CN105026422A - Sh2结构域变体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于结合含磷酸酪氨酸(pTyr)肽的变体SH2结构域。本发明的变体SH2结构域包括在亲代SH2结构域的15个氨基酸位点的预定义区域具有至少一个氨基酸取代的亲代SH2结构域,其中所述至少一个氨基酸取代增加了变体SH2结构域相对于亲代SH2结构域对含pTyr肽的亲和性。本申请还涉及使用变体SH2结构域,在蛋白激酶相关的失调的治疗或蛋白激酶相关的失调的诊断或预后中用于分离含pTyr的分子或检测其浓度,以及在研究中作为试剂的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年3月27日提交的美国临时申请号61/616,167的权益,其内容在此全文被引入本发明作为参考。
技术领域
本发明整体涉及蛋白酪氨酸激酶信号,具体的,本发明涉及对含有磷酸酪氨酸的肽或蛋白具有增强的结合亲和性的多肽,涉及使用该多肽用于治疗蛋白酪氨酸激酶相关的失调的方法,例如免疫学的和肿瘤学的失调,涉及使用该多肽用于诊断蛋白酪氨酸激酶相关的失调的方法,涉及使用该多肽用于检测、追踪或监控细胞中的酪氨酸磷酸化事件的方法,涉及使用该多肽用于富集或纯化含有磷酸酪氨酸的肽或蛋白的方法,以及涉及含有该多肽的药物组合物。
背景技术
蛋白酪氨酸激酶(PTKs)及其底物在多种细胞进程中起重要作用,例如增殖、分化、运动和凋亡。磷酸酪氨酸(还称为pTyr或pY)信号网中的异常激酶激活和伴随的改变是多种癌症的标志。细胞用来翻译pTyr介导的信号的主要机制依赖于特异性结合酪氨酸磷酸化蛋白的模块化蛋白结构域。Src同源区2(SH2)结构域是这些模块化结构域中最普遍的,并在PTK信号途径中起核心作用。不同的pTyr位点使用不同的含SH2结构域的蛋白,后者反过来激活不同的信号途径。
PTKs尤其包括受体酪氨酸激酶,包括表皮生长因子激酶家族成员。在多种恶性和非恶性增殖性疾病中已有显示增强的PTKs活性。此外,PTKs在调节免疫系统细胞中起作用是已知的。
PTKs是用于癌症治疗的重要药物靶点。目前的抗癌药主要基于小分子激酶抑制剂或人源化抗体。这些药物经常显示对一组相关激酶的广谱特异性,患者在接受治疗1年左右后最终对药物发展出耐受性。
抑制PTK信号的替代想法是通过遮盖PTK底物的磷酸酪氨酸来阻断下游信号。虽然磷酸酪氨酸特异性抗体对含pTyr多肽具有高亲和性,但是它们不能在细胞内使用。
pTyr特异性抗体(美国专利6,824,989)被广泛用来检测生物样本中含有的pTyr。然而,抗体不能在活细胞内使用。IgG抗体分子是总分子量为~150kDa的异四聚化蛋白,其通过免疫系统中的B细胞分泌至胞外空间。抗体含有二硫键,在免疫系统中的细胞外部起作用,且没有被设计为在细胞质中起作用或透过细胞膜。因此,pTyr特异性抗体无法被用作体内试剂用于在活细胞内部干扰涉及蛋白酪氨酸磷酸化的胞内信号事件。
含SH2结构域的蛋白在PTK信号下游起作用,且为信号集合点。SH2结构域含有~100个氨基酸且约比抗体分子小15倍。当分离的SH2结构域在细胞中递送或表达时,其能够与结合pTyr位点的内生性信号蛋白竞争。然而,天然的SH2结构域被设计为介导与其同源结合位点的瞬间相互作用,以确保动态细胞信号。换而言之,天然SH2结构域被内在地设计为在体内不阻断PTK信号途径。由于该特征,天然SH2结构域无法用作强抑制试剂。
美国专利号5,786,454(“US 454”)公开了具有改变的结合位点的SH2结构域,所述改变的结合位点改变了序列识别特异性。还有报道称对SH2结构域目标结合位点的修饰,包括缺失、取代或引入非天然氨基酸,能够改变SH2结构域的序列识别特异性((Songyang等人,(1995)J.Biol.Chem.,Vol.270,pp.26029;Kimber等人,(2000)Mol.Cell,Vol.5,pp.1043;Kaneko等人,(2010)Sci.Signal.,Vol.3,pp.ra34;Virdee等人,(2010)Chemistry&Biology,Vol.17,pp.274)。通过该方法创造的SH2变体在一些情况下表现出对其同源目标多肽的增强的特异性。然而,这些SH2变体通常以与对应的天然SH2结构域相似的亲和性结合至其同源目标多肽。
发明内容
本发明涉及与亲代SH2结构域(包括野生型SH2结构域)相比,针对含磷酸酪氨酸(“pTyr”)的肽或蛋白具有增强的结合亲和性的变体SH2结构域,涉及使用该变体SH2结构域治疗蛋白酪氨酸激酶相关的失调(例如免疫学的和肿瘤学的失调)的方法,涉及使用该变体SH2结构域诊断蛋白酪氨酸激酶相关的失调的方法,涉及使用该变体SH2结构域追踪细胞中的酪氨酸磷酸化事件的方法,涉及该变体SH2结构域在研究中作为亲和试剂或检测试剂的用途,以及涉及包含该变体SH2结构域的药物组合物。
本发明还涉及增强SH2结构域与含pTyr肽的结合亲和性的一般策略。残基取代已被引入SH2结构域的pTyr-结合区域,并且阐述了对含pTyr肽的结合亲和性增强的有利取代。不同的取代组合表现了对亲和性增强的不同程度的影响,并且所产生的变体SH2结构域组(panel)显示了亲和性梯度。这些亲和性增强的变体在体外结合分析中和在哺乳动物细胞系中表现出比野生型对照SH2结构域更紧密的与含pTyr的蛋白的结合。因此,变体结构域在生理环境中和在体外条件下都起作用。
在一个实施方式中,本发明提供了一种结合含磷酸酪氨酸(pTyr)肽的变体SH2结构域。在一个实施方式中,变体SH2结构域包括在亲代SH2结构域的15个氨基酸位点的预定义区域中具有至少一个氨基酸取代的亲代SH2结构域,该取代增强了变体SH2结构域相对于亲代SH2结构域而言对含pTyr肽的亲和性。
在本发明的变体SH2结构域的一个实施方式中,当所述亲代SH2结构域与SEQ IDNO:1对齐时,亲代SH2结构域的15个氨基酸的预定义的区域对应于SEQ ID NO:1的Arg18(位点1)、Lys19(位点2)、Ala21(位点3)、Arg38(位点4)、Ser40(位点5)、Glu41(位点6)、Thr42(位点7)、Thr43(位点8)、Ala46(位点9)、Ser48(位点10)、Leu49(位点11)、Ser50(位点12)、Lys63(位点13)、His64(位点14)、和Lys66(位点15)。
在本发明的变体SH2结构域的另一个实施方式中,该至少一个取代包括在亲代SH2结构域中对应于位点10的位点处取代为小残基或疏水残基。
在本发明的变体SH2结构域的另一个实施方式中,该小残基或疏水残基包括丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸。
在本发明的变体SH2结构域的另一个实施方式中,该至少一个取代包括在亲代SH2结构域中对应于位点15的位点处取代为疏水残基。
在本发明的变体SH2结构域的另一个实施方式中,该疏水残基包括异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸。
在本发明的变体SH2结构域的另一个实施方式中,该至少一个取代包括在亲代SH2结构域中对应于位点10和15的位点处的取代。
在本发明的变体SH2结构域的另一个实施方式中,该至少一个取代包括在亲代SH2结构域中对应于位点8和15的位点处的取代。
在本发明的变体SH2结构域的另一个实施方式中,该至少一个取代包括在亲代SH2结构域中对应于位点8、10和15的位点处的取代。
在本发明的变体SH2结构域的另一个实施方式中,该对应于位点8的取代包括取代为苯丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、或缬氨酸。
在本发明的变体SH2结构域的另一个实施方式中,变体SH2结构域包括位点4的精氨酸残基、位点11的亮氨酸残基和位点12的丝氨酸残基。
在本发明的变体SH2结构域的另一个实施方式中,变体SH2结构域包括选自SEQID NOs:5-17、19-22的氨基酸序列。
在本发明的变体SH2结构域的另一个实施方式中,亲代SH2结构域是真核的(eukaryotic)。
本发明,在一个实施方式中,还提供了编码根据上述任一实施方式的变体SH2结构域的分离的DNA序列。
本发明,在一个实施方式中,还提供了含有前述实施方式的DNA序列的载体。
在一个实施方式中,本发明提供了本发明的变体SH2结构域在治疗含pTyr肽相关的失调中的用途。
在另一个实施方式中,本发明提供了本发明的变体SH2结构域在抑制或预防细胞中酪氨酸激酶的效果中的用途。
在另一个实施方式中,本发明提供了一种用于预防或抑制细胞中酪氨酸激酶的效果的方法,其特征在于该方法包括将上述实施方式的变体SH2结构域递送或引入细胞中。
在本发明的一个方面,在允许跨细胞运输的载体中提供变体SH2结构域。
在本发明的另一个方面,变体SH2结构域作为融合至细胞膜穿透分子的产物而被提供。
在另一个实施方式中,本发明还提供了上述实施方式的变体SH2结构域在评估样品中是否存在含pTyr肽中的用途。
在一个实施方式中,本发明提供了评估样品中是否存在含pTyr肽的方法,该方法包括(a)用所述样品接触本发明的变体SH2结构域,从而如果样品中存在含pTyr肽,会形成含pTyr肽/变体SH2结构域复合物;和(b)检测复合物的形成,从而检测样品中是否存在含pTyr肽。
在另一个实施方式中,本发明还提供了本发明的变体SH2结构域在含pTyr肽信号途径的研究中和/或在分离含pTyr肽中的用途。
在一个实施方式中,本发明涉及一种用于从样品中分离含pTyr肽的方法,其特征在于该方法包括:(a)用所述样品接触本发明的变体SH2结构域,从而如果样品中存在含pTyr肽,会形成含pTyr肽/变体SH2结构域复合物;和(b)从复合物中释放该含pTyr肽,从而从样品中分离含pTyr肽。
在前述方法的一个方面,该方法进一步包括通过检测所释放的含pTyr肽的量来测定含pTyr肽在样品中的浓度。
在另一个实施方式中,本发明提供了一种测定含pTyr肽在样品中的浓度的方法,该方法包括:(a)将本发明的变体SH2结构域固定在树脂上,(b)将样品流经具有结合的变体SH2结构域的树脂,(c)通过添加去除变体SH2结构域结合含pTyr肽的能力的溶剂,释放结合到树脂上的任何含pTyr肽,从而产生洗脱组份,和(d)测定在洗脱组份中存在的含pTyr肽的浓度。
在本发明的各方面,含pTyr肽的浓度通过高效液相色谱(HPLC)进行确定。
在本发明的各方面,变体SH2结构域被结合至亲和性柱或侧流试纸条。
在另一个实施方式中,本发明提供了本发明的变体SH2结构域在体外或体内的肽或蛋白中结合或检测pTyr残基的用途。
在另一个实施方式中,本发明提供了一种制造相对于亲代SH2结构域而言具有增强的含pTyr肽结合亲和性的变体SH2结构域的方法,其特征在于该方法包括取代亲代SH2结构域的15个氨基酸位点的预定义区域中至少一个氨基酸残基,当所述亲代SH2结构域与SEQ ID NO:1对齐时,亲代SH2结构域的15个氨基酸的预定义区域对应于SEQ ID NO:1的Arg18(位点1)、Lys19(位点2)、Ala21(位点3)、Arg38(位点4)、Ser40(位点5)、Glu41(位点6)、Thr42(位点7)、Thr43(位点8)、Ala46(位点9)、Ser48(位点10)、Leu49(位点11)、Ser50(位点12)、Lys63(位点13)、His64(位点14)、和Lys66(位点15)。
在一个实施方式中,本发明提供了包含多个SH2结构域的多肽,该多肽中至少一个所述多个SH2结构域为本发明的变体SH2结构域。
通过参考下述附图,本发明的这些方面和其它方面根据发明详述将变得显而易见。
附图说明
根据本文给出的发明详述和伴随的附图,将更全面地理解本发明,这些发明详述和附图仅以说明的方式给出,而不限制预期的发明范围。
图1(A)显示了围绕着pTyr的15个残基位点的位置和用于定义这些位点的序列比对。
图1(B)显示了pTyr在人Fyn SH2结构域上的结合位点。原子坐标源自蛋白质数据库ID:1AOT(Mulhern等,(1997)Structure,Vol.5,pp.1313),其描述了Fyn SH2结构域和结合的含pTyr肽的结构。在此图中,为清楚起见,只有结合肽中的pTyr残基以插入的方式进行了显示。围绕着结合pTyr的15个SH2结构域残基以深灰色阴影显示。SH2结构域的骨架结构显示为条带状。15个残基的位置展示为球状。
图2(a)显示了围绕着pTyr的15个残基位点的位置和用于定义这些位点的序列比对。根据一个实施方式,该15个位点被定义在Fyn SH2结构域上(图2a上阴影黑色残基)。序列比对(图2a)包含人Fyn SH2结构域(始于残基W149)、人Src SH2结构域(始于残基W151)和人Grb2SH2结构域(始于残基W60)。SH2结构域上的15个位点可从包括人Fyn SH2结构域的序列对齐中定义(图2a)。图2(b)说明了在对齐中存在对齐缺口时确定15个位点的一个实施方式。根据图2(b)中所示的实施方式,位点4处的精氨酸首先定义,然后位于位点4残基C端的位点5、6、7和8处的残基将分别被定义为第2、3、4和5个残基。图2(c)显示了根据本发明对15个位点的编号和由Eck等定义的对应的编号系统的对比(1993,Nature,Vol.362,pp.87)。
图3列举了用于本发明的噬菌体展示筛选实验的含pTyr的合成肽。这些肽在其N端生物素化,在其C端酰胺化。
图4是显示根据本发明的一个实施方式获得的人Fyn SH2结构域的63个变体的15个位点的残基的表格。从野生型取代的残基为阴影黑色。
图5是显示图4的63个变体中观察到的取代残基的列表。
图6列举了用于本发明荧光偏振分析的含pTyr的合成肽。这些肽在其N端荧光素标记,在其C端酰胺化。
图7显示了测定Fyn SH2结构域和图5中列举的肽之间相互作用亲和性的溶液内荧光偏振结合分析结果。图7(a)显示了肽和含有如第一行所示取代的变体Fyn SH2结构域之间相互作用的解离常数(Kd)值(以μM为单位)。针对每个肽-变体组合计算了相对于野生型的亲和性增强,如图7(b)所示。变体从左至右按照平均亲和性增强进行分类。
图8显示了通过荧光偏振(ΔFP)的增加测定的野生型或变体Fyn SH2结构域与肽的结合曲线和Kd值。图8(a)显示了野生型Fyn SH2结构域与荧光素-GGpYGG肽(SEQ IDNO:23)的结合。图8(b)显示了T8V/S10A/K15L变体Fyn SH2结构域与荧光素-GGpYGG肽(SEQ ID NO:23)的结合。图8(c)显示了在T8V/S10A/K15L变体SH2结构域和非磷酸化的荧光素-GGYGG肽(SEQ ID NO:24)之间观察到的不明显信号。
图9是说明测定Src SH2结构域和图5中列举的肽之间相互作用亲和性的溶液内荧光偏振结合分析结果的表格。图9(a)是显示含pTyr肽和野生型或变体Src SH2结构域之间相互作用的Kd值(以μM为单位)的表格。针对每个肽-变体组合计算了相对于野生型的亲和性增强,如图9(b)所示。
图10(a)是显示野生型Src SH2结构域与荧光素-GGpYGG肽(SEQ ID NO:23)的结合曲线和Kd值的图。图10(b)是显示T8V/C10A/K15L变体Src SH2结构域与荧光素-GGpYGG肽(SEQ ID NO:23)的结合曲线和Kd值的图。
图11显示了8V/10A/15L取代的Fyn、Grb2和Src SH2结构域(称为TrM)与野生型(称为Wt)结构域相比在EGFR下游细胞信号中的效果。SH2结构域与GFP融合并在HEK293细胞中表达。图11(a)是显示TrM SH2结构域比Wt结构域更紧密结合EGFR的蛋白质印迹图。IP:免疫沉淀,IB:免疫印迹。图11(b)显示了在表达TrM SH2结构域的细胞中Erk磷酸化被显著降低。Erk位于EGFR信号途径的下游。图11(c)是显示图11(b)中相对于设定为100%的GFP空载体对照的pErk条带强度定量的图。
图12显示了TrM(8V/10A/15L-取代的)SH2结构域对HEK293细胞生长的抑制效果。SH2结构域在HEK293细胞中作为GFP融合蛋白表达。图12(a)是显示相对于GFP空载体对照对细胞活性的抑制效果的图。图12(b)是显示通过软琼脂分析观察到的8V/10A/15L取代的SH2结构域对菌落形成的抑制效果的图,其相对于GFP空载体对照定量。图12(c)是图12(b)中定量菌落的示例照片。在图12(a)和12(b)中,黑条表示TrM,白条表示Wt。相对于GFP空载体对照样品(设定为100%)计算数量。
图13是显示TAT-SH2蛋白在细胞中转导的照片。对细菌表达的、纯化的TAT-FynSH2结构域用FITC进行标记并与HEK293细胞一起在指示的浓度(列)和时间(行)下培育。1hr培育后在2.5μM SH2蛋白下观察到有效的蛋白输入(transfusion)。
图14显示了如谷胱甘肽S-转移酶(GST)沉淀(pulldown)分析所示的,与Wt SH2结构域相比Fyn TrM SH2结构域的增强的结合酪氨酸-磷酸化蛋白的能力。IB:免疫印迹。4G10:针对pTyr的抗体(Millipore Co.)。MW:单位为千道尔顿的分子量。上图显示了沉淀分析后的蛋白质印迹结果。下图显示了如考马斯染色法所示的固定在谷胱甘肽琼脂糖珠(GE healthcare)上的GST-标记蛋白的上载对照。
图15的图A显示了GST-SrcSH2TrM与抗-pTyr小鼠单克隆抗体(Cell Signaling,#9411)的沉淀(pull down)酪氨酰磷酸化蛋白能力的比较。在此使用了来自H370细胞系(一种稳定表达人间变性淋巴瘤激酶(ALK)的HEK293细胞系)的细胞裂解物。ALK产生一种220kDa的蛋白,其随后被蛋白水解地裂解产生更小的片段,包括一个140kDa的片段。当用抗体mAb46刺激时,ALK被酪氨酸磷酸化(描述于Moog-Lutz C,Degoutin J,Gouzi JY,Frobert Y,Brunet-de Carvalho N,Bureau J,Créminon C,Vigny M.J Biol Chem.2005Jul 15;280(28):26039-48.Epub 2005May 10)。上图显示了用抗-pTyr抗体显示的蛋白质印迹结果。IP:使用抗-pTyr抗体和蛋白-G珠的免疫沉淀。GST-SH2结构域泳道:来自GST-沉淀实验的样品。hSrc:人Src。vSrc:劳斯氏肉瘤病毒Src。图B显示了与HRP(辣根过氧化物酶)缀合的SrcTrM SH2结构域能够在PVDF膜上检测磷酸化的ALK蛋白种类。
图16显示Src SH2TrM能够在膜上检测酪氨酸-磷酸化的蛋白。U937人淋巴瘤细胞用过钒酸钠(+PV)处理,或不用其处理(–PV,阴性对照),将9μg裂解物上载至SDS-PAGE凝胶的每个泳道上,并转移至PVDF膜(Millipore)。GST-Src SH2TrM结合膜上的磷酸化蛋白,并通过兔抗-GST抗体-HRP缀合物(Sigma-Aldrich#A7340)显像。
图17显示融合GFP的Fyn和Src SH2TrM可用于监控活细胞中酪氨酸-磷酸化蛋白的定位。图像显示了GFP-融合的TrM SH2结构域或野生型(WT)SH2对照转染的A549细胞中的绿色荧光蛋白。TrMSrc SH2和TrM Fyn SH2结构域表现出相似的亚细胞定位模式。相比之下,WT Src SH2和Fyn SH2结构域在细胞中或多或少地均匀分布,并在细胞核区域有轻微富集。对于所有图片横条=25μm。
图18显示由金纳米粒子递送进A549细胞的重组TrMSrc SH2结构域降低了在EGF处理下的细胞活力。
具体实施方式
定义
除非另有说明,否则本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员所普遍理解的相同含义。同样的,除了在权利要求中,除非另有说明,否则“或”的使用包括了“和”,反之亦然。非限制性术语不会被解释为限制性的,除非有明确表述或上下文清楚地显示了相反含义(例如“包括”、“具有”和“包含”一般表示“无限制地包括”)。在权利要求中包含的单数形式例如“一”、“一个”和“该”包括了复数指向,除非另有明确说明。
说明书全文中可使用下述标准的氨基酸残基单字母和三字母缩写:A,Ala--丙氨酸;R,Arg--精氨酸;N,Asn--天冬酰胺;D,Asp—天冬氨酸;C,Cys--半胱氨酸;Q,Gln—谷氨酰胺;E,Glu—谷氨酸;G,Gly—甘氨酸;H,His—组氨酸;I,Ile--异亮氨酸;L,Leu--亮氨酸;K,Lys—赖氨酸;M,Met—甲硫氨酸;F,Phe--苯丙氨酸;P,Pro--脯氨酸;S,Ser--丝氨酸;T,Thr—苏氨酸;W,Trp—色氨酸;Y,Tyr--酪氨酸;和V,Val—缬氨酸。
“含pTyr多肽”指含有含pTyr肽片段的分子。
术语"亲代SH2结构域"包括任何真核SH2结构域或多肽,其中该多肽具有与源自含有SH2结构域的人蛋白的SH2结构域至少约50%序列同一性。Liu等人(2011)ScienceSignaling,Vol.4,pp.ra83(参见表1)鉴定了含有SH2结构域的111种人蛋白。可以通过比较每个约100个氨基酸残基的序列中的位点来确定序列同一性,所述序列可以为比较目的而进行对齐。序列之间的序列同一性是序列所共有的匹配位点数量的函数。如此,术语“亲代SH2”结构域还包括人工制备的序列和病毒SH2结构域。例如,可以基于一种或多种哺乳动物SH2结构域序列产生或制备人工SH2结构域序列作为亲代SH2结构域,其将代表一种典型的SH2结构域序列,但是与任何哺乳动物SH2都不相同。另一个例子可以是由劳斯氏肉瘤病毒编码的v-Src,其是一种具有微小序列偏差的人Src病毒同系物。
术语"片段"指具有比本文所示氨基酸残基序列的肽更短的氨基酸残基序列的任何受试肽。
视具体情况,术语“分离的肽”或“分离的DNA”可被定义为肽或DNA分子,其基本上与可能是天然伴随着所述肽或DNA的其它细胞组分分离。该术语包括(没有限制)重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。
术语“配体”表示结合另一分子或目标的分子。
本文使用的术语“肽”或“多肽”定义为氨基酸残基的链,通常具有定义的序列。本文使用的术语“肽”与术语“多肽”、“肽”和“蛋白”互相包括。
术语"变体SH2结构域"、“SH2变体”、“SH2单体”无差别地被用于指为了本发明的亲和性增强而引入取代的亲代SH2结构域。本发明适用于亲代SH2结构域的变体SH2结构域,以及含有位点1和位点15之间区域(该位点如下定义)的亲代SH2结构域片段的变体。在本发明的多个方面,变体SH2结构域在人类的临床或诊断应用中的用途优选的从人SH2结构域作为亲代SH2结构域进行设计,以最小化向体内补充变体SH2结构域所可能导致的免疫应答的可能性。
优先权文件和本申请中引用的所有文件在此全文引入作为参考。
发明综述
本发明总体上涉及SH2结构域变体和获得所述变体的方法。本发明的变体SH2可用于分离含pTyr的分子,例如肽,包括多肽和蛋白,用于检测样品中含pTyr分子的浓度,或仅仅检测样品中是否存在含pTyr的分子。本发明的变体SH2结构域还可用于其它应用,例如治疗、诊断或作为试剂用于研究目的。
SH2结构域变体
申请人发明了SH2变体和增强SH2结构域与含pTyr多肽的结合亲和性的策略。本发明的策略可包括在亲代SH2结构域蛋白序列上生成单一或多个氨基酸残基取代。
取代被应用到SH2结构域上预定义的15个氨基酸位点处。SH2结构域可被用作标准。例如,作为标准,这些位点可在人Fyn SH2结构域氨基酸序列上定义,如图1和图2(a)所示。然而,本领域普通技术人员理解其它SH2结构域可被用作标准,例如Src SH2结构域、GRB2SH2结构域等等。参见图1,15个位点对应于原子结构中围绕着pTyr的15个氨基酸残基。这些位点可连续编号为位点1至位点15(图1A和图2(a))。其它SH2结构域上对应的15个位点可通过蛋白序列比对进行定义。亲代SH2结构域序列上的位点1、2、3、4、9、10、11、12、13、14、和15可从比对中通过参考Fyn SH2结构域作为标准直接鉴定(图2(a))。位点5、6、7和8也可从比对中直接鉴定。在一个实施方式中,位点5、6、7和8可从位点4开始计数来定义(图2(b))。可以使用这种实施方式(例如)以避免图1A中所示的BC环区域中潜在的序列缺口问题。位点5、6、7、和8对应于4个连续残基,位点5的残基位于位点4处残基的C端2个残基。这些位点对应于Eck等定义的SH2结构域序列命名系统(参见图2(c))。
图5列出了15个位点中的氨基酸残基,从中选择1个或多个残基取代以产生变体SH2结构域。在一个实施方式中,本发明的变体SH2可包括1个残基取代。为了亲和性增强,在一个实施方式中,可以优选将位点10的残基取代为小的或疏水的残基,包括丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、或缬氨酸。也可以优选将位点15的残基取代为疏水残基,包括异亮氨酸、亮氨酸、或缬氨酸。
为了亲和性进一步增强,在另一个实施方式中,可以优选在变体SH2结构域中进行两个取代。例如,取代在位点1和2、或1和5、或1和6或1和7和任意两个位点的任意可能的组合,只要其能导致SH2变体具有增强的pTyr结合。在一个实施方式中,可以优选包括在位点10和15取代。也可更优选同时将位点8和15的残基取代为疏水残基。这些取代包括位点8的残基变为苯丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、或缬氨酸,组合位点15的残基变为异亮氨酸、亮氨酸、或缬氨酸。
为了亲和性进一步增强,在另一个实施方式中,可以优选在变体SH2结构域中进行3个取代。例如,取代在位点1、2和5或1、2和6,或1、2和7和任意3个位点的任意可能的组合,只要其能导致SH2变体具有增强的pTyr结合。在一个实施方式中,可特别期望同时进行变体结构域位点8、10、和15上的3个优选取代。本发明还覆盖了15个氨基酸残基中多于3个取代。
在本发明一个实施方式中,蛋白分子可被设计为含有多个SH2结构域,其中至少一个是变体SH2结构域。例如,可设计和产生包含多个SH2结构域的蛋白,其中每个SH2结构域靶向不同的含pTyr的结合位点。变体SH2结构域在多SH2结构域构建体中的应用进一步增加了与含有多个含pTyr结合位点的目标蛋白的结合亲和性。SH2结构域通过柔性接头材料连接,优选含有甘氨酸的多肽。接头长度和组成的变化进一步改变了多-SH2结构域蛋白的结合亲和性。多-SH2结构域蛋白可对多-pTyr区域具有增强的亲和性,例如单一蛋白的ITAM基序。多-SH2结构域蛋白也可用于通过目标蛋白的pTyr位点桥连多个蛋白。在多-SH2结构域蛋白中包含变体SH2结构域可能导致增加的结合或桥连紧密度。
本发明的SH2变体与含pTyr多肽的亲和性可通过优化应用至亲代SH2结构域上的取代组合来很好地进行调节。另外,亲和性增强取代可以与修饰了序列识别特异性的其它取代相组合。因此,变体SH2结构域具有与目标含pTyr序列结合这一特征可调节变化的优点,包括可变的结合亲和性、可变的序列识别特异性、和模块化以前后连接多个结构域。变体SH2结构域可通过在结构域序列中引入非天然氨基酸获得进一步的功能变化。例如,已报道在天然SH2结构域中引入光可交联氨基酸p-三氟甲基-双吖丙啶-l-苯丙氨酸,其有助于质谱检测SH2结构域和目标含pTyr蛋白之间的直接相互作用(Hino等,2011J Mol Biol.Vol.406,pp.343)。在变体SH2结构域的目标结合位点中引入光可交联氨基酸能帮助永久封闭目标含pTyr的结合位点。
本发明的SH2单体可通过本领域已知的任何肽合成方法进行合成,包括固相合成(Merrifield(1964)J.Am.Chem.Assoc.65:2149;J.Amer.Chem.Soc.85:2149(1963);和Int.J.Peptide Protein Res.35:161-214(1990))或在均相溶液中合成(Methods of OrganicChemistry,E.Wansch(编辑)Vol.15,pts.I and II,Thieme,Stuttgart(1987)以产生合成肽。
可选的,本发明的变体SH2结构域可通过使用本领域技术人员已知的重组DNA技术进行制备。编码本发明选择的肽的核酸序列可以已知的方式被引入合适的表达载体(即重组表达载体)。可能的表达载体包括(但不限于)黏粒、质粒或修饰的病毒(例如复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒、慢病毒、疱疹病毒、痘病毒),只要载体与所使用的宿主细胞相容即可。“载体与宿主细胞相容”这种表达定义为预期该表达载体含有本发明的核酸分子(下文描述)和根据用于表达的宿主细胞选择的伴随的调控序列,所述调控序列可操作地连接核酸分子。“可操作地连接”意在表示核酸分子以允许该核酸分子表达的方式连接至调控序列。合适的调控序列可来自多种来源,包括细菌、真菌或病毒基因。(例如,参见Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,SanDiego,Calif.(1990)中描述的调控序列)。合适的调控序列的选择依赖于选择的宿主细胞,其可以容易得被本领域普通技术人员完成。这些调控序列的例子包括如下:转录启动子和增强子、RNA聚合酶结合序列、或核糖体结合序列(包括翻译起始信号)。根据选择的宿主细胞和使用的表达载体,可以在表达载体中引入其它额外的序列(例如复制起点、额外的DNA限制性位点、增强子、和赋予转录可诱导性的序列)。
进一步预期的是本发明涵盖了包含编码至少一个SH2单体的核酸的载体。
本发明的SH2单体可与细胞膜穿透性肽一起提供,例如TAT蛋白转导结构域,或富Arg肽,或其它肽,或脂质体,或纳米颗粒,或任何其它利于SH2单体向细胞或组织递送的载体材料。已显示TAT融合物能穿过细胞膜,且在一些情况下,能穿过血屏障。就此而言,申请人确认了纯化的TAT-SH2结构域(用FITC标记)穿过细胞且在细胞培养中具有2-3天的半衰期(参见图13)。
如本领域技术人员能够理解的是,本发明的变体SH2结构域可标记标签以利于其在多种分析中的检测。这些标签可包括但不限于放射性标记、细胞毒素标记和荧光标记。本发明的SH2单体可与载体一起提供,例如,例如偶联至牛血清白蛋白(BSA)或血兰蛋白。所述肽可以共价或非共价偶联至固相载体,例如金或聚苯乙烯微球、玻片、芯片或微滴板壁。所述肽可直接或间接用标签标记,所述标签选自但不限于生物素、荧光素和酶,例如辣根过氧化物酶。例如,所述变体SH2可用生物素N端序列作为先导,其可利于通过(Tyr或Y的)OD280检测进行肽浓度测定(参见图3)。
本发明还提供了包含能够以有效的量来治疗蛋白酪氨酸激酶相关的失调的变体SH2的药物组合物,和药学上可接受的载体、溶媒或稀释剂。药物组合物可以以用于体内给药的生物相容的形式被给予受试者。本发明的肽可在如上所述的DNA表达载体中提供,其在合适的药物组合物中配制。
本文使用的“适于在体内以生物相容性的形式给予”这一表述意味着待给予的物质的一种形式,其中治疗效果超越了任何的毒性效应。治疗活性量、或“有效量”的本发明药物组合物的给药被定义为剂量有效且在一段时间内需要达到期望结果的量。治疗有效量的物质可根据例如受试者疾病状态/健康、年龄、性别和体重,以及具体多肽、其编码核酸或引起期望应答的重组病毒的内在能力等因素进行改变。可调整剂量方案以提供最优的治疗应答。例如,每天或在定周期时段可给予几次分开的剂量,和/或可根据治疗情况的紧急状态的提示按比例减少剂量。给予变体SH2的剂量将依赖于给药途径、给药时间和随着个体受试者的应答进行改变。
变体SH2可通过任何合适的方式给药,例如口服,例如以片剂、胶囊、颗粒或粉剂的形式;舌下给药;含服给药;肠道外给药,例如通过皮下、静脉、肌肉内、腹膜内或胸骨内注射或以输液技术(例如作为无菌可注射水溶液或非水溶液或悬浮液);鼻腔给药例如通过吸入气雾剂;外用给药,例如以霜剂或膏剂的形式;或直肠给药,例如以栓剂的形式;以含非毒性的、药学上可接受的溶媒或稀释剂的剂量单位剂型给药。本变体SH2可以,例如,以适于即释或缓释的形式给药。即释或缓释可通过使用包含本化合物的合适的药物组合物来获得,或者,特别是在缓释的情况下,通过使用例如皮下植入或渗透泵等装置来获得。本化合物还可通过脂质体给药。
本文描述的组合物可通过本身已知的用于制备能对受试者给药的药学可接受的组合物的方法进行制备,从而有效量的活性物质(即SH2变体肽)在混合物中与药学上可接受的溶媒进行组合。合适的溶媒描述于,例如,“Handbook of Pharmaceutical Additives”(Michael和Irene Ash编辑,Gower Publishing Limited,Aldershot,England(1995))。在此基础上,所述组合物包括(虽然不是排他性的)物质的溶液联合一种或多种药学上可接受的溶媒或稀释剂,且可被包含在具有合适的pH和/或与生理溶液等渗的缓冲溶液中。在这一点上,可参考美国专利号5,843,456。
药学上可接受的载体是本领域技术人员熟知的,包括例如无菌生理盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、芝麻油和水。其它载体可以是例如MHC II类分子。可溶性MHC II类分子包括单体、二聚体、三聚体、四聚体等,瓜氨酸肽/MHC II类复合物可通过美国专利号5,869,270(其公开内容在此引入作为参考)中公开的方法进行制备。
此外,根据本发明的药物组合物可包含一种或多种稳定剂,例如碳水化合物,包括山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖和葡萄糖;蛋白质,例如白蛋白或酪蛋白;和缓冲液,如碱性磷酸盐。
本发明的组合物可含有如下所述的其他治疗剂,且可通过例如采用传统的固体或液体溶媒或稀释剂以及适于期望的给药方式的药学添加剂(例如,赋形剂、结合剂、防腐剂、稳定剂、香味剂等)根据例如药物制剂领域熟知的技术进行配制。
本发明的变体SH2可单独使用或彼此组合和/或组合其它可用于治疗蛋白酪氨酸激酶相关的失调的合适的治疗剂,例如除本发明以外的PTK抑制剂、抗炎剂、抗增殖剂、化疗剂、免疫抑制剂、抗癌剂和细胞毒性剂。
示例性的这些其它治疗剂包括下述:环孢菌素(例如,环孢菌素A),CTLA4-Ig,抗体,例如抗-ICAM-3、抗-IL-2受体(抗-Tac)、抗-CD45RB、抗-CD2、抗-CD3(OKT-3)、抗-CD4、抗-CD80、抗-CD86,单克隆抗体OKT3,阻断CD40和gp39相互作用的试剂,例如CD40和/或gp39(即,CD154)特异性抗体,从CD40和gp39(CD40Ig和CD8gp39)构建的融合蛋白,抑制剂,例如NF-κB功能的核转位抑制剂,例如脱氧精胍菌素(DSG),非甾体抗炎药(NSAIDs)例如布洛芬,甾体例如强的松或地塞米松,金制剂,抗增殖剂例如氨甲喋呤、FK506(他克莫司,Prograf)、霉酚酸酯,细胞毒性药物例如咪唑硫嘌呤和环磷酰胺,TNF-oc抑制剂例如替尼达普,抗-TNF抗体或可溶性TNF受体例如益赛普(Enbrel)、雷帕霉素(西罗莫司或雷帕鸣)、来氟米特(Arava),和环氧合酶-2(COX-2)抑制剂例如塞来昔布(Celebrex)和罗非考昔(Vioxx),或其衍生物,和PTK抑制剂。
治疗用途
本发明的变体SH2抑制蛋白酪氨酸激酶的作用,特别是Src-家族激酶例如Lck、Fyn、Lyn、Src、Yes、Hck、Fgr和Blk的作用,因此可以用于蛋白酪氨酸激酶相关失调(例如免疫学的和肿瘤学的失调)的治疗,包括预防和治疗。本发明的变体SH2结构域还抑制受体酪氨酸激酶的作用,包括EGFR,因此可以用于增殖性失调的治疗,例如牛皮癣和癌症。这些变体SH2抑制EGFR和其它受体激酶的能力还可以允许其作为抗血管生成剂治疗例如癌症和糖尿病视网膜病变等失调的用途。"蛋白酪氨酸激酶相关的失调"是由于异常酪氨酸激酶活性导致的失调,和/或其被对一种或多种这些酶的抑制所减轻。例如,Lck抑制剂在治疗多种这类失调(例如,治疗自身免疫病)中很有价值,因为Lck抑制阻断了T细胞活化。T细胞介导的疾病的治疗,包括抑制T细胞的活化和增殖,是本发明的一个特别优选的实施方式。选择性阻断T细胞活化和增殖的化合物可以是优选的。通过氧化压力阻断内皮细胞PTK从而限制诱导中性粒细胞结合的粘附分子的表面表达、以及抑制中性粒细胞活化所必须的PTK的本发明的化合物可用于例如治疗局部缺血和再灌注损伤。
从而,本发明提供了治疗蛋白酪氨酸激酶相关的失调的方法,包括对需要其的受试者给予对其有效量的变体SH2。在本方法中可以与发明的化合物一起应用其它治疗剂,例如如下描述的那些。在本发明的方法中,这些其它治疗剂可在本发明的化合物给药之前、同时或之后给药。在本发明的实施方式中,变体SH2可作为与膜穿透性肽例如TAT蛋白转导结构域的融合产物提供。变体SH2也可以在允许跨膜运输的载体中进行提供。
本发明的变体SH2在治疗蛋白酪氨酸激酶相关的失调中的用途通过治疗一系列失调进行例示(但不限于此),例如:移植排斥(如器官移植,急性移植或异种或同种移植(如被用在烧伤治疗中));保护不产生如器官移植期间产生的缺血或再灌注损伤,心肌梗死、中风或其他原因造成的缺血或再灌注损伤;移植免疫耐受诱导;关节炎(如类风湿关节炎、银屑病关节炎或骨关节炎);多发性硬化症;慢性阻塞性肺疾病(COPD),如肺气肿;炎症性肠病,包括溃疡性结肠炎和克罗恩病;狼疮(系统性红斑狼疮);移植物抗宿主病;T-细胞介导的过敏性疾病,包括接触性超敏反应、迟发型超敏反应、和麸质敏感性肠病(乳糜泻);牛皮癣;接触性皮炎(包括由毒藤导致的);桥本氏甲状腺炎;干燥综合征;自身免疫性甲状腺功能亢进症,如Graves病;阿狄森氏病(肾上腺的自身免疫病);自身免疫性多腺体疾病(也称为自身免疫性多腺体综合征);自身免疫性脱发;恶性贫血;白癜风;自身免疫性垂体机能减退;格林-巴利综合征;其他自身免疫性疾病;癌症,包括Lck或其它Src家族激酶如Src蛋白被激活或过度表达的癌症,例如结肠癌和胸腺瘤,和Src家族激酶活性促进肿瘤生长或存活的癌症;肾小球肾炎;血清病;荨麻疹;过敏性疾病如呼吸道过敏(哮喘、枯草热、过敏性鼻炎)或皮肤过敏;硬皮病;蕈样肉芽肿;急性炎症反应(如急性呼吸窘迫综合征和局部缺血/再灌注损伤);皮肌炎;斑秃;慢性光化性皮炎;湿疹;白塞氏病;掌跖脓疱病;坏疽性脓皮病;塞扎里氏综合征;特应性皮炎;全身性硬化;和硬斑病。本发明还提供了一种通过给药任何能够抑制蛋白酪氨酸激酶的化合物以用于治疗前述失调例如特应性皮炎的方法。
Lck之外的Src-家族激酶,例如Hck和Fgr,在单核细胞和巨噬细胞Fcγ受体应答中非常重要。本发明的变体SH2结构域抑制不表达Lck的单核细胞系THP-1中Fcγ依赖的TNFα生产。抑制Fcγ受体依赖的单核细胞和巨噬细胞应答的能力导致本化合物除其对T细胞作用之外的额外抗炎症活性。该活性在例如治疗炎性疾病如关节炎或炎性肠病中特别有价值。
特别的,本SH2单体可在治疗自体免疫肾小球肾炎和由免疫复合物在肾脏中的沉积(其诱发导致肾脏损伤的Fcγ受体应答)所导致的肾小球肾炎的其它情况中是有价值的。
另外,Lck之外的Src-家族激酶,例如Lyn和Src,在Fcε受体诱导的肥大细胞和嗜碱粒细胞脱粒中非常重要,后者在哮喘、过敏性鼻炎和其它过敏性疾病中起重要作用。Fcε受体受到IgE抗原复合物刺激。本发明的变体SH2抑制Fcε诱导的脱粒应答,包括在不表达Lck的嗜碱粒细胞系RBL中。抑制Fcε受体依赖的肥大细胞和嗜碱粒细胞应答的能力导致本化合物除其对T细胞作用之外的额外抗炎症活性。特别的,本化合物在治疗哮喘、过敏性鼻炎和其它过敏性疾病的情况中是有价值的。
本变体SH2对于单核细胞、巨噬细胞、T细胞等的组合活性可在治疗前述任意失调中是有价值的。
由于其抑制EGFRs的能力,本发明的变体SH2也可被用于治疗增殖腺疾病,包括牛皮癣和癌症。已显示在很多实体瘤,包括非小细胞肺癌、结肠直肠癌和乳腺癌中HER1受体激酶表达和活化。类似的,已显示在乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胃癌中HER2受体激酶过表达。下调HER2受体丰度或抑制HER1受体的信号的单克隆抗体在临床前和临床研究中已表现出抗肿瘤效果。因此期望HER1和HER2激酶抑制剂将在治疗依赖来自两种受体的任一种的信号的肿瘤方面具有效果。这些化合物可预期作为单一试剂或组合其它化疗剂例如紫杉醇(Taxol)、盐酸多柔比星(阿霉素)、和顺铂(Platinol)时都会具有效果。参见下述文件和其中引用的参考文件:Cobleigh,M.A.,Vogel,C.L.,Tripathy,D.,Robert,N.J.,Scholl,S.,Fehrenbacher,L.,Wolter,J.M.,Paton,V.,Shak,S.,Lieberman,G.,和Slamon,D.J.,"Multinational study of the efficacy and safety of humanized anti-HER2monoclonal antibody inwomen who have HER2-overexpressing metastatic breast cancer that has progressed afterchemotherapy for metastatic disease",J.of Clin.Oncol.17(9),p.2639-2648(1999);Baselga,J.,Pister,D.,Cooper,M.R.,Cohen,R.,Burtness,B.,Bos,M.,D'Andrea,G.,Seidman,A.,Norton,L.,Gunnett,K.,Falcey,J.,Anderson,V.,Waksal,H.,和Mendelsohn,J.,"Phase I studies of anti-epidermal growth factor receptor chimeric antibody C225alone and incombination with cisplatin",J.Clin.Oncol.18(4),p.904-914(2000)。
当与本发明化合物联合使用时,上述其它治疗剂(其并非穷举)可以例如Physicians'Desk Reference(PDR)中所示的那些数量或否则按照本领域普通技术人员的判断进行使用。
诊断
根据本发明的另一实施方式,提供了一种用于诊断受试者中蛋白酪氨酸激酶相关失调的方法。
在一个实施方式中,受试者的样品可接触本发明的SH2变体以检测样品中磷酸化的蛋白。样品中磷酸化蛋白数量相对于正常对照样品中磷酸化蛋白数量的增加可指示蛋白激酶相关的失调。
组织样品可包括组织裂解物、血液和其它体液。可通过使用本发明的SH2变体测试组织样品的激酶活性以检测组织样品中磷酸化的蛋白。也可通过使用荧光标记的SH2变体以在组织切片上造影磷酸化的蛋白;使用基于ELISA的SH2变体组合目标蛋白特异性抗体以分析其在正常和疾病组织(或细胞)中的磷酸化等来测试组织的组织学(histology)。
另一应用是体内造影。用造影标签标记的SH2变体被用于肿瘤、PET、MRI等的体内造影。以异常激酶活化为特征的癌组织可表现出相对于正常组织而言增强的蛋白磷酸化,其可使用基于SH2变体的造影工具进行检测和造影。
另一实施方式可包括基于Bruce Mayer(美国专利7,846,746)的方法的SH2谱(profiling),以比较正常和疾病细胞裂解物的结合谱。又一实施方式可包括对癌症患者注射放射标记的和可以是TAT标记的变体SH2结构域,以检测SH2在患者体内的肿瘤位置的累积。
为了检测样品中的SH2变体,本发明的变体SH2结构域可优选的用探针分子标记。
pTyr阳性细胞的检测可通过探针进行。探针可至少包括一个包含SH2变体的肽和一个造影组分。可选的,该探针可用可检测标记物进行标记,其可允许检测pTyr阳性细胞的位置。本发明的探针可允许跟随pTyr阳性细胞的移动和发展。
制备探针的方法是本领域技术人员熟知的(参见,例如Sambrook等,MolecularCloning:A Laboratory Manual(第二版),Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,(1989)或Current Protocols in Molecular Biology,F.Ausubel等编辑,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York(1987)),其在此引入作为参考。
探针的造影组分一般可包含标签。标记的方法是本领域技术人员熟知的。优选的标签可以是适于体内造影使用的那些。SH2单体探针可在检测前进行可检测的标记。可选的,可以使用可结合杂交产物的可检测标签。这些可检测标签可包括但不限于具有可检测的物理或化学性质且在免疫分析领域已经良好开发的任何材料。用于本发明的标签可以是通过显微镜、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可检测的任何组合物。
可用于本发明的标签包括基于生物素的标签、磁性标签(例如DYNABEADSTM)、放射性标签(例如3H、35S、32P、51Cr、或125I)、荧光标签(例如荧光素、罗丹明、德克萨斯红等)、高电子密度试剂(例如金)、酶类(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、或其它通常用于ELISA的酶)、地高辛、或可获得抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白(例如本发明的肽可通过例如在肽中引入放射标记而变得可检测,并使用其检测与肽的抗体特异性反应)。本发明的变体SH2可与载体一起提供,例如,如偶联至牛血清白蛋白(BSA)或血兰蛋白。变体SH2可以共价或非共价偶联至固相载体,例如金或聚苯乙烯微球、玻片、芯片或微滴板壁。所述变体SH2可直接或间接用标签标记,所述标签选自但不限于生物素、荧光素和酶,例如辣根过氧化物酶。
对于本发明而言具体使用的标签并不重要,只要其不干扰SH2变体与pTyr的亲和性即可。然而,在一个实施方式中,造影组分可以是放射性核素(例如18F、11C、13N、64Cu、68Ga、123I、111In、99mTc等),因为容易使用诸如SPECT、CT和PET等造影技术进行体内检测SH2变体-pTyr复合物和肿瘤细胞。也可根据放射性核素是否通过发生器或回旋加速器产生或是否为螯合物或有机/卤化物来判断在SPECT或PET造影中使用的试剂的合适的造影组分的决定。
本文使用的直接标记的探针可以是其上连接可检测标记的探针。因为直接标记已经连接到探针上,因此可以不需要随后的步骤来将探针与可检测标签连接。相反,间接标记的探针可以是负载有随后连接(一般在SH2变体肽连接目标pTyr之后)的可检测标签的部分的探针。
在另一个实施方式中,还可以制备和使用识别本发明的任何变体SH2的单克隆抗体(mab)以检测样品中是否存在变体SH2。Mab可提供一种快速和简单的检测本发明组合物的质量的方法。一般而言,用于制备抗体的方法是熟知的。例如,产生特异性识别本发明的变体SH2的mab的方法对本领域技术人员而言是熟知的。一般,用肽在弗氏佐剂中注射小鼠。在三周中注射9次后,移除小鼠脾脏并将其重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。脾细胞可作为淋巴细胞来源,一些淋巴细胞可能产生具有合适特异性的抗体。然后可将这些细胞与永生骨髓瘤伴侣细胞融合,融合产物可在选择性试剂(例如HAT)的存在下被涂布于多个组织培养孔中。然后可以筛选这些孔以通过ELISA鉴定那些含有能产生有用抗体的细胞的孔。然后可以重新涂布这些孔。在生长一段时间后,可以再次筛选这些孔来鉴定产生抗体的细胞。可以进行几个克隆流程直至超过90%的孔含有抗体生产阳性的单克隆。从该流程中可建立产生mab的稳定的克隆系。然后可以使用蛋白A或蛋白G琼脂糖通过亲和色谱法纯化mab(还参见,美国专利号4,609,893;4,713,325;4,714,681;4,716,111;4,716,117;和4,720,459)。
研究
在一个实施方式中,本发明的变体SH2结构域可被用作试剂。在特别的实施方式中,变体SH2结构域或编码变体SH2结构域的基因可被引入哺乳动物细胞系。对目标pTyr位点表现出超高亲和性的变体SH2结构域(Kd值小于约10nM)可能发生作用遮盖目标pTyr位点并可能对pTyr位点下游的PTK信号事件导致严重的阻断效果。因此,该变体SH2结构域可作为细胞PTK信号途径的抑制性试剂。来自不同的天然SH2结构域的超高亲和性变体SH2结构域表现出不同的序列识别特异性。因此,当导入活细胞中时,超高亲和性变体SH2结构域可能阻断特定的信号途径,且可被用作考察特定途径生理学的试剂。
具有对pTyr超高亲和性的本发明的SH2变体可被用作抗-pTyr抗体的替代品,且可被用于使用抗-pTyr抗体的研究领域,例如,如蛋白质印迹、IF、蛋白质组学(磷酸蛋白/肽的富集),等等。
在一个实施方式中,可以根据本发明产生表现出中度增强的亲和性的变体SH2结构域(比野生型表现出增强亲和性的变体,但优选对目标pTyr位点具有大于约10nM的Kd值)。这些变体SH2结构域不具有完全阻断pTyr位点及其下游信号的能力,但是他们可以保留被进行氨基酸取代的亲代SH2结构域的内在序列识别特异性。因此,这些变体SH2结构域可在细胞中被用作特定酪氨酸磷酸化事件的示踪剂。为了在细胞中检测示踪剂SH2结构域,可以优选对SH2结构域标记探针分子,如上所述。
含pTyr的目标的纯化、存在和浓缩
本发明的另一个实施方式包括使用本发明的变体SH2多肽作为配体用于对样品中具有pTyr的分子目标进行分离、纯化、检测存在和/或测定浓度。在一个实施方式中,一种用于对样品中具有pTyr的分子目标进行检测存在和/或测定浓度的方法可包括:(a)使样品接触本发明的变体SH2肽(“SH2配体”),从而如果样品中存在目标则形成目标/SH2配体复合物;和(b)通过检测形成的目标/SH2配体复合物的量测定样品中含pTyr的目标的浓度。
在另一个实施方式中,本发明提供了一种用于在样品中分离含pTyr的目标的方法。该方法可包括:(a)使样品接触本发明的SH2配体,从而如果样品中存在目标则形成含pTyr的目标/SH2配体复合物;和(b)从复合物中释放含pTyr的目标,从而分离该含pTyr的目标。然后可通过检测含pTyr的目标的释放量来测定样品中目标的浓度。
在多个方面,可将SH2配体固定在树脂上,例如亲和性柱上,可能包括液体例如体液和提取物的样品可以流过该树脂。在多个方面,可使用不含目标的溶液洗涤树脂。可以通过添加能去除SH2配体与目标结合的能力的溶剂释放结合至SH2配体的含pTyr的目标,从而产生洗脱组分。可通过任何合适的方法测定洗脱组分中存在的目标的存在和/或浓度,例如,如,荧光法、高效液相色谱法,等等。该方法也可用于从样品分离含pTyr的目标。也可将SH2配体结合到侧流试纸条上。
含pTyr的分子(例如肽,包括多肽和蛋白)的存在或浓度可通过高效液相色谱(HPLC)测定。SH2配体可结合至亲和柱或侧流试纸条。
在本发明的一个实施方式中,变体SH2可被用于鉴定具有比对照增强的蛋白磷酸化的细胞的方法。这样一种方法可包括使用一种或多种变体SH2检测样品中pTyr阳性细胞的存在。
优点
本发明的优点包括:
(1)不像抗-pTyr抗体,本发明的变体SH2肽是相对抗体具有更小尺寸(~12kDa)的单一多肽,其适于作为分子药物或试剂,并具有在活细胞中起作用的能力,正如在细胞质中起作用的SH2结构域一样。另外,不像pTyr特异性抗体,本发明的变体SH2肽装备有序列识别特异性,因此它能够检测唯一特异性的含pTyr的分子作为介入目标。
(2)使用本发明的SH2结构域的另一个优点包括容易生产和修饰该结构域。SH2结构域含有~100个氨基酸残基,适于在标准表达系统中进行重组蛋白生产,包括细菌、酵母和哺乳动物细胞。特别的,120个人SH2结构域中约三分之二被报道在大肠杆菌(Escherichia coli)中以重组形式生产(Huang等,2008,Mol Cell Proteomics,Vol.7,pp.768;Machida等,2007,Mol Cell,Vol.26,pp.899)。Virdee等报道了通过缀合多个多肽片段合成SH2结构域并引入非天然氨基酸(Virdee等,Chemistry&Biology,2010,Vol.17,pp.274)。无细胞表达系统也已被用于生产SH2结构域(He和Taussig,2007,Biochem SocTrans,Vol.35,pp.962;Scott等,2004,J Biomol NMR,Vol.30,pp.463)。本文所提出的氨基酸取代能完全相容地成为现存SH2结构域生产技术的一部分,包括上述的那些技术。
以上公开内容大概描述了本发明。可参考下述具体实施例获得更全面的了解。描述这些实施例仅用于阐释,不意味着限制本发明的范围。按照条件可能建议的或作为权宜之用也预期了形式的变化和等效物替换。虽然本文使用了具体的术语,但是这些术语被用作描述性的含义,而非用于限制。
实施例
为说明目的,描述了实施例,其不意味着限制本发明的范围。
实施例1–通过噬菌体展示技术鉴定变体SH2结构域
人Fyn SH2结构域上15个位点的氨基酸残基被随机替换为20种天然氨基酸之一,来鉴定结合含pTyr肽的变体SH2结构域。人Fyn SH2结构域所有氨基酸残基数根据UniProt数据库条目(entry)FYN_人的全长同种型。将编码Ala139和Gly249之间(其氨基酸序列见SEQ ID NO:1)的野生型Fyn SH2结构域的基因亚克隆入pDEST15载体(InvitrogenCanada Inc.)。通过QuikChange II定点突变试剂盒(Qiagen Inc.)将SEQ ID NO:1中的三个半胱氨酸残基替换为丝氨酸残基。该突变产生了SEQ ID NO:2所示的基因。SEQ ID NO:2中所示的基因编码SEQ ID NO:3所示的蛋白序列。SEQ ID NO:3包括野生型人Fyn SH2结构域在Ala139和Leu238之间的片段,随后是多肽序列SSRLVVPSHKG(SEQ ID NO:25),其中三个丝氨酸残基被替换为SEQ ID NO:1中存在的三个半胱氨酸残基。将SEQ IDNO:2所示基因融合至编码M13噬菌体主外壳蛋白的基因。用Kunkel方法在如下详述的预定义的15个氨基酸位点上进行同时随机化(Sidhu等,2000,Method Enzymol.Vol.328,pp.333)。这些15个位点对应于野生型全长人Fyn SH2的残基Arg156(位点1)、Lys157(位点2)、Ala159(位点3)、Arg176(位点4)、Ser178(位点5)、Glu179(位点6)、Thr180(位点7)、Thr181(位点8)、Ala184(位点9)、Ser186(位点10)、Leu187(位点11)、Ser188(位点12)、Lys201(位点13)、His202(位点14)、和Lys204(位点15)(图2a)。在SEQID NO:1中,这15个位点如下:Arg18(位点1)、Lys19(位点2)、Ala21(位点3)、Arg38(位点4)、Ser40(位点5)、Glu41(位点6)、Thr42(位点7)、Thr43(位点8)、Ala46(位点9)、Ser48(位点10)、Leu49(位点11)、Ser50(位点12)、Lys63(位点13)、His64(位点14)、和Lys66(位点15)。突变产生了Fyn SH2结构域库,其在15个位点上含有随机取代的氨基酸残基。使用了噬菌体展示方法来在M13噬菌体表面上展示这些引入取代的Fyn SH2结构域。针对图3所列举的33种固定化的含pTyr的合成肽进行噬菌体筛选。每种肽在TentaGel酰胺树脂(INTAVIS Inc.)上合成,并用生物素进行N端标记。结合至少一个这些肽的噬菌体继续进行DNA测序,以鉴定结合至肽的变体SH2结构域的序列。相应的,鉴定了63种变体Fyn SH2结构域。每种变体SH2结构域中15个位点的残基列于图4。在每种变体中,至少一个位点含有对野生型残基的氨基酸取代,其在图4中用阴影黑色显示。没有一种变体SH2结构域与具有SEQ ID NO:3的野生型SH2结构域相同。这表明所有的变体SH2结构域都获得了与野生型SH2结构域相比对结合含pTyr肽更有利的序列组成。在变体SH2结构域中观察到的取代一起列于图5。因此,我们鉴定了氨基酸取代,应用于SH2结构域,其增强了与含pTyr多肽的结合。
实施例2–变体Fyn SH2结构域与含pTyr肽在体外的增强结合
对野生型Fyn SH2结构域引入单一或多个取代并测定了由这些取代的引入而产生的亲和性增强程度。SEQ ID NO:2的基因在N端融合编码6-组氨酸标签的基因,其产生了表达SEQID NO:4的构建体,后者包括一个6-组氨酸标签,对应Ala139和Leu238之间区域的野生型Fyn SH2结构域,并继之以序列SSRLVVPSHKGAAA(SEQ ID NO:26)的多肽。使用该野生型构建体作为模板,通过定点突变方法构建了13个变体Fyn SH2结构域。在以下的描述中,使用位点编号具体指明被取代的残基。例如,T8V表示对野生型构建体进行位点8的Thr取代为Val。在另一实施例中,T8V/S10A/K15L表示组合的3个取代,对野生型构建体进行位点8的Thr取代为Val,位点10的Ser取代为Ala,和位点15的Lys取代为Leu。将13个变体SH2结构域的位点1和位点15间的氨基酸序列列在序列表部分。通过对野生型构建体(SEQ ID NO:4)进行取代,构建了以下变体Fyn SH2结构域:T8V(SEQ IDNO:5)、S10V(SEQ ID NO:6)、ΔT8/S10A/K15L(SEQ ID NO:7)、S10A(SEQ ID NO:8)、K15L(SEQ ID NO:9)、S10V/K15L(SEQ ID NO:10)、K2E/T8V/S10A/K15I(SEQ IDNO:11)、T7S/S10A/K15L(SEQ ID NO:12)、S10A/K15L(SEQ ID NO:13)、T8V/S10A/K15I(SEQ ID NO:14)、T8V/K15L(SEQ ID NO:15)、T8I/S10A/K15L(SEQ ID NO:16)、和T8V/S10A/K15L(SEQ ID NO:17)。ΔT8表示位点8的Thr缺失。
合成了含有pTyr的一系列肽和不含pTyr的一个肽进行结合分析(图6)。每种肽都在TentaGel酰胺树脂(INTAVIS Inc.)上合成,并使用NHS-荧光素(Thermo FisherScientific)进行N端荧光标记。通过在LB培养基(EMD Chemicals)中培养大肠杆菌BL21(DE3)菌株过表达来生产13个变体的每一种和野生型SH2结构域。通过0.3mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,细胞培养物在37℃下培育5小时。在含20mM磷酸钠、0.1M NaCl、20mM咪唑、1mg/ml溶菌酶和1%Triton-X 100,调节pH 7.8的缓冲溶液中,离心收集细胞,并在冰上破碎。用Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen Inc.)按照制造商的说明进行亲和纯化。纯化的材料用磷酸盐缓冲盐水(PBS),pH 7.4在4℃下透析过夜。通过在保持肽浓度恒定的情况下滴定SH2结构域浓度进行荧光偏振检测。用GraphPad Prism软件通过假设单一位点结合模型(GraphPad Software)计算Kd值。
测定的14个SH2结构域(包括野生型)和7个肽之间相互作用的Kd值列于图7(a)。亲和性增强的增加倍数被计算为Kd[野生型]除以Kd[变体],并列于图7(b)。与范围在10-5M和10-7M量级(亚微摩尔亲和性)的野生型Kd值相比,T8V/S10A/K15L变体SH2结构域与相同系列的7个肽的Kd值的范围在10-7M和10-9M(纳摩尔亲和性)量级(图7(a))。平均而言,这对应于293倍的亲和性增加(图7(b))。特别的,与EGFR-pY978肽的结合表现出超过1000倍的亲和性增加。发明人还比较了野生型和T8V/S10A/K15L变体SH2结构域与含pTyr的短肽——GGpYGG肽(SEQ ID NO:23)的结合。对该肽的亲和性从67μM的Kd值(图8(a))增加至0.82μM(图8(b))。然而,非磷酸化的肽——GGYGG肽(SEQ ID NO:24)对同一变体SH2结构域未表现出可检测的结合(图8(c))。这表明3个取代的组合,即T8V、S10A和K15L,有助于增强受试肽中与含pTyr氨基酸的结合。因此,发明人创造了呈现含pTyr肽亲和性显著增强的变体SH2结构域。
除了上述变体SH2结构域,12种其它的变体SH2结构域也对7种肽表现出增强的亲和性。这些变体SH2结构域的每一种都含有选自图5中出现的氨基酸取代列表的每个不同的多个取代。结果显示不同取代导致不同的亲和性增强程度。平均而言,增强的效果范围为1.4倍(T8V变体)至86.4倍(T8I/S10A/K15L变体)的增加(图7(b))。因此,发明人获得了一组能产生与含pTyr肽亲和性梯度变化增强的变体SH2结构域。
实施例3–通过对Src SH2结构域引入取代而观察到亲和性增强
在本部分,发明人阐释了在人Fyn SH2结构域上建立的取代在另一个上同样起到亲和性增强的作用。
编码人Src SH2结构域Asp144和Lys252(其残基编号按照UniProt条目SRC_人)之间的基因被亚克隆至载体pETM-11(Dümmler等,2005,Microb Cell Fact.,Vol.4,pp.34)中。得到的构建体编码SEQ ID NO:18的蛋白,其包含N端6-组氨酸亲和标签、烟草蚀纹病毒蛋白酶切割位点、和Src SH2结构域。接下来,使用程序PROMALS3D(Pei等人,2008,Nucleic Acids Research,Vol.36,pp.W30)产生了包括人Fyn和Src SH2结构域序列的序列对齐(图2a)。基于对齐的在Fyn SH2结构域上定义的位点在野生型Src SH2结构域序列上鉴定了15个位点。例如,在Src SH2结构域序列中,Thr183对应于位点8,Cys188对应于位点10,Lys206对应于位点15。通过定点突变产生了3个变体Src SH2结构域的表达构建体。3个变体Src SH2结构域各自位点8和位点15之间区域的多肽序列列于序列表中,其中SEQ ID NO:19对应于K15L变体SH2结构域,SEQ ID NO:20对应于T8V/C10变体SH2结构域,SEQ ID NO:21对应于T8V/C10A/K15L变体SH2结构域。位点8的残基取代为Val、位点10的残基取代为Ala、和位点15的残基取代为Leu这3个氨基酸残基取代源于有利取代的列表,其最初是从Fyn SH2结构域噬菌体展示实验中阐述的(图5)。
在LB培养基中生长大肠杆菌BL21(DE3)菌株,通过用0.3mM IPTG诱导蛋白表达,和将细胞培养物在37℃下培育6小时来表达野生型和变体Src SH2结构域。在含20mM磷酸钠、0.1M NaCl、20mM咪唑、1mg/ml溶菌酶和1%Triton-X 100,调节pH 7.8的缓冲溶液中,离心收集细胞,并在冰上破碎。用Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen Inc.)按照制造商的说明进行亲和纯化。从树脂上洗脱的材料用含有20mM Tris-HCl,pH 7.0,1mM二硫苏糖醇(DTT),0.5mM乙二胺四乙酸(EDTA),和50mM NaCl的缓冲溶液在4℃下透析过夜。每个透析样品补充烟草蚀纹病毒蛋白酶(Tropea等,2009,Methods Mol Biol.Vol.498,pp.297)以裂解6组氨酸标签,并在室温下培育过夜。进一步用Superdex75体积排阻柱(GE Healthcare)用含有20mM Tris-HCl,pH 7.0,1mM DTT,和150mM NaCl的缓冲溶液纯化样品。
进行荧光偏振分析测定野生型或变体Src SH2结构域和7个荧光素标记的含pTyr肽之间相互作用的Kd值(图9a)。计算了Kd值的增加倍数并列于图9b。所有3种变体SH2结构域表现出亲和性比野生型SH2结构域增加。T8V/C10A/K15L变体Src SH2结构域结合3种肽,即EGFR-pY978、MidT-pY324和ShcA-pY239肽,其Kd值的量级为10-9M(纳摩尔亲和性)。该变体Src SH2结构域表现出从野生型SH2结构域平均238倍的亲和性增加。这个亲和性增加的量与T8V/S10A/K15L变体Fyn SH2结构域显示的293倍亲和性增加相似(图7(b))。此外,T8V/C10A/K15L变体Src SH2结构域表现出以0.51μM的Kd值结合GGpYGG肽(SEQ ID NO:23),这显示了比野生型Src SH2结构域与肽结合更高的亲和性(图10)。因此,位点8的残基取代为Val、位点10的残基取代为Ala、和位点15的残基取代为Leu这3个取代的组合用于不同的SH2结构域导致了相似的含pTyr肽亲和性增强的显著效果。
实施例4–在哺乳动物细胞中变体SH2结构域与EGFR的结合和对下游信号的抑制表皮生长因子(EGF)的结合诱导了一种受体酪氨酸激酶——EGF受体(EGFR)的二聚化,和在C端尾部多个酪氨酸残基的反式自磷酸化。这些含pTyr的位点召集(recruit)含有SH2结构域的下游蛋白,包括Grb2。EGFR表达或活性的失调与多种上皮性癌症有关。当在EGFR下游被激活后,MAP激酶途径(Ras–Raf–MEK–Erk蛋白信号)导致细胞增殖;然而,当过度活化时,其导致细胞转化或侵袭性表现(Kim&Choi,(2010)Biochimica etbiophysica acta,Vol.1802,pp.396)。在此,我们进一步阐述了在Fyn SH2结构域上定义的取代在其它SH2结构域上的亲和性增强中起作用。另外,当在哺乳动物细胞中表达时,从不同的亲代SH2结构域产生的变体SH2结构域表现出与EGFR增强的结合。此外,在哺乳动物细胞中表达的变体SH2结构域抑制EGFR下游细胞信号事件。
使用XhoI和BamHI限制性位点将编码人Grb2的Met55和Pro158之间(其中残基编号按照UniProt条目GRB2_人)多肽的基因亚克隆入pEGFPC2载体。将Grb2的氨基酸序列与Fyn序列对齐以鉴定Grb2序列上的位点(图2(a))。相应的,位点8、10和15的氨基酸残基分别被鉴定为Ala91、Ser96和Lys109。在3个位点的这些残基使用定点突变方法分别取代为Val、Ala和Leu,以产生A8V/S10A/K15L变体Grb2SH2结构域构建体,其序列包含Met55和Pro158之间区域并具有A8V、S10A和K15L取代,见于SEQ ID NO:22。
使用XhoI和BamHI限制性位点分别将编码野生型Fyn SH2结构域、野生型Src SH2结构域、野生型Grb2SH2结构域、T8V/S10A/K15L变体Fyn SH2结构域、T8V/C10A/K15L变体Src SH2结构域、和A8V/S10A/K15L变体Grb2SH2结构域的基因亚克隆入pEGFPC2载体(Clontech)。
在以下描述以及图11和图12中,上一句中提及的变体SH2结构域被称为8V/10A/15L取代的SH2结构域,或TrM SH2结构域。亚克隆入pEGFPC2载体的野生型(Wt)和TrM SH2结构域在HEK 293细胞中作为GFP-融合蛋白表达。在本部分和之后的部分中使用的方法如下所述。
抗-GFP兔多克隆抗体购自Sigma-Aldrich。抗-EGFR兔多克隆抗体购自Millipore。抗-p44/42MAPK(Erk1/2)小鼠单克隆抗体和抗-磷酸-p44/42MAPK(Thr202/Tyr204)小鼠单克隆抗体购自Cell Signaling。HEK 293细胞在补充10%胎牛血清(FBS,SAFCBiosciences)、50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素(GIBCO Invitrogen Corp.)的Dulbecco’s修饰的Eagle’s培养基(DMEM,Sigma-Aldrich),在空气中含5%CO2的潮湿环境的37℃下生长。在指定的时间点向培养基添加终浓度100ng/ml的EGF(Invitrogen)。用jet-PEI(PolyPlus-Transfection;Illkirch,France)按照制造商的说明进行瞬时转染。
用亚克隆在pEGFPC2载体中的SH2结构域构建体转染HEK 293细胞,并在含血清完全培养基中培养24h,然后血清饥饿16h,随后用EGF(100ng/ml)处理10min,过钒酸钠处理10min。制备全细胞裂解物用于IB分析以检测磷酸化的Erk和全Erk。
用冷裂解液(1%NP-40,50mM Tris-HCl pH 7.4,150mM NaCl,2mM EDTA,50mM NaF,10%甘油和蛋白酶抑制剂混合物,1:1000稀释)裂解HEK 293细胞。13,000*g离心15min后收集上清液。用合适的预免疫血清和蛋白G(Roche)清除裂解物后,进行免疫沉淀(IP)和免疫印迹(IB)。
所有用GFP标记的TrM SH2结构域显著结合EGFR(图11(a))。使用抗-GFP和抗-EGFR抗体进行免疫沉淀(IP)分析观察结合。相反,Wt Fyn和Src SH2结构域没有表现出与EGFR可检测的结合。观察到Wt Grb2SH2结构域的弱结合,其是合理的,因为EGFR是Grb2SH2结构域的生理结合目标。与TrM Fyn和Src SH2结构域相似,TrM Grb2SH2结构域表现出与EGFR的强结合,比Wt Grb2SH2结构域具有显著更高的亲和性。因此,我们证明了我们的亲和性增强策略通过将其用于Grb2SH2结构域而有效发挥作用。
接下来,我们观察了哺乳动物细胞中TrM SH2结构域的表达对EGFR下游信号事件的影响。用抗-磷酸-Erk(pErk)抗体进行蛋白质印迹观察了下游蛋白Erk的磷酸化水平。对于表达TrM SH2结构域的HEK293细胞,观察到比Wt SH2结构域显著减少的pErk水平(图11(b)、图11(c))。这表明处于EGFR下游的MAP激酶途径的活化在细胞中被TrMSH2结构域的表达所阻断。因此,我们证明了TrM SH2结构域与EGFR的紧密结合阻断了下游信号的活化。
实施例5–在细胞生长和菌落形成中观察到的TrM SH2结构域的抑制效应
为了考察TrM SH2结构域对细胞生长的影响,用pEGFPC2-SH2结构域构建体质粒转染HEK 293细胞,如前所述,然后在具有EGF(100ng/ml)的完全培养基中培育36h。胰蛋白酶化细胞并用0.4%台盼蓝(Sigma-Aldrich)染色,在血球计数器中使用显微镜按照生产商的说明计数活细胞和全细胞。图12(a)显示了活细胞相对于空载体对照的数量。与表达Wt SH2结构域的细胞相比,TrM SH2结构域的表达导致活细胞减少。这一观察结果证明TrM SH2结构域具有减缓细胞增殖的抑制效果。
为了考察TrM SH2结构域对不贴壁细胞生长(其是肿瘤发生的指示物)的影响,按照Howard等,(Proc Natl Acad Sci,2003,Vol.100,pp.11267)描述的方法进行了软琼脂分析。用pEGFPD2-SH2结构域构建体通过PEI转染HEK293细胞并生长过夜。在第二天,将细胞胰蛋白酶化并以在0.25%琼脂的DMEM(10%FBS)中1×104细胞的密度一式三份涂布于60mm盘中0.5%琼脂的DMEM(10%FBS)顶部。将细胞在37℃ 5%CO2中保持21天,并用3-(4,5-二甲噻唑-2-基)-2,5-联苯基-四唑溴化物染色过夜。图12(b)显示了表达Wt或TrM SH2结构域的菌落的数量相对于空载体对照细胞的数量。图12(c)显示了从每个样品取得的示例照片。因此,TrM SH2结构域在软琼脂中证明了其对菌落形成的抑制效果,其表明TrM SH2结构域可被用作抗癌剂。
实施例6–SH2变体作为EGFR信号的体内探针
细胞信号是高度动态化的21。然而,有一些实验工具允许以非侵入方式监控这些动态事件。使用磷酸特异性抗体23或质谱(MS)21进行磷酸化动力学作谱(profiling)只能获得信号转导的快照,因为细胞必需经过处理进行免疫染色或MS分析。SH2结构域变体提供了一个代替品,通过它能实时并在活细胞中考察动态信号事件。
开发体内信号探针的两个重要考虑是特异性和亲和性。天然SH2结构域以适中的特异性和亲和性结合其同源的含pTyr目标多肽。使用根据本发明的噬菌体展示库运行获得具有期望性质的SH2变体。本实施例的目标是产生一组表现出定义的与EGFR中的pTyr位点的特异性、和与优化的pTyr结合口袋(pocket)的期望的亲和性的SH2变体。该组“量身定制的”SH2变体在细胞中融合XFP(即GFP、YFP或CFY)进行表达。SH2-XFP融合物可在A431中表达,它是一种表达高水平EGFR的人上皮瘤细胞系,并通过活细胞造影21监控其在EGF刺激下在细胞膜上的定位。单个SH2探针的使用将揭示单一位点的动态磷酸化谱。多个正交探针的使用将允许在EGFR信号中同时监控多个pTyr位点。通过对位点特异性酪氨酸磷酸化的多反应监测(MRM)-MS分析22和考察对应活化信号途径的蛋白质印迹(WB)对SH2-XFP探针研究进行补充。本实施例中获得的磷酸化动力学信息能够有助于重点考虑检测何种pTyr位点和SH2单体进行癌症介入,如下所述。
实施例7–SH2单体作为ErbB信号特异性抑制剂和治疗剂
虽然基于抗体的治疗在治疗癌症中表现出巨大的前景,但是它们需要进行人源化以避免致命免疫反应。大多数患者在抗体治疗中一段时间后变得耐受治疗20,1-3,导致有必要发现能够单独使用或与现存治疗方法联合使用的替代治疗策略4。基于人SH2结构域的SH2单体是低免疫原性的5。它们的低免疫原性与相对小的体积和针对pTyr位点(其经常在癌症中扩增6,7)的高特异性一起,使得基于SH2结构域的单体成为一种有吸引力的平台用于开发分子靶向的癌症治疗。本发明提供了进化和设计具有明确特异性和超高亲和性的SH2变体的能力,给予了开发此种潜力的前所未有的机遇。
通过检测SH2单体在抑制ErbB受体信号和细胞增殖中的效果,前述实施例中开发的一组SH2变体/单体被用作乳腺癌的候选治疗剂。然后在乳腺癌的3D细胞培养模型中评估了有前景的候选对象。最终,在小鼠肿瘤移植中评估了最优的SH2单体。
实施例8–SH2单体作为ErbB信号的抑制剂
由于ErbB家族,特别是ErbB1(EGFR)和ErbB2,经常在乳腺癌中扩增20,本文实施例中开发的超级pTyr结合剂可被用于抑制相关细胞模型中的ErbB受体信号和细胞增殖。为此,可以利用Muthuswamy实验室中产生的MCF10A-ErbB1(或10A-ErbB1)和MCF10A-ErbB2(或10A-ErbB2)8-11。具体的,使得乳腺来源的MCF10A细胞稳定表达嵌合ErbB1或ErbB2受体,其细胞质结构域连接来自FK506-结合蛋白(FKBP)的合成的配体结合结构域8-12。嵌合ErbB受体可被二聚化,并从而被二价FKBP配体AP1510所激活8-12。可用编码wt或变体SH2结构域的质粒转染MCF10A、10A-ErbB1和10A-ErbB2细胞,或用融合TAT蛋白转导结构域13-14的SH2单体处理这些细胞。申请人已经确认纯化的TAT-SH2结构域(用FITC标记)能穿透细胞并在细胞培养中具有2-3天的半衰期(图13)。用AP1510刺激后,通过MTS分析4监控细胞增殖,通过TUNEL分析4,8-10监控细胞凋亡。还进行了免疫沉淀(IP)和WB实验以考察Ras/MAPK生长途径的活化(即,通过分别检测MEK1/2和Erk1/2的磷酸化)和PI3K/Akt存活途径的活化(即通过检测Akt磷酸化)。对于表现出对ErbB信号和ErbB依赖的细胞生长的抑制效果的SH2单体组,将在其它过表达ErbB的人乳腺肿瘤细胞系例如BT-474、SKBR-3和MDA-361中进行类似的研究。
实施例9–3D培养中的SH2单体
当涂布于胞外基质床上时,MCF10A细胞形成类似体内乳腺腺泡的3D腺泡结构8。已有显示乳腺癌细胞形成以异常形态、增强的增殖和降低的凋亡为特征的不正常腺泡结构。10A-ErbB2细胞概括(recapitulate)了这些特征8,10,15。因此,MCF10A 3D培养系统被用于进一步评估SH2单体。具体的,MCF10A、10A-ErbB1和10A-ErbB2细胞在基质凝胶(matrigels)上培养,其中存在或不存在按照所建立的流程的不同浓度的AP1510和/或TAT-SH2单体。然后可以通过DAPI标记结构共聚焦分析测定形态发生不同阶段的腺泡组织。可通过Ki-67(增殖标志物)和裂解的半胱天冬酶-3(凋亡)免疫染色或通过TUNEL染色监控细胞增殖和存活4,8,9,15,16。
实施例10–小鼠乳腺癌模型中的SH2单体
可在人乳腺癌小鼠模型在体内评估SH2单体在抑制或减缓乳腺肿瘤发生中的作用。例如通过使用Muthuswamy实验室中建立的Comma-1D细胞和乳腺脂肪垫移植系统9,15。稳定表达Erb1或Erb2的CD细胞已经可以从Muthuswamy实验室获得9;将这些细胞注射进3周大雌性BALB/c小鼠9的去除上皮细胞的乳腺脂肪垫。每周用数字卡尺检测肿瘤生长。分别使用两种互补手段对SH2单体在抑制肿瘤起始和生长进行评估。对于肿瘤起始,建立了同时稳定表达Erb2(或Erb1)和SH2单体(具有XFP标签以易于追踪)的CD细胞。在移植时,将这些细胞起始乳腺肿瘤的能力与单独表达Erb2或Erb1的CD细胞进行比较分析。对于肿瘤进展,当肿瘤达到一定大小(例如,~150mm3)时4用TAT-SH2单体处理移植CD-ErbB2或CD-ErbB1细胞的小鼠。每天一次腹腔内注射不同浓度的TAT-SH2单体(或对照SH2结构域),共三周。作为对照,用曲妥珠单抗(Herceptin)——一种抗-ErbB2抗体——处理肿瘤4。每天检测肿瘤大小。在治疗最后处死小鼠,用苏木精和曙红固定和染色肿瘤组织以评估组织学变化117。TUNEL染色或免疫染色裂解的半胱天冬酶-3118被用于考察肿瘤的凋亡状态。用Ki67免疫染色和增殖细胞核抗原(PCNA)分析肿瘤增殖9,18。对肿瘤裂解物生化分析Erk和Akt的活化。使用Fyn/Src/Grb-SH2三变体建立使用小鼠乳腺癌模型评估SH2单体的流程,并将研究延伸至包括在2D和3D培养中在阻断ErbB信号时表现出最高效果的单体。最有效的SH2单体也可在裸鼠中建立的BT-474异种移植中进一步确认4。
实施例11–比较TrM与野生型(WT)SH2结构域结合能力的GST沉淀
(pulldown)分析
GST沉淀分析证实TrM SH2结构域从细胞裂解物俘获更多酪氨酸-磷酸化的蛋白(图14)。
分别将野生型(Wt)和三变体(TrM)Fyn SH2结构域(Ala139–Gly249)亚克隆入pETM30载体(Dümmler等,Microb.Cell Fact.4,34(2005))。Fyn SH2结构域构建体在C端含有FLAG标签序列(DYKDDDDKC)(SEQ ID NO:27)。为了产生GST对照载体,在原始pETM30载体的GST标签序列之后插入终止密码。GST和GST-SH2蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。用50μM过钒酸钠在37℃下处理HeLa细胞10min。在含0.5%NP-40、50mM HEPES pH 7.4、1mM氯化镁、150mM KCl、和完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的裂解缓冲液中在冰上裂解HeLa细胞。GST沉淀分析按照描述进行(Li等,J.Biol.Chem.278,3852–3859(2003))。使用4G10抗-pTyr抗体(Millipore)通过蛋白质印迹揭示磷酸蛋白。
实施例12–通过Src SH2TrM进行依赖激酶活化的间变性淋巴瘤激酶(ALK)检
测
受体酪氨酸激酶通过胞外刺激激活并磷酸化胞内基质,包括激酶自身的细胞质区域。间变性淋巴瘤激酶(ALK)是一种受体酪氨酸激酶,其受到活化抗体mAb46的刺激。H370细胞系是一种稳定表达ALK的HEK293细胞系。图15A显示SrcTrM能够在刺激下从细胞裂解物俘获基本上比Wt更大数量的磷酸化蛋白。
作为GST标签融合蛋白分别制备了Wt人Src(hSrc)SH2、TrM hSrc SH2、和Wt劳斯氏肉瘤病毒Src(vSrc)SH2结构域。vSrc SH2结构域与hSrc SH2结构域几乎相同(在SH2结构域区域有3个残基的不同,该不同点位于结合目标的表面的外部)。将5μgGST标记的SH2结构域与500μg用ALK激活抗体mAb-46处理或不处理的H370细胞裂解物一起在室温下孵育30min。然后加入20μl谷胱甘肽琼脂糖珠进行另外30min的室温孵育。作为阳性对照,抗-pTyr抗体P-Tyr-100(Cell Signaling,#9411)被用于免疫沉淀。将4μl的P-Tyr-100抗体与500μg用ALK激活抗体mAb-46处理或不处理的H370细胞裂解物一起在4℃下孵育2小时。随后,加入20μl蛋白G珠进行另外2小时的4℃孵育。谷胱甘肽珠或蛋白G珠用1x PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤3次。将珠子添加至30μl 2x SDS上载缓冲液并煮沸10min。样品在8%双-Tris SDS-PAGE凝胶上进行拆分。将凝胶用于蛋白质印迹,把样品转移到PVDF膜(Millipore)上,用P-Tyr-100抗体探针检测蛋白。蛋白质印迹上显示的主条带(220kDa和140kDa)是两种ALK(图15A)。
在图15B中,Src SH2TrM被进一步显示作为探针在PVDF膜上检测酪氨酸-磷酸化的蛋白,其作为缀合至辣根过氧化物酶(HRP)的材料。通过直接将HRP与探针缀合,可以免除使用抗体(所谓的第二抗体)检测探针的步骤。
按上述部分的描述纯化6组氨酸标记的Src SH2Wt和TrM蛋白,并按上述部分的描述通过烟草蚀纹病毒裂解标签。将该材料通过液相色谱使用体积排阻柱Superdex7510/300(GE Healthcare)在由0.1M磷酸钠和0.15M氯化钠组成的缓冲液中在pH7.2下进一步纯化。
将浓度0.3μg/μl的400μl SH2结构域蛋白混合冻干活化的过氧化物酶(EZ-Link PlusActivated Peroxidase#31478)。然后,将15μL新鲜制备的5M硼氢化氰钠添加至反应混合物并在室温下孵育1小时。然后,加入30μL的淬火缓冲液(3M乙醇胺,pH 9)在室温下反应15分钟。HRP标记的TrM SH2用1L的pH 7.2磷酸盐缓冲盐水(0.1M磷酸钠,0.15M氯化钠)透析过夜。
使用4μg抗-ALK抗体(Santa Cruz)免疫沉淀来自500μg的H370细胞裂解物(用mAb-46处理或不处理)的ALK。免疫沉淀样品被用于8%双-Tris SDS-PAGE,并将样品从SDS-PAGE凝胶转移至两个PVDF膜的试纸条上。一个膜试纸条用TrM SH2-HRP缀合物以1:500稀释进行探针标记。作为对比,另一个膜试纸条与第一抗体P-Tyr-100(CellSignaling)孵育,然后与抗-小鼠IgG第二抗体-HRP缀合物(Bio-Rad)孵育。在膜上来自HRP缀合物的信号作为增强化学发光(Western Lightning Plus-ECL试剂盒,Perkin Elmer)进行检测并在x-射线胶片上检测(图15B)。
实施例13–使用Src SH2TrM检测酪氨酸-磷酸化的蛋白。
Nollau和Mayer(美国专利号7,846,746)使用Far-蛋白质印迹方法证明了SH2结构域能够检测来自裂解物的一系列酪氨酸-磷酸化的蛋白。因为自然中不同的SH2结构域具有不同的目标识别特异性,每种SH2结构域结合至一组独特的裂解物蛋白。
相反,亲和性增强的SH2结构域变体结合细胞裂解物中基本上更大部分的磷酸化蛋白。通过使用Src SH2TrM进行Far-蛋白质印迹实验,图16表明了SH2结构域变体对酪氨酸-磷酸化的蛋白的广泛检测。
在TBS缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.2,137mM NaCl)中以3.5μg/ml浓度制备GST蛋白和GST-Src SH2TrM。用50μM过钒酸钠在PBS中37℃下处理或不处理培养的U937细胞10min。在缓冲液中在冰上用超声裂解细胞(0.5%NP-40,50mM HEPES pH7.4,1mM氯化镁,150mM KCl),并将上清液上载至SDS-PAGE凝胶进行分离和随后的转移至PVDF膜(Millipore)。用5%牛奶在TBS-T(0.5%Tween-20的TBS液)中在4℃下过夜封闭膜,并在室温下用3.5μg/ml GST蛋白探针检测1小时。膜用TBS-T洗涤,并与抗-GST抗体-HRP(辣根过氧化物酶)缀合物(Sigma,#A7340)在室温下孵育1小时。来自HRP的信号在X射线胶片上作为增强化学发光进行检测。
实施例14–监控TrM SH2结构域的亚细胞定位以在活细胞中显像酪氨酸-磷酸化的
蛋白
不同于抗体分子,包括磷酸酪氨酸特异性抗体,SH2变体可被用在活细胞中作为监控酪氨酸磷酸化事件的工具。
编码Src SH2Wt、SrcSH2TrM、FynSH2Wt和FynSH2TrM的基因被插入pEGFP载体(Clontech)中表达与绿色荧光蛋白融合的功能性SH2变体。非小细胞肺癌细胞系A549在补充10%胎牛血清(FBS;SAFC Biosciences)、青霉素(50U/ml)和链霉素(50μg/ml)的无酚红Dulbecco’s修饰的Eagle’s培养基(DMEM;Sigma-Aldrich)中在37℃的含5%CO2的潮湿环境下生长。用JetPEI PolyPlus-Transfection根据制造商的说明用pEGFP构建体瞬时转染细胞。转染后16-20小时用Nikon荧光显微镜捕捉图像(图17)。
实施例15–在EGF处理下SH2变体选择性杀死表达EGFR的细胞
由于当变体SH2结构域在细胞中表达时,TrM SH2结构域抑制EGFR信号,本发明的变体可被用作EGFR信号的抑制剂。然而,信号事件发生在细胞内部。为了使用变体SH2结构域作为基于蛋白的抑制剂材料,该变体需要被从细胞膜外部递送入细胞内。
A549非小细胞肺癌细胞系表达高水平的野生型表皮生长因子受体(EGFR),适于进行监控EGFR激活事件(PCT公开号WO/2011/130343)。使用金纳米颗粒(Zhang等,Langmuir.2012Dec 11;28(49):17053-60)用于将SH2变体递送入细胞。图18显示SrcSH2TrM被递送入细胞且在EGF处理下与Wt SH2结构域相比降低了细胞变异性。作为对比,本分析中也检测了MCF-7细胞。由于MCF-7细胞不表达EGF受体(Ju等,Biochem.J.2013,452,123-134),SH2变体递送后EGF刺激没有显著影响细胞变异性(图18)。该结果表明TrM SH2蛋白对于依赖EGF生长的细胞表现出抑制效果。
在5mM HEPES缓冲液(pH 7.6)中将6组氨酸标记的SrcWt和TrM蛋白纯化至均质。1nM金纳米颗粒混合100nM Wt或TrM变体蛋白。MCF-7和A549细胞在处理前饥饿6小时。然后用100ng/ml EGF处理细胞20小时。将纳米颗粒-蛋白混合物用于细胞。对细胞进行胰蛋白酶化,并用0.4%台盼蓝(Sigma-Aldrich)染色,在血球计数器中用显微镜按照制造商的说明计数活性和全部细胞的数量。
表1
UniProt数据库项ID | 基因名称 |
3BP2_人 | SH3BP2 3BP2 RES4-23 |
ABL1_人 | ABL1 ABL JTK7 |
ABL2_人 | ABL2 ABLL ARG |
BCAR3_人 | BCAR3 NSP2 SH2D3B UNQ271/PRO308 |
BLK_人 | BLK |
BLNK_人 | BLNK BASH SLP65 |
BMX_人 | BMX |
BTK_人 | BTK AGMX1 ATK BPK |
CBLB_人 | CBLB RNF56 Nbla00127 |
CBLC_人 | CBLC CBL3 RNF57 |
CBL_人 | CBL CBL2 RNF55 |
CHIN_人 | CHN1 ARHGAP2 CHN |
CHIO_人 | CHN2 ARHGAP3 BCH |
CISH_人 | CISH G18 |
CLNK_人 | CLNK MIST |
CRKL_人 | CRKL |
CRK_人 | CRK |
CSK_人 | CSK |
DAPP1_人 | DAPP1 BAM32 HSPC066 |
FER_人 | FER TYK3 |
FES_人 | FES FPS |
FGR_人 | FGR SRC2 |
FRK_人 | FRK PTK5 RAK |
FYN_人 | FYN |
GRAP2_人 | GRAP2 GADS GRB2L GRID |
GRAP_人 | GRAP |
GRB10_人 | GRB10 GRBIR KIAA0207 |
GRB14_人 | GRB14 |
GRB2_人 | GRB2 ASH |
GRB7_人 | GRB7 |
HCK_人 | HCK |
HSH2D_人 | HSH2D ALX |
ITK_人 | ITK EMT LYK |
JAK1_人 | JAK1 JAK1A JAK1B |
JAK2_人 | JAK2 |
JAK3_人 | JAK3 |
KSYK_人 | SYK |
LCK_人 | LCK |
LCP2_人 | LCP2 |
LYN_人 | LYN JTK8 |
MATK_人 | MATK CTK HYL |
NCK1_人 | NCK1 NCK |
NCK2_人 | NCK2 GRB4 |
P55G_人 | PIK3R3 |
P85A_人 | PIK3R1 GRB1 |
P85B_人 | PIK3R2 |
PLCG1_人 | PLCG1 PLC1 |
PLCG2_人 | PLCG2 |
PTK6_人 | PTK6 BRK |
PTN11_人 | PTPN11 PTP2C SHPTP2 |
PTN6_人 | PTPN6 HCP PTP1C |
RASA1_人 | RASA1 RASA |
RIN1_人 | RIN1 |
RIN2_人 | RIN2 RASSF4 |
RIN3_人 | RIN3 |
SH21A_人 | SH2D1A DSHP SAP |
SH21B_人 | SH2D1B EAT2 |
SH22A_人 | SH2D2A SCAP TSAD VRAP |
SH23A_人 | SH2D3A NSP1 UNQ175/PRO201 |
SH24A_人 | SH2D4A PPP1R38 SH2A |
SH24B_人 | SH2D4B |
SH2B1_人 | SH2B1 KIAA1299 SH2B |
SH2B2_人 | SH2B2 APS |
SH2B3_人 | SH2B3 LNK |
SH2D3_人 | SH2D3C NSP3 UNQ272/PRO309/PRO34088 |
SH2D5_人 | SH2D5 |
SH2D6_人 | SH2D6 |
SH2D7_人 | SH2D7 |
SHB_人 | SHB |
SHC1_人 | SHC1 SHC SHCA |
SHC2_人 | SHC2 SCK SHCB |
SHC3_人 | SHC3 NSHC SHCC |
SHC4_人 | SHC4 SHCD UNQ6438/PRO21364 |
SHD_人 | SHD |
SHE_人 | SHE |
SHF_人 | SHF |
SHIP1_人 | INPP5D SHIP SHIP1 |
SHIP2_人 | INPPL1 SHIP2 |
SLAP1_人 | SLA SLAP SLAP1 |
SLAP2_人 | SLA2 C20orf156 SLAP2 |
SOCS1_人 | SOCS1 SSI1 TIP3 |
SOCS2_人 | SOCS2 CIS2 SSI2 STATI2 |
SOCS3_人 | SOCS3 CIS3 SSI3 |
SOCS4_人 | SOCS4 SOCS7 |
SOCS5_人 | SOCS5 CIS6 CISH5 CISH6 KIAA0671 |
SOCS6_人 | SOCS6 CIS4 SOCS4 |
SOCS7_人 | SOCS7 NAP4 SOCS6 |
SPT6H_人 | SUPT6H KIAA0162 SPT6H |
SRC_人 | SRC SRC1 |
SRMS_人 | SRMS C20orf148 |
STA5A_人 | STAT5A STAT5 |
STA5B_人 | STAT5B |
STAP1_人 | STAP1 BRDG1 |
STAP2_人 | STAP2 BKS |
STAT1_人 | STAT1 |
STAT2_人 | STAT2 |
STAT3_人 | STAT3 APRF |
STAT4_人 | STAT4 |
STAT6_人 | STAT6 |
TEC_人 | TEC PSCTK4 |
TENC1_人 | TENC1 KIAA1075 TNS2 |
TENS1_人 | TNS1 TNS |
TENS3_人 | TNS3 TEM6 TENS1 TPP |
TENS4_人 | TNS4 CTEN PP14434 |
TXK_人 | TXK PTK4 RLK |
TYK2_人 | TYK2 |
VAV2_人 | VAV2 |
VAV3_人 | VAV3 |
VAV_人 | VAV1 VAV |
YES_人 | YES1 YES |
ZAP70_人 | ZAP70 SRK |
实施例6–10的参考文献
1.Sierra,J.R.,Cepero,V.&Giordano,S.Molecular mechanisms of acquired resistance totyrosine kinase targeted therapy.Mol Cancer9,75。
2.Kobayashi,S.等,An alternative inhibitor overcomes resistance caused by amutation of the epidermal growth factor receptor.Cancer Res65,7096-7101(2005)。
3.Kobayashi,S.等,EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer togefitinib.N Engl J Med352,786-792(2005)。
4.Zhang,S.等,Combating trastuzumab resistance by targeting SRC,a common nodedownstream of multiple resistance pathways.Nat Med17,461-469(2011)。
5.Grabulovski,D.,Kaspar,M.&Neri,D.A novel,non-immunogenic Fyn SH3-derived binding protein with tumor vascular targeting properties.J Biol Chem282,3196-3204(2007)。
6.Liu,B.A.等,The human and mouse complement of SH2 domain proteins-establishing the boundaries of phosphotyrosine signaling.Molecular Cell22,851-868(2006)。
7.Lappalainen,I.,Thusberg,J.,Shen,B.&Vihinen,M.Genome wide analysis ofpathogenic SH2domain mutations.Proteins72,779-792(2008)。
8.Muthuswamy,S.K.,Li,D.,Lelievre,S.,Bissell,M.J.&Brugge,J.S.ErbB2,but notErbB1,reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini.Nat Cell Biol3,785-792(2001)。
9.Xiang,B.等,Brk is coamplified with ErbB2to promote proliferation in breastcancer.Proc Natl Acad Sci U S A105,12463-12468(2008)。
10.Zhan,L.,Xiang,B.&Muthuswamy,S.K.Controlled activation of ErbB1/ErbB2heterodimers promote invasion of three-dimensional organized epithelia in an ErbB1-dependentmanner:implications for progression of ErbB2-overexpressing tumors.Cancer Res66,5201-5208(2006)。
11.Moulder,S.L.等,Epidermal growth factor receptor(HER1)tyrosine kinaseinhibitor ZD1839(Iressa)inhibits HER2/neu(erbB2)-overexpressing breast cancer cells invitro and in vivo.Cancer Res61,8887-8895(2001)。
12.Aranda,V.等,Par6-aPKC uncouples ErbB2induced disruption of polarizedepithelial organization from proliferation control.Nat Cell Biol8,1235-1245(2006)。
13.Kilic,E.,Kilic,U.&Hermann,D.M.TAT fusion proteins against ischemic stroke:current status and future perspectives.Front Biosci11,1716-1721(2006)。
14.Harada,H.,Kizaka-Kondoh,S.&Hiraoka,M.Antitumor protein therapy;application of the protein transduction domain to the development of a protein drug for cancertreatment.Breast Cancer13,16-26(2006)。
15.Arias-Romero,L.E.等,A Rac-Pak signaling pathway is essential for ErbB2-mediated transformation of human breast epithelial cancer cells.Oncogene29,5839-5849。
16.Seton-Rogers,S.E.等,Cooperation of the ErbB2receptor and transforming growthfactor beta in induction of migration and invasion in mammary epithelial cells.Proc Natl Acad SciU S A101,1257-1262(2004)。
17.Zeller,R.&Rogers,M.Counterstaining and mounting of autoradiographed in situhybridization slides.Curr Protoc Mol BiolChapter 14,Unit 1415(2001)。
18.Zhan,L.等,Deregulation of scribble promotes mammary tumorigenesis andreveals a role for cell polarity in carcinoma.Cell135,865-878(2008)。
19.Wunderbaldinger,P.,Josephson,L.&Weissleder,R.Tat peptide directs enhancedclearance and hepatic permeability of magnetic nanoparticles.Bioconjug Chem13,264-268(2002)。
20.Saxena,R.&Dwivedi,A.ErbB family receptor inhibitors as therapeutic agents inbreast cancer:Current status and future clinical perspective.Med Res Rev。
21.Blagoev,B.,Ong,S.-E.,Kratchmarova,I.&Mann,M.Temporal analysis ofphosphotyrosine-dependent signaling networks by quantitative proteomics.Nat Biotechnol22,1139-1145(2004)。
22.Liu,H.等,Systematic identification of methyllysine-driven interactions for histoneand nonhistone targets.J Proteome Res9,5827-5836。
23.Ciaccio,M.F.,Wagner,J.P.,Chuu,C.-P.,Lauffenburger,D.A.&Jones,R.B.Systemsanalysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays.Nat Methods 7,148-155(2010)。
Claims (34)
1.一种用于结合含磷酸酪氨酸(pTyr)肽的变体SH2结构域,该变体SH2结构域包含在亲代SH2结构域的15个氨基酸位点的预定义区域具有至少一个氨基酸取代的亲代SH2结构域,该取代增强变体SH2结构域相对于亲代SH2结构域对含pTyr肽的亲和性。
2.根据权利要求1的变体SH2结构域,其特征在于当所述亲代SH2结构域与SEQ ID NO:1对齐时,所述亲代SH2结构域的15个氨基酸位点的预定义区域对应于SEQ ID NO:1的Arg18(位点1)、Lys19(位点2)、Ala21(位点3)、Arg38(位点4)、Ser40(位点5)、Glu41(位点6)、Thr42(位点7)、Thr43(位点8)、Ala46(位点9)、Ser48(位点10)、Leu49(位点11)、Ser50(位点12)、Lys63(位点13)、His64(位点14)、和Lys66(位点15)。
3.根据权利要求2的变体SH2结构域,其特征在于该至少一个取代包括在亲代SH2结构域中对应于位点10的位点处取代为小残基或疏水残基。
4.根据权利要求3的变体SH2结构域,其特征在于该小残基或疏水残基包括丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸。
5.根据权利要求2的变体SH2结构域,其特征在于该至少一个取代包括在亲代SH2结构域中对应于位点15的位点处取代为疏水残基。
6.根据权利要求5的变体SH2结构域,其特征在于该疏水残基包括异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸。
7.根据权利要求2的变体SH2结构域,其特征在于该至少一个取代包括在亲代SH2结构域中对应于位点10和15的位点处的取代。
8.根据权利要求2的变体SH2结构域,其特征在于该至少一个取代包括在亲代SH2结构域中对应于位点8和15的位点处的取代。
9.根据权利要求2的变体SH2结构域,其特征在于该至少一个取代包括在亲代SH2结构域中对应于位点8、10和15的位点处的取代。
10.根据权利要求8或9的变体SH2结构域,其特征在于对应于位点8的取代包括取代为苯丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、或缬氨酸。
11.根据权利要求2的变体SH2结构域,其特征在于所述变体SH2结构域包括位点4的精氨酸残基、位点11的亮氨酸残基和位点12的丝氨酸残基。
12.根据权利要求2的变体SH2结构域,其中所述变体SH2结构域包含选自SEQ ID NOs:5-17、19-22的氨基酸序列。
13.根据权利要求1-12任一项的变体SH2结构域,其特征在于所述亲代SH2结构域是真核的。
14.一种编码权利要求1-13任一项的变体SH2结构域的分离的DNA序列。
15.一种含有权利要求15的DNA序列的载体。
16.权利要求1-13任一项的变体SH2结构域在治疗含pTyr肽相关失调中的用途。
17.权利要求1-13任一项的变体SH2结构域在细胞中抑制或预防酪氨酸激酶效果的用途。
18.根据权利要求16或17的用途,其特征在于变体SH2结构域在允许跨细胞运输的载体中被提供。
19.根据权利要求16或17的用途,其特征在于变体SH2结构域作为融合至细胞膜穿透性分子的产物而被提供。
20.一种用于在细胞中抑制或预防酪氨酸激酶效果的方法,其特征在于所述方法包括向细胞中递送或引入权利要求1-13任一项的变体SH2结构域。
21.根据权利要求20的方法,其特征在于变体SH2结构域在允许跨细胞运输的载体中被提供。
22.根据权利要求20的方法,其特征在于该多肽作为包含该多肽和细胞膜穿透性分子的融合产物而被提供。
23.权利要求1-13任一项的变体SH2结构域在评估样品中含pTyr肽的存在中的用途。
24. 一种评估样品中含pTyr肽的存在的方法,该方法包括(a)用所述样品接触权利要求1-13任一项的变体SH2结构域,从而如果样品中存在含pTyr肽,会形成含pTyr肽/变体SH2结构域复合物;和(b)检测复合物的形成,从而检测样品中是否存在含pTyr肽。
25.权利要求1-13任一项的变体SH2结构域在含pTyr肽信号途径研究中的用途。
26.权利要求1-13任一项的变体SH2结构域在分离含pTyr肽中的用途。
27.一种用于从样品中分离含pTyr肽的方法,其特征在于该方法包括:(a)用所述样品接触权利要求1-13任一项的变体SH2结构域,从而如果样品中存在含pTyr肽,会形成含pTyr肽/变体SH2结构域复合物;和(b)从复合物中释放该含pTyr肽,从而分离含pTyr肽。
28.根据权利要求27的方法,其特征在于所述方法进一步包括通过检测所释放的含pTyr肽的数量来检测含pTyr肽在样品中的浓度。
29.一种检测样品中含pTyr肽的浓度的方法,包括:(a)将权利要求1-13任一项的变体SH2结构域固定在树脂上,(b)将样品流经具有结合的变体SH2结构域的树脂,(c)通过添加去除变体SH2结构域结合含pTyr肽的能力的溶剂,释放结合到树脂上的任何含pTyr肽,从而产生洗脱组份,和(d)测定在洗脱组份中存在的含pTyr肽的浓度。
30.根据权利要求28或29的方法,其特征在于含pTyr肽的浓度通过高效液相色谱(HPLC)进行确定。
31.根据权利要求24、27、28或29的方法,其特征在于所述变体SH2结构域被结合至亲和性柱或侧流试纸条上。
32.权利要求1-13任一项的变体SH2结构域在体外或体内的肽或蛋白中结合或检测pTyr残基的用途。
33.一种制造相对于亲代SH2结构域具有对含pTyr肽增强的结合亲和性的变体SH2结构域的方法,其特征在于该方法包括在亲代SH2结构域的15个氨基酸位点的预定义区域中取代至少一个氨基酸残基,当所述亲代SH2结构域与SEQ ID NO:1对齐时,亲代SH2结构域的15个氨基酸的预定义区域对应于SEQ ID NO:1的Arg18(位点1)、Lys19(位点2)、Ala21(位点3)、Arg38(位点4)、Ser40(位点5)、Glu41(位点6)、Thr42(位点7)、Thr43(位点8)、Ala46(位点9)、Ser48(位点10)、Leu49(位点11)、Ser50(位点12)、Lys63(位点13)、His64(位点14)、和Lys66(位点15)。
34.一种多肽,其特征在于该多肽包含多个SH2结构域,该多个SH2结构域的至少一个为权利要求1-13任一项的本发明的变体SH2结构域。
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106349378A (zh) * | 2016-11-17 | 2017-01-25 | 南通大学 | 小分子多肽102aa及其应用 |
CN109564215A (zh) * | 2016-06-10 | 2019-04-02 | 李顺成 | 用于以变体sh2结构域对蛋白质酪氨酸磷酸化进行概述的方法 |
CN112250750A (zh) * | 2020-10-21 | 2021-01-22 | 青岛肿瘤研究院 | 与含酪氨酸磷酸化修饰肽具有高亲和力的变体sh2结构域 |
CN114524871A (zh) * | 2022-01-28 | 2022-05-24 | 青岛赛诺基因科技有限公司 | 与含酪氨酸硫酸化修饰的肽具有高亲和力的变体sh2结构域 |
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Families Citing this family (2)
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---|---|---|---|---|
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WO2019241308A1 (en) * | 2018-06-11 | 2019-12-19 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Effector protein identification by sh2 domain affinity chromatography coupled mass spectrometry |
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---|---|---|---|---|
US4714681A (en) | 1981-07-01 | 1987-12-22 | The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center | Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same |
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US4720459A (en) | 1985-02-14 | 1988-01-19 | Medical College Of Wisconsin Research Foundation, Inc. | Myelomas for producing human/human hybridomas |
US5843456A (en) | 1991-03-07 | 1998-12-01 | Virogenetics Corporation | Alvac poxvirus-rabies compositions and combination compositions and uses |
US5786454A (en) | 1994-09-16 | 1998-07-28 | Washington University School Of Medicine | Modified SH2 domains |
US5869270A (en) | 1996-01-31 | 1999-02-09 | Sunol Molecular Corporation | Single chain MHC complexes and uses thereof |
US6824989B1 (en) | 2000-09-01 | 2004-11-30 | Upstate Biotechnology, Inc. | Recombinant monoclonal antibody to phosphotyrosine-containing proteins |
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2019
- 2019-03-18 US US16/356,698 patent/US20190271705A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
<GENBANK>: "P12931.3", <GENBANK> * |
J. MICHAEL BRADSHAW,等。: "Investigation of Phosphotyrosine Recognition by the SH2 Domain of the Src Kinase", 《J. MOL. BIOL》 * |
MICHAEL J ECK,等。: "Recognition of a high-affinity phosphotyrosyl peptide by the Src homology-2 domain of p56 lck", 《NATURE》 * |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109564215A (zh) * | 2016-06-10 | 2019-04-02 | 李顺成 | 用于以变体sh2结构域对蛋白质酪氨酸磷酸化进行概述的方法 |
US11274129B2 (en) | 2016-06-10 | 2022-03-15 | Shun-Cheng Li | Methods for protein tyrosine phosphorylation profiling with variant SH2 domains |
CN106349378A (zh) * | 2016-11-17 | 2017-01-25 | 南通大学 | 小分子多肽102aa及其应用 |
CN106349378B (zh) * | 2016-11-17 | 2017-12-29 | 南通大学 | 小分子多肽102aa及其应用 |
CN112250750A (zh) * | 2020-10-21 | 2021-01-22 | 青岛肿瘤研究院 | 与含酪氨酸磷酸化修饰肽具有高亲和力的变体sh2结构域 |
CN114524871A (zh) * | 2022-01-28 | 2022-05-24 | 青岛赛诺基因科技有限公司 | 与含酪氨酸硫酸化修饰的肽具有高亲和力的变体sh2结构域 |
CN114524871B (zh) * | 2022-01-28 | 2023-06-09 | 青岛赛诺基因科技有限公司 | 与含酪氨酸硫酸化修饰的肽具有高亲和力的变体sh2结构域 |
WO2024020328A1 (en) * | 2022-07-16 | 2024-01-25 | Eurofins Discoverx Corporation | Binding assays using phage display technology and kits thereof |
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