CN112961833B - 一种将永生化淋巴细胞系重编程为诱导多能干细胞的方法 - Google Patents

一种将永生化淋巴细胞系重编程为诱导多能干细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种将永生化淋巴细胞系重编程为诱导多能干细胞的方法。该重编程方法主要为向永生化淋巴细胞中通过核转法导入表达外源重编程因子的附加体质粒，重编程因子包括OCT3/4、shP53、SOX2、KLF4、LIN28及L‑MYC。本发明能够高效地将永生化淋巴细胞系重编程为iPSC，附加体质粒不会整合进宿主细胞基因组，同时会随细胞增殖而逐渐丢失，从而能够适时沉默外源表达，降低细胞致瘤风险。本发明获得的iPSC具有典型的干细胞形态和与ESC相似的特性，表达细胞干性基因，有分化为外胚层、中胚层、内胚层组织的分化潜能。本发明重编程效率高，且致瘤性低，拓展了永生化淋巴细胞系的临床研究价值，具有应用前景。

Description

一种将永生化淋巴细胞系重编程为诱导多能干细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种将永生化淋巴细胞系重编程为诱导多能干细胞的方法。
背景技术
2006年Yamanaka和Takahashi通过成功利用小鼠细胞获得诱导多能干细胞(induced Pluripotent Stem Cell，iPSC)，这一方法是通过逆转录病毒载体将四种转录因子Sox2(sex determining region Y box protein 2)、Oct4(octamer bidingtranscription factor 4)、c-Myc(cellular myelocytomatosis oncogene)和Klf4(kruppel like factor 4)导入小鼠成纤维细胞的。经过重编程获得的iPSC具有与胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)相似的细胞特征，如表达干性标志基因、具有三胚层分化潜能等(Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouseembryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell.2006；126(4):663-76.)。在2007年，Yamanaka团队克服转染效率低下的问题，调整前述方法成功获得人源iPSC(Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,Narita M,Ichisaka T,Tomoda K,YamanakaS.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by definedfactors.Cell.2007；131(5):861-72.)。同一时期，Thomson团队利用慢病毒载体的方法，将人类成纤维细胞重编程为iPSC，该方法中使用的转录因子主要为Sox2、Oct3/4、Nanog和Lin28(Yu J,Vodyanik MA,Smuga-Otto K,Antosiewicz-Bourget J,Frane JL,Tian S,NieJ,Jonsdottir GA,Ruotti V,Stewart R,Slukvin II,Thomson JA.Induced pluripotentstem cell lines derived from human somatic cells.Science.2007；318(5858):1917-20.)。
而后，iPSC的重编程及其定向分化技术在随后的时间里得到充分发展，全世界的科学家已经在多种模式动物和人类中成功将胚胎成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、血液细胞、尿液细胞等各种类型的细胞重编程为iPSC(Theunissen TW,Jaenisch R.Molecularcontrol of induced pluripotency.Cell Stem Cell.2014；14(6):720-34.)。iPSC具有自体来源的特性，因而产生伦理问题可能性较小，通过体外的定向分化技术可以在组织特异性的角度进行细胞命运决定、器官发育、疾病分子机制、大规模药物筛选等领域开展研究，在细胞治疗等临床场景也有相当的应用前景。具体来说，iPSC由于具有类似于ESC的多能性，理论上可以分化成为对应生物体内任意种类的细胞，一方面可以分化为疾病累及的组织特异性的细胞，从而增加我们对于疾病发生发展的机制研究；另一方面，由于克服了异体免疫排斥的问题，在规范的临床级培养条件下会成为一种理想发现药物、筛选药物的工具，甚至移植iPSC或其分化成的细胞会成为未来临床治疗中的有效对策，具有广阔的临床应用前景(Colman A,Dreesen O.Pluripotent stem cells and disease modeling.Cell StemCell.2009；5(3):244-7.)。用于iPSC重编程的关键转录因子，从最初的“山中伸弥因子”SOX2、OCT4、KLF4、C-MYC，发展到今天已有TET1、SALL4、LIN28、L-MYC等多种替代因子以多种组合方式，在多种生物中多种类型的细胞中进行重编程(Theunissen TW,JaenischR.Molecular control of induced pluripotency.Cell Stem Cell.2014；14(6):720-34.)。用以表达这些关键因子的载体最初是逆转录病毒、慢病毒，但这些病毒载体往往会导致这些转录因子整合进入宿主细胞基因组，其结果是外源性转录因子表达不能沉默，引起重编程过程不完全，甚至有致瘤危险。不过在后续的研究中，仙台病毒、腺病毒、附加体质粒等非整合性的方法陆续成功将体细胞重编程为iPSC(Malik N,Rao MS.A review of themethods for human iPSC derivation.Methods Mol Biol.2013；997:23-33.)，这也使得iPSC更加接近临床级应用。这些研究结果提示，在不同物种来源、不同组织类型的细胞中，选用不同的重编程因子组合、不同的递送方式时，重编程效率将会产生较大差异，因此选择适宜的实验体系至关重要。
尽管iPSC相关技术在各国都已开展了大量研究，然而目前尚未见成熟的诱导人类永生化淋巴细胞系为iPSC的技术体系。对于因病故、地域等客观因素导致难以再次采样的家系，永生化淋巴细胞系可能是唯一能较长时间保存的遗传材料，对于其疾病分子机制研究有着重要贡献。遗传性疾病往往具有组织特异性的特征，为更进一步探究相关疾病的分子机制与组织特异性，必须探索一种能够高效地将永生化淋巴细胞系重编程为诱导多能干细胞的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种将永生化淋巴细胞系重编程为iPSC的方法，通过以下步骤实现：
(1)利用淋巴细胞培养基扩增培养需要进行重编程的永生化淋巴细胞系；
(2)将表达外源重编程因子的附加体质粒导入需要进行重编程的永生化淋巴细胞系；
(3)利用重编程培养基培养(2)中获得含有表达外源重编程因子的附加体质粒的永生化淋巴细胞系，直至获得干细胞克隆样细胞，经鉴定表达内源性干性基因的为iPSC。
步骤(1)所述细胞培养环境为37℃，5％CO2湿润环境的恒温培养箱。
步骤(1)所述淋巴细胞培养基成分为RPMI 1640培养液，添加体积百分比为15％胎牛血清(FBS)，1％青-链霉素溶液(100×)，终浓度为1mmol/L丙酮酸钠。
优选的，步骤(2)中当重编程永生化淋巴细胞系含氨基糖苷类药物敏感相关的线粒体突变时，所述淋巴细胞培养基中添加的青-链霉素溶液应替换为终浓度0.2％的Normocin(500×)。
步骤(2)所述永生化淋巴细胞系是通过EBV转化人外周血来源的单个核细胞获得的细胞系。
步骤(3)所述附加体质粒包括pCXLE-hOCT3/4-shp53-F，pCXLE-hSK，pCXLE-hUL，pCXLE-EGFP，pCXWB-EBNA1。更优选的，添加pCXWB-EBNA1可有效提高永生化淋巴细胞系的重编程效率。
步骤(2)所述外源重编程因子包括OCT3/4、shP53、SOX2、KLF4、LIN28及L-MYC。
所述OCT3/4、SOX2、KLF4、LIN28及L-MYC均为人源转录因子。
所述shP53位特异性识别人源P53的短发卡RNA。
步骤(2)所述导入方式为通过核转仪将附加体质粒导入永生化淋巴细胞系。
优选的，所述核转仪为Lonza 2B。
优选的，所述导入方式使用Amaxa Lonza Cell Line Nucleofector Kit V试剂。
优选的，所述导入方式按照每样品加入Cell Line Nuceofector Solution V81.8μL和Supplement 18.2μL比例混合，加入无内毒素质粒大提获得的质粒pCXLE-hOCT3/4-shp53-F，pCXLE-hSK，pCXLE-hUL，pCXLE-EGFP，pCXWB-EBNA1各2μg。
优选的，所述导入方式使用核转程序X-005。
优选的，所述导入步骤完成后，每样品添加1mL重编程培养基重悬，将重悬液转移进入12孔板中的1个孔进行培养。
所述重编程培养基是由DMEM/F12培养基中添加20％体积百分比的Knockout血清替代物，终浓度为1×的非必需氨基酸，终浓度为1×的GlutaMAX，终浓度为50μg/mL抗坏血酸磷酸酯镁，终浓度为10ng/mL的碱性成纤维生长因子得到的培养基。
优选的，所述培养过程在导入附加体质粒后2天，更换含丁酸钠的重编程培养基，并将含有表达外源重编程因子的附加体质粒的永生化淋巴细胞系重悬并均分至12孔板的2个孔。优选的，所述培养过程在导入附加体质粒后3或4天，通过荧光显微镜观察含有表达外源重编程因子的附加体质粒的永生化淋巴细胞系中EGFP表达效率，以监测导入附加体质粒的效率。
所述含丁酸钠的重编程培养基是由重编程培养基添加终浓度为0.5mmol/L的丁酸钠得到的培养基。
优选的，所述培养过程在导入附加体质粒后4天、6天、10天，使用含丁酸钠的重编程培养基对含有表达外源重编程因子的附加体质粒的永生化淋巴细胞系换液培养。
优选的，所述培养过程在导入附加体质粒后7天，准备小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为饲养层细胞。按照每个样品准备6孔板中的2个孔，其中每个孔接种丝裂霉素C处理过的MEF量为2×105，每孔加生长培养液2mL。
优选的，所述培养过程在导入附加体质粒后8天，将含有表达外源重编程因子的附加体质粒的永生化淋巴细胞系重悬计数，以每孔5×104的量接种于含丝裂霉素C处理过的MEF的6孔板，用含丁酸钠的重编程培养基继续培养。
优选的，所述培养过程在导入附加体质粒后12天、14天、16天、18天、20天、22天、24天、26天、28天，使用重编程培养基培养。
所述干细胞克隆样细胞呈通常在导入附加体质粒后16-18天可见，22-26天时可以挑取单克隆传代。所述克隆样为单层的细胞团，光学显微镜下观察具有核质比高、折光率均一、与MEF边界清晰等特征。
所述内源性干性基因包括SOX2、OCT4、C-MYC、KLF4、NANOG、SSEA4、TRA-1-60中的多个组合。
所述鉴定方式为逆转录PCR，免疫荧光染色等。
更优选的，通过转录因子启动子区甲基化程度检测、拟胚体形成及自发分化检测、免疫缺陷型小鼠在体畸胎瘤形成等实验检测iPSC的多能性及分化潜能。
本发明提供了一种将永生化淋巴细胞系重编程为iPSC的方法，通过该方法获得的iPSC具有典型的干细胞形态和与ESC相似的特性，表达细胞干性基因，有分化为外胚层、中胚层、内胚层组织的分化潜能。
本发明的有益效果为：通过在永生化淋巴细胞系中导入附加体质粒，能够高效地将永生化淋巴细胞系重编程为iPSC，附加体质粒不会整合进宿主细胞基因组，同时会随细胞增殖而逐渐丢失，从而能够适时沉默外源表达，降低细胞致瘤风险。本发明大大拓展了永生化淋巴细胞系的临床研究价值，具有临床应用前景。
附图说明
图1.核转后72h荧光显微镜观察转染效率，呈绿色的是导入的pCXLE-EGFP质粒表达的EGFP。
图2.经重编程获得的iPSC在有饲养层细胞体系培养的形态，饲养层细胞为小鼠MEF细胞。
图3.经重编程获得的iPSC在无饲养层细胞体系培养的形态，培养皿用Matrigel提前包被，培养基为mTeSR。
图4.经重编程获得的iPSC克隆经碱性磷酸酶染色后呈紫红色，为阳性。
图5.经重编程获得的iPSC克隆经免疫荧光实验鉴定后SOX2、OCT4、NANOG、SSEA4、TRA-1-60均有表达，呈蓝色的是DAPI标记的细胞核。
图6.经重编程获得的iPSC经逆转录PCR鉴定后，内源性SOX2、OCT4、C-MYC、KLF4、NANOG均有表达。
具体实施方式
下面结合附图说明及具体实施方式对本发明进一步说明。
实施例1将将永生化淋巴细胞系重编程为iPSC
(1)淋巴细胞系生长状态良好，密度达到1×106/mL左右时，取2mL细胞于1000rpm室温离心5min。用预热过的1×PBS润洗细胞，弃去上清。同时预热重编程培养液。重编程培养基为DMEM/F12培养基中添加20％体积百分比的Knockout血清替代物，终浓度为1×的非必需氨基酸，终浓度为1×的GlutaMAX，终浓度为50μg/mL抗坏血酸磷酸酯镁，终浓度为10ng/mL的碱性成纤维生长因子。
(2)每样品按照Cell Line Nuceofector Solution V 81.8μL和Supplement 18.2μL比例混合，加入无内毒素质粒大提获得的质粒pCXLE-hOCT3/4-shp53-F，pCXLE-hSK，pCXLE-hUL，pCXLE-EGFP，pCXWB-EBNA1各2μg，混匀获得电转液备用。
(3)用配制好的电转液重悬各细胞，轻轻用枪吹均匀，转移至电转杯，避免产生气泡。
(4)开启Lonza电转仪，选择程序X-005。将含各样品的电转杯依次放入电转仪，启动程序，完成电转。
(5)在12孔板对应孔中各加入预热过的重编程培养基1mL，用细巴氏管吸出电转后的各样品加入对应孔中，轻轻摇匀，培养于37℃，5％CO2湿润环境的恒温培养箱中。标记为Day 0，之后在iPSC克隆长出来之前隔天换液。
(6)Day 2换液时，将各孔样品用含丁酸钠的重编程培养基2mL重悬并均分至12孔板的2个孔。Day 4，Day 6换液培养液为含丁酸钠的重编程培养基。其中Day 3或Day 4可检测GFP荧光强度来确定电转效率。含丁酸钠的重编程培养基为重编程培养基添加终浓度为0.5mmol/L的丁酸钠。
(7)Day 7时准备MEF饲养层细胞。按照每个样品2个孔，每个6孔板需丝裂霉素处理过的MEF细胞2×106的比例进行接种，每孔加生长培养液2mL。
(8)Day 8取各孔样品的细胞，于1000rpm室温离心5min。重悬后计数，按照每孔5×104的量接种于MEF饲养层上，每孔加含丁酸钠的重编程培养基2mL。
(9)Day 10换液，培养液为含丁酸钠的重编程培养基。
(10)Day 12-30隔天换液，培养液为重编程培养基。通常Day 16-18克隆可见，Day22-26可以挑取单克隆。克隆可见后需每天换液。
(11)挑取单克隆前参照Day 7操作进行饲养层铺板，用烧细带钩的玻璃针挑取单克隆传代至新的含饲养层的孔板中，每个孔中只接种1个克隆。单克隆培养4-6天后用1mg/mL IV型胶原酶，37℃培养箱孵育1h消化，然后传代至新的含饲养层的孔板中，并进行后续鉴定、保种、传代。
实施例2iPSC多能性基因表达鉴定
(1)收集正常传代培养的iPSC，通过TRIzol法提取iPSC的总RNA，再将总RNA逆转录为cDNA，用多能性基因SOX2、OCT4、C-MYC、KLF4、NANOG的引物进行PCR，产物通过琼脂糖凝胶电泳分析表达情况。
(2)利用正常传代培养的iPSC，通过多聚甲醛进行固定，用PBS漂洗，经封闭后，各孔分别加入SOX2、OCT4、NANOG、SSEA4、TRA-1-60抗体4度孵育过夜，经PBS漂洗后加入对应种属荧光二抗室温孵育2小时，再经DAPI染色、PBS漂洗后于荧光显微镜下观察拍照。

Claims (5)

1.一种将永生化淋巴细胞系重编程为iPSC的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
（1）利用淋巴细胞培养基扩增培养需要进行重编程的永生化淋巴细胞系；细胞培养环境为37℃，5% CO2湿润环境的恒温培养箱；所述淋巴细胞培养基成分为RPMI 1640培养液，添加体积百分比为15%胎牛血清，1%青-链霉素溶液，终浓度为1 mmol/L丙酮酸钠；
（2）将表达外源重编程因子的附加体质粒导入需要进行重编程的永生化淋巴细胞系；所述永生化淋巴细胞系是通过EBV转化人外周血来源的单个核细胞获得的细胞系；所述外源重编程因子包括OCT3/4、shP53、SOX2、KLF4、LIN28及L-MYC；
（3）利用重编程培养基培养步骤（2）中获得含有表达外源重编程因子的附加体质粒的永生化淋巴细胞系，直至获得干细胞克隆样细胞，经鉴定表达内源性干性基因的为iPSC；
所述重编程培养基是由DMEM/F12培养基中添加20%体积百分比的Knockout血清替代物，终浓度为1×的非必需氨基酸，终浓度为1×的GlutaMAX，终浓度为50μg/mL抗坏血酸磷酸酯镁，终浓度为10ng/mL的碱性成纤维生长因子得到的培养基，所述附加体质粒包括pCXLE-hOCT3/4-shp53-F，pCXLE-hSK，pCXLE-hUL，pCXLE-EGFP，pCXWB-EBNA1；
所述培养过程第2天、第4天、第6天、第8天、第10天用含丁酸钠重编程培养基培养，所述含丁酸钠的重编程培养基是由重编程培养基添加终浓度为0.5mmol/L的丁酸钠得到的培养基。
2.根据权利要求1所述的一种将永生化淋巴细胞系重编程为iPSC的方法，其特征在于，步骤（2）所述OCT3/4、SOX2、KLF4、LIN28及L-MYC均为人源转录因子。
3.根据权利要求1所述的一种将永生化淋巴细胞系重编程为iPSC的方法，其特征在于，步骤（2）所述导入方式为通过核转仪将附加体质粒导入永生化淋巴细胞系。
4.根据权利要求1所述的一种将永生化淋巴细胞系重编程为iPSC的方法，其特征在于，步骤（3）所述培养过程第8天将细胞传代至含饲养层细胞的6孔板进行培养，所述饲养层细胞为小鼠胚胎成纤维细胞。
5.根据权利要求1所述的一种将永生化淋巴细胞系重编程为iPSC的方法，其特征在于，步骤（3）所述培养过程第12天至第26天，隔天换液，直至多能干细胞样克隆出现，所用培养基为重编程培养基。
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