgccgtggag cgttcgcgtc 3600gtctcgaaca ggaggcggca ggtttggcga agtcgatgac catcgacacg cgaggaacta 3660tgacgaccaa gaagcgaaaa accgccggcg aggacctggc aaaacaggtc agcgaggcca 3720agcaggccgc gttgctgaaa cacacgaagc agcagatcaa ggaaatgcag ctttccttgt 3780tcgatattgc gccgtggccg gacacgatgc gagcgatgcc aaacgacacg gcccgctctg 3840ccctgttcac cacgcgcaac aagaaaatcc cgcgcgaggc gctgcaaaac aaggtcattt 3900tccacgtcaa caaggacgtg aagatcacct acaccggcgt cgagctgcgg gccgacgatg 3960acgaactggt gtggcagcag gtgttggagt acgcgaagcg cacccctatc ggcgagccga 4020tcaccttcac gttctacgag ctttgccagg acctgggctg gtcgatcaat ggccggtatt 4080acacgaaggc cgaggaatgc ctgtcgcgcc tacaggcgac ggcgatgggc ttcacgtccg 4140accgcgttgg gcacctggaa tcggtgtcgc tgctgcaccg cttccgcgtc ctggaccgtg 4200gcaagaaaac gtcccgttgc caggtcctga tcgacgagga aatcgtcgtg ctgtttgctg 4260gcgaccact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Claims (34)

1.仅含有其功能性和细胞、尤其是植物细胞转基因发生(transgenesis)必需的元件的纯合成载体，它包含以下与其功能性和细胞转基因发生必需的有效连接元件：
-至少一个核酸序列，它编码至少一个第一复制起点，优选oriRK2，更优选至少一个具有广泛宿主范围的大肠杆菌pRK2的ori V；
-至少一个核酸序列，它编码选择剂，优选抗生素抗性基因，更优选赋予细菌对卡那霉素抗性的nptIII基因；
-编码至少一种蛋白的trfA基因座，所述蛋白可以增加所述质粒的复制率，它优选得自pRK2，更优选编码蛋白P285和P382。
2.按照前述权利要求中任一项的纯合成载体，其特征在于它包括鉴定编号为SEQ.ID01的核酸序列。
3.按照前述权利要求中任一项的纯合成载体，其特征在于它由其核酸序列鉴定编号为SEQ.ID01的单纯质粒pMRT1105组成。
4.按照前述权利要求1-3中任一项的纯合成载体，其特征在于它包括至少一个编码第二复制起点的核酸序列，所述第二复制起点优选大肠杆菌的ori，更优选ori ColEI。
5.按照前述权利要求1-3中任一项的纯合成载体，其特征在于它包括鉴定编号为SEQ.ID02的核酸序列。
6.按照前述权利要求中任一项的纯合成载体，其特征在于它由其核酸序列鉴定编号为SEQ.ID02的单纯质粒pMRT1106组成。
7.按照前述权利要求中任一项的纯合成载体，其特征在于它包括由至少一个核酸序列组成的区，所述核酸序列包含几个独特的酶限制位点，总称为《多克隆位点》(MCS)。
8.按照前述权利要求中任一项的纯合成载体，其特征在于它还包括编码T-DNA的核酸序列，所述T-DNA包括右边界RB和左边界LB，使得所述载体可以起双元质粒的作用。
9.按照权利要求7或8的纯合成载体，其特征在于所述MCS位于所述T-DNA的右边界RB附近。
10.按照权利要求8的纯合成载体，其特征在于它还包括编码至少一个表达启动子和至少一个转录终止子的核酸序列，所述核酸序列位于所述T-DNA的左边界LB和右边界RB之间。
11.按照权利要求10的纯合成载体，其特征在于所述表达启动子选自组成型启动子、诱导型启动子和特异性启动子，优选选自植物表达启动子。
12.按照权利要求11的纯合成载体，其特征在于所述表达启动子选自35S CaMV启动子、CaMV的ep35S、豌豆质体蓝素基因启动子、其“增强子”区和衍生区、小麦“高分子量麦谷蛋白”(HMWG)启动子、CsVMV“木薯花叶病毒”启动子、CoYMV“鸭跖草黄色斑点花叶病毒(commelina ycllow mosaic virus)”启动子、CsVMV和CoYMV启动子的嵌合启动子，以及它们的衍生物。
13.按照权利要求8-12中任一项的纯合成载体，其特征在于所述表达终止子选自在植物细胞中有效的终止子，优选为35S或nos终止子。
14.按照权利要求8-13中任一项的纯合成载体，其特征在于它包括至少一个编码在植物细胞中有效的选择剂的核酸序列，优选包括至少一个编码抗生素抗性基因和/或除草剂抗性基因的核酸序列。
15.按照权利要求14的纯合成载体，其特征在于它含有编码bar抗性(《bialaphos抗性》)基因或pat(《膦丝菌素乙酰转移酶》)基因的序列。
16.按照权利要求14的纯合成载体，其特征在于所述编码在植物细胞中有效的选择剂的核酸序列是编码突变或野生型nptII抗性基因的序列。
17.按照权利要求14、15或16中任一项的纯合成载体，其特征在于编码所述选择剂的所述核酸序列位于所述T-DNA的左边界附近。
18.按照前述权利要求中任一项的纯合成载体，其特征在于它包括至少一个含启动表达的核酸序列的表达盒，所述核酸序列与需要表达的核酸序列有效连接，所述表达核酸序列编码需要产生的多肽，表达盒本身结合转录终止核酸序列。
19.按照权利要求18的纯合成载体，其特征在于所述需要产生的多肽是在体外和/或人类和/或动物中具有活性的酶或蛋白或蛋白衍生物，所述活性包括消化、胰腺、胆汁、抗病毒、抗炎症、肺、抗微生物、营养、化妆、结构、血液、心血管、眼、抗原、免疫刺激和大脑活性。
20.按照前述权利要求8-19中任一项的纯合成载体，其特征在于它以双元、线性或环状质粒形式存在，选自鉴定编号为SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID14、SEQ.ID15、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.ID19、SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22的核酸序列。
21.按照前述权利要求中任一项的纯合成载体，其特征在于每个功能性元件都可以独立于其它元件被切割。
22.按照权利要求21的纯合成载体，其特征在于每个功能性元件都可以通过酶促消化，在存在于同一载体中的第一独特限制位点和第二独特限制位点的水平上独立于其它元件被切割。
23.分离的核酸序列，其特征在于它对应于选自以下的核酸序列：鉴定编号为SEQ.ID01、SEQ.ID02、SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID14、SEQ.ID15、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.ID19、SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22的核酸序列。
24.具有稳定整合入其基因组的按照前述权利要求中任一项的载体或核酸序列的转基因植物。
25.按照权利要求24的转基因植物，其特征在于它选自双子叶物种，例如马铃薯、烟草、棉花、莴苣、番茄、甜瓜、黄瓜、豌豆、油菜、甜菜根或向日葵，或选自单子叶植物，例如小麦、大麦、燕麦、稻或玉米。
26.按照前述权利要求24或25的任一项的转基因植物的繁殖体。
27.按照权利要求26的转基因植物的繁殖体，其特征在于它是种子。
28.包含按照前述权利要求1-23中任一项的载体或核酸序列的细胞。
29.按照权利要求28的细胞，其特征在于它是植物细胞。
30.在细胞中表达编码需要产生的多肽的核酸序列或基因的方法，其特征在于它包含以下步骤：
-用按照权利要求1-23中任一项的载体或核酸序列转化所述细胞；
-在允许表达编码所述需要产生的多肽的核酸序列或基因的条件下，制备所述细胞的培养物。
31.按照权利要求30的方法，其特征在于所述细胞是原核细胞或真核细胞。
32.按照前述权利要求30或31中任一项的方法，其特征在于所述细胞是选自以下的细胞：微生物细胞、真菌细胞、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞。
33.按照前述权利要求30-32中任一项的方法，其特征在于所述细胞是植物细胞。
34.获得按照前述权利要求24或25中任一项的转基因植物或按照权利要求26的繁殖体的方法，其特征在于它包含以下步骤：
-用按照前述权利要求1-23中任一项的核酸序列或包含其的载体转化细胞植物；
-选择所述载体或所述核酸序列整合入其中的植物细胞；
-或者通过培养或者通过再生嵌合或转基因全株，繁殖所述转化并选择的植物细胞。
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