KR101639198B1

KR101639198B1 - Ａｅｇ－１을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101639198B1
Application number: KR1020140062961A
Authority: KR
Inventors: 김상룡; 이석근
Original assignee: 경북대학교 산학협력단; 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2014-05-26
Filing date: 2014-05-26
Publication date: 2016-07-13
Also published as: KR20150135867A

Abstract

본 발명은 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 AEG-1은 파킨슨병 동물 모델에서 도파민 신경 세포의 보호 효과가 우수하여, 파킨슨병의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

ＡＥＧ－１을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition comprising AEG-1 for preventing or treating Parkinson's disease}

본 발명은 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

파킨슨병(Parkinson's disease)은 안정떨림, 경직, 운동완만 및 자세 불안정이 특징적으로 나타나는 신경계의 만성 진행성 퇴행성 질환으로 뇌의 흑질(Substantia Nigra pars compacta: SNc)에 분포하는 도파민의 신경세포가 점차 소실되는 신경병리학적인 특징을 나타낸다(Calne et al., 1983, Heikkila 1984). 파킨슨병 환자는 대략 60세 이상에서 인구의 약 1% 정도로 추정된다.

파킨슨병의 원인은 정확히 밝혀져 있지 않지만 유전적 인자와 환경적 인자가 서로 상호작용하여 일어난다는 '다인성 가설'이 가장 보편적으로 받아들여지고 있다. 대부분의 파킨슨병 환자들은 가족력 없이 발병하지만 약 10% 정도가 가족성 파킨슨병으로 나타나고 있다.

파킨슨병에서 감소된 도파민의 양을 증가시키기 위한 대증요법제로서 L-Dopa가 현재 일반적으로 사용되고 있다. L-Dopa는 사용 후, 파킨슨병의 진행을 더디게 하고 임상증상의 경감을 보이지만, 장기간 복용 시 불수의적인 운동, 구토 등의 부작용이 따른다(Clarke and Deane, 2001). 그 외에도, 파킨슨병을 치료하기 위하여 사용되고 있는 치료제로는 FDA 허가된 도파민 작용제(Dopamine Agonists), 카테콜-0-메틸트랜스퍼레이즈(catechol-Omethyltransferase inhibitor, COMT inhibitor), 모노아민 산화효소 B(monoamine oxidase B, MAO-B inhibitors), 항-콜린작용제(Anti-cholinergics) 등이 있다.

본 발명자들은 신규한 파킨슨병 치료제를 개발하기 위해 연구를 거듭한 결과, 파킨슨병 환자의 중뇌 흑질에서 AEG-1의 발현이 현저하게 감소함을 확인하고, AAV를 이용하여 AEG-1 유전자를 도입시킬 경우 도파민 신경세포의 보호 효과가 우수하여, AEG-1를 파킨슨병의 치료에 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 AEG-1을 이용한 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 AEG-1 단백질 또는 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 단계 1)의 세포주에서 AEG-1의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및

3) 단계 2)의 AEG-1의 발현 또는 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 AEG-1은 파킨슨병 동물 모델에서 도파민 신경 세포의 보호 효과가 우수하여, 파킨슨병의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 pBL-AEG-1의 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 2는 AAV-AEG-1(HA-tag) 투여 3주 후, 마우스 뇌 조직을 HA-tag 염색 및 도파민 신경세포(TH)로 이중 형광염색한 결과를 나타낸 도이다(Scale bar, 10 ㎛).
도 3은 AAV-AEG-1(HA-tag) 투여 3주 후, 마우스 뇌 조직을 AEG-1으로 염색한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 AAV-AEG-1(HA-tag) 투여 3주 후 6-OHDA를 주입하고, TH 염색을 통하여 AAV-AEG-1(HA-tag)의 신경보호효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다(A, a: 대조군, B, b: 6-OHDA만 주입, C, c: AAV-AEG-1(HA-tag) 투여 3주 후 6-OHDA를 주입).
도 5는 파킨슨병(PD) 환자의 중뇌 흑질을 염색하여 도파민 신경세포 (Neuromelanin positive cell, Brown)에서 AEG-1(Blue)의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다(Scale bar, 25 ㎛).
도 6은 파킨슨병(PD) 환자의 중뇌 흑질에서 AEG-1 단백질 발현을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 약학적 조성물 및 식품 조성물을 포함한다.

상기 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질은 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 인코딩 되는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명의 AEG-1 단백질에는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. AEG-1 단백질의 변이체란 AEG-1 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 AEG-1 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).

상기 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으며, 상기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 핵산 분자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 백터에 포함된 형태일 수 있다. 상기 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터는 인체 또는 동물세포에서 발현되는 선형 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스성 발현벡터를 포함하는 벡터, 또는 재조합 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 재조합 아데노 바이러스(adenovirus) 벡터, 재조합 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 벡터 또는 재조합 렌티바이러스(lentivirus) 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 벡터인 것이 바람직하고, 재조합 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글라이콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글라이콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.001 내지 1000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 상기 투여량은 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 그러나 경구 투여시, 단백질은 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다.

본 발명에 있어서 '건강기능식품'이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.

상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기 "후보물질"이란 파킨슨병 치료 활성을 테스트할 물질을 의미하며, 예컨대 추출물, 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드 및 광범위한 화합물 등의 임의 분자를 포함할 수 있다. 이러한 후보물질은 또한 천연물질뿐 아니라, 합성물질도 포함한다.

상기 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 방법(DNA chip technology)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

상기 활성 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 방법(protein chip technology)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 파킨슨병 환자의 중뇌 흑질에서 AEG-1의 발현이 감소하고, 이를 파킨슨병 동물 모델에 투여하였을 경우 도파민 신경 세포의 보호 효과가 우수하여, 파킨슨병을 치료하는데 이용될 수 있음을 확인하였다. 따라서, AEG-1은 파킨슨병 치료제 후보물질을 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. AAV-AEG-1의 제조

1-1. pBL-AEG-1 재조합 벡터 제조

pBL 플라스미드(HA-tag)에 AEG-1 (astrocyte elevated gene-1) 유전자를 도입하여, AEG-1 유전자가 도입된 pBL-AEG-1 재조합 벡터를 제조하였다. 그 벡터맵을 도 1에 나타내었다.

1-2. AAV-AEG-1의 제조

AAV(Adeno-associated virus)-AEG-1은 University of North Carolina Vector Core에 의뢰하여 제작하였으며, 유전적 역가는 9.4×10¹² viralgenomes/ml이었다. 동일한 바이러스 백본에 활성화된 GFP(greenfluorescent protein)를 서브클로닝하여 대조군으로 이용하였다.

실시예 2. 파킨슨병 동물 모델을 이용한 분석 결과

2-1. 실험 동물

8 주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 Daehan Biolink (Eumseong, Korea)에서 구입하였다. 각 마우스에 클로랄 수화물(chloral hydrate, 360 mg/kg; Sigma, St. Louis, MO.)을 i.p(intraperitoneal) 투여하여 마취시킨 후, 스테레오텍식 프레임(stereotaxic frame, David Kopf Instrument, Tujunga, CA, USA)에 위치시켰다. 종래 알려진 방법에 따라 각 마우스의 중뇌 흑질 부위에 AAV-AEG-1을 실린지 펌프(KD Scientific, NewHope, PA)에 붙어있는 10 ㎕ Hamilton syringe(30S needle)를 이용하여 오른쪽 SN(AP: -0.35 cm; ML: +0.11 cm; DV: -0.37 cm, relative to bregma)에 주사하였다(Paxinos and Watson, 1998). 주입 후, 바늘을 천천히 회수하기 전에 추가적으로 5분간 유지시켰다. 이 때 2.0 ㎕의 바이러스 벡터 현탁액을 0.1 ㎕/min의 속도로 20분 간 주입하였다.

2-2. 면역조직화학 염색(Immunohistochemical staining)

공지된 실험 방법(Kim et al., 2005; Kim et al., 2011; Kim et al., 2012)을 변형하여 면역조직화학 염색을 수행하였다. 상기 실시예 2-1의 각 마우스에 경심관류를 수행한 후, 조직을 고정시키고, 30 ㎛ 두께로 뇌 조직을 섹션하였다. 조직 섹션을 PBS로 세척한 후, 1차 항체와 함께 48시간 동안 상온에서 배양하였다. 1차 항체로는 rabbit anti-tyrosine hydroxylase(TH, 1:2000; Pel-Freez, Brown Beer, WI) 및 mouse anti-HA(1:100; Cell-signaling, Beverly, MA)를 이용하였다. 이를 다시 PBS로 세척한 후, 2차 항체와 함께 배양하고, avidin-biotin complex kit(Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 처리하였다. 상기 조직 섹션을 0.003% H₂O₂를 포함하는 0.1M PB에 녹인 0.5 mg/ml 3,3'-다이아미노벤지딘(diaminobenzidine)(Sigma, St. Louis, MO)과 함께 배양하는 것을 통해 신호를 검출하였다. 염색된 샘플은 명시야 현미경(bright-field microscope, Carl Zeiss, Gotingen, Germany)을 이용하여 분석하였다.

또한, 면역형광 라벨링(immunofluorescence labeling)을 위하여, 뇌 조직 섹션을 세척한 후, rabbit anti-tyrosine hydroxylase(TH, 1:2000; Pel-Freez, Brown Beer, WI) 및 mouse anti-HA(1:100; Cell-signaling, Beverly, MA) 항체와 함께 밤새 배양하였다. 다음 날, 조직 섹션을 세척한 후, Cy3 conjugated anti-rabbit IgG(1:200; Millipore, Bedford, MA) 및 FITC-conjugated anti-rabbit IgG(1:200; Millipore)와 함께 1시간 동안 배양하고, 다시 세척하였다. 이를 Vectashield mounting medium(Vector)으로 마운트하였다. 염색된 샘플은 공초점 현미경(LSM700, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 관찰하였다.

이상의 실험 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, AAV-AEG-1가 주입된 흑질 부위(SNpc)에 AAV-AEG-1이 발현되고 있음을 HA-tag 염색을 통해 확인하였으며(도 2의 위), 도파민 신경세포[Tyrosine hydroxylase (TH)-positive cell, red]에서 AEG-1 유전자(HA-tag, green)가 발현됨을 확인하였다(도 2의 아래).

또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 흑질 도파민 신경세포에서 AAV-AEG-1 도입에 의해 AEG-1이 더 많이 발현될 수 있음을 확인하였다.

2-3. 6-OHDA lesion

상기 실시예 2-1과 같이 각 마우스에 AAV-AEG-1을 주입하고 3주 후, 6-OHDA의 흡수를 막기 위해 데시프라민(desipramine)을 전처리하였다. 각 마우스에 클로랄 수화물(chloral hydrate, 360 mg/kg; Sigma, St. Louis, MO.)을 i.p(intraperitoneal) 투여하여 마취시킨 후, 스테레오텍식 프레임에 위치시켰다. 이 후, 마이크로리터 실린지를 이용하여 0.5 ㎕/min의 속도로 총 농도 15.0 ㎍/ 3 ㎕의 6-OHDA (5.0 ㎍/㎕ in 0.9% NaCl/0.02% ascorbate) 용액을 주입하였다. 주입은 왼쪽 선조체(striatum)에 이루어졌다(AP: +0.09 cm; ML: +0.22 cm; DV: -0.25 cm relative to bregma). 5분간 기다린 후, 바늘을 천천히 제거하였다. 각 마우스에서 뇌 조직을 분리한 후, 상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 TH 염색을 수행하였다. 또한, 니슬(Nissl) 염색을 위하여, SN 조직 샘플을 겔라틴 코팅된 슬라이드에 마운트한 후, 0.5% cresyl violet(Sigma)으로 염색하였다. 그 후, 명시야 현미경을 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 신경독성 물질인 6-OHDA만 주입된 쥐(B, b)에 비해 AEG-1 주입 3주 후 6-OHDA가 주입된 쥐(C, c)에서 상대적으로 더 많은 도파민 신경세포(brown color)가 남아있음을 확인하였으며, 남아있는 도파민 신경세포의 크기도 보존이 되는 것을 확인하였다.

실시예 3. 인간 뇌 세포를 이용한 분석 결과

3-1. 면역조직화학분석

파킨슨병 환자의 뇌(중뇌 흑질) 조직은 VBBN(Victoria Brain Bank Network)에서 수득하였다. 상기 인간 뇌 조직을 자일렌에서 탈파라핀화 하였으며, 면역조직화학 수행 전에 항원 회복(antigen retrieval)을 수행하였다. 조직 섹션을 차가운 PBS로 15분 동안 세척한 후, universal blocking solution(0.3% Triton X-100, 1% BSA(bovine serum albumin), 0.05% Tween 20, 0.1% cold fish gelatin and 0.05% sodium azide in PBS)으로 상온에서 1시간 동안 블락하였다. 1차 항체(rabbit anti-AEG-1, 1:200; Invitrogen, Camarillo, CA)는 antibody Diluent(Dako; S3022)에 희석하여 이용하였으며, 상기 조직 섹션을 streptavidin-conjugated HRP(horseradish peroxidase)(Vectastain ABC kit, Vector Lavoratories)에 이어 biotin-conjugated secondary antibody와 함께 배양하였다. 각 조직 샘플을 0.05% DAB(diaminobenzidine-HCl), 0.05% 황산 니켈 암모늄(nickel ammonium sulfate), 0.05% 염화 코발트(cobalt chloride hexahydrate) 및 0.003% 과산화수소를 포함하는 0.1M PB와 함께 배양함으로써 시각화하였다. 염색된 샘플은 명시야 현미경을 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 파킨슨병 환자의 도파민 신경세포(Neuromelanin positive cell, Brown)에서 AEG-1(Blue)의 발현을 확인하였으며, 대조군에 비해 파킨슨병 환자에서 AEG-1의 발현이 감소함을 확인하였다.

3-2. 웨스턴 블랏

상기 실시예 3-2의 파킨슨병 환자의 뇌 조직을 이용하여, 종래 공지된 방법에 따라 웨스턴 블랏을 수행하였다. 1차 항체로는 mouse anti-β-actin(1:5000; Abcam, Cambridge, UK) 및 rabbit anti-AEG-1(1:500; Invitrogen)을 이용하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 파킨슨병 환자의 중뇌 흑질에서 대조군에 비해 AEG-1 단백질 양이 감소함을 확인하였다.

이상의 실험 결과를 통하여, 파킨슨병 환자의 중뇌 흑질에서 AEG-1 단백질의 양이 현저하게 감소하며, AAV를 이용하여 AEG-1 유전자를 도입시킬 경우 도파민 신경세포의 보호 및 파킨슨병에 대한 치료 효과가 우수함을 확인하였다.

이하 본 발명의 약학적 조성물 및 식품 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 약학적 조성물의 제조

1-1. 산제의 제조

AEG-1 단백질 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

1-2. 정제의 제조

AEG-1 단백질 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

1-3. 캡슐제의 제조

AEG-1 단백질 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 2. 식품 조성물의 제조

2-1. 건강식품의 제조

AEG-1 단백질 100 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 g

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 g

비타민 C 10 mg

비오틴 10 g

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 g

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Composition comprising AEG-1 for preventing or treating Parkinson's disease <130> 196 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 582 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ala Arg Ser Trp Gln Asp Glu Leu Ala Gln Gln Ala Glu Glu 1 5 10 15 Gly Ser Ala Arg Leu Arg Glu Met Leu Ser Val Gly Leu Gly Phe Leu 20 25 30 Arg Thr Glu Leu Gly Leu Asp Leu Gly Leu Glu Pro Lys Arg Tyr Pro 35 40 45 Gly Trp Val Ile Leu Val Gly Thr Gly Ala Leu Gly Leu Leu Leu Leu 50 55 60 Phe Leu Leu Gly Tyr Gly Trp Ala Ala Ala Cys Ala Gly Ala Arg Lys 65 70 75 80 Lys Arg Arg Ser Pro Pro Arg Lys Arg Glu Glu Ala Ala Ala Val Pro 85 90 95 Ala Ala Ala Pro Asp Asp Leu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Arg Ser Glu 100 105 110 Glu Gln Lys Lys Lys Asn Arg Lys Lys Leu Ser Glu Lys Pro Lys Pro 115 120 125 Asn Gly Arg Thr Val Glu Val Ala Glu Gly Glu Ala Val Arg Thr Pro 130 135 140 Gln Ser Val Thr Ala Lys Gln Pro Pro Glu Ile Asp Lys Lys Asn Glu 145 150 155 160 Lys Ser Lys Lys Asn Lys Lys Lys Ser Lys Ser Asp Ala Lys Ala Val 165 170 175 Gln Asn Ser Ser Arg His Asp Gly Lys Glu Val Asp Glu Gly Ala Trp 180 185 190 Glu Thr Lys Ile Ser His Arg Glu Lys Arg Gln Gln Arg Lys Arg Asp 195 200 205 Lys Val Leu Thr Asp Ser Gly Ser Leu Asp Ser Thr Ile Pro Gly Ile 210 215 220 Glu Asn Thr Ile Thr Val Thr Thr Glu Gln Leu Thr Thr Ala Ser Phe 225 230 235 240 Pro Val Gly Ser Lys Lys Asn Lys Gly Asp Ser His Leu Asn Val Gln 245 250 255 Val Ser Asn Phe Lys Ser Gly Lys Gly Asp Ser Thr Leu Gln Val Ser 260 265 270 Ser Gly Leu Asn Glu Asn Leu Thr Val Asn Gly Gly Gly Trp Asn Glu 275 280 285 Lys Ser Val Lys Leu Ser Ser Gln Ile Ser Ala Gly Glu Glu Lys Trp 290 295 300 Asn Ser Val Ser Pro Ala Ser Ala Gly Lys Arg Lys Thr Glu Pro Ser 305 310 315 320 Ala Trp Ser Gln Asp Thr Gly Asp Ala Asn Thr Asn Gly Lys Asp Trp 325 330 335 Gly Arg Ser Trp Ser Asp Arg Ser Ile Phe Ser Gly Ile Gly Ser Thr 340 345 350 Ala Glu Pro Val Ser Gln Ser Thr Thr Ser Asp Tyr Gln Trp Asp Val 355 360 365 Ser Arg Asn Gln Pro Tyr Ile Asp Asp Glu Trp Ser Gly Leu Asn Gly 370 375 380 Leu Ser Ser Ala Asp Pro Asn Ser Asp Trp Asn Ala Pro Ala Glu Glu 385 390 395 400 Trp Gly Asn Trp Val Asp Glu Glu Arg Ala Ser Leu Leu Lys Ser Gln 405 410 415 Glu Pro Ile Pro Asp Asp Gln Lys Val Ser Asp Asp Asp Lys Glu Lys 420 425 430 Gly Glu Gly Ala Leu Pro Thr Gly Lys Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys 435 440 445 Lys Lys Lys Gln Gly Glu Asp Asn Ser Thr Ala Gln Asp Thr Glu Glu 450 455 460 Leu Glu Lys Glu Ile Arg Glu Asp Leu Pro Val Asn Thr Ser Lys Thr 465 470 475 480 Arg Pro Lys Gln Glu Lys Ala Phe Ser Leu Lys Thr Ile Ser Thr Ser 485 490 495 Asp Pro Ala Glu Val Leu Val Lys Asn Ser Gln Pro Ile Lys Thr Leu 500 505 510 Pro Pro Ala Thr Ser Thr Glu Pro Ser Val Ile Leu Ser Lys Ser Asp 515 520 525 Ser Asp Lys Ser Ser Ser Gln Val Pro Pro Ile Leu Gln Glu Thr Asp 530 535 540 Lys Ser Lys Ser Asn Thr Lys Gln Asn Ser Val Pro Pro Ser Gln Thr 545 550 555 560 Lys Ser Glu Thr Ser Trp Glu Ser Pro Lys Gln Ile Lys Lys Lys Lys 565 570 575 Lys Ala Arg Arg Glu Thr 580 <210> 2 <211> 1746 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atggctgcac ggagctggca ggacgagctg gcccagcagg ccgaggaggg ctcggcccgg 60 ctgcgggaaa tgctctcggt cggcctaggc tttctgcgca ccgagctggg cctcgacctg 120 gggctggagc cgaaacggta ccccggctgg gtgatcctgg tgggcactgg cgcgctcggg 180 ctgctgctgc tgtttctgct gggctacggc tgggccgcgg cttgcgccgg cgcccgcaaa 240 aagcggagga gcccgccccg caagcgggag gaggcggcgg ccgtgccggc cgcggccccc 300 gacgacctgg ccttgctgaa gaatctccgg agcgaggaac agaagaagaa gaaccggaag 360 aaactgtccg agaagcccaa accaaatggg cggactgttg aagtggctga gggtgaagct 420 gttcgaacac ctcaaagtgt aacagcaaag cagccaccag agattgacaa gaaaaatgaa 480 aagtcaaaga aaaataagaa gaaatcaaag tcagatgcta aagcagtgca aaacagttca 540 cgccatgatg gaaaggaagt tgatgaagga gcctgggaaa ctaaaattag tcacagagag 600 aaacgacagc agcgtaaacg tgataaggtg ctgactgatt ctggttcatt ggattcaact 660 atccctggga tagaaaatac catcacagtt accaccgagc aacttacaac cgcatcattt 720 cctgttggtt ccaagaagaa taaaggtgat tctcatctaa atgttcaagt tagcaacttt 780 aaatctggaa aaggagattc tacacttcag gtttcttcag gattgaatga aaacctcact 840 gtcaatggag gaggctggaa tgaaaagtct gtaaaactct cctcacagat cagtgcaggt 900 gaggagaagt ggaactccgt ttcacctgct tctgcaggaa agaggaaaac tgagccatct 960 gcctggagtc aagacactgg agatgctaat acaaatggaa aagactgggg aaggagttgg 1020 agtgaccgtt caatattttc tggcattggg tctactgctg agccagtttc tcagtctacc 1080 acttctgatt atcagtggga tgttagccgt aatcaaccct atatcgatga tgaatggtct 1140 gggttaaatg gtctgtcttc tgctgatccc aactctgatt ggaatgcacc agcagaagag 1200 tggggcaatt gggtagacga agaaagagct tcacttctaa agtcccagga accaattcct 1260 gatgatcaaa aggtctcaga tgatgataaa gaaaagggag agggagctct tccaactggg 1320 aaatccaaaa agaaaaaaaa gaaaaagaag aagcaaggtg aagataactc tactgcacag 1380 gacacagaag aattagaaaa agagattaga gaagaccttc cagtgaatac ctctaaaacc 1440 cgtccaaaac aggaaaaagc tttttccttg aagaccataa gcactagtga tccagccgaa 1500 gtactcgtca aaaatagcca gcctatcaag actcttccac ctgctacttc taccgagcca 1560 tctgtaatct tatcaaaaag tgattctgac aagagctctt cccaagtgcc gccaatacta 1620 caagagacag ataaatccaa gtcaaatacc aagcaaaata gtgtgcctcc ttcacagacc 1680 aagtctgaaa ctagctggga atctcccaaa caaataaaaa agaagaaaaa agccagacga 1740 gaaacg 1746

Claims

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 벡터에 포함된 것을 특징으로 하는, 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 및 재조합 바이러스성 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 재조합 바이러스성 벡터는 AAV(Adeno-associated virus)인 것을 특징으로 하는, 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 단백질 또는 AEG-1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 파킨슨병의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
1) AEG-1(astrocyte elevated gene-1) 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 세포주에서 AEG-1의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 AEG-1의 발현 또는 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
제8항에 있어서, 상기 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 방법(DNA chip technology)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법인 것을 특징으로 하는, 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
제8항에 있어서, 상기 활성 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 방법(protein chip technology)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법인 것을 특징으로 하는, 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.