JPH08506506A

JPH08506506A - 細胞誘導デバイス

Info

Publication number: JPH08506506A
Application number: JP6518373A
Authority: JP
Inventors: グロワッキ，ジュリ; ミズノ，シュウイチ
Original assignee: ブリガーム・アンド・ウーメンズ・ホスピタル・インコーポレーテッド
Priority date: 1993-02-12
Filing date: 1994-02-10
Publication date: 1996-07-16
Also published as: WO1994018307A1; US5656492A; AU6137994A

Abstract

(57)【要約】本発明は細胞分化を誘導するためのデバイスと方法とに関する。本発明の１実施態様は内面と外面とを有する壁を含むデバイスに関する。この内面は室を画定する。外面は生物学的組織と接触して配置されることができる。壁は誘導物質を受容するために室と連通し、この誘導物質を含むために室を閉鎖する開口を有する。この壁は分化できる細胞を受容することができる、生物学的に適合性で、透過性物質を含む。このデバイスを用いて、誘導物質を生物学的環境に含めて、この室に細胞を受容することができる。細胞派この誘導物質の存在下で分化することができる。

Description

【発明の詳細な説明】細胞誘導デバイスこの研究は国立衛生研究所（ＪＧへの助成金＃ＣＡ４５５４８）によって一部支援されたものである。米国政府は本発明にある程度の権利を有しうる。発明の背景１つの表現型の細胞が１種以上の成長及び分化因子（growth and differentia tion factors）の存在下で他の表現型に形質転換されるときに、分化転換又は誘導が生ずる。１つの例は脱塩された骨粉に対する結合組織の反応である。脱塩された骨粉の存在下で、結合組織細胞は軟骨芽細胞（chondroblast）に転化して、軟骨マトリックスを生成し、この軟骨マトリックスが骨によって再吸収されて、骨によって代わられる。分化転換の研究に用いられるデバイスは、必要な成長及び分化因子のため及びこれらの因子によって作用される細胞のためのサポートとしての半透膜に、しばしば基づくものであった。これらの半透膜は、生体内（in vivo）に移植されたときに、しばしば被験者（subject）に炎症反応を誘導する。さらに、成長及び分化因子の能力と、この活性を調節する他の分子とを試験するように設計された生体内分析はしばしば費用がかかり、複雑で非能率的であり、かつ時間を要する。さらに、以前の培養デバイスは成長及び分化因子のサポート表面への分散に関連した問題を欠点として有する。これらの因子は、サポート中のレベルが低すぎて所望の効果を生ずることができないので、効果的ではない。その結果、分化転換を促進するための試験管内（in vitro）系と、分化転換を誘導するように設計された生体内インプラントは一般に効果的ではなかった。発明の概要本発明は細胞分化を誘導するためのデバイスと方法とに関する。本発明の１実施態様は内面と外面とを有する壁を含むデバイスに関する。内面は室を画定する。外面は生物学的組織と接触して配置されることができる。この壁は、誘導物質（induction material）を受容する室に連通し、誘導物質を含む室を閉鎖するための開口を有する。この壁は生物学的に適合性の透過性物質を含み、分化可能な細胞を受容することができる。誘導物質を生物学的環境に含め、室に細胞を受容するために、このデバイスを用いる。細胞を誘導物質の存在下で分化させる。デバイスの好ましい１実施態様では、壁と開口とが第１壁区分（wall section ）と第２壁区分とを含む。第１壁区分は誘導物質を受容するための室領域（cham ber area）と、周縁領域（peripheral edge area）とを有する。第２壁区分は第１壁区分の周縁領域によって受け入れられて、室を形成することができる協同作用（cooperating）周縁領域を有する。本発明のデバイスの１実施態様はサポートに関する。このサポートは第１及び第２壁区分の周縁領域と係合して、縁領域を閉鎖し、取り扱いを容易にする。サポートは好ましくはハウジングを含む。このハウジングは内面と外面とを有する。この内面は第１及び第２壁区分と係合する溝を有するキャビティを画定する。この溝が間隔を置いて内側に突出する協同作用フランジによって画定されることが好ましい。好ましくは、ハウジングは２つの端部を有する。少なくとも１つの端部はハウジングを平たい表面上に安定に載せるために平縁（planar edge）を有する。ハウジングが平縁上に在るときに該キャビティを外面における環境と流体連通させるように、ハウジングは外面から内面に達する流路（conduit）を有する。前記平縁とは反対側の縁は露出しており、細胞及び他の物質を壁の外面に付着させることができる。本発明の細胞誘導デバイスの１つは、構造マトリックス物質の第１層及び第２層を含むラミネートを有する。各層は外側及び内側の周辺面（peripheral surfa ce）を有する。第１層及び第２層の各々の内側周辺面は向かい合う関係で（in f acing relationship）相互に係合する。内側周辺面のこのような係合は２層の間に室を画定する。この室は構造マトリックス物質を実質的に含まない。係合した周辺面はラミネートの外周（outer periphery）の周囲に伸びるシームを画定する。１種以上の細胞の成長及び／又は分化を誘導することができる基質（substrat e）を室内の基質密度を最適にするために充分な量で室内に分配する。ラミネートは好ましくは透過性かつ基質と生体適合性である。基質は好ましくは、１種以上の細胞の分化転換を誘導することができる物質である。最も好ましくは、基質は骨原性物質である。本発明の特に好ましい実施態様では、基質は脱塩された骨粉であり、構造マトリックスは例えばコラーゲンのような構造タンパク質である。細胞誘導デバイスはさらに、ラミネートのためのサポートを含むことができ、このサポートはラミネートの周辺シームと係合する。支持構造は対立する端部を有する環状カラーであり、ラミネートの周辺シームはこの環状カラーの内側周辺面に結合する。最も好ましくは、ラミネートシームはカラーの対立する端部の間に結合する。カラーの１端部は培養培地（すなわち、例えば結合組織のような、培養すべき細胞）をカラーの内部に移動させるための複数の流路を有する。本発明は被験者に移植するためのデバイスを含む。このデバイスは透過性構造マトリックスの第１層と第２層とを含むラミネートを有する。各層は外側及び内側の周辺面を有し、第１層及び第２層の各々の内側周辺面は向かい合う関係で共に係合して、構造マトリックスを含まない、実質的に中空の室を画定する。この室内には、ラミネートと接触する１種以上の細胞に対する誘導活性を有する基質を配置する。複数個の誘導された細胞がこのラミネートと係合するが、前記細胞の一部はデバイスのインプランテーション（implantation）前に既に誘導されている。本発明はまた、細胞の誘導活性（inductive activity）を分析する方法にも関する。この方法は構造マトリックス物質の第１層と第２層とを含むラミネートを用意する工程を含み、各層は外側及び内側の周辺面を有する。第１層及び第２層の各々の内側周辺面は向かい合う関係で相互に係合して、マトリックスを実質的に含まない、実質的に中空の室を画定する。基質を室中に配置し、基質の存在下で誘導されることができる細胞と基質とを接触させる。細胞が基質によって誘導される（すなわち、成長及び／又は分化する）ために充分な時間、これらの細胞の存在下でラミネートをインキュベートする。この方法はまた、少なくとも１種の細胞成長因子及び／又は１種のグリコソアミノグリカンをラミネートに加えることを含む。好ましくは、基質は脱塩された骨粉である。本発明はまた、本発明のデバイスの製造方法にも関する。この方法は、対立する端部を有する管を含む型（mold）を用意する工程を含む。構造マトリックス物質の第１溶液を管型の底部に入れ、凍結させる。スペーサーを凍結マトリックスの頂部に載せるが、マトリックスの小さい非被覆周縁を露出して残させる。スペーサーとマトリックスとを再度凍結させ、第２回量の構造マトリックス物質をスペーサーの頂部に付着させる。第２スペーサーを第２構造マトリックス物質上に載せ、型全体を凍結乾燥させる。凍結乾燥後に、スペーサーを注意深く構造マトリックスから除去し、第１層と第２層とを含むラミネートを製造する、これらの層の各々は外側及び内側の周辺面を有する。スペーサーはラミネート上により緻密な不透性層が形成されるのを防止する。各層シートの内側周辺面は向かい合う関係で係合して、周辺シームを画定する。このラミネートは実質的に構造マトリックス物質を含まない中空室を画定する。ラミネートの層間に基質を配置する。サポート中の受容手段をラミネートの周辺シームと係合させることによって、基質を含むラミネートは所望によりサポートと係合する。図面の簡単な説明図１は本発明のラミネートの概略断面図であり；図２は本発明のラミネートを製造するための方法及び装置の概略断面図であり；図３はサポートデバイスと係合した、本発明のラミネートの概略断面図である。発明の詳細な説明本発明は三次元ラミネートと、三次元細胞誘導デバイスのフレームワークとしてのその使用とに関する。このデバイスは、既述した系よりも大きな程度に、生体内に存在する生理的条件を模倣する。このデバイスは異なる種類の細胞の成長に適用可能であり、骨及び結合組織に限定することなく、多くの種々な組織の形成に適用可能である。このデバイスは多様な用途を有する。例えば、デバイスを試験管内状態から生物（living organism）の生体内に移植するか、又は直接生物に移植することができる。或いは、増殖する細胞を移植のためにデバイスから単離することができる。また、細胞毒性の試験及び化合物のスクリーニング（screening）のためにデバイスを試験管内で用いることもできる。さらに他の用途では、デバイスを“ バイオリアクター（bioreactor）”として用いて、細胞産物を多量に生成することができる。本発明によると、１個以上の標的細胞の誘導を促進することができる基質を、予め確立した三次元ラミネート構造体の室中に配置する。“誘導”なる用語は標的細胞の成長及び／又は分化を意味し；特に、“誘導性（inductive）”なる用語は、例えば間充織細胞（例えば、繊維芽細胞）の軟骨生成軟骨芽細胞への表現型形質転換（phenotypic transformation）のような分化転換プロセスを促進することができる基質を意味する。本明細書でさらに詳しく述べる、付加的な細胞及び／又は要素を含む又は含まない三次元ラミネートによって、室が形成される。ラミネートの物質は三次元培養系における多くの種々な細胞及び組織の成長を支持することができる。ひと度形成されると、この三次元ラミネート内に基質が配置される。このラミネートに他の成長及び調節因子を加えることもできる。図１に関しては、本発明のラミネートを示す。ラミネート１０は構造マトリックス物質の第１層１２と第２層１４とを含む。“マトリックス”なる用語は、目視的に均質であることができるが、好ましくは粒状、フィブリル状及び／又は繊維状の構造である物質を意味する。第１層及び第２層の各々は、それぞれ、外側周辺面１６、１８を有する。各層はそれぞれ内側周辺面１７、１９を有する。第１層及び第２層の内側周辺面１７、１９は向かい合う関係で共に係合して、シーム２１を形成する。シーム２１はラミネートの全周の周囲に実質的に伸びる。表面１７と１９との間に実質的な中空室２０が形成され、室２０は構造マトリックス物質を実質的に含まない。室２０内には基質２２を配置する。基質２２は１種以上の細胞（図示せず）の成長及び／又は分化を誘導することができる。本発明の構造マトリックスは使用環境に対して透過性である。“透過性”とは、ラミネートが物質（例えば、標的細胞、標的細胞フラグメント、血管、体液（ bodily fluid））の浸入及び排出を、これらの物質を特定の分子量又はサイズに限定することなく、可能にすることを意味する。この性質は、分子量及び／又はサイズに応じて識別する周知の半透膜又は選択的半透膜とは区別されるべきである。本発明のラミネートの透過性性質（permeable nature）は、生体内状態を模倣するラミネート内微小環境（microenvironment）の発生を促進する。本発明のラミネートは基質と生体適合性でもなければならない。通常の細胞培養デバイスは、特にそれらが生体内に移植される場合には、典型的にインプラントであり、細胞又は細胞産物がインプラントから放出されて遠隔標的に作用する。これらの構造体の生体適合性は、７日後に、炎症細胞（すなわち、泡沫細胞、多形核白血球、マクロファージ等）の有無に関してインプラントを分析することによって試験する。この分析が陰性（すなわち、インプラント中に炎症細胞が存在せず）であるならば、このインプラント物質は生体適合性であると見なされる。これとは対照的に、本発明のラミネートはラミネート自体の中で標的細胞が誘導されることを必要とするので、標的細胞に対する基質の作用は遠隔作用ではない。本発明に関連して、“生体適合性”なる用語の意味は厳密であり、ラミネートが基質の生物学的結合性（biological integrity）を維持できることを意味する。したがって、生体適合性ラミネートは（i）例えば血管のような構造体を誘引する又は１種以上の細胞を誘導する基質の能力を直接阻害しない；及び／又は（ii）１種以上の細胞を誘引又は誘導する基質の能力を炎症細胞が危険にさらす（compromise）ことを防止するものでなければならない。特に、本発明の好ましいラミネートは、多形核白血球の一過性浸潤が生体内で２日後に観察されないならば、基質について生体適合性と見なされる。特定のラミネートの生体内での生体適合性は、ラミネートと封入される基質とを用意して、このラミネートを炎症細胞の存在に関して組織学的に検査し、この組織学的検査を誘導性活性の分析と相互に関連させることによって容易に試験することができる。中空室内への基質の配置は構造マトリックス物質自体の全体に基質を均質に分散させるよりも非常に長期間、培養中の細胞の活発な増殖と分化を持続させる。出願人は発明が作用する機構を説明する義務又は責任を課せられないが、これにはこの三次元培養に固有の幾つかの要素が寄与すると考えられる：（ａ）室が生体模倣的な（biomimetic）基質の空間分配を可能にする（すなわち、基質分配が生体内の対応（counterpart）組織に見られる基質分配に類似する）。（ｂ）室中の粒状基質の可能な容積（volume）の増加が、細胞の成長及び／又は分化を助成する粒状基質充填密度の確立を可能にする。すなわち、室中の細胞と基質とのより大きい充填を可能にすることによって、室内の粒状基質の配置が細胞−基質の相互作用を最適にすることができると考えられる。（ｃ）分化した細胞表現型の維持（maintenance）は、成長／分化因子の産生のために有利な微小環境を必要とすることが認識されている。本発明のデバイスが適当な細胞相互作用に適した、この微小環境を提供すると考えられる。（ｄ）ラミネートは流体、細胞又は他の構造体（例えば、血管）の室中への浸透（infiltration）を妨害する不透性部分を有さない。ラミネートマトリックスは：（ａ）細胞のそれへの結合を可能にする（又は細胞のそれへの結合を可能にするように改質されることができる）；及び（ｂ）層の内側周辺面が向かい合う関係で共に、接着剤、賦形剤又は他の添加物の使用なしで、シール又はアニールされて、室を画定する複数の層として形成されることができる、任意の物質であることができる。本発明のラミネートには幾つかの物質が適する。好ましいラミネートは：（ｉ）中性に近い又は中性よりも大きい生体内ｐＨ（約７．０〜約８．０）を有するべきである。この性質は例えばポリグリコリド又はポリラクチドのような生体腐食性（bioerodible）ポリマーを、これらのポリマーは生体内に移植されたときに酸性になると思われるので、排除する傾向がある。これらのポリマーの酸性度はラミネート内への繊維芽細胞の移行及び軟骨への分化を妨害する；（II）半透性及び／又は選択的半透性であるよりもむしろ、透過性であるべきである；（iii）試験管内及び生体内において基質と生体適合性であるべきである。限定する訳ではなく、無機物（例えば、ヒドロキシアパタイト、アラゴナイト）、セラミック、ガラス、ダクロン（ポリエステル）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ；テフロン）、ニトロセルロース、綿、セルロース、ゼラチン、デキストラン等を含めた、幾つかの透過性物質を用いて、マトリックスを形成することができる。これらの物質が上記必要条件を満たすならば、これらの物質のいずれもラミネートに形成することができる。しかし、本発明のラミネートを形成するための最も好ましい物質は例えばエラスチンファイバー（elastin fiber）、フィブロネクチン、ラミニン等のような構造タンパク質である。ラミネートを形成するための特に好ましい物質は、凍結乾燥時に多孔度を維持し、生体内で炎症性でないように処理されたコラーゲンである。５種類のコラーゲン：繊維芽細胞、骨、デンティン（dentin）及び結合組織中に存在するＩ型；ヒアリン及び弾性軟骨中に存在するＩＩ型；血管中に存在するＩＩＩ型；基底膜中に存在するＩＶ型；及び骨、平滑筋及び胎児膜（fetal memb rane）中に存在するＶ型が知られている。Ｉ型が本発明のラミネートに好ましい。他の細胞及び以下に述べる要素の有無に拘わらず、１種以上の細胞の成長及び／又は分化を誘導することができる基質を室中に配置する。基質は、生検（必要な場合）又は剖検時に得ることができる細胞又は組織に由来するものであることができる。基質は１種類以上の細胞の成長及び／又は分化を誘導することができる物質である。このカテゴリーの一般的な基質は、限定する訳ではなく、（ｉ）骨原性；（ii）血管形成性（angiogenic）；（iii）脂肪形成性（adipogenic）；又は（iv）血液生成性の基質を含む。これらの各特性を有する、特定の基質は：（ｉ）例えば繊維芽細胞のような間充織細胞を誘導して軟骨芽細胞を形成することができる脱塩骨粉（ＤＢＰ）；（ii）血管形成を誘導することができる硫酸ヘパラン（heparan sulfate）；（iii）繊維芽細胞を脂肪組織に転化させることができるステロイド産生細胞；及び（iv）標的細胞を血管細胞に転化させることができる骨髄結合組織細胞の細胞外マトリックスを含む。基質は室内のその充填密度を最適にするように選択された濃度を有する。基質の充填密度はその誘導能力を決定する上で重要である。繊維芽細胞の軟骨芽細胞への分化はしばしば、ＤＢＰの隣接粒子の間で生ずる。直径約３／８”のラミネートに対しては、約１０ｍｇのＤＢＰが最適である。当業者は他の基質の最適量を、基質量とその基質の誘導能力との間の関係を分析することによって、容易に知ることができる。ＤＢＰの場合には、各ＤＢＰ粒子が隣接ＤＢＰ粒子と物理的に接触することを確認することによって、充填密度は目視的に最適化される。培養中の長期間成長及び／又は分化を支持するために、基質以外の他の物質をラミネートに加えることができる。例えば、ルーズな（loose）結合組織中に存在する細胞をラミネート中に接種することができる。このような細胞は、限定する訳ではなく、内皮細胞、周皮細胞、マクロファージ、単核細胞、形質細胞、マスト細胞、脂肪細胞、骨芽細胞及び骨髄間質細胞を含む。これらの細胞は、技術上周知の方法を用いて、例えば皮膚、肝臓等のような、適当な器官から容易に得ることができる。他の細胞は原核生物細胞、真核生物細胞及び組み換え処理細胞（ recombinantly engineered cell）を含むことができる。基質の存在下での細胞の成長は、ラミネートに糖タンパク質（例えば、骨形態形成性（bone morphogenic）タンパク質）、グリコサミノグリカン（例えば、硫酸ヘパラン、コンドロイチン−４−スルフェート、コンドロイチン−６−スルフェート、硫酸デルマタン、硫酸ケラタン等）、細胞マトリックス及び／又は他の物質を加えることによって、さらに促進させることができる。成長因子の添加を用いて、培養物中の増殖と細胞成熟とを促進、変更又は調節することができる。培養中の細胞の成長及び活性は、例えば血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスホーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、インシュリン、成長ホルモン、ソマトメジン、コロニー刺激因子、エリスロポイエチン、上皮増殖因子、肝臓造血因子（ヘパトポイエチン）及び肝細胞増殖因子のような、多様な成長因子によって影響される可能性がある。増殖及び／又は分化を調節する他の因子は、ステロイド、プロスタグランジン、インターロイキン、ビタミン及び自然生成（natura lly occuring）ケイロンを含む。例えば、繊維芽細胞又は骨髄細胞の分化転換をステロイドによって調節して、繊維芽細胞又は骨髄細胞を軟骨細胞ではなく脂肪細胞に形質転換させることができる。ラミネートによって形成される室中に基質を配置した後に、基質の影響下で成長及び／又は分化することができる１種以上の細胞を含む、適当な栄養培地中でラミネートをインキュベートする。例えばＲＰＭＩ１６４０、フィッシャー培地（Fisher's）、イスコブ培地（Iscove's）、マッコイ培地（McCoy's）等のような、多くの商業的に入手可能な培地が使用に適切である。増殖及び／又は分化活性を最大にするために、インキュベーション期間中に培地中にラミネートを懸濁又は浮遊させることができる。さらに、消費された培地を除去し、放出された細胞を取り出し（depopulate）、新たな培地を加えるために、培養物を定期的に供給すべきである。室内に配置される特定の基質に依存して、広範囲な細胞をラミネート中に導入することができる。例えば、ＤＢＰが封入基質である場合には、繊維芽細胞を用意して、ラミネートに加える。繊維芽細胞の供給源として役立つことができる適当な器官又は組織を分解する（disaggregate）することによって、繊維芽細胞を容易に単離することができる。このことは、当業者に周知の方法を用いて、容易に実施することができる。例えば、組織又は器官を機械的に分解して、及び／又は隣接細胞の間の結合を弱める消化酵素及び／又はキレート化剤によって処理して、細胞の知覚しうる破壊なしに、組織を個々の細胞の懸濁物に分散させることができる。組織を細かく刻み、この刻んだ組織を幾つかの消化酵素のいずれかの単独又は組合せによって処理することによって、酵素分解を実施することができる。これらの酵素は、限定する訳ではなく、トリプシン、キモトリプシン、コラーゲナーゼ、エラスターゼ及び／又はヒアルロニダーゼ、ＤＮアーゼ、プロナーゼ、ディスパーゼ等を含む。機械的破壊も、限定する訳でなく、若干のみを挙げても、グラインダー、ブレンダー、シーブ（siave）、ホモジナイザー、プレッシャーセル（pressure cell）、又はインソネーター（insonator）を含む、幾つかの方法によって実施することができる。組織分解方法の概観に関しては、フレッシュネイ（Freshney），ＣｕｌｔｕｒｅｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ，ＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅ，第２版，Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ニューヨーク，１９８７，第９章，１０７〜１２６頁を参照のこと。本発明の独特の特徴は、本発明の層状細胞培養デバイスの製造に用いる方法と装置である。不活性なエラストマー（すなわち、タイゴン（Tygon）（登録商標）チューブ（tubing））から製造された型を用意する。図２は、製造プロセスの中間工程における好ましい型とラミネートとを説明する。型３０は対立する端部３４、３６を有する実質的に環状のカラー３２である。型を製造するために、３／８”タイゴン（登録商標）チューブを約１ｃｍピース（piece）に切断する。組織培養皿３１上にチューブを例えばメディカルアドヘシブシリコン（Medi cal Adhesive Silicon）（ＤｏｗＣｏｒｎｉｎｇ）によって接着することによって、チューブの１端３６を閉鎖する。型を乾燥させる。型３０の閉鎖端部３６に構造タンパク質（すなわち、コラーゲンマトリックス）の第１溶液３８（数百μｌまで）を供給することによって、好ましいラミネートを形成する。本発明の好ましいラミネート構造体には８０〜２００μｌの構造タンパク質溶液が最適である。次に、型を凍結する。スペーサー４０（好ましくは、湿った紙）を凍結マトリックス３８の頂部に載せるが、マトリックスの周縁は露出させて残す。スペーサー４０とマトリックス３８とを再び凍結させ、第２量の構造タンパク質マトリックス４２（数百μｌまで）をスペーサー４０の頂部上に配置する。第２スペーサー４４を第２構造タンパク質マトリックス４２上に載せる。第２マトリックスの周縁は露出させて残す必要はない。型全体を凍結乾燥させる。凍結乾燥後に、スペーサーを構造タンパク質マトリックスから注意深く除去する。層の内側周辺面は凍結乾燥操作中に自然にシール又はさもなくばアニールして、シームを形成し、構造マトリックス物質を実質的に含まない、実質的に中空の室を画定する。このシームはラミネートの全外周の周囲に実質的に伸びる（図１参照）。スペーサーの使用は、凍結乾燥中に典型的に形成される、タンパク質の不透性の緻密なシェルの発生を除く。凍結乾燥はラミネートの取り扱い及び充填を容易にするために充分な強度をラミネートに与える。ラミネートの形成後に、室に基質を充填する。好ましい基質は大腿骨及び脛骨の皮質切片（すなわち、ラット）から製造された脱塩骨粉である（実施例１参照）。骨をアルコール溶剤（すなわち、エタノール）及びエーテル溶剤によって抽出する。脱水した骨を凍結させ、例えば液体窒素衝撃ミル（impacting mill）（ＳｐｅｘＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ニュージャーシー州，メツヘン）中で微粉状にする。骨片をふるい分けし、好ましくは７５〜２５０μｍの画分（fraction）として回収する。無機物抽出は酸（すなわち、０．５ＨＣｌ）によって室温において数時間実施する。最終乾燥は上述したように溶剤洗浄によって実施する。必要なら、基質を含むラミネートをサポートデバイスに固定する。サポートデバイスは製造型に幾つかの特徴を加えたものと実質的に同じである。図３は基質２２を室２０中に配置した後のサポート５０を説明する。３／８” タイゴンチューブの１端５４中に複数の流路５２が開けられている。これらの流路はサポートの外部からの培養流体（culture fluid）の浸入を可能にする。サポート５０の反対端部５５は標的細胞（図示せず）を受容し、ラミネートの周辺面１６と、サポート５０の内周６０と、端部５５とによって画定される空間５７は、好ましくは、標的細胞が浸透し、ラミネート中に移行するように、標的細胞の容器として役立つ。１対の対立フランジ５６、５８又はシリコンＯ−環をサポート５０の内周６０上に配置する。フランジ５６、５８は相互に向かい合う関係にある。サポート５０の内周６０上の対立フランジはラミネートの周辺シーム２１を収容する。好ましくは、シリコンチューブ（直径約３／８”、肉厚１／１６”、長さ１．５ｍｍ）を用いて、フランジを形成する。サポート５０の内周６０上の適所に取り付ける。基質を充填したラミネートを含むサポートは、１種以上の細胞の移行、成長及び分化のための安定な容器及びプラットフォームを提供するために、試験管内細胞培養の予備段階に用いることができる。本発明の方法を用いて、多様な他のラミネート形状を製造することができることは理解されるであろう。例えば、幾つかのスペーサーと、３層以上の構造マトリックス物質とを用いて、多重室ラミネートを容易に製造することができる。各室には同じ又は異なる基質を装入することができる。本発明のデバイスは多様な用途に使用可能である。これらの用途は、限定する訳ではなく、若干のみを挙げると、生体内でのラミネートの移植又はインプランテーション；試験管内における分化誘導因子、細胞毒性化合物、アレルゲン、成長／調節因子、薬剤化合物等のスクリーニング；薬物及び／又は成長因子が作用する機構の研究；及び生物学的に活性な産物の生成を含む。被験者（すなわち、動物、好ましくはヒトを含む哺乳動物）中に生体内移植又はインプランテーションのために、関係する組織の種類に依存して、ラミネートから得られた細胞又はラミネート全体のいずれかを移植することができる。例えば、三次元骨培養物を長期間試験管内に維持することができ；これらの培養物から単離した細胞を移植に用いることができる、或いはラミネート全体を移植することができる。既存組織に代用する若しくは既存組織を増大させるため、新しい若しくは変化した組織を導入するため、人工プロテーゼを調節する（modify）ため、又は生物学的組織若しくは構造体を共に結合させるために、三次元組織培養物インプラントを、本発明によって、用いることができる。例えば、但し限定する訳ではなく、本発明の特定の実施態様は（ｉ）被験者からの細胞（すなわち、ヒト皮膚生検サンプルからの繊維芽細胞）の取り出し、これらの細胞の試験管内誘導による軟骨芽細胞の形成、及び化学療法による治療中に破壊された骨に代用するために同じ被験者に生体内で用いる三次元骨培養物インプラントの生成；（ii）例えば、治療剤をコードする組み換え遺伝子を表現する軟骨芽細胞の三次元培養物を製造するための、三次元培養物中で成長した細胞の遺伝的変化と、化学療法による治療中に破壊された骨に代用するためのこれらの生体内使用を含む。このデバイスを試験管内で用いて、広範囲な、考えられる（putative）基質及び成長／調節因子をスクリーンすることができる。この目的のために、細胞培養物を試験管内に維持して、誘導活性を有すると考えられる特定の基質に暴露させる。細胞培養物の反応を通常の方法を用いて分析する（実施例１参照）。誘導性活性を調節（すなわち、促進又は抑制）する化合物の能力を、例えば生体染色方法によって、又は例えば全細胞計数（cell count）若しくは示差細胞計数によるラミネートの細胞含量の分析によって評価することもできる。このことは、種類特異的な（type-specific）細胞抗原を限定する（define）抗体を用いる免疫細胞化学的な方法の使用を含む、標準の細胞学的、生化学的及び／又は組織学的方法を用いて達成することができる。このデバイス中で培養された細胞に対する種々な薬物の効果も評価することができる。例えば、骨及び／又は軟骨形成を増大させる薬物は、軟骨芽細胞の培養で試験することができる。本発明のデバイスは、種々な構造マトリックス物質の生体適合性の試験及び評価にも用いることができる。試験すべき物質からラミネートを製造して、このラミネートに特定の基質を装入することができる。基質の誘導能力（inductive ca pacity）に対する種々なラミネート物質の影響は、本明細書に述べる方法を用いて、分析することができる。本発明のデバイスは、生理的又は病的（pathological）状態の研究のためのモデル系として使用可能である。例えば、本発明の特定の実施態様では、骨を通しての物質の浸透を調べるために使用可能な骨系のモデルとして、及び／又は骨分化転換因子の効果を調べるためのモデル系として、ラミネートを用いることができる。増殖した及び／又は分化した細胞の予定の用途に依存して、デバイスに種々な特殊化細胞（specialized cell）を加えることができる。例えば、ある種の単核細胞集団の添加によって又は培養培地への成長因子の添加によって、ラミネート中の骨細胞の長期間成長を促進することができる。このデバイスは、生物学的産物を高い収率で生成するために、試験管内での有用性を有する。例えば、基質の存在下で多量の特定生物学的産物を製造する分化細胞（differentiated cell）をこのデバイスによって増殖させることができ、この産物をラミネート物質内に捕捉し、単離させることができる（例えば、細胞外マトリックス、細胞−表面−結合産物（cell-surface-associated product））。より溶解性の産物（例えば、成長因子、調節因子、ペプチド、ホルモン等）を産生する分化細胞も増殖させることができる。特に、形質転換細胞（transfor med cell）が産物をラミネートマトリックス又は栄養培地中に直接放出する場合には、この産物をラミネートから栄養培地中へ単離することができ、産物をラミネート又は培地から標準の分離方法（例えば、若干のみを挙げると、ＨＰＬＣ、カラムクロマトグラフィー、電気泳動方法）を用いて、容易に単離することができる。それ故、例えば標的細胞の細胞外マトリックス又は細胞−表面−結合産物の産生のために、試験管内のラミネートに供給する連続流動方法（continuous f low method）を利用する“バイオリアクター”を考案することができる。試験管内研究のためのキットは、対象の細胞（cell of interest）の成長及び／又は分化に特異的な基質を室内に配置されてする本発明のラミネート；このラミネートに接種された対象の細胞；及び対象の細胞の成長及び／又は分化に対する所定化合物の効果を評価するための試薬を含む。好ましくは、ラミネートはコラーゲンマトリックスであり、基質はＤＢＰである。他の実施態様では、上記キットは基質を含まないコラーゲンマトリックスと細胞とを含むことができる。ラミネートは凍結乾燥又は凍結状態で販売されることができる。キットは、ラミネートの室に適時に配分するために別の容器に入れた基質を含むことができる。キットはさらに、対象の細胞に対する化合物の効果を評価するための１種以上の試薬を含むことができる。以下の項では本発明の実施例を述べる。限定するためではなく、説明のみのために、本発明のラミネートを基質としてのＤＢＰと、基質によって誘導される細胞としての繊維芽細胞とに基づいて述べる。このデバイスが他の種類の細胞及び基質に対しても使用可能であることは、明白に理解されるであろう。実施例１：繊維芽細胞の軟骨誘導（chondroinduction）材料と方法型／サポート物質の用意医用等級タイゴン（登録商標）チューブ（Ｎｏｒｔｏｎ（オハイオ州，アクロン）によって製造）（内径３／８”、厚さ３／３２”）を１ｃｍ長さに切断する。これらのピースを細胞−培養等級ソープ（soap）によってソニケーター（soni catoｒ）中で洗浄し、次に水道水と蒸留水とによってすすぎ洗いする。これらのピースを包装し（packaged）、１２１℃、１ｋｇ／ｃｍ²圧力において１０分間オートクレーブ処理する。型を形成するために、チューブの片側を６０ｍｍ培養皿に医用等級シリコン接着剤によって接着させる。この型と皿を滅菌フード（st erile hood）内で１２時間乾燥させる。脱塩骨／コラーゲンマトリックス複合体例えばセラゲン（Cellagen）（登録商標）（Ｃａｔ．＃ＰＣ−５−ＩＣＮＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、カリフォルニア州）のような、Ｉ型溶解性コラーゲン溶液をラミネート製造のために用いた。これは子牛真皮から抽出された精製不溶性Ｉ型コラーゲンから成り、このコラーゲン溶液を中和するためにペプシン処理によって可溶化したものである。このコラーゲン溶液に、最終量の約１／１００の１ＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４（最終１０ｍＭ））と、同じ量の１ＭＮａＨＣＯ₃（最終１０ｍＭ）とを加えた。次に、約１２０μｌの０．５％コラーゲン溶液（ＩＣＮＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，イリノイ州）を型に注入して、−２０℃ において凍結した。最終マトリックスの多孔度がコラーゲン濃度の関数であるので、コラーゲン濃度は変化することができる。酢酸中でｐＨ３である０．５％ペプシン消化コラーゲン溶液が最も好ましい。しかし、濃度は０．５％を越えることができるが、０．３％よりも非常に低い濃度は充分に丈夫なコラーゲンマトリックスを生じない。次に、紙を折り畳んだ、湿ったピースを凍結コラーゲンの頂部表面に載せたが、ラミネートの小さい非被覆縁を露出させて残した。凍結後に、さらに１３０μｌの氷冷コラーゲン溶液を凍結コラーゲン上に注入し、再び凍結させた。最後に、この追加コラーゲン上に湿ったティッシュ（tiss ue）を載せて、ラミネート上に緻密なコラーゲンシェルが形成されるのを避けた。凍結乾燥後に、このティッシュをコラーゲンから注意深く除去した。ラミネートの両側にＵＶ光線を３時間照射した。コラーゲンラミネートの層の間に、約１０ｍｇのＤＢＰを挿入して、層の外周をラミネートの周辺面の上下にシリコンフランジが在るようにサポートに固定した（例えば、図３を参照のこと）。脱塩骨粉（ＤＢＰ）は標準プロトコールに従って製造した。簡単には、例えば牛からの骨幹（diaphyseal）の骨のような、哺乳動物の骨から筋肉及び脂肪を除去し、骨膜を除き、圧力と冷水とによって骨髄を除去し（demarrowed）、乾燥させ、大型ミルでの破砕と微粉砕によって微粉状化する（fragmented）。液体窒素を用いることによって、加熱を防止するように注意する。微粉状骨を約７５〜２５０ミクロンの粒度に磨砕する。次に骨粉を４℃において２０倍量の０．５ＮＨＣｌ約２４時間脱塩する。８時間毎に酸を除去し、新たな酸を加える。この粉末を次に多量の水によって、洗液（wash solution）が中性ｐＨを有するまで、洗浄する。脱塩骨粉をさらに３倍量のクロロホルムとメタノール（３：１）によって抽出する。この粒状骨を１倍量の無水エタノールによって洗浄し、１倍量の無水エーテルによって脱水する。ＤＢＰを２０倍量の４Ｍグアニジン−ＨＣｌによる分離抽出（dissociate ext raction）によって不活化する。次に、固体物質を水によって洗浄し、１倍量の無水エタノールによって洗浄し、１倍量の無水エーテルによって脱水する。細胞培養：１０％ＦＢＳと抗生物質とを含むＤＭＥＭ中での組織片培養によって、ヒト皮膚繊維芽細胞を単離した。ヒト肋骨の軟骨細胞（陽性対照として用いる）をコラーゲナーゼ消化によって単離し、１０％ＦＢＳと抗生物質とを含むハム（Ham's）Ｆ−１２中で培養した。ウシ関節の軟骨細胞も陽性対照として用いた。約１ｘ１０⁶標的細胞をサポートの開放端部から導入し、ラミネートの上部周辺面に接触させた。他では、細胞を直接ラミネート中に接種した。一晩インキュベートした後に、ラミネートを効果的に栄養分交換するために垂直状態の型中で培養した。３日間後に、型からラミネートを取り出し、続いて、ラミネートのみをインキュベートした。培地は１週間に２回交換した。７日目に又は１０日目に、ラミネートを回収し、２％パラホルムアルデヒド中に上述したように固定した。分析：生体内活性を評価するために、ＤＢＰ又はグアニジン抽出ＤＢＰ残渣を含む／含まないラミネートを生後２８日間のラットの皮下ポケット中に配置した。ラミネートを間隔を置いて回収し、２％パラホルムアルデヒド中に固定し、グルコールメタクリレート（ＪＢ−４）又はパラフィン中に埋封した。一連の２０ミクロン切片をトルイジンブルーによって染色して、細胞周囲の異染性（metach romatic）マトリックスの可視化を可能にした。２０ミクロン切片を５％正常ヤギ血清によってブロックし（blocked）、コンドロイチナーゼＡＢＣ消化後に、種々な量（１：１００から１：１０００までの希釈）のモノクローナル抗体によって硫酸コンドロイチン；ＣＳ−５６（ＩＣＮＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃａｔ．＃６３−６５０−１）若しくはＤ型（ＭＯ−２２５；ＳｅｉｋａｇａｋｕＡｍｅｒｉｃａ，Ｃａｔ．＃２７０８０２）；抗−ＩＩ型コラーゲン（anti-t ype II collagen）（ＣｈｅｍｉｃｏｎＣｏ．，Ｃａｔ．＃ＭＡＢ１３３０）；硫酸ケラタン（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ，Ｃａｔ．＃２７０７８６）；アンチ−プロテオグリカン（△Ｄｉ−０Ｓ；Ｓｅｉｋａｇａｋｕ，Ｃａｔ．＃２７０７８８；△Ｄｉ−６Ｓ；Ｓｅｉｋａｇａｋｕ，Ｃａｔ．＃２７０７８９；及び△Ｄｉ− ４Ｓ；Ｓｅｉｋａｇａｋｕ，Ｃａｔ．＃２７０７９０）に対して染色した。可視化のために、銀強化イムノゴールド方法（silver-enhanced immunogold procedu re）を用いた（アウロプローブ（AuroProbe）ＬＭＲ，ＪａｎｓｓｅｎＢｉｏｔｅｃｈＮＶ，ベルギー）。結果生体内：組織学的分析のために、間隔を置いて反応性組織を回収した。上述したように製造したＤＢＰラミネートは炎症性ではなく、実質的な血管形成を可能にして、細胞移行のための足場（scaffold）を提供し、軟骨内骨形成（endochon dral osteogenesis）を誘導した。試験管内：ＤＢＰ基質と接触した、ラミネートの室中に繊維芽細胞を接種したサンプルにおいて、生存能力（viability）は７日目までは良好であったが、その後は、退行性（degenerative）細胞が優勢であった。これらの細胞が移動（tr ansfer）中にＰＯ₂変化を受けて、生存能力を失ったと考えられる。繊維芽細胞をラミネートの頂部に接種して、コラーゲンマトリックス中に移行させた場合に、最も良い結果が得られた。軟骨細胞含有ラミネートでは、細胞はコラーゲンネットワークに浸透し、ＤＢＰとＤＢＰ残渣の両方に結合した。３日目までに、異染性の粒状付着物が軟骨特異的抗体とのイムノヒストケミカル（immunohistochemical）反応性によって軟骨細胞を囲んだ。繊維芽細胞含有ラミネートでは、移行と生存能力とはＤＢＰ及びＤＢＰ残渣と同等であった。繊維芽細胞はコラーゲンネットワークと、ＥＣＭ合成の形跡を有する粒子とに結合した。異染性（metachromasia）と、軟骨特異的抗体との免疫反応性とはコラーゲンラミネート上でもＤＢＰ残渣上でも繊維芽細胞の周囲に見られなかった。これとは対照的に、ＤＢＰに密接に接近した繊維芽細胞は、真正の軟骨細胞の周囲と同様に、異染性の免疫反応性マトリックスによって囲まれた。抗−硫酸ケラタン（anti-keratan sulfate）抗体はラミネートに及びＤＢＰ粒子間に結合したヒト軟骨細胞内及び周囲に強度の染色を示した。軟骨特異的抗体はＤＢＰ上のヒト繊維芽細胞と反応性であった。また、コンドロイチン−４スルフェートに対する抗体はＤＢＰ上の細胞に対してはポジティブ（positive）であり、グアニジン抽出ＤＢＰ又はコラーゲン単独上の細胞に対してはネガティブ（ negative）であった。結論ヒト皮膚繊維芽細胞は、本発明のＤＢＰ／コラーゲンラミネートにおいて培養した場合に、軟骨細胞特性を表現した。この三次元試験管内系は細胞浸透を最適化した。ラミネート内の細胞は少なくとも２週間生存能力を有した。ＤＢＰの充填形態（packing geometry）は生体内微小環境をより密接に模倣した。ＤＢＰに近接する皮膚繊維芽細胞によって、軟骨様マトリックスが合成された。この系は（１）骨誘導性（osteoinductive）物質による分化転換の細胞生物学と、（２）分化に及ぼす他の細胞外成分（例えば、ヒアルロン酸）及び溶解性因子（例えば、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β）の影響と、（３）他の誘導性因子の試験管内バイオアッセイと、（４）骨格再構成のための複合代替え物（composite substitute）の開発とを明確にする（define）ために重要である。同等物好ましい実施態様において特有の設計を示したが、これらの特有の設計によって本発明を限定することは意図しない。本発明の上記説明が単に例示を意図するものであり、本発明の他の実施態様、変更及び同等物が、発明の範囲及び要旨から逸脱せずに、当業者に明らかであることを理解すべきである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年４月６日【補正内容】３４条補正の翻訳（当初請求の範囲を全て削除して以下の内容に差し替える）請求の範囲１．生物学的適合性の構造物質を含み、誘導物質を保持するための室を有する容器を画定する壁手段を含む細胞分化を誘導するためのデバイスであって、前記構造物質が密度を有し、前記壁手段が少なくとも１つの内面と少なくとも１つの外面とを有し、これらの内面と外面とが一致した密度を有し、緻密な物質のシェルを含まず、前記内面と外面とが細胞透過性であり、前記外面が分化可能な細胞を受容し、前記内面が前記細胞を、誘導物質を含む前記室に侵入させ、前記誘導物質が細胞を分化させることができるデバイスであり、被験者内に挿入又は栄養培地と共に配置されると、分化された細胞を生成することができる前記デバイス。２．前記壁手段が第１層と第２層とを含むラミネートを包含し、少なくとも１つの層が、一致した密度を有する内面と外面とを有し、緻密な構造物質のシェルを含まず、前記内面と外面とが細胞透過性であり、前記第１層が周縁を有し、前記第２層も周縁を有し、これらの周縁が係合して、前記室を形成する請求項１記載のデバイス。３．前記縁が係合して、シームを形成する請求項２記載のデバイス。４．前記少なくとも１つの外面と前記少なくとも１つの内面とがＵＶ照射タンパク質を含む請求項１記載のデバイス。５．前記壁手段がコラーゲンを含む請求項１記載のデバイス。６．前記コラーゲンが凍結乾燥したものである請求項５記載のデバイス。７．前記室内に配置された誘導物質をさらに含み、前記誘導物質が前記外面に接触する１種以上の細胞に対して誘導活性を有する請求項１記載のデバイス。８．サポートをさらに含み、前記サポートが前記容器を保持するために前記壁手段と係合する請求項１記載のデバイス。９．サポートをさらに含み、前記サポートが前記容器を保持するために前記第１及び第２層の前記縁と係合する請求項２記載のデバイス。１０．前記サポートが２つの対立端部を有する環状カラーを含み、前記カラーが外面と内面とを有し、前記内面が前記容器を保持するために前記第１及び第２層の前記縁と係合する請求項９記載のデバイス。１１．このようなカラーの前記内面と、前記壁手段とが前記誘導物質によって誘導されることができる１種以上の細胞を受容するための容器を画定する請求項１０記載のデバイス。１２．前記内面が溝を有し、この溝が前記容器を保持するために前記第１及び第２層の前記縁と係合する請求項１０記載のデバイス。１３．前記溝が第１及び第２フランジによって画定され、前記第１及び第２フランジが前記カラーの内面上に向かい合う関係で存在して、前記層の前記縁と係合する請求項１２記載のデバイス。１４．第１量の構造物質又は第１スペーサーを用意し；前記構造物質上に第２スペーサーを配置し；前記スペーサーと構造マトリックス物質とを凍結乾燥させ；前記凍結乾燥構造物質から前記スペーサーを取り出して、一致した密度の凍結乾燥構造マトリックス物質を有する壁手段を形成することによって製造され、前記スペーサーが不透性シェルの形成を防止する請求項１記載のデバイス。１５．下記工程：（ａ）細胞を誘導して分化させることができる誘導物質をさらに含む請求項１記載のデバイスを形成する工程と；（ｂ）前記デバイスを１種以上の細胞の存在下に配置して、前記外面及び内面に通して前記細胞を前記誘導物質中に移行させる工程とを含む細胞を誘導する方法。１６．誘導物質に少なくとも１種の成長因子を加える工程をさらに含む請求項１５記載の方法。１７．前記成長因子が骨形態形成性タンパク質、血小板由来増殖因子、及び形質転換増殖因子−βから成る群から選択される請求項１６記載の方法。１８．前記誘導物質が脱塩骨粉である請求項１７記載の方法。１９．前記壁手段がコラーゲンを含む請求項１２記載の方法。２０．第１スペーサー上に第１量の生物学的適合性構造物質を供給し；前記第１量の構造物質上に第２スペーサーを配置し；前記スペーサーと構造物質とを凍結乾燥させ；前記凍結乾燥構造物質から前記スペーサーを取り出して、細胞透過性表面を有する壁手段を形成する工程を含む請求項１記載のデバイスの製造方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．透過性構造マトリックスの第１層と第２層とを包含するラミネートを含み、前記層の各々が外側及び内側の周辺面を有し、前記第１層と第２層との内側周辺面が向かい合う関係で共に係合して、それらの間に前記構造マトリックスを含まない実質的に中空の室を画定する細胞誘導デバイス。２．前記室内に配置される基質をさらに含み、この基質が前記ラミネートと接触する１種以上の細胞に対する誘導活性を有する請求項１記載のデバイス。３．基質の充填密度を最適にするように、前記室を構成し、配置する請求項１記載のデバイス。４．前記係合した内側周辺面が前記ラミネートの外周の周囲に伸びるシームを画定する請求項１記載のデバイス。５．前記ラミネートが前記基質に関して生体適合性である請求項１記載のデバイス。６．前記ラミネートの前記外側周辺面と係合するサポートをさらに含む請求項１又は２に記載のデバイス。７．前記サポートが前記外周シームと係合する請求項６記載のデバイス。８．前記サポートが対立した端部を有する環状カラーを含み、前記ラミネートの前記周辺シームが前記カラーの内部周辺面によって支えられる請求項７記載のデバイス。９．前記ラミネートが前記カラーの前記対立端部の中間に配置される請求項８記載のデバイス。１０．前記対立端部の１つと、前記カラーの前記内部周辺面と、前記ラミネートの外側周辺面とが前記基質によって誘導されることができる１種以上の細胞を受容する容器を画定する請求項９記載のデバイス。１１．前記内部周辺面がその中に画定されたスリットを有し、前記スリットが前記ラミネートの前記外周面と係合する請求項８記載のデバイス。１２．前記スリットが向かい合う関係の１対のフランジによって画定され、前記フランジが前記カラーの前記内部周辺面によって支えられ、前記ラミネートの前記外周シームが前記フランジ対の間に係合する請求項１１記載のシーム。１３．前記対立端部の一方がそこに画定された複数の流路を有する請求項８記載のデバイス。１４．前記流路が前記カラーの前記端部に隣接して配置される請求項１３記載のデバイス。１５．前記構造マトリックスが構造タンパク質マトリックスを含む請求項１記載のデバイス。１６．前記基質が骨原性物質を含む請求項１５記載のデバイス。１７．前記骨原性物質が脱塩骨粉を含む請求項１６記載のデバイス。１８．前記構造タンパク質がコラーゲンを含む請求項１５記載のデバイス。１９．細胞の成長及び分化を分析する方法であって、構造タンパク質マトリックスの第１層と第２層とを含み、前記層の各々が外側及び内側の周辺面を有し、前記第１層と第２層との内側周辺面が向かい合う関係で共に係合して、それらの間に構造タンパク質マトリックスを含まない実質的に中空の室を画定するラミネートを形成する工程と；前記室内に、１種以上の細胞に対する誘導能力を有する基質を配置する工程と；前記基質を前記１種以上の細胞と接触させる工程と；前記細胞が前記基質によって誘導されるために充分な時間、前記ラミネートを前記細胞の存在下でインキュベートする工程とを含む前記方法。２０．前記ラミネートに少なくとも１種の細胞増殖因子を加える工程をさらに含む請求項１９記載の方法。２１．前記ラミネートに加える前記細胞増殖因子が骨形態形成性タンパク質、血小板由来増殖因子、及び形質転換増殖因子−βから成る群から選択される請求項２０記載の方法。２２．前記ラミネートに少なくとも１種のプロテオグリカン又はグリコサミノグリカンを加える工程をさらに含む請求項１９記載の方法。２３．前記グリコサミノグリカンが硫酸コンドロイチン、硫酸ケラタン、硫酸ヘパラン、ヒアルロン酸及びこれらの組合せから成る群から選択される請求項２２記載の方法。２４．第１量の構造マトリックス物質を用意し；前記構造マトリックス物質上に第１スペーサーを配置し；前記第１スペーサーに第２量の構造マトリックス物質を供給し；前記第２量の構造マトリックス物質上に第２スペーサーを配置し；前記スペーサーと構造マトリックス物質とを凍結乾燥させ；前記凍結乾燥マトリックスから前記スペーサーを除去して、向かい合う関係で共に係合して、構造マトリックス物質を実質的に含まない実質的に中空の室を画定する内面を有するラミネートを形成することによって製造される請求項１記載の培養デバイス。２５．前記第１量及び第２量の構造マトリックス物質を、対立端部を有するチューブを含む型に供給する請求項２４記載の培養デバイス。２６．第１量の構造マトリックス物質を用意し；前記構造マトリックス物質上に第１スペーサーを配置し；前記第１スペーサーに第２量の構造マトリックス物質を供給し；前記第２量の構造マトリックス物質上に第２スペーサーを配置し；前記スペーサーと構造マトリックス物質とを凍結乾燥させ；前記凍結乾燥マトリックスから前記スペーサーを除去して、向かい合う関係で共に係合して、構造マトリックス物質を実質的に含まない実質的に中空の室を画定する内面を有するラミネートを形成し；前記室中に基質を配置することによって製造される請求項２記載の培養デバイス。２７．前記基質が脱塩骨粉であり、前記構造マトリックス物質がコラーゲンを含む請求項２６記載の培養デバイス。２８．対立端部を有するチューブを含む型を用意し；前記チューブ中に第１量の構造マトリックス物質を配置し；前記構造マトリックス物質上に第１スペーサーを配置し；前記第１スペーサー上に第２量の構造マトリックス物質を配置し；前記第２量の構造マトリックス物質上に第２スペーサーを配置し；前記スペーサーと構造マトリックス物質とを含む前記型を凍結乾燥させ；前記凍結乾燥マトリックスから前記スペーサーを除去して、第１層と第２層とを含み、各層が外側周辺面と内側周辺面とを有し、前記各内側周辺面が向かい合う関係で共に係合して、構造マトリックス物質を実質的に含まない実質的に中空の室を画定するラミネートを形成する工程を含む、三次元培養デバイスの形成方法。２９．前記室中に基質を配置することをさらに含む請求項２８記載の方法。３０．内面と外面を有し、前記内面が室を画定し、前記外面が生物学的組織と接触して配置される壁手段を含み、前記壁手段が誘導物質を受容するために前記室と連通し、前記誘導物質を含むために前記室を閉鎖するための開口手段を有し、かつ前記壁手段が分化可能な細胞を受容することができる生物学的に適合性で、透過性物質を含む細胞分化を誘導するデバイスであって、生物学的環境に誘導物質を含み、前記室中に細胞を受容し、前記誘導物質の存在下で前記細胞を分化させる前記デバイス。３１．前記壁手段と開口手段とが第１壁区分と第２壁区分とを含み、前記第１壁区分が誘導物質を受容するための室領域と周縁領域とを有し、前記第２壁区分が前記第１壁区分の前記周縁領域によって収容されて、前記室を形成することができる協同作用周縁領域を有する請求項３０記載のデバイス。３２．前記第１及び第２壁区分の周縁領域と係合して、前記周縁領域のクロージャーを形成して、取り扱いを用意にするためのサポートをさらに含む請求項３１記載のデバイス。３３．前記サポートがハウジングを含み、前記ハウジングが内面と外面とを有し、前記内面がキャビティを画定し、かつ前記壁手段と係合する壁保持手段を有する請求項３１記載のデバイス。３４．前記壁保持手段が前記ハウジングの内面における溝を含み、前記溝が前記第１及び第２壁区分の周縁領域と係合する請求項３３記載のデバイス。３５．前記内面が間隔を置いた関係で内側に突出して、前記溝を画定する２個の協同作用フランジを有する請求項３４記載のデバイス。３６．前記ハウジングが２個の端部を有し、前記端部の少なくとも一方が前記ハウジングを平面上に安定に載せるために平縁を有する請求項３３記載のデバイス。３７．前記ハウジングが前記平縁で支えられるときに、前記キャビティを前記外面における環境と流体連通させるために、前記ハウジングが前記外面から前記内面に達する流路を有する請求項３３記載のデバイス。３８．次の要素：（ａ）内面と外面を有し、前記内面が室を画定し、前記外面が生物学的組織と接触して配置される壁手段であって、分化することができる細胞を受容し、このような細胞を前記室に侵入させることができる、生物学的に適合性で、透過性物質を含む前記壁手段と；（ｂ）細胞を分化させることができる誘導物質とを含む細胞分化を誘導するデバイスであって、生物学的組織と共に配置されると、前記室に含まれる前記誘導物質によって、誘導型細胞を形成することができる前記デバイス。３９．前記誘導物質によって誘導されることができる又は既に誘導された少なくとも１種の細胞をさらに含む請求項３８記載のデバイス。