CN108913654B - Hippo-YAP通路与Wnt通路相互作用在脂肪干细胞细胞谱命运选择中的用途 - Google Patents

Hippo-YAP通路与Wnt通路相互作用在脂肪干细胞细胞谱命运选择中的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN108913654B
CN108913654B CN201810734425.3A CN201810734425A CN108913654B CN 108913654 B CN108913654 B CN 108913654B CN 201810734425 A CN201810734425 A CN 201810734425A CN 108913654 B CN108913654 B CN 108913654B
Authority
CN
China
Prior art keywords
yap
catenin
beta
pathway
adipose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810734425.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108913654A (zh
Inventor
李兴艳
李军最
黄克
李林
张波
胡敏
杨业静
黄家志
蔡敏
杜勇军
郑泽文
周松
马鸳霞
李加洪
宋菲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Second Peoples Hospital of Nanning
Original Assignee
Second Peoples Hospital of Nanning
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Second Peoples Hospital of Nanning filed Critical Second Peoples Hospital of Nanning
Priority to CN201810734425.3A priority Critical patent/CN108913654B/zh
Publication of CN108913654A publication Critical patent/CN108913654A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108913654B publication Critical patent/CN108913654B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0654—Osteocytes, Osteoblasts, Odontocytes; Bones, Teeth
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0653—Adipocytes; Adipose tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1384—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from adipose-derived stem cells [ADSC], from adipose stromal stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了Hippo‑YAP通路与经典Wnt相互作用在制备用于影响脂肪干细胞细胞谱命运选择的产品中的用途，具体地，公开了YAP蛋白与β‑catenin相互结合在制备用于影响脂肪干细胞细胞谱命运选择的产品中的用途。本发明提供了抑制YAP蛋白与β‑catenin相互结合的物质在制备用于促进β‑catenin向细胞核内转移的产品中的用途，或者抑制YAP蛋白与相互结合的物质在制备用于提高TCF转录活性中的产品中的用途，或者抑制YAP蛋白与β‑catenin相互结合的物质在制备用于促进细胞核内经典Wnt通路的产品中的用途。

Description

Hippo-YAP通路与Wnt通路相互作用在脂肪干细胞细胞谱命运 选择中的用途
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种Hippo-YAP通路与经典Wnt相互作用在制备用于影响脂肪干细胞细胞谱命运选择的产品中的用途，更具体涉及YAP蛋白与β-catenin相互结合在制备用于影响脂肪干细胞增殖和细胞谱命运选择的产品中的用途。
背景技术
随着道路交通和机械化生产的高速发展，因暴力等高能量创伤原因导致的骨折如粉碎性骨折及骨折术后不愈合都是骨科最为棘手的问题，临床上通常采用自体骨或同种异体骨移植的方法来治疗此类疾病。但是自体骨移植损害取骨的部位且获得的骨量有限，同种异体骨移植会带来诸如免疫排斥、疾病传染等风险。骨组织工程技术的迅速发展为彻底有效地治疗骨缺损带来了曙光[1]。脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ASCs)为来源于脂肪组织的间充质干细胞，通过简单的抽脂即能获得大量的种子细胞[2]。有关研究显示将脂肪干细胞和脐带静脉内皮细胞共培养后可以促进脂肪干细胞的成骨分化，此效应可能与脐带静脉内皮细胞分泌BMP-2促进 ASCs成骨分化相关[3]。
目前ASCs已广泛应用于骨缺损的修复，如Lin[4]等人利用稳定转染 BMP2/VEGF的ASCs成功修复了新西兰白兔的股骨干大段骨缺损。也有研究显示利用ASCs和珊瑚构建的骨组织能明显促进犬模型中临界尺寸颅骨缺损的修复，且此修复作用为ASCs直接成骨分化导致[5]。
但脂肪干细胞成骨能力较弱，其更易向脂肪组织分化，这限制了脂肪干细胞在骨缺损愈合方面的应用。因此，脂肪干细胞的分化方向需要进行调整，成脂分化需要得到抑制，成骨能力需要进一步的增强。
目前得到证实调节脂肪干细胞分化的方法主要有五种：一是使用荧光标记流式细胞仪筛选的方式将成骨能力较强的脂肪干细胞从干细胞群体中挑选出来进行扩增然后使用，这种方法每一次使用脂肪干细胞都需要进行荧光标记和流式细胞仪筛选，费时费力，降低了脂肪干细胞取材和使用方便的优势；二是使用成骨诱导液对脂肪干细胞进行成骨诱导，然后再应用到组织工程骨上促进骨缺损的愈合，这种方法只是将脂肪干细胞的成骨能力提前在体外得到发挥，并没有从本质上促进脂肪干细胞的成骨分化，对脂肪干细胞的成脂分化也没有影响；三是使用BMP等能促进脂肪干细胞成骨分化的细胞因子直接添加到培养基中或者以各种缓释的方式在体内对脂肪干细胞发挥作用，这种方式可以从本质上提高脂肪干细胞的成骨分化能力，但是其作用时间有限，促成骨或者抑制成脂的作用难以保持稳定、持久；四是使用小分子化物，例如地塞米松、他汀类药物对脂肪干细胞进行干预提升其成骨能力，这种方法比较简便且花费较少，但是作用效果有限；五是通过基因工程方法促进脂肪成骨分化、抑制成脂分化，但操作繁琐，费用昂贵，难以在临床上得到广泛推广。
因此，能够有效、持久、简便地促进脂肪干细胞成骨分化同时抑制其成脂分化的方法需要探索。
[1]Samavedi S,Whittington AR,Goldstein AS.Calcium phosphate ceramicsin bone tissue engineering:a review of properties and their influence on cellbehavior.Acta Biomater.2013.9(9):8037-45.
[2]Zuk PA,Zhu M,Mizuno H,Huang J,Futrell JW,Katz AJ,Benhaim P, LorenzHP,Hedrick MH.Multilineage cells from human adipose tissue: implications forcell-based therapies.Tissue engineering.2001.7(2):211-28.
[3]Wang J,Ye Y,Tian H,Yang S,Jin X,Tong W,Zhang Y.In vitroosteogenesis of human adipose-derived stem cells by coculture with humanumbilical vein endothelial cells.Biochem Biophys Res Commun.2011.412(1): 143-9.
[4]Lin C Y,Chang Y H,Sung L Y,et al.Long-term Tracking of SegmentalBone Healing Mediated by Genetically Engineered ASCs:Focuses on BoneRemodeling and Potential Side Effects.[J].Tissue Engineering Part A, 2013,20(9-10).
[5]Liu G,Zhang Y,Liu B,Sun J,Li W,Cui L.Bone regeneration in a caninecranial model using allogeneic adipose derived stem cells and coralscaffold.Biomaterials.2013.34(11):2655-64.
发明内容
为了解决上述技术问题的至少一个，本发明的一方面提供了 Hippo-YAP通路与经典Wnt相互作用在制备用于影响脂肪干细胞增殖和细胞谱命运选择的产品中的用途。
本发明的第二方面提供了YAP蛋白与β-catenin相互结合在制备用于影响脂肪干细胞增殖和细胞谱命运选择的产品中的用途。
在本发明的实施方案中，所述细胞谱命运选择是指成骨、成软骨或成脂分化。
在本发明的具体实施方案中所述影响脂肪干细胞细胞谱命运选择是指促进脂肪干细胞成骨或成软骨分化、抑制成脂分化。
本发明的第三方面提供了抑制YAP蛋白与β-catenin相互结合的物质在制备用于促进β-catenin向细胞核内转移或用于促进β-catenin在细胞核内积累达到有效量的产品中的用途。
在本发明的实施方案中，所述有效量是指能够激活经典Wnt通路的量。
本发明的第四方面提供了抑制YAP蛋白与β-catenin相互结合的物质在制备用于提高TCF转录活性的产品中的用途。
本发明的第五方面提供了抑制YAP蛋白与β-catenin相互结合的物质在制备用于促进细胞核内经典Wnt通路的产品中的用途。
本发明的第六方面提供了抑制YAP蛋白与β-catenin相互结合的物质在制备治疗骨性关节炎的产品中的用途。
本发明的第七方面提供一种产品，包括抑制YAP蛋白与β-catenin相互结合的物质，所述产品具有如下1)-4)中任一种功能：
1)促进β-catenin向细胞核内转移或者促进β-catenin在细胞核内积累达到有效量，优选地，所述有效量是指能够激活经典Wnt通路的量；
2)提高TCF转录活性；
3)促进细胞核内经典Wnt通路；
4)促进脂肪干细胞成骨或成软骨分化、抑制成脂分化。
本发明的第八方面提供一种促进脂肪干细胞成骨或成软骨分化、抑制成脂分化的方法，其特征在于，包括抑制YAP蛋白磷酸化的步骤。
利用本发明，能够有效地促进脂肪干细胞成骨或成软骨分化，抑制成脂分化。
附图说明
图1显示了分离得到的ASCs形态。
图2显示了转染β-catenin和转染YAP后TCF/LEF转录活性。
图3显示了转染β-catenin和转染YAP后细胞增殖率变化。
图4显示了转染β-catenin后7天、14天和21天后Aggrecan、Collagen 和Sox-9的mRNA水平变化。
图5显示了转染β-catenin后7天、14天和21天后Collagen、Sox-9 和β-catenin的蛋白水平变化。
图6显示了转染β-catenin后7天、14天和21天后GAG水平变化。
图7显示了转染β-catenin和转染YAP后ASCs成软骨分化和成脂分化。
图8显示了转染shYAP后β-catenin蛋白水平的变化。
图9显示了利用GSK3β特异性抑制剂CHIR99021上调TCF转录活性后，进一步转染YAP后TCF活性显著降低。
图10显示了转染shYAP后YAP水平的变化。
图11显示了转染shYAP后Hippo-YAP通路和Wnt通路靶基因表达水平的变化。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
术语
Hippo-YAP通路
Hippo-YAP通路能调节干细胞、祖细胞和分化细胞之间的动态平衡。研究显示YAP能够通过促进干细胞增殖且抑制干细胞分化来上调祖细胞的数量，也能诱导已分化的细胞转变为更加原始的干细胞样祖细胞来达到上调祖细胞数量的目的。Hippo-YAP信号通路的核心成员包括丝氨酸/苏氨酸激酶MST1、MST2、LATS1及LATS2，支架蛋白SAV1(与MST1和MST2结合)、MOB1(与LATS1和LATS2结合)，转录共激活子YAP，及包含TEA结合域的转录因子TEAD1-4。当Hippo通路激活时，MST1/2 激酶与SAV1形成复合体并磷酸化激活LATS1/2和MOB1，激活的 LATS1/2和MOB1进而磷酸化YAP，磷酸化的YAP被运出细胞核在细胞质内与14-3-3结合并进一步被β-TRCP依赖的蛋白酶体降解。与此相反的是，当Hippo通路失活时，YAP聚集在细胞核内并与TEAD等转录因子结合成复合物进而调控相关基因表达。Hippo-YAP通路的上游调控原件包括碎屑同源物(Crumbs homolog，CRB)复合体、MST激酶上游的直接调控子、肌动蛋白细胞骨架及细胞间连接复合体。除了这四个最主要的 Hippo-YAP通路上游调控原件之外，许多其他蛋白质也参与了对此通路的调控，如能直接调控YAP的WW域结合蛋白2(WW domain-binding protein2,WBP2)、闭锁小带蛋白(zona occludens protein)、蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型14(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 14,PTPN14)等。
经典Wnt信号通路
经典Wnt通路(Wnt/β-catenin通路)也调控着许多不同的生物学行为如细胞增殖、细胞命运选择、胚胎期器官的发育形成等，其最重要的效应蛋白为转录激活子β-catenin。在没有上游Wnt信号时，细胞质内β-catenin的丝氨酸残基被包含有糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)、腺瘤性结肠息肉(adenomatous polyposiscoli,APC)、轴抑制蛋白(Axin)的多蛋白降解复合体磷酸化并进一步导致β-catenin被蛋白酶体降解。与此相反，当上游Wnt信号与低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low-densitylipoproteinreceptor-related protein 5/6,LRP5/6)及卷曲蛋白(frizzled，Fzd)共受体结合时，一系列反应被激活且多蛋白降解复合体被破坏，β-catenin不再被降解并进入细胞核，然后通过TCF/LEF家族转录因子激活下游的靶基因转录。
Aggrecan
Aggrecan，聚集蛋白聚糖，是软骨细胞外基质中发现的主要结构蛋白多糖，其分子量大于2500kDa。核心蛋白(210-250kDa)有100-150个氨基葡聚糖(GAG)链。大多数的GAG链是软骨素/硫酸软骨素，其余的是硫酸角质素。Aggrecan是软骨结构和关节功能的重要组成部分。
Collagen
胶原蛋白(Collagen)又叫胶原质，是组成各种细胞外间质的聚合物在动物细胞中扮演结合组织的角色，是细胞外基质最重要的组成成份，同时也是动物结构组织最主要的构造性蛋白质，主要是以以下不溶性纤维蛋白的形式存在，在人体的组成中，约占蛋白质的33％，扮演着有如‘床垫’‘水泥’的角色，能保证并连结各种组织支撑起人体的结构。
Sox-9
Sox-9蛋白Sox蛋白家族中的一种。Sox基因是指在HMG-box区与 SRY产物具有60％以上的氨基酸序列性的编码基因。Sox基因高度保守，这种保守性仅限于HMG-box区，按HMG-box区的同源性程序，Sox基因可被划分为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J共10个家族。在发育过程中，与软骨细胞分化相关的属于E族的Sox-8、Sox-9、Sox-10和属于D 族的Sox-4、Sox-5、Sox-6，而关系最为密切的是Sox-9。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
实施例1
一、实验材料
1.动物
取2周龄新西兰大白兔(取腹股沟和附睾周围脂肪组织分离的干细胞)，由广西医科大学实验动物中心提供。
2.主要试剂与仪器
Trizol试剂盒购于美国Bictrin公司，紫外分光光度计、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管购于美国Sigma公司，鼠抗人β3整合素IgG购自 Chemicon公司、RPMI1640(GIBICO公司)，胎牛血清(Gibco公司)，各种消化酶(Sigma公司分装)，逆转录试剂(MBI公司)，PEGeneAmp PCR System 2400(美国BD公司)，SYBRGreen I定量PCR试剂盒 (Invetrgen公司和Toyobo公司),美国BD FACSCanto流式细胞仪(美国 BD公司)，ABI-7300定量PCR仪。SPECT为Siemens DIACAM/ VAX3300；FITC、PE或Alexa系列荧光二抗、PI等染料(BD、Sigma 等公司)；NC膜购自西安先锋公司；RT-PCR引物购自北京奥科生物公司；反转录试剂盒购自TaKaRa公司；2x Taq MasterMix购自北京康为世纪有限公司。
3.细胞培养
将分离纯化脂肪干细胞培养于含有10％胎牛血清的RPMI-1640 培养液中(pH7.2-7.4)，在37℃、5％CO2和饱和湿度条件下，细胞呈贴壁生长，待其铺满瓶时以0.25％胰蛋白酶消化传代，取对数生长期的细胞进行实验。
二、实验指标及其检测方法
1.Real-time PCR检测
2.构建突变体
方法参考：Konsavage WM Jr,Kyler SL,Rennoll SA,Jin G,Yochum GS.Wnt/beta-catenin signaling regulates Yes-associated protein(YAP)gene expressionin colorectal carcinoma a cells.J Biol Chem. 2012.287(15):11730-9.全文引入作为参考。
3.RNA提取与定量
RNA的提取实验步骤按RNA提取试剂盒说明书操作，紫外分光光度计定量RNA。
4.反转录与PCR扩增
依据TaKaRa反转录试剂盒说明书操作，琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像仪采图。
5.Western-blot检测
采用BCA法定量蛋白浓度，按标准ECL试剂盒化学发光，x线光片曝光，显影，定影。
6.免疫荧光染色检测
按免疫荧光染色试剂盒标准步骤进行检测，GST pull down和免疫共沉(参考：oZhao,B,i Li,L,Wang,L,g Wang,CY,u Yu,J,n Guan.KL.l Cell t detachment sactivates the Hippo pathway via cytoskeleton n reorganization to induce sanoikis.Genes Dev.2012.26(1):54-68.)。
7.细胞增殖
细胞培养后弃去上清，于酶标仪450nm处检测各样本吸光值(OD) 记录结果，求其平均值。
8.细胞成骨、成软骨、成脂分化
成骨分化：去除细胞培养液，PBS洗两遍后使用4％多聚甲醛固定 15分钟，去除固定液使用浓度为0.1％，pH值为7.2的茜素红染液染色 30min，PBS洗去浮色后，使用倒置显微镜观察。
成软骨分化：去除细胞培养液，PBS洗两遍后使用4％多聚甲醛固定15分钟，去除固定液使用pH为2.5的阿利新蓝染液中染色50min；PBS 洗去浮色后，使用倒置显微镜观察。
成脂分化：去除细胞培养液，PBS洗两遍后使用4％多聚甲醛固定 15分钟，去除固定液使用浓度为0.6％油红O染液染色30min，75％的酒精洗去浮色后，PBS洗去酒精脱色液，使用倒置显微镜观察。
三、实验指标的评价标准
1.Real-time PCR检测结果
采用比较CT值法(2-△△CT法)，对实验样品进行相对定量。
2.Western-blot检测结果
采用Tanon GIS系列数码凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值,图片扫描保存为电脑文件，并用分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
3.免疫荧光染色检测结果
荧光显微镜下观察，拍摄后用LAS AF Lite 2.0图像分析软件处理。
4.细胞增殖率
利用如下公式计算各处理组细胞生长增殖率(％)。
细胞增殖率(％)＝[(处理组细胞OD值-对照组细胞OD值)]/对照组细胞OD值×100％。
5.细胞成骨、成软骨、成脂分化
成骨细胞会出现钙化，会被茜红素当成红色，未钙化的细胞不会被染色。成软骨细胞会被阿利新蓝染色。成脂细胞油红O染色呈阳性。
四、数据统计学分析方法：
实验数据以Mean±SD表示，根据数据类型选择重复测量设计方差分析或单因素方差分析的统计方法，采用SPSS14.0统计软件进行统计处理。以P<0.05具有统计学差异。
实施例2运用显微磁共振弹性成像(μMRE)技术观察骨折处骨折愈合情况。
a.动物应力模型的建立：取2周龄新西兰大白兔，戊巴比妥麻醉后无菌条件下取右前外侧纵行切口分离胫骨并将胫骨中下段处理至骨折，然后用细克氏针固定作为空白应力对照；麻醉后，无菌条件下取右前外侧纵行切口分离胫骨并将胫骨中下段处理至骨折，取出约0.3cm 胫骨造成胫骨缺损，克氏针内固定后取腹股沟和附睾周围脂肪干细胞填塞骨折缺损部分(方法参考：Liu G,Zhang Y,Liu B,Sun J,Li W,Cui L. Bone regeneration in acanine cranial model using allogeneic adipose derived stem cells and coralscaffold.Biomaterials.2013. 34(11):2655-64.)，复位后缝合，建立对照模型。
b.运用μMRE技术观察活体动物骨折愈合情况，即在现有的三维等方性高空间分辨成像序列上添加网格标记脉冲，实现三维空间网格标记的实时三维高精度成像，从而明确骨细胞生长情况。
c.利用图像分析软件初步统计μMRE结果，与对组比较，初步推算正常情况下骨折愈合情况。
实施例3以μMRE成像结果为基础，分离骨折端脂肪干细胞和体外培养脂肪干细胞。
a.混合细胞获取：取2周龄新西兰大白兔腹股沟和附睾周围脂肪干细胞；
b.免疫磁珠分选(magnetic activated cell sorting,MACS)：利用特异性表面标志CD24a和CD200，采用免疫磁珠分选系统(德国 Miltenyi公司)分离混合细胞悬液中的脂肪干细胞，体外培养并流式细胞技术对其表面标记物其进行鉴定证实；(参考Belluoccio D等的方法：J Bone Miner Res,2010,25(6):1267-81)
流式细胞术检测显示大鼠ASCs阳性表达CD29和CD44分子，阴性表达CD34、CD45和CD31分子。
c.生物学特性检测：观察细胞增殖情况，运用免疫组化或荧光染色检测细胞外基质表达情况。
贴壁生长的ASCs细胞呈长梭形或多角形，涡旋状排列(如图1)。
实施例4YAP对TCF转录活性和β-catenin的调控作用及此调控对ASCs增殖和细胞谱系命运选择的影响
①以TCF的转录活性来代表Wnt信号通路强度，以TCF结合位点的串联重复序列或者其突变序列构建荧光素酶报告系统，利用 Wnt3a激活Wnt通路来进一步验证报告系统。转染β-catenin后研究 TCF转录活性是否发生上调，在此基础上进一步表达YAP，研究YAP 对TCF转录活性的调控作用，研究YAP表达上调后TCF转录活性变化与ASCs增殖和细胞谱系命运选择(成骨、成软骨、成脂分化) 的联系。
根据萤光素酶报告系统结果，转染β-catenin后，TCF转录活性发生上调，相比转染前升高至190％(图2)，ASCs的增值能力也显著加强 (图3)。
RT-PCR结果显示，转染β-catenin后7d、14、21天后，基因Aggrecan、 Collagen和Sox-9的表达水平显著升高(图4)。Western-blot检测显示，转染β-catenin后7d、14、21天后，Collagen和Sox-9蛋白的表达水平显著升高，β-catenin蛋白在第14天出现降低，但在21天时又回到最高水平(图 5)。进一步检测硫酸软骨素的含量，发现转染β-catenin后7d、14、21 天后，硫酸软骨素的含量逐渐升高(图6)。
细胞经阿利新蓝染色明显加深(图7A)，表明转染后软骨基质合成明显增加。
以上结果表明，转染β-catenin可以促进脂肪干细胞的成软骨分化。
进一步结果表明，表达YAP后，TCF转录活性减弱(图2)，ASCs 增殖能力也显著变弱(图3)，细胞更多向脂肪细胞方向分化(油红O 染色阳性)(图7B)。
②利用Western Blot检测转染YAP后β-catenin蛋白水平的表达情况，分析其转染对β-catenin蛋白水平表达的影响。利用GSK3β特异性抑制剂CHIR99021上调TCF转录活性，然后进一步研究转染 YAP后对TCF活性的调控作用。
结果显示，转染YAP后，β-catenin蛋白水平逐渐降低(图8)。
利用GSK3β特异性抑制剂CHIR99021上调TCF转录活性后，进一步转染YAP后TCF活性显著降低(图9)。
③构建β-catenin突变体(S33Y和S37A，GSK3β磷酸化位点突变)以持续活化Wnt信号通路，在此基础上转染shYAP抑制YAP在 mRNA和蛋白质水平的表达。研究转染shYAP之后，其靶基因如 CTGF、Ankrd1等的表达，同时研究Wnt通路靶基因如ENC1、EphB2 等的表达。然后检测ASCs成骨/成脂分化相关基因表达情况，研究 shYAP转染对Wnt激活状态下ASCs增殖和细胞谱系命运选择能力的调控作用。
结果显示，S33Y和S37A，GSK3β磷酸化位点突变后，β-catenin 不能被磷酸化，从而可以不被磷酸酶降解，在细胞浆中得以保留，并进一步进入细胞核，持续活化Wnt信号通路。
转染shYAP后，YAP在mRNA水平都显著降低(图10)，ASCs中 CTFG、Ankdr1和PCNA的表达水平降低。而Wnt通路的靶基因ENC1和 EphB2表达量升高(图11)。
同时，阿利新蓝染色结果显示转染shYAP脂肪干细胞呈阳性，说明转染shYAP后细胞能够分泌酸性粘多糖，具有软骨组织的成份特征，证明转染shYAP可以促进脂肪干细胞的成软骨分化。
实施例5YAP与β-catenin间的相互作用
①研究YAP与β-catenin之间的直接作用以进一步理解YAP对 TCF转录活性的调控作用。免疫共沉淀研究YAP与β-catenin之间是否存在着相互结合。进一步在体外表达并纯化YAP蛋白，利用GST 下拉试验研究YAP与β-catenin之间是否存在直接相互结合(免疫共沉淀参考Tharmalingam S等的方法：J Biol Chem, 2011,286(47):40922-33)。
免疫共沉淀结果显示，YAP与β-catenin可以相互结合，而GST下拉试验发现YAP蛋白不能直接和β-catenin结合。该结果表明，YAP蛋白可能需要修饰后与β-catenin结合并抑制其向胞核内转移，进而抑制Wnt 靶基因的表达。
②利用LATS磷酸化YAP，将磷酸化的YAP(pYAP)进行GST 下拉试验研究其与β-catenin之间是否也存在着直接结合。
结果显示，磷酸化的YAP能直接与β-catenin结合，该结果也表明，通过抑制YAP磷酸化，可以抑制YAP与β-catenin结合，从而促进β-catenin 进入细胞核，进而活化Wnt通路。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (1)

1.抑制YAP蛋白与β-catenin蛋白相互结合的物质在制备用于促进脂肪干细胞成软骨分化的产品中的用途。
CN201810734425.3A 2018-07-06 2018-07-06 Hippo-YAP通路与Wnt通路相互作用在脂肪干细胞细胞谱命运选择中的用途 Active CN108913654B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810734425.3A CN108913654B (zh) 2018-07-06 2018-07-06 Hippo-YAP通路与Wnt通路相互作用在脂肪干细胞细胞谱命运选择中的用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810734425.3A CN108913654B (zh) 2018-07-06 2018-07-06 Hippo-YAP通路与Wnt通路相互作用在脂肪干细胞细胞谱命运选择中的用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108913654A CN108913654A (zh) 2018-11-30
CN108913654B true CN108913654B (zh) 2022-08-05

Family

ID=64424514

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810734425.3A Active CN108913654B (zh) 2018-07-06 2018-07-06 Hippo-YAP通路与Wnt通路相互作用在脂肪干细胞细胞谱命运选择中的用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108913654B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018204764A1 (en) * 2017-05-05 2018-11-08 Camp4 Therapeutics Corporation Identification and targeted modulation of gene signaling networks

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2908443A1 (en) * 2013-04-16 2014-10-23 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Blastoid, cell line based artificial blastocyst
US10683484B2 (en) * 2015-06-12 2020-06-16 National University Of Singapore Derivation of hepatic stem cells and mature liver cell types and uses thereof
CN106540259B (zh) * 2015-09-22 2019-08-09 北京师范大学 细胞骨架通过yap调控癌细胞中s100a7、s100a8和s100a9的表达中的应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018204764A1 (en) * 2017-05-05 2018-11-08 Camp4 Therapeutics Corporation Identification and targeted modulation of gene signaling networks

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
lncRNA和Hippo-YAP通路调控脂肪干细胞成骨分化机制的研究进展;李军最等;《广西医科大学学报》;20181015;第35卷(第10期);1459-1463 *
Timothy F. Day等.Wnt/β-Catenin Signaling in Mesenchymal Progenitors Controls Osteoblast and Chondrocyte Differentiation during Vertebrate Skeletogenesis.《Developmental Cell》.2005,第8卷739–750. *
Yes相关蛋白通过Wnt/β-catenin信号通路调控软骨细胞Sox9表达的研究;鲍远等;《骨科》;20160520;第7卷(第03期);195-200 *
人脂肪组织来源血管周干细胞成骨、成脂、成软骨分化能力研究;张蕾等;《中国实用口腔科杂志》;20180715;第11卷(第07期);420-425 *
整合素参与间充质干细胞分化;闪海燕等;《生理学报》;20170710;第69卷(第04期);498-508 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108913654A (zh) 2018-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Guan et al. Human urine derived stem cells in combination with β-TCP can be applied for bone regeneration
JP5863639B2 (ja) 椎間板の状態に関する指標を得る方法、椎間板障害の治療または予防方法、および髄核細胞集団のポテンシャルまたは品質の評価方法
CN107828722B (zh) 特异性表达pd-1的干细胞、其鉴定和分离方法及用途
Salgado et al. Clarifying the tooth-derived stem cells behavior in a 3D biomimetic scaffold for bone tissue engineering applications
Elkhenany et al. Impact of the source and serial passaging of goat mesenchymal stem cells on osteogenic differentiation potential: implications for bone tissue engineering
Lin et al. Characterisation of multipotent stem cells from human peripheral blood using an improved protocol
US20220372443A1 (en) Lbm, cpc, opc, production and quality control methods therefor, kit, graft material, and disease model
Rumiński et al. Osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells in 3D conditions-comparison of spheroids and polystyrene scaffolds
Moghadam et al. Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into chondrocytes after short term culture in alkaline medium
Iwasaki et al. Changes in characteristics of periodontal ligament stem cells in spheroid culture
RU2738969C2 (ru) Способ оценки и мониторинга in vitro чистоты препарата клеток, применение фактора роста, набор
Zarychta-Wiśniewska et al. The influence of cell source and donor age on the tenogenic potential and chemokine secretion of human mesenchymal stromal cells
Qureshi et al. Human adipose-derived stromal/stem cell isolation, culture, and osteogenic differentiation
Liu et al. Flow cytometric cell sorting and in vitro pre-osteoinduction are not requirements for in vivo bone formation by human adipose-derived stromal cells
Huang et al. Differential dynamics of bone graft transplantation and mesenchymal stem cell therapy during bone defect healing in a murine critical size defect
KR20210063324A (ko) 지방 유래 줄기 세포 및 젤라틴을 포함하는 생체물질 및 이의 제조방법
Yoon et al. Frozen-thawed gelatin-induced osteogenic cell sheets of canine adipose-derived mesenchymal stromal cells improved fracture healing in canine model
CN108913654B (zh) Hippo-YAP通路与Wnt通路相互作用在脂肪干细胞细胞谱命运选择中的用途
WO2012099104A1 (ja) 再生軟骨を評価する方法
JP2020516241A (ja) 筋肉由来の前駆細胞分化した細胞を取得する方法
JP2006122147A (ja) 移植用材料及び未分化間葉系幹細胞の培養方法
Ginis et al. Bone progenitors produced by direct osteogenic differentiation of the unprocessed bone marrow demonstrate high osteogenic potential in vitro and in vivo
JP6606413B2 (ja) 真皮幹細胞の検出及び分離方法
Desantis et al. Ultrastructural characteristics of ovine bone marrow‐derived mesenchymal stromal cells cultured with a silicon stabilized tricalcium phosphate bioceramic
WO2023189485A1 (ja) 間葉系幹細胞の品質評価方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant