KR20180082084A

KR20180082084A - Aeg-1을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20180082084A
Application number: KR1020170003321A
Authority: KR
Inventors: 이석근; 김상룡; 최민지
Original assignee: 경희대학교 산학협력단; 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2017-01-10
Filing date: 2017-01-10
Publication date: 2018-07-18

Abstract

본 발명은 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서, AEG-1 처리에 따른 허혈성 뇌질환에 의한 신경세포 사멸을 억제시킬 수 있음을 구체적으로 확인하였는바, 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료에 있어서, 보다 근본적으로 접근하여 타겟치료를 할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

AEG-1을 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising astrocyte elevated gene-1 for preventing or treating ischemia}

본 발명은 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

2015년 우리나라 사망원인 통계조사에 따르면, 뇌혈관 질환에 의한 사망률(인구 십만 명당 사망자수)이 암과 심장 질환 다음으로 3위인 48.0명에 이른다. 이와 같이 뇌혈관 질환 치료제에 대한 수요는 점차 더 증가하고 있으며, 뇌혈관 질환 치료를 통한 사회적 경제적 손실을 줄이기 위한 치료제 개발연구의 중요성이 강조되고 있다. 뇌혈관 질환은 특히 노령 연령층에 발병률이 높으며, 일단 발생하면 사망률이 매우 높다. 2015년 국내 65세 이상 인구는 662만4000명으로 전체의 13.1%로 나타났으며, 2030년에는 1269만명으로 늘어날 것으로 추정된다.

뇌혈관 질환은 크게 2가지 형태로 분류될 수 있다. 하나는 뇌출혈 등에서 볼 수 있는 출혈성 뇌질환이고, 다른 하나는 뇌혈관의 폐쇄 등에 의해 나타나는 허혈성 뇌질환이다. 출혈성 뇌질환은 교통사고 등에 의해서 주로 나타나며, 허혈성 뇌질환은 주로 노령의 사람들에서 자주 나타나는 질환이다. 허혈성 뇌질환은 혈전증(thrombosis), 색전증(em-bolism), 일과성 허혈 발작(transient ischemic attack) 및 소경색(lacune)등으로 세분할 수 있는데, 허혈성 뇌혈관질환은 주로 혈전과 색전 등에 의하여 뇌에 혈류를 공급하는 혈관에 병리학적 이상이 생긴 것이다.

대뇌에 일시적인 뇌허혈이 유발되는 경우, 뇌조직에 산소와 포도당의 공급이 차단되어 신경세포에서는 ATP 감소, 부종(edema)이 발생하며, 결국 뇌의 광범위한 손상이 유발된다. 신경세포의 사멸은 뇌허혈이 있은 후 나타나는데, 이를 신경세포사멸(neuronal death)라고 한다.

이와 같이, 허혈성 뇌손상에 의한 성체 신경세포의 손상기전과 관련된 타겟 특이적인(target-specific) 연구는 아직 미흡한 상황이며, 궁극적인 허혈에 의한 뇌 조직 손상을 효과적으로 치료 및 예방할 수 있는 신규 치료제 개발이 시급한 상황이다. 이와 관련하여 국내 공개특허 제2012-0064316호에서는 에틸피루베이트 유도체를 이용한 허혈성 뇌질환의 치료 방법을 제시한 바 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 유전자 구조물의 도입에 따른 신경세포사멸 억제 효과를 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 개선용 건강 기능 식품 조성물을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 다른 목적은 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계(S1);

상기 S1 단계의 세포주에서 AEG-1의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계(S2); 및

상기 S2 단계의 AEG-1의 발현 또는 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가된 피검물질을 선별하는 단계(S3);를 포함하는 허혈성 뇌질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 허혈성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일구현예로서, 상기 AEG-1 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로서, 상기 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 벡터에 포함된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로서, 상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 및 재조합 바이러스성 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로서, 상기 재조합 바이러스성 벡터는 아데노 거대세포바이러스 벡터(adeno cytomegalovirus vector)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로서, 상기 허혈성 뇌질환은 뇌졸중인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 신경세포의 사멸을 억제시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계(S1);

상기 S2 단계의 AEG-1의 발현 또는 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가된 피검물질을 선별하는 단계(S3);를 포함하는 허혈성 뇌질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일구현예로서, 상기 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 방법(DNA chip technology)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 활성 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 방법(protein chip technology)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 뇌질환의 치료방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조성물의 허혈성 뇌질환 치료용도를 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 AEG-1 처리에 따른 신경세포사멸의 억제 효과를 확인하였는바, 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료에 있어서, 보다 근본적인 타겟 치료 방법을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 허혈성 뇌질환 모델에서의 AEG-1의 발현량의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도면으로, A는 면역조직학적 방법을 이용하여 MCAO 모델에서의 AEG-1 발현량을 확인한 결과이고, B 및 C는 각각 대뇌피질부위와 선조체에서의 신경세포와 AEG-1의 발현 위치 및 발현 정도를 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 AEG-1의 발현이 허혈성 뇌질환 모델에서 유도되는 세포사멸을 억제하는지 확인한 결과를 나타낸 도면으로, A는 허혈성 뇌질환을 Oxigen-Glucose Deprivation을 통해 in vitro 상에서 구현한 결과를 나타낸 것이며, B는 adeno-AEG-1 virus를 이용하여 primary neuronal cell에 과발현시킨 후 OGD처리를 하였을 때 신경세포 사멸 보호효과가 있는지 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 MK801의 처리에 의해 OGD에 의한 세포 사멸을 억제함을 확인한 결과이고(A), MK801(1uM) 처리군에서의 AEG-1의 발현의 증가를 확인한 결과(B)를 나타낸 도면이다.
도 4는 MCAO로 유도된 허혈성 뇌질환 모델에서 AEG-1의 발현량 감소를 확인한 결과를 나타낸 결과이고(A, C), 신경세포 사멸 억제 작용이 있음이 밝혀진 MK801을 처리하였을 때 허혈성 뇌질환에서 나타나는 신경세포 사멸 감소뿐만 아니라 AEG-1의 발현이 유지되고 있음을 확인한 결과(B, D)를 나타낸 도면이다.

본 발명자들은, 중뇌동맥협착(middle cerebral artery occlusion, 이하 MCAO)에 의해 허혈성 뇌질환이 유도된 동물모델을 이용하여 AEG-1 처리에 따른 신경세포 사멸 억제 효과를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질은 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 인코딩 되는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명의 AEG-1 단백질에는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. AEG-1 단백질의 변이체란 AEG-1 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 AEG-1 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem.Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).

상기 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으며, 상기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 핵산 분자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 백터에 포함된 형태일 수 있다. 상기 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터는 인체 또는 동물세포에서 발현되는 아데노 거대세포바이러스 벡터(adeno cytomegalovirus vector), 선형 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스성 발현벡터를 포함하는 벡터, 또는 재조합 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 재조합 아데노 바이러스(adenovirus) 벡터, 재조합 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 벡터 또는 재조합 렌티바이러스(lentivirus) 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 벡터인 것이 바람직하고, 아데노 거대세포바이러스 벡터(adeno cytomegalovirus vector) 벡터인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물에 의한 예방 또는 치료 대상 질병인 “허혈성 뇌질환”은 성체 신경세포의 손상기전과 관련된 질병으로, 상기 조성물 중 허혈성 뇌질환은 특히 뇌졸중에 대하여 우수한 치료 효과를 가진다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 허혈성 뇌질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 허혈성 뇌질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 일실시예에서는, MCAO에 의해 허혈성 뇌질환이 유도된 동물모델에 AEG-1 발현 증가 유전자 구조물을 처리함으로써, 궁극적인 허혈에 의한 뇌 조직 손상을 효과적으로 치료 및 예방할 수 있음을 확인하였다(실시예 2, 도 2 참조).

본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 100 내지 500 mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 "후보물질"이란 허혈성 뇌질환 치료 활성을 테스트할 물질을 의미하며, 예컨대 추출물, 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드 및 광범위한 화합물 등의 임의 분자를 포함할 수 있다. 이러한 후보 물질은 또한 천연물질뿐 아니라, 합성물질도 포함한다.

상기 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 방법(DNA chip technology)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

상기 활성 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 방법(protein chip technology)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 뇌질환의 치료방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 허혈성 뇌질환 동물모델의 AEG-1의 발현 감소

1-1. 허혈성 뇌질환 동물모델 제작

250 내지 300g 몸무게의 성장한 수컷 스프래그-돌리(Sprague-Dawle) 랫트(대한바이오,한국)를 1.5% isoflurane을 이용 하여 흡입 마취시킨 뒤, 끝이 둥근 intraluminal mononylon 4.0 구조를 이용하여, 상기 경동맥의 기부에 삽입하여 내경동맥 분기점으로부터 약 20mm의 내경동맥 내부로 나아가게 하여 중대뇌동맥 (MCA)의 입구를 막고 2시간 동안 방치하였다. 허혈시간이 끝날 무렵 내경동맥으로부터 intraluminal flimament 구조를 제거하고, 1시간에서 3일 동안 재관류를 시행하였다.

1-2. 면역조직화학 염색(Immunohistochemical staining)

공지된 실험 방법(Kim et al., 2005; Kim et al., 2011; Kim et al., 2012)을 변형하여 면역조직화학 염색을 수행하였다. 상기 실시예 1-1의 정상군과 실험군에서 허혈성을 유발시킨후 7일째 ether로 마취, 실험동물의 흉곽을 열고 좌심실을 통해 cannula를 오름대동맥(ascending aorta)에 삽입한 다음, 우심방을 통하여 방혈시킴과 동시에 주입기(Cole Parmer, USA)를 이용하여 생리식염수(pH 7.4)로 분당 10 ml의 속도로 관류 세척하였다. 이어서 4% paraformaldehyde [0.1 M phosphate buffer (PB), pH 7.4] 용액으로 전신을 관류 고정한 후 머리뼈를 절개하여 뇌를 적출하였다. 고정된 뇌 조직을 통상적인 조직처리 과정을 거쳐서 20 ㎛ 두께로 뇌 조직을 섹션하였다. 조직 섹션을 PBS로 세척한 후, 1차 항체와 함께 48시간 동안 상온에서 배양하였으며, 1차 항체로는 anti-astrocyte elevated gene-1(AEG-1, 1:500; Invitrogen, Camarillo, CA.)를 이용하였다. 이를 다시 PBS로 세척한 후, 2차 항체와 함께 배양하였고, avidin-biotin complex kit(Vector Laboratories, Burlingame, CA.)로 처리하였다. 상기 조직 섹션을 DAB(DAKO^® Liquid DAB + Substrate-Chromogen System) 과 함께 배양하는 것을 통해 신호를 검출하였다. 염색된 샘플은 명시야 현미경(bright-field microscope, Carl Zeiss, Gotingen, Germany)을 이용하여 분석하였다.

또한, 면역형광 라벨링(immunofluorescence labeling)을 위하여, 뇌조직 섹션을 세척한 후, anti-AEG-1(1:500; Invitrogen) 및 anti-neuronal nuclei(NeuN, 1:100; Millopore), anti-glial fibrillary acidic protein(GFAP, 1:500; cell signaling) 항체들과 함께 24시간 배양하였다. 다음 날, 조직 섹션을 세척한 후, Alexa 488- and Alexa 546-conjugated secondary antibodies (1:1000) 와 함께 1시간 동안 배양하고, 다시 세척하였다. 이를 permount(Fisher)로 mount하였다. 염색된 샘플은 iRiS digital cell imaging system(logos biosystems, korea)을 이용하여 관찰하였다.

1-3. Western blot analysis

랫트의 대뇌의 신경세포 분리를 위해 임신 16-18일이 된 SD rat에서 태아를 분리하여 대뇌를 신속히 분리한뒤 trypsin을 처리하여 단일세포로 만들었다. neurobasal 배지와 b-27이 함유된 배양액에 분리된 단일세포들을 poly-L-lysine이 코팅된 cover glass 또는 배양플라스크에 분주하고 7~21일 동안 배양하였다. AEG-1의 발현을 유도하기 위해 adeno AEG-1 virus를 이용하여 infection 시킨뒤 OGD를 처리한 군과 대조군을 harvest하여 western blot을 위한 샘플을 채취하였다. bradford assay (bradford assay; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 단백질 농도를 결정하였고, SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-PolyacrylAmide Gel Electrophoresis)를 통해 단백질을 분리하였다. Electrophoretic transfer system (Bio-Rad Laboratories)를 이용하여 membrane에 분리된 단백질들을 이송시켰고, 각각 일차항체들[anti-AEG-1(1:500; Invitrogen), anti-β-actin (1:4000, Cell Signaling, Beverly, MA.)]과 함께 하루 동안 4℃에서 배양하였다. 이후, 다시 2차 항체 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)와 반응시키고 ECL Western blot detection reagents (Amersham Biosciences) 처리하여 발색시켰다. 정량 분석을 위해 컴퓨터 프로그램 Image gauge 4.0 (FUJIFILM Science Lab)을 이용하여 각 단백질의 밀도를 측정하였다.

1-4. 통계분석

모든 값은 Sigma plot 12.0 프로그램을 이용하여, 평균 ± 평균치 표준오차(mean ± standard error of the mean (SEM))로 표현하였다. 다중 비교분석은 Tukey 사후검정을 이용한 단일 분산분석(one-way analysis of variance (ANOVA))을 실시하였다.

1-5. 결과 확인

면역조직화학 실험 결과를 나타낸 도 1A에서와 같이, MCAO에 의해 허혈이 유발된 랫트의 경우 대조군과 비교하여 보다 낮은 AEG-1 발현 수준을 보인다는 것을 확인할 수 있다.

또한 AEG-1 양성 세포 표현형 확인을 위해서 수행한 이중형광 염색 결과를 도 1B 및 도 1C에 나타내었다. 도 1B 및 1C에서 확인할 수 있는 것과 같이, MCAO 모델에서 AEG-1의 발현은 대뇌 피질 및 선조체 신경세포에서 모두 관찰되었다.

허혈성 뇌 손상에 의한 AEG-1의 발현 차이를 확인하기 위해 도 2A에서 허혈성 뇌손상의 주요 원인이 되는 OGD 처리후 세포사멸을 확인하고, 이에 따른 AEG-1의 발현감소를 확인하였다. 도 2B에서 확인할 수 있는 것과 같이, Ad.AEG-1에 처리하여 AEG-1의 과발현을 유도한 신경세포 AEG-1의 과발현이 유도되었음을 확인함과 동시에 OGD에 의한 세포사멸이 억제됨을 확인하였다.

이러한 허혈성 뇌손상의 치료제로서 MK801이 알려져 있으며, 도 3A에서 나타나는 바와 같이 MK801 처리는 신경세포의 사멸을 억제함을 확인하였으며, OGD를 처리한 군에서 MK801을 처리하였을 때 나타나는 신경세포 사멸억제군에서 AEG-1의 발현이 증가되어있음을 도 3B를 통해 확인할 수 있었다.

도 3에서 보여지는 신경세포 보호기전에 AEG-1의 발현의 증가를 in vivo 상황에서 재현하기 위해 도 4에서 랫트에 MCAO를 유발한 뒤, MK801을 처리하여 AEG-1의 신경세포 사멸 억제를 확인하였다.

실시예 2. AAV-AEG-1의 제조

2-1. Oxigen-Glucose Deprivation을 통한 허혈성 뇌질환 유도

허혈성 손상은 산소와 영양소의 공급이 부족하여 뇌조직 대사에 이상이 일어나며, 이에 따른 신경세포의 사멸을 in vitro 상에서 구현하기 위해서, OGD(oxigen-glucose deprivation) 방법을 수행하였다(ref. Carla I. Tasca, et al. In Vitro Oxygen-Glucose Deprivation to Study Ischemic Cell Death. Neuronal Cell Death. 2014. 1254: 197-210). 산소와 글루코스의 결핍에 의한 세포 사멸 유도실험은 기존의 glucose가 함유된 배지가 제거되도록 glucose가 없는 배지로 충분히 씻어준 후, glucose가 없는 배지로 교환해 주었다. 1시간 뒤, 세포를 혐기성 챔버(anaerobic chamber(Billups-Rothenberg Inc., Del Mar, CA))로 옮겨, 5% CO₂와 95%의 N₂로 구성된 혐기성 환경에 2시간 노출시켜주었다. 2시간 후 세포를 혐기성 챔버에서 꺼내 배지를 glucose가 함유된 배지로 갈아 reoxygenation 해주었다.

2-2. Ad. AEG-1의 제조

p0TgCMV 플라스미드(HA-tag)에 AEG-1 유전자를 도입하여, AEG-1 유전자가 도입된 adeno. AEG-1 재조합 벡터를 제조하였다. AEG-1 유전자를 pCR2.1에 삽입하고 그 뒤, suttle 벡터인 p0TgCMV vector로 옮겼다. 이를 Adeno. CMV 벡터로 삽입하여 adeno. AEG-1을 제작하였으며, 유전적 역가는 1×10¹² viral genomes/ml이었다. 동일한 백본(backbone)에 비복제성 유전자를 서브클로닝하여 대조군으로 이용하였다(ref. Oncogene (2005) 24, 75527566).

2-3. MTT 분석법

AEG-1의 세포 사멸에 대한 억제효과가 있음을 확인하기 위해 Ad. AEG-1을 infection시킨 후 OGD에 의한 세포 사멸에서 세포의 생존율을 측정하기 위해 MTT assay를 수행하였다. 재산소화 반응까지 모두 끝난 세포에, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) 용액을 1㎎/㎖ 의 농도로 처리하고 37℃에서 2시간 반응하였다. 살아 있는 세포의 미토콘드리아와 MTT가 반응하여 보라색 결정이 생긴 세포를 100% DMSO(dimethyl sulfoxide) 용액에 넣어 용해시키고 microplate reader 를 이용하여 570㎚에서 UV 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율(%)은 OGD를 처리하지 않은 정상 대조군의 흡광도 값에 대한 백분율로 나타냈다.

2-4. 결과 확인

본 실시예 2에서는 OGD 모델에 의해 AEG-1 발현량이 변화하는지와, AEG-1 기반 유전자 구조물인 Ad. AEG-1의 도입에 의해 신경세포 사멸의 보호 효과가 있는지 확인하였다.

그 결과 도 2A에 나타낸 것과 같이, OGD 처리에 의해 신경세포의 생존율이 감소한다는 것을 확인하였다. 이와 동시에, AEG-1의 발현이 감소하였음을 확인할 수 있다.

또한, 도 2B에 나타낸 것과 같이 Ad. AEG-1 주입 후 신경세포의 생존율을 확인한 결과, Ad. AEG-1 주입이 신경세포의 사멸을 보호한다는 것을 확인하였으며, AEG-1의 발현 감소도 억제한다는 것을 확인하였다.

실시예 3. AEG -1의 도입에 의한 허혈성 뇌질환과 관련된 신경세포 사멸의 저해 확인

MK801은 NMDA blocker로서 glutatmate에 의한 신경손상으로부터 신경세포의 사멸을 보호해 주는 것으로 알려져 있다. glutamate에 의한 세포독성과 OGD에 의한 세포사멸에 있어서 MK801은 도 3A에서 나타내는 바와 같이 OGD에 의한 세포 사멸을 억제함을 세포 독성실험을 통해 확인할 수 있었으며, 이러한 OGD환경에서의 MK801(1uM) 처리군에서의 AEG-1의 발현은 증가되어있음을 도 3B를 통해 확인하였다.

이는 도 4A 및 도 4C에서 확인할 수 있는 것과 같이, 허혈성 손상 유발시 나타나는 AEG-1의 발현의 감소에 비하여 B, D에서 MK801를 처리함으로써 허혈성 손상이 감소한다는 것과, 이에 따라 AEG-1의 발현도 유지되고 있음을 확인한 것으로, 상기와 같이 in vivo 실험을 통해 신경세포 사멸 기전에 있어서 AEG-1의 역할이 중요함 확인한 것이다.

상기 실시예의 결과로부터, 본 발명의 조성물의 유효성분인 AEG-1의 도입에 의해 허혈성 뇌질환과 관련된 신경세포 사멸이 현저히 저해된다는 것을 알 수 있으며, 이로부터 상기 AEG-1 발현 증가 유전자 구조물의 허혈성 뇌질환 치료 효과가 우수하다는 것을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Composition comprising astrocyte elevated gene-1 for preventing or treating ischemia <130> MP16-489 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 582 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ala Arg Ser Trp Gln Asp Glu Leu Ala Gln Gln Ala Glu Glu 1 5 10 15 Gly Ser Ala Arg Leu Arg Glu Met Leu Ser Val Gly Leu Gly Phe Leu 20 25 30 Arg Thr Glu Leu Gly Leu Asp Leu Gly Leu Glu Pro Lys Arg Tyr Pro 35 40 45 Gly Trp Val Ile Leu Val Gly Thr Gly Ala Leu Gly Leu Leu Leu Leu 50 55 60 Phe Leu Leu Gly Tyr Gly Trp Ala Ala Ala Cys Ala Gly Ala Arg Lys 65 70 75 80 Lys Arg Arg Ser Pro Pro Arg Lys Arg Glu Glu Ala Ala Ala Val Pro 85 90 95 Ala Ala Ala Pro Asp Asp Leu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Arg Ser Glu 100 105 110 Glu Gln Lys Lys Lys Asn Arg Lys Lys Leu Ser Glu Lys Pro Lys Pro 115 120 125 Asn Gly Arg Thr Val Glu Val Ala Glu Gly Glu Ala Val Arg Thr Pro 130 135 140 Gln Ser Val Thr Ala Lys Gln Pro Pro Glu Ile Asp Lys Lys Asn Glu 145 150 155 160 Lys Ser Lys Lys Asn Lys Lys Lys Ser Lys Ser Asp Ala Lys Ala Val 165 170 175 Gln Asn Ser Ser Arg His Asp Gly Lys Glu Val Asp Glu Gly Ala Trp 180 185 190 Glu Thr Lys Ile Ser His Arg Glu Lys Arg Gln Gln Arg Lys Arg Asp 195 200 205 Lys Val Leu Thr Asp Ser Gly Ser Leu Asp Ser Thr Ile Pro Gly Ile 210 215 220 Glu Asn Thr Ile Thr Val Thr Thr Glu Gln Leu Thr Thr Ala Ser Phe 225 230 235 240 Pro Val Gly Ser Lys Lys Asn Lys Gly Asp Ser His Leu Asn Val Gln 245 250 255 Val Ser Asn Phe Lys Ser Gly Lys Gly Asp Ser Thr Leu Gln Val Ser 260 265 270 Ser Gly Leu Asn Glu Asn Leu Thr Val Asn Gly Gly Gly Trp Asn Glu 275 280 285 Lys Ser Val Lys Leu Ser Ser Gln Ile Ser Ala Gly Glu Glu Lys Trp 290 295 300 Asn Ser Val Ser Pro Ala Ser Ala Gly Lys Arg Lys Thr Glu Pro Ser 305 310 315 320 Ala Trp Ser Gln Asp Thr Gly Asp Ala Asn Thr Asn Gly Lys Asp Trp 325 330 335 Gly Arg Ser Trp Ser Asp Arg Ser Ile Phe Ser Gly Ile Gly Ser Thr 340 345 350 Ala Glu Pro Val Ser Gln Ser Thr Thr Ser Asp Tyr Gln Trp Asp Val 355 360 365 Ser Arg Asn Gln Pro Tyr Ile Asp Asp Glu Trp Ser Gly Leu Asn Gly 370 375 380 Leu Ser Ser Ala Asp Pro Asn Ser Asp Trp Asn Ala Pro Ala Glu Glu 385 390 395 400 Trp Gly Asn Trp Val Asp Glu Glu Arg Ala Ser Leu Leu Lys Ser Gln 405 410 415 Glu Pro Ile Pro Asp Asp Gln Lys Val Ser Asp Asp Asp Lys Glu Lys 420 425 430 Gly Glu Gly Ala Leu Pro Thr Gly Lys Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys 435 440 445 Lys Lys Lys Gln Gly Glu Asp Asn Ser Thr Ala Gln Asp Thr Glu Glu 450 455 460 Leu Glu Lys Glu Ile Arg Glu Asp Leu Pro Val Asn Thr Ser Lys Thr 465 470 475 480 Arg Pro Lys Gln Glu Lys Ala Phe Ser Leu Lys Thr Ile Ser Thr Ser 485 490 495 Asp Pro Ala Glu Val Leu Val Lys Asn Ser Gln Pro Ile Lys Thr Leu 500 505 510 Pro Pro Ala Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val Ile Leu Ser Lys Ser Asp 515 520 525 Ser Asp Lys Ser Ser Ser Gln Val Pro Pro Ile Leu Gln Glu Thr Asp 530 535 540 Lys Ser Lys Ser Asn Thr Lys Gln Asn Ser Val Pro Pro Ser Gln Thr 545 550 555 560 Lys Ser Glu Thr Ser Trp Glu Ser Pro Lys Gln Ile Lys Lys Lys Lys 565 570 575 Lys Ala Arg Arg Glu Thr 580 <210> 2 <211> 1746 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atggctgcac ggagctggca ggacgagctg gcccagcagg ccgaggaggg ctcggcccgg 60 ctgcgggaaa tgctctcggt cggcctaggc tttctgcgca ccgagctggg cctcgacctg 120 gggctggagc cgaaacggta ccccggctgg gtgatcctgg tgggcactgg cgcgctcggg 180 ctgctgctgc tgtttctgct gggctacggc tgggccgcgg cttgcgccgg cgcccgcaaa 240 aagcggagga gcccgccccg caagcgggag gaggcggcgg ccgtgccggc cgcggccccc 300 gacgacctgg ccttgctgaa gaatctccgg agcgaggaac agaagaagaa gaaccggaag 360 aaactgtccg agaagcccaa accaaatggg cggactgttg aagtggctga gggtgaagct 420 gttcgaacac ctcaaagtgt aacagcaaag cagccaccag agattgacaa gaaaaatgaa 480 aagtcaaaga aaaataagaa gaaatcaaag tcagatgcta aagcagtgca aaacagttca 540 cgccatgatg gaaaggaagt tgatgaagga gcctgggaaa ctaaaattag tcacagagag 600 aaacgacagc agcgtaaacg tgataaggtg ctgactgatt ctggttcatt ggattcaact 660 atccctggga tagaaaatac catcacagtt accaccgagc aacttacaac cgcatcattt 720 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Claims

AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 AEG-1 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 벡터에 포함된 것을 특징으로 하는, 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제4항에 있어서,
상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 및 재조합 바이러스성 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 재조합 바이러스성 벡터는 아데노 거대세포바이러스 벡터(adeno cytomegalovirus vector)인 것을 특징으로 하는, 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 허혈성 뇌질환은 뇌졸중인 것을 특징으로 하는, 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 과립세포의 분산화를 억제시키는 것을 특징으로 하는, 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계(S1);
상기 S1 단계의 세포주에서 AEG-1의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계(S2); 및
상기 S2 단계의 AEG-1의 발현 또는 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가된 피검물질을 선별하는 단계(S3);를 포함하는 허혈성 뇌질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
제9항에 있어서,
상기 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 방법(DNA chip technology)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법인 것을 특징으로 하는, 허혈성 뇌질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
제9항에 있어서,
상기 활성 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 방법(protein chip technology)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법인 것을 특징으로 하는, 허혈성 뇌질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.