KR101075974B1 - 역분화 만능 줄기세포의 증식능 및 분화능 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특정한 플라보이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 역분화 만능 줄기세포의 증식능 및 분화능 개선용 조성물에 관한 것이다.

역분화 만능 줄기세포, 증식, 분화,

Description

역분화 만능 줄기세포의 증식능 및 분화능 개선용 조성물{A composition for improving the proliferation ability and differentiation ability of induced pluripotent stem cells}

본 발명은 특정한 플라보노이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 역분화 만능 줄기세포의 증식능 및 분화능 개선용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 다양한 세포, 조직으로 분화 가능한 줄기 세포관련 연구는 1960년대부터 배아종양세포(embryonic carcinoma cells) 위주로 진행되었으나, 종양세포의 특성 및 불안정한 염색체상태에 의하여 지극히 한정된 연구결과만 도출되고 있다. 배아줄기 (ES) 세포는 포유류 포배기 배아 (blastocyst)의 내부 세포덩어리 (inner cell mass)에서 유래하는 것으로, 인간의 장기로 분화할 수 있는 다능성 (pluripotency)을 유지하면서 무한히 증식하는 특성을 지니고 있다. 1981년 세계 최초로 톰슨에 의해서 생쥐배아 줄기세포가 확립된 후, 배아 줄기세포 연구가 급격히 발전되었으며, 1984년에는 생식선 키메라 생산을 통하여 배아 줄기세포 전능성 이 직접적으로 확인되었다.

줄기세포를 다양한 장기나 조직으로 분화될 시, 질병이 발생한 조직과 기관을 재생 또는 대체할 수 있는 새로운 세포를 만들어낼 수 있으며, 이를 이용한 당뇨병ㆍ심장병ㆍ알츠하이머병ㆍ암 등 각종 난치병 치료연구가 진행되고 있다.

동물 복제와 인간 배아 줄기세포 기술의 혼합은 개개인의 환자로부터 줄기세포를 생산하여 임상적으로 사용하는 맞춤형 치료법 개발을 촉진시켜왔으며, 이러한 줄기세포는 동종 배아 줄기 세포로부터 유도된 세포 이식에 대한 면역 거부반응을 극복할 수 있고 복합적인 인간 질병들을 연구하는 실험 모델로도 사용되어질 수 있다.

그러나 이러한 방법들이 인간의 질병 치료에 응용되는 데는 윤리적ㆍ기술적인 한계가 있으므로, 줄기 세포를 사용하기 보다는 체세포를 재 프로그램화하여 다양한 세포로 분화시키는 방법들이 연구되고 있다. 또한 역 분화 만능 줄기세포 (iPSc; induced pluripotent stem cells)는 배아세포를 둘러싼 윤리 논란을 불식시키고 치료용 맞춤 줄기세포를 연구할 수 있는 계기를 마련하였다. 최초로 2006년 8월 일본 교토대 야마나카 교수팀은 retrovirus를 이용해서 마우스의 배아줄기세포에 Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4를 삽입하여 배아줄기세포와 유사한 원시세포를 생성하였으며(Kazutoshi Takahashi and Shinya Yamanaka, 2006 Cell 126, 663-676), 이 세포를 induced Pluripotent Stem cells (iPSc)라고 명명하였다. 이러한 연구는 배아파괴나 난자제공과 같은 윤리적 문제가 없는 환자별/질환별 맞춤식 역 분화 만능 줄기세포를 만들어낼 수 있는 기반을 제공하였다는 데서 중요한 의미를 가지고 있 다. 역 분화 만능 줄기세포는 질병의 발병메커니즘 이해와 약물의 효능 및 안전성 검사에 활용될 수 있음을 확신한다. 하지만 확립된 역분화 만능줄기세포의 안정성 및 분화능은 현저히 떨어지고 있는 실정이다. 이러한 문제점들을 해결하기 섬유 모세포의 재 프로그램화 과정을 증가 시킬 수 있는 small molecules을 첨가함으로써 역 분화 만능 줄기세포의 안정화 및 분화능을 증가시키는 기술의 개발이 필요하다.

이에 본 발명에서 폴리페놀 구조를 가진 플라보노이드를 첨가하였을 때 역분화 만능줄기세포의 유지 및 성장에 효율이 매우 우수할 뿐만 아니라 확립된 줄기세포의 분화 성능이 매우 안정적으로 발현되는 것을 확인 할 수 있었다. 사용된 플라보노이드는 식용으로 사용하는 식물로부터 유래된 물질로서 안전성이 검증된 물질로서, 본 발명은 역분화 만능 줄기세포가 배아 줄기세포에 못지 않은 증식능 및 분화능을 가지도록 함으로써, 실제 역분화 줄기세로의 응용성을 높이는데 중요한 역할을 할 수 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 역분화 만능줄기세포의 유지 및 성장에 효율이 매우 우수할 뿐만 아니라 확립된 줄기세포의 분화 성능이 매우 안정적으로 발현되는 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 3,2'-다이하이드록시시플라본(DHF) 및 3,4'-다이하이드록시시플라본(DHF)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 플라보노이드를 유효성분으로 함유하는 역분화 만능 줄기세포의 증식능 및 분화능 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 유효량은 1∼10μM인 것이 바람직하고, 1∼7μM인 것이 더욱 바람직하며, 본 발명의 실시예에서는 5μM을 사용하였으나, 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명의 조성물은 역분화 만능 줄기세포의 신경 세포로의 분화 효율을 증가시키는 것을 특징으로 하고,

역분화 만능 줄기세포의 미분화능(undifferentiation) 유지 효과를 가지는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 3,2'-다이하이드록시시플라본(DHF)을 유효성분으로 함유하는 역분화 만능 줄기세포의 증식능 및 분화능 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 유효량은 1∼10μM인 것이 바람직하고, 1∼7μM인 것이 더욱 바람직하며, 본 발명의 실시예에서는 5μM을 사용하였으나, 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명의 조성물은 역분화 만능 줄기세포의 신경 세포로의 분화 효율을 증가시키는 것을 특징으로 하고, 역분화 만능 줄기세포의 미분화능(undifferentiation) 유지 효과를 가지는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 설명한다.

마우스 유래 체세포에 Lenti-virus를 이용하여 Oct4, Sox2, Klf4, C-myc 유전자를 도입해 역분화 만능 줄기세포를 확립하였다. 먼저, RT-PCR을 통하여 내인성 외인성 4가지 (Oct4, Sox2, Klf4, C-myc) 유전자 발현을 확인한 결과 역분화 줄기세포 자체에서 발현하는(내인성) 및 외부에서 도입시킨 (외인성) 4가지 유전자의 발현이 확인되었다 (도 1의 A). 또한 줄기세포의 특성을 분석하기 위하여 줄기세포의 특징이라고 보고되고 있는 알카라인 포스파타제 (Alkaline phosphatase, AP) 활성도를 실시한 결과 정상적인 줄기세포와 같이 염색되는 것을 확인하였다 (도 1의 B). 확립된 역분화 줄기세포의 줄기세포성 (stemness)을 확인하기 위하여 줄기세포 마커 (Oct4, Sox2, Nanog, Cripto)를 사용하여 RT-PCR 한 결과 정상적인 마우스 배아줄기세포 같이 모두 발현되고 있었으며 (도1의 C), 면역 염색법(immunocytochemistry)을 이용한 방법에서도 줄기세포 특이 마커인 Oct4 와 SSEA-1 모두 염색되는 것을 확인하였다 (도1의 D 및 E). 역분화 만능 줄기세포의 삼배엽 분화 특성을 확인하기 위하여 배상체 (embryonic body)를 형성하여 14일 동안 삼배엽 (3 germ layers)으로 분화시켜 면역염색을 실시 한 결과 중배엽 (근육세포 마커 brachyury), 내배엽(간세포 마커 HNF-3b) 및 외배엽(신경세포 마커 Tuj-1)으로 분화가 일어났음을 확인할 수 있었다 (도1의 F). 이로써 본 발명에서 사용 된 역 분화 만능 줄기세포 (KU-iL1)는 줄기세포의 특성을 가지는 것으로 확인 되었다.

본 발명에서 사용된 플라보노이드의 선택은 피부세포인 HaCaT 세포에 여러 플라보노이드를 농도별로 처리 하였을 때 3,2‘-DHF와 3,4‘-DHF가 높은 세포 증식률을 보였다. 따라서 -OH기가 규칙적으로 붙은 플라보노이드들이 생장률에 도움을 줄 것으로 생각되어지며 이러한 후보군들을 이용하여 iPS 세포의 성장 및 분화 안정성에 응용하고자 하였다(도 2 및 도 3 참고).

도 3과 5에서 알 수 있는 바와 같이 역 분화 만능 줄기세포(KU-iL1)의 성장률이 정상적인 마우스 배아 줄기세포 (D3)와 비교 했을 때 증식 효율이 현저하게 떨어지는 결과를 보였다. 이를 극복하기 위해 선택된 4가지의 플라보노이드를 농도별로 처리하고 적정 농도를 확인 하였다. 그 결과 3,2’-DHF가 5uM 처리 되었을 때 처리하지 않은 역 분화 만능 줄기세포(KU-iL4)에 비해 증식 효율이 약 100% 증가하는 결과를 얻었을 뿐만 아니라 정상적인 마우스 배아줄기세포 (D3)보다 약 45% 증가하는 결과를 얻었다. 하지만 3,2’-DHF의 농도가 높아질수록 증식 효율이 떨어지는 결과를 얻었다. 이러한 결과를 바탕으로 역 분화 만능 줄기세포(KU-iL1)의 증 식 효율에 3,2’-DHF가 적정 농도에서 효과가 있음이 검증 되었다.

한편 확립된 역 분화 만능줄기세포 (KU-iL1)의 세포 주기를 flow cytometry를 이용하여 검증 하였다. 그 결과 그림(도 6)에서 보는 바와 같이 정상적이 배아줄기세포에 비해 확립된 역분화 만능 줄기세포 (KU-iL1)의 세포 주기 중 증식이 활발하게 일어나는 S 주기에서의 구역이 약 50% 정도 감소한 결과를 얻었다. 이를 극복하기 위해 3,2’-DHF를 앞 실험에서 검증된 농도 (5 uM)로 처리한 후 세포 주기를 검증 하였다. 그 결과 3,2’-DHF가 처리 된 역분화 만능 줄기세포 (KU-iL1)의 S 주기의 구역이 마우스 배아줄기세포와 유사하게 증가하는 결과를 얻었고 처리 전 역분화 만능 줄기세포 (KU-iL1)의 S 주기보다 약 25%이상 증가하는 결과를 얻을 수 있었다. 이로써 3,2’-DHF가 역분화 만능 줄기세포 (KU-iL1)의 세포주기 중 증식에 중요한 S 주기를 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

또 줄기세포 및 마우스 체세포로부터 확립한 역분화 만능줄기세포 (KU-iL1)의 미분화능을 유지하기 위해서는 leukemia inhibitory factor (LIF)를 필수적으로 첨가하여야 한다. 그러나 본 발명에서 3,2’-DHF를 처리가 역분화 만능줄기세포 (KU-iL1)의 미분화능 유지에 효과가 있는 것을 확인하였다.

도 7에서 보는바와 같이 역 분화 만능 줄기세포 (KU-iL1)에 LIF를 처리 하였을 때는 미분화능 마커인 알카라인 포스파타제 (Alkaline phosphatase, AP)의 활성이 나타나는 것을 확인 할 수 있었다. 그러나 LIF 미 첨가 시 그 활성도가 현저하게 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 상황에서 3,2’-DHF의 미분화능을 검증하기 위해 LIF가 빠진 실험군에 3,2’-DHF를 처리 해 보았다 그림에서 보는 바와 같이 비록 LIF가 첨가 되지 않더라도 3,2’-DHF의 첨가에 의해 미분화능 마커인 알카라인 포스파타제의 활성이 LIF가 빠진 역 분화 만능 줄기세포 (KU-iL1)에 비해 미분화능이 유지 되는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과로 3,2’-DHF가 미분화능에도 효과가 있음이 검증 되었다.

또한, 3,2’-DHF의 줄기세포 마커 유전자의 발현 및 세포내 신호전달 분자 활성도를 알아보기 위해서 3,2’-DHF를 확립된 역분화 만능 줄기세포(KU-iL1)에 처리 한 후 웨스턴 블라팅을 실시하였다. 도 8의 A에서 보는 바와 같이 3,2’-DHF가 처리 된 역분화 만능 줄기세포 (KU-iL1)의 Oct4, Sox2, 및 Klf4의 단백질 발현양이 처리 되지 않은 역분화 만능 줄기세포(Ku-iL1)에 비해 현저하게 증가되는 결과를 얻었고 또한 마우스 줄기세포와 비교 되었을 때도 그 정도가 비슷하거나 좀 더 증가되는 결과를 얻었다. 그러나 역분화 만능 줄기세포(KU-iL1)를 만든 재료인 마우스 배아 체세포에서는 발현이 되지 않는 것이 확인 되었다. 또한, 마우스 배아 줄기세포의 증식 및 유지에 필수적인 세포신호전달 분자인 SATA3와 Akt의 인산화 정도를 확인 하였다. 도 8의 B에서 보는 바와 같이 3,2’-DHF가 처리된 역분화 만능 줄기세포 (KU-iL1)에서 현저하게 그 인산화 정도가 증가되는 결과를 얻을 수 있었다. 이러한 결과로 3,2’-DHF는 줄기세포 유지 마커인 Oct4, Sox2, Klf4의 단백질 발현을 증가 시킬 뿐만 아니라 마우스 배아 줄기세포의 증식 및 유지에 필수적인 세포신호전달 분자인 SATA3와 Akt의 활성을 증가시킴을 검증 할 수 있었다.

또한, 3,2’-DHF를 처리 했을 때 역분화 만능 줄기세포 (KU-iL1)의 신경 세포로의 분화 효율을 검증하기 위해 면역염색법을 실시하여 신경분화 특이 마커인 Tuj-1, GFAP, 그리고 A2B5를 확인 하였다. 도 9에서 보듯이 역분화 만능 줄기세포 (KU-iL1)에 3,2’-DHF를 처리 하였을 때 처리 되지 않은 역분화 만능 줄기세포 (KU-iL1)에 비해 신경 특이 마커인 Tuj-1, GFAP, A2B5의 발현이 약 50 % 이상 증가되는 것을 확인 할 수 있었다. 이로써 3,2’-DHF의 처리는 역 분화 만능 줄기세포 (KU-iL1)의 신경 분화 효율을 증가 시키는 것을 검증 할 수 있었다. 이러한 결과는 역 분화 만능 줄기세포를 이용한 다른 세포로의 분화에도 효과가 있을 것으로 사료된다.

상기의 기재로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 3,2’-DHF와 같은 화합물을 포함하고 있는 본 발명의 조성물은 역분화 만능줄기세포의 유지 및 성장에 효율이 매우 우수할 뿐만 아니라 확립된 줄기세포의 분화 성능이 매우 안정적으로 발현되는 효과를 가진다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위하여 기재된 것으로서, 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되지 아니한다.

실시예 1:세포배양

1. 유도 다능성 줄기세포 (iPSc) 및 마우스 배아 줄기세포 배양

유도 다능성 줄기 (iPS) 세포는 mitomycin C를 처리한 STO 세포를 feeder 세포로 사용하여 유지하였다. iPS 배양액은 하이-글루코스 (high-glucose 4.5g/L), Na-파이루베이트(pyruvate 0.11g/L) 및 L-글루타민 (glutamine)이 들어있는 DMEM 배양액 (No. 12800-017, GIBCO사 제조)에 0.1 mM β-머캅토에탄올 (mercaptoethanol, GIBCO사 제조), 1% 비필수 아미노산 (non-essential amino acid, Sigma사 제조), 50 U/ml 페니실린 (penicillin), 50 ug/ml 스트렙토마이신 (streptomycin), 10% 소혈청 (fetal bovine serum, FBS, Hyclone사 제조)과 leukemia inhibitory factor (LIF, 1000 units/ml, CHEMICON사 제조)를 첨가하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 또한 소분자 물질 (small molecule)의 효능을 알아보기 위하여 배양액에 5 uM 3,2'-Dihydroxyflavone (DHF)를 처리하였다.

2. Embryoid body (EB) 형성 및 신경분화

삼배엽으로 분화 가능성을 조사하기 위하여, 분화 배양액으로는 DMEM/F12 (GIBCO사 제조)에 10%의 소혈청과 5 uM 3,2‘-DHF를 함께 첨가 하였다. Embryonic body (EB)를 형성하기 위하여 4일간은 부유상태로 배양하였고 4일간은 1 uM RA를 첨가하여 0.1% gelatin coating된 dish에 배양하였다. 신경 분화를 유도하기위하여 EB를 0.1% gelatin coated dish에 붙인 후 7일간 ITFSN에서 배양하였고 나머지 7일 간은 20 ng/ml of bFGF (Koma Biotech Inc.)가 첨가된 N2 배양액을 사용하여 신경으로 분화시켰다.

실시예 2:벡터 DNA 구성

1. Oct4, Sox2, KLF4 및 C-myc 유전자가 도입된 T-벡터의 준비

(1) 마우스 배아줄기세포로부터 total RNA의 추출

회수된 배아줄기세포에 트리졸 시약 (Trizol reagent, Sigma사 제조) 1 ㎖을 넣고 상온에서 5분간 반응 후, 세포를 파괴하여 세포의 내용물을 용출시켰다. 200 ㎕의 클로로포름(chloroform)을 넣고 15초 동안 인버트 (invert) 상태로 섞어준 다음 상온에서 15분간 반응하여 1300 rpm, 15분, 4℃의 조건으로 원심 분리하여 DNA와 단백질부분을 제외한 상층액만을 회수하였다. 그 후 500 ㎕의 이소프로판올 (isopropanol)을 넣고 상온에서 10분간 반응시킨 후 1300 rpm, 10 min, 4℃의 조건 하에서 원심 분리하여 펠렛 (pellet)을 세척 (washing)하였다. 그리고 75% EtOH 1 ㎖로 세척 (washing)하고 8000 rpm, 5 min, 4℃의 조건 하에서 원심 분리한 다음 상층액을 제거하고 펠렛 (pellet)을 건조 시켰다. 그 후 RNA 저해용액 (DEPC water) 30 ul에 펠렛 (pellet)을 녹여 total RNA를 준비하였다.

(2) cDNA 합성

cDNA를 합성하기 위하여 total RNA 3 ㎕(1 ㎍/㎕)와 올리고 dT(oligo dT) 2 ㎕(10 pmols/㎕)를 혼합하여 70℃에서 5분간 반응시킨 후 4℃에서 5분간 방치하였다. 리버스 역전사 믹스쳐 (reverse transcription mixture) (water 5.6 ㎕, ImProm-II 5X buffer 4 ㎕, 25 mM MgCl₂ 2.4 ㎕, 10 mM dNTP 1 ㎕, RNase inhibitor 1 ㎕ (40unit), Improm-II reverse transcriptase 1 ㎕, Promega사 제조)를 15 ul 넣고 25℃에서 5분간 어닐링 (annealing), 42℃에서 60분 동안 신장 (extending), 70℃에서 15분간 Improm-II 리버스 트랜스크립타제(reverse transcriptase)를 불활성화 (inactivation) 하였다.

(3) RT-PCR

합성된 cDNA는 핫 스타트택폴리머라제 (제품명: AccuPrime DNA Taq polymerase, Invitrogen사 제조)를 이용하여 95℃ 15분, 95℃ 1분, 51~53℃ 1분, 72℃ 1분간 30 사이클, 72℃ 5분 동안 익스텐션 (extension)하였다. 유전자 복제에 사용된 프라이머는

mOct4 (정방향 프라이머: 5'-GAATTC-CCATGGCTGGACACCTG-3' (23mer; 서열번호 1), 역방향 프라이머: 5'-GCGGCCGC-TCAGTTTGAATGCAT-3'(23mer; 서열번호 2)),

mSox2 (정방향 프라이머: 5'-GAATTC-GCATGTATAACATGATG-3' (23mer; 서열번호 3)), 역방향 프라이머: 5'-GCGGCCGC-TCACATGTGCGACAGG-3' (24mer; 서열번호 4),

mKLF4 (정방향 프라이머: 5'-GAATTC-ACATGGCTGTCAGCGAC-3' (23mer; 서열번호 5), 역방향 프라이머: 5'-GCGGCCGC-TTAAAAGTGCCTCTTC-3' (24mer; 서열번호 6)),

mC-myc (정방향 프라이머: 5'-GAATTC-GGCTGGATTTCCTTTGG-3' (23mer; 서열번호 7), 역방향 프라이머: 5'-GCGGCCGC-TTATGCACCAGAGTT-3' (23mer; 서열번호 8))이다.

PCR후 DNA 밴드는 전기 영동하여 에디티움 브로마이드 (ethidum bromide) 염색후 UV하에서 관찰하였다.

(4) T-벡터 클로닝

T-벡터에 클로닝 하기 위하여 DNA 추출 킷 (제품명: QIAquick gel extraction kit, Qiagen사 제조)를 사용하여 아가로스 겔로부터 PCR 밴드만 용리 (elution) 하여 pGEM-T 이지 벡터 (easy vector) 1 ul, 타겟 (target) DNA 3 ul, 리가제 버퍼 (ligase buffer) 1 ul, 물 4 ul, 리가아제 (ligase, Promega사 제조) 1 ul를 혼합하여 16℃에서 하루 동안 반응 (overnight reaction) 시켰다. 반응한 라이게이션 혼합액은 (ligation mixture) DH5α E.coli.에 형질전환 (transformation)시켜 T-벡터 클로닝을 하였다. DNA 시퀀싱 장치 (sequencing, Applied biosystems company's 3730XL Capillary DNA sequencer machine)을 통하여 4개의 각각의 유전자들이 클로닝되었음을 확인하였다.

2. pENTR4 벡터로 서브 클로닝

T-벡터에 클로닝 된 mOct4, mSox2, mKlf4 및 mC-myc DNA를 EcoRI 효소를 사용하여 절단 (cutting) 후 pENTR4 벡터와 리게이션 (ligation)을 실시하였다.

3. 렌티 바이러스 벡터와의 상동 제조합 (homologus recombination)

pENTR4/mOct4, mSox2, mKlf4 및 mC-myc 벡터와 렌티바이러스 벡터와의 재조 합을 위하여 각각의 pENTR4/hOct4, hSox2, mKlf4 및 mC-myc DNA 4 ㎕, 렌티바이러스 벡터 2 ㎕, 물 2 ㎕, LR 클로나제 (LR clonase, Invitrogen사 제조) 효소 2 ㎕을 혼합 하여 20℃에서 오버나잇 반응 (overnight reaction)을 실시하였다. 그 후 프로테나제 (Proteinase K) 용액 1 ㎕를 넣고 37℃에서 10분간 반응시키고 혼합물을 DH5α E.coli.컴피턴트 셀(competent cell)에 유전자 주입한 후 LB/Apm 아가 플레이트 (agar plate)에 도말하여 37℃에서 하룻동안 배양(overnight culture)하였다. 배양 후 DNA 샘플 추출하고 DNA 시퀀싱 장치(sequencing, Applied biosystems company's 3730XL Capillary DNA sequencer machine)를 통하여 상동 재조합이 이루어졌음을 확인하였다.

실시예 3:바이러스 생산

바이러스는 293T 세포에 일시 감염 (transient transfection)을 실시하여 생산하였고, 칼슘 포스페이트 감염 (calcium phosphate transfection)을 이용하였다. 감염 (transfection) 12~16시간 후에 10% FBS가 보충된 배양액 (medium, DMEM; Sigma사 제조)으로 교체하고 약 48시간 동안 바이러스 입자를 생산하였다. 이 후, 50,000 g, 20℃, 2시간 원심 분리하여 바이러스를 농축 하였다.

실시예 4: 유세포 분석(Flow cytometry analysis)

트립신(TRIPLE)을 사용하여 세포를 때어낸 후 phosphate-buffered saline (PBS)로 washing하였다. washing한 세포는 1 ml의 70% ethanol에 1 ul의 propidium iodide (PI) 넣고 15분 동안 어두운 곳에서 고정 및 염색하였다. 그 후 세포의 sub-G0/G1 DNA (subdiploid cells) 함량 측정은 FACS를 사용하였으며 CellQuest analysis program (BectonDickinson)을 사용하여 그 수치를 분석하였다.

실시예 5: 웨스턴 블럿팅

단백질을 추출하기 위해서, 준비된 세포를 차가운 PBS에 3번 washing하였다. 그 후 300 ul의 lysis buffer (1% Triton X-100, 100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM NaCl, 10% glycerol, 1 mM sodium orthovanadate, 50 mM sodium fluoride, 1 mM p-nitrophenyl phosphate, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)를 넣고 ice에서 30분 동안 반응시켰다. 용해단백질을 원심분리한 후 상측액만 회수하였고 Bradford Protein Assay Reagent (Bio-Rad)를 사용하여 단백질을 정량하였다. 정량의 단백질을 10% SDS-PAGE로 분리한 후 nitrocellulose membranes으로 전기영동을 실시하였다. Membranes을 blocking solution (5% non-fat dry milk and 0.1% Tween-20 in Tris-buffered saline)에 넣고 30분간 반응시켰다. 1차 항체로는 anti-Oct3/4 (1:1000, Santa Cruz), anti-Sox2 (1:1000, Santa Cruz), anti-p-STAT3(1:1000, cell signaling), anti-STAT3 (1:1000, cell signaling), p-AKT (1:1000, cell signaling), AKT (1:1000, cell signaling), anti-b-actin (1:1000, Snata Cruz), anti-mouse IgG-HRP (1:1000, Santa Cruz)을 사용하였고 2차 항체는 anti-rabbit IgG-HRP (1:1000, Santa Cruz)를 사용하여 enhanced chemiluminescence (ECL) kit (Amersham Bioscience)로 검출하였다.

실시예 6:면역 염색법 (Immunohistocytochemistry)

분화된 iPS 세포를 면역염색법으로 확인하기 위하여 준비된 세포를 4% paraformaldehyde로 고정한 후 0.2% Triton X-100 용액에 10분간 반응시켰다. 그 후 세포를 PBS에 washing하고 10% normal goat serum에 1시간 동안 반응시킨 후 1 차 항체를 넣고 4℃에서 하루 동안 반응시켰다. 2차 항체를 붙이기 위하여 PBS로 washing한 후 2차 항체를 넣고 1시간동안 반응 시켰으며 핵은 10 ug/ml of Hoechst (Sigma)을 사용하여 염색하였다. 사용한 1차 항체로는 monoclonal antibodies against SSEA1 (1:100 chemicon) and A2B5 (1:100, Chemicon), b-tubulin III (1:100; Chemicon), polyclonal antibodies against Oct4 (1:250; Santa Cruz Biotechnology), Brachyury (1:200 Santa Cruz Biotechnology), HNF-3b(1:200; Santa Cruz Biotechnology) and GFAP (1:50; Dako, Glostrup, Denmark, http://www.ump.com/dako.html)이며, 2차 항체는 goat anti-rabbit Alexa Fluor 546 (1:200, Invitrogen, goat anti-mouse Alexa Fluor 546 (1:200, Invitrogen)을 사용하였다.

도 1은 역 분화 만능 줄기세포의 확립 및 검증한 그림.

도 2는 시중에서 구입한 여러 플라보노이드의 처리에 의한 피부세포의 성장률 확인을 통한 스크리닝 결과를 나타내는 그래프.

도 3은 확립된 역 분화 만능 줄기세포(KU-iL1)의 증식에 여러 다이하이드록시플라본의 효율을 검증한 결과이다.

도 4는 본 발명에서 사용된 플라보노이드 3,2'-dihydroxyflavone (3,2’-DHF)의 구조이다.

도 5는 3,2’-DHF 처리 후 확립된 역분화 만능 줄기세포 (KU-iL1)의 콜로니 형성 효율을 검증한 그래프.

도 6은 3,2’-DHF 처리 후 확립된 역분화 만능 줄기세포(KU-iL1)의 세포주기 검증 그림.

도 7은 3,2’-DHF 처리 후, 역분화 만능 줄기세포 (KU-iL1)의 미분화능 (undifferentiation) 유지 효과를 검증한 사진.

도 8은 3,2’-DHF 처리에 의한 줄기세포 마커 유전자의 발현 및 세포내 신호전달 분자 활성을 검증한 사진.

도 9은 3,2’-DHF의 처리에 의한 역분화 만능 줄기세포 (KU-iL1)의 신경 분화 효율을 검증한 사진이다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> A composition for improving the proliferation ability and differentiation ability of induced pluripotent stem cells <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gaattcccat ggctggacac ctg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcggccgctc agtttgaatg cat 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gaattcgcat gtataacatg atg 23 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcggccgctc acatgtgcga cagg 24 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gaattcacat ggctgtcagc gac 23 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcggccgctt aaaagtgcct cttc 24 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gaattcggct ggatttcctt tgg 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gcggccgctt atgcaccaga gtt 23

Claims (12)

1. 각각 1∼5μM의 3,2'-다이하이드록시시플라본(DHF) 또는 3,4'-다이하이드록시시플라본(DHF)을 유효성분으로 함유하는 마우스 유래 역분화 만능 줄기세포의 증식능 개선용 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 5μM의 3,2'-다이하이드록시시플라본(DHF)을 유효성분으로 함유하는 마우스 유래 역분화 만능 줄기세포의 미분화능(undifferentiation) 유지 효과를 가지는 조성물.
8. 5μM의 3,2'-다이하이드록시시플라본(DHF)을 유효성분으로 함유하는 마우스 유래 역분화 만능 줄기세포의 신경 세포로의 분화 효율을 증가시키는 조성물.
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