KR102691658B1 - 동결수정란의 라벨링 방법 및 이를 이용한 소의 번식 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 동결수정란의 라벨링 방법 및 이를 이용한 소의 번식 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 동결수정란의 라벨링 방법은 체외 배양된 수정란의 분리된 할구에서 소의 성별, 육질형과 육량형으로 수정란을 구분할 수 있어, 향후 목적에 맞게 수정란을 선별적으로 활용가능한 효과가 있다.
Description
본 발명은 동결수정란의 라벨링 방법 및 이를 이용한 소의 번식 방법에 관한 것이다.
수정란 동결에 대한 연구는 생명공학 분야뿐만 아니라 가축의 개량과 증식 그리고 보존분야에서도 그 중요성이 증가되고 있다. 기후 변화에 따른 지구의 식생 변화와 각국의 토종가축 또는 희소품종들을 보존하여 국가의 유전자원 확보를 위한 측면에서 종자의 보존은 곧 국가의 미래자산이기 때문이다.
소에 있어서 동결보존 방법은 수정란을 동결보존 후 융해하여 직접 이식하는 slow-freezing(완만동결) 방법과 보다 간편한 동결법인 vitrification(초자화동결)방법을 이용하고 있다.
완만동결은 ethylene glycol을 동결보호제로 사용하는 동결법으로서 동결, 융해 후 수정란을 이식하였을 때 임신율이 우수하여 동결란의 직접이식법으로 이용되고 있다(Pereira, P. V., Dayan, A., Watanabe, M. R., Avila, F. M., Marchizeli, J. C., Accorsi, M. F. and Watanabe, Y. F. 2002. Pregancy rate following transfer of cryopreservation in vitro produced bovine embryos. Theriogenology. 57:475.).
또한, 소 수정란 성판별에 대한 연구는 유전적으로 우수한 혈통의 수정란을 이식하기 전에 성판별을 실시하여 암컷 예측 수정란을 이식하여 암송아지를 생산하는 것으로서 수정란이식연구에 포함되는 중요한 연구 분야이다.
이에 본 발명자들은 수정란에서 분리된 할구에서 유전체 분석을 통해 육질형과 육량형으로 수정란을 구분하여 라벨링하여 수정란에 대한 정보를 정확히 함으로써 수정란에 대한 활용성을 높일 수 있는 방법을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 수정란의 동결보존 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 동결수정란의 라벨링 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 동결보존된 수정란을 해동한 후, 수정란을 배란기의 암소에 주입하는 단계;를 포함하는, 소의 번식방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 라벨링된 동결수정란을 해동한 후, 수정란을 배란기의 암소에 주입하는 단계;를 포함하는, 소의 번식방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 소의 난자를 체외 성숙하고, 체외 성숙된 난자와 소의 정자를 체외 수정한 다음 체외 배양하는 단계(단계 1);
체외 배양된 수정란의 할구를 분리하여 유전체 정보를 분석하는 단계(단계 2); 및
상기 유전체 정보를 분석한 수정란을 동결보존하는 단계(단계 3); 를 포함하는, 수정란의 동결보존 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 소의 난자를 체외 성숙하고, 체외 성숙된 난자와 소의 정자를 체외 수정한 다음 체외 배양하는 단계(단계 1);
체외 배양된 수정란의 할구를 분리하여 유전체 정보를 분석하는 단계(단계 2);
상기 유전체 정보를 분석한 수정란을 미세조작기를 이용하여 수정란을 라벨링하는 단계(단계 3); 및
상기 라벨링된 수정란을 동결보존하는 단계(단계 4); 를 포함하는, 동결수정란의 라벨링 방법을 제공한다.
나아가 본 발명은 상기 수정란의 동결보존 방법에 의하여 동결보존된 수정란을 해동한 후, 수정란을 배란기의 암소에 주입하는 단계;를 포함하는, 소의 번식방법을 제공한다.
더 나아가 본 발명은 동결수정란의 라벨링 방법에 의하여 라벨링된 동결수정란을 해동한 후, 수정란을 배란기의 암소에 주입하는 단계;를 포함하는, 소의 번식방법을 제공한다.
본 발명에 따른 동결수정란의 라벨링 방법은 체외 배양된 수정란의 분리된 할구에서 소의 성별, 육질형과 육량형으로 수정란을 구분할 수 있어, 향후 목적에 맞게 수정란을 선별적으로 활용가능한 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 동결수정란의 라벨링 방법으로 수정란의 성별, 육질형 및 육량형을 구분한 모식도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 소의 난자를 체외 성숙하고, 체외 성숙된 난자와 소의 정자를 체외 수정한 다음 체외 배양하는 단계(단계 1);
체외 배양된 수정란의 할구를 분리하여 유전체 정보를 분석하는 단계(단계 2); 및
상기 유전체 정보를 분석한 수정란을 동결보존하는 단계(단계 3);를 포함하는, 수정란의 동결보존 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 2의 유전체 정보 분석을 통하여 소의 성별, 육질형 또는 육량형을 구분할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 3의 동결보존은 완만동결(slow-freezing) 방법을 사용하여 수정란을 동결보존할 수 있다.
또한, 본 발명은 소의 난자를 체외 성숙하고, 체외 성숙된 난자와 소의 정자를 체외 수정한 다음 체외 배양하는 단계(단계 1);
체외 배양된 수정란의 할구를 분리하여 유전체 정보를 분석하는 단계(단계 2);
상기 유전체 정보를 분석한 수정란을 미세조작기를 이용하여 수정란을 라벨링하는 단계(단계 3); 및
상기 라벨링된 수정란을 동결보존하는 단계(단계 4);를 포함하는, 동결수정란의 라벨링 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 2의 유전체 정보 분석을 통하여 소의 성별, 육질형 또는 육량형을 구분할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 3의 라벨링은 상기 단계 2에서 분석한 유전체 정보를 미세조작기의 피펫에 흡입된 식용색소를 수정란 투명대 내로 주입하여 색상구분에 의해 구분할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 4의 동결보존은 완만동결(slow-freezing) 방법을 사용하여 수정란을 동결보존할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 수정란의 동결보존 방법에 의하여 동결보존된 수정란을 해동한 후, 수정란을 배란기의 암소에 주입하는 단계;를 포함하는, 소의 번식방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 해동은 동결보존된 수정란을 상온에서 정치하여 동결보존용 조성물을 휘발시켜 제거한 다음, 물에 침지하여 수행할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 침지는 1 내지 10℃의 물에서 2 내지 10분, 30 내지 40℃의 물에서 10 내지 30초 또는 60 내지 80℃의 물에서 1 내지 5초 동안 수행할 수 있고, 바람직하게 30 내지 40℃의 물에서 10 내지 30초 수행할 수 있고, 보다 바람직하게 35 내지 39℃의 물에서 15 내지 25초 수행할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 동결보존용 조성물은 에틸렌글리콜, 수크로스, 시트르산염, 바이카보네이트염, 타우린, 하이포타우린, 트레할로스, 글리세롤, 글루코스, 프로필렌 글리콜, 프럭토스, 덱스트란, 히알루론산, 시트르산, 아세트산, 부티르산, 팔미트산, 옥살산, 타타르산, 스트렙토마이신, 페니실린, 앰피실린, 카나마이신, 난황단백질, 아미노산 및 이들의 조합을 사용할 수 있고, 바람직하게 1 내지 2M 농도의 에틸렌글리콜 및 0.1 내지 0.5M 농도의 수크로스를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 동결수정란의 라벨링 방법에 의하여 라벨링된 동결수정란을 해동한 후, 수정란을 배란기의 암소에 주입하는 단계;를 포함하는, 소의 번식방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 해동은 동결보존된 수정란을 상온에서 정치하여 동결보존용 조성물을 휘발시켜 제거한 다음, 물에 침지하여 수행할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 침지는 1 내지 10℃의 물에서 2 내지 10분, 30 내지 40℃의 물에서 10 내지 30초 또는 60 내지 80℃의 물에서 1 내지 5초 동안 수행할 수 있고, 바람직하게 30 내지 40℃의 물에서 10 내지 30초 수행할 수 있고, 보다 바람직하게 35 내지 39℃의 물에서 15 내지 25초 수행할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 동결보존용 조성물은 에틸렌글리콜, 수크로스, 시트르산염, 바이카보네이트염, 타우린, 하이포타우린, 트레할로스, 글리세롤, 글루코스, 프로필렌 글리콜, 프럭토스, 덱스트란, 히알루론산, 시트르산, 아세트산, 부티르산, 팔미트산, 옥살산, 타타르산, 스트렙토마이신, 페니실린, 앰피실린, 카나마이신, 난황단백질, 아미노산 및 이들의 조합을 사용할 수 있고, 바람직하게 1 내지 2M 농도의 에틸렌글리콜 및 0.1 내지 0.5M 농도의 수크로스를 사용할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 체외수정란 생산
한우 도축 암소로부터 적출된 난소를 0.9% 생리식염수에 담아 2시간 이내로 운반하였다. 가시난포의 직경이 2 내지 6 mm의 난포로부터 난포란을 난포액과 함께 19 gauge 주사침이 부착된 10 ml 주사기를 이용하여 채취하였다. 체외성숙을 위한 난포란은 1등급 및 2등급(IETS 기준)만을 사용하였다. 그리고 난포란의 체외성숙을 위해서 TCM199(Sigma)를 기본배양액으로 5% FBS(Gibco)와 LH(10 μg/ml) 그리고 FSH(35 μg/ml)를 첨가하여 5% CO2, 95% 공기, 39℃ 배양기에서 22시간 동안 체외성숙을 유도하여 체외수정을 실시하였다. 체외수정에 사용된 정액은 한우 동결정액(KPN)을 이용하였고 정자의 수정능 획득과 정자의 분리는 BO 배양액을 이용하였다. 정자의 회수를 위한 원심분리는 1,800 rpm으로 5분 동안 2회 반복적으로 실시한 후 정자의 펠렛을 회수하였다. 그리고 체외수정용 배양액인 IVF 100(IFP, Japan)에서 한번 더 원심 분리를 실시하여 체외수정에 사용하였다. 체외수정은 IVF 100 배양액을 60 mm petri dish(Nunc, Denmark)에서 50 μl 미소적을 만들어 약 20개의 체외성숙된 난포란과 정자를 공동 배양하여 체외수정을 유도하였다. 체외수정액에 사용된 정자의 최종농도는 2×106/ml로 하였으며, 체외수정은 CO2 배양기 내에서 6시간 동안 실시하였다. 수정란의 체외배양은 IVMD(IFP, Japan) 배양액에서 실시하였다. 체외수정 후 3일째와 5일째에 신선한 배양액으로 교환을 하였으며, 수정란은 수정 후 7일과 8일째 생산된 배반포기배 수정란을 실험에 공시하였다.
실시예 2. 수정란 할구 분리 및 라벨링
상기의 방법으로 생산된 체외 수정란을 마이크로 미세조작기 (Micromanipulator)에서 수정란의 투명대를 통과하여 수정란의 할구를 분리하여 수정란에서 유전체 분석기법 등을 활용하여 육질형, 육량형 등으로 구분하였다.
구분된 수정란의 특성에 맞게 미세조작기를 이용하여 injection 피펫에 식용색소(파란색 또는 빨간색)를 흡입하여 투명대 내로 주입하여 수정란을 구분하였다.
실시예 3. 수정란의 동결보존
수정란의 완만동결을 위한 동결보호제로서는 1.8 M 에틸렌글리콜(ethylene glycol)(EG, Sigma) 및 0.3 M 수크로스(Sucrose)가 첨가된 보존액을 사용하였다. 수정란의 동결을 위해서는 프로그램화된 자동동결기(CL863, Cryogenic, Australia)를 사용하여 동결을 실시하였다. 수정란 동결 과정은 0.25 ml 스트로우에 장착 후 액체질소에 침지된 chamber내에 위치시킨 후, chamber 온도는 -6℃에서 시작하여 10분간 정치시키는데 약 3분 후에 스트로우 식빙을 실시한다. 그리고 -34℃까지 -0.4℃/분 속도로 냉각시킨 후 -34℃에 도달하였을 때 액체질소(-196℃)에 바로 침지하고, 액체질소 탱크에 동결보존 한다.
실시예 4. 수정란의 생존성 확인
동결된 수정란의 생존성을 확인하기 위하여 수정란을 융해하였다. 보다 구체적으로, 액체질소 탱크에서 꺼내어 공기중에서 10초간 질소를 건초시킨 후 37℃로 가온된 온수에서 20초간 스트로우를 깊숙이 담그고 흔들지 말고 꺼내어 스트로우를 멸균된 타올로 닦아내고 수정란을 배양에 옮긴 후 인큐베이터에서 배양하여 수정란이 재확장 되는 것으로 생존성을 평가하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (13)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 소의 난자를 체외 성숙하고, 체외 성숙된 난자와 소의 정자를 체외 수정한 다음 체외 배양하는 단계(단계 1);
체외 배양된 수정란의 할구를 분리하여 유전체 정보를 분석하는 단계(단계 2);
상기 유전체 정보를 분석한 수정란을 미세조작기를 이용하여 수정란을 라벨링하는 단계(단계 3); 및
상기 라벨링된 수정란을 동결보존하는 단계(단계 4);
를 포함하는, 동결수정란의 라벨링 방법으로서,
상기 단계 2의 유전체 정보는 소의 성별, 육질형 및 육량형이고,
상기 단계 3의 라벨링은 미세조작기의 피펫에 흡입된 식용색소를 수정란 투명대 내로 주입하는 것을 특징으로 하는, 동결수정란의 라벨링 방법. - 삭제
- 삭제
- 제4항에 있어서,
상기 단계 4의 동결보존은 완만동결(slow-freezing) 방법인 것을 특징으로 하는, 동결수정란의 라벨링 방법. - 삭제
- 제4항의 방법에 의하여 라벨링된 동결수정란을 해동한 후, 수정란을 배란기의 암소에 주입하는 단계;를 포함하는, 소의 번식방법.
- 제9항에 있어서,
상기 해동은 동결보존된 수정란을 상온에서 정치하여 동결보존용 조성물을 휘발시켜 제거한 다음, 물에 침지하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 소의 번식방법. - 제10항에 있어서,
상기 침지는 1 내지 10℃의 물에서 2 내지 10분, 30 내지 40℃의 물에서 10 내지 30초 또는 60 내지 80℃의 물에서 1 내지 5초 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, 소의 번식방법. - 제10항에 있어서,
상기 동결보존용 조성물은 에틸렌글리콜, 수크로스, 시트르산염, 바이카보네이트염, 타우린, 하이포타우린, 트레할로스, 글리세롤, 글루코스, 프로필렌 글리콜, 프럭토스, 덱스트란, 히알루론산, 시트르산, 아세트산, 부티르산, 팔미트산, 옥살산, 타타르산, 스트렙토마이신, 페니실린, 앰피실린, 카나마이신, 난황단백질, 아미노산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 소의 번식방법. - 제12항에 이어서,
상기 동결보존용 조성물은 1 내지 2M 농도의 에틸렌글리콜 및 0.1 내지 0.5M 농도의 수크로스인 것을 특징으로 하는, 소의 번식방법.
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| KR1020210176066A KR102691658B1 (ko) | 2021-12-09 | 2021-12-09 | 동결수정란의 라벨링 방법 및 이를 이용한 소의 번식 방법 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101592554B1 (ko) * | 2009-08-18 | 2016-02-12 | 이화여자대학교 산학협력단 | 바이오-무기 복합체, 이의 제조방법, 이를 포함하는 식별용 조성물, 및 이를 이용한 식별 시스템 |
-
2021
- 2021-12-09 KR KR1020210176066A patent/KR102691658B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Sergi Novo et al., "A novel embryo identification system by direct tagging of mouse embryos using silicon-based barcodes", Human Reproduction, Vol. 26, No.1, pp. 96-105, 2011* |
| 한영훈 외, "체내 및 체외 수정란의 할구를 이용한 성 판별", CNU Journal of Agricultural Science, Vol. 38, No. 2, pp. 269-275, June 2011* |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20230087269A (ko) | 2023-06-16 |
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