JP2012150019A - 再生軟骨の軟骨特性を評価する方法 - Google Patents

再生軟骨の軟骨特性を評価する方法 Download PDF

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Abstract

【課題】再生軟骨またはその材料となる軟骨細胞の一部を犠牲にすることなく、再生軟骨の軟骨特性を定量的に評価する方法を提供する。
【解決手段】単離された軟骨細胞または単離および培養された軟骨細胞の培養上清に含まれるＧＦＡＰ含有量を測定することにより再生軟骨の軟骨特性を評価する方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、再生軟骨の軟骨特性を評価する方法に関する。
顎顔面における先天性形態形成異常や悪性腫瘍切除後の顎顔面欠損に対しては、これまで自家組織移植による組織修復および再建が行われてきた。しかし、自家組織移植には、採取できる組織の大きさの限界、または採植する部位への侵襲などといった課題が残されている。その中でも軟骨再生医療は比較的、臨床応用が進んでおり、現在、自家軟骨細胞を用いた移植法（ＡＣＩ（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ））が世界的に普及している。ＡＣＩ原法は１９９５年にスウェーデンの研究グループによって報告されたのが始まりである。スポーツ外傷などによる関節軟骨の局所欠損に対し、自家培養軟骨細胞を細胞懸濁液として欠損部に投与し、さらに漏出を防ぐため骨膜パッチで被覆する方法である。
顎顔面領域では、シリコンインプラントによる隆鼻術再生手術例や鞍鼻などに対して、自家軟骨細胞の懸濁液を注入した応用例が報告されている。
培養軟骨細胞についてその特性を評価する方法には、遺伝子発現の評価、表面マーカーの評価などがある。しかしながら、これらは定量性に乏しく、最終的に得ようとする細胞群の一部を犠牲にする必要があるのが現状である。
Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇ Ｍ， Ｌｉｎｄａｈｌ Ａ， Ｎｉｌｓｓｏｎ Ａ， Ｏｈｌｓｓｏｎ Ｃ， Ｉｓａｋｓｓｏｎ Ｏ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ Ｌ． １９９４． Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｅｐ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｆｅｃｔ ｉｎ ｔｈｅ ｋｎｅｅ ｗｉｔｈ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３１(１４)：８８９−８９５. Ｙａｎａｇａ Ｈ， Ｙａｎａｇａ Ｋ， Ｉｍａｉ Ｋ， Ｋｏｇａ Ｍ， Ｓｏｅｊｉｍａ Ｃ，Ｏｈｍｏｒｉ Ｋ． ２００６．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｈｕｍａｎ ａｕｒｉｃｕｌａｒ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ｗｉｔｈ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｓｅｒｕｍ ｆｏｒ ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ ｏｒ ｎａｓａｌ ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐａｉｒ. Ｐｌａｓｔ Ｒｅｃｏｎｓｔｒ Ｓｕｒｇ １１７(６)：２０１９−２０３０.
本発明の目的は、再生軟骨またはその材料となる軟骨細胞の一部を犠牲にすることなく、定量的に再生軟骨の軟骨特性を評価する方法を提供することである。
本発明の１つの態様に従うと、単離された軟骨細胞または単離および培養された軟骨細胞の培養上清に含まれるＧＦＡＰ含有量を測定することにより再生軟骨の軟骨特性を評価する方法が提供される。
本発明の１つの態様によれば、再生軟骨またはその材料となる軟骨細胞の一部を犠牲にすることなく、定量的に再生軟骨の軟骨特性を評価する方法が提供される。
各種細胞におけるＧＦＡＰ遺伝子の発現量を示す図。 由来の異なるヒト耳介軟骨細胞におけるＧＦＡＰ遺伝子の発現量を示す図。 ヒト耳介軟骨細胞におけるＧＡＧ産生能について培養軟骨細胞を用いて評価した結果を示す図。 ヒト耳介軟骨細胞におけるＣＯＬ２産生能について培養軟骨細胞を用いて評価した結果を示す図。 ヒト耳介細胞におけるＧＡＧ産生能について培養上清を用いて評価した結果を示す図。 ヒト耳介細胞におけるＣＯＬ２産生能について培養上清を用いて評価した結果を示す図。 軟骨細胞と線維芽細胞の培養上清中のＧＦＡＰ量の測定結果を示す図。 図７で示した軟骨細胞と線維芽細胞を移植した後の再生組織のイメージを示す図。 一態様に係る耳介軟骨再生製品の製造工程の概略スキームを示す図。
１．概要
従来、軟骨を再建する再生医療としては、軟骨細胞を注入する方法がとられていた。
しかしながら、軟骨細胞を注入するだけでは有形性や強度がないため、組織再建の目的を十分に果たせない可能性は依然として大きい。このような状況において、本願発明者は、これまで、形や強度のある「インプラント」のような再生軟骨を提供するための手段を開発してきた。その開発において、まず、軟骨細胞が体内へ移植される際に、品質が担保される必要があることに着目した。この品質は、再生軟骨が軟骨特性を有する場合に担保される。ここで「軟骨特性」の語は、「軟骨としての特性」、「軟骨の特性」、「軟骨としての性質」、「軟骨の性質」の語と交換可能に使用される。「軟骨特性」とは、他細胞などの異物の混入がなく、且つ過増殖することがないため安全に移植することができ、移植後、体内で軟骨として生着可能な性質をいう。具体的には、移植後に軟骨を形成し、旺盛な軟骨再生を示す性質をいう。また、移植に適した軟骨としての特異的な性質をいい、移植妥当性と解されてもよい。
軟骨細胞は、再生軟骨の特性と機能を左右する軟骨基質を分泌する重要な構成要素である。例えば、軟骨細胞が過増殖した場合、軟骨としての性質を失う。
また、軟骨細胞単離時に線維芽細胞が少量混入すると、当該線維芽細胞が培養中で過増殖し、目的である軟骨細胞を駆逐してしまうという製造工程上のリスクがある。更に、過増殖した線維芽細胞を含む培養移植組織を移植した場合には、軟骨細胞の代わりに線維芽細胞が移植されることになる。そのような移植組織は軟骨として生着することはない。従って、再生軟骨製品の構成細胞において、軟骨細胞を十分な量で含むこと、過増殖せずに軟骨特性を維持できること、且つ他細胞の混入がないこと、更には、移植後においても軟骨特性が維持されることを担保できることを、移植前に予め判別することが必要不可欠である。
そのための手段として、本発明者らは、軟骨細胞、特に耳介軟骨細胞に特異的なマーカーを見出した。本発明はこの発見に基づく。このマーカーによれば、最終的に得ようとする目的物の一部を犠牲にすることなく、軟骨特性を定量的に評価することが可能になる。
２．耳介軟骨細胞に特異的なマーカー
上述した軟骨細胞、特に耳介軟骨細胞に特異的なマーカーは、ＧＦＡＰである。
ＧＦＡＰとは、グリア細胞線維性酸性タンパク質（Ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）を意味する。ＧＦＡＰは、一般に神経系、例えばアストロサイトやシュワン細胞に特異的に局在するタンパク質である。
本願発明者は、ＧＦＡＰが軟骨再生医療の有用な細胞源である培養耳介軟骨細胞に特異的に高発現すること、および継代培養に伴い徐々にＧＦＡＰ遺伝子発現量およびタンパク質含量が減少していくことを見出した。
このＧＦＡＰタンパク量を定量することにより、線維芽細胞の混入や耳介軟骨細胞の過増殖に伴う軟骨特性の減弱化などを検出することが可能になる。これにより、培養耳介軟骨細胞を用いる再生軟骨製品の軟骨特性を評価する方法が提供される。
本発明に従う１つの態様によれば、単離され、培養された軟骨細胞の培養上清に含まれるＧＦＡＰ含有量を測定することにより軟骨特性を評価する方法が提供される。
また、培養上清に含まれるＧＦＡＰ含有量を測定すれば、同時に定量的に軟骨細胞の基質蓄積量についても情報を得ることが可能になる。
ここで「基質」とは、軟骨の構造の基盤となる物質の総称をいう。軟骨の構造の主な基質は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、ＩＩ型コラーゲン（ＣＯＬ２）である。
後述する例に示すように、本発明の基礎となる研究において、培養上清中のＧＦＡＰ含有量が、ＧＡＧおよびＣＯＬ２の蓄積量に相関することを新たな知見として見出した。このような知見に基づき、培養上清中のＧＦＡＰ含有量を測定することにより、軟骨特性を評価することが可能となった。
例えば、再生軟骨の製造に用いられているヒト関節軟骨細胞において、発現が増強するマーカーとしてＣＤ１０、ＣＤ２６、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ８１、ＣＤ１６６など、減少するものとしてＣＤ９４ａ、ＣＤ１０６などの細胞表面マーカーが挙げられる。しかしながら、細胞表面マーカーはフローサイトメトリーにより解析され、異なる実験同士を定量的に解析することは困難である。また、細胞の接着状態などの培養環境によって変動していく可能性もあり、一定の基準を設けるのは困難である。
さらに、上記細胞接着分子の他、セリンプロテアーゼインヒビター（Ｓｅｒｐｉｎ）Ａ１およびＡ３、線維芽細胞成長因子−１８（ＦＧＦ−１８）やメラノーマ抑制活性因子（ＭＩＡ）等が確認されている。特に、ＦＧＦ−１８は平面培養を重ねていくことにより、遺伝子発現量が増加する因子であるため、軟骨細胞の基質産生能を示す指標として使用できる可能性がある。しかしながら、これらの因子を指標として用いる場合、遺伝子レベルで評価することとなるため、定量性に課題が残る。また、これらはいずれも分泌タンパクであるため、培養上清をサンプルとして用いてそれに含まれるタンパク量を測定できる可能性はあるが、増殖中の培養軟骨細胞から分泌される生理活性物質はきわめて少量であると予想され、検出するのは困難である。また、ヒト関節軟骨細胞では耳介軟骨細胞に比べてＧＦＡＰの発現量が少なく、継代培養による発現量の変化も少ないため、ＧＦＡＰを指標として用いることは難しい。
以上のような理由から、再生軟骨の細胞源として耳介軟骨細胞を用い、ＧＦＡＰ含有量を測定することにより、軟骨特性を定量的に評価することが有利であることは明白である。
３．軟骨細胞
ここにおいて使用される軟骨細胞は、耳介軟骨細胞である。
軟骨細胞の由来は、何れかの哺乳動物であってよく、例えば、マウスおよびラットなどの齧歯類、ウサギ、イヌおよびネコなどの愛玩動物、ウマおよびウシなどの家畜など、サルおよびヒトなどの霊長類など、何れかの哺乳動物であってよく、好ましくはヒトである。
軟骨細胞の供給源となる動物は、軟骨細胞により構成された再生軟骨を移植する対象となる動物に依存して選択されればよい。軟骨細胞により構成された再生軟骨についての説明は後述する。
ヒトが移植の対象になる場合には、ヒト由来の耳介軟骨細胞（以下、「ヒト耳介軟骨細胞」）、より好ましくはヒト自家耳介軟骨細胞である。ここで、「自家耳介軟骨細胞」とは、軟骨細胞により構成された再生軟骨を最終的に移植しようとする対象の耳介から、移植および再生軟骨の製造に先駆けて採取された細胞をいう。
４．軟骨細胞の単離および培養
軟骨細胞の単離は、例えば、次のように行われてよい。まず、ドナーである動物から軟骨片を外科的に採取する。次に、無菌状況下で採取した軟骨片をさらに細片化し、必要に応じて所望の消化酵素、例えば、コラゲナーゼおよび／またはゼラチナーゼ、トリプシン、ペプシン、アグリカナーゼなどにより消化する。それにより、個々に遊離したそれぞれの細胞からなる細胞群および／または複数の細胞からなる微細組織片を形成する細胞群を単離細胞として得る。次に、これらの単離細胞について培養を行う。
培養は、再生軟骨の製造に必要な生細胞数を得ることのできる限りにおいて、当業者に既知のいずれかの方法で行われてよい。培養は、例えば、必要な生細胞数を得るために継代培養であってよい。培養の形態は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。培養の形態としては例えば、ボトル中での浮遊培養、培養皿での平面および／または浮遊培養（単層培養）、ペレット培養、ハイドロゲルなどによる３次元培養などが挙げられる。培養は、単離した軟骨細胞を３週間、平面培養により培養し、１回継代し、さらに３週間培養し、約１０００倍増させることにより行われてよい。また、更なる継代培養が行われてもよい。
軟骨細胞の培養に使用できる培地は、それ自身公知の何れの軟骨細胞の培養に適した培地であればよい。好ましい培地は、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２および血清含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２などであってよい。
また、培養条件は、例えば、３〜７％のＣＯ２存在下で、湿度８０〜１００％、温度３６℃〜３８℃であってよい。また、培養中に培地を攪拌しても、しなくてもよいが、攪拌を行うことが好ましい。
ここで再生軟骨の製造に必要な生細胞数は、２億４千万個以上あるのが好ましい。また、必要な生存率は８０％以上であることが好ましい。生存率は、それ自身公知の何れの方法により測定されてもよい。例えば、ＰＥ測定法によりヌクレオカウンターによって測定してもよい。生存率は、好ましくは８０％以上である。８０％未満であれば健全な軟骨の再生が見込まれない可能性がある。
培養軟骨細胞は、互いに結合した少なくとも部分的に組織を形成した軟骨細胞群であってよく、または個々に遊離した軟骨細胞からなる軟骨細胞群であってもよい。また、培養軟骨細胞は、初代培養物および／または継代培養物であってもよい。
５．ＧＦＡＰ量の測定
ＧＦＡＰ量は、ＧＦＡＰ量を測定することが可能なそれ自身公知の何れかの方法を利用して測定してよい。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＰＲ−ＰＣＲ法、およびウエスタンブロッティング法を使用してよい。
当該再生軟骨の軟骨特性を評価する方法において、ＧＦＡＰ量の測定にはサンプルとして培養軟骨細胞の培養上清を用いる。培養上清とは、細胞を含まない培地をいう。培養上清の採取は、培養場から、細胞を含まないように培養液を採取することであっても、遠心分離により培養細胞などを除いて得られる上澄みであってもよい。ここにおいて、「培養場」とは、そこにおいて培養が行われる系をいい、その培養様式および培養条件などに係わらず、軟骨細胞の培養が行われる系または場所を指す。ここで「培養」とは、当該細胞を特定の条件で維持することをいう。この維持において、細胞分裂が生じなくとも、生じてもよい。
また、ＧＦＡＰ量の測定の対象となる培養上清は、培養中の培地であってもよく、培養中に、一時的にそれ自身公知の生理的組成を有した緩衝液に培地を置き換え、更に所望の時間に亘るインキュベーションを行った後の当該緩衝液であってもよい。
ＧＦＡＰ量を測定する時期は、軟骨細胞の単離後、培養の開始前後、初代培養中、何れかの継代培養中若しくは継代培養の前後、培養終了時、再生軟骨形成前および／または再生軟骨形成後であってよい。単離直後または単離細胞を任意にインキュベーションした後、ＧＦＡＰ量を測定する場合、当該細胞を含む溶液が培養場と解されればよい。
培養軟骨細胞自体をサンプルとして用いる場合、貴重な原料となる培養軟骨細胞の損失が生じてしまうが、培養上清をサンプルとして用いる場合、貴重な培養軟骨細胞を犠牲にすることがないので有利である。
軟骨特性を有すると評価される条件は、培養上清に含まれるＧＦＡＰ含有量が、培養上清１ｍＬあたり０．０５ｎｇ以上、好ましくは０．５ｎｇ以上、より好ましくは５ｎｇ以上である。この条件を満たす場合、測定された培養軟骨細胞が、軟骨特性を有すると判断される。また、当該ＧＦＡＰ含有量が高いほど、軟骨特性はより良好である。
培養上清に含まれるＧＦＡＰ含量が、培養上清１ｍＬ当たり０．０５ｎｇ以上であれば、移植後に軟骨形成し、且つ旺盛な軟骨再生を示す。一方、ＧＦＡＰ含有量が、培養上清１ｍＬあたり０．０５ｎｇ未満である場合、培養軟骨細胞が移植後、軟骨を形成しないか、または所望の軟骨再生を示さない可能性が高い。
６．再生軟骨の製造方法
上述のように単離されたヒト耳介軟骨細胞を培養し、培養上清に含まれるＧＦＡＰ含量を測定し、当該含量が前記培養上清１ｍＬあたり０．０５ｎｇ以上であることを確認したヒト耳介軟骨細胞を用いて、再生軟骨を形成することにより、再生軟骨を製造することが可能である。そのような方法も本願発明の１つの態様として提供される。
再生軟骨は、軟骨細胞群を含む。ここで、軟骨細胞群とは、軟骨細胞の集合体とも解され、これは個々に遊離した軟骨細胞、軟骨細胞の集団、軟骨組織、またはこれらのいずれかの組合せをいう。軟骨細胞群は、軟骨細胞を用いた軟骨再生医療におけるいずれかの段階で得られる。軟骨細胞群は、目的の再生軟骨の製造過程におけるいずれかの段階で得られる軟骨細胞群であってよい。例えば軟骨細胞群は、軟骨細胞の単離段階、培養段階、または再生軟骨の形成段階で得られる軟骨細胞群であってよい。また、軟骨細胞群は、再生軟骨の製造後且つ移植前のいずれかの段階で得られる軟骨細胞群であってもよい。さらに、軟骨細胞群は再生軟骨の移植後の軟骨細胞群であってもよい。
再生軟骨は、軟骨再生医療におけるいずれかの段階で得られる軟骨細胞群を含んでよい。また再生軟骨は、目的の再生軟骨の製造過程におけるいずれかの段階で得られる軟骨細胞群を含んでよい。例えば、再生軟骨は軟骨細胞の単離の段階で得られる軟骨細胞群を含んでよい。また例えば、再生軟骨は軟骨細胞の培養の段階で得られる細胞群を含んでよい。さらに例えば、再生軟骨は、再生軟骨の形成段階で得られる軟骨細胞群を含んでよい。また、再生軟骨は、再生軟骨の製造後且つ移植前のいずれかの段階で得られる軟骨細胞群、または再生軟骨の移植後の軟骨細胞群を含んでよい。
再生軟骨はさらに、３次元基材および／またはゲル化剤を含んでよい。
再生軟骨は、ある程度の大きさを持ち、インプラントとして使用できることが好ましい。
再生軟骨は、懸濁液形態または固体形態であってよいが、固体形態であることが好ましい。再生軟骨は、移植に適した軟骨特性を維持した軟骨細胞と、所望に応じて、ゲル化剤および／または足場素材など３次元基材の補助材などを用いて形成されてよい。これにより、一定以上の品質が担保された再生軟骨を製造する方法が提供される。例えば、再生軟骨細胞の製造方法は、単離されたヒト耳介軟骨細胞を培養することと、培養上清に含まれるＧＦＡＰ含量を測定することと、当該ＧＦＡＰ含量が培養上清１ｍＬあたり０．０５ｎｇ以上であることが確認された前記培養されたヒト耳介軟骨細胞を用いて再生軟骨を形成することとを具備する。
軟骨再生医療は主に、（１）患者からの軟骨の採取、（２）軟骨細胞の単離と培養、（３）培養軟骨細胞の回収または再生軟骨の形成、（４）患者への移植の４つのプロセスを含む。２番目の軟骨細胞の単離と培養は細胞プロセッシングセンターという特殊な施設で行う再生医療に特徴的な工程であり、再生医療製品製造のための本質的部分である。それと同時に最も厳密な品質管理が求められる工程でもある。
実施形態に係る再生軟骨の軟骨特性を評価する方法は、軟骨細胞を用いた軟骨再生医療におけるいずれかの段階で実施されてよい。当該方法は、目的の再生軟骨の製造過程におけるいずれかの段階で実施されてよい。例えば当該方法は、軟骨細胞の単離段階で実施されてよい。例えば当該方法は、培養段階で実施されてよい。また例えば当該方法は、再生軟骨の形成段階で実施されてよい。また、当該方法は、再生軟骨の製造後且つ移植前に実施されてもよい。さらに、当該方法は再生軟骨の移植後に実施されてもよい。好ましくは、当該方法は、培養軟骨細胞が培地から回収される前に実施される。
実施形態に係る再生軟骨の軟骨特性を評価する方法は、再生軟骨を製造する方法と解されてもよく、再生軟骨の品質を評価または管理する方法と解されてもよく、軟骨細胞の純度を調べる方法と解されてもよい。
ここで再生軟骨を形成することは、軟骨細胞を３次元培養することを含む。
３次元培養は、３次元基材（ここにおいて、「足場素材」とも記す）の上または内部で軟骨細胞を培養することにより行われてよい。３次元培養は例えば、３７℃、５%ＣＯ２インキュベータで２時間インキュベートすることにより行われてよい。
３次元基材は、特に制限はなく、目的に応じてその素材、性状、形状、構造、大きさなどについて適宜選択することができる。３次元基材の素材としては例えば、アテロコラーゲン、フィブリン、ヒアルロン酸、生分解性ポリマー多孔体などが挙げられる。生分解性ポリマー多孔体としては、例えば、ＰＬＬＡ、ＰＧＡ、ＰＬＧＡなどが挙げられる。
３次元基材は、いずれか公知の方法を用いて形成されてよい。
また、再生軟骨の形成にあたり、３次元基材の使用に加えて、ゲル化剤を用いてもよい。例えばゲル化剤と軟骨細胞を混合し、３次元基材に接触することにより、安定な３次元培養を行い、安定した再生軟骨を得ることが可能である。ゲル化剤の例は、例えばアテロコラーゲン、アルジネートなどである。
当該製造された再生軟骨は、軟骨欠損もしくは軟骨損傷部位の医療用移植素材、または美容整形用移植素材として用いられてよい。
別の実施の形態によると、上記製造方法により製造された再生軟骨が提供される。
従来、軟骨細胞以外の混入や少量の軟骨細胞の過増殖により再生軟骨の品質が担保されず、予定された医療を患者に提供できない、または移植後軟骨形成が低下するという問題が生じていた。軟骨細胞以外の混入は、軟骨細胞の純度を示す指標が未確立であるため判別することができなかった。また、少量の軟骨の過増殖は採取した軟骨細胞を酵素処理したものが夾雑物であり、単離時の軟骨細胞数の正確な計測が困難であるために生じていた。単離時の軟骨細胞数を過多に評価し、継代培養により規定通りの細胞数を入手した場合、培養した細胞集団は過増殖により脱分化が著しく進行し、軟骨としての特性が減弱化したものである可能性があった。
実施の形態に係る再生軟骨の軟骨特性を評価する方法によれば、培養軟骨細胞の軟骨特性を評価し、移植後所望の軟骨形成を示す再生軟骨を製造することが可能であるため、上述のような従来生じていた問題を解決することができる。
また、実施の形態によれば、移植後軟骨形成が低下する状況を回避でき、且つ品質を担保した医療用および美容用移植素材の提供が期待される。特に、先天性形態形成異常、例えば口唇口蓋裂の鼻変形のための医療用移植素材の提供が期待される。
［例］
以下、本発明の例について説明する。
＜実施例１＞
例１．再生軟骨製品の構成細胞が耳介軟骨細胞であることを判定するための指標の検討
再生軟骨製品の製造に用いる培養後１０００倍増殖した耳介軟骨細胞で高発現する遺伝子を以下の方法により検索した。
耳介軟骨細胞、線維芽細胞、皮膚角化細胞、気管上皮細胞、関節軟骨細胞、肋軟骨細胞、アストロサイト（星状膠細胞）について、単層培養法により約1週間に1回継代し、長期連続継代培養を行った。第２継代（ＰＳ）および第８継代（Ｐ８）の時点で各培養細胞からＴｏｔａｌ ＲＮＡを採取し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ ｐｌｕｓ Ａｒｒａｙを用いたマイクロアレー法により、それぞれの細胞で高発現している遺伝子を検索した。
その結果、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−１８、グリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）などの遺伝子が検出されたが、その中でも特に発現が高い遺伝子はＧＦＡＰ遺伝子であった。
さらに、ＧＦＡＰ遺伝子の発現量をＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＴ−ＰＣＲ法により測定した。各細胞について３サンプルの測定を行い、測定値の平均と標準偏差を得た。
各細胞について得られた結果を図１に示す。
図１から、耳介軟骨細胞、線維芽細胞、皮膚角化細胞、気管上皮細胞、関節軟骨細胞、肋軟骨細胞、アストロサイトのうち、ＧＦＡＰは耳介軟骨細胞において著しく発現量が高いことが示された。
この結果から、ＧＦＡＰを検出することにより、培養中に耳介軟骨細胞が線維芽細胞に置換され、意図せずに線維芽細胞が投与されてしまうというリスクを除外できることが示唆された。
例２．ＧＦＡＰの基質産生の指標としての適性の検討
由来の異なる６例の耳介軟骨細胞を、５％血清ならびにＦＧＦ−２およびインスリン含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液で約1週間に1回継代し、単層培養法で第８継代（Ｐ８）まで長期連続継代培養した。基質産生量の豊富な培養後１００倍増程度の耳介軟骨細胞（Ｐ２）と１億倍程度の細胞（Ｐ８）の時点で培養細胞からＴｏｔａｌ ＲＮＡを採取し、ＧＦＡＰ遺伝子の発現量をＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＴ−ＰＣＲ法により測定した。
結果を図２に示す。図２から、全例でＰ２の発現が高いことが示されたが、同じ培養条件で培養したにも関わらず、Ｐ２での遺伝子発現はコピー数で７．２×１０３〜１．３２１×１０６と、細胞間で非常にばらつきが大きいことが示された。
そこで、測定上のばらつきを抑制するため、タンパクレベルでの評価を検討した。
例３．タンパク質レベルでのＧＦＡＰの発現測定
１８例のヒト耳介軟骨細胞について、５％血清ならびにＦＧＦ−２およびインスリン含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液で約1週間に1回継代し、長期にわたる培養を第３継代まで行った。培養した耳介軟骨細胞をトリプシン処理して回収し、１×１０７細胞/ｍＬの濃度で１％アテロコラーゲンゲルに混和した。この細胞混和ゲルを２０μｌずつ試験管に分注し、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−２）、インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、甲状腺ホルモン（Ｔ３（Ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｒｙｏｎｉｎｅ））を含むＢＭＰ−２／ｉｎｓｕｌｉｎ／Ｔ３含有軟骨細胞基質産生誘導培地で高密度包埋培養を行った。３週間後、軟骨細胞が分泌したＧＡＧ量、およびＣＯＬ２量を比色法およびＥＬＩＳＡ法により測定した。またアテロコラーゲンに包埋したものと同じＰ３培養軟骨細胞を１×１０４細胞分取し、この細胞溶解液中のＧＦＡＰ量をＥＬＩＳＡ法で測定した。１８例の提供者の異なる耳介軟骨細胞で同試験を行い、培養細胞が分泌したＧＡＧ量、ＣＯＬ２量と細胞中ＧＦＡＰ量の相関をＳＳＲＩ社製エクセル統計により計算した。結果を図３および図４に示す。
図３および図４より、細胞中ＧＦＡＰ量とＧＡＧの相関係数は０．５０７、ＣＯＬ２との相関係数は０．５９０であり、両値のあいだには中程度の相関があることが示された。このことから再生軟骨を構成する軟骨細胞のＧＦＡＰをタンパク質レベルで測定することにより、軟骨細胞の機能的な評価が可能となることが示唆された。
例４．ＧＦＡＰ含有量を評価するためのサンプルの検討
上記例３．におけるタンパク質測定は、細胞溶解液ではなく細胞培養上清をサンプルとして用いて行った。細胞上清をサンプルとして用いれば、再生軟骨製品の貴重な原材料となる細胞をひとつも損ねることがないため、再生軟骨の製造において非常に有利である。
そこで、以下の方法により１８例の提供者の異なる耳介軟骨細胞について試験を行った。第３継代（Ｐ３）まで培養した耳介軟骨細胞をトリプシン処理により回収し、１×１０７細胞/ｍＬの濃度で１％アテロコラーゲンゲルに混和した。この細胞混和ゲルを２０μｌずつ試験管に分注し、ＢＭＰ−２／ｉｎｓｕｌｉｎ／Ｔ３含有軟骨細胞基質産生誘導培地で高密度包埋培養を行った。３週間後、軟骨細胞が分泌したＧＡＧ量、およびＣＯＬ２量を比色法およびＥＬＩＳＡ法により測定した。またアテロコラーゲンに包埋したものと同じＰ３培養軟骨細胞の培養上清を一部分取し、この培養上清に含有するＧＦＡＰ量をＥＬＩＳＡ法により測定した。１８例の提供者の異なる耳介軟骨細胞で同試験をおこない、培養細胞が分泌したＧＡＧ量、ＣＯＬ２量と培養上清中ＧＦＡＰ量の相関を計算した。結果を図５および図６に示す。
図５および図６から、培養上清中ＧＦＡＰ量とＧＡＧの相関係数は０．７６７、ＣＯＬ２との相関係数は０．７３５であり、両値の間には強い相関があることが示された。また、培養上清中のＧＦＡＰ含量が高ければ高いほど、旺盛な軟骨再生が示された。
したがって、培養上清の一部を採取し、ＧＦＡＰ量をＥＬＩＳＡで測定することにより、細胞や組織を損ねることなく、出荷判定できることが示された。
例５．軟骨特性の評価のためのＧＦＡＰタンパク質量の閾値の決定
第２継代（Ｐ２）の培養耳介軟骨細胞および培養線維芽細胞をそれぞれ３例、軟骨増殖培地で５％血清ならびにＦＧＦ−２およびインスリン含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液で１週間培養を行った。この培養細胞から培養上清を１ｍＬ分取し、その後トリプシン処理により培養細胞を回収した。回収した細胞を１×１０８細胞／ｍＬの濃度で１％アテロコラーゲンゲルに混和したものを多孔体型足場素材に投与し、３７℃で２時間インキュベートしてゲル化させた。これをヌードマウス背部皮下に移植した。
２ヶ月後、移植物を摘出し、半切して一方はトルイジンブルー染色による組織学評価に用いた。もう一方はＧＡＧ量、ＩＩ型コラーゲン量のタンパク質定量評価に用いた。分取した培養上清の含有するＧＦＡＰ量はＥＬＩＳＡ法で測定した。結果を図７および図８に示す。
図７の培養上清中のＧＦＡＰ量の結果および図８の組織学的評価から、耳介軟骨細胞の全例で、培養上清よりＧＦＡＰが検出され、ヌードマウス移植により軟骨形成が見られることが示された。一方、線維芽細胞では全例でＧＦＡＰは検出されず、軟骨形成もみられなかった。
また、図７および図８から、移植後に軟骨形成し且つ旺盛な軟骨再生を示した培養ヒト耳介軟骨細胞では、培養上清中にＧＦＡＰが少なくとも０．０５ｎｇ／ｍＬ以上存在していることが示された。これらのことから、培養上精にＧＦＡＰが０．０５ｎｇ／ｍＬ以上含まれれば、再生軟骨を形成する培養ヒト耳介軟骨細胞が含有していることが示唆され、出荷判定の基準として用いることができることが明らかとなった。
以上のことから、培養上清にＧＦＡＰが０．０５ｎｇ／ｍＬ含まれることを確認することによって、軟骨細胞の純度の低さに起因した軟骨形成が低下する状況を回避することができ、品質を担保することが出来ると判断された。
＜実施例２＞
再生軟骨は以下の手順で製造される。図９は、当該再生軟骨の製造工程を概略的に示す図である。
患者耳介軟骨の一部（約１ｃｍ×５ｍｍ×２ｍｍ）を採取し、コラゲナーゼ処理により軟骨細胞を単離する。単離した軟骨細胞は、５％自己血清およびＦＧＦ−２、インスリン含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液で約３〜６週間培養する。培養し、約１０００倍の細胞数に増殖させた細胞を回収する。回収した培養軟骨細胞を、ＰＬＬＡ製足場素材に投与し、再生軟骨を形成する（図９）。
なお、製造工程中の試験として、培養後３９日で培養液検査として、ＥＬＩＳＡを用いて培養上清中に含有されるＧＦＡＰのタンパク濃度を測定する。培養３９日（移植３日前）において、培養上清中にＧＦＡＰが０．０５ｎｇ／ｍＬ以上含まれることを確認することによって、安全に移植可能であり、移植後、体内で軟骨を形成し、再生軟骨として生着可能であると判断する。
したがって、上述の手順に従って製造される再生軟骨は、良好な軟骨特性を有し、品質を担保した再生軟骨である。

Claims (8)

  1. 単離された軟骨細胞または単離および培養された軟骨細胞の培養上清に含まれるＧＦＡＰ含有量を測定することにより再生軟骨の軟骨特性を評価する方法。
  2. 前記軟骨細胞が耳介軟骨細胞であることを特徴とする請求項１の再生軟骨の軟骨特性を評価する方法。
  3. 前記ＧＦＡＰ含有量が培養上清１ｍＬあたり０．０５ｎｇ以上であるとき、移植に適していると判断する、請求項１または２に記載の再生軟骨の軟骨特性を評価する方法。
  4. 前記ＧＦＡＰ含有量が培養上清１ｍＬあたり０．５ｎｇ以上であるとき、移植に適していると判断する、請求項１または２に記載の再生軟骨の軟骨特性を評価する方法。
  5. 前記ＧＦＡＰ含有量が培養上清１ｍＬあたり５ｎｇ以上であるとき、移植に適していると判断する、請求項１または２に記載の再生軟骨の軟骨特性を評価する方法。
  6. （１）単離されたヒト耳介軟骨細胞を培養することと、
    （２）培養上清に含まれるＧＦＡＰ含量を測定することと、
    （３）当該ＧＦＡＰ含量が培養上清１ｍＬあたり０．０５ｎｇ以上であることが確認された前記（１）において培養されたヒト耳介軟骨細胞を用いて再生軟骨を形成することと
    を具備する再生軟骨の製造方法。
  7. 前記再生軟骨を形成することが、足場素材を用いて軟骨細胞を３次元培養することを含む請求項６に記載の再生軟骨の製造方法。
  8. 請求項６または７に記載の製造方法により製造される再生軟骨。
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