JPWO2018143166A1 - 細胞の凍結保存組成物および凍結保存方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]ソホロースリピッドを0.01重量%から20重量%含む凍結保存後の細胞生存率を高める組成物
[2]ジメチルスルホキシド(DMSO)を5重量%から10重量%含む[1]に記載する組成物
[3]多価アルコールを1重量%から50重量%含む[1]または[2]に記載する組成物
[4]多価アルコールとして、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコールのいずれか少なくとも一つを含む[3]に記載する組成物
[5]細胞を凍結保存する直前から6時間前の間で細胞培養培地中に[1]で記載する組成物を1容量%となるように添加して細胞を凍結保存する方法
[6]細胞を凍結保存する際に、細胞培養培地中に[2]乃至[4]に記載する組成物を10容量%から99容量%添加して細胞を凍結保存する方法
最も汎用されている細胞保存時に使用する培地であるダルベッコ改変培地(DMEM)に表1の組成物を7:3の容量比で混和した。各試料を15mL遠沈管(Thermo Scientific BioLite)に分注し、4℃条件下で5分、−20℃条件下で20分、−80℃条件下の順で冷却し、−80℃10分後に試料の外観を目視にて観察した。
ヒト正常線維芽細胞(クラボウ)を3.2×104 cells/mlとなるように6ウェルプレートに播種し、48時間培養した。培養後、培養培地を除去し、5重量%SL水溶液を0.05容量%となるようにウシ胎児血清含有のDMEMにて希釈して添加した。所定時間培養後、生細胞数をトリパンブルー染色により計測した(凍結前の生細胞数)。残りの細胞をクライオジェニックバイアル(三商)の中で10%DMSO/ウシ胎児血清含有DMEM1mLに懸濁し、4℃条件下で5分、−20℃条件下で20分、−80℃条件下の順で冷却した。−80℃で一晩保存後、37℃で速やかに解凍し、生細胞数をトリパンブルー染色により計測した(解凍後の生細胞数)。残りの細胞懸濁液を6ウェルプレートに播種して72時間培養した。培養後の生細胞数をトリパンブルー染色により計測した(培養後の生細胞数)。
増殖率(%)=培養後の生細胞数/解凍後の生細胞数×100
増殖率(%)=凍結保存後の吸光度(72時間培養)/未凍結の吸光度(72時間培養)
ヒト正常線維芽細胞(クラボウ)を3.2×104 cells/mlとなるように6ウェルプレートに播種し、48時間培養した。培養後、培養培地を除去し、5重量%SL水溶液を0.05容量%となるようにDMEM培地にて希釈して添加した。6時間培養後、生細胞数をトリパンブルー染色により計測した(凍結前の生細胞数)。残りの細胞をクライオジェニックバイアル(三商)の中で10%DMSO/DMEM1mLに懸濁し、4℃条件下で5分、−20℃条件下で20分、−80℃条件下の順で冷却した。−80℃で一晩保存後、37℃で速やかに解凍し、生細胞数をトリパンブルー染色により計測した(解凍後の生細胞数)。
間葉系幹細胞(Lonza)を3.2×104 cells/mlとなるように6ウェルプレートに播種し、48時間培養した。培養後、培養培地を除去し、5重量%SL水溶液を0.05容量%となるようにMSCGM−CD培地にて希釈して添加した。6時間培養後、生細胞数をトリパンブルー染色により計測した(凍結前の生細胞数)。残りの細胞をクライオジェニックバイアル(三商)の中で10%DMSO/MSCGM−CD培地1mLに懸濁し、4℃条件下で5分、−20℃条件下で20分、−80℃条件下の順で冷却した。−80℃で一晩保存後、37℃で速やかに解凍し、生細胞数をトリパンブルー染色により計測した(解凍後の生細胞数)。
ヒト正常線維芽細胞(クラボウ)の生細胞数をトリパンブルー染色により計測した(凍結前の生細胞数)。細胞をウシ胎児血清含有DMEMで懸濁した。クライオジェニックバイアル(三商)の中で表7、8の各試料と細胞懸濁液を3:7の容量比で混合し、4℃条件下で5分、−20℃条件下で20分、−80℃条件下の順で冷却した。−80℃で一晩保存後、37℃で速やかに解凍し、生細胞数をトリパンブルー染色により計測した(解凍後の生細胞数)。残りの細胞懸濁液を6ウェルプレートに播種して72時間培養した。培養後の生細胞数をトリパンブルー染色により計測した(培養後の生細胞数)。
増殖率(%)=培養後の生細胞数/解凍後の生細胞数×100
増殖率(%)=凍結保存後の吸光度(72時間培養)/未凍結の吸光度(72時間培養)
ラット骨格筋筋芽細胞(JCRB9081 L6)の生細胞数を計測した(凍結前の生細胞数)。残りの細胞をウシ胎児血清含有DMEMで懸濁した。クライオジェニックバイアル(三商)の中で表7の各組成物と細胞懸濁液を3:7の容量比で混合し、4℃条件下で5分、−20℃条件下で20分、−80℃条件下の順で冷却した。−80℃で一晩保存後、37℃で速やかに解凍し、生細胞数を計測した(解凍後の生細胞数)。
また、筋芽細胞の性質として、5日間培養後の培養上清中のサイトカイン(VEGF)をELISAで定量した。
ヒト骨格筋筋芽細胞(患者より)の生細胞数を計測した(凍結前の生細胞数)。残りの細胞をウシ胎児血清含有DMEMで懸濁した。クライオジェニックバイアル(三商)の中で表11の各組成物と細胞懸濁液を3:7の容量比で混合し、4℃条件下で5分、−20℃条件下で20分、−80℃条件下の順で冷却した。−80℃で一晩保存後、37℃で速やかに解凍し、生細胞数を計測した(解凍後の生細胞数)。
ヒト正常線維芽細胞(クラボウ)の生細胞数をトリパンブルー染色により計測した(凍結前の生細胞数)。細胞を非血清のDMEMで懸濁した。クライオジェニックバイアル(三商)の中で表13の各試料と細胞懸濁液を3:7の容量比で混合し、4℃条件下で5分、−20℃条件下で20分、−80℃条件下の順で冷却した。−80℃で一晩保存後、37℃で速やかに解凍し、生細胞数をトリパンブルー染色により計測した(解凍後の生細胞数)。
増殖後の生存率(%)=培養後の生細胞数/培養後の総細胞数×100
間葉系幹細胞(Lonza)の生細胞数をトリパンブルー染色により計測した(凍結前の生細胞数)。細胞をMSCGM−CD培地で懸濁した。クライオジェニックバイアル(三商)の中で表14の各試料と細胞懸濁液を3:7の容量比で混合し、4℃条件下で5分、−20℃条件下で20分、−80℃条件下の順で冷却した。−80℃で一晩保存後、37℃で速やかに解凍し、生細胞数をトリパンブルー染色により計測した(解凍後の生細胞数)。
増殖率(%)=凍結保存後の吸光度(72時間培養)/未凍結の吸光度(72時間培養)
間葉系幹細胞(Lonza)を2.0×104 cells/mlとなるように96ウェルプレートに播種し、72時間培養した。培養後、培養培地を除去して、表16の各組成物の濃度となるようにウシ胎児血清非含有のDMEMにて希釈して添加した。48時間培養後、Cell Counting Kit−8(同仁化学研究所)により吸光度を測定した。
間葉系幹細胞(Lonza)を2.0×104 cells/mlとなるように96wellプレートに播種して6時間あるいは72時間培養後、Cell Counting Kit−8(同仁化学研究所)により吸光度を測定した(未凍結の吸光度)。残りの細胞をウシ胎児血清含有DMEMで4.0×105 cells/mlとなるように懸濁した。クライオジェニックバイアル(三商)の中で表17の各組成物と細胞懸濁液を1:1の容量比で混合し、凍結処理容器BICELL(日本フリーザー)に入れて、―80℃条件下で冷却した。一晩保存後、37℃で速やかに解凍し、各組成物を除去せずに100 μLを96 wellプレートに播種して6時間培養して、Cell Counting Kit−8(同仁化学研究所)により吸光度を測定した(凍結保存後の吸光度)。
各食品(きゅうり、ほうれん草、りんご)を、それぞれ、表18、表19、表20の組成となるように水で調製した溶液100gに30分間浸漬した。浸漬後、ペーパータオルで余分な水分を拭き取り、−20℃で冷凍した。一晩保存後、37℃で解凍して、外観および食感を以下の判定基準に従って評点下した。
<判定基準>
3:冷凍前と比べて、差は認められない
2:冷凍前と比べて、差が認められる
1:冷凍前と比べて、かなり差が認められる
各食品(まぐろ、レバー)を、それぞれ、表21、22の組成となるように水で調製した溶液100gに30分間浸漬した。浸漬後、ペーパータオルで余分な水分を拭き取り重量測定(冷凍前の重量)後、−20℃で冷凍した。一晩保存後、37℃で解凍し、外観観察とドリップ量測定を行った。外観を以下の判定基準に従って評点下した。
<判定基準>
3:冷凍前と比べて、差は認められない
2:冷凍前と比べて、差が認められる
1:冷凍前と比べて、かなり差が認められる
ドリップ量(食材を取り除いた後の重量)を測定して、以下の式によりドリップ流出率を算出した。ドリップ量とは、食品を解凍した際に、細胞内の氷が溶けて水になり、傷ついた細胞から流れ出てくる水分のことをいう。
Claims (9)
- ソホロースリピッドを0.01重量%から20重量%含む凍結保存後の細胞生存率を高める組成物。
- ジメチルスルホキシド(DMSO)を5重量%から10重量%含む請求項1に記載する組成物。
- 多価アルコールを1重量%から50重量%含む請求項1または2に記載する組成物。
- 多価アルコールとして、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコールのいずれか少なくとも一つを含む請求項3に記載する組成物。
- ソホロースリピッド及び多価アルコールを含み、ジメチルスルホキシド(DMSO)を含まない、凍結保存後の細胞生存率を高める組成物。
- 前記多価アルコールはグリセリンであり、細胞は幹細胞である請求項5記載の組成物。
- 前記幹細胞は間葉系幹細胞である請求項6記載の組成物。
- 細胞を凍結保存する直前から6時間前の間で細胞培養培地中に請求項1で記載する組成物を1容量%となるように添加して細胞を凍結保存する方法。
- 細胞を凍結保存する際に、細胞培養培地中に請求項2乃至7の何れか1項に記載する組成物を10容量%から99容量%添加して細胞を凍結保存する方法。
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