KR100729732B1

KR100729732B1 - 자외선에 의한 사람 피부 세포의 세포사멸을 억제하는활성을 갖는 플라보노이드

Info

Publication number: KR100729732B1
Application number: KR1020060005735A
Authority: KR
Inventors: 조쌍구; 이응룡; 강용진
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2006-01-19
Filing date: 2006-01-19
Publication date: 2007-06-20

Abstract

본 발명은 자외선으로 인한 사람 피부 세포의 세포사멸을 억제하는 활성을 갖는 플라보노이드에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 식물 유래 플라보노이드인 5,7,3’,4‘-테트라하이드록시플라보논(5,7,3’,4‘-tetrahydroxy flavanone)을 유효성분으로 함유하는 자외선으로 인한 사람 피부세포의 세포사멸(apoptosis) 억제용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 5,7,3’,4‘-테트라하이드록시플라보논(5,7,3’,4‘-tetrahydroxy flavanone)는 자외선으로 인한 사람 피부세포의 세포사멸(apoptosis)을 억제하는 기능을 가지고 있음으로써 자외선에 의한 사람 피부세포의 세포사멸을 예방 또는 치료할 수 있는 기능성 화장료 조성물 또는 의료용 조성물의 개발에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

자외선에 의한 사람 피부 세포의 세포사멸을 억제하는 활성을 갖는 플라보노이드{5,7,3',4'-tetrahydoxy flavanone having protective activity on the UV-induced cell death in human keratinocytes}

도 1은 HaCaT cell의 viability와 apoptosis에 대한 UV의 영향을 나타내는 데이터이다.

도 2는 본 발명의 5,7,3',4'-tetrahydoxy flavanone이 3,4‘-dihydroxy flavone보다 UV에 의한 apoptosis에 더 특이적이라는 것을 보여주는 데이터이다.

도 3은 HaCaT cell에서 UV에 의해 유발된 apoptosis를 5,7,3',4'-THF가 저해하는 것을 보여주는 데이터이다.

도 4는 본 발명의 5,7,3',4'-THF가 p38 MAPK signaling pathway의 활성에 의해 UV에 의한 cell death를 저해한는 것을 보여주는 데이타이다.

도 5는 UV 처리에 의한 p38 kinase의 활성 억제와 5,7,3',4'-THF에 의한 p38 kinase의 활성에 따른 apoptosis의 저해를 보여주는 데이터이다.

도 6은 본 발명의 5,7,3',4'-THF가 세포내 활성산소종(ROS) 생성을 억제함으로써 스트레스에 의한 apoptosis로부터 HaCaT cell를 보호한다는 것을 보여주는 데이터이다.

태양으로부터 오는 자외선은 UVA, UVB, UVC로 구성되어 있는데, UVA는 315-400 nm의 파장을 가지며 계절에 관계없이 일정하며 외출 시나 유리창으로 비취지는 햇빛만으로도 피부가 서서히 검어지며 피부 노화의 원인으로 작용 한다. UVB는 280-315 nm의 파장을 가지며 여름철 야외 활동 후에 얼굴이 붉게 달아오르거나 검게 타게 한다. 가장 짧은 파장인 UVC는 100-280 nm의 파장을 가지며 가장 살균력이 강한 것으로 알려져 있다. UVC는 오존층에서 흡수되므로 우리 피부에 직접적으로 영향을 주지는 않는 것으로 여겨졌지만 환경오염에 의한 오존층의 파괴에 의해 점점 더 지표로의 도달이 많아지고 이에 따라 UVC에 대한 질환이 크게 증가하고 있는 실정이다. 자외선에 노출된 피부에서 과다한 아폽토시스 (세포사멸)가 발생한다는 보고가 많이 되고 있는데, 정상적인 경우의 세포사멸은 생리적인 균형을 유지하는데 적용되는 기본적인 세포 활동일 뿐만 아니라 손상된 세포나 비정상적인 세포의 제거를 통하여 carcinogenesis에 대항하는 protective mechanism으로 알려져 있으나, 과다한 세포사멸은 또 다른 질환의 원인으로 작용하게 된다. 즉 세포들이 정상 적인 기능을 수행하기 위해서는 세포사멸이 적절한 양만큼만 일어나도록 신호전달 반응이 조절되어야 한다. 세포사멸의 신호전달 경로를 조절하는 요소 중의 하나로 mitogen-activated protein kinases (MAPKs)가 널리 연구되고 있는데, MAPKs는 serine-threonine kinases의 한 family로 protein kinase family인 MAPK kinase kinases (MAPKKKs), MAPK kinases (MAPKKs)와 MAPK 들로 구성되어 있다. p42/p44 extracellular signal-related kinases (ERK1 과 2), c-Jun N-terminal protein kinase(JNK)/stress-activated protein kinases (SAPK), p38 MAP kinases를 포함한 MAP kinase 와 big MAPK (BMK1/ERK5)가 독립적인 signaling pathway 안에서 존재 하고 여러 가지 기능을 한다고 보고되어 있는데, 이들 중 자외선에 의한 세포사멸에서 p38 MAP kinase가 중요한 역할을 한다고 알려지고 있다. 활성화된 MAP kinase는 기질 단백질 안의 Ser-Pro와 Thr-Pro motifs 의 phosphorylation에 영향을 끼치고, growth factor, mitogen, cytokine와 자외선을 포함한 environmental stress 등의 다양한 세포 외 자극에 의해 조절된다고 밝혀져 왔다.

플라보노이드는 식물의 세포 어디에나 산재되어 있고, 자연계에서 식물의 색깔에 많이 관련되어 광범위하게 퍼져있는 식물 색소의 구성 물질로, 최근 의학적 치료의 목적으로 플라보노이드의 구조와 기능에 대한 활발한 연구가 이루어지고 있다. 대부분의 플라보노이드들은 자외선에 의해 자극되어 밝은 형광을 뿜는 것으로 보고되었으며, 일부 플라보노이들은 유전자 발현, exocytosis 및 특정 효소의 활성의 조절은 물론, 특정 미생물의 생장을 억제시키는 기능을 등을 나타내는 것으로 보고되었다. 이들은 또한 특정 병원성 원생동물을 죽인다고도 알려져 있지만, 동물 세포에 대해 독성은 매우 낮은 것으로 알려져 있다. 플라보노이드는 phenolic compound이며 diphenylpropane (C6C3C6) skeleton에 의해 특이적인 구조를 가지며, monomeric flavanol, flavone, flavanol, flavanon로 나누어지는데, 이들의 기능에 대한 많은 연구에도 불구하고 pro-oxidant/anti-oxidant 및 pro-apoptosis/anti-apoptosis에 대한 성질 및 이들의 효과에 대한 자세한 분자 기전은 여전히 연구되어야할 과제로 남아 있다.

본 발명자들은 자외선에 노출된 피부 keratinocyte가 세포사멸 과정을 거치는데, 식물 유래의 플라보노이드 중 하나인 eriodyctyol (5,7,3‘,4‘-tetrahydroxy flavanone) 를 세포에 처리하게 되면 피부 keratinocyte의 손상 (세포사멸)이 억제되는 것을 발견하였으며, 상기 3',4',5,7-tetrahydroxy flavone의 피부 세포의 사멸 억제 효과는 p38 MAP kinase 신호전달계의 조절을 통해서 이루어짐을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 자외선으로 인한 사람 피부 세포의 세포사멸을 효과적으로 억제하는 활성을 갖는 식물 유래 플라보노이드인 5,7,3’,4‘-테트라하이드록시플라보논(5,7,3’,4‘-tetrahydroxy flavanone)을 포함하는 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 5,7,3’,4‘-테트라하이드록시플라보논(5,7,3’,4‘-tetrahydroxy flavanone)을 유효성분으로 함유하는 자외선 에 의한 사람 피부 세포의 세포사멸 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 5,7,3’,4‘-테트라하이드록시플라보논(5,7,3’,4‘-tetrahydroxy flavanone)는 식물 유래 플라보노이드의 일종으로 에리오딕티올(eriodictyol)으로도 불리우며 하기 화학식 1과 같은 구조를 가진다. 플라보노이드 diphenylpropane (C6C3C6) skeletons의 5번과 7번 탄소위치에 OH를 가지며, 6번 8번 탄소위치에는 OH기가 없다.

[화학식 1]

본 발명에서는, 상기 5,7,3’,4'-tetrahydroxy flavanone (5,7,3',4'-THF)가 표피 세포에 제일 첫 번째 세포 종류이고 인체의 첫 방어선인 keratinocytes를 apoptotic cell damage인 UV로부터 보호한다는 것을 증명하였다. 또한, p38 MAP kinase의 활성 감소가 HaCaT cell에서 UV에 의한 apoptosis에 관여한다는 것과 5,7,3‘,4'-THF와 관련된 anti-apoptotic 효과가 UV에 의한 p38의 활성을 증가시켜 일어난다는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 5,7,3’,4‘-테트라하이드록시플라보논(5,7,3’,4‘-tetrahydroxy flavanone)는 자외선에 의한 피부의 세포사멸 보호용 기능성 화장료 조성물 또는 약학적 조성물의 원료로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

환경오염에 의한 오존층의 파괴는 UV 즉 자외선의 지표 도달 양을 증가 시켰고, 그에 피부암 같은 피부에 미치는 영향 또한 증가 되었다. 최근 UV 보호제, 치료제와 같은 약품의 개발에 있어 천연 물질의 사용은 과학적, 산업적으로 아주 중요한 과제가 되고 있다. 특히 UV 차단제 뿐만 아니라 UV에 의한 세포 손상을 막아주는 약품 또한 많이 개발 되고 있는 실정이다.

플라보노이드는 최근 큰 관심을 받고 있는 천연물질이며, kaempferol과 quercetin를 포함한 몇 가지의 플라보노이드들은 항산화효과에 영향을 주고 또한 암을 억제할 수 있다는 여러 연구가 발표되었다. 종양의 활성을 억제하는 것 말고도 항과민반응, 항바이러스, 그리고 항염증반응의 특징을 포함한 유익한 생물학적 활동하는 플라보노이드들이 보고되고 있으며, 몇몇 플라보노이드 역시 anti-apoptotic 특성이 있는 것으로 발표되었다. 플라보노이드와 관련된 다양한 생물학적 기능을 알기 위해 수행된 많은 연구에도 불구하고, 세포 기능에 기본이 되는 명확한 분자적 메카니즘은 아직까지 알려지지 않고 있다. 본 발명에서 우리는 플라보노이드가 인간 HaCaT keratinocytes의 UV 손상을 가 했을 시 cell viability에 특이적인 영향을 준다는 것을 증명하였다. 특히 5,7,3‘,4'-THF는 세포성장을 유도하고, UV에 의해 유도된 세포사멸을 억제한다는 것이 증명되었다 (도 3 및 5). 최근 여러 플라보노이드는 세포주기의 정지와 다양한 암세포에서 apoptosis를 유도한다는 것이 보고되었다. 그러나 몇몇 연구만이 플라보노이드의 anti-apoptotic 효과를 증명하는 정도였다. 지금까지의 연구들은 5,7,3‘,4'-THF의 anti-apoptotic 효 과에 대해 연구가 되지 않았다. 5,7,3‘,4'-THF가 표피 세포에 제일 첫 번째 세포 종류이고 인체의 첫 방어선 인 keratinocytes를 apoptotic cell damage인 UV로부터 세포를 보호한다는 것은 본 발명에서 처음 밝혀내었다. 또한, 본 발명에서는 p38의 활성 감소가 HaCaT cell에서 UV에 의한 apoptosis에 관여한다는 것과 5,7,3‘,4'-THF와 관련된 anti-apoptotic 효과가 UV에 의한 p38의 활성을 증가시켜 일어난다는 것을 처음으로 밝혀내었다 (도 5).

JNK와 p38 MAPK분자들은 세포 스트레스에 반응하여 활성화 되거나 비활성화 되어 세포 보호뿐만이 아니라 pro-apoptotic effects에 영향을 주는 것으로 알려 져 왔다. p38의 신호경로는 다양한 기능 조절에 이용되는 다수 신호 전달 경로에 관여한다고 보도 되고 있다. 본 연구에서 UV에 의해 p38 MAP kinase의 활성이 감소하는 것을 보여 주었다. 여러 보고에서도 p38은 세 가지 타입의 UV (UVA,UVB,UVC)에 의해 강하고 빠르게 활성화 된다고 알려져 있다. 반대로 ERK MAP kinase는 keratinocyte에서 세 가지 타입의 UV에 의해 활성이 특이적으로 일어나지 않는다고 보고되고 있으며, JNK는 UVA에 의해 활성화가 되고, UVB나 UVC에 의해서는 상대적으로 활성화가 정도가 낮다고 보고되고 있다. UVB와 같은 경우에는 인간 세포에서 apoptosis를 유도 한다는 보고가 많다. 이러한 apoptosis는 핵의 응축 그리고 fragmentation고 같은 형태학적 변화를 포함 하고 있다. UV에 의한 p38의 활성은 여러 가지 transformed 세포에서 apoptosis를 유도 한다는 보고가 많다. 이러한 발견은 p38이 조절하는 UV에 대한 반응에 대한 연구를 가능하게 해줄 것이다. 본 발명에서는 UV에 의해서 감소하는 p38 활성이 UV에 의한 인간 HaCaT keratinocytes의 apoptosis에 관여한다는 것을 증명하였다. 또한, 5,7,3‘,4'-THF에 의한 p38의 활성이 UV에 의한 인간 HaCaT keratinocytes의 apoptosis를 저해 한다는 결과를 얻었다.

본 발명에서 5,7,3‘,4'-THF는 UV에 의한 활성산소종 생성에 대한 명확한 억제 효과를 보여주었다 (도 6). 이러한 결과들은 UV에 의한 p38 활성 감소가 세포내 5,7,3‘,4'-THF처리에 의한 활성산소종 억제에 영향을 미친다는 것을 보여주었다(도 6). 활성산소종에 의존적인 redox cycling은 Protein kinase C와 MAPKs (mitogen-activated protein kinases), 특히 p38의 활성을 포함한 신호 전달 기작에서 중요한 단백질들의 활성을 조절하는 상호작용 조절에 매우 중요한 것으로 생각되어진다. MAPKs는 산화 환원 상태에서 산화에 의한 변화에 반응하여 활성화 되는 것으로 알려 져 있다. 이러한 활성화 후에 각각의 MAPK들은 apoptosis 조절인자, cytoskeletal 단백질, 핵 수용체, 그리고 다수의 전사요소들을 포함한 특정 물질을 인산화 시키는 것으로 보고되었다. 게다가 세포 내 활성산소종 생성은 CD45와 PTPs의 억제를 통해 지속적인 MAPK 활성을 유지시키는 것으로 보고되어졌고, 또한 특정 신호경로를 통해 특정 MAPK 활성 유도에 기여하는 것으로 보여 졌다. 본 발명에서 UV에 의한 세포사멸이 p38 신호경로의 특이적 저해제인 SB202190의 처리에 의해 증가되어 졌고, 5,7,3‘,4'-THF는 UV에 의한 p38의 활성 감소를 저해함으로써 keratinocytes에서 apoptosis의 조절에 기여하는 것을 확인 하였다.

본 발명에서 UV에 의한 apoptosis 억제에 3,4‘-dihydroxy flavone과 5,7,3‘,4'-THF이 anti-apoptotic 효과를 보였지만 5,7,3‘,4'-THF이 훨씬 더 효과 적임 을 보였다. 이들 결과들은 3,4'-DHF와 5,7,3‘,4'-THF를 포함한 여러 플라보노이드에서 특정 structure-activity relationship (SAR)가 있음을 분명히 나타낸다. 이러한 결과를 바탕으로 플라보노이드 diphenylpropane (C6C3C6) skeletons의 5 및/또는 7 carbons에 특정 OH-치환을 갖는 5,7,3‘,4'-THF와 같이 이 부분에서의 치환이 anti-apoptotic 효과에 상당한 영향을 줄 것이라고 생각 되어진다 (도 7).

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 5,7,3’,4‘-tetrahydroxy flavanone (5,7,3‘,4'-THF)는 상업적으로 구입할 수 있는 화합물의 형태로 포함될 수도 있으나, 상기 플라보노이드가 많이 함유되어 있는 붉은겨우살이(Viscum album var.)와 같은 식물의 추출물 또는 정제물의 형태로 포함될 수도 있다.

본 발명의 조성물은 당업계에 알려진 통상의 방법에 의해 과립, 정제, 캡슐 또는 드링크제 등의 형태로 제제화되거나 크림, 로션, 화장수 등의 화장료 형태로 제조될 수 있다. 또한, 보존이나 취급을 용이하게 하기 위하여 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 통상 제제화에 사용되는 캐리어, 그 밖의 임의의 조제를 부가하여도 좋다.

또한, 본 발명의 5,7,3’,4‘-tetrahydroxy flavanone (5,7,3‘,4'-THF)의 투여량은 사용자의 연령, 증상 등에 따라 적당히 증감하는 것이 가능하나, 바람직하게는 성인 하루당 0.1~1000mg이 되도록 투여하는 것이 적당하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의 해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

1. 재료

인간 keratinocyte HaCaT 세포주는 ATCC (USA)에서 구입하였다. DAPI와 propidium iodide는 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)사에서 구입하였고, PD98059, SB203580, SP106203은 BioMol (Plymouth Meeting, PA)사, dichlorofluorosteine diacetate (DCFHDA)는 Molecular Probes (Eugene, USA)사에서 구입하였다. 그리고 electrophoresis reagents와 Bio-Rad protein assay kit는 Bio-Rad Laboratories (Hercules, USA)사에서 각각 구입하였다. 실험에 사용한 항체로는 anti-Actin, anti-PARP, anti-Caspase-3 는 Santa Cruz Biotech Inc. (Santa Cruz, USA)사, anti-phospho p38, anti-p38 Cell Signaling Technology Inc. (Beverly, MA)사에서 각각 구입하였다. Enhanced chemiluminescence (ECL) Western blot detection kit는 Amersham Phamacia Biotech. (Oxford, UK)사에서 구입하였고, Lipofectamine, Lipofectamine Plus reagent, 그리고 G418은 Gibco BRL (Gaithersberg, USA)사에서 구입하였다. 세포배양 용기는 NUNC (New York, USA)사에서 구입하였다. 실험에 사용된 플라보노이드들인 3-Hydroxyflavone, 4'-Hydroxyflavone, 4'-Hydroxy-5-methoxyflavone, 4'-Hydroxy-6-methoxyflavone, 4'-Hydroxy-7-methoxyflavone, 3,2'-Dihydroxyflavone, 3,3'-Dihydroxyflavone, 3,4'-Dihydroxyflavone, 6,4'-Dihydroxyflavone, 5,7,3'-Trihydroxy-4'-methoxyflavone, eriodictyol (5,7,3',4'-Tetrahydroxyflavanone), 5,7,3',4',5'-Pentahydroxyflavone 그리고 5,7-Dihydroxy-3',4',5'-trimetoxyflavone들은 Indofine chemical (USA, NJ)사에서 구입 하였다.

2. 실험방법

실시예 1: p38 MAPK 및 p38-DN의 과발현 세포주 제조와 세포배양

p38 MAPK 및 p38-DN (dominant negative mutant)의 과발현을 위해 인간 피부 keratinocyte HaCaT 세포에 p38 MAPK 및 p38-DN 을 pcDNA 발현 벡터(Invitrogen, USA)에 클로닝 하여 transfection하였다. 이들 vector는 Lipofectamine을 사용해서 HaCaT 세포에 transfection을 수행 한 뒤 p38 MAPK 또는 p38-DN을 발현하는 세포들을 G418 (500 μg/ml)이 첨가된 선택배지에 10일에서 20일 정도 키워 몇 개의 클론을 선택하고 Western blotting으로 단백질의 발현 여부를 검증하여 최대로 발현되는 클론을 선택하였다. p38 MAPK 및 p38-DN이 과발현되는 HaCaT 세포주는 10% fetal bovine serum과 항생제 (50 μg/ml streptomycin 및 50 U/ml penicillin)가 첨가된 DMEM으로 37℃, 5% CO₂배양기에서 100 mm 배양조에 배양하였고 2일에서 3일에 한번 씩 분주함과 동시에 배양액을 갈아주었다.

실시예 2: DAPI 염색

Apoptotic 핵을 확인하기 위해 DAPI염색을 수행하였다. HaCaT 세포는 (1 x 10⁶cells/㎖) 35 mm 배양조에서 배양액과 함께 24시간 배양하고, 플라보노이드를 처리하고 24시간 배양 하였다. 처리 된 HaCaT 세포는 PBS로 3회 수세한 후, acetone/methanol (50:50, vol/vol)로 15분간 고정시킨 후 PBS로 3번 정도 수세 후 형광을 띠며 DNA에 결합하는 염색액인 4, 6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI, 2 μg/㎖)용액으로 5분간 염색하였다. 그리고 PBS로 2-3번 정도 수세 후 염색된 핵의 모양은 형광현미경 (Carl Zeiss) 하에서 ultraviolet excitation filter (300-500 nm)를 통해 관찰하였다.

실시예 3: 형광 현미경을 이용한 활성산소종의 측정

세포 내 활성 산소종의 농도는 oxidant-sensitive fluorescent probe인 DCFHDA를 이용해서 역상 형광 현미경으로 측정되었다. 세포는 (1 x 10⁶cells/㎖) 35 mm 배양조에서 배양액과 함께 24시간 배양하였다. 세포는 serum free 배지로 2번 수세 후 각 처리 물질을 12시간 처리 후 5 mM DCFHDA를 37℃에서 30분간 처리하였다. 그 후 PBS로 4번 수세하고 cover glass를 덮은 다음 역상 형광 현미경 (excitation, 488 nm; emission, 520nm)을 이용하여 확인했다.

실시예 4: MTT assay

Cell viability를 결정하기 위해 MTT assay를 수행하였다. UV 또는 플라보노이드에 의한 세포독성을 알아보기 위해 HaCaT 세포를 (1 x 10⁶cells/㎖) 37℃, 5% CO₂에서 24시간 배양하였다. 배양된 세포는 (5 x 10⁴cells/㎖) 96 well에 100 ㎕ 씩 분주한 후 24시간 후 UV와 플라보노이드들을 처리하고 48시간을 배양 하였다. 48시간 후 배지를 제거하고 50 ㎕ MTT reagent ( 2 ㎎/㎖ )를 첨가한 후 37℃, 5% CO₂에서 4시간 반응 시켰다. 그 후 MTT reagent를 제거하고 100 ㎕ DMSO를 첨가하고 microplate (ELISA) reader로 450과 500 nm의 파장에서 흡광도를 측정하 였다.

실시예 5: 형광세기를 이용한 활성산소종의 측정

세포 내 활성 산소종의 생성 정도는 oxidant sensitive prode인 DCFHDA를 사용하여 excitation 파장은 504 nm, emission 파장은 524 nm에서 peroxide에 의해 DCFHDA가 산화되어 생성되는 DCF의 형광을 측정하였다. 측정하기 30분전에 DCFHDA를 5 mM 되도록 처리하고 37℃에서 배양한 후 세포를 모은 후 sonication buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl₂, 5 mM NaCl, 5% glycerol, 1 mM sodium orthovanadate, 50 mM sodium fluoride, 1 mM p-nitrophenol phosphate, 1 mM PMSF)를 첨가하여 초음파 파쇄기로 4초씩 7회 파쇄하였다. 12,000 x g에서 15분간 원심 분리하여 얻은 상등액의 단백질을 BSA를 표준물질로 하여 BCA 단백질 정량 kit을 이용해 562 nm에서 흡광도를 측정하여 정량 한 후, 동일한 양의 단백질을 가지고 형광세기를 UV spetraphotometer로 excitation 파장은 504 nm, emission 파장은 524 nm에서 측정하였다.

실시예 6: Western Blotting

전기영동을 위한 단백질 시료의 추출은 처리 시간별로 세포를 ice-cold Tris buffered saline (TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 137 mM NaCl)으로 3회 수세한 후, lysis buffer (TBS, 1% NP-40, 1 mM sodium orthovanadata, 10 ㎍/㎖ leupeptin 및 1 mM PMSF)를 넣어 4℃에서 20분간 반응시켰다. 12,000 × g에서 15분간 원심 분리하여 얻은 상등액의 단백질을 BSA를 표준물질로 하여 BCA 단백질 정량 kit을 이용 해 562 nm에서 흡광도를 측정하여 정량한 후, 동일한 양의 단백질을 가지고 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리시켰다. 분리된 단백질을 nitrocellulose membrane에 transfer하고, 이 membrane을 항체의 비 특이적 결합을 차단하기 위하여 blocking buffer (5% non-fat milk와 0.1% Tween 20을 함유한 TBS용액)에서 1시간동안 반응시킨 후, 각 검증 단백질에 대한 항체를 가하여 1～2시간동안 반응시켰다. 이어서 0.1% Tween 20을 함유한 TBS-T 용액으로 10분씩 3차례 수세한 다음, peroxidase-conjugated anti-mouse IgG 혹은 anti-rabbit IgG를 secondary antibody로 1-2시간 동안 반응시켰다. 0.1% Tween 20을 함유한 TBS-T 용액으로 10분씩 3차례 수세한 다음 ECL system으로 반응시킨 후 X-ray film상에서 단백질을 검증하였다. 각 시료의 단백질 정량은 BCA protein assay kit를 사용하여 565 nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였다.

실시예 7:세포사멸 분석

세포는 35 mm 배양조에 3 x 10⁵cells/㎖으로 배양액과 함께 배양하였고, UV를 처리하고 24시간 후에 trypsin을 처리하여 세포를 모은 후 Trypan blue 염색약을 이용해서 염색된 세포만을 혈구 계산기로 그 수를 산정하였다.

3. 실험 결과

여러 플라보노이드가 HaCaT keratinocyte의 cell viability에 미치는 영향

자연계에서 약 3000가지 정도의 flavonoid가 알려 지고 있고 그 기능 또한 조금씩 보고되고 있다. 이러한 flavonoid의 세포 내 기작과 세포에 미치는 영향에 대해 완벽하게 이해 하기는 어려운 실정이다. 본 연구에서는 인간 keratinocyte cell line인 HaCaT 세포주를 이용하여 자연계에 존재하는 여러 플라보노이드 중 몇 가지를 이용하여 HaCaT 세포주의 cell viability에 어떠한 영향을 주는지를 MTT assay를 이용하여 확인 하였다. 표 1에서 보는 바와 같이 여러 플라보노이드의 cell viability에 영향을 주는 정도가 다른 결과를 얻었다. 그 중 3,2‘-dihydroxy flavone 3,3‘-dihydroxy flavone, 3,4‘-dihydroxy flavone 그리고 5,7,3’,4‘-tetrahydroxy flavanone이 HaCaT 세포주의 증식을 증가 시키는 결과를 얻었고, 그중에서 5,7,3’,4‘-tetrahydroxy flavanone이 가장 높은 증식률을 보였다.

[표 1]

UV가 HaCaT keratinocyte의 cell viability와 apoptosis에 미치는 영향

인체의 첫 방어선은 주로 외피와 내피로 구성된 피부이다. keratinocyte는 epidermis로 구성된 principle cell type이고 총 epidermis cell의 90%를 차지한다. 인간 keratinocyte cell line은 세포 배양을 하면서 만들어진 인간 epithelial cell line이며, Tumor suppress gene p53의 mutation을 가지고 있다. 하지만, HaCaT cell은 쥐에게 접종시켜도 암으로 발달 되지는 않는다고 알려 지고 있다. 인간 HaCaT cells에 미치는 UV의 영향을 알아보기 위해서 세포에 여러 가지 농도의 UV를 처리하였다. 먼저, MTT assay를 통해 시간대별 cell viability를 확인하였다. MTT assay는 살아있는 세포 내 미토콘드리아의 물질대사에 반응하며, 세포내 산화 환원반응에 의해 발색 반응을 보여준다. UV의 농도가 증가 할수록 HaCaT cells의 viability를 감소되었으며, 시간이 지남에 따라 viability가 감소하는 결과를 얻었다(도 1A, 1B). 다음 실험에서는 UV에 의해 유도된 cell death가 apoptosis인지를 알아보았다. 농도의 증가에 따라 apoptosis의 대표적 신호전달 기작인 PARP의 절편과 caspase-3를 활성화시키는 것으로 나타났으며, Cell viability가 약 50%로 관찰된 농도의 UV를 이용하여 시간별 확인을 한 결과 역시 HaCaT keratinocyte에서 UV가 apoptosis를 유도 한다는 결과를 얻었다 (도 1C, 1D). 도 1은 HaCaT cell의 viability와 apoptosis에 대한 UV의 영향을 나타내는 데이터이다.

3,4‘-dihydroxy flavone 보다 5,7,3‘,4‘-tetrahydroxy flavanone이 UV에 의한 apoptosis에 특이적이다.

좀 더 확실한 플라보노이드의 영향을 알아보기 위해서, 세포 증식을 가장 많이 증가 시킨 3,4‘-dihydroxy flavone과 5,7,3‘,4‘-tetrahydroxy flavanone(5,7,3‘,4‘-THF)을 전 처리하고 UV를 처리 한 후 HaCaT cell에서 cell death를 확인했다. 결과에서와 같이 5,7,3‘,4‘-THF가 전 처리 된 세포에서 3,4‘-dihydroxy flavone을 처리 한 세포 보다 UV에 의한 HaCaT cells의 viability의 감소의 방어가 사진 상으로도 증가되는 결과를 얻었다 (도 2A). 다음 실험에서는 MTT assay를 통하여 cell death에 대한 3,4‘-dihydroxy flavone와 5,7,3‘,4‘-THF의 영향을 알아보았다. 결과에서 보는 바와 같이 농도와 시간에 따른 UV에 의한 cell viability의 감소가 3,4‘-dihydroxy flavone보다 5,7,3‘,4‘-THF에 의해 증가 되는 결과를 얻었다(도 2B, 2C). 이러한 결과로 구조적인 차이에 의해 UV에 의한 cell death에 특이적인 플라보노이드가 존재 한다는 것을 알았다. 도 2는 본 발명의 5,7,3',4'-tetrahydoxy flavanone이 3,4‘-dihydroxy flavone보다 UV에 의한 apoptosis에 더 특이적이라는 것을 보여주는 데이터이다.

더 나아가 UV에 의해 유도된 cell death를 5,7,3‘,4‘-THF가 감소시키는 기작이 apoptosis를 감소시키는 것인지를 알아보기 위해 DAPI 염색을 통해 apoptosis의 증거인 세포핵의 형태학적 변화인 핵의 응축과 fragmentation을 확인 하였다. UV는 HaCaT cells에서 핵의 응축과 fragmentation을 유발시키지만, 이러한 핵의 fragmentation을 5,7,3‘,4‘-THF가 억제하였다 (도 3A). 또한, 5,7,3‘,4‘-THF는 UV에 의한 apoptotic marker인 PARP와 pro-caspase-3의 절단을 저해 하였다 (도 3B). 지금까지의 결과를 보면 UV가 HaCaT 세포주에서 apoptosis를 일으킨다는 것을 알 수 있었으며, 또한 아직 완전히 연구되지 않은 5,7,3‘,4‘-THF 플라보노이드가 인간 HaCaT keratinocyte에서 UV에 의한 apoptosis에 대해 anti-apoptotic한 작용 을 한다는 것을 보여 주었다. 도 3은 HaCaT cell에서 UV에 의해 유발된 apoptosis를 5,7,3',4'-THF가 저해하는 것을 보여주는 데이터이다.

UV에 의한 apoptosis에서 p38 MAP kinase signaling pathway에 의한 cell death 저해

지금까지 플라보노이드와 관련한 많은 연구에도 불구하고, 세포에 영향을 주는 것으로 관찰된 플라보노이드의 정확한 분자학적인 메카니즘은 아직 명확하게 밝혀지지 않고 있다. 그러나 여러 논문에 의하면 MAPK signaling pathway가 여러 가지 시약의 처리에 대한 영향과 효과에 중요한 역할을 할 것이라고 보고되고 있고, UV에 의한 apoptosis에 p38 MAP kinase가 관여 하고 있다는 보고가 되고 있다. MAPK signaling pathway는 세포성장, 분화, 발생 그리고 apoptosis 등 다수의 세포 기능에 관여한다고 알려져 있으며, 일반적으로 이들은 ERK, p38 kinase, 그리고 JNK라고 불리는 3개의 신호전달 분자들로 구성되어 있다. MAPK signal pathway가 UV에 의한 apoptosis에 관여하는지를 알아보기 위해 특정 MAPK pathway를 저해하는 각 kinase의 저해제들인 PD98059(ERK1/2), SB202190(p38), 또는 SP600125(JNK)를 세포에 전 처리하고 UV를 처리하였다. PD98059 그리고 SP600125는 HaCaT cells에서 UV에 의한 cell viability 감소에 어떠한 영향도 주지 않는 것을 알 수 있었고 (도 4), SB202190 (MEK inhibitor)의 처리 시에는 현저하게 UV에 의한 cell death를 증가 시키는 결과를 보여주었다. 이러한 결과로 p38 MAP kinase가 UV에 의한 cell death에 관련을 할 것으로 생각이 되어 진다. 도 4는 본 발명의 5,7,3',4'-THF가 p38 MAPK signaling pathway의 활성에 의해 UV에 의한 cell death를 저해한는 것을 보여주는 데이타이다.

p38 MAP kinase signaling pathway가 5,7,3‘,4‘-THF의 anti-apoptotic 영향에 관여

p38의 활성은 UV에 노출된 세포에서 UV의 농도에 따라 그리고 시간이 경과함에 따라 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (도 5A, 5B). 이러한 지속적인 감소하는 p38의 활성이 인간 HaCaT keratinocyte에서 UV에 의한 apoptosis에 관련되어 있을 것이라는 것을 확인 할 수 있었다. p38의 활성은 일반적으로 apoptosis를 촉진하는 것으로 보고되고 있으나, 최근 연구에서는 지속적인 p38의 활성이 anti-aopoptotic 작용에 관여한다는 것으로 보고되고 있다. 따라서 사람 HaCaT keratinocyte에서 p38의 활성이 UV에 의한 apoptosis와 연관이 있을 것으로 생각 되어 진다. 또한, 5,7,3',4'-THF의 전처리에 의해 UV에 의한 p38 kinase의 활성 감소를 저해하는 결과를 얻었다(도 5C). 이러한 결과에 의해 5,7,3',4'-THF의 처리가 p38 kinase의 활성을 유도 할 것이라는 결과를 얻었다. 5,7,3',4'-THF의 처리가 UV에 의한 p38 활성 억제를 저해 시키고, 핵의 fragmentation과 PARP 와 pro-caspase-3의 절단을 동시에 저해 한다는 것은 매우 중요한 결과이다 (도 5D, 5E).

지금까지의 결과로, p38 신호경로는 UV에 의한 HaCaT keratinocytes의 apoptosis, 그리고 특히 5,7,3',4'-THF와 관련한 anti-apoptotic 효과에 중요한 기능을 수행하는 것으로 확인 되어 지며, 5,7,3',4'-THF 처리와 관련된 anti-apoptotic 효과에 있어 p38의 관련여부를 좀 더 명확히 확인하기 위해서 HaCaT keratinocyte에 wild type p38 그리고 dominant negative p38 mutant인 p38-DN을 transfection 시켰다. 이에 대한 결과로 p38의 과발현은 5,7,3',4'-THF의 anti-apoptotic 기능을 증가 시키는 결과를 나타났지만, p38-DN을 처리한 세포에서는 5,7,3',4'-THF의 anti-apoptotic 기능을 현저히 감소시키는 결과를 얻었다 (도 5F). DAPI-staining nuclear fragmentation 분석에서도 명확하게 p38의 과발현이 5,7,3',4'-THF의 anti-apoptotic 효과를 증가 시키는 효과를 보여주었다 (도 5D). 지금까지의 결과로 p38 신호경로가 직접적으로 5,7,3',4'-THF와 연관된 anti-apoptotic 효과에 관여한다는 것을 확인 하였다. 도 5는 UV 처리에 의한 p38 kinase의 활성 억제와 5,7,3',4'-THF에 의한 p38 kinase의 활성에 따른 apoptosis의 저해를 보여주는 데이터이다.

5,7,3',4'-THF에 의한 활성 산소종의 억제와 p38 kinase의 활성 signal pathway는 HaCaT cell에서 apoptosis 조절에 중요한 역할을 수행한다.

여러 보고들에서 UV를 포함한 다수의 환경적 스트레스가 세포내 활성 산소종을 다양하게 변화시킨다고 보고되고 있다. 5,7,3',4'-THF의 anti-apoptotic 효과의 분자적인 원인을 설명하기 위해 5,7,3',4'-THF가 활성 산소종에 의해 유도되는 apoptosis에 대한 저해 효과에 영향을 주는지를 알아보았다. 처음으로 HaCaT keratinocyte를 UV에 노출시킨 후 oxidant-sensitive fluorescent dye인 DCFHDA를 사용하여 세포내 활성 산소종 생성을 측정하였다. 세포내 peroxide가 존재하면, DCFHDA에서 dichlorofluorescin(DCFH)로의 esterase-mediated deacylation이 세포에서 발생하고 높은 fluorescent dichlorofluorescin(DCF)의 생성 결과로 non-fluorescent DCFH는 산화된다. 최근에 DCFH는 peroxynitrite, hydrogen peroxide( 세포의 peroxidases와 협력하여), 단독적인 peroxidase, 그리고 hydroxyl radical 에 의한 산화에 민감하다고 보고되고 있다. 그러나 DCFH는 생물학적 시스템에 있어서 NO, hypochlorous acid, 또는 superoxide radicals의 측정에는 적합하지 않다고 알려져 있다.

UV 처리는 HaCaT keratinocyte에서 fluorescent DCF의 생성을 많이 유도하는 것으로 보아 세포내에 활성산소종이 많이 생성된 것으로 보여지며, 5,7,3',4'-THF를 전 처리 하고 UV는 준 결과 세포내 활성산소종을 감소시키는 결과를 얻었다. 지금까지의 결과에서 5,7,3',4'-THF는 HaCaT cell에서 UV에 의한 활성 산소종 생성을 억제 하였고 그 자체적으로는 활성산소종을 유도하지 않았다. 따라서, 5,7,3',4'-THF는 세포내 활성 산소종 생성, 그리고 동시에 p38 신호경로의 활성을 증가시켜 스트레스에 의한 apoptosis로부터 keratinocyte를 보호하는 것으로 확인 되었다. 도 6은 본 발명의 5,7,3',4'-THF가 세포내 활성산소종(ROS) 생성을 억제함으로써 스트레스에 의한 apoptosis로부터 HaCaT cell를 보호한다는 것을 보여주는 데이터이다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 식물 유래 플라보노이드인 5,7,3’,4‘-테트라하이드록시플라보논(5,7,3’,4‘-tetrahydroxy flavanone)는 자외선으로 인한 사람 피부세포의 세포사멸(apoptosis)을 억제하는 기능을 가지고 있음으로써 자외선에 의한 사람 피부세포의 세포사멸을 예방 또는 치료할 수 있는 기능성 화장료 조성물 또는 의료용 조성물의 개발에 효과적으로 이용될 수 있다.

Claims

5,7,3’,4‘-테트라하이드록시플라보논(5,7,3’,4‘-tetrahydroxy flavanone)을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 사람 피부 세포의 세포사멸 억제용 조성물.
제 1항에 있어서, 자외선에 의한 세포내 활성산소종 생성 및 p38 MAP kinase의 활성 감소를 억제시킴으로써 세포사멸을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 자외선에 의한 피부의 세포사멸 보호용 화장료 조성물의 원료로 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 자외선에 의한 피부의 세포사멸 보호용 약학적 조성물의 원료로 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.