KR100729731B1 - 사람 피부 세포의 세포사멸을 억제하는 활성을 갖는플라보노이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사람 피부 세포의 세포사멸을 억제하는 활성을 갖는 플라보노이드에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 식물 유래 플라보노이드인 3,4’-디하이드록시플라본(3,4’-dihydroxyflavone)을 유효성분으로 함유하는 사람 피부세포의 세포사멸(apoptosis) 억제용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 3,4’-디하이드록시플라본(3,4’-dihydroxyflavone)의 사람 피부세포의 세포사멸(apoptosis) 억제 기능을 이용함으로써 사람 피부세포의 세포사멸을 예방 또는 치료할 수 있는 기능성 화장료 조성물 또는 약학적 조성물의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

3,4’-디하이드록시플라본, 사람피부세포

Description

사람 피부 세포의 세포사멸을 억제하는 활성을 갖는 플라보노이드{3,4'-dihydroxyflavone having activity of suppressing apoptosis of keratinocyte}

도 1은 HaCaT cell의 viability와 apoptosis에 대한 플라보노이드와 etoposide의 영향을 나타내는 데이터이다.

도 2는 본 발명의 3,4'-DHF가 HaCaT cell에서의 etoposide에 의해 유발된 apoptosis를 억제하는 것을 보여주는 데이터이다.

도 3은 본 발명의 3,4'-DHF가 ERK signaling pathway의 억제를 통하여 etoposide에 의해 유발된 apoptosis를 차단하는 것을 보여주는 데이타이다.

도 4는 HaCaT cell에서 ERK1의 과발현이 etoposide에 의해 유발된 apoptosis에 대한 3,4'-DHF의 저해를 복구(override)하도록 한다는 것을 보여주는 데이터이다.

도 5는 본 발명의 3,4'-DHF가 세포내 활성산소종(ROS) 생성과 그에 따른 ERK 활성화를 억제함으로써 스트레스에 의한 apoptosis로부터 HaCaT cell를 보호한다는 것을 보여주는 데이터이다.

도 6은 본 발명의 3,4'-DHF이 HaCaT cell에서 kaempferol에 의해 유발된 apoptosis를 억제한다는 것을 보여주는 데이터이다.

도 7은 본 발명에 사용된 플라보노이드의 화학적 구조와 그들의 HaCaT cell 의 cell viability에 대한 영향을 나타내는 그림이다.

본 발명은 사람 피부 세포의 세포사멸을 억제하는 활성을 갖는 플라보노이드에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 식물 유래 플라보노이드인 3,4’-디하이드록시플라본(3,4’-dihydroxyflavone)을 유효성분으로 함유하는 사람 피부세포의 세포사멸(apoptosis) 억제용 조성물에 관한 것이다.

Apoptosis는 생리적인 balance를 유지하는데 적용되는 기본적인 세포 활동일 뿐만 아니라 손상된 세포나 비정상적인 세포의 제거를 통하여 carcinogenesis에 대항하는 protective mechanism으로 알려져 있다 (Hengartner, M. O. (2000) Nature 407(6805), 770-776). 이것은 복잡한 면역방어기작과 positive, negative cell survival regulatory factor의 불균형에 연관된 많은 질병의 발병에도 관련되어 있다고 보고되고 있다. Apoptotic process는 많은 pro-와 anti-apoptotic molecules의 엄격한 조절에 의해 일어난다. 그리고 이는 주로 cysteine protease의 caspase family에 의해서 일어난다. 최근의 연구 결과에서 중요 조절 단백질들의 phosphorylation과 dephosphorylation이 세포성장과 apoptosis의 측면에서 매우 중요한 두 가지 세포성 기작이라는 것을 밝혀내었다. 초기의 phosphorylation- dephosphorylation apoptotic signaling cascades 중의 하나는 mitogen-activated protein kinases (MAPKs)가 관련 되어 있다는 것이 밝혀졌다. MAPKs는 serine- threonine kinases의 한 family로 protein kinase family의 세 가지 요소 - the MAPK kinase kinases (MAPKKKs), the MAPK kinases (MAPKKs)와 MAPKs- 로 구성되어 있다. 현재, p42/p44 extracellular signal-related kinases (ERK1 과 2), c-Jun N-terminal protein kinase(JNK)/stress-activated protein kinases (SAPK), p38 MAP kinases를 포함한 MAP kinase 와 big MAPK (BMK1/ERK5)가 독립적인 signaling pathway 안에서 기능을 한다고 보고되어 왔다. 활성화된 MAP kinase는 기질 단백질 안의 Ser-Pro와 Thr-Pro motifs 의 phosphorylation에 영향을 끼치고, growth factor, mitogen, cytokine와 environmental stress를 포함한 다양한 세포 외 자극에 의해 조절된다고 밝혀져 왔다. MAP-kinase signaling module의 기능과 활성의 특이성은 scaffold, adaptor와 MAP kinase signaling cascade 안에서 kinase와의 상호작용에 관여하는 inhibitory protein을 포함한 몇몇의 apoptotic regulator의 활성에 의해 결정된다.

플라보노이드(flavonoids)는 광범위 하게 퍼져있는 식물 색소의 구성 물질이고 대부분은 phenylalanine에서 합성되어질 수 있다. 최근 상당히 의학적 치료의 목적으로 플라보노이드의 구조와 기능에 초점이 맞춰지고 있다 (Havsteen, B. H. (2002) Pharmacol Ther 96(2-3), 67-202). 이것은 녹색식물의 세포 어디에나 산재되어 있고, 자연계에서 식물의 색깔에 많이 관련되어 있다. 대부분은 UV light에 의해서 자극되어 밝은 형광을 뿜는다. 플라보노이드는 유전자 발현 억제뿐만 아니라 auxin indolyl acetic acid의 exocytosis를 통하여 식물성장의 많은 조절 기능에 영향을 끼치고 여러 생물학적 기능을 조절한다. 그리고 플라보노이드는 reverse transcriptase와 protease와 같은 viral enzyme은 물론이고 bacterial strain을 줄이거나 죽이는 기능도 한다. 이것은 또한 특정 병원성 원생동물을 죽인다고도 알려져 있지만, 동물 세포에 대해 독성은 매우 낮다고 알려져 있다. 플라보노이드는 그들의 특정 효소를 특이적으로 저해하는 성질로 인하여 많은 질병의 치료에서 특정 호르몬이나 신경전달물질을 자극시키거나 free radical을 제거하는데 이용되어 왔다 (Hertog, M. G., et al. (1993) Nutr Cancer 20(1), 21-29).

플라보노이드는 phenolic compound이며 diphenylpropane (C6C3C6) skeleton에 의해 특성화된 구조를 가진다. 이 구조는 monomeric flavanol, flavone, flavanol, flavanon에 나타나고 이러한 모든 화합물은 cancer prevention을 포함한 인간의 건강 전반에 걸쳐 어떤 중요한 잠재적인 역할을 하는지 알아보아야 할 것이다. 이전의 연구들에서 몇몇 플라보노이드는 anti-tumor 성질을 나타내기도 하고 또한, 이들의 항산화적 성질을 이용하여 apoptosis와 세포의 분화, 그리고 세포 주기를 조절 한다 (Fu, Y., et al. (2004) Biochem Biophys Res Commun 322(1), 263-270). 그러나 in vitro에서는 플라보노이드의 항산화적 활성이 낮은 빈도로 나타나며 농도에 따라 pro-oxidant나 anti-oxidant compound로서의 기능으로 항산화적 성질의 가능성의 논쟁이 일기도 했었다 (Cemeli, E., et al. (2004) Environ Mol Mutagen 44(5), 420-426). 플라보노이드의 기능에 대한 많은 연구에도 불구하고 플라보노이드의 pro-oxidant/anti-oxidant 성질은 논쟁으로 남아 있으며, 또한 이들 효과에 대한 자세한 molecular mechanism은 잘 알려지지 않았다. 최근 연구에서는 몇몇 플라보노이드의 apoptosis 조절 효과에 대한 접근이 시도 되었다.

신체와 외부의 경계인 epidermal keratinocyte은 정기적, 연속적으로 radiation과 chemical을 포함한 다양한 environmental, physiological stress에 노출되어 있다. Keratinocyte는 때때로 이러한 유해한 자극에 apoptosis가 일어나거나 생존을 위한 신호전달 기작이 있다고 보고되고 있다 (Diker-Cohen, T., et al. (2003) Ann N Y Acad Sci 1010, 350-353). 본 발명에서는 HaCaT keratinocyte에 keampferol, quercetin, isohamnetin을 포함한 다양한 종류의 플라보노이드를 처리하여 pro-apoptotic effect를 확인하였다. 그러나 3,4’-dihydroxyflavone (3,4'-DHF)를 포함한 몇몇의 플라보노이드는 anti-apoptotic 영향을 나타내었으며, 3,4’-dihydroxyflavone (3,4'-DHF)가 etoposide 그리고 kaempferol이 유도하는 apoptosis에서 활성산소종이 조절하는 ERK의 신호전달 기작을 저해해 apoptosis를 억제 한다는 것을 알 수 있었다. 그리고 이러한 반응들이 플라보노이드들 간의 structure-activity relationship(SAR)에 의해 일어날 것이라는 것을 예상할 수 있으며, 본 발명을 통해 apoptosis는 여러 플라보노이드에 의해 특이적으로 조절되고, 이들의 diphenylpropane (C6C3C6) skeleton 안에서 hydroxyl (OH)기의 특이적인 위치에 의해 좌우된다는 것을 알 수 있었다.

이에 본 발명자들은 이들 결과를 통해서 3,4’-dihydroxyflavone와 같은 플라보노이드가 사람 피부세포를 외부자극으로부터 보호하는데 효과적으로 응용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 사람 피부 세포의 세포사멸을 효과적으로 억제하 는 활성을 갖는 식물 유래 플라보노이드인 3,4’-디하이드록시플라본(3,4’-dihydroxyflavone)을 포함하는 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 3,4’-디하이드록시플라본(3,4’-dihydroxyflavone)을 유효성분으로 함유하는 사람 피부세포의 세포사멸(apoptosis) 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 3, 4'-dihydroxy flavone (3,4'-DHF)는 식물 유래 플라보노이드의 일종으로서 하기 화학식 1과 같은 구조를 가진다. 플라보노이드 diphenylpropane (C6C3C6) skeletons의 3,4번 탄소위치에 OH를 가지며, 5,7번 탄소위치에는 OH기가 없다.

[화학식 1]

본 발명에서는, 상기 3, 4'-dihydroxy flavone (3,4'-DHF)가 세포 성장 저해 효과를 나타내는 keamferol, quercetin 및 isohamnetin와 같은 flavonoids와 달리 오히려 세포 성장을 자극하며, 사람 피부세포(keratinocyte)의 세포사멸을 효과적으로 억제한다는 것을 확인하였다. 또한, 상기 세포사멸의 억제가 세포내 활성산소종 생성 및 ERK 신호경로의 활성을 억제시킴으로써 이루어진다는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 3,4’-디하이드록시플라본(3,4’-dihydroxyflavone)는 피부의 세포사멸 보호용 기능성 화장료 조성물 또는 약학적 조성물의 원료로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

지금까지, 다양한 flavonids와 관련된 세포 효과를 설명하는 정확한 분자 메카니즘은 아직 밝혀진 바 없다. 본 발명에서는, 여러 flavonoids를 인간 HaCaT keratinocytes에 투여하였으며, 세포 성장 저해 효과를 나타내는 keamferol, quercetin 및 isohamnetin를 포함하는 다른 flavonoids와 달리 3,4'-dihydroxy flavone (3,4'-DHF)이 세포 성장을 자극하는 효과를 발휘하는 것을 확인하였다. 3,4'-DHF는 HaCaT keratinocytes의 etoposide에 의한 세표사멸에 대해 anti-apoptotic 효과를 발휘하였다. 본 발명에서는, 또한 ERK 활성화가 HaCaT cells의 etoposide-유발된 apoptosis와 밀접하게 연관되어 있다는 것과 3,4'-DHF를 처리하면 etoposide-유발된 ERK 활성화를 현저히 억제하며 동시에 PARP 또는 procaspase 3의 절단을 저해한다는 것을 확인하였다. ERK 과발현은 3,4'-DHF의 anti-apoptotic 기능을 무력화(override)하였으나, ERK-DN는 그렇지 않았다. 또한, 3,4'-DHF를 처리하면 H₂O₂-유발된 세포 사멸로부터 세포를 보호하였으며, 스트레스에 의한 ROS의 생성을 현저히 저해하는 효과를 나타내었다. 마지막으로, 본 발명에서는, 3,4'-DHF가 kaempferol에 의해서 유발된 apoptosis를 거의 완전히 저해할 뿐만 아니라, 세포내 ROS 생성 및 ERK의 활성화를 동시에 억제한다는 것을 밝혀냈다. 결과적으로, 본 발명은 etoposide와 다양한 flavonoids를 포함하는 phytochemicals 집단들이 세 포내 ROS의 생성의 차별적 조절 및 ERK signaling pathway의 활성화를 통해 인간 HaCaT keratinocytes의 apoptosis를 차별적으로 조절한다는 것을 가르킨다. 이들 결과로부터 여러 flavonoids들 사이의 뚜렷한 structure-activity relationship (SAR)이 있다고 결론내릴 수 있다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 3, 4'-dihydroxy flavone (3,4'-DHF)는 상업적으로 구입할 수 있는 화합물의 형태로 포함될 수도 있으나, 상기 플라보노이드가 많이 함유되어 식물의 추출물 또는 정제물의 형태로 포함될 수도 있다.

본 발명의 조성물은 당업계에 알려진 통상의 방법에 의해 과립, 정제, 캡슐 또는 드링크제 등의 형태로 제제화 되거나 크림, 로션, 화장수 등의 화장료 형태로 제조될 수 있다. 또한, 보존이나 취급을 용이하게 하기 위하여 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 통상 제제화에 사용되는 캐리어, 그 밖의 임의의 조제를 부가하여도 좋다.

또한, 본 발명의 3, 4'-dihydroxy flavone (3,4'-DHF)은, 성인 하루당 0.1~1000 mg이 되도록 투여하는 것이 적당하다. 또한, 투여량은 연령, 증상 등에 따라 적당히 증감하는 것이 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

1. 재료

사용한 세포주는 인간 keratinocyte HaCaT 세포주 (Boukamp, P., et al.(1988) J. Cell Biol. 106, 761-771)이며, 플라보노이드 (isohamnetin, kaempferol, 3,4'-dihydroxy flavone(3,4'-DHF) 및 quercetin)는 INDOFINE Chemical 사 (India)에서 구입하였다. 플라보노이드(isohamnetin, kaempferol, 3,4'-dihydroxy flavone(3,4'-DHF) 및 quercetin)는 (INDOFINE Chemical Company, Inc, India)에서 구입하였다. N-acetylcysteine, DAPI, catalase와 propidium iodide는 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)사에서 구입하였다. Etoposide, PD98059, SB203580, SP106203은 BioMol (Plymouth Meeting, PA)사, dichlorofluorosteine diacetate (DCFHDA)는 Molecular Probes (Eugene, USA)사, 그리고 electrophoresis reagents와 Bio-Rad protein assay kit는 Bio-Rad Laboratories (Hercules, USA)사에서 각각 구입하였다. 실험에 사용한 항체로는 anti-Actin, anti-PARP, anti-Caspase-3 는 Santa Cruz Biotech Inc. (Santa Cruz, USA)사, anti-phospho ERK, Cell Signaling Technology Inc. (Beverly, MA)사에서 각각 구입하였다. Enhanced chemiluminescence (ECL) Western blot detection kit는 Amersham Phamacia Biotech. (Oxford, UK)사에서 구입하였고, Lipofectamine, Lipofectamine Plus reagent, 그리고 G418은 Gibco BRL (Gaithersberg, USA)사에서 구입하였고, 세포배양 용기는 NUNC (New York, USA)사에서 구입하였다.

2. 실험방법

실시예 1: ERK, ERK-DN 의 과발현 세포주 제조와 세포배양

Wild type의 ERK1와 효소 활성이 없는 dominant-negative mutant인 ERK-DN (K52R)의 과발현을 위해 HaCaT 세포에 transfection을 실시하였다. 이들 DNA는 pEF vector(Invitrogen, USA)에 cloning 하여 Lipofectamine (Invitrogen. USA)을 사용해서 HaCaT 세포에 transfection을 수행 한 뒤 ERK, ERK-DN을 가진 세포들을 G418 (500 μg/ml)이 첨가된 선택배지에 10일에서 20일 정도 키워 몇 개의 클론을 선택하고 Western blotting으로 ERK의 발현 여부를 검증하여 최대로 발현되는 클론을 선택하였다. ERK, ERK-DN이 과발현된 HaCaT 세포주는 10% fetal bovine serum과 항생제 (50 μg/ml streptomycin 및 50 U/ml penicillin)가 첨가된 DMEM으로 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 100 mm 배양조에 배양하였고 2일에서 3일에 한번 씩 분주함과 동시에 배양액을 갈아주었다.

실시예 2: DAPI 염색

Apoptotic 핵을 확인하기 위해 DAPI염색을 수행하였다. HaCaT 세포는 (1 x 10⁶ cells/㎖) 35 mm 배양조에서 배양액과 함께 24시간 배양하고, etoposide와 플라보노이드를 처리하고 24시간 배양 하였다. 처리 된 HaCaT 세포는 PBS로 3회 수세한 후, acetone/methanol (50:50, vol/vol)로 15분간 고정시킨 후 PBS로 3번 정도 수세 후 형광을 띠며 DNA에 결합하는 염색액인 4, 6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI, 2 μg/㎖)용액으로 5분간 염색하였다. 그리고 PBS로 2-3번 정도 수세 후 염색된 핵의 모양은 형광현미경 (Zeiss) 하에서 ultraviolet excitation filter (300-500 nm)를 통해 관찰하였다.

실시예 3: 형광 현미경을 이용한 활성산소종의 측정

세포 내 활성산소종의 농도는 oxidant-sensitive fluorescent probe인 DCFHDA를 이용해서 역상 형광 현미경으로 측정되었다. 세포는 (1 x 10⁶ cells/㎖) 35 mm 배양조에서 배양액과 함께 24시간 배양하였다. 세포는 serum free 배지로 2번 수세 후 각 처리 물질을 12시간 처리 후 5 mM DCFHDA를 37℃에서 30분간 처리하였다. 그 후 PBS로 4번 수세하고 cover glass를 덮은 다음 역상 형광 현미경 (excitation, 488 nm; emission, 520nm)을 이용하여 확인했다

실시예 4: MTT assay

Cell viability를 결정하기 위해 MTT assay를 수행하였다. 우선 Etoposide에 의한 세포독성을 알아보기 위해 NIH3T3 세포를 (1 x 10⁶ cells/㎖) 37℃, 5% CO₂에서 24시간 배양하였다. 배양된 세포는 (5 x 10⁴ cells/㎖) 96 well에 100 ㎕ 씩 분주한 후 24시간 후 etoposide와 플라보노이드들을 처리하고 48시간을 배양 하였다. 48시간 후 배지를 제거하고 50 ㎕ MTT reagent ( 2 ㎎/㎖ )를 첨가한 후 37℃, 5% CO₂에서 4시간 반응 시켰다. 그 후 MTT reagent를 제거하고 100 ㎕ DMSO를 첨가하고 Microplate (ELISA) reader로 450과 500 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 5: 형광세기를 이용한 활성산소종의 측정

세포 내 활성산소종의 생성 정도는 oxidant sensitive prode인 DCFHDA를 사용하여 excitation 파장은 504 nm, emission 파장은 524 nm에서 peroxide에 의해 DCFHDA가 산화되어 생성되는 DCF의 형광을 측정하였다. 측정하기 30분 전에 DCFHDA를 5 mM 되도록 처리하고 37℃에서 배양한 후 세포를 모은 후 sonication buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl₂, 5 mM NaCl, 5% glycerol, 1 mM sodium orthovanadate, 50 mM sodium fluoride, 1 mM p-nitrophenol phosphate, 1 mM PMSF)를 첨가하여 초음파 파쇄기로 4초씩 7회 파쇄한 후 12,000 x g에서 15분간 원심분리하여 얻은 상등액의 단백질을 BSA를 표준물질로 하여 BCA 단백질 정량 kit을 이용해 562 nm에서 흡광도를 측정하여 정량 한 후 동일한 양의 단백질을 가지고 형광세기를 UV spetraphotometer로 excitation 파장은 504 nm, emission 파장은 524 nm에서 측정하였다.

실시예 6: Western Blotting

전기영동을 위한 단백질 시료의 추출은 처리 시간별로 세포를 ice-cold Tris buffered saline (TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 137 mM NaCl)으로 3회 수세한 후, lysis buffer (TBS, 1% NP-40, 1 mM sodium orthovanadata, 10 ㎍/㎖ leupeptin 및 1 mM PMSF)를 넣어 4℃에서 20분간 반응시키고 12,000 × g에서 15분간 원심분리하여 얻은 상등액의 단백질을 BSA를 표준물질로 하여 BCA 단백질 정량 kit을 이용해 562 nm에서 흡광도를 측정하여 정량 한 후 동일한 양의 단백질을 가지고 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리시킨 후, 단백질을 nitrocellulose membrane에 transfer하였다. 이 membrane을 항체의 비 특이적 결합을 차단하기 위하여 blocking buffer (5% non-fat milk와 0.1% Tween 20을 함유한 TBS용액)에서 1시간동안 반응시킨 후, 각 검증 단백질에 대한 항체를 가하여 1～2시간동안 반응시켰다. 이어서 0.1% Tween 20을 함유한 TBS-T 용액으로 10 분씩 3차례 수세한 다음, peroxidase-conjugated anti-mouse IgG 혹은 anti-rabbit IgG를 secondary antibody로 1-2시간 동안 반응시켰다. 0.1% Tween 20을 함유한 TBS-T 용액으로 10분씩 3차례 수세한 다음 ECL system으로 반응시킨 후 X-ray film상에서 단백질을 검증하였다. 각 시료의 단백질 정량은 BCA protein assay kit를 사용하여 565 nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였다.

실시예 7:세포사멸 분석

세포는 35 mm 배양조에 3 x 10⁵ cells/㎖으로 배양액과 함께 배양했다. 10 mM Etoposide를 24시간 처리 후 trypsin을 처리하여 세포를 모은 후 Trypan blue 염색약을 이용해서 염색된 세포만을 혈구 계산기로 그 수를 산정했다.

3. 실험 결과

여러 플라보노이드가 HaCaT keratinocyte의 cell viability에 미치는 영향

인체의 첫 방어선은 주로 외피와 내피로 구성된 피부이다. keratinocyte는 epidermis로 구성된 principle cell type이고 총 epidermis cell의 90%를 차지한다. 인간 keratinocyte cell line은 세포 배양을 하는 동안 우연히 생겨난 인간 epithelial cell line이며, Tumor suppress gene p53의 mutation을 가지고 있다. 하지만, HaCaT cell은 쥐에게 접종시켜도 암으로 발달 되지는 않는다. 인간 HaCaT cells에 미치는 다양한 플라보노이드의 영향을 평가하기 위해서 세포에 여러 가지 농도의 isohamnetin, kaempferol, 3,4'-dihydroxy flavone(3,4'-DHF), 그리고 quercetin을 처리하였다.

먼저, MTT assay를 통해 시간대별 cell viability를 확인하였다. MTT assay는 살아있는 세포 내 미토콘드리아의 물질대사에 반응하며, 세포내 산화 환원반응에 의해 반응을 보여준다. 대부분의 플라보노이드들은 HaCaT cells의 viability를 감소시켰으며, 그 중에서도 kaempferol과 isohamnetin은 cell viability를 가장 많이 억제 시켰다 (도 1a, 1b). 그러나 몇몇의 플라보노이드는 cell viability에 다른 결과를 보여주었고 흥미롭게도 3,4'-DHF는 HaCaT keratinocyte에서 cell viability를 증가시키는 결과를 보였다.

도 1은 HaCaT cell의 viability와 apoptosis에 대한 플라보노이드와 etoposide의 영향을 나타내는 데이터이다. HaCaT 세포를 소정량의 flavonoids로 처리하고 cell viability를 MTT assay를 통해 결정하였다. A: HaCaT 세포를 서로 다른 농도 (5-30 uM)의 flavonoids에 48 시간동안 노출시켰다. 대조군으로서, flavonoids 없이 동량의 DMSO로 처리하였다. 데이터는 3회 독립 실험값의 means ± S.E.로 표시하였다. B: 세포를 소정 시간동안 flavonoids (10 uM)로 배양하였다. C: HaCaT 세포를 서로 다른 농도 (5-30 uM)의 etoposide로 48 시간동안 처리하고, cell viability를 MTT assay를 통해 분석하였다. D: 세포를 소정 시간동안 etoposide (10 uM)로 배양하였다. 단백질을 10% SDS polyacrylamide gel (30 ㎍/lane)상에서 분리하고, 니트로셀룰로스 막으로 전달하였다. PARP 및 pro-caspase-3의 절단은 마우스 단클론 항체로 Western blotting을 통해 분석하였다. 동량의 단백질 로딩을 확인하기 위해, 블롯을 anti-Actin antibody로 재프로빙(re-probe)하였다. E: 세포를 1 시간동안 flavonoids (10-30 uM)로 전배양(pre-incubate)한 후 , 24시간동안 etoposide (10 μM)로 자극화(stimulate)하였다. F: 세포를 1시간동안 flavonoids (10 uM)로 전처리(pre-treat)한 후, 소정 시간동안 etoposide (10 μM)에 노출시켰다.

3,4'-dihydroxy flavone는 etoposide에 의한 apoptosis를 억제시킨다.

명확한 플라보노이드의 영향을 알아보기 위해서, phenolic phytochemical이고 apoptosis 유도 인자로 잘 알려진 etoposide를 이용해서 HaCaT cell에서 apoptosis를 유도했다. 결과에서와 같이 농도에 의존적으로 etoposide는 HaCaT cells의 viability를 감소시켰다 (도 1c). 다음 실험에서는 etoposide에 의해 유도된 cell death에 플라보노이드의 영향을 알아보았다. Cell viability가 약 50%로 관찰된 10 uM의 etoposide를 이용하였으며, 이 농도에서 apoptosis의 대표적 신호전달 기작인 PARP의 절편과 caspase-3를 활성화시키는 것으로 나타났다. 이러한 결과로 HaCaT keratinocyte에서 etoposide가 apoptosis를 유도 한다는 결과를 얻었다 (도 1d).

세포에 여러 플라보노이드를 농도별로 전처리하고 그 후에 10 uM의 etoposide를 처리하였다. Kaempferol, quercetin 그리고 isohamamnetin을 같이 처리하였을 경우, cell viability가 etoposide 만을 처리 하였을 때 보다 현저하게 감소하는 반면, 3,4'-DHF는 etoposide에 의해 유도되는 cell viability의 감소를 억제시키는 결과를 얻었다 (도 1e 및 f). HaCaT keratinocytes에 3,4'-DHF를 처리 했을 때 인간의 피부에 영향을 주는 환경적 요소 중 중요 인자로 알려진 자외선 스트레스에 대해서도 저항성을 갖는 것을 확인 할 수 있었다 (data not shown). 또 한, 10 uM의 etoposide 만을 3,4'-DHF와 etoposide 또는 3,4'-DHF만을 세포에 노출시킨 후 DAPI 염색을 통해 apoptosis의 증거인 세포핵의 형태학적 변화를 확인 하였다. Etoposide는 HaCaT cells에서 핵의 fragmentation을 유발시키지만, 이러한 핵의 fragmentation을 3,4'-DHF가 억제하였다 (도 2a). 또한, 3,4'-DHF는 etoposide에 의한 PARP와 pro-caspase-3의 절단을 저해 하였다 (도 2b). 지금까지의 결과를 보면 다양한 플라보노이드가 apoptosis에 서로 다른 영향을 준다는 것을 알 수 있었으며, 또한 아직 완전히 연구되지 않은 3,4'-DHF 플라보노이드가 인간 HaCaT keratinocyte에서 etpopside 또는 UV에 의한 apoptosis에 대해 anti-apoptotic한 작용을 한다는 것을 보여 주었다.

도 2는 본 발명의 3,4'-DHF가 HaCaT cell에서의 etoposide에 의해 유발된 apoptosis를 억제하는 것을 보여주는 데이터이다. HaCaT 세포를 1시간동안 3,4'-DHF (10 uM)로 전배양한 후, 24시간동안 etoposide (10 μM)에 노출시켰다. A: 세포를 수거하고, 고정하고, methanol/acetic acid (1:1, vol/vol)로 permeabilize한 다음, 5분간 0.8 ㎍/㎖ DAPI로 로딩시켰다. 형광 이미지를 fluorescence microscopy하에서 얻고, apoptotic nuclear morphology를 갖는 세포를 계수하였다. 데이터는 3회 독립 실험값의 means ± S.E.로 표시하였다. B: 세포 용해물을 pro-caspase-3, actin 및 cleaved PARP에 대한 항체(Santa Cruz, CA)로 immunoblot analysis를 하였다.

ERK signaling pathway가 3,4'-DHF의 anti-apoptotic 영향에 관여한다.

이전의 플라보노이드와 관련한 많은 연구에도 불구하고, 세포에 영향을 주는 것으로 관찰된 플라보노이드의 정확한 분자학적인 메카니즘은 아직 명확하게 밝혀지지 않고 있다. 그러나 여러 논문에 의하면 MAPK signaling pathway가 화학요법으로 사용되는 약의 영향과 효과에 중요한 역할을 할 것이라고 보고되고 있다 (Boldt, S., et al. (2002) Carcinogenesis 23(11), 1831-1838). MAPK signaling pathway는 세포성장, 분화, 발생 그리고 apoptosis 등 다수의 세포 기능에 관여한다고 알려져 있으며, 일반적으로 이들은 ERK, p38 kinase, 그리고 JNK라고 불리는 3개의 신호전달 분자들로 구성되어 있다. MAPK signal pathway가 3,4'-DHF의 anti-apoptotic 영향에 관여하는지를 알아보기 위해 각각의 특정 MAPK pathway를 저해하는 각 kinase의 inhibitor들인 PD98059, SB202190, 또는 SP600125를 세포에 처리하였다. SB202190 (p38 kinase inhibitor) 그리고 SP600125 (JNK inhibitor)는 HaCaT cells에서 etoposide에 의한 cell viability 감소에 어떠한 영향도 주지 않는 것을 알 수 있었고 (도 3a), PD98059 (MEK inhibitor)의 처리 시에는 현저하게 etoposide에 의한 apoptosis를 저해 하는 결과를 보여주었다. 이러한 ERK signal pathway inhibitor인 PD98059의 효과는 3,4'-DHF와 관련된 경로와 비슷한 것으로 나타났다. 그리고 좀 더 확실한 결과를 확인하기 위해 핵의 fragmentation과 caspase-3 활성을 확인하였다. MEK inhibitor의 전처리는 etoposide에 의한 핵 breakdown과 caspase-3의 활성을 막았다 (도 3b 및 c). 그리고 ERK1과 ERK2의 활성은 etoposide에 노출된 세포에서 시간이 경과함에 따라 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3d). 이러한 지속적인 증가되어 유지되는 ERK의 활성이 인간 HaCaT keratinocyte에서 etoposide에 의한 apoptosis에 관련되어 있을 것이라는 것을 확 인 할 수 있었다.

ERK 활성은 일반적으로 apoptosis를 억제하는 것으로 생각되어지나, 최근 연구는 지속적으로 증가되어 유지되는 ERK 활성이 또한 aopoptotic 작용에 관여한다는 것으로 보고 되고 있다 (Yang, Y. L., and Li, X. M. (2000) Cell Res 10(3), 169-177). 따라서 사람 HaCaT keratinocyte에서 ERK의 활성이 etoposide에 의한 apoptosis와 연관이 있을 것으로 생각 되어 진다. 3,4'-DHF 처리가 etoposide에 의한 ERK 활성을 억제하고, PARP 와 pro-caspase-3의 절단을 동시에 저해 한다는 것은 매우 중요한 결과이다 (도 3e).

도 3은 본 발명의 3,4'-DHF가 ERK signaling pathway의 억제를 통하여 etoposide에 의해 유발된 apoptosis를 차단하는 것을 보여주는 데이터이다. HaCaT 세포를 1시간 동안 PD98059 (30 μM), SB203580 (20 μM), SP600125 (40 μM) 또는 3,4'-DHF (10 uM)로 전 처리한 다음, 24시간 동안 etoposide (10 μM)에 노출시켰다. A: Cell viability를 MTT assay를 통해 분석하였다. 데이터는 3회 독립 실험값의 means ± S.E.로 표시하였다. B: 세포를 수거하고, 고정하고, methanol/acetic acid (1:1, vol/vol)로 permeabilize한 다음, 0.8 ㎍/㎖ of DAPI로 염색하였다. Apoptotic nuclear morphology를 갖는 세포의 개수를 fluorescence microscopy를 통해 계수하였다. C: PARP 및 pro-caspase 3의 절단을 Western blotting을 통해 분석하였다. D: 세포를 소정시간동안 etoposide (10 uM)로 배양하고, 세포 용해물을 anti-ERK 또는 anti-phospho-ERK 항체로 immunoblot analysis를 하였다. E: 동량의 세포 용해물을 SDS-PAGE를 통해 분리하고, anti-ERK, anti-phospho-ERK, anti-PARP 및 anti-procaspase-3 항체로 Western blotting을 통해 분석하였다.

지금까지의 결과로, ERK 신호경로는 etoposide에 의한 HaCaT keratinocytes의 apoptosis, 그리고 특히 3,4'-DHF와 관련한 anti-apoptotic 효과에 중요한 기능을 수행하는 것으로 확인 되어 지며, 3,4'-DHF 처리와 관련된 anti-apoptotic 효과에 있어 ERK의 관련 여부를 좀 더 명확히 확인하기 위해서 HaCaT keratinocyte에 wild type ERK 그리고 dominant negative ERK2 mutant인 ERK2-DN (K52R)를 transfection 시켰다. 이에 대한 결과로 ERK의 과발현은 3,4'-DHF의 anti-apoptotic 기능을 저해하는 결과를 나타났지만, ERK2-DN를 처리한 세포에서는 3,4'-DHF의 anti-apoptotic 기능을 현저히 증가 시키는 결과를 얻었다 (도 4). 또한, ERK가 과발현 되었을 때 ERK 인산화와 동시적으로 caspase-3의 활성이 증가하는 것을 확인 할 수 있었다 (도 4a). DAPI-staining nuclear fragmentation 분석에서도 명확하게 ERK의 과발현이 3,4'-DHF의 anti-apoptotic 효과를 저해하는 효과를 보여주었다 (도 4b). 지금까지의 결과로 ERK 신호경로가 직접적으로 3,4'-DHF와 연관된 anti-apoptotic 효과에 관여한다는 것을 확인 하였다.

도 4는 HaCaT cell에서 ERK1의 과발현이 etoposide에 의해 유발된 apoptosis에 대한 3,4'-DHF의 저해를 복구(override)하도록 한다는 것을 보여주는 데이터이다. HaCaT 세포를 wild-type ERK 1 또는 ERK1의 dominant negative mutant form (ERK-DN)로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 세포를 1시간동안 3,4'-DHF (10 uM)로 전처리한 다음, 추가 24시간동안 etoposide (10 μM)에 노출시켰다. A: 동량의 세포 용해물을 SDS-PAGE와 anti-ERK, anti-phospho-ERK, anti-PARP 및 anti- procaspase-3 항체를 사용한 Western blotting을 통해 분석하였다. B: 세포를 DAPI로 염색하고, apoptotic cells를 fluorescence microscopy를 통해 분석하였다. 데이터는 3회 독립 실험값의 means ± S.E.로 표시하였다.

3,4'-DHF에 의한 활성 산소종과 ERK의 억제 signal pathway는 HaCaT cell에서 apoptosis 조절에 중요한 역할을 수행한다.

여러 보고들에서 etoposide와 플라보노이드를 포함한 다수의 phenolic phytochemicals가 세포내 활성 산소종을 다양하게 변화시킨다고 보고되고 있다 (Ko, C. H., et al. (2005) Biochem Pharmacol 69(6), 913-927). 3,4'-DHF의 anti-apoptotic 효과의 분자적인 원인을 설명하기 위해 3,4'-DHF가 활성 산소종에 의해 유도되는 apoptosis에 대한 저해 효과에 영향을 주는지를 알아보았다. 처음으로 HaCaT keratinocyte를 hydrogen peroxide에 노출시킨 후 cell viability에 대한 3,4'-DHF의 효과를 관찰하였다. hydrogen peroxide는 300 uM 농도에서 약 50% 정도의 세포사멸을 일으켰으며, 여기에 3,4'-DHF를 전처리를 하게 되면 hydrogen peroxide에 의한 apoptosis로 부터 상당수의 세포를 보호하는 것을 알 수 있었다 (도 5a 및 b).

세포에 etoposide 또는 플라보노이드를 처리한 후 oxidant-sensitive fluorescent dye인 DCFHDA를 사용하여 세포내 활성 산소종 생성을 측정하였다. 세포내 peroxide가 존재하면, DCFHDA에서 dichlorofluorescin(DCFH)로의 esterase-mediated deacylation이 세포에서 발생하고 높은 fluorescent dichlorofluorescin(DCF)의 생성 결과로 non-fluorescent DCFH는 산화된다. 최근에 DCFH는 peroxynitrite, hydrogen peroxide(세포의 peroxidases와 협력하여), 단독적인 peroxidase, 그리고 hydroxyl radical 에 의한 산화에 민감하다고 보고되고 있다. 그러나 DCFH는 생물학적 시스템에 있어서 NO, hypochlorous acid, 또는 superoxide radicals의 측정에는 적합하지 않다고 알려져 있다. Etoposide 처리는 HaCaT keratinocyte에서 fluorescent DCF의 생성을 많이 유도하는 것으로 보아 세포내에 활성산소종이 많이 생성된 것으로 보여지며, 항산화제 그리고 자유라디칼 제거제로 잘 알려진 N-acetyl cysteine를 첨가한 결과 etoposide에 의한 활성산소종의 생성은 억제 되었다 (도 5c). N-acetyl cysteine의 처리는 etoposide에 의한 caspase-3의 활성과 ERK 인산화를 억제하였다. 이것은 etoposide가 HaCaT keratinocytes에서 세포내 활성 산소종을 형성함으로써 apoptosis와 ERK 인산화를 유도한다는 것을 알수 있었다 (도 5c). 이러한 결과와 대조적으로 kaempferol은 etoposide에 의한 활성산소종 생성을 더욱 더 증가시키는 결과를 얻었다. 지금까지의 결과에서 3,4'-DHF는 HaCaT cell에서 etoposide에 의한 활성 산소종 생성을 억제 하였고 그 자체적으로는 활성산소종을 유도하지 않았다. 그렇지만, kaempferol은 독자적으로 활성 산소종 생성을 유도하였다. 따라서, 3,4'-DHF는 세포내 활성 산소종 생성, 그리고 동시에 ERK 신호경로의 활성을 억제시켜 스트레스에 의한 apoptosis로부터 keratinocyte를 보호하는 것으로 확인 되었다.

도 5는 본 발명의 3,4'-DHF가 세포내 활성산소종(ROS) 생성과 그에 따른 ERK 활성화를 억제함으로써 스트레스에 의한 apoptosis로부터 HaCaT cell를 보호한다는 것을 보여주는 데이터이다. A 및 B: HaCaT 세포를 1시간동안 3,4'-DHF (10 uM)로 전처리한 다음, 48시간동안 (A) 또는 소정 시간동안 (B) H2O2 (300 μM) 에 노출시켰다. Cell viability를 MTT assay를 통해 평가하였다. C: 세포를 1시간동안 3,4'-DHF, kaempferol, 또는 N-acetylcysteine (NAC)으로 전처리한 후, 세포를 12시간동안 etoposide (10 uM)에 노출시켰다. 다음 세포내 ROS 레벨을 oxidant-sensitive probe인 DCFHDA로 fluorescence microscopy를 통해 측정하였다. D: 세포에서의 DCF fluorescence를 spectrofluorometer (excitation, 504 nm; emission, 524 nm)로 정량화하였다. 그 결과는 3회 독립 실험값의 means ± S.E.로 표시하였다. E: 동량의 세포 용해물을 SDS-PAGE상에서 분리하고, anti-ERK, anti-phospho-ERK, anti-PARP 및 anti-procaspase-3 항체로 Western blotting을 통해 분석하였다.

서로 다른 플라보노이드에 의한 활성산소종과 ERK 신호경로의 조절이 HaCaT keratinocyte에서 apoptosis를 조절하는 중요한 역할을 한다.

과일과 야채에서 자연적으로 형성되는 구성물질인 kaempferol은 종양 발생, 촉진 그리고 진행과 관련된 다양한 세포 작용에서 놀라운 억제효과와 다양한 생물 시스템에서 세포 분열을 억제하는 능력을 보여주는 것으로 알려져 있다 (Aligiannis, N., et al. (2001) Planta Med 67(5), 468-470). Kaempferol과 3,4'-DHF라 불리는 두 플라보노이드는 cell viability와 활성산소종 생성에서 특이적으로 다른 효과를 보여주었다 (도 1a 및 도 5c). 이러한 결과로 3,4'-DHF가 kaempferol 효과에 상반되는지를 알았다. MTT와 DAPI staining assay에서 3,4'-DHF가 kaempferol 처리에 의해 유도되는 apoptotic 효과를 완전히 없애주는 결과을 얻었다 (도 6c 및 d). 따라서 이러한 결과는 etoposide와 플라보노이드를 포함한 많 은 phytochemical이 유도하는 apoptosis가 활성산소종과 ERK 신호경로에 의해 조절된다는 것을 확인 할수 있었고, 3,4'-DHF를 포함한 몇몇 특정 플라보노이드들은 Human HaCaT keratinocyte에서 활성산소종-ERK 신호경로의 조절을 통해 apoptosis를 억제하는 것으로 확인 되었다 (도 6e).

도 6은 본 발명의 3,4'-DHF이 HaCaT cell에서 kaempferol에 의해 유발된 apoptosis를 억제한다는 것을 보여주는 데이터이다. A 및 B: 세포를 1시간동안 3,4'-DHF (10 uM)로 전처리한 다음, 48시간동안 kaempferol (10 μM)에 노출시켰다. A: Cell death를 MTT assay를 통해 분석하였다. 데이터는 3회 독립 실험값의 means ± S.E.로 표시하였다. B: 세포를 DAPI로 염색하고, 형광 이미지를 fluorescence microscopy를 통해 얻었다. 다음 핵의 condensation과 fragmentation을 나타내는 apoptotic cells를 계수하고, apoptotic death를 겪는 세포의 백분율을 도면에 표시하였다. C 및 D: 3,4'-DHF로 전처리된 세포를 12시간동안 kaempferol (10 μM)에 노출시킨 다음, 세포내 ROS 레벨을 oxidant-sensitive probe인 DCFHDA로 fluorescence microscopy에 의해 평가하였다. D: DCF fluorescence를 spectrofluorometer (excitation, 504 nm; emission, 524 nm)로 결정하였다. 그 결과는 3회 독립 실험값의 means ± S.D.로 표시하였다. F: 동량의 세포 용해물을 anti-ERK, anti-phospho-ERK, anti-PARP, 및 anti-pro-caspase-3 항체를 사용한 immunoblot analysis를 통해 분석하였다.

최근 항암 약품의 개발에 있어 천연 물질의 사용은 과학적, 산업적으로 아주 중요한 과제가 되고 있다. 특히 taxol과 etoposide와 같은 여러 phytochemicals은 이미 치료용 항암 약품으로 이용되어 지고 있다. 플라보노이드는 최근 큰 관심을 받고 있는 천연물질이며, kaempferol과 quercetin를 포함한 몇 가지의 플라보노이드들은 항산화효과에 영향을 주고 또한 암을 억제할 수 있다는 여러 연구가 발표되었다. 종양의 활성을 억제하는 것 말고도 항과민 반응, 항바이러스, 그리고 항염증반응의 특징을 포함한 유익한 생물학적 활동하는 플라보노이드들이 보고되고 있으며, 몇몇 플라보노이드 역시 anti-apoptotic 특성이 있는 것으로 발표되었다 (Chen, Y. C., et al. (2002) Arch Toxicol 76(5-6), 351-359). 플라보노이드와 관련된 다양한 생물학적 기능을 알기 위해 수행된 많은 연구에도 불구하고, 세포 기능에 기본이 되는 명확한 분자적 메카니즘은 아직까지 알려지지 않고 있다. 본 발명에서 우리는 플라보노이드가 인간 HaCaT keratinocytes의 cell viability에 특이적인 영향을 준다는 것을 증명하였다. kaempferol, quercetin 그리고 isohamamnetin를 포함한 여러 플라보노이드는 세포 성장을 억제하는 영향을 보여주었으나 3,4'-DHF는 세포성장을 유도하고, etoposide와 UV에 의해 유도된 세포사멸을 억제한다는 것이 증명되었다 (도 1 및 7).

최근 여러 플라보노이드가 세포주기의 정지와 다양한 암세포에서 apoptosis를 유도한다는 것이 보고되었다(Hsu, Y. L., et al. (2004) Biochem Pharmacol 67(5), 823-829). 그러나 몇몇 연구만이 특정 플라보노이드의 anti-apoptotic 효과에 관심을 가지는 정도였다. 지금까지의 연구들은 3,4'-DHF의 anti-apoptotic 효과를 알지 못했다. 3,4'-DHF가 표피 세포에 있어 제일 첫 번째 세포 타입이고 인체의 첫 방어선 인 keratinocytes를 apoptotic cell damage로부터 세포를 보호한다는 중요한 역할을 알 수 있었다. 또한, 지속적인 ERK의 활성이 HaCaT cell에서 etoposide에 의한 apoptosis에 관여한다는 것과 3,4'-DHF와 관련된 anti-apoptotic 효과가 etoposide에 의한 ERK의 활성을 저해하여 일어난다는 것을 알 수 있었다 (도 3).

일반적으로 ERK cascade는 mitogenic stimuli에 의해서 활성 되고 세포 분열과 생존에 관여 한다고 알려 져 왔고, JNK와 p38 MAPK분자들은 세포 스트레스에 반응하여 활성화 되고 세포 보호뿐만이 아니라 pro-apoptotic effects에 영향을 주는 것으로 알려져 왔다. ERK의 신호경로는 다양한 기능 조절에 이용되는 다수 신호 전달 경로에 관여한다고 보도 되고 있다 (Impey, S., et al. (1999) Neuron 23(1), 11-14). 세포외 성장 신호에 의한 ERK의 활성은 G protein인 RAS를 통해 중재되고 이를 통해 세포 분열을 증가 시킨다.

여러 연구들이 ERK의 활성이 cyclin D 발현을 유도하거나 p27KIP cell cycle 억제 단백질의 비활성을 통해서 분열을 일어나게 함을 알 수 있었다. 게다가 ERK와 caspase-3의 활성을 통해 Mcl-1과 IAPs를 포함한 anti-apoptotic factor의 발현을 유도해 apoptosis을 막는 것으로 알려져 있다(Tran, S. E., et al. (2001) J Biol

Chem 276(19), 16484-16490). ERK의 활성이 성장인자가 처리 된 조건하의 PC12세포의 apoptosis를 억제시키는 것이 보고되어 졌다 (Xia, Z., et al. (1995) Science 270(5240), 1326-1331). 그러나 최근 보고서들은 지속적인 ERK의 활성이 apoptotic 과정에 관여한다는 보고가 있다 (Zhou, B., et al. (2002) J Biol Chem 277(35), 31818-31825).

강한 ERK 자극이 p21Cip/Waf 와 p27KIPO를 포함한 cell cycle 억제단백질의 발현 유도를 통해 cell cycle을 억제한다고 보고되고 있으며 DNA 손상에 의해 유도되는 ERK의 활성이 apoptosis와 관련되어져 있다고 보고되고 있다 (MacKeigan, J. P., et al. (2000) J Biol Chem 275(50), 38953-38956). ERK의 활성은 pro-apoptotic BAD의 활성을 유도함으로써 ceramide가 유도하는 apoptosis를 이끌어내는 상위 조절자인 FAS의 발현을 통한 T세포에서의 apoptosis를 중재 한다고 알려져 있다 (Basu, S., et al. (1998) J Biol Chem 273(46), 30419-30426). 본 발명에서 우선 지속적인 ERK 활성이 etoposide에 의한 인간 HaCaT keratinocytes의 apoptosis에 관여한다는 것을 증명하였다. 본 실험의 결과는 hydrogen peroxide 또는 다른 oxidant를 처리한 T세포, Jurkat T세포 그리고 neutrophilis와 관련 된 연구 결과와 일치하였다 (Lee, K., and Esselman, W. J. (2002) Free Radic Biol Med 33(8), 1121-1132). 이들 연구가 말해 주듯이 etoposide를 처리 후 HaCaT cell에서의 지속적인 ERK 활성은 MEK 활성화와 cysteine-containing 단백질, 특히 tyrosine phosphatases (PTPs) 억제의 결합으로부터 나온 결과라고 예상되어진다.

본 발명에서 3,4'-DHF는 hydrogen peroxide에 의한 세포사멸로 부터 세포를 보호하고, etoposied에 의한 활성산소종 생성에 대한 명확한 억제 효과를 보여주었다 (도 5). 이러한 결과들은 etoposide에 의한 ERK 활성이 세포내 3,4'-DHF처리에 의한 활성산소종 억제에 영향을 미친다는 것을 보여주었다. 또한 3,4'-DHF가 완전하게 kaempferol에 의한 세포내 활성산소종 생성과 ERK 신호경로의 활성을 억제함으로써 kaempferol에 의한 apoptosis를 억제 하는 것을 보았다 (도 6). 활성산소종 에 의존적인 redox cycling은 Protein kinase C와 MAPKs (mitogen-activated protein kinases), 특히 ERK의 활성을 포함한 신호 전달 기작에서 중요한 단백질들의 활성을 조절하는 상호작용 조절에 매우 중요한 것으로 생각되어진다. MAPKs는 산화 환원 상태에서 산화에 의한 변화에 반응하여 활성화되는 것으로 알려져 있다 (Fialkow, L., et al. (1994) J Biol Chem 269(49), 31234-31242). 이러한 활성화 후에 각각의 MAPK들은 apoptosis 조절인자, cytoskeletal 단백질, 핵 수용체, 그리고 다수의 전사요소들을 포함한 특정 물질을 인산화 시키는 것으로 관찰되었다. 게다가 세포 내 활성산소종 생성은 CD45와 PTPs의 억제를 통해 지속적인 MAPK 활성을 유지시키는 것으로 보고되어졌고, 또한 특정 신호경로를 통해 특정 MAPK 활성 유도에 기여하는 것으로 보여 졌다. 본 발명에서 etoposide와 kaempferol에 의한 세포사멸이 MEK/ERK 신호경로의 특이적 저해제인 3,4'-DHF와 PD98059의 처리에 의해 억제되어 졌고, etoposide와 플라보노이드를 포함한 다양한 phytochemical에 의한 활성산소종 조절이 MEK/ERK 신호경로를 통해 keratinocytes에서 apoptosis의 조절에 기여하는 것을 확인 하였다.

플라보노이드는 어떤 특정 효소의 억제와 신경전달물질을 자극하고 자유 라디칼을 제거하는 능력 때문에 여러 질병의 치료에 사용되고 있다. 비록 대다수의 연구들이 플라보노이드의 항산화 효과에 중점을 두었지만 플라보노이드의 농도와 구조에 의한 항산화 그리고 pro-oxidant한 면에서의 기능은 상대적으로 많이 보고되어 있지 않다 (Shen, S. C., et al. (2004) Int J Cancer 108(4), 502-510).

여러 보고서들에서는 다양한 플라보노이드가 특정세포의 apoptosis를 특이적 으로 조절하는 것만을 증명하였다. 이러한 특이적 효과는 플라보노이드가 자체적으로 가진 structure-activity relationship (SAR) 부분에 있어서의 구조 때문에 발생할 것이다. 이전 논문들은 플라보노이드에 있는 다수의 hydroxyl (OH)의 치환이 reactive oxygen species (ROS)를 제거하는 능력에 있어 중요한 요소라고 보고 하였다. OH-그룹을 많이 가진 플라보노이드들은 더욱더 잠재적인 항산화 특성을 가지며 또한 항염증 효과를 강화시키는데 큰 효과가 있다고 알려졌다 (Hendriks, J. J., et al. (2003) Biochem Pharmacol 65(5), 877-885). 그러나 OH-치환의 효과는 아직 자세히 결론지어지지 않고 있으며, 특정 플라보노이드의 diphenylpropane (C6C3C6) skeletons에 있는 특정 부위에서 각각의 OH-가 주는 영향을 정의 내리기 위해 앞으로 더 많은 연구가 필요할 것이다. 또한 이전 연구들은 methoxyl (OCH3) 그룹이 플라보노이드의 항염증과 항산화 효과에 부정적인 영향을 준다고 보고되었으며, 3-OH 플라본이 표피 성장 요소(EGF)에 의한 분열을 억제하고 glycoside의 처리에 의해 일반적으로 알려진 플라보노이드의 apoptotic 효과를 억제하는 것으로 보고되고 있다 (Shen, S. C., et al. (2003) J Cell Biochem 89(5), 1044-1055).

본 발명에서, kaempferol, isorhamnetin, naringenin, taxifolin, 그리고 quercetin이 HaCaT keratinocytes의 세포 생존을 저해 하는 부정적인 영향을 주었으나 3,4'-DHF는 세포의 생존을 증가 시키는 긍정적인 영향을 주었다 (도 7). 계속된 연구 결과에서 kaempferol이 HaCaT세포에서 세포내 활성산소종의 생성을 유발시키지만, 3,4'-DHF는 이 kaempferol에 의한 활성산소종의 생성을 억제시켰다 (도 6). 이들 결과들은 3,4'-DHF와 kaempferol을 포함한 여러 플라보노이드에서 특정 structure-activity relationship (SAR)가 있음을 분명히 나타낸다. 이러한 결과를 바탕으로 플라보노이드 diphenylpropane (C6C3C6) skeletons의 5 또는/그리고 7 carbons에 특정 OH-치환을 갖는 3,4‘-dihydroxy flavone과 같이 이 부분에서의 치환이 anti-apoptotic 효과에 상당한 영향을 줄 것이라고 생각 되어진다 (도 7).

도 7은 본 발명에 사용된 플라보노이드의 화학적 구조와 그들의 HaCaT cell의 cell viability에 대한 영향을 나타내는 그림이다. Cell viability의 감소는 하향 화살표로 cell viability의 증가는 상향 화살표로 표시하였다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 식물 유래 플라보노이드인 3,4’-디하이드록시플라본(3,4’-dihydroxyflavone)는 사람 피부세포의 세포사멸(apoptosis) 억제 기능을 가지고 있음으로써 사람 피부세포의 세포사멸을 예방 또는 치료할 수 있는 기능성 화장료 조성물 또는 의료용 조성물의 개발에 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명의 결과는 플라보노이드 structure-activity relationship (SAR)의 이해에 있어 중요한 첫 단계임을 보여주며, 또한 서로 다른 플라보노이드의 구조적인 특정 효과에 기초한 분자적 메카니즘에 새로운 빛을 비추었다. 그러나 다른 플라보노이드들과 관련된 structure-activity relationship (SAR)을 명확하게 밝히기에는 더 많은 연구가 요구된다.

Claims (4)

1. 3,4’-디하이드록시플라본(3,4’-dihydroxyflavone)을 유효성분으로 함유하는 사람 피부세포의 세포사멸 억제용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 세포내 활성산소종 생성 및 ERK 신호경로의 활성을 억제시킴으로써 세포사멸을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 피부의 세포사멸 보호용 기능성 화장료 조성물의 원료로 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 피부의 세포사멸 보호용 약학적 조성물의 원료로 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.

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