KR20070035592A - 지방형성 중간엽 줄기 세포를 포함하는 폴리(에틸렌글리콜)-디아크릴레이트-(ｐｅｇｄａ)-가교된 하이드로겔 - Google Patents

지방형성 중간엽 줄기 세포를 포함하는 폴리(에틸렌글리콜)-디아크릴레이트-(ｐｅｇｄａ)-가교된 하이드로겔 Download PDF

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Abstract

생체적합성 스캐폴드 내의 성체 중간엽 줄기 세포(MSC)로부터 소정 형태와 규모의 연조직을 새로이(de novo) 생체내(in vivo) 합성하는 방법 및 조성물을 게시한다. 스캐폴드는 숙주 동물에 생체내 이식되어, 그곳에서 제조되거나 또는 생체외(ex vivo)에서 유지된다. 혈관신생 유도는 연조직 이식물의 성공률을 증가시킨다.
생체적합성 스캐폴드, 중간엽 줄기 세포, 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트, 하이드로겔, 연조직

Description

지방형성 중간엽 줄기 세포를 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜)-디아크릴레이트-(ＰＥＧＤＡ)-가교된 하이드로겔{Poly(ethylene glycol)-diacrylate-(PEGDA)-crosslinked hydrogels comprising adipogenic mesenchymal stem cells}
지방조직과 섬유아세포를 포함하는 연조직은 생체적합성 하이드로겔 기질(matrix) 내에 매립된 성체 중간엽 줄기 세포를 사용함으로써 소정의 형태와 규모(dimension)로 생물 공학적으로 처리된다.
연조직 결함의 복구는 현대 의료업계의 상당한 과제이다. 많은 유형의 유방암과 얼굴 암은 생명을 위협하고, 일단 거부되면 환자에게 연조직 결함과 미관손상을 남기게 된다. 유방절제술과 종양 절제 수술은 물리적 형태 및/또는 생리적 기능을 복원하기 위한 상실된 연조직의 교체를 지시하는 비선택적 수술 절차 중 하나이다. 얼굴 재건 수술은, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 흑색종 및 기타 두경부 암과 같은 암 절제 후, 필수적이다. 암에 대한 개선된 의학적 치료는 생존율을 증가시키고, 결과적으로 암 생존자는 자신의 연조직 결함의 형태학과 기능이 복원되기를 희망한다. 전쟁 중에 상처가 발생하여 골격 손상외에도 연조직 외상을 일으킨 다. 작업 관련 사고와 교통 사고도 연조직 결함의 또 다른 원인이다. 연조직은 화상 후에도 유실되어 피부뿐만 아니라 피하 연조직의 재건을 필요로 한다. 반얼굴 왜소증(얼굴의 절반이 다른 절반에 비해 덜 발달된 것)과 같은 선천 기형에서는 상당한 양의 연조직이 유실되어 재건되어야 한다. 2003년, 미국에서는 총 약 6백만명의 환자가 성형의사가 집도하는 재건 수술을 받았다(American Society of Plastic Surgeons http://www.plasticsurgery.org/public_education/2004Statistics.cfm).
2002년에 미국에서 소비된 수술적 미용 시술 비용은 약 50억불이고, 비수술적 미용 시술(예컨대, 콜라겐 주사) 비용은 약 20억불이다. 이것은 2002년에만 실시된 수술적 및 비수술적 미용 시술 약 7백만건에 관한 것이다.
지난 10년간, 외과의는 연조직 재건 시술의 개선을 위하여 자신들의 독창적인 지식을 이용했다. 자가 연조직 이식편 및 합성 재료는 연조직 재건 시술의 주요 수단이다. 각 시도는 각각의 찬반양론이 있으며, 임상적 판단에 기초하여 환자 및 연조직 결함의 특정 유형마다 적합한 것이 있다. 불행하게도, 현재 이용되는 연조직 재건 및 확대술은 제공 부위 이환, 누출, 압출, 부자연스러운 감촉, 재흡수 및 면역 거부와 같은 부작용으로 인해 이상적이지 못하다. 자가 성숙 지방조직은 연조직 결함의 충전재로서 사용되었지만, 그 결과는 예측할 수 없다. 부피 감소는 최고 70%까지 재흡수하는 자가 이식편의 주요 문제인 것으로 보인다. 자가 연조직 이식편의 부피 감소는 허혈에 대한 낮은 내성과 느린 혈관재형성으로 인한 이식된 성숙 지방세포의 아폽토시스 때문일 수 있다. 지방절제술 또는 지방흡입술은 지방 이식의 또 다른 경로이다. 지방흡입술에 의한 흡입물에서 분리한 성숙 지방세포의 단세 포 현탁액은 연조직 결함을 채우기 위해 스캐폴드(scaffold)에 혼입하여 이식했다. 하지만, 부피 감소는 여전히 해결되지 않았고, 이는 성숙 지방세포의 세포질 중 85%가 지질이기 때문에 막대한 혈관신생(angiogenesis)을 필요로 하기 때문인 것 같다. 대부분의 심각한 증례에서, 지방흡입술에 의한 흡인물 유래의 지방 이식편은 이식편의 준최적의 혈액 공급 및 괴사를 나타낸다. 지방흡입술에 의한 기계적 스트레스는 이식 시 지방세포의 90% 이하가 손상되게 한다. 또 다른 악화 요인은 성숙한 지방세포가 완전하게 분화되고 증식하지 못하여, 지방 이식편 내에 지방형성(adipogenic) 세포가 결핍된다는 점이다.
동물 또는 사람 지방 조직에서 절제 또는 지방흡입 시술을 통해 분리할 수 있는 전구지방세포(pre-adipocyte)는, 생체외에서 특정한 정도까지 증식할 수 있고 성숙 지방세포보다 더 큰 정도까지 저산소 환경에 견딜 수 있는 것으로 생각되기 때문에, 성숙 지방세포보다 바람직하다. 하지만, 일부 전구지방세포는 절제 및/또는 지방흡입 시술 동안 손상될 가능성이 있다. 몇몇 전구지방세포주, 예컨대 3R3-L1 및 3T3-F442A는 PGA 메쉬(mesh)와 같은 생체물질에 지방 조직을 공학적 처리하는데 사용되었다. 이러한 지방형성 세포주는, 시험관내 연구에서의 상당한 가치에도 불구하고, 불멸화되므로, 지방 조직의 생체내 공학적 처리에서는 1차적인 전구지방세포로서 유용하지 않다. 예를 들어, 다공성 PLA 스캐폴드에 접종된 전구지방세포는 생체내에서 지방 조직을 발생한다. 펩타이드가 결합된 알기네이트 이식물은 접종된 양(羊) 전구지방세포의 부착 및 증식과 지방 조직 형성을 지지했다. 사람 및 쥐의 전구지방세포로 외부에서 전달된 bFGF는 콜라겐 또는 마트리겔(Matrigel) 스캐폴드에서 연속적인 지방형성 분화 및 지방 조직 형성을 촉진하는 것으로 보고되었다.
중간엽 줄기 세포(MSC)는 배아 줄기 세포에서 파생되어 지방 조직, 연골, 골, 골격근 및 간질 섬유 조직과 같은 모든 결합 조직을 형성하는 세포 계통으로 분화한다. MSC는 골수, 지방 조직, 젖니 및 골격근에서 분리할 수 있다. 이의 다분화능(multipotent)외에도, MSC는 이의 줄기세포성을 상실하지 않고 다수 세대 동안 자가재생 및 복제할 수 있다. MSC는 처음에는 세포 배양 페트리 접시에 부착성인 섬유아세포 유사 세포로 분리되고 동정되었다. 사람의 MSC는 일반적으로 상부 장골능의 골수로부터 흡인되는 반면, 쥐의 MSC는 일반적으로 정강뼈 및 대퇴골의 골간 중간에서부터 흡인된다. 지방형성, 연골발생성, 골원성, 근육성 등과 같은 각종의 정립된 유도 배지에 노출시, MSC는 특정 경로를 따라 분화하고 각 세포 계통에 특징적인 유전자 및 단백질 마커를 발현하기 시작한다.
중간엽 줄기 세포(MSC)는 지방형성 세포 및 지방세포의 선조세포이다. 말기 지방세포는 복제 또는 추가 분화를 일으키지 않는다. 즉, 지방 조직 형성 세포의 부족은 다른 요인 중에서도 현행 연조직 이식 시술 후의 부피 감소에 기여하는 요인이다. 사람 중간엽 줄기 세포(hMSC)는 페트리접시 단층 배양에서 지방형성 세포로 분화하는 것으로 보고되었다. 시험관내에서 사람 MSC의 지방형성 동안 발현되는 다수의 유전자도 기재되어 있다.
스캐폴드 물질은 보통 초기 부착을 제공하고 공학적 처리된 이식편의 조직 형성 세포를 지지하는데 요구된다. 특정 조직 공학 분야에서 적당한 스캐폴드의 선 택은 시도의 성공에 중요하다. 조직 발생은 구조적인 환경, 세포-생체물질 상호작용 및 스캐폴드에 혼입된 잠재적 생물학적 시그널에 의존적이다.
세포계 지방 조직 공학에 대한 종래 연구에서는 주로 다공성 스캐폴드를 이용했다. 다공성 스캐폴드의 장점은 혈관 내증식을 용이하게 하는 잠재성이다. 하지만, 지방 조직 공학에서 다공성 스캐폴드의 일반적인 단점은 침범한 숙주 세포에 의해 생산된 효소와 잠재적으로 관련성이 있는 다공성 스캐폴드의 분해 및/또는 조기 재흡수이다. 하이드로겔은 콜라겐, 엘라스틴, 히알루론산, 아가로스, 알기네이트, 키토산 및 폴리에틸렌 글리콜 하이드로겔을 포함한 다양한 부류의 스캐폴드를 포함한다. PEG 하이드로겔은 다양한 세포 유형, 예컨대 연골세포 및 골모세포를 피막화하는데 사용되었다. PEGDA 하이드로겔의 유동학적 성질과 회복 성질은 사람 복부 지방 조직과 비슷한 여러 매개변수를 공유하는 것으로 보고되어 있다.
재건 수술 및 성형 수술은 특정 형태와 규모에 초점을 둔다. 이론상, 줄기 세포 유래의 성공적인 조직 공학적 신장은, 실체화될 때 공학적 신장이 생체내에서 양호한 기능을 나타내기만 한다면, 환자의 정상 신장과 똑같은 형태를 가질 필요는 없다. 이에 반해, 도 1A와 도 1B에 예시한 바와 같은 연조직 결함은 생리학적 기능 외에도 본래 형태와 규모를 갖도록 복원되어야 한다. 부피 감소는 시간이 경과함에 따라 최고 60% 정도로 심각해질 수 있다. 실제, 연조직 이식편의 "수술후 부피 감소"는 외과학 논문에 보고된 연조직 재건 시술의 다른 합병증 중에서도 주요한 문제이다.
부피 감소는 흉터형성이나 준최적의 조직 통합과 같은 다수의 요인에 의해 유발되는 것으로 보이지만, 주요 문제는 1) 부피를 유지하기 위한 지방질 및 섬유성 기질의 지속적인 합성 및 2) 지방질 및 섬유성 기질 형성 세포 공급을 보충하는 자가 복제를 할 수 있는 혼입 세포의 부족이라는 가설이 있다. 지방세포와 같은 말기 세포는 이러한 요구를 충족시킬 수 없다.
조직 공학에서 생물학적 물질의 적용시 부딪히는 주요 장애는 준최적의 조직 내증식 및 불량한 혈관화이다. 생체내에서 사용되어 온 생체물질의 성공은 연골 및 피부와 같은 대체 숙주 조직의 무혈관성 덕분이다. 천연 연골 및 피부는 대부분 무혈관성이고 혈관화의 부재에서도 영양소를 확산하기에 충분하게 얇다. 하지만, 생체내 조직 형성 세포의 생존은 규모가 수 밀리미터보다 큰 공학적 조직 또는 기관에서는 일반적으로 불량하지만, 대부분의 조직과 기관을 공학적 처리하는 데에는 보다 대량의 조직 형성 세포가 필요하다. 따라서, 신혈관형성은 조직 형성 세포가 공학적 처리된 조직 및 기관의 생존을 촉진하는데 필수적이다.
혈관은 자연에서 2가지 다른 생물학적 과정, 즉 혈관형성(vasculogenesis) 및 혈관신생(angiogenesis)을 통해 형성되는 것으로 알려져 있다. 혈관형성은 내피 선조세포로부터 모세혈관이 형성되는 과정이다. 기존 혈관으로부터 새로운 혈관의 형성을 나타내는 혈관신생은 조직 발생 및 상처 치유 모두에 있어서 극히 중대한 필수적인 과정이다. 혈관신생은 잠재적으로 2가지 기작, 즉 전충(intussusception) 및 발아(sprouting)를 통해 일어난다. 전충 혈관신생은 간질 세포 기둥이 기존 혈관으로 이동할 때 일어난다. 이러한 유형의 혈관신생은 국소 혈관 망의 리모델링을 일으킨다. 한편, 발아 혈관신생은 기존 혈관 구조로부터 새로운 혈관이 형성되는 것을 의미한다. 혈관형성은 최근 출생후 관찰되었으나, 혈관신생은 성체에서 새로운 혈관의 형성을 유도하는 일반적인 과정이다. 혈관신생과 혈관형성은 수많은 시그널 전달 과정을 필요로 하고 다수 세포 계통을 포함하는 복잡한 일련의 사건을 수반한다. 천연 조직의 혈관화 과정은 점차 밝혀지고 있지만, 공학적 처리된 조직의 신혈관형성에 대한 이해는 아직 초기에 있다.
조직 공학은 혈관화를 유도하기 위해 주로 2가지 시도를 이용하고 있다: 내인성 혈관신생 반응의 자극 및 천연 혈관 망을 모방하는 생체재료의 물리적 구조의 공학적 처리. 정지기 내피 세포는 혈관내피성장인자(VEGF), 간세포성장인자(HGF) 및 섬유아세포성장인자(FGF)와 같은 수많은 혈관신생 분자에 의해 자극되어 혈관신생 내피 세포로 변환될 수 있다. bFGF는 혈관신생 작용 외에도 골모세포의 증식을 자극하는 것으로 밝혀져서, 골조직 공학에 특히 중요하게 되었다.
미세통로(microchannel)는 모세혈관을 모방하기 위하여 사진제판술에 의하여 조직 공학 재료로 패턴화되었다. 종래 다수의 생체적합성 중합체 재료로의 혈관신생 촉진에 관한 많은 연구가 집중되었음에도 불구하고, 비다공성 하이드로겔 스캐폴드의 생체내 신혈관형성은 조직 공학 분야에서 도전할만한 과제로 남아있다.
폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)은 조직 공학에 사용되어 온 수많은 하이드로겔 중합체 중 하나이다. PEG는 면역계에 의해 인식되지 않는 비독성 수용성 중합체이다. PEG는 이미 사람의 생의학 분야에서 식약청(FDA)의 승인을 받은 것이다. PEG의 장점은 공학적 처리된 조직 및 기관에 필수적인 소정의 형태 및 규모로의 성형성(moldability)이다. PEG 하이드로겔은 선형 PEG에 의해 연결된 올리고아크릴레이 트 결절을 가교시키는 광개시제를 사용하여 제조할 수 있다. 하지만, PEG는 치밀한 하이드로겔로서 분해 속도가 느려서, 특정 조직 공학 분야에 따라서 장점 및 단점이 될 수 있다. 약물 전달시에는 PEG의 느린 분해 속도는 피막화된 사이토카인의 조절 방출에 도움이 된다. 사이토카인 확산 속도는 PEG 하이드로겔의 분자량 및 농도 변화로 변경될 수 있다. 조직 공학용 스캐폴드로서, PEG 분해 속도는 이의 가교, 농도 및 공중합과 관련하여 변경될 수 있다. 예를 들어, PEG의 분해 속도는 폴리-d-l-락틱-코-글리콜산(PLGA)으로의 공중합을 통해 변경된다. 하지만, 생체내 조직 공학 분야에서 PEG의 광범위한 이용에 따른 현안 문제는 PEG 하이드로겔에서의 느리고 최소량인 숙주 조직 내증식 및 혈관화이다.
발명의 개요
생체적합성 스캐폴드 내의 성체 중간엽 줄기 세포 유래의 생물 공학적 처리된 연조직은 소정의 3차원 형상, 즉 형태 및 크기 또는 규모를 갖고 있다. 생물 공학적 처리된 연조직 작제물은 성체 중간엽 줄기 세포로부터 임의의 형태 또는 규모로 제조되고 시험관내, 생체외 및 생체내에서 용이하게 제조된다. 이러한 이식물은 미용, 질환, 선천 기형 또는 외상으로 인한 미용 성형 수술을 필요로 하는 환자에게 유용하다.
각종 보충물을 보유한 하이드로겔에서 중간엽 줄기 세포는 부피 손실이 감소되고 세포 분해 속도가 느리며 소정 형태 및 규모로의 성형성을 보유한 이식물을 제공한다.
본 발명은 생체적합성 스캐폴드 내의 성체 중간엽 줄기 세포를 이용하여 소정(또는 예정)의 형태 및 규모를 가진 생물 공학적 처리된 연조직을 생체내 또는 생체외에서 제조하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 이러한 방법에 따르면, 중간엽 줄기 세포(MSC)는 소정의 3차원 형상을 가진 생체적합성 스캐폴드에 분산된 상태로 제공된다. MSC는 지방형성 유도 보충물 및/또는 섬유아세포 성장인자 bFGF와 접촉함으로써 지방 세포 및 섬유아세포 조직 형성 세포로 유도 분화된다. 이 때 접촉은 적어도 일부 성체 중간엽 줄기 세포가, 요구된 재건 또는 복원의 성향에 따라 결정되는 바와 같은 소정의 3차원 형상을 가진 연조직으로 분화하기에 충분한 시간 기간 동안 유지한다. 작제물은 표준 외과 절차에 의해 필요로 하는 수용체에게 이식되는 연조직이다. 지방세포 및 섬유아세포는 형성된 연조직에 존재하고, 줄기 세포는 검출할 수 없을 정도로 소량으로 존재한다.
생체적합성 스캐폴드는 중합된 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트와 같은 하이드로겔 중합체로부터 작제된다. 이러한 생체적합성 스캐폴드, 및 이 스캐폴드를 사용하여 제조된 공학적 처리된 연조직은 소정의 3차원 형상을 갖고 있다. 하이드로겔 중합체는 이 중합체가 MSC를 포획하도록 생체적합성 스캐폴드 전구체에 MSC를 분산시키기 전이나 후에 형성시킬 수 있다. 하이드로겔 중합체는 예컨대 생체적합성 스캐폴드 전구체의 광중합을 통해 형성된다.
PEG 하이드로겔은 지방조직 공학 분야의 스캐폴드로서 바람직하다. PEG는 공학적 처리된 지방조직의 부피 보존에 유용한, 친수성이고 생체적합성이며 분해가 느리다.
작제물의 면역거부는, 조직 형성 세포가 환자 자신의 골수 또는 적합한 다른 공급원에서 유래되는 것이기 때문에 예방된다. 연조직은 생물학적 치유 과정을 통해 환자 자신의 조직과 통합된다. 따라서, 별도의 제도상의 승인의 필요를 줄일 수 있는 현행 정형 외과적 시도를 이용할 수 있다. 더욱이, 윤리 문제가 있는 조직을 최소화하기 위해 (배아 줄기 세포 대신) 성체 줄기 세포를 사용한다.
표준 세포 배양 절차는 다수의 조직 공학 실험실에 생물 공학적 처리된 연조직을 제조하도록 지시할 수 있게 변형된다.
본 명세서에 기술된 재료 및 방법은 강제로 생체내 혈관 조직 내증식이 비다공성 생체적합성 하이드로겔 안으로 이루어지게 하는 물리적 및 화학적 시도의 드문 조합이다. PEG 하이드로겔의 내피 유사 세포가 안에 대어져 있는 혈관 유사 구조는 적혈구 세포를 포함하고 항VEGF 항체 및 WGA 항체 모두에 대해 양성으로 염색되어, 침윤된 숙주 조직의 내피 세포의 존재를 보여준다. 공학적 처리된 거대통로 안에 내피 유사 세포가 안에 대어져 있는 내강에 함유된 적혈구 세포의 형태와 더불어, 당해 연구의 조직 내증식은 혈관 조직과 유사하다. 종래 사용된 미세통로보다 큰 물리적 거대통로, 및 화학 자극제, 염기성 섬유아세포 성장인자, 각각 또는 조합은 생체내에서 PEG 하이드로겔에서의 혈관 조직 내증식을 촉진한다는 것을 암시한다. 하지만, 거대통로와 bFGF의 효과 사이에는 중요한 차이가 있다. 거대 통로 없이 bFGF 적재된 PEG를 이용한 숙주 혈관 조직의 무작위 침윤과 비교해볼 때, 혈관 및 과립 조직 내증식은 잔여 PEG의 침윤 없이 bFGF 적재된 PEG의 거대통로의 내강으로 유도된다. 즉, 조직 공학 분야에서 바람직하지 않을 수 있는, PEG 하이드로 겔에서 bFGF에 의해 유도된 분명한 무작위 숙주 조직 침습 능력은 공학적 처리된 거대통로에 의하여 혈관 조직 내증식으로 유도되어진다. 이와 같이 유도된 혈관 조직 내증식은 혈관신생이 필요한 일반적인 조직 공학 분야에서 중요하다. bFGF 없이 거대통로화된 PEG가 그 통로 내에서 혈관 조직 내증식을 유도하더라도, 거대통로화되고 bFGF 적재된 PEG로 침윤된 혈관 조직 부피의 양은 bFGF 없이 거대통로화된 PEG보다 유의적으로 많다.
도 1은 면역결핍 마우스의 등에 4주 피하 이식한 후 조직 공학적 처리된 지방 조직 작제물 및 대조 작제물의 전체 외관을 예시한 일련의 4가지 사진(A-D)이다: (A) 작제물의 제조 중 중합체/세포 현탁액의 적재에 사용된 플라스틱 주형; (B) 원 주형의 형태와 규모를 유지하는 지방형성 처리된 hMSC를 피막화하는 조직 공학적 지방 조직 작제물; (C) 미처리된 hMSC를 피막화하는 수거된 대조 작제물; (D) 피막화된 세포가 없이 수거된 대조 작제물. 모든 작제물과 원 주형 간의 규모 유사성이 조직 공학적 처리된 작제물(B)과 대조 작제물(C 및 D) 간에 대조적임이 특징적이다.
도 2는 단층 배양물과 하이드로겔 작제물에서 생체외 생육되는 사람 중간엽 줄기 세포(hMSC)에 의한 지방형성을 예시한 일련의 4가지 현미경사진(A-D)이다; (A) 4주 동안 지방형성 배지에서 생육된 hMSC의 단층 배양물의 오일 레드-O(Oil Red-O)로의 양성 염색; (B) hMSC가 4주 동안 기본 배지에서 생육되었을 때 오일 레 드-O 염색에 대한 음성 반응을 나타내는 (A)의 대응 대조 단층 배양물; (C) 지방형성 배지에서 4주 동안 생체외 생육되고 지방형성 처리된 hMSC를 피막화하는 하이드로겔 작제물에 대한 대표적인 현미경사진에서 오일 레드-O로 양성 염색되어 확인되는 지방 침전물; (D) 오일 레드-O에 대한 어떠한 반응도 나타내지 않는 (C)의 대응 대조군의 대표적인 현미경사진.
도 3은 조직 공학적 처리된 작제물에서 생체내 생육된 hMSC에 의한 지방형성을 조직화학적 염색 및 RT-PCR로 보여주는 일련의 4가지 현미경사진(A-D)이다; (A) 지방형성 처리된 hMSC를 피막화하고 4주 동안 면역결핍 마우스의 등에 이식된 조직 공학적 처리된 하이드로겔 작제물의 오일 레드-O에 의한 양성 염색; (B) 미처리된 hMSC를 피막화하고 4주 동안 면역결핍 마우스의 등에 이식된 대조 하이드로겔 작제물의 대표적인 현미경사진으로서, 오일 레드-O 염색 음성 반응으로 명백한 바와 같이 지방 침전이 전혀 없음을 보여주고 있다; (C) 오일 레드-O 염색에 대해 음성 반응과 작제물 주위에 섬유성 피막의 순수 경계 및 작제물에 대한 숙주 세포 침습의 부재를 보여주는, 모든 세포를 피막화하지 않은 대조군 하이드로겔 작제물의 대표적인 현미경사진; (D) 면역결핍 마우스에서 피하 이식 4주 후 수거한, 지방형성 처리된 hMSC(+Adipo) 또는 미처리 hMSC(-Adipo)를 피막화한 작제물에서의 지방세포 특이적 유전자(PPAR-γ2)의 발현을, 관리(housekeeping) 유전자(GAPDH)와 비교하여 나타낸 RT-PCR 분석.
도 4: 생체내 이식 후 PEG 하이드로겔 및 대조군 그룹 중의 hMSC 유도된 지방 조직의 수거. A: 무세포 PEG 하이드로겔(화살표 사이). B: hMSC(지방형성 분화 부재)(화살표 사이)를 피막화한 PEG 하이드로겔. C: 주위 숙주 조직에 대해 부착성을 나타내고 최초 9mm 직경을 유지하는 hMSC 유래 지방형성 세포(화살표 사이)를 피막화한 PEG 하이드로겔 중의 공학적 처리된 지방 조직(A 및 B 보다 배율이 높다).
도 5: 공학적 처리된 지방 조직 및 대조군의 형태, 규모 및 불투광도: (A) 형태 및 규모의 일반적인 주형으로서 사용된 에펜도르프 관(직경 9mm)의 플라스틱 캡; (B) 수거된 무세포 PEG 하이드로겔은 대부분 투명하다; (C) 약간의 불투광도를 보이는 hMSC(지방형성 분화 부재)를 피막화한 PEG 하이드로겔; (D) 실질적인 불투광도를 나타내고 소정의 형태와 규모를 유지하는 hMSC 유래 지방형성 세포를 피막화한 PEG 하이드로겔.
도 6은 초기 형태와 규모를 모두 상실한 대조군과 hMSC가 접종된 생체내 수거된 콜라겐 스펀지의 형태 및 규모. (A) 약 4x4x4mm 정6면체로 준비된 멸균 콜라겐 스펀지; (B) 실질적인 크기 감소 및 실질적인 형태 변화를 나타내는, 생체내 이식 4주 후에 수거된 무세포 콜라겐 스펀지, hMSC 및 hMSC 유래 지방세포가 각각 접종된 콜라겐 스펀지(왼쪽부터 차례로).
도 7. 생체내 이식 4주 후 수거된 PEG와 콜라겐 이식편의 스캐폴드 직경(x100%±S.D.)의 정량적 변화. hMSC: 사람 중간엽 줄기 세포. 회색 막대그래프는 PEG 이식편을 나타내는 반면, 흰색 막대그래프는 콜라겐 이식편을 나타낸다. 무세포 PEG 작제물(N=6), hMSC를 피막화한 PEG 하이드로겔 작제물(N=6) 또는 hMSC 유래 지방세포를 피막화한 PEG 하이드로겔 작제물(N=6)은 스캐폴드의 초기 직경을 거의 100% 유지했다. 이에 반해, 세포가 접종되지 않은 콜라겐 스펀지(N=4)는 초기 직경의 65.0%±0.5 정도가 상실되었고, hMSC가 접종된 콜라겐 스펀지(N=4) 및 hMSC 유래의 지방세포가 접종된 콜라겐 스펀지(N=6)는 각각 초기 직경의 31.7%±5.8 및 31.7%±5.4 정도가 상실되었다. **: P<0.01.
도 8은 생체내 이식 4주 후 공학적 처리된 지방 조직 및 대조군의 H&E 및 오일 레드 O 염색. (A); hMSC: 사람 중간엽 줄기 세포; (B) 정주 세포(resident cell) 또는 지질 공포가 없는 무세포 PEG 하이드로겔; (C) 과다 세포를 보여주는 지방형성 분화가 없는 hMSC를 피막화한 PEG 하이드로겔; (D) 지질 공포가 없는 hMSC PEG 하이드로겔의 오일 레드-O 염색; (E) 공간 섬 중에서 과다 정주 세포를 보여주는 hMSC 유래 지방형성 세포를 피막화한 PEG 하이드로겔; (F) 지방세포와 유사한 편평 세포 중에서 과다 지질 공포를 보여주는 hMSC 유래 지방형성 세포를 피막화한 PEG 하이드로겔의 오일 레드-O 염색. 10x 배율.
도 9는 섬유아세포 성장인자-염기성(bFGF) 적재된 PEG 하이드로겔 실린더 및 사람 피부 섬유아세포(hDF) 코팅의 모식도이다.
도 10은 bFGF 적재된 PEG 하이드로겔의 생체내 이식 및 거대통로의 형성에 대한 모식도이다.
도 11은 PEG 하이드로겔에 피막화된 bFGF의 생체내 방출 프로필을 도시한 것이다.
도 12는 생체내 이식된 시료의 수거를 도시한 것이다: (A) 육안적으로 숙주 조직의 침습이 보이지 않는 세포, bFGF 또는 통로(channel)가 없는 PEG 하이드로 겔; (B) 형성된 3개의 거대통로 내강에서 숙주 조직 증식을 보여주는 3개의 거대통로를 보유한 PEG 하이드로겔(직경 각각 1mm); (C) 거대통로 없이 bFGF가 적재된 PEG 하이드로겔; (D) 형성된 3개의 거대통로 내강에서 3가지 숙주 조직 내증식과 전반적인 적색을 보여주는 bFGF 및 거대통로 형성된 PEG 하이드로겔.
도 13은 다른 물리적 및 화학적 조건, 즉 거대통로와 함께 또는 거대통로 없이 bFGF로 처리된 생체내 수거된 PEG 하이드로겔의 고배율 촬영 사진으로서, 혈관 유사 구조의 형성이 확인된다.
도 14는 bFGF 또는 거대통로 없이 수거된 PEG 하이드로겔 실린더의 대표적인 절편에서 나타나는 항VEGF 항체 기반 음성 면역블롯반응을 도시한 것이다.
도 15는 트리티컴 불가리스(Triticum vulgaris)(밀배아 어글루티닌)(WGA) 유래의 렉틴에 의해 대부분의 침습성 숙주 조직이 양성 염색된 것을 보여주고 있다.
연조직은 재건 및 확대 수술에서 복구용 주요 구조물이다. 연조직 재건 및/또는 확대에 사용되는 현행 재료는 준최적의 부피 보유, 제공자 부위 이환 및 생체적합성 불량과 같은 단점을 갖고 있다. 생물학적으로 생육가능한 연조직은 찻숟가락 하나 크기의 환자 성체 줄기 세포를 취한 후, 이 세포를 팽창시키고, 지방형성 세포로 분화시킨 뒤, 적당한 생체적합성 중합체 재료로 피막화하여, 공학적 처리할 수 있다. 최종 결과는 바늘 크기와 같은 최소 제공자 부위 외상, 환자 자신의 줄기 세포가 사용됨으로 인한 면역 적합성, 및 공학적 처리된 연조직이 소정 형태와 크기를 보유하기 위해 줄기 세포가 지방형성 세포를 보충할 수 있는 능력으로 인한 장기 부피 유지성이다. 줄기 세포 유래의 연조직 이식편은 성형 및 재건 시술에 실제 이용할 수 있다.
소정의 3차원 형상을 가진 생체적합성 스캐폴드 내의 성체 중간엽 줄기 세포로부터 제조된 연조직의 신(de noveo) 합성은 연조직의 복원, 확대 또는 재구성에 유용한 작제물을 제공한다. 성체 MSC는 연골 조직, 골 조직 및 지방 조직을 비롯한 모든 결합 조직 형성 세포 계통으로 분화할 수 있다. MSC는 골수 또는 신체의 다른 결합 조직 근원으로부터 최소의 침습 시술을 통해 수득될 수 있고, 배양물에서 높은 팽창성이며, 널리 정립된 지방형성 유도 보충물에 노출 후 지방 조직 형성 세포로 쉽게 유도 분화될 수 있다(Pittenger et al., Caplan, 2003). 더욱이, 성숙 MSC의 사용은 시술상 및 윤리상의 이유로 인해 배아 줄기 세포 또는 분화된 지방세포의 사용에 비해 바람직하다.
성체 중간엽 줄기 세포는 골수 세포에서 유래된 것이다. 적어도 일부 성체 중간엽 줄기 세포는 지방세포로 분화되는데, 초기에는 이 두 세포가 혼합물로 존재하다가 시간이 지남에 따라 거의 지방세포만으로 변화하여, 결과적으로 줄기 세포는 검출할 수 없는 소량으로 존재하게 된다. 지방 조직은 줄기 세포에 의해 생체내에서 제조되거나 줄기 세포에 의해 생체외에서 제조되기도 한다.
MSC는 지방 조직 공학용 지지 재료 안에 배치된다. 스캐폴드 안에 MSC의 배치는 스캐폴드가 제조된 후, 예컨대 줄기 세포가 숙주 신체에서부터 제조된 스캐폴드로 확산할 때 일어날 수 있다. MSC는 스캐폴드의 전구체와 혼합하면, 그 다음 스캐폴드가 MSC 주위에 작제되어 그 세포의 적어도 일부가 스캐폴드 망 안에 포획되어진다. 이러한 스캐폴드는 생체적합성이고 조직 형성을 지지하며, 새로 형성된 조직과 주위 숙주 조직 사이에 성공적인 통합이 이루어지기에 충분한 안정성을 나타낸다.
숙주 동물의 예에는 래트, 마우스 및 토끼와 같은 실험 동물, 개 또는 고양이와 같은 애완 동물, 말(말과), 소(소과), 양(양과) 또는 염소(염소과)와 같은 수의학적 동물, 또는 원숭이, 꼬리없는 원숭이(침팬지, 오랑우탄 또는 고릴라) 또는 사람과 같은 영장류가 포함된다.
적당한 생체적합성 스캐폴드에는 하이드로겔 중합체 작제물 또는 중합된, 방사선 중합성 단량체 또는 다른 적당한 작제물이 포함된다. 하이드로겔 중합체는 조직 형성 세포에 대해 체내의 세포외 기질과 유사한 환경을 제공한다. 하이드로겔 중합체는 다량의 물 또는 생물학적 유체를 흡수 또는 흡착하면서 독특한 3차원 구조를 유지하는 친수성의 3차원 망상 구조이다. 예컨대, 알기네이트, 산호, 아가로스, 섬유소, 콜라겐, 뼈, 연골, 하이드록시아파타이트, 인산칼슘, 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA) 또는 이의 공중합체(PLGA), 키토산 및 폴리에틸렌 글리콜계 중합체(peg계 중합체), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트 및 이의 혼합물과 같은 하이드로겔 중합체가 적당하다. 스캐폴드는 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 단량체[MW3400; Shearwater Polymers, Huntsville, AL]의 중합에 의해 형성된다. 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 또는 디메타크릴레이트 단량체는 분자량이 약 1000 내지 약 100,000 달톤, 및 약 2000 내지 약 5000 달톤일 수 있다. 스캐폴드는 고체, 액체, 겔, 메쉬, 분말, 스펀지 또는 페이스트와 같은 물리적 형태일 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜계 하이드로겔 중합체는 증명된 생체적합성, 및 골과 같은 다수 계통으로 MSC의 성장 및 분화를 지지하는 입증된 능력으로 인해 조직 공학 분야에 확실한 장점을 갖고 있다. 또한, 최소 침습 시술(주사)에 의한 피부 아래 세포-중합체 계의 투여 가능성 및 이러한 하이드로겔이 광중합과 같은 경피 방사선 유도 중합을 수행할 수 있는 능력이 있다. 숙주 동물에게 손상을 입히지 않는 X선 또는 감마선의 선량은 또한 숙주 동물에 이식한 후에 중합을 개시하는 데에도 사용될 수 있다.
생체적합성 스캐폴드 내의 성체 중간엽 줄기 세포로부터 유도된 생물 공학적 처리된 지방 조직은 소정의 3차원 형상, 즉 형태 및 크기를 갖고 있는 것이 바람직하다. 이 형상은 주형이나 생체외(숙주 신체의 외부) 다른 형태에서 생체적합성 스캐폴드를 중합시켜(형성시켜) 수득할 수 있다. 생체적합성 스캐폴드의 3차원 형상은 또한 생체적합성 스캐폴드가 제조되는 숙주 신체 내의 생체내 위치의 크기 및 형태에 따라 결정될 수 있다.
지방 조직이 제조되는 지방형성 작제물은 생체적합성 스캐폴드 및 골수 유래의 성체 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 이 작제물은 스캐폴드 안에 분산된 지방형성제를 포함한다. 이러한 지방형성제는 프로글리타존, β 계열의 성장인자, 프로스타글란딘, 시글리타존, 덱사메타손 또는 이의 혼합물일 수 있다.
조성물은 중합된 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트와 같은 수화된 하이드로겔 중합체로 구성된 생체적합성 스캐폴드, 사람 골수 유래의 성체 중간엽 줄기 세포, 및 추가로 지방형성제, 영양 배지, 경우에 따라 성장인자 및 하나 이상의 항생제를 포함한다. 지방형성제, 영양소 및 항생제의 예에는 암포테리신 B, 시글리타존, 비오틴, 덱사메타손, 젠타마이신, 인슐린, 3-이소부틸-1-메틸잔틴 및 L-티록신(thyroxine)이 있다.
생체내에서 생물 공학적 처리된 연조직을 생산하는 방법은 성체 중간엽 줄기 세포와 지방형성 배지를 포함하는 생체적합성 스캐폴드를 포함하는 조성물을 숙주 동물에게 이식하는 것을 포함한다. 성체 중간엽 줄기 세포는 이 세포와 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트와 같은 단량체 전구체를 포함하고, 추가로 암포테리신 B, 시글리타존, 비오틴, 덱사메타손, 젠타마이신, 인슐린, 3-이소부틸-1-메틸잔틴 및 L-티록신을 함유하는 혼합물의 중합 후에 포획(entrapment) 등을 통해 스캐폴드에 부착된다. 중합시 형성된 생체적합성 스캐폴드는 중합되고 수화된 하이드로겔 중합체를 포함한다.
추가 단계로는 성체 중간엽 줄기 세포를 수거하는 단계, 이 세포를 지방형성 배지와 접촉시키고 이러한 접촉을 지방세포로의 분화를 유도하기에 충분한 시간 동안 유지하는 단계, 수득되는 지방세포를 생체적합성 스캐폴드 위에 적재하는 단계, 및 지방세포가 적재된 스캐폴드를 숙주 동물에게 이식하는 단계를 포함한다.
생체외 생물 공학적 처리된 연조직의 생산방법에는 추가로, 지방형성제, 영양 배지 및 하나 이상의 항생제를 포함하는 스캐폴드 하이드로겔 기질 내에서 세포의 포획에 의해 실시되는, 생체적합성 스캐폴드에 성체 중간엽 줄기 세포를 부착시키는 단계를 포함한다. 스캐폴드는 지방형성제, 영양 배지 및 하나 이상의 항생제, 예컨대 암포테리신 B, 시글리타존, 비오틴, 덱사메타손, 젠타마이신, 인슐린, 3-이소부틸-1-메틸잔틴 및 L-티록신을 포함하는, 중합 수화된 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 기질을 포함한다.
익명의 성인 제공자 유래인 시중에서 입수할 수 있는 사람 중간엽 줄기 세포는 지방형성 세포로 분화되었다. hMSC 유래의 지방세포는 PEG 하이드로겔로 피막화되고, 면역결핍성 마우스의 등에 수술로 만들어낸 피하 주머니에 이식했다. 생체내 이식 4주 후, 줄기 세포 유래의 지방 조직 이식편을 수거했다. 도 4는 PEG 하이드로겔 스캐폴드의 회복 과정을 보여준 것이다. hMSC 유래의 지방형성 세포를 피막화한 PEG 하이드로겔은 도 1D에서와 같이 색이 어둡게 나타나고 숙주 피하 조직에 잘 부착되어 있다(도 5). 도 6은 생체내 이식 후 PEG 지방 조직 이식편의 형태, 규모 및 상이한 불투광도를 보여주는 것이다. hMSC 유래 지방형성 세포를 피막화한 PEG 하이드로겔 작제물은 원 형태와 규모를 유지할 뿐만 아니라 상당한 불투광도를 나타냈다(도 6D). 이는 hMSC 유래 지방형성 PEG 작제물에서 상당한 양의 생물 구조가 형성되었음을 암시한다. PEG 하이드로겔 작제물과 대조적으로, 동일하게 생체내 이식 4주 후 수거한 콜라겐 스펀지는 원 형태와 규모를 상실했다. 도 7에 도시된 바와 같이, 모든 콜라겐 스펀지는 무세포이든, hMSC가 접종된 것이든, 또는 hMSC 유래 지방형성 세포가 접종된 것이든지의 여부에 관계없이, 원 형태를 상실하고 상당량이 축소되었다(도 7C). 지질 축적의 조직학적 마커인 오일-레드-O 염색에서, hMSC 유래 지방형성 PEG 및 콜라겐 작제물은 양성 염색을 나타냈다. 하지만, H&E 염색에서는 PEG 작제물로의 숙주 세포 침습이 확인되지 않았는데, 이것은 생성된 지방조직 모두가 이식된 사람 MSC 유래 지방형성 세포로부터 유도된 것임을 암시한다. 비교로서, 숙주 마우스 세포가 콜라겐 스펀지를 침습하기 쉬우므로, 콜라겐 작제물 내에서의 지방형성에 숙주 세포가 기여할 것이라는 가능성을 남겼다(도 8).
사람 중간엽 줄기 세포는 페트리 접시의 단층 배양물 뿐만 아니라 3D 하이드로겔 및 동물 모델 생체내에서도 연조직의 성분으로 쉽게 분화한다. 사람 MSC는 면역거부의 문제를 우회하기 위해서는 자가 세포 치료법이 유용하기 때문에 외과적 복원을 필요로 하는 연조직 결함을 보유한 환자로부터 쉽게 분리할 수 있다. PEG 하이드로겔 중의 hMSC 유래 연조직 이식편은 피하 이식 4주 후 소정의 형태 및 규모를 사실상 100% 유지할 수 있다.
혈관신생은 지방 조직 공학을 비롯한 공학적 처리된 조직의 문제점으로 남아 있다. 분리 시도에도 불구하고, 공학적 처리된 연조직 이식편에서는 조절된 혈관신생이 유도되어야 한다. 전구지방세포 세포주 유래의 지방 패드(pad)에서의 혈관신생은 전구지방세포보다는 숙주 유래인데, 이것은 숙주 혈관신생을 자극해야 한다는 것을 시사한다. 지방 조직은 연조직의 주성분이지만, 연조직은 지방조직보다 더 많은 것으로 이루어진다. 예를 들어, 숙주 섬유성 조직은 공학적 처리된 연조직 이식편에 필요한 것일 수 있다. 골 조직 공학에서 혈관신생을 유도하기 위한 여러 시도는 공학적 처리된 지방 조직에서 혈관신생을 유도하는데 유용하다.
규모 확대(scale up)는 연조직 공학을 비롯한 일반 조직 공학의 문제점이다. 게시된 조직 처리된 연조직 이식편은 직경이 최고 9mm이고 특정 얼굴 연조직 결함 및 다른 소형 연조직 결함에 충분하다. 하지만, 유방절제술 후 연조직 결함 및 큰 외상은 수배 큰 규모 확대를 필요로 한다. 대량 수송, 영양소 확산, 혈관신생 및 신경 분포와 같은 문제도 공학적 처리된 연조직의 규모 확대에 있어서 연구 과제로서 점차 다루어지고 있다.
실시예 1: 지방 조직 공학을 위한 생체외 배양 및 생체내 이식물
A. 사람 MSC의 분리 및 배양
사람 MSC(hMSC)는 건강한 22세 남성 제공자(AllCells, LLC., Berkely, CA)의 장골능 유래의 전(全) 골수 흡인물에서 분리했다. 간략히 설명하면, 세포는 RosetteSep 중간엽 농축 칵테일(StemCell Technologies, Inc., Vancouver, Canada)을 전 골수 시료에 첨가하여 농축시켰다. 그 다음, 세포를, 2% 태아 송아지 혈청(FBS)(Atlanta Biologicals, Inc., Norcross, GA) 및 1mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)(Sigma, St.Louis, MO)을 포함하는 인산염 완충 식염수(PBS)로 2배 부피로 희석했다.
희석된 시료를 Ficoll-Paque(StemCell Technologies, Inc., Vancouver, Canada) 쿠션 상부에 적층하고, 25분간 300xg로 원심분리했다. 농축된 세포를 Ficoll-Paque 혈장 계면에서 분리하여, 2% FBS 및 1mM EDTA를 포함하는 PBS로 세척하고, 그 후 세포를 완전 배양 배지 [hMSC용 MesenCult 기본 배지(StemCell Technologies, Inc., Vancouver, Canada), 10% 사람 중간엽 줄기 세포 자극 보충 물(StemCell Technologies, Inc., Vancouver, Canada) 및 1% 항생제-항진균제(Gibco, Carlsbad, CA)]에 재현탁시켰다. 세포를 계수하여, 100mm 배양 접시에 10ml 완전 배지씩 평판배양하여 95% 공기/5% CO2, 37℃에서 생육시켰다. 24시간 후, 비부착성 세포는 제거하고, 부착성 세포는 PBS로 2회 세척하고 3 내지 4일마다 새로운 배지로 교환하면서 10 내지 14일 동안 생육시켰다. 대형 콜로니가 형성되고 컨플루언스(confluence) 형성 전, 1차 hMSC를 0.25% 트립신 및 1mM EDTA로 37℃에서 5분 동안 트립신처리하고, 계수한 뒤, 100mm 접시에서 다시 평판배양했다. 오로지 1차 계대한 hMSC만을 사용했다.
B. hMSC 의 지방형성 보충물 처리
피막화 연구를 위해, 1차 계대한 hMSC를 기본 배지 또는 지방형성 배지에서 각각 1주 동안 배양했다. 기본 배지는 사람 중간엽 줄기 세포용 MesenCult 기본 배지(StemCell Technologies, Inc., Vancouver, Canada), 10% 사람 중간엽 줄기 세포 자극 보충물(StemCell Technologies, Inc., Vancouver, Canada) 및 1% 항생제-항진균제(Gibco, Carlsbad, CA)로 구성된 것이다. 지방형성 배지는 사람 중간엽 줄기 세포용 MesenCult 기본 배지(StemCell Technologies, Inc., Vancouver, Canada), 10% 사람 지방형성 자극 보충물(StemCell Technologies, Inc., Vancouver, Canada) 및 1% 항생제-항진균제(Gibco, Carlsbad, CA)로 구성된 것이다. 배양물은 95% 공기/5% CO2, 37℃에서 생육시켰고, 배지는 3 내지 4일마다 교환했다.
단층 배양에서의 지방형성 과정을 입증하기 위하여 1차 계대한 hMSC를 각각 기본 또는 지방형성 배지에서 4주 동안 배양하고, 오일 레드-O(Sigma, St.Louis, MO)로 염색했다. 배양물 내 지방 침전물을 보여주는 양성 오일 레드-O 염색에 대해 배양물을 비교했다.
C. 하이드로겔 / 광개시제 용액 제조 및 작제물 가공
하이드로겔 용액을 제조하기 위하여, 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트(PEGDA)(MW3400; Shearwater Polymers, Huntsville, AL)를 페니실린 100U/ml과 100㎍/ml 스트렙토마이신(Gibco, Carlsbad, CA)이 보충된 멸균 PBS 중에 용해시켜 10%w/v의 최종 용액을 수득했다. 이러한 PEGDA 용액에 광개시제, 2-하이드록시-1[4-(하이드록시에톡시)페닐]-2-메틸-1-프로파논(Ciba, Tarrytown, NY)을 첨가하여 최종 광개시제 농도가 0.05%w/v인 용액을 수득했다.
기본 배지 또는 지방형성 배지에서 1주간 생육시킨 후, 1차 계대한 hMSC를 0.25% 트립신 및 1mM EDTA로 73℃에서 5분간 트립신처리하고, 계수한 뒤, PEGDA 중합체/광개시제 용액에 각각 5x106 세포/ml 밀도로 재현탁시켰다. 각 작제물을 제조하기 위해, 세포/중합체/광개시제 현탁액 150㎕ 분취량을 9mm 직경의 플라스틱 삽입기(1.5ml 미세원심분리관의 캡)(Fisher Scientific, Hampton, NH) 위에 적재했다. 적재 후, 세포/중합체/광개시제 현탁액을 담은 플라스틱 삽입기를 장파장 365nm 자외선 램프(Glowmark, Upper Saddle River, NJ)에 약 4mW/㎠ 강도로 5분 동안 노출시켰다. 그 다음, 광중합된 작제물을 플라스틱 삽입기에서 꺼내어, 멸균 PBS로 2회 세척하고, 각각 기본 배지 또는 지방형성 배지가 담긴 6웰 배양판(Fisher Scienctific, Hampton, NH)으로 옮겨담았다.
D. 작제물의 생체외 배양 및 생체내 이식
생체외 연구를 위해, hMSC 유래 지방형성 세포를 피막화하는 하이드로겔 작제물(n=12)을 지방형성 배지(앞에 기술한 것)에서 생육시키고, 미처리 hMSC를 피막화하는 하이드로겔 작제물(N=12)은 기본 배지(앞에 기술한 것)에서 생육시켰다. 모든 배양물은 95% 공기/5% CO2, 37℃에서 4주 동안 생육시키고, 3 내지 4일마다 배지를 교체했다.
생체내 연구를 위해, 지방형성 처리된 hMSC를 피막화하는 중합된 하이드로겔 작제물(n=8), 지방형성 처리된 hMSC를 피막화하는 작제물(N=4) 및 무세포 대조군 작제물(N=4)을 주형에서 꺼내어 멸균 PBS로 2회 세척했다. 100mg/kg 케타민과 5mg/kg 자일라진을 IP 주사하여 전신 마취하고 비절개 박리(blunt dissection)로 준비한 중증 복합면역결핍(SCID) 마우스(4 작제물/마우스)(Harlan, Indianapolis, IN) 등의 피하 주머니에 모든 작제물을 이식했다.
E. 세포 생육력 분석
세포 생육력은 제조자의 추천 프로토콜에 따라 생/사 생육력/세포독성 키트(Molecular Probes, L-3224, Eugene, OR)를 사용하여 4주간 생체외 생육시킨 작제물을 가지고 평가했다. 칼세인(형광 염료)은 세포막을 통해 확산하여, 세포내 에 스터라제와 반응하여 녹색 형광을 발생하는 반면, 에티디움 동종이량체는 손상된 세포막을 통해서만 확산하고 핵산에 결합하여 적색 형광을 발생한다. 세포 표지화 후, 시료를 장거리 이중 방출 형광 필터(Chroma, Rockingham, VT)를 장착한 도립 광현미경(Leica Microsystems, Wetzler, Germany)으로 관찰했다.
F. 조직검사
4주간 생체외 생육 및 SDID 마우스 등에서 생체내 배양한 후, 작제물을 최적 절단 온도(OCT) 조직 동결 혼합물(IMEB, Chicago, IL)에 매립시키고, 표준 조직검사 기술을 사용하여 10㎛ 절편으로 절단했다. 절편을 오일 레드-O(Sigma, St. Louis, MO)로 염색하고, 글리세롤 젤라틴(Sigma, St.Louis, MO)으로 고정시킨 다음, 광학 현미경(Leica Microsystems, Weltzer, Germany)으로 관찰했다.
G. RNA 추출 및 역전사 폴리머라제 연쇄 반응
총 RNA는 수거한 생체내 작제물로부터 RNeasy Purification Reagent(Qiagen; Valencia, CA)을 사용하여 추출했다. 작제물을 RNeasy 키트 유래의 RLT 완충액 200㎕가 담긴 1.5ml 미세원심분리관에서 균질화했다(펠드 막자 혼합기; Kimble/Kontes, Vineland, NJ). 그 다음, RLT 완충액 400㎕를 첨가한 후, QUIshredder(Qiagen, Valencia, CA) 컬럼을 이용하여 추가 균질화했다. 역전사(RT)는 슈퍼스크립트 증폭 시스템(Gibco, Carlsbad, CA)으로 랜덤 헥사머를 사용하여 수행했다. 수득되는 cDNA 1㎕ 분취량을 Ex Taq DNA 폴리머라제 프리믹스(Takara Bio, Otsu, Shiga, Japan)를 사용하여 50㎕ 부피에서 어닐링 온도 58℃ 하에 30회 증폭시켰다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)은 PPAR-γ2의 특이적인 사람 프라이머, 센스: 5'-GCTGTTATGGGT GAAACTCTG-3'(서열번호 1), 안티센스: 5'-ATAAGGTGGAGATGCAGGCTC-3'(서열번호 2), 및 관리유전자(housekeeping gene) 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH), 센스: 5'-CCCATGTTCGTCA-TGGGTGT-3'(서열번호 3), 안티센스: 5'-TGGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3'(서열번호 4)를 사용하여 수행했다. PCR은 30 내지 35 사이클을 수행했고, 각 사이클마다 95℃에서 30초간 변성, 55 내지 60℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 1분간 신장 반응 후, 최종 사이클을 완료한 후 72℃에서 추가 10분 동안 유지시켰다. 게놈 DNA의 가능한 오염을 차단하기 위하여, RT가 아닌 반응물에서 PCR 반응을 실시했다. 증폭된 상보성 DNA를 1% 아가로스 겔을 통해 전기영동하고, 염색한 뒤, 자외선 하에서 사진촬영했다.
H. 조직 공학적 처리된 지방조직 작제물의 전체적인 검사
생체내 이식 및 생체외 생육 4주 후, 두 작제물(hMSC 유래 지방형성 세포를 피막화한 것) 및 대조군 작제물(미처리 hMSC를 피막화한 작제물 또는 무세포 작제물)은 원 플라스틱 주형(도 1A)의 물리적 형태와 규모를 유지했다. 물리적 촉진 시, 작제물은 단단하고 탄성이며 제한된 정도의 강직성을 나타냈다. 조직 공학적 처리된 지방형성 작제물(도 1B)은 연황색이고, 기본 배지(지방형성 배지가 아닌)에서 처리된 hMSC를 포함하는 생체내 이식에서 수거한 투명 작제물(도 1C) 및 수거된 무피막화세포 대조군 작제물(도 1D)에 반해 불투광성이었다.
I. 생체외 생육된 단층 배양물 및 하이드로겔 작제물에서의 hMSC 의 지방형성
지방형성 배지에서 4주 동안 생육된 사람 MSC 단층 배양물은 적색으로 표시되는 오일 레드-O 염색에 대하여 양성 반응을 나타냈고(도 2A), 이에 반해 기본 배지 존재(지방형성 배지 없이) 하에 단층 배양된 hMSC에서는 오일 레드-O 염색이 일어나지 않았다. 오일 레드-O는 심적색의 라이소크롬(지용성 염료)으로서, 주로 동결 절편에 트리글리세라이드의 존재를 증명하는데 주로 사용된다(Lillie, Conn's Biological Stains, 9th Ed. Baltimore Williams & Wilkins co., 1977). 이와 유사하게, 지방형성 처리된 hMSC를 피막화하는 하이드로겔 작제물은 PEG계 하이드로겔에서 4주간 생체외 생육한 후 오일 래드-O로의 양성 염색을 나타낸 반면, 비지방형성 배지 처리된 hMSC를 피막화한 PEG계 하이드로겔에서는 오일 레드-O 염색이 일어나지 않았다(도 2C 및 도 2D).
J. 생체내 조직 공학적 처리된 지방형성 작제물
조직 검사와 RT-PCR 분석에서는 SCID 마우스의 등에 생체내 배양 4주 후 지방형성 처리된 hMSC를 피막화한 하이드로겔 작제물에서 지방 조직이 새로(de novo) 형성되었음을 보여주었다(도 3). 지방형성 작제물은 미처리 hMSC를 피막화한 대조군 작제물(도 3B) 또는 무피막화세포 대조군 작제물(도 3C)와 비교했을 때 양성 오일 레드-O 염색(도 3A)을 나타냈다. 또한, 무피막화세포 대조군 작제물에서는 숙주 세포 침습의 징후 및 하이드로겔 작제물의 온전한 경계가 전혀 관찰되지 않았다(도 3C). 지방세포 특이적 PPAR-γ2 유전자는 지방형성배지 처리된 hMSC를 피막화한 지방조직 작제물에서 양성 발현되었다(도 3D). 마우스는 온도와 빛이 조절되는 방(23-25℃, 14시간 주간/일)에 넣어, 표준 1일 식사 및 물 공급량을 제공했다.
실시예 2: 비다공성 생체재료에서 성장 및 혈관신생되는 공학적 처리된 연조직
A. PEG 하이드로겔 제조
폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트(1g)(Shearwater Huntsville, AL, USA)를 133 유닛/ml 페니실린 및 133mg/ml 스트렙토마이신(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)이 보충된 6.6ml PBS 중에 용해시켜 6.6%w/v의 최종 용액을 수득했다.
자외선 광개시제인 2-하이드록시-1-[4-(하이드록시에톡시)페닐]-2-메틸-1-프로파논(Irgacure)(Ciba, Tarrytown, NY, USA)]은 100% 에탄올 중에 50mg/ml 농도로 용해시켰다. 광개시제/에탄올 용액 100㎕를 PEG 용액 6.6ml에 첨가하여 최종 유닛 스톡 PEG 용액을 제조했다.
B. 시험관내 bFGF 방출 프로필
섬유아세포 성장 인자-염기성(bFGF) 사람 재조합체(Sigma, St.Louis, MI, USA)는 0.1% 소혈청알부민(BSA)을 포함하는 PBS로 제조자의 지침에 따라 25㎍/ml의 농도로 재건시켰다. 이 용액을 다시 BSA 보충된 PBS로 0.4㎍/ml의 최종 농도로 희 석했다. 0.4㎍/ml bFGF 용액 총 100㎕를 200㎕ PEG 스톡 용액이 담긴 멸균 시험관에 첨가했다. 이 혼합물을 5회 피펫팅하여 균질하게 한 다음, 75㎕씩 에펜도르프 캡의 실린더형 주형에 담았다. 이러한 실린더형 주형에 365nm의 UV선(Glo-Mark, Upper Saddle River, NJ, USA)을 5분 동안 조사하여 광중합시켰다. 각각 0.1% BSA/PBS 용액 1ml를 담고 있는 각 시험관에 bFGF 적재된 PEG 하이드로겔 실린더를 넣고, bFGF 방출 동역학을 측정하기 위하여 37℃ 수조에서 1일, 3일, 7일, 14일, 21일 및 28일(각 시간 당 N=4) 동안 방치했다. 각 시간 점마다. 각 시험관의 상청액을 채취하여 사람 bFGF 면역분석법(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)(Alhadlaq et al., 2004; Moioli et al., 2005)으로 분석했다.
C. PEG 하이드로겔로부터 방출된 bFGF 의 생물활성
섬유아세포성장인자-염기성(bFGF) 사람 재조합체(Sigma, St.Louis, MI, USA)는 전술한 바와 같이 개건하고, 추가 희석하여 최종 농도 4㎍/ml로 만들었다. 4㎍/ml bFGF 용액 총 200㎕를 PEG 스톡 용액 400㎕와 함께 멸균 시험관에 첨가했다. 이 혼합물을 5회 피펫팅하여 균질하게 만들고, 각각 75㎕ 분취량씩 에펜도르프 실린더형 주형에 담은 다음, 365nm UV선(Glo-Mark, Upper Saddle River, NJ, USA)으로 5분간 광중합시켰다. bFGF 없는 PEG 하이드로겔 실린더를 제조하기 위하여, bFGF 용액 대신에 0.1% BSA/PBS 용액 200ml를 사용했다.
사람 피부 섬유아세포(hDF)(Cambrex, Walkersville, MD, USA)는 10% 태아송아지 혈청 및 1% 페니실린과 스트렙토마이신이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM 완전 배지) 4ml에 20,000 세포/웰의 밀도로 평판배양했다. 부착성 hDF는 다음과 같은 4가지 조건(N=6/그룹)에서 배양했다: 1) 0.1% BSA/PBS를 함유하는 블랭크 액체(도 9A); 2) 0.1% BSA/PBS 적재된 블랭크 PEG 하이드로겔(도 9A), 3) PEG 하이드로겔 없이 6.25ng/ml bFGF를 함유하는 bFGF 용액(도 9B), 및 4) 0.1㎍ bFGF를 함유하는 bFGF 적재된 PEG 하이드로겔(도 9B). 그룹 4에서 hDF는 DMEM 중에서 각 세포 배양 웰(0.4㎛ 세공 크기)에 배치된 트랜스웰 삽입기(Becton Dickinson Labaware, Franklin Lakes, NJ)와 함께 37℃, 5% CO2 하에 1주 동안 배양했다(도 9C). 트랜스웰 삽입기는 DMED 배지 중의 hDF 단층 배양물 위에 0.9mm 이격되어 배치되어, bFGF 적재된 PEG 실린더와 직접 접촉시킴이 없이 방출된 bFGF에 세포를 노출시켰다(도 9C). 각각 상기 4 조건하에서 1주간 배양한 후, hDF를 0.1% TritonX 용액(Sigma, St.Louis, MI, USA) 500㎕로 처리하고, 멸균 1회용 세포 리프터(Fisherbrand, Pittsburgh, PA)로 긁어낸 다음, 조직 배양관에 수집하여, 빙상에서 초음파(Sonica Dismembrator Mode 100, Fisher, Pittsburgh, PA, USA)를 이용하여 용해 및 균질화시켰다. 그 다음, hDF 용해물을 원심분리관에 담아 -80℃에서 보관했다. DNA 함량은 본 출원인의 종래 방법(Fluorescent DNA Quantitation kit, Bio-Rad, Hercules, CA)에 따라 이본쇄 DNA에 결합된 Hoechst 33258의 형광 정량 분석으로 측정했다.
D. bFGF 적재된 PEG 하이드로겔의 생체내 이식
1㎍/㎕ bFGF 용액 총 100㎕를 PEG 용액 200㎕에 첨가한 다음, 부드럽게 혼합하고, 피펫팅으로 75㎕ 분취량씩 에펜도르프 캡의 실린더형 주형에 주입했다. 수득 되는 PEG 실린더는 365nm UV선(Glo-Mark, Upper Saddle River, NJ, USA)으로 5분간 광중합시켰다. 각 PEG 하이드로겔 실린더에 멸균 모세관으로 3개의 천공을 유도하여 총 3개의 거대통로를 만들었다(도 10B 및 도 10D). 다음의 PEG 하이드로겔 실린더는 생체내 이식을 위해 준비했다(N=4/그룹); 1) 블랭크(bFGF 없고, 거대통로 없음)(도 10A), 2) bFGF 적재되나 거대통로 없는 실린더(도 10B), 3) 거대통로 있으나 bFGF 없는 실린더(도 10C), 4) bFGF 적재되고 거대통로가 있는 실린더(도 10D).
수컷 중증 복합면역결핍(SCID) 마우스(C.B17 종; 4-5주령)를 케타민(100mg/kg체중) 및 자일라진(4mg/kg 체중)의 복강내 주입으로 마취시켰다(Alhadlaq et al., 2004). 마우스 등의 털을 깎고, 엎드린 자세로 두고, 10% 포비돈 요오드 및 70% 알콜로 소독했다. 등의 상부 정중시상 라인을 따라 1cm 길이의 직선 절단부를 만든 다음, 비절개 박리로 피하 주머니를 만들었다. 각 SCID 마우스에게 4가지 PEG 하이드로겔 이식물을 이식했다: 블랭크 PEG 겔, bFGF 적재되나 거대통로 없는 PEG, bFGF 없이 거대 통로만 있는 PEG, 및 bFGF와 거대통로가 있는 PEG. 절개부는 흡수성 단순 장 4-0 봉합사로 봉합했다. 모든 PEG 하이드로겔 실린더는 4주 동안 생체내 이식되었다. 본 동물 프로토콜은 동물 보호 협회의 승인 하에 이루어졌다.
E. 생체내 PEG 하이드로겔 시료의 수거, 조직분석, 면역조직화학 및 데이터 분석
SCID 마우스의 등에 피하 이식하고 4주 후, PEG 하이드로겔 실린더를 수거했다. CO2 질식 후, SCID 마우스의 등에 무균적으로 절개부를 만들었다. 주변 섬유성 피막을 조심스럽게 제거한 후, PEG 하이드로겔 실린더를 숙주로부터 분리하고, PBS로 세정한 다음, 10% 포르말린에 최소 24시간 동안 고정시켜 두었다. PEG 시료를 그 다음 파라핀에 매립시키고 횡단면(거대통로에 대해 횡방향; 도 10B 및 도 10D 참조)으로 5㎛ 두께로 절편화했다. 파라핀 절편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색했다.
H&E 염색된 절편에 인접한 후속 절편은 파라핀제거 후, PBS로 세척하고, 아세트산나트륨 완충액(pH 5.5) 중의 소 고환 히알루로니다제(1600U/ml) 및 150mM 염화나트륨으로 실온에서 30분 동안 분해했다. 모든 면역조직화학 절차는 종래 방법을 따랐다(Mao et al., 1998; Alhadlaq and Mao, 2005). 간략히 설명하면, 절편을 5% 소 혈청 알부민(BSA)으로 실온에서 20분 동안 처리하여 비특이적 반응을 차단했다. 다음과 같은 항체를 사용했다: 항혈관내피 성장인자(항VEGF)(ABcam, Cambridge, MA USA) 및 억제제인 악틸루라민산(Sigma, St.Louis, MI, USA)의 존재 및 부재 하에 트리티컴 불가리스(밀배아 어글루티닌)(WGA) 유래의 비오틴 표지된 렉틴. WGA는 α-D-GlcNAc 및 NeuAc가 풍부한 혈관내피세포의 탄수화물 기에 결합한다(Jinga et al., 2000; Izumi et al., 2003). 가습실에서 1차 항체와 하룻밤 항온배양한 후, 절편을 PBS로 세척하고 IgG 항마우스 2차 항체(1:500; Antibodies, Davis, CA)와 30분 동안 항온배양했다. 그 다음, 절편을 가습실에서 스트렙타비딘-HRP 접합체와 30분 동안 항온배양했다. PBS로 세척한 후, 2차 항체와의 이중 결합 절차를 반복했다. 슬라이드는 디아미노벤즈아딘(DAB) 용액으로 발색시키고, 메이어 헤마톡실린으로 3 내지 5분 동안 대비염색했다. 대비염색된 슬라이드를 등급별 에 탄올로 탈수시키고 자일렌으로 처리했다. 이와 동일한 절차를 1차 항체를 제외한 음성 대조군에 대해서도 수행했다.
공학적 처리된 거대통로에서 조직 내증식의 양은 H&E 염색된 절편 상에 존재하는, 적재된 bFGF를 보유하거나 보유하지 않은 거대통로를 가진 PEG 하이드로겔 내의 침윤된 숙주 조직의 양을 4x 확대 배율 하에 수동으로 대략으로 정량분석했다. 컴퓨터 영상 분석을 통해 수득되는 자동 면적값은 스투던트 t 검정 및 ANOVA를 사용하여 비교하여, bFGF가 적재되거나 적재되지 않은 거대통로화된 PEG 하이드로겔 간에 조직 내증식의 양이 유의적인 차이가 있는지를 측정했다.
F. 시험관내 bFGF 방출 프로필
PEG 하이드로겔에 피막화된 bFGF의 방출 프로필은 도 11A에 나타냈다. 이 PEG 내에 피막화된 bFGF의 방출 동역학은 처음 24시간 내에 집중적인 방출(약 5.8%)을 보인 다음, 검사된 28일 동안 지속적인 방출을 보였다(도 11A). 28일 동안, 피막화된 bFGF의 총 15.3%가 PEG 하이드로겔에서 방출되었다(도 11A).
G. PEG로부터 방출시 bFGF 대생물활성
PEG로부터의 방출된 피막화된 bFGF은 단층 배양된 사람 피부 섬유아세포에 대하여 독특한 효과를 나타냈다. bFGF 용액으로 처리된 hDF의 DNA 함량, 69.8±5.6ng(평균±S.E.; N=6; 도 11B의 좌측 검은색 막대그래프)은 bFGF에 노출되지 않은 hDF의 DNA 함량, 34.5±2.7ng(N=6; '블랭크' 또는 도 11B의 좌측 흰색 막대그래 프)에 비해 훨씬 높았다. 이와 마찬가지로, PEG 하이드로겔로부터 방출된 bFGF로 처리된 hDF의 DNA 함량, 52.6±3.7(N=6; 도 11B의 우측 검은색 막대그래프)은 bFGF 없는 PEG 하이드로겔에 노출된 hDF의 DNA 함량, 27.5±1.7(N=6; '블랭크' 또는 도 11B의 우측 흰색 막대그래프)에 비해 훨씬 높았다. 흥미롭게도, bFGF 용액이 보충된 DMEM에서 배양한 hDF의 DNA 함량은 PEG 하이드로겔에서 방출된 bFGF 보충된 DMEM에서 배양된 hDF의 DNA 함량보다 훨씬 높았다(P=0.43)(도 11B의 두 검은색 막대그래프). 이러한 bFGF 용액에 의해 유도된 hDF의 DNA 함량과 PEG 하이드로겔에서 방출된 bFGF에 의해 유도된 hDF의 DNA 함량의 차이는 이하에서 논의될 것이다.
H. 거대통로 및/또는 bFGF 를 보유한 생체내 수거한 PEG 하이드로겔
SCID 마우스의 등에 4주간 생체내 이식한 후, 거대통로 및 bFGF가 없는 수거된 PEG 하이드로겔 실린더의 H&E 염색 절편은 어떠한 숙주 조직 내증식도 나타내지 않았다(도 12A). 하지만, bFGF 없이 거대통로를 보유한 PEG 하이드로겔은 거대통로의 내강에서만 숙주 조직 내증식을 나타내고, 나머지 PEG에서는 내증식을 나타내지 않았다(도 12B). 이에 반해, 거대통로 없이 bFGF만 적재된 PEG 하이드로겔은 분리된 PEG 하이드로겔 영역에서 분명히 무작위적인 숙주 조직 내증식 영역을 나타냈다(도 12C). 가장 흥미로운 점은, bFGF 적재되고 거대통로를 보유한 PEG 하이드로겔에서는, 잔여 PEG가 아닌, 거대통로의 내강으로만 숙주 조직 내증식을 나타낸다는 점이다(도 12D). 거대통로를 보유하고 bFGF가 적재된 PEG 하이드로겔 실린더는 내증식성 숙주 조직이 0.47±0.18㎟으로, 거대통로를 보유한 bFGF 없는 PEG 하이드 로겔 실린더의 0.13±0.05㎟(평균±S.D.; P<0.01; N=4/그룹)에 비해 훨씬 많았는데, 이는 bFGF가 없는 것보다 bFGF를 보유하고 거대통로화된 PEG 하이드로겔에서의 숙주 조직 내증식이 더 왕성한 것을 의미한다.
상이한 물리적 및 화학적 조건, 즉 거대통로를 보유하거나 보유하지 않고 bFGF로 처리된 생체내 수거된 PEG 하이드로겔을 고배율 조사한 결과, 혈관 유사 구조물의 형성이 확인되었다(도 13). bFGF 없이 거대통로를 보유한 생체내 수거된 PEG 하이드로겔은 20x 배율에서 널리 분포된 혈관 유사 구조를 나타냈다(도 13A). 60x 배율에서는 작은 혈관 유사 구조가 내피세포 유사 세포로 분명하게 둘러싸여 있었고, 적혈구 세포와 흡사한 에오신 양성 세포를 함유하고 있었다(도 13B). 이에 반해, 거대통로가 없는 bFGF 적재된 PEG 하이드로겔은 분명히 무작위적인 방식으로 널리 분포된 세포 침윤을 나타냈고, PEG 하이드로겔의 영역은 그대로 보존되었다(도 13C의 H). 도 13C에서 보이는 다수의 포말형 구조물은 침습된 숙주 세포와 조직(도 13C의 H로 표시된 넓은 PEG 하이드로겔 부분) 중에서 분해를 일으킨 PEG 하이드로겔을 나타내는 것으로 보인다. 60x 배율에서는 세포질이 많은, 두께운 막-유사 구조의 밴드가 PEG 하이드로겔과 침습된 숙주 조직을 분리하고 있는 것으로 보였다(도 13D). 특이한 점은, 거대통로를 보유하고 bFGF 적재된 PEG 하이드로겔이 도 13E에서 화살표로 표시한 것과 같은 뚜렷한 혈관 유사 구조물 중에서 집중적인 숙주 세포 침습을 나타낸다는 점이다. 60x 배율에서 화살표로 표시된 혈관 유사 구조물은 내피유사 세포가 안에 둘러싸여 있는 것을 분명하게 나타냈고, 적혈구 세포와 흡사한 도넛형의 무핵 세포를 함유하고 있었다(도 13F).
항VEGF 항체는 bFGF 또는 거대통로 없는 수거된 PEG 하이드로겔 실린더의 대표적 단면에서 음성 면역블롯 반응을 나타냈다(도 14A). 하지만, bFGF 없이 거대통로를 보유한 PEG 하이드로겔은, PEG에서가 아닌, 거대통로에서만 다소 미약한 반응을 나타냈다(도 14B). 이에 반해, 거대통로 없이 bFGF 적재된 PEG 하이드로겔은, 조직 내증식 없이 분명한 하이드로겔 스캐폴드 영역을 유지했지만, 광범위한 항VEGF 면역블롯 반응을 나타냈다(도 14C). 거대통로를 보유하고 bFGF가 적재된 PEG 하이드로겔은 거대통로에서 양성 항VEGF 염색을 나타내지만, 잔여 PEG에서는 보이지 않았다(도 14D).
침습성 숙주 조직의 대부분은 혈관 내피세포를 표지하는 항체(Jinga et al., 2000; Izumi et al., 2003)인, 트리티컴 불가리스(밀배아 어글루티닌)(WGA) 유래의 렉틴에 의해 양성으로 염색되었다(도 15). 이러한 WGA로의 양성 염색은 WGA 억제제, 악틸루라민산으로 염색하여 확인했다. 도 15A에서 양성 WGA 염색된 밴드는 숙주 조직에 의해 형성된, 이식된 거대통로 없고 bFGF 없는 PEG 하이드로겔 실린더의 막 주위를 나타낸다. bFGF는 없지만 거대통로를 보유한 PEG 하이드로겔 실린더(도 15B) 뿐만 아니라 bFGF와 거대통로를 모두 보유한 PEG 하이드로겔 실린더(도 15D)에서도 강한 WGA 염색이 나타났는데, 이것은 침습된 숙주 혈관 및 과립 조직에 내피세포의 존재를 암시하는 것이다. 이에 반해, 거대통로 없이 bFGF가 적재된 대표적인 PEG 하이드로겔 실린더의 WGA 염색은 다소 약하게 나타났다(도 15C).
참고문헌
Figure 112007009238430-PCT00001
Figure 112007009238430-PCT00002
Figure 112007009238430-PCT00003

Claims (20)

  1. 비다공성 생체적합성 스캐폴드에 분산된 성체 중간엽 줄기 세포를 포함하는 연조직 작제물.
  2. 제1항에 있어서, 추가로 소정의 3차원 형태 및 규모를 갖는 것을 특징으로 하는 연조직 작제물.
  3. 제1항에 있어서, 스캐폴드가 하이드로겔 중합체인 연조직 작제물.
  4. 제3항에 있어서, 하이드로겔 중합체가 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트인 연조직 작제물.
  5. 제1항에 있어서, 지방 및 섬유성 조직을 포함하는 연조직 작제물.
  6. 제1항에 있어서, 성체 중간엽 줄기 세포가 골수 세포에서 유래하는 연조직 작제물.
  7. 제1항에 있어서, 스캐폴드가 고체, 액체, 겔, 메쉬(mesh), 분말, 스펀지 및 페이스트(paste)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 물리적 형태인 연조직 작제물.
  8. 제1항에 있어서, 스캐폴드가 폴리락트산 폴리글리콜산, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 물질을 포함하는 연조직 작제물.
  9. 제1항에 있어서, 스캐폴드가 알기네이트, 키토산, 산호, 아가로스, 섬유소, 콜라겐, 골(骨), 실리콘, 연골, 하이드록시아파타이트, 인산칼슘 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 천연 물질을 포함하는 연조직 작제물.
  10. 제1항에 있어서, 지방형성제(adipogenic agent)가 프로글리타존, β 계열의 성장 인자 및 프로스타글란딘으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 연조직 작제물.
  11. (a) 소정의 3차원 형상을 가진 비다공성 생체적합성 스캐폴드에 분산된 성체 중간엽 줄기 세포를 제공하는 단계;
    (b) 상기 성체 중간엽 세포를 지방형성(adipogenic) 유도 보충물과 접촉시키는 단계; 및
    (c) 지방세포가 적재된 스캐폴드를 숙주에 이식하는 단계
    를 포함하여, 소정의 3차원 형태와 규모를 보유한 연조직 작제물을 제조하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 비다공성 생체적합성 스캐폴드가 하이드로겔 중합체인 제조 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    (c) 중간엽 세포를 섬유아세포성장인자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
  14. 제12항에 있어서, 중간엽 줄기 세포가 생체적합성 스캐폴드 전구체 내에 분산된 다음 하이드로겔 중합체가 형성되는 제조 방법.
  15. 제15항에 있어서, 숙주에 이식된 후 하이드로겔의 중합을 개시함을 추가로 포함하는 제조 방법.
  16. 제11항에 있어서, 연조직이 지방 조직 및 섬유성 조직을 포함하는 제조 방법.
  17. 숙주의 연조직을 복원, 확대 또는 재구성하는데 사용되는 제1항에 기재된 연조직 작제물의 용도.
  18. 제17항에 있어서, 숙주가 포유동물인 용도.
  19. (a) bFGF 및 성체 중간엽 줄기 세포를 보유한 하나 이상의 비다공성 하이드로겔 실린더를 제조하는 단계; 및
    (b) 하나 이상의 하이드로겔 실린더를 숙주에 이식하여 혈관신생을 유도하는 단계를 포함하여, 연조직 이식물에서 혈관신생을 유도하는 방법.
  20. (a) 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 2-하이드록시-1-[4-(하이드록시에톡시)페닐]-2-메틸-1-프로파논, 덱사메타손, 형질전환성 성장인자 베타-1, β-글리세로포스페이트 및 아스코르브산 2-포스페이트를 포함하는 영양소 배지, 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 생체적합성 스캐폴드; 및
    (b) 사람 골수 유래의 성체 중간엽 줄기 세포
    를 포함하는 조성물.
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KR20160117050A (ko) 2015-03-31 2016-10-10 홍익대학교세종캠퍼스산학협력단 생체분해성 고분자를 포함하는 마이크로젤 및 이의 제조방법

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